TIM-3 ÉS GALECTIN-9 MOLEKULÁK VIZSGÁLATA EGÉSZSÉGES ÉS PATHOLÓGIÁS TERHES, VALAMINT INFERTILIS NŐKNÉL
DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS
MEGGYES MÁTYÁS
Pécsi Tudományegyetem Klinikai Központ Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet
Témavezető: Dr. Szereday László, egyetemi docens Programvezető: Prof. Dr. Szekeres-Barthó Júlia, egyetemi tanár Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Szekeres-Barthó Júlia, egyetemi tanár
2015
Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke ........................................................................................................ 5 I. Bevezetés ....................................................................................................................... 7 1.1. Immunológiai háttér ............................................................................................... 7 1.2. Az anyai immuntolerancia kialakulása .................................................................. 8 1.3. A TIM-3 ............................................................................................................... 11 1.4. A Galectin-9 (Gal-9) ............................................................................................ 14 1.5. A TIM-3/Gal-9 interakció .................................................................................... 15 1.6. A TIM-3/Gal-9 interakció vizsgálata transzplantációs kísérletekben.................. 16 1.7. A TIM-3 molekula vizsgálata humán kísérletekben ............................................ 17 II. Általános célkitűzések ................................................................................................ 19 III. Anyagok és módszerek ............................................................................................. 20 3.1. Mintalvétel ........................................................................................................... 20 3.2. PBMC (mononukleáris sejtek) szeparálás perifériás vérből Ficoll grádiensen ... 20 3.3. Szeparált sejtek fagyasztása és felolvasztása ....................................................... 20 3.4. A sejtek fenotípusos jelölése flow cytometriás méréshez ................................... 21 3.5. A kísérlet során használt ellenanyagok ................................................................ 21 3.6. Intracelluláris jelölés anti-perforinnal .................................................................. 21 3.7. FoxP3-at expresszáló sejtek fenotípus jelölése flow cytometriás méréshez........ 22 3.8. CD107a aktivációs marker mérése ...................................................................... 22 3.9. Flow cytometria ................................................................................................... 22 3.10. TIM-3+/TIM-3- NK és CD8 szubpopulációk szeparálása ................................ 24 3.10.1. Mágneshez kötött sejtszeparálás (MACS) .................................................. 24 3.10.2. Fluoreszcens sejtszortolás ........................................................................... 25 3.11. PMA/Ionomycin kezelés.................................................................................... 25 3.12. Termelt cytokinek meghatározása ..................................................................... 26 3.13. Szolubilis Galectin-9 meghatározása ................................................................. 26 3.14. Statisztikai analízis ............................................................................................ 27 IV. TIM-3 és Galectin-9 molekulák expressziójának vizsgálata különböző immunsejt szubpopulációkon egészséges terhesség három trimesztere alatt ................................... 28 4.1. Irodalmi háttér...................................................................................................... 28 4.2. Célkitűzések ......................................................................................................... 30 4.3. Donorok, mintavétel ............................................................................................ 31 4.4. Eredmények ......................................................................................................... 31 2
4.4.1. Egészséges terhesség három trimeszteréből származó, illetve nem terhes kontroll nők mononukleáris sejtjeinek fenotípusos analízise ................................. 31 4.4.2. CD3+ T, CD4+ Th, CD8+ Tc, NKT, NK és NK sejt szubpopulációk TIM-3 molekula expressziójának meghatározása flow cytometriás analízissel................. 33 4.4.3. TIM-3 receptort expresszáló, illetve nem expresszáló perifériás CD8+ Tc, NKdim és NKbright sejtek cytokin termelésének összehasonlítása ............................ 35 4.4.4. TIM-3 receptort exprersszáló CD8+ Tc, NK és NK sejt szubpopulációk cytotoxikus aktivitásának meghatározása a terhességi trimeszterekben és nem terhes kontroll mintákban ....................................................................................... 36 4.4.5. Szérum szolubilis Gal-9 molekula összehasonlítása a terhesség három trimeszterében és nem terhes mintákban ................................................................ 39 4.5. Megbeszélés ......................................................................................................... 40 V. TIM-3 és Galectin-9 molekulák összehasonlító vizsgálata egészséges terhességben és early-onset pre-eclampsiában ......................................................................................... 43 5.1. Irodalmi háttér...................................................................................................... 43 5.2. Célkitűzések ......................................................................................................... 44 5.3. Donorok, mintavétel ............................................................................................ 44 5.4. Eredmények ......................................................................................................... 46 5.4.1. Egészséges terhes és early onset pre-eclampsiás terhes mintákból izolált mononukleáris sejtek fenotípusos analízise ............................................................ 46 5.4.2. TIM-3 receptor expresszió összehasonlító vizsgálata egészséges terhes és early-onset pre-eclampsiás minták mononukleáris sejtjein .................................... 47 5.4.3. Gal-9 expresszió összehasonlítása egészséges terhes és early-onset preeclampsiás minták mononukleáris sejtjein ............................................................. 48 5.4.4. Egészséges terhes és early-onset pre-eclampsiás nők CD8+ Tc és NK sejteinek cytotoxikus aktivitása .............................................................................. 49 5.5. Megbeszélés ......................................................................................................... 51 VI. NK sejtek összehasonlító vizsgálata sikeres és sikertelen mesterséges megtermékenyítésen átesett nőkben ............................................................................... 54 6.1. Irodalmi háttér...................................................................................................... 54 6.2. In vitro fertilizáció (IVF) ..................................................................................... 56 6.3. Célkitűzések ......................................................................................................... 57 6.4. Donorok, mintavétel ............................................................................................ 58 6.5. Eredmények ......................................................................................................... 59 3
6.5.1. Sikeres és sikertelen mesterséges megtermékenyítésen átesett nők NK és NK sejt szubpopulációinak fenotípusos analízise, illetve aktiváló-gátló receptorainak expressziója............................................................................................................. 59 6.5.2. Sikeres, illetve sikertelen IVF eljáráson átesett nők NK és NK szubpopulációinak cytotoxikus aktivitása és perforin expressziója ....................... 62 6.5.3. Sikeres, illetve sikertelen IVF procedúrán átesett nők NKT sejtjeinek fenotípusos analízise, receptor és perforin expressziója ......................................... 63 6.6. Megbeszélés ......................................................................................................... 64 VII. Összegzés ................................................................................................................ 66 VIII. Új eredmények, következtetések ........................................................................... 68 IX. Az értekezés alapjául szolgáló eredeti közlemények ............................................... 69 X. Egyéb közlemények ................................................................................................... 69 XI. Irodalomjegyzék ....................................................................................................... 70 XII. Köszönetnyilvánítás ................................................................................................ 79 XIII. Mellékletek ............................................................................................................ 80
4
Rövidítések jegyzéke ART: asszisztált reprodukciós kezelések ANOVA: variancia-analízis APC: allophycocyanin At: antitest CBA: Cytometric Bead Array CRD: szénhidrát-felismerő domén DC: dendritikus sejt DMSO: dimetil-szulfoxid EAE: kísérletes allergiás enkefalitisz ELISA: enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat EVCT: extravillosus cytotrophoblast FCS: borjú szérum FSC: előre irányuló fényszórás FITC: fluorescein isothiocyanate Gal-9: Galectin-9 GBM: Glioblastoma Multiforme GM-CSF: granulocyta-makrophág kolónia stimuláló faktor HLA: human leukocyta antigén Ig: immunglobulin IFN-γγ: interferon gamma IL: interleukin iNKT: invariáns NKT sejt IVF: in vitro fertilizáció KIR: Killing Inhibitory Receptors mAt: monoklonális ellenanyag MACS: mágneshez kötött sejtszeparálás MHC: klasszikus hisztokompatibilitási antigének NK: Natural Killer (természetes ölősejt) NKT: Natural Killer T sejt NS: nem szignifikáns NT: nem terhes PBMC: perifériás vér mononukleáris sejtek PBS: foszfát puffer 5
PE: phycoerythrin PFA: paraformaldehid PIBF: Progeszteron Indukálta Blokkoló Faktor PMA: phorbol-12-myristate-13-acetate RA: Reumatoid Arthritisz RPMI: Roswell Park Memorial Institute-féle tápfolyadék RT-PCR: real time PCR SM: Sclerosis Multiplex SSC: oldalra irányuló fényszórás STBM: syncytiotrophoblast mikrovezikula Tc: cytotoxikus T lymphocyta TCR: T-sejt receptor Th: T helper lymphocyta TIM-3: T-sejt Immunglobulin és Mucin domén-3 TNF-α α: tumor necrosis factor alfa TNFR: TNF-α receptor Treg: regulatorikus T sejt
6
I. Bevezetés 1.1. Immunológiai háttér A terhesség egy „immunológiai rejtély”, ugyanis a petesejt és a hímivarsejt találkozásakor a fejlődésnek induló új egyed genetikai állományának felét az anyától felét az apától örökli, így a magzat fele részben apai, az anyai immunrendszer számára idegen antigéneket hordoz. Az allograftok kilökődéséért immunrendszerünk tehető felelőssé tehát a terhesség ilyen szempontból immunológiailag paradoxonnak minősül, mivel a semi-allograft magzat zavartalanul fejlődik a terhesség ideje alatt. Logikus lenne a magzat túlélése szempontjából, hogy a rá jellemző antigének az anyai immunrendszer számára rejtve maradjanak, és így felismerésük gátolt legyen. Jelenlegi ismereteink szerint azonban a magzat jelenlétének immunológiai felismerése kifejezetten szükséges ahhoz, hogy elindítsa azokat a mechanizmusokat, melyek a továbbiakban a védelmét szolgálják az anya immunrendszerével szemben. Az a tény, hogy egészséges terhesség során az anyai immunrendszer nem támadja meg a magzatot, olyan megváltozott immunológiai hátteret feltételez, amely bizonyos fokú toleranciát biztosít a félig idegen antigenitású magzati szervezettel szemben a terhesség sikeres kihordása érdekében. Ezzel szemben, az anya immunrendszerének az esetlegesen fellépő fertőzések elleni védelmet is biztosítania kell, ami pedig pro-inflammatorikus immunválaszokat igényel. A magzat és az anya immunológiai kapcsolata tehát egy olyan kétoldalú folyamat, melyet magzati részről az arra jellemző antigének prezentálása, anyai részről azok felismerése és reagálva rá az immunválasz mértéke határoz meg. Terhesség során az említett anyai immunválasz immunszupresszív jellegű, így például a cytokin termelés egyensúlya T helper 2-es (Th2) irányba tolódik el, illetve alacsony perifériás NK aktivitás figyelhető meg [1]. A terhesség alatt az anyai immunválaszokat szabályozó immunregulációs folyamatok megfelelő működése rendkívül fontos az előbb említett két ellentétes folyamat közötti egyensúly kialakításában. Ennek az egyensúlynak a megléte biztosítja a magzat fejlődését, megbomlása azonban koraszüléssel, pre-eclampsia kialakulásával vagy akár a magzat elvesztésével is járhat.
7
1.2. Az anyai immuntolerancia kialakulása Az anyai immuntolerancia kialakításában számos mechanizmus vesz részt, melyek együttes jelenléte és összehangolt működése biztosítja a magzat zavartalan fejlődését. Egyik ilyen tényező a magzat anatómiai elhelyezkedése az anyai szervezeten belül, valamint az anyától elválasztó, illetve összekötő szövetek speciális tulajdonságai, melyek részletes magyarázatot adnak az anyai immunrendszerrel való különleges kapcsolatra. A placentában az anyai részt a terhes méh nyálkahártyája, a decidua vagy hullóhártya alkotja. Az embrionális eredetű trophoblast sejtek képezik az anya és a magzati felszínek közötti érintkezési
felületet.
A
placenta
bolyhos
struktúráját
adó
cytotrophoblast
és
syncyciotrophoblast rétegek mellett az extravillosus cytotrophoblast (EVCT) sejtek alkotják a méhlepény invazív szubpopulációját, melyek az anyai szövetekbe hatolva képesek közvetlen, sejt-sejt szintű kapcsolatot teremteni az anyai sejtekkel, így itt van elsősorban lehetőség a magzati antigének anyai lymphocyták általi felismerésére, illetve az EVCT lehet az anyai immunválaszok támadásának célpontja (1. ábra).
1. ábra. Az anya-magzat határfelület és az immunológiailag kiemeltem fontos magzati trophoblast [2].
Az EVCT-ról ugyanis részben hiányoznak az egyén immunológiai ujjlenyomatának tekinthető klasszikus hisztokompatibilitási antigének (HLA), melyeknek egyezése vagy különbözősége határozza meg a beültetett szerv sorsát. Ha a beültetett szerv HLA antigénjei megegyeznek a beteg HLA antigénjeivel, akkor a graft életben maradási esélyei jónak mondhatóak, azonban ha a recipiens HLA antigénjei nagyban eltérnek a donorétól, a transzplantátum nagy valószínűséggel kilökődik. Az EVTC-n a klasszikus polimorf HLA-A, illetve HLA-B 8
antigének nem fejeződnek ki [3], de kis mennyiségben a HLA-C igen [4]. Kimutathatóak rajta továbbá trophoblast szövetspecifikus antigének és I. osztályú korlátozott polimorfizmusú HLA antigének is (HLA-E, illetve HLA-G) [5] [6]. Ezek az antigének alacsonyabb molekulasúlyúak, mint a klasszikus HLA antigének és hiányoznak róluk az apai alléldeterminánsok, melyek a graft kilökődési reakciójának targetjei. A cytotoxikus Tlymphocyták (Tc) aktiválódásának feltétele a klasszikus, polimorf HLA antigének jelenléte, míg az NK sejtek aktiválódását éppen ezen antigének hiánya idézi elő. Az EVCT-n nagymértékben expresszálódó HLA-G tehát nem képes antigént prezentálni a Tc sejteknek, ezzel védve a trophoblast sejteket az eliminációtól, ugyanakkor képes az NK sejt gátló receptorához is kapcsolódni, ami negatív szignált közvetít az ölő sejteknek, következésképpen a HLA-G jelenléte védheti a trophoblastot a Tc-, illetve az NK sejt mediálta lízissel szemben (2. ábra). Ezzel párhuzamosan az EVCT-n kis mennyiségben kifejeződő apai eredetű HLA-C molekulák klasszikus gyulladásos reakciót váltanak ki lokálisan, ami a deciduális szöveti struktúra oldásával és fellazításával megkönnyíti ezen sejtek invázióját.
2. ábra. A magzati trophoblaston expresszálódó HLA-G és interakciója az anyai immunrendszerrel [7].
Nagy szerepe van a deciduában hormonális hatásokra a perifériás vérhez képest megváltozó lymphocyták arányának. Emelkedik például a deciduális lymphocyták mintegy 80%-át alkotó úgynevezett deciduális NK sejtek száma. Ezek az NK sejtek különböznek az érett perifériás vérben keringő NK sejtektől, annak egy kis csoportjára, a CD56bright/CD16/CD3- emlékeztetnek és alacsony cytotoxicitással rendelkeznek [8]. Szintén emelkedik a γ/δ T-sejtek száma is a perifériához képest, aminek a lehetséges oka a nem klasszikus HLA molekulák antigén prezentáló szerepével hozható összefüggésbe. Ugyanis a klasszikus HLA antigének hiányában valószínűtlen a trophoblaston kifejeződő antigének α/β T-sejtek általi 9
felismerése, de ősibb antigénfelismerő receptorral rendelkező γ/δ T-sejtek azonban képesek a típusos MHC antigének, illetve az MHC nélküli antigének felismerésére is. A trophoblaston lévő nem klasszikus HLA molekulák tehát antigént prezentálnak a γ/δ T-sejtek számára, és egyidejűleg védik a trophoblastot az anyai immunrendszer támadásaitól. A regulatorikus T(Treg) sejtek számát illetően is emelkedés figyelhető meg, melyek elsődleges funkciója mind a T helper 1 (Th1), mind pedig a Th2-es immunválaszok regulálása. A sejtek a periférián válnak éretté, ahol kapcsolatba kerülnek a folyamatosan felszabaduló apai antigénekkel. A szubpopuláció klonális osztódását követően a sejtek a feto-maternális határra vándorolnak és ott egy toleráns mikrokörnyezet kialakítását indukálják az általuk termelt cytokinekkel [9]. Szintén lényeges feltétel a cytokin egyensúly eltolódása Th2-es irányba. A cytokinek alacsony molekulasúlyú proteinek, glikoproteinek, melyek fontos szerepet játszanak a sejtek közötti kommunikációban, illetve a sejtek differenciálódásának és proliferációjának szabályozásában. A Th1-es cytokinek, mint az interferon gamma (IFN-γ), az interleukin-2 (IL-2) vagy a tumor necrosis alfa (TNF-α) celluláris immunválaszt indukálnak, míg a Th2-es cytokinnek számító IL-4 vagy IL-10 termelődése humorális immunválasz során fokozódik. A Th1 és Th2-es cytokinek aránya egyensúlyban van, de bizonyos esetekben eltolódhat valamely irányába. Klinikai megfigyelések és kísérleti adatok egyaránt alátámasztják azt a megfigyelést, hogy a terhességet Th2-es cytokin dominancia jellemzi (3. ábra), azaz egészséges terhesség során a Th2-es szubpopulációba tartozó sejtek működése kerül túlsúlyba és ezáltal a Th2-es típusú cytokinek irányába tolódik el az immunológiai egyensúly [10].
Th1
Th2
IFNγγ TNFα α IL-2 IL-12 IL-15 IL-18
IL-3 IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 IL-13
3. ábra. Th1 és Th2 cytokinek megoszlása a terhesség alatt
10
A terhesség alatt a megnövekedett Th1-es aktivitással járó krónikus autoimmun betegségek tünetei enyhülnek, míg a terhesség után újabb relapszusok következnek be [11]. A foetoplacentáris egység két oldala cytokinek termelésével hat egymásra, így például az anya által termelt cytokinek befolyásolják a placenta méretét, ezzel szemben a placenta antigénexpressziója pedig az anya által termelt cytokinekre van hatással. Egészséges terhességből származó trophoblast sejtekkel stimulált lymphocyták Th2-es cytokineket termeltek, míg vetélésből származó placenták sejtjei ugyanilyen körülmények között Th1-es típusú cytokineket és immunválaszt indukáltak [12]. A cytokineket a terhesség sikeressége szempontjából is két csoportba oszthatjuk. A Th1-es típusú cytokinek (IL-2, IFN-γ, TNF-α) gyulladáskeltő hatásuk révén a terhesség megszakadásához vezethetnek ugyanis az IFN-γ Tcés NK sejteket aktivál, melyek károsíthatják a trophoblastot, illetve csökkenthetik a trophoblast növekedését elősegítő Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor (GMCSF) produkciót. Gátolják továbbá a Th2-sejtek proliferációját, ezáltal a Th2-sejtek által indukált B-sejt érést és immunglobulin termelést, továbbá kis dózisban korlátozza az intrauterin növekedést, nagyobb dózisban pedig vetélést okozhat [12]. Ezzel ellentétben a Th2-es cytokinek (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10) az erős celluláris válasz gátlása révén előnyös hatásúak a terhesség zavartalan lefolyása szempontjából. 1.3. A TIM-3 A TIM-3 (T-sejt Immunglobulin és Mucin domén-3) a TIM fehérje család tagja, melyek az I-es típusú transzmembrán proteinekhez tartoznak, N-terminális végükön egy V-ös típusú Immunglobulin (Ig) domén található, melyet egy változó hosszúságú mucin domén követ,
amelyen
különböző
számú
O-glikoziláció
található.
Az
N-glikolizáció
a
transzmembrán domén előtt lévő, úgynevezett „stalk” doménen található, míg a receptorok cytoplazmába nyúló része 38 és 65 aminosav között változik (4. ábra) [13]. Az egér genom 8 tim gént tartalmaz, ebből 4 kódol funkcionális fehérjét (tim-1-tim-4), míg a humán genomban 3 tim gén található, (tim-1, tim-3 és a tim-4), de homológ szekvenciáit megtalálták már majom és patkány genomban is [14].
11
4. ábra. A TIM-3 receptor.
A TIM-3 receptort elsőként kísérletes allergiás enkefalitisz (EAE) egérmodellben (Th1 mediálta autoimmun betegség) kezdték vizsgálni, amelyet párhuzamba lehet állítani a humán sclerosis multiplex-xel (SM) [15]. Az állatokat in vivo TIM-3 monoklonális antitestekkel (mAt) kezelve súlyosabb klinikai megbetegedést, illetve az agyban sokkal erősebb gyulladásos reakciót figyeltek meg. Nem volt azonban egyértelmű, hogy ezeket a folyamatokat az anti-TIM-3 mAt kezelés hatására az emelkedett számú aktivált macrophágok okozzák-e, elősegítve a Th1-es sejteknek az agyba való vándorlását vagy, hogy az ellenanyag blokkolja-e a receptor és a ligandja közti kapcsolat létrejöttét, ami pedig a Th1-es sejtek apoptózisát gátolja. A kísérleti eredmények alapján arra következtettek, hogy a TIM-3 szövetroncsoló gyulladásos immunválaszokban, EAE esetén egy negatív szabályzó molekula és úgy azonosították, mint egy a CD4+ Th1-es sejteken igen, de a Th2-es sejteken nem expresszálódó receptor fehérjét [16]. Ez a felvetés összhangban volt egy későbbi kutatás eredményeivel, melyek szerint TIM-3-Ig fúziós protein alkalmazása a T-sejtek hyperproliferációját eredményezte továbbá elősegítette cytokin termelésüket, gátolva ezzel a perifériás tolerancia mechanizmusok kialakulását [17]. Ugyanezen TIM-3-Ig alkalmazása genetikailag TIM-3 deficiens egereknél szintén a tolerancia mechanizmusok elmaradását eredményezte [17]. Hasonló következtetést vont le egy a témával foglalkozó másik kutatócsoport is, mely szerint autoimmun diabetes egérmodell vizsgálatakor, mikor is az egyedeken TIM-3 antitest, illetve TIM-3-Ig fúziós protein kezelést alkalmaztak és mindkét esetben a betegség súlyosbodását tapasztalták [18]. 12
Ebben a tanulmányban szerepel továbbá, hogy a TIM-3 receptor és a valószínűsíthető ligandja közti kapcsolat blokkolása szintén a tolerancia kialakulásának elmaradását idézi elő, tehát a TIM-3 és ligandja közti interakció létrejöttének gátlása ezen autoimmun betegség súlyosbodásához vezetett. Kapcsolódóan ehhez a publikációhoz Kearley és mtsai. írták le, hogy a TIM-3 receptor blokkolása a Th1-es immunválaszok up-regulációjával jár, amit pedig a Th2-es immunválaszok intenzitásának csökkenése kísér [19]. Az utóbbi évek kísérleteiből tehát egyértelműnek tűnik, hogy a TIM-3 a Th1-es immunválaszok negatív regulátora, de újabban azt is valószínűsítik, hogy a T-sejtes válaszokban bizonyos körülmények, illetve feltételek mellett pozitív szabályzó szerepe is lehet. Ugyanis a TIM-3 folyamatos expresszióját figyelték meg monocytákon, dendritikus- (DC) és mikroglia sejteken, illetve a TIM-3 ligand kötése egyaránt növelte ezen sejtek kostimulációs receptorainak expresszióját és cytokin termelését [20]. Az antigén prezentáló sejtek folyamatos, illetve az effektor Tsejtek kései, up-regulált TIM-3 expressziója lehetővé teszi, hogy a TIM-3 elősegítse egyrészt a T-sejt aktivációt és differenciációt az immunválasz korai szakaszában, másrészt pedig hogy az immunválasz kései szakaszban annak terminációjában is szerepet játsszon. Az azonban még nem teljesen világos, hogy ezek a pozitív és negatív szabályozó folyamatok milyen egyensúlyban vannak in vivo. A legtöbb TIM-3-mal foglalkozó tanulmány a T-sejtekre illetve azok funkciójára fókuszál, pedig szabályzó szerepet töltenek be egyes myeloid eredetű sejtek működésében is, például hízósejtek esetében. Egér csontvelői sejtekből képzett hízósejteken kimutatták a TIM3 expressziót, illetve ezen hízósejtek poliklonális TIM-3 antitesttel való kezelése emelkedett Th2-es cytokin illetve IgE produkciót mutatott [21]. Abból adódóan, hogy a TIM-3 a veleszületett, illetve az adaptív immunrendszer sejtjein különbözőképpen expresszálódhat képes elindítani vagy terminálni a Th1-es immunválaszokat, illetve befolyásolni számos gyulladásos folyamat kimenetelét.
13
1.4. A Galectin-9 (Gal-9) A galektinek az állati lektinek családjába tartozó molekulák, amelyek egy 130-140 aminosavnyi szénhidrát-felismerő doménen (CRD) keresztül képesek kapcsolódni a βgalaktozidhoz [22]. Szerkezetük alapján a galektin molekulákat három csoportra oszthatjuk. Az egyértékű galektineknek két azonos CRD-je van, ezáltal homológ CRD ligandok keresztkötésére képes, míg a kiméra galektinek egy CDR-vel rendelkeznek, továbbá található rajtuk egy nem- szénhidrát kötő domén is (5. ábra) [23]. A Gal-9 a kétértékű tandem repeat-et tartalmazó galektinek csoportjába sorolható, melynek van két homológ, de különböző CRDje, amelyek egy linker fehérjén keresztül kapcsolódnak össze (5. ábra). A tandem repeat-et tartalmazó galektinek N- és C-terminális régiójánál általában különböző a cukrot kötő specificitás [24].
5. ábra. A galektinek csoportosítása.
A humán Gal-9 volt az első klónozott galektin molekula, melyet egy non-Hodgkin lymphómában szenvedő betegből izoláltak [25]. Gal-9 expressziót már az adaptív immunválasz alatt a különböző, T-sejt által átjárt szövetek sejtjein is kimutattak, mint például endothélium, fibroblast vagy a tüdő epitheliális sejtjein [26], amelyből arra lehet következtetni, hogy a Gal-9 egyaránt fontos szerepet játszik veleszületett- és a szerzett immunválaszokban. A Gal-9-et először eozinofil kemoattraktánsként azonosították, ami elősegíti a szuperoxid produkciót és megnöveli a sejtek túlélését [27], ugyanakkor számos egyéb biológiai folyamatban is nagy jelentőséggel bír, úgy mint sejtadhézió, proliferáció [28], apoptózis [29], illetve a sejtciklus [30]. Bizonyítottan elősegíti a humán éretlen DC-k érését, ezáltal stimulálja a természetes immunsejteket, illetve a veleszületett immunválaszokat [31]. Nemrég megjelent publikációkban leírták, miszerint anti-metasztatikus hatással is bír bizonyos rákbetegségnél, úgy mint az emlőrák vagy az orális laphámkarcinóma [32]. Frissebb 14
eredmények szerint a Gal-9 kezelés pozitívan hatott egy indukált arthritis modellben [33], továbbá Th17-sejtek szupresszióját és a Treg sejtek up-regulációját figyelték meg EAE modellben [34]. Az eredményekből arra lehet következtetni, hogy a Gal-9 immuntoleranciát idéz elő olyan esetekben, ahol az immunválaszok túlzott mértékűek, mint pl. az autoimmun betegségeket is. Szintén bizonyítást nyert, miszerint a Gal-9 apoptózist indukál az aktivált CD4+ Th sejtekben, ami a nyugvó sejtek esetében elmarad [35]. Hasonlóan a Th1-es sejtek apoptózisát idézte elő EAE esetében is, ahol ezáltal lassult a betegség progressziója [36]. Nagahara és mtsai leírták, hogy a Gal-9 képes elősegíteni a TIM-3+ CD8+ Tc-sejtek perforin, granzyme-B, illetve IFN-γ produkcióját [37]. Tumor indukálta immunszupresszív állapotban a TIM-3/Gal-9 útvonalon keresztül antitumor aktivitása van, ugyanakkor hyperimmun feltételek mellett apoptózist idéz elő TIM-3+ Th1-es, Th17-es és CD8+ Tcsejteken [34]. Egy nemrégen megjelent publikációban Oomizu és mtsai. olyan Gal-9+ sejtpopulációt azonosítottak (Gal-9+ Th sejtek), amely összefüggésbe hozható a keringő Gal-9 molekula koncentrációjával [38]. Egyre valószínűbb, hogy a Gal-9-nek egy „termosztát” szerű, kulcsfontosságú szerepe lehet az immunológiai homeosztázis fenntartásában, ugyanis az immunrendszer túlzott működése esetén immunszupresszív, míg immunhiányos állapotban az immunológiai válaszképességet növelő hatása is bizonyított. 1.5. A TIM-3/Gal-9 interakció A Th prekurzor sejtek differenciációja T effektor sejtekké és ezek klonális expanziója rendkívül fontos az adaptív immunválaszokban, ami biztosítja a különböző pathogének és intracelluláris vírusok elleni védelmet. Viszont a Th effektor sejtek korlátlan aktivációja sok gyulladásos rendellenességhez vezet. Ilyen lehet például a reumatoid arthritis (RA), a belek gyulladásos megbetegedései (Crohn-betegség), és egyéb autoimmun rendellenességek, mint az I. típusú diabetes, a SM [39] de az allograft kilökődés is [40]. Ezzel ellentétben a Th2-es sejtek aktivációja nélkülözhetetlen az allergiás asthma pathogenezisében [41] és a transzplantációs tolerancia megszerzésében [40]. A T-sejt aktiváció mértéke és a differenciáció módja a T-sejt receptor (TCR) mediálta stimuláció erőssége és időtartama által meghatározott. Ráadásul sok egyéb molekula szabályozza a klonális expanzió és deléció mértékét, valamint az anergiát, mint például a TNF-α receptor (TNFR) az immunglobulinok (Ig), és a cytokinek közül az IL-2. Habár számos celluláris és molekuláris mechanizmus
15
ismert, melyek szabályozzák az éretlen T-sejtek aktivációját, azok a molekulák melyek meghatározhatják egy effektor T-sejt szubpopuláció sorsát, továbbra is ismeretlenek. Mint az immunglobulin szuperfamília tagja, a TIM-3 egy transzmembrán protein, melynek expresszióját elsősorban a differenciált Th1-es sejteken írták le [16]. A Gal-9-et a TIM-3 ligandjaként azonosították, melynek folyamatos expressziója T-sejtek felszínén kívül egyéb szövetekben is megfigyelhető, így a thymus, lép, máj, vese, tüdő és különböző izmokon is. Továbbá néhány gyulladáskeltő cytokin, úgy mint az IFN-γ vagy az IL-1β képesek indukálni a Gal-9 expresszióját endotheliális illetve fibroblast sejteken [42]. Úgy tűnik, hogy a Gal-9 a Th1-es lymphocytákon sejthalált idéz elő, ha a TIM-3-mal kölcsönhatásba lép, ami mind apoptózist mind nekrózist is jelenthet a kálcium-kalpainkaszpáz útvonalon keresztül (6. ábra) [36].
6. ábra. A TIM-3/Gal-9 kapcsolódás és hatásmechanizmusa [43].
1.6. A TIM-3/Gal-9 interakció vizsgálata transzplantációs kísérletekben Szervtranszplantáció során a befogadó szervezet immunrendszere az átültetett szervet idegenként ismeri fel és reagál rá [44]. Ez a graft ellen kialakuló immunválasz egy dinamikus folyamat, melyben mind citopatikus, mind toleráns aktivitások megfigyelhetőek [45]. Egyértelmű tény, hogy az akut kilökődési fázis az immunválaszok eme két ellentétes hatásának az eredménye [46], azonban ennek a mechanizmusnak a pontos folyamata még nem teljesen tisztázott. Wang és mtsai. egér bőr transzplantációs kísérletben vizsgálták a két molekula kapcsolódásának következményeit. Eredményeik azt mutatták, hogy a TIM-3/Gal-9 kapcsolat szignifikánsan gátolja az allograft kilökődését és meghosszabbítja a transzplantátum túlélését 16
in vivo. További megfigyelésük, hogy a Gal-9 kezelés dózisfüggően gátolhatja a TCR-kat in vitro, ezáltal a T-sejtek proliferációját, illetve hogy a TIM-3/Gal-9 kölcsönhatás szelektíven csökkenti a TIM-3+ Th1-es-sejtek működését, ezáltal gátolja a Th1-es immunválaszokat és így növeli a bőrtranszplantátum túlélését. Eredményeik között szerepel továbbá, hogy a Gal-9 szignifikánsan csökkenti az IFN-γ produkciót in vitro és in vivo egyaránt, a CD8+ Tc sejtek pedig jelentős alulműködést produkáltak, ha a transzplantációt követően Gal-9 kezelést alkalmaztak [47]. Egy másik kísérletben a TIM-3 és a Gal-9 jelenlétét, illetve egyéb proinflammatorikus hatást közvetítő molekula (IFN-γ, IFN-α, granzyme-B és perforin) expresszióját vizsgálták vese allograft akut kilökődési fázisában. Eredményeik alapján az akut kilökődési fázis alatt a Gal-9 kimutatható az allograft nefrektómiai mintáiból. Továbbá pozitív korrelációt találtak a Gal-9 szint és a kilökődés súlyosságával. A TIM-3 és a Gal-9 expressziós szintje szintén pozitívan korrelál, ami Gal-9 szint növekedést feltételez a cytotoxikus Th1-es immunválasz kialakulása során [48]. Jelenleg sok kutatás folyik a TIM-3/Gal-9 kölcsönhatásnak, mint szabályozó mechanizmusnak a tisztázása érdekében, beleértve a szabályozás különböző szintjeinek megértését, de még fontosabb az akut kilökődésért felelős cytotoxikus válaszok ellensúlyozása.
Ezek
ismeretében
olyan,
eddig
feltérképezetlen
immunológiai
mechanizmusok megértése lenne lehetséges, amelyek ismerete hozzájárulhat az allograftok sikeresebb túléléséhez. 1.7. A TIM-3 molekula vizsgálata humán kísérletekben A TIM-3, illetve a Gal-9 molekulák expressziós mintázatát autoimmun betegségeknél elsősorban SM-nél kutatják intenzíven. Az SM a központi idegrendszer egy definitív autoimmun betegsége, mely különböző aktív és inaktív klinikai fázisokkal, illetve a betegség lefolyása során változó Th1-es és Th2-es cytokinek termelődésével jellemezhető [49]. A TIM3 lényeges szerepet játszik a Th1-es immunválasz és a humán autoimmun betegségek szabályozásában. Anderson és mtsai. SM-ben szenvedő betegek lépéből izolált természetes és adaptív immunsejtek TIM-3 expresszióját vizsgálták. Eredményeik szerint a TIM-3 nyugalmi állapotban elsősorban a DC-ken expresszálódik, ami elősegíti a sejtek TNF-α szekrécióját. Th1-es immunválaszok során, a differenciálódott Th1-es sejteken a TIM-3 receptor nagyobb arányban expresszálódik, mint a DC-ken, ami a Gal-9 mediálta jelátviteli útvonal upregulációját eredményezi, ez pedig megnövekedett IFN-γ produkcióhoz vezet. Végül a Gal-9 TIM-3 expressziót idéz elő a Th-1-es sejteken, ami megszünteti a Th1-es immunválaszt [20]. 17
A kísérlet további részében megvizsgálták az átszűrődő monocyta és a központi idegrendszeri fehérállomány mikroglia sejtjeinek TIM-3 expresszióját, illetve hatását a sejtek cytokin termelésére SM-ban és Glioblastoma Multiforme-ban (GBM) szenvedő betegeknél. A két esetben a cytokin termelés lényegesen különbözött ugyanis, míg az IFN-γ és a TNF-α, mint a monocyták által termelt Th1-es cytokinek az SM-nél megjelentek, a GBM-nél nem. Ebből arra következtettek, hogy a központi idegrendszerben lévő mikroglia és az átszűrődő monocyták hozzájárulnak a központi idegrendszerben keletkező gyulladáshoz. Ezzel ellentétben a TIM-3 expresszió a monocytákban és a mikrogliákban szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult a GBM szövetben [20]. Egy másik kísérletben a TIM-3 receptor mRNS expresszióját vizsgálták SM-ben szenvedő betegek Th1-es sejtjein in vitro. A kvantitatív real-time PCR (RT-PCR) eredmények azt mutatják, hogy a humán Th1/Th0 sejtvonalak TIM-3 mRNS mennyisége magasabb, mint a Th2-es sejtvonalaké alátámasztva, hogy a humán Th1 és Th2-es sejtek különböző mértékben expresszálják a molekulát. A Th0 sejtek alacsonyabb TIM-3 expressziót mutattak, mint az érett Th1-es sejtek, ami fontos szerepét támasztja alá ezen sejteknek a Th1-es differenciációban. Leírták továbbá az agy-gerincvelői folyadékból izolált sejtek TIM-3 expressziója jól korrelál a különböző gyulladásos cytokinek az IFN-γ és a TNF-α termelődésével [50].
18
II. Általános célkitűzések A Pécsi Tudományegyetem Klinikai Központjának Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézetében működő Reproduktív Immunológiai kutatócsoport fő kutatási területe a terhesség során a magzattal szemben kialakuló anyai immuntolerancia mechanizmusok kialakulásának, szabályozásának és pathológiás megjelenési formáinak vizsgálata. Kutatásaim célja a feto-maternális tolerancia kialakításában részt vevő komplex immun-regulatorikus mechanizmusok felderítése, funkcionális jellemzése volt. Kutatómunkám során az említett toleranciát szabályzó folyamatokat egy új oldaláról tanulmányoztuk; egy a közelmúltban azonosított és leírt ligand-receptor páros jelenlétét és annak lehetséges funkcionális következményeit vizsgáltuk a terhesség során. A TIM-3 és a Galectin-9 molekulák immunológiai toleranciában betöltött szerepére számos nemzetközi publikáció hívja fel a figyelmet, terhességben betöltött szerepükről azonban igen kevés információval rendelkezünk. Ebből kifolyólag az alábbi kérdésekre kerestünk választ: 1. A TIM-3/Gal-9 útvonal szerepe egészséges terhességben A terhesség előremenetelével hogyan változik a TIM-3 receptor és a Gal-9 ligand sejtfelszíni kifejeződése az egyes lymphocyta szubpopulációkon terhes nők perifériás vérében? Mik a funkcionális jellemzői az egyes TIM-3+ lymphocyta szubpopulációknak: eltér-e cytotoxikus aktivitásuk, cytokintermelésük a TIM-3 negatív sejtekétől? Mutat-e időfüggő változást a szérum szolubilis Gal-9 koncentrációja a terhesség előrehaladtával? 2. A TIM-3/Gal-9 útvonal lehetséges szerepe pathológiás terhességben Mutat-e eltérést a TIM-3 és Gal-9 molekulák megoszlása, expressziója, az immunológiai eredetű pre-eclampsiás betegek perifériás vérében egészséges terhesekhez képest? Járnak-e az esetleges változások funkcionális következménnyel is? 3. TIM-3/Gal-9 útvonal prognosztikai szerepe mesterséges megtermékenyítés során Elsősorban arra kerestünk válasz, hogy változik-e az NK sejtek aránya, receptor expressziós mintázata, illetve funkciói az IVF beavatkozást követően, és ha igen, a változásoknak van-e valamilyen hatása az eljárás sikeres kimenetelére.
19
III. Anyagok és módszerek 3.1. Mintavétel Kísérleteink során perifériás vénából nyert, minimum 20 ml heparinizált vérmintából indultunk ki, melyek a betegek hozzájárulásával, a Pécsi Tudományegyetem Orvostudományi és Egészségtudományi Centrum Regionális Kutatásetikai Bizottság, illetve az Egészségügyi Tudományos Tanács Tudományos Kutatásetikai Bizottságának engedélyével (8-289/20091018 EKU) történtek.
3.2. PBMC (mononukleáris sejtek) szeparálás perifériás vérből Ficoll grádiensen A perifériás vérmintát 1:2 arányban foszfát pufferrel (PBS) felhígítottuk majd a szeparáláshoz használt Ficoll-Paque grádiens (GE Healtcare) fölé pipettáztuk. Ezt követően a mintákat 20 percen keresztül 2000 rpm-en centrifugáltuk majd a Ficoll réteg felszínén kialakult lymphocytákat és monocytákat tartalmazó gyűrűt leszívtuk és 10 percig 2000 rpmen centrifugálva mostuk. A felülúszó leöntését követően a sejteket 1 ml 10% FCS-t tartalmazó RPMI1640 (Gibco) tápfolyadékban felszuszpendáltuk majd meghatároztuk a sejtszámot.
7. ábra. PBMC szeparálása perifériás vérmintából Ficoll grádiensen.
3.3. Szeparált sejtek fagyasztása és felolvasztása A fagyasztás során a szeparált fehérvérsejteket 10 percig 2000 rpm-en centrifugáltuk, majd 500 µl hő-inaktivált humán-szérumban (BioWest) vettük fel. Ezt követően 500 µl 20%os DMSO (dimetil-szulfoxid, Sigma-Aldrich) oldatot készítettünk a humán szérummal, amit lassan cseppenként hozzáadtunk a humán-szérumban felszuszpendált lymphocytákhoz 1:1 20
arányban. A cseppenkénti hozzáadás az ozmotikus sokk és a felmelegedés okozta hőkárosodás elkerülése végett szükséges, mely a DMSO vízzel való érintkezése során következik be. A 10%-os DMSO oldatot tartalmazó humán savóban lévő sejteket 1 ml-es fagyasztó kapszulákba osztottuk szét, és felhasználásukig –80°C-on tároltuk. A minták felolvasztásakor a fagyasztókapszulát vízfürdőbe helyeztük, majd felolvadása után tartalmát azonnal a felolvasztó médiumhoz adtuk. Ezt követően a szuszpenzióból a DMSO-t kétszeri 10 perces 1500 rpm-en, tápfolyadékban történő mosással távolítottuk el. 3.4. A sejtek fenotípusos jelölése flow cytometriás méréshez A minták felolvasztását és DMSO mentesítését követően a sejteket fluorochrommal konjugáltatott monoklonális ellenanyagokkal 30 percig, sötétben jelöltük. A nem kötődött ellenanyagok és apoptotizáló sejtek eltávolítása érdekében a mintákat 2 ml PBS-ben, 5 percig, 2000 rpm-en mostuk és 1%-os paraformaldehyde (PFA)-ben fixáltuk. A mintákat +4°C-os fokos hűtőben, sötétben tároltuk a flow cytometriás analízisig. A jelölt sejteket BD FACSCalibur (BD Biosciences), illetve BD FACSCanto (BD Biosciences) flow cytométerekkel mértük, melyhez CellQuest (BD Biosciences), illetve FACSDiva V6. (BD Biosciences) szoftverek voltak rendelve, továbbá az eredmények kiértékeléséhez FCS express V3. szoftver programot használtuk. 3.5. A kísérlet során használt ellenanyagok A felszíni és intracelluláris jelölésekhez használt monoklonális ellenanyagok: fluorescein isothiocyanate (FITC)-konjugált anti-humán CD3 (BD Biosciences) FITCkonjugált anti-humán CD4 (BD Biosciences), FITC-konjugált anti-humán CD8 (BD Biosciences), FITC-konjugált anti-humán CD107a (BD Biosciences), phycoerythrin (PE)konjugált anti-humán CD160 (BD Biosciences), PE-konjugált anti-humán TIM-3 (R and D Systems), PE-konjugált anti-humán Galectin-9 (Biolegend), PE-konjugált anti-humán NKG2D (BD Biosciences), PE-konjugált anti-humán CD69 (BD Biosciences), PE-konjugált anti-humán perforin (BD Biosciences), allophycocyanin (APC)- konjugált anti-humán CD56 (BD Biosciences), APC-konjugált anti-humán CD8 (BD Biosciences), APC-konjugált antihumán TIM-3 (R and D Systems) APC-konjugált anti-humán FoxP3 (eBioscience). 3.6. Intracelluláris jelölés anti-perforinnal A felszíni jelölés és az utána lévő mosást követően a sejteket 1:10 arányban Q vízben higított BD FACSTM permeabilizáló oldatba (BD Biosciences) pipettáztuk és 10 percig 21
szobahőmérsékleten permeabilizáltuk. Az 5 perces, 2000 rpm-es mosást követően a sejteket PE-el jelölt anti-humán perforinnal jelöltük. A 30 perces sötétben való inkubálás után a sejteket 5 percig, 2000 rpm-en mostuk majd 300 µl 1% PFA-val fixáltuk és a flow cytometriás mérésig +4°C-os fokos hűtőben tároltuk. 3.7. FoxP3-at expresszáló sejtek fenotípus jelölése flow cytometriás méréshez A felszíni jelölést és az utána lévő mosást követően a sejteket a gyári diluensben 1:4 arányban higított permeabilizáló oldatban 1 órán át 4°C-on inkubáltuk. Ezt követően a sejteket kétszer 2 ml, a PBS-el 1:10 arányban higított permeabilizáló pufferrel mostuk 5 percig, 2000 rpm-en. Ezután a mintáinkat APC-el jelölt anti-humán FoxP3 antitesttel inkubáltuk, 1 órán át 4°C-on. Az inkubációt követően ismételten kétszer 5 perces mosás végeztünk 2000 rpm-en a permeabilizáló pufferrel majd a sejteket 300 µl 1% PFA-val fixáltuk és a flow cytometriás mérésig 4°C-on hűtőben tároltuk. 3.8. CD107a aktivációs marker mérése A sejtek aktivációs potenciáljának meghatározásához a CD107a receptor expresszió mérését használtuk, melyhez elsőként a sejteket 10% FCS-t, 50 µg/ml ionomycin-t (SigmaAldrich), 1 µg/ml phorbol-12-myristate-13-acetate-ot (PMA) (Sigma–Aldrich) tartalmazó tápfolyadékban szuszpendáltunk fel és 4 óráig, 37°C-on inkubáltuk anti-humán CD107a ellenanyag jelenlétében. Ezt követően a mintákat 2 ml PBS-ben, 5 percig, 2000 rpm-en centrifugáltuk majd elvégeztük a CD8+ Tc és NK sejtek fenotípusos jelölését. A mintákat +4°C-os fokos hűtőben, sötétben tároltuk a flow cytometriás analízisig.
3.9. Flow cytometria Az flow cytometria egy olyan eljárás, amely alkalmas vegyes sejtpopulációkban az egyes sejtcsoportok elkülönítésére azok nagysága és a sejtalkotók granularitása alapján, valamint sejtszinten több hullámhosszon azok fluoreszcens jeleinek detektálására.
22
8. ábra. Flow cytométer és működési elve.
Fluoreszcens festékkel jelölt sejtszuszpenziót a készülékben a köpenyfolyadék egy kapillárisban áramoltatja (8. ábra). A kapillárisban haladó sejteket, mint részecskéket a készülék nagyságtól függetlenül számlálja. Ezzel párhuzamosan hagyományos fényforrással megvilágítva a sejteket, kétféle jelet detektálunk: 1. A fény előrefelé szóródása (FSC= forward scatter): a sejtek nagyságáról ad információt. 2. A fénysugár oldalirányú szóródása (SSC= side scatter): a sejtek granularitásával arányos. Ezen jeleket két detektor érzékeli, és digitális jellé alakítja, amit egy számítógép program (BD FACS Diva V6. Software) ábrákon (dot plot) jelenít meg. Minden részecske, egy pontként (dot) jelenik meg az ábrán nagyság és granularitás szerint. Ezzel kevert sejtcsoportok (pl. perifériás vér) egyes sejttípusai külön populációkat alkotva elkülöníthetők és számuk, százalékos arányuk meghatározható. Az egyes sejtalkotók fluoreszcens jelét egyszerre több hullámhosszon mérhetjük. A készülékben elhelyezett lézerek alkalmasak adott fluoreszcens festékmolekulák gerjesztésére. A fluoreszcens festékek fényemisszióját detektorok mérik adott hullámhosszakon (FL-1, FL-2
23
FL-3, FL-4 csatornákon). A jelet átalakítva és ábrázolva lehetőség nyílik egy-sejt szinten egyszerre több molekula fluoreszcens jelének detektálására. Összefoglalásként elmondhatjuk, hogy szuszpenzióban lévő sejtek egyesével áramlanak egy megvilágított térfogatban. A megvilágítás hatására azon sejtek, melyek fluorochrommal vannak jelölve, a fény szórásán kívül még fluoreszkálnak is. Ezen optikai jeleket
megszűrve
és
összegyűjtve
számokká
alakíthatjuk,
kiértékelhetjük,
illetve
számítógépen tárolhatjuk. A jelölt sejteket olyan BD FACSCanto és BD FACSCalibur flow cytométerrel analizáltuk, melyhez BD FACSDiva V6. és CellQuest software program volt rendelve, így az eredmények elmentése és analizálása is akár rövid időn belül megoldható volt.
3.10. TIM-3+/TIM-3- NK és CD8 szubpopulációk szeparálása 3.10.1. Mágneshez kötött sejtszeparálás (MACS) A Ficoll kimosását követően a sejteket 2 ml, 4°C-os MACS pufferben (PBS 5% FCSsel kiegészítve) vettük fel és 1500 rpm-en 10 percig centrifugáltuk. A felülúszó leöntését követően a sejteket ismét 2 ml, 4°C-os MACS pufferben felvettük majd a sejt aggregátumok elkerülése végett egy előszeparáló szűrőn átszűrtük. A 10 perces, 1500 rpm-en történő mosást követően a felülúszót leöntöttük majd a sejteket mágnessel konjugáltatott anti-humán CD56 ellenanyaggal (Milteny Biotech), 20 µl/107 sejt koncentrációban, 15 percig, jégen jelöltük. Ezt követően a mintákat 2 ml, hideg MACS pufferben 10 percig, 1200 rpm-en centrifugáltuk majd 500 µl, hideg MACS pufferben szuszpendáltuk fel és pipettáztuk a pozitív szeparációs mágnes oszlopra (Milteny Biotech). A pozitív szeparáció elve alapján az antitesttel nem jelölődött CD56 negatív sejtek kötődés nélkül áthaladnak az oszlopon, míg a jelölt CD56 pozitív sejtek az ellenanyaghoz kapcsolt mágneses gyöngy segítségével mágnesoszlophoz kötődnek (9. ábra). Az oszlop háromszori átmosását követően a CD56 pozitív sejt frakciót egy erőteljes mozdulattal az oszlophoz tartozó dugattyúval oldottuk le és számoltuk meg. A visszamaradt CD56 negatív sejteket mágnessel konjugáltatott anti-humán CD8 ellenanyaggal (Milteny Biotech), 20 µl/107 sejt koncentrációban jelöltük majd az előzőekhez hasonlóan szeparáltuk a CD8 pozitív sejtpopulációt (9. ábra).
24
9. ábra. Mágneshez kötött sejt szeparálás (pozitív szeparációs elv).
A PBS-sel történő mosást követően az így kapott tiszta CD56+ szubpopulációt FITC konjugált anti-humán CD3, PE konjugált anti-humán TIM-3 és APC konjugált anti-humán CD56, míg a tiszta CD8+ sejtfrakciót PE konjugált anti-humán TIM-3 és APC konjugált antihumán CD8 antitestekkel jelöltük sötétben, szobahőmérsékleten, 30 percig. Az ezt követő mosás után a sejteket 400 µl PBS-ben vettük fel további szeparációs eljárásokhoz. 3.10.2. Fluoreszcens sejtszortolás A mágnessel szeparált majd fluoreszcensen jelölt sejteket BD FACS ARIA III (BD Biosciences) sejtsorterrel válogattuk szét TIM-3 pozitivitásuk alapján. A BD FACS Diva V6. software segítségével lehetőségünk nyílt a CD3- CD56dim TIM-3-, CD3- CD56dim TIM-3+ CD3- CD56bright TIM-3-, CD3- CD56bright TIM-3+, CD8+TIM-3- és CD8+TIM-3+ szubpopulációk különválasztására, melyeknek tisztasága minden esetben 95% felett volt. 3.11. PMA/Ionomycin kezelés A szeparált sejteket 10% FCS-t tartalmazó RPMI 1640 tápfolyadékba gyűjtöttük majd 1500 rpm-en, 10 percig mostuk. A felülúszó eltávolítását követően a sejteket a sejtszámnak megfelelően 50 µg/ml ionomycin, 1 µg/ml PMA valamint 10 % FCS-sel kiegészített RPMI 1640 tápfolyadékban szuszpendáltuk fel és overnight inkubáltuk 37°C-on. Másnap a 10 perces, 2000 rpm-en történő centrifugálás után a felülúszót összegyűjtöttük és további cytokin vizsgálat céljából -80°C-on tároltuk.
25
3.12. Termelt cytokinek meghatározása A felülúszók felolvasztását követően a jelenlévő cytokinek mennyiségét Human Th1/Th2/Th17 Cytometric Bead Array (CBA) (BD Biosciences) kittel határoztuk meg. A módszer nagy előnye, hogy minden mintából egyszerre tudtuk detektálni az IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ és IL-17A cytokineket. A CBA assay hétféle fluoreszcens festékekkel megjelölt 2-10 mikrométer átmérőjű mikrogyöngyök keverékét tartalmazza, melyek fluoreszcencia intenzitásuk alapján azonosíthatók flow cytométerben. A gyöngyök felszínére más-más cytokinre érzékeny befogó antitest van kovalensen kötve, melyek képesek detektálni a biológiai mintákban az antigént, ami jelen esetben a felülúszóban található cytokin. A detektáló antitest PE-nel konjugált, ami a keresett antigénnel immunkomplexet képez (10. ábra). Az egyes cytokinek koncentrációját a detektáló antitest gerjesztése által kiváltott fluoreszcencia intenzitása alapján BD FACSCanto flow cytométerrel határoztuk meg.
10. ábra. Cytometric Bead Array technika [51].
3.13. Szolubilis Galectin-9 meghatározása A perifériás vérből származó szérum Gal-9 szintjét szendvics enzimhez kapcsolt immunszorbens módszerrel (ELISA) határoztuk meg, melynek lényege hogy a szilárd felülethez kötött egyik komponens (ellenanyag) és az oldatban lévő másik komponens (jelen esetben a fehérje) kapcsolódását az oldott komponenshez kovalensen kötött enzim működése jelzi. Fontos, hogy a felületen több fehérje-kötőhely legyen, mint amennyi fehérje a mintában van, így minden fehérje megkötésére adott a lehetőség. Az ellenanyag és a fehérje specifikus kötésének kialakulásához meghatározott ideig inkubáltuk az elegyet, majd a rögzítetlen anyagokat kimostuk. Ezt követően egy második, specifikus enzimmel konjugáltott ellenanyag 26
hozzáadása következett, így a vizsgálandó fehérjét egy „szendvics”-komplexbe zártuk. Az antigén-fehérje kapcsolódás kimutatásához olyan kromogénre van szükség, amely az enzimreakció következtében színváltozáson megy át. Így az átalakított kromogén intenzitását megfelelő hullámhosszon ELISA plate reader spektrofotométerrel (BMG Biotech) mértük majd a kapott abszorbancia értékeket kalibrációs görbe alapján koncentrációkra számítottuk át. Ebben az esetben a mért abszorbancia a vizsgálandó fehérje (minta, antigén) koncentrációjával egyenesen arányos lesz.
3.14. Statisztika analízis Az eredmények kiértékelését, illetve a statisztikai összehasonlítást parametrikus Student t-próbával, párosított t-próbával és ANOVA teszttel, valamint non parametrikus Mann-Whitney-U teszttel végeztük SPSS V20. szoftver segítségével. A különbségeket szignifikánsnak tekintettük, ha a p-érték kisebb vagy egyenlő volt, mint 0,05.
27
IV. TIM-3 és Galectin-9 molekulák expressziójának vizsgálata különböző immunsejt szubpopulációkon egészséges terhesség három trimesztere alatt A “Peripheral Blood TIM-3 Positive NK and CD8+ T Cells throughout Pregnancy: TIM3/Galectin-9 Interaction and Its Possible Role during Pregnancy” című közlemény alapján (lásd mellékletek).
4.1. Irodalmi háttér Az NK sejtek alkotják a T- és B sejtek mellett a harmadik legnagyobb lymphocyta populációt. Ezekben a lymphocytákban nem történik meg sem az Ig-gének, sem a TCR antigénfelismerő láncait kódoló gének átrendeződése és kifejeződése, tehát a T és B lymphocytákéhoz hasonló antigénreceptoruk sincs. Az NK sejtek a veleszületett immunitás fontos effektor sejtjei, az elpusztítandó célsejtet a T és B lypmphocytáktól eltérő mechanizmusokkal ismerik fel. Egyrészt részt vesznek bizonyos típusú (elsősorban daganatos, illetve vírussal fertőzött) sejtek közvetlen elpusztításában, másrészt immunválaszt moduláló cytokineket termelnek. A humán NK sejtek a perifériás vér lymphocytáinak mintegy 10 %-át alkotják, fenotípusosan a CD56 antigén jelenléte és a CD3 antigén hiánya jellemzi őket [52],[53]. Az NK sejtek az elpusztítandó célsejtek között azok MHC-I molekulái alapján is különbséget tudnak tenni. Az NK sejtek felszínén található receptorok között vannak olyanok is, amelyek a partner-sejt MHC-I molekuláit ismerik fel. Az így létrejövő kölcsönhatás azonban nem aktiváló, hanem gátló jeleket továbbít, ezért ezeket a receptorokat killing inhibitory receptors (KIR) nevezik. A vírussal fertőzött sejtek és a daganatsejtek egyik sajátsága, hogy teljesen vagy jelentős mértékben megszűnik az MHC molekulák megjelenése e sejtek membránján. Ennek következtében a KIR „nem talál” ligandumot a partnersejt felszínén, tehát nem tud gátló jeleket továbbítani, és így a sejtpusztítást eredményező aktivációs folyamatok érvénysülnek és az NK sejt elpusztítja a vírussal fertőzött vagy daganatsejtet. A CD56 sejtfelszíni receptor denzitásától függően két további csoportra oszthatók, mely felosztás úgy tűnik, egyúttal funkcióbeli különbséget is jelent. A humán NK sejtek mintegy 90%-a kisebb mennyiségben hordoz a felszínén CD56 antigént (NKdim sejtek), mint a többi 10% (NKbright sejtek). Több megfigyelés is támogatja azt az elképzelést, mely szerint a NKdim sejtek végzik elsősorban a cytotoxikus sejtfunkciókat. Ezek a NKdim sejtek cytotoxikusabbak NK érzékeny target sejtekkel szemben, mint a NKbright sejtek. Továbbá konjugációs képességük is a megfelelő target sejttel szemben kétszerese a NKbright sejtekének, 28
ezen kívül mintegy tízszer annyi cytotoxikus enzimet tartalmaznak granulumaikban, ami sokkal hatékonyabb cytolízist tesz lehetővé. Ugyanakkor viszont a NKbright sejtek különböző stimulusokra szignifikánsan nagyobb arányban termelnek cytokineket [54]. Valószínűsíthető, hogy a NKbright sejtek specializálódott NK sejtek, melyek az immunológiai mechanizmusokat inkább a cytokin termelésükkel, mint cytotoxikus potenciáljukkal befolyásolják. Az NK sejtek nemcsak a daganatos sejtek és különböző kórokozók elleni harcban játszanak fontos szerepet, hanem meghatározó jelentőségük van a terhesség alatt is. A bevezetőben részletes bemutatásra került a deciduális NK sejtek és az immunológiailag kiemelten fontos trophoblast továbbá a trophoblaston expresszálódó HLA-G és HLA-E molekulák közötti kapcsolat, illetve szerepük a terhesség szempontjából fontos intrauterinális immunológiai mikrokörnyezet kialakításában. Korábban a bevezetőben említésre került, hogy a TIM-3 és a Gal-9 interakciója a receptort expresszáló CD4+ Th sejt apoptózisát idézi elő [36]. Ezek alapján azt feltételezhetjük, hogy a TIM-3 képes módosítani a Th1/Th2-es egyensúlyt, továbbá az a tény, hogy a TIM-3 expresszióját sikerült kimutatni DC-ken, valószínűsíti szerepüket a természetes immunválaszok kialakulásában [55]. A TIM-3 receptor sok jellemzője párhuzamba állítható a terhesség során létrejövő Th1/Th2-es cytokin eltolódással, illetve a veleszületett immunrendszer aktiválódásával. Ebből a nézőpontból lehetséges, hogy a TIM-3 szerepet játszhat a szisztémás immunológiai védelmi válaszokban a terhesség alatt, úgy, hogy mind a veleszületett, mind a szerzett immunrendszert szabályozni képes. Nagyon kevés kísérlet vizsgálta eddig a TIM-3-nak, illetve ligandjának, a Gal-9-nek a kifejeződését, illetve interakciójuk funkcionális következményeinek hatását a terhesség során. Egy nemrég publikált tanulmány syngén és allogén vemhes egérmodelleket hasonlított össze, a veleszületett immunrendszer sejtjeinek TIM-3 receptor expressziója alapján. Kísérletük során kimutatták a TIM-3 molekulát a 10,5 napos allogén vemhes állat uterusában, továbbá összehasonlították az uterinális DC és makrophágok TIM-3 expresszióját különböző terhességi korokban. TIM-3 blokkoló antitestet használva vizsgálták a molekula szerepét az anyai immuntolerancia kialakulásában. Eredményeik szerint allogén terhesség esetén a TIM-3 receptor blokkolása szignifikánsan csökkentette az alom egyedeinek számát továbbá ezzel párhuzamosan pedig növelte a foetalis resorpciók arányát [56]. Egy másik a TIM-3 receptort a terhesség során vizsgáló tanulmányban szintén a természetes immunrendszer sejtjeinek TIM-3 expresszióját, illetve hatását elemezték humán terhesség alatt. A publikált eredmények szerint a TIM-3 molekula up-regulációja figyelhető 29
meg a terhes anya veleszületett immunsejtjein, elsősorban a DC-ken, ami elősegítheti a természetes és az adaptív immunrendszer válaszreakcióit, továbbá feltételezik, hogy a terhesség során fellépő megváltozott TIM-3 szint károsan hathat a terhességre [57]. Ezen eredmények alapján azt mondhatjuk, hogy a TIM-3 egy potenciális jelzőmolekula lehet, mellyel talán előre megjósolható egyes, a terhesség során fellépő pathológiás elváltozások bekövetkezése. Érdekes eredményeket hozott a Gal-9 génexpresszió összehasonlító vizsgálata egészséges vemhes és spontán vetélés egérmodelljei között különböző terhességi korokban. Huesschen és mtsai. igazolták, hogy a 7,5 napos egér decidua Gal-9 mRNS szintje megemelkedik a terhesség 13,5 napjára a vizsgált állatmodelleken. Immunhisztokémiai módszerrel kimutatták továbbá, hogy a Gal-9-et expresszáló sejtek szignifikánsan nagyobb arányban vannak jelen a spontán vetélő állat deciduájában mint az egészséges terhes állatéban [58]. A fenti irodalmi adatokból egyértelműen látszik, hogy a receptor ligand kapcsolat lényeges szerepet tölthet be a terhesség során megváltozott immunológiai folyamatokban. Jelenleg egy olyan tanulmány sem készült, amely egy kontextusban vizsgálná TIM-3 receptort és a Gal-9 ligandot a terhesség viszonylatában. 4.2. Célkitűzések Tekintve, hogy az irodalom rendkívül kevés adattal rendelkezik a TIM-3 és a Gal-9 terhességben betöltött szerepéről, jelen kutatásunk céljául tűztük ki ezen molekulák vizsgálatát egészséges humán terhesség ideje alatt. Perifériás vérből izolált mononukleáris sejtek fenotípusos elemzését, valamint az egyes sejtpopulációk TIM-3 és Gal-9 expressziójának összehasonlítását terveztük a különböző terhességi trimeszterek alatt, illetve nem terhes kontroll mintákban. Funkcionális tesztekkel elemeztük az egyes szubpopulációk terhesség alatti cytotoxikus aktivitását és cytokin termelését, továbbá ELISA módszerrel a szérumok Gal-9 szintjét vizsgáltuk.
30
4.3. Donorok, mintavétel Kísérletünkbe 87 nőt vontunk be, melyből 16 a terhesség első trimeszteri, 19 a második trimeszteri és 22 a terhesség harmadik trimeszteri fázisában volt. A kontroll csoportot 30 egészséges, nem terhes nő alkotta. A kísérlethez szükséges minták az első trimeszter esetében 11-16-ik hét között, a második trimeszter esetében 24-28-ik hét között, illetve a harmadik trimeszter esetében a 3538-ik hét között lettek levéve. Nem terhes
1 trimeszter
2 trimeszter
3 trimeszter
Betegek száma
30
16
19
22
Életkor (évek)
33 (19-44)
31 (27-35)
32 (26-45)
33 (28-43)
-
38,8
38,0
39,0
Graviditás
1,5
1,2
1,9
1,7
Paritás
1,0
0,4
0,7
0,5
Szülési terhességi hét
1. táblázat. A kísérletben részt vevő nők demográfiai és nőgyógyászati adatai (átlag értékek).
4.4. Eredmények 4.4.1. Egészséges terhesség három trimeszteréből származó, illetve nem terhes kontroll nők mononukleáris sejtjeinek fenotípusos analízise Részletesen elemeztük a CD3+ T sejteket, ezen belül a CD4+ Th, CD8+ Tc szubpopulációkat, az NK (CD3- CD56+) sejteket és azok NKdim- és NKbright szubpopulációit, továbbá az NKT (CD3+ CD56+)- valamint a Gal-9+ Th sejtek megoszlását egészséges terhesség három trimeszterében, illetve nem terhes kontroll mintákban (2. táblázat). Összehasonlítva a CD3+ T-, CD4+ Th-, CD8+ Tc-, NKT-, valamint az NK sejteket és szubpopulációinak megoszlását nem találtunk szignifikáns különbséget a három trimeszter, illetve a kontroll minták között. Az NK sejtek azon belül is a NKdim populáció aránya magasabb míg a NKbright populáció aránya alacsonyabb volt a kontroll csoport mintáiban összehasonlítva a különböző trimeszter mintáival, a különbségek nem érték el a statisztikai szintet (2. táblázat). Elemezve az Oomizu és mtsai által leírt Gal-9+ Th sejtpopulációt kimutattuk, hogy a nem terhes mintákban 0,97% ezen sejtek aránya, illetve, hogy a terhesség előrehaladtával a 31
sejtek száma emelkedő tendenciát mutat. A harmadik trimeszteri nőkben 2,39% a Gal-9+ Th sejtek aránya, amely érték szignifikánsan magasabb, mint az első, illetve a második trimeszterben és a nem terhes kontroll nőkben mért értékeknél (11. ábra).
Nem terhes
1. 2. 3. trimeszter trimeszter trimeszter
p-érték
CD3+ T sejt
66,64±2,23
65,10±3,27
69,43±3,33
67,74±1,34
NS
CD4+ Th sejt
44,04±2,32
39,92±2,28
45,68±3,47
39,03±2,60
NS
CD8+ Tc sejt
32,02±1,51
35,25±1,53
28,98±2,67
34,31±2,41
NS
CD8+ TIM-3+ Tc sejt
5,59±0,83
6,0±0,89
4,36±0,88
5,97±0,50
NS
NK sejt
13,65±1,38
12,31±1,85
10,69±1,74
11,47±1,53
NS
NKdim sejt
12,72±1,31
10,56±1,75
9,29±1,69
9,74±1,39
NS
NKbright sejt
1,03±0,24
1,80±0,29
1,44±0,30
1,76±0,24
NS
TIM-3+ NK sejt
9,61±1,41
9,16±1,53
7,34±1,30
9,05±1,30
NS
TIM-3+ NKdim sejt
9,02±1,38
8,10±1,42
6,49±1,25
8,07±1,23
NS
TIM-3+ NKbright sejt
0,61±0,18
1,11±0,22
0,93±0,24
1,11±0,17
NS
NKT sejt
4,08±0,75
6,37±1,21
4,70±0,98
5,46±1,26
NS
2. táblázat. Mononukleáris sejtek fenotípusos analízise egészséges terhesség három trimeszteri és nem terhes kontroll mintáiból. Átlag ± SEM, ANOVA teszt, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns. NT: nem terhes.
32
11. ábra. Gal-9+ Th sejtek fenotípusos analízise egészséges terhesség három trimeszteri és nem terhes kontroll mintáiból. Medián + interkvartilis + alsó/felső kvartilis terjedelem. ANOVA teszt, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05.
4.4.2. CD3+ T, CD4+ Th, CD8+ Tc, NKT, NK és NK sejt szubpopulációk TIM-3 molekula expressziójának meghatározása flow cytometriás analízissel Eredményeink alapján egészséges terhesség alatt az NK sejtek és azon belül a NKdim szubpopuláció expresszálja legnagyobb arányban a TIM-3-at míg az NKbright szubpopuláció, a CD8+ Tc, és a CD4+ Th sejtek receptor expressziójának szintje alacsonyabbnak bizonyult. Megvizsgálva a CD3+ T sejteket, a TIM-3 receptor kifejeződése a harmadik trimeszteri mintákban szignifikánsan magasabb, mint a többi vizsgált csoportban (nincs ábrázolva). A CD8+ Tc sejtek esetében egy receptor expresszió csökkenést mértünk a második trimeszteri nőknél a többi vizsgált mintához képest, ez azonban nem érte el a szignifikáns szintet (12/A. ábra). NK sejtek esetében a harmadik trimeszteri nők NK sejtjeinek TIM-3 expressziója szignifikánsan magasabb volt a második trimeszteri csoporténál (12/B. ábra). Elemezve az NK sejt szubpopulációkat a harmadik trimeszteri NKdim sejtek szignifikánsan nagyobb arányban fejezik ki a receptort, mint az első és második trimeszterből származó, illetve a kontroll minták NKdim sejtjei, míg a NKbright szubpopuláció esetében a kontroll mintákhoz képest emelkedik a TIM-3 expressziója, ami az egész terhesség alatt
33
megfigyelhető (12/B ábra). Az NKT sejtek TIM-3 expressziójában nem találtunk szignifikáns különbséget a vizsgált csoportok között (nincs ábrázolva).
12. ábra. CD8+ Tc, CD4+ Th, NK és NK sejt szubpopulációk TIM-3 expressziójának összehasonlítása egészséges terhesség három trimesztere alatt és nem terhes kontroll mintákban. Medián + interkvartilis + alsó/felső kvartilis terjedelem. ANOVA teszt, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05.
34
4.4.3. TIM-3 receptort expresszáló, illetve nem expresszáló perifériás CD8+ Tc, NKdim és NKbright sejtek cytokin termelésének összehasonlítása Th1, Th2 és Th17-es cytokineket CBA módszerrel analizáltuk, amely során az IL-4, IL-6, IL-10- és az NK sejtek esetében az IL-17 cytokin koncentráció a kimutathatósági határ alatt maradtak. Méréseink során kimutattuk, hogy a TIM-3+ CD8+ Tc sejtek szignifikánsan kisebb mennyiségben termeltek pro-inflammatorikus (IL-2, TNF-α és IFN-γ) és Th17-es cytokineket összehasonlítva a TIM-3 negatív CD8+ Tc sejtekkel az első és a harmadik trimeszterben, valamint a nem terhes kontroll mintákban (3. táblázat). Szintén szignifikáns csökkenést tapasztaltunk az TIM-3+ NKdim sejtek esetében az IL2 termelést illetően összehasonlítva a TIM-3 negatív NKdim sejtekkel az első és második trimeszter mintáiban (3. táblázat). Érdekes eredményeket mértünk a NKbright sejtek cytokin termelését analizálva ugyanis a TIM-3+ NKbright szubpopuláció szignifikánsan nagyobb mennyiségű IFN-γ cytokint termelt a terhesség második trimeszterében, mint a TIM-3 negatív NKbright szubpopuláció (3. táblázat). Nem terhes
pg/ml NK dim sejtek NK bright sejtek CD8 T sejtek
* ** *** $ $$ $$$
1. trimeszter
2. trimeszter
3. trimeszter
TIM-3+
TIM-3-
p
TIM-3+
TIM-3-
p
TIM-3+
TIM-3-
p
TIM-3+
TIM-3-
p
IL-2
9,18
117,18
NS
9,53
62,95
<0,04
9,25
17,17
<0,01
9,23
80,71
NS
TNF-α IFN-γ IL-17
1625,01
2157,81
NS
1820,63
2278,48
NS
104,75**
793,57
NS
439,75**
403,62
NS
2010,29
2172,1
NS
3095,85
3516,78
NS
218,03**
1095,87
NS
816,23***
696,77$
NS
<min
<min
NS
<min
<min
NS
<min
<min
NS
<min
<min
NS
IL-2
20,97
114,27
NS
13,25
39,99
NS
14
12,78
NS
12,93
50,89
NS
TNF-α IFN-γ IL-17
1211,37
1786,06
NS
1036,76
1315,13
NS
641,82
461,83
NS
1188,97
1046,67
NS
1961,81
3513,19
NS
2656,23
2543,13
NS
1632,29
979,18
<0,04
1894,9
2136,18
NS
<min
<min
NS
<min
<min
NS
<min
<min
NS
<min
<min
NS
IL-2
3076,06
6400,32
<0,05
2463,73
7812,88
<0,01
687,87
1276,9*
NS
2587,58
7471,57
<0,03
TNF-α IFN-γ IL-17
1385,92
6064,46
<0,01
1217,89
6654,4
<0,01
356,7
1468,89$
NS
861,61
3427,65
<0,01
3455,09
5750,34
NS
4223,87
6306,06
<0,05
908,5$$$
2093$$
NS
2364,49
4851,96
<0,04
17,33
345,2
<0,04
16,93
247,9
<0,05
9,83
11,49
NS
20,83
257,01
<0,04
Szig különbség: Nem terhes; 1. és 3. trimesztertől (p<0,01) Szig különbség: Nem terhes és 1. trimesztertől (p<0,01) Szig különbség: Nem terhestől (p<0,05);1. trimesztertől (p<0,01) Szig különbség: 1. trimesztertől (p<0,01) Szig különbség: 1. trimesztertől (p<0,04) Szig különbség: Nem terhestől (p<0,03);1. trimesztertől (p<0,05)
3. táblázat. TIM-3+/TIM-3- CD8+ Tc, illetve NKdim és NKbright sejtek cytokin termelésének összehasonlítása egészséges terhesség három trimesztere alatt és nem terhes kontroll mintákban. Átlag, ANOVA teszt, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.
35
4.4.4. TIM-3 receptort exprersszáló CD8+ Tc, NK és NK sejt szubpopulációk cytotoxikus aktivitásának meghatározása a terhességi trimeszterekben és nem terhes kontroll mintákban Vizsgálva a cytotoxikus aktivitással korreláló CD107a molekula kifejeződését a harmadik trimeszter TIM-3+ CD8+ Tc sejtjei szignifikánsan nagyobb mennyiségben expresszálják, mint a terhesség többi trimeszteréből származó, illetve a nem terhes kontroll minták (13/A ábra). Figyelemre méltó eredmény továbbá, hogy a harmadik trimeszteri TIM3+ CD8+ Tc sejtek CD107a szintje szignifikánsan magasabb összehasonlítva a TIM-3 negatív CD8+ Tc sejtekkel (13/A ábra). A TIM-3+ NK sejtek cytotoxikus aktivitása a harmadik trimeszterben szignifikáns emelkedést mutat, mint az első trimeszterben és a nem terhes mintákban (13/B ábra). Összehasonlítva a TIM-3 receptort kifejező és nem kifejező sejtek CD107a expresszióját minden vizsgált csoportban a TIM-3 negatív sejtek cytotoxikus aktivitása mutatkozott magasabbnak (13/B ábra). Az NKdim szubpopuláció cytotoxicitása hasonló mintázatot mutat, mint az NK sejteké, mely szerint a CD107a expresszió a harmadik trimeszterben szignifikánsan magasabb, mint az első trimeszterben és a nem terhes mintákban (14/A ábra). A vizsgált csoportok NKbright sejtjeinek cytotoxikus aktivitásában szignifikáns különbséget nem tapasztaltunk (14/B ábra). Összehasonlítva az NK sejt szubpopulációk TIM-3 pozitív és TIM-3 negatív sejtpopulációit érdekes eredményeket kaptunk, amely szerint a TIM-3+ NKdim szubpopuláció cytotoxikus aktivitása összes vizsgált csoportban szignifikánsan alacsonyabb, mint a TIM-3 receptort nem expresszáló NKdim szubpopulációkéval (14/A ábra). Az NKbright sejtek vizsgálata során a nem terhes minták TIM-3 negatív szubpopulációjában szignifikánsan emelkedett értéket mértünk a TIM-3 pozitív populációhoz viszonyítva. (14/B ábra).
36
13. ábra. TIM-3+/TIM-3- CD8+ Tc és NK sejtpopulációk CD107a expressziójának összehasonlítása egészséges terhesség három trimesztere alatt és nem terhes kontroll mintákban. Medián + interkvartilis + alsó/felső kvartilis terjedelem. ANOVA teszt, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05.
37
14. ábra. TIM-3+ és TIM-3- NKdim és NKbright szubpopulációk CD107a expressziójának összehasonlítása egészséges terhesség három trimesztere alatt és nem terhes kontroll mintákban. Medián + interkvartilis + alsó/felső kvartilis terjedelem. ANOVA teszt, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05.
38
4.4.5. Szérum szolubilis Gal-9 molekula összehasonlítása a terhesség három trimeszterében és nem terhes mintákban Megvizsgálva a szérum Gal-9 molekula koncentrációját, a nem terhes kontroll mintákban szignifikánsan alacsonyabb értéket mutattunk ki, mint a trimeszterek mintáiban (15. ábra). Összehasonlítva egymással a terhességi trimesztereket a második és harmadik trimeszterben mért keringő Gal-9 molekula szignifikánsan nagyobb koncentrációban van jelen, mint az első trimeszterben (15. ábra).
15. ábra. Szolubilis Gal-9 molekula koncentrációjának összehasonlítása egészséges terhesség három trimesztere alatt és nem terhes kontroll mintákban. Medián + interkvartilis + alsó/felső kvartilis terjedelem. ANOVA teszt, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05.
39
4.5. Megbeszélés Az anyai immunrendszer már a terhesség elején igen komoly változásokon esik át, melyek a fejlődő magzat védelmét szolgálják az anya immunválaszaival szemben. Egyre több kutatás bizonyítja, hogy a TIM fehérjecsalád tagjai az immunválaszok egyik központi szabályzói, pleiotropikus hatásuk a reproduktív immunológiában azonban igen kevéssé ismert. Kísérleti eredmények igazolták, hogy a Gal-9 ligandnak kapcsolódva a TIM-3+ sejtekkel immunmoduláló hatása van, ami a Th1-es sejtek apoptózisához, valamint számos cytokin termelődésének megváltozásához vezet. Számos publikáció leírta, hogy a receptor ligand interakció többek között a T sejtek IFN-γ termelésének csökkenéséhez vezet, illetve befolyásolja a T sejtes tolerancia mechanizmusok kialakulását is [17],[18]. Funkcionális tesztjeink során kimutattuk, hogy a TIM-3 receptort expresszáló CD8+ Tc sejtek szignifikánsan alacsonyabb mennyiségű pro-inflammatorikus és Th17-es cytokineket
termelnek
összehasonlítva
a
TIM-3-at
nem
expressszáló
CD8+
Tc
sejtpopulációval az első- és a harmadik trimeszteri terhes valamint a nem terhes kontroll mintákban. Véleményünk szerint a terhesség során az emelkedő koncentrációjú szolubilis Gal-9 kapcsolódva a CD8+ Tc sejtek TIM-3 receptorával gátolhatja ezt a pro-inflammatorikus cytokin produkciót, ami hozzájárulhat a Th1 és Th17-es immunválaszok downregulációjához. Ezen eredményeinkre alapozva feltételezzük, hogy a Gal-9 képes szabályozni a TIM-3+ CD8+ Tc sejtek cytokin termelését így pedig az immunválaszok Th2-es irányba való eltolódásában is szerepet játszhat. Megvizsgálva a TIM-3+ CD8+ Tc sejtek arányát és cytotoxikus aktivitását a különböző terhességi korú nőknél az első és második trimeszterben nem tapasztaltunk változást. Véleményünk szerint ez a TIM-3 negatív CD8+ Tc sejtekével megegyező cytotoxikus aktivitás igazolhatja, hogy a TIM-3+ CD8+ Tc sejtek továbbra is részt vesznek a pathogének elleni cytotoxikus immunválaszokban, de csökkent cytokin produkciójuk révén hozzájárulhatnak a terhesség fenntartásához is az első két trimeszterben. Ezzel ellentétben, a TIM-3+ CD8+ Tc sejtek száma nem szignifikánsan emelkedik a harmadik trimeszterben összehasonlítva a második trimeszter értékével, továbbá ezek a harmadik trimeszteri TIM-3+ CD8+ Tc sejtek szignifikánsan nagyobb cytotoxikus aktivitást mutatnak, mint az összes többi csoportban vizsgált szubpopuláció. Ismert tény, hogy a szülés immunológiai fázisában pro-imflammatorikus immunválaszok kerülnek túlsúlyba [59] [60], fenti eredményeinkből pedig arra következtetünk, hogy a harmadik trimeszteri emelkedett cytotoxicitású TIM-3+ CD8+ Tc sejtek részesei ezen folyamatoknak . 40
A különböző perifériás vagy deciduális NK sejtek és paramétereik beleértve a sejtek és a szubpopulációk száma, aránya, cytotoxikus aktivitása, cytokin termelése vagy a különböző aktiváló és gátló receptorok fehérje és génexpressziója intenzíven kutatott terület, azonban a perifériás TIM-3 receptort expresszáló NK sejteket a terhességet végigkövetően elsőként kutatócsoportunk vizsgálta. Az NK sejtek megfelelő szabályzása nélkülözhetetlen a terhesség sikeres kiviseléséhez. Irodalmi adatok támasztják alá, miszerint a perifériás vérben lévő NK sejtek száma szignifikánsan nem változik a terhesség alatt, de a nem terhes kontroll mintákhoz képest sem [61]. Kísérletünk során az NK sejteknél és a cytotoxikus NKdim szubpopulációnál egy szignifikánsan emelkedett TIM-3 receptor expressziót mutattunk ki a harmadik trimeszter mintáiban, összehasonlítva a második trimeszterrel, míg az NKbright szubpopulációnál különbséget nem mértünk. Vizsgálva az NK sejtek és szubpopulációik Th1, Th2 és Th17-es cytokin termelését markáns különbségeket nem találtunk a TIM-3 pozitív és TIM-3 negatív alpopulációk összehasonlításakor. Ugyanakkor az első és második trimeszteri TIM-3+ NKdim sejtek szignifikánsan kevesebb IL-2 cytokint termeltek, mint a TIM-3 negatív NKdim sejtek. További különbséget mértünk a TIM-3+ NKbright sejtek IFN-γ termelését illetően, amely szignifikánsan magasabbnak mutatkozott összehasonlítva a TIM-3- NKbright sejteknél a második trimeszteri mintákban. Eredményeink alapján arra következtetünk, hogy a TIM-3+ NK sejtek, illetve a keringő vagy membránhoz kötött Gal-9 közötti kapcsolat magyarázhatja az első és második trimeszterben a periférián mért csökkent cytotoxikus aktivitást, azonban egy nemrég megjelent publikáció a Gal-9-nek ezt a hatását egy TIM-3 receptor független útvonalon értelmezi [62]. Az anyai immuntolerancia kialakításában és fenntartásában szerepet játszó sejtpopulációk megfelelő működéséhez számos molekula hozzájárul. Egyre növekvő számú publikáció valószínűsíti a galektin molekulák fontos szabályzó szerepét a terhesség alatt [63],[64]. Számottevő irodalmi adat utal a Gal-9 komplex immunmoduláló szerepére mind a veleszületett mind a szerzett immunválaszokban [65], amely számos immunsejtet érint. Általánosságban elmondható, hogy a Gal-9-nek a veleszületett immunválaszok aktiválásában [66],[67], illetve a Th1 és Th17 válaszok downregulálásában tulajdonítanak szerepet [34]. Legújabb kutatások szerint a Gal-9-nek egy NK sejt szabályzó és CD8+ Tc gátló hatása is 41
lehet, valamint képes elősegíti a Th2-es sejtek migrációját és a Treg sejtek expanzióját, azonban terhességben ezek az eredmények még nem bizonyítottak. A Gal-9 tehát szabályozhatja az NK és CD8+ Tc sejtek funkcióit a terhesség alatt, ez azonban függ a terhességi kortól, a gyulladásos hatásoktól és a sejtek relatív receptor expressziójától. Eddig is ismert volt a Gal-9 jelenléte az anya-magzat határfelületen [68],[69], de nemcsak a placenta expresszálja a ligandot, hanem egy a perifériás vérben található sejtpopuláció is, a Gal-9+ Th sejtek. Kutatócsoportunk elsőként igazolta, hogy a terhes nők szérumában igen magas koncentrációban található a Gal-9 molekula, összehasonlítva a nem terhes mintákkal.
Megvizsgálva a szérum Gal-9 szintet a különböző terhességi
trimeszterekben egy emelkedő tendenciát mutattunk ki, szignifikáns különbséggel a második és harmadik trimeszterben összehasonlítva az első trimeszteri és nem terhes mintákkal, továbbá ezen eredményekkel párhuzamosan emelkedik a Gal-9+ Th sejtek aránya is a perifériás vérben. Véleményünk szerint ez lehet az egyik sejtpopuláció, amely Gal-9 szekréciójával meghatározza a terhes nők perifériás vér szérumának Gal-9 szintjét. Jelenleg ismeretlen a Gal-9 molekula egészséges terhességben betöltött szerepe. A különböző terhességi trimeszterekből és nem terhes kontroll mintákból mért szérum Gal-9 szint alapján feltételezhető lenne, hogy az terhesség előrehaladtával az egyre nagyobb mennyiségben jelenlévő molekula a terhességre pozitív hatással van. Eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy terhesség során a Gal-9 különböző módokon befolyásolja a periférián a CD8+ Tc és NK sejtek működését. Feltételezzük, hogy egészséges terhesség során az emelkedő szérum Gal-9 szint eredményezi TIM-3+ CD8+ Tc sejtek csökkent pro-inflammatorikus cytokin produkcióját, valamint a TIM-3+ NK és NKdim sejtek csökkent cytotoxikus aktivitását. Ismert tény, hogy a TIM-3-nak szerepet tulajdonítanak az immuntolerancia kialakulásában [17], ezen tény és eredményeink tudatában valószínűsítjük a különböző immunsejteken széles körben expresszálódó receptor szabályzó funkcióját terhesség során. Kísérleteink eredményei alapján elmondhatjuk, hogy a TIM-3 és Gal-9 molekulák sejtfüggően képesek befolyásolni a CD8+ Tc és NK sejtek működését a terhesség alatt. A periférián mért konzekvens eredményeink bizonyításához azonban további vizsgálatok szükségesek, melyek tisztázhatják a TIM-3/Gal-9 útvonal szerepét az anya-magzat határfelületen is.
42
V. TIM-3 és Galectin-9 molekulák összehasonlító vizsgálata egészséges terhességben és early-onset pre-eclampsiában Az “Involvement of Galectin-9/TIM-3 Pathway in the Systemic Inflammatory Response in Early-Onset Preeclampsia” című közlemény alapján (lásd mellékletek).
5.1. Irodalmi háttér A pre-eclampsia (terhességi toxémia) egy gyakori és súlyos humán terhesség specifikus megbetegedés, amely a terhességek 3-5%-át érinti [70]. Általában a terhesség második felében, 20. gesztációs hét után jelentkeznek klasszikus tünetei, a 160 Hgmm-nél magasabb szisztolés vagy 90 Hgmm-nél magasabb diasztolés vérnyomás, a napi 5 grammnál nagyobb mennyiségben ürített fehérje, illetve az ödéma kialakulása [71]. A kórkép diagnózisát csak a klinikai tünetek megjelenése után tudják felállítani, azonban a preeclampsia a legújabb kutatások szerint az implantációval összefüggő képet mutató betegség. Az implantáció során a trophoblast sejtjeinek endometriumba történő inváziója figyelhető meg, melynek során a méhfal spirális artériáinak módosítása (kolonizációja) a cél, hiszen az embriónak közvetve, a placentán keresztül kell bekapcsolódnia az anyai vérkeringésbe, hogy fejlődése biztosított legyen a terhesség során. Az implantáció végső lépéseként a trophoblast sejtek megváltoztatják a méh keringését. A jelenlegi hipotézis szerint a trophoblast sejtek nem megfelelő inváziója okozhatja a lokális anyai immunválaszokhoz való elégtelen alkalmazkodást pre-eclampsia során [72],[73]. A magzat immunológiai felismerése, illetve az ez által
kialakuló anyai
immuntolerancia nem csak az embrió beágyazódása vagy kilökődése miatt lényeges, hanem a kezdődő implantáció és placentáció szempontjából is fontos. Az extravillosus trophoblaston expresszálódó polimorf apai antigének az anyai deciduális szövetben inflammatorikus természetű immunválaszokat idéznek elő, amely így alkalmassá válik a trophoblast sejtek általi inváziós folyamatokhoz és a spirális artériák kialakulásához. Későbbiekben az apai monomorf antigének a lokális anyai immunválaszok általi felismerése fogja limitálni a placentáció mélységét [74],[75]. Pre-eclampsia során ez a trophoblast invázió zavart szenved, ami placentáció zavarához, illetve alacsony méretű és tömegű méhlepény kialakuláshoz vezet [76],[77]. Amint a magzat fejlődése felgyorsul (általában a 20. hét után) a kis méretű placentát és funkcióját kompenzálni kell, ami a pre-eclampsia tüneteinek megjelenéséhez vezet. A hypoxiás és oxidatívan stresszelt placenta ezen kompenzációs mechanizmusok ellenére is különböző intrinsic (syncytiotrophoblast mikrovezikula (STBM), anti-angiogenetikus faktorok) faktorokat termel és jutatt a keringésbe [78]–[82]. A csökkent méretű placenta által 43
termelt és keringésbe jutatott STBM szerepet játszik a pro-inflammatorikus immunválaszok létrejöttében továbbá TNF-α [83],[84], IL-6 [85] és IFN-γ [86] szekréciót idéz elő, ami hozzájárul a Th1-es immunválaszok túlsúlyának kialakulásához [87]. A betegség klinikai megnyilvánulásának hátterében egy szisztémás gyulladásos immunválasz, illetve endotheliális diszfunkció áll [88]. Kutatócsoportunk
egy
korábbi
munkájában
részletesen
vizsgálta
a
kórkép
pathogenezisét és a veleszületett immunrendszer kapcsolatát, amely során a perifériás γ/δ Tés invariáns NKT (iNKT) sejtek egy emelkedett cytotoxikus aktivitást mutattak, ami együtt járt az NK sejtek megváltozott aktiváló és gátló receptor expressziós mintázataival [89]. A jelenlegi elgondolás szerint a pre-eclampsiás betegeket a tünetek megjelenése alapján early (34. hét előtti) és late (34. hét utáni) csoportba osztják [73]. A különbség a két pathológiás állapot között a nem megfelelő placentáció kialakulásának oka. Az early-onset pre-eclampsiát szokás „igazi pre-eclampsiának” nevezni, melynek pathomechanizmusát feljebb tárgyaltam. Ellenben a late-onset pre-eclampsiás betegeknél az anya egy meglévő kórképe (pl. diabetes mellitus, anémia, hegyi betegség) miatt kialakult hypoxia és mikrovaszkuláris megbetegedés kompenzálására nagyobbodik meg a placenta, ami produkálja az early-onset tüneteihez hasonló állapotot [73].
5.2. Célkitűzések A fenti előzmények tükrében vizsgálataink céljául early-onset pre-eclampsiás betegek és harmadik trimeszteri kontroll donorok perifériás véréből izolált mononukleáris sejtek flow cytometriás analízisét tűztük ki. Részletesen kívántuk vizsgálni a különböző immunsejt szubpopulációk fenotípusos megoszlását, továbbá ezen sejtek TIM-3 receptor és Gal-9 ligand expresszióját. A sejtek cytotoxikus aktivitásának meghatározását a CD107a molekula expressziós szintjének mérésével kívántuk elemezni.
5.3. Donorok, mintavétel Kísérletünk során 27 early-onset a terhességi pre-eclampsia tüneteit (magas vérnyomás, proteinuria és ödéma kialakulás) mutató nőt vizsgáltunk. Hypertenziót jelent, ha 24 órán belül két különböző alkalommal mért diasztolés nyomás ≥90 Hgmm, a fehérjevizelést 24 óra alatt a vizeletből ≥5 g fehérje kimutatása jelentette. A kísérlethez tartozó kontroll csoportot 25 a gesztációs kornak megfelelő egészséges terhes nő alkotta.
44
A pre-eclampsiás nők mintavételi időpontja a 29-34-ik terhességi hetek között történt, míg az egészséges nők gesztációs ideje a mintavételkor megegyezett a pre-eclampsiás csoportéval. A vizsgálati protokoll megfelel az 1975-os Helsinki Nyilatkozat etikai irányelveinek. Egészséges
Early-onset pre-
terhes nők
eclampsia
Betegek száma
25
27
Életkor (évek)
32,6±1,03
29,1±1,53
NS
A mintavétel terhességi hete
35,64±0,27
33,74±0,48
NS
A szülési terhességi hete
38,9±0,27
34,1±0,64
p<0,05
3420±126,84
1881±148,28
p<0,05
0,58±0,15
0,88±0,31
NS
Születési súly (g) Előző egészséges újszülött/donor
p-érték
4. táblázat. A kísérletben részt vevő nők demográfiai és nőgyógyászati adatai. Átlag ± SEM, Student t-próba, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.
45
5.4. Eredmények 5.4.1. Egészséges terhes és early-onset pre-eclampsiás terhes mintákból izolált mononukleáris sejtek fenotípusos analízise Kísérletünk során részletesen elemeztük a CD3+ T sejtek ezen belül a CD4+ Th és CD8+ Tc, a Treg, az NK ezen belül NKdim és NKbright valamint az NKT sejtek megoszlási arányát a perifériás vérből egészséges terhes, illetve early-onset pre-eclampsiás mintákból (5. táblázat). Szignifikáns csökkenést tapasztaltunk a Treg, illetve a NKbright sejtek arányát illetően a pre-eclampsiás csoportban összehasonlítva a kontroll mintákkal (5. táblázat).
Egészséges
Early-onset
terhes
pre-eclampsiás terhes
CD3+ T sejt
67,51±1,5
66,1±4,39
NS
CD4+ Th sejt
39,98±2,93
37,53±2,98
NS
CD8+ Tc sejt
31,29±2,52
29,92±2,52
NS
Treg sejt
0,92±0,12
0,55±0,08
p<0,05
NK sejt
9,91±0,94
8,12±1,25
NS
NKdim sejt
8,53±0,92
7,54±1,15
NS
NKbright sejt
1,41±0,12
0,61±0,13
p<0,01
NKT sejt
5,11±1,18
3,35±1,11
NS
p-érték
5. táblázat. Mononukleáris sejtek fenotípusos analízise egészséges terhes kontroll és earlyonset pre-eclampsiás betegek mintáiból. Átlag ± SEM, Student t-próba, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.
46
5.4.2. TIM-3 receptor expresszió összehasonlító vizsgálata egészséges terhes és early-onset pre-eclampsiás minták mononukleáris sejtjein Vizsgálva a TIM-3 expressziót az early-onset pre-eclampsiás mintákban szignifikáns csökkenést figyeltünk meg a receptor expresszióban a CD8+ Tc, NK és a NKdim sejtek esetén összehasonlítva a kontroll mintákkal, míg a NKbright sejteknél különbséget nem tapasztaltunk (16. ábra).
16. ábra. CD8+ Tc, NK és NK sejt szubpopulációk TIM-3 expressziójának összehasonlítása egészséges terhes kontroll és early-onset pre-eclampsiás betegek mintáiból. Medián + interkvartilis + alsó/felső kvartilis terjedelem. Student t-próba, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.
47
5.4.3. Gal-9 expresszió összehasonlítása egészséges terhes és early-onset pre-eclampsiás minták mononukleáris sejtjein Méréseink során a perifériás lymphocyták Gal-9 expressziójában szignifikáns emelkedést figyeltünk meg az early-onset pre-eclampsiás CD8+ Tc, NK és a NKbright sejtpopulációk esetében összehasonlítva az egészséges kontroll mintákkal, míg Treg sejtek esetében különbséget nem mértünk (17. ábra).
17. ábra. CD8+ Tc, NK, NKbright és Treg sejtek Gal-9 expressziójának összehasonlítása egészséges terhes kontroll és early-onset pre-eclampsiás betegek mintáiból. Medián + interkvartilis + alsó/felső kvartilis terjedelem. Student t-próba, a különbség szignifikáns ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.
48
5.4.4. Egészséges terhes és early-onset pre-eclampsiás nők CD8+ Tc és NK sejtjeinek cytotoxikus aktivitása Kísérletünk során szignifikánsan magasabb CD107a expressziós értéket mértünk az early-onset pre-eclampsiás TIM-3+ CD8+ Tc (18/A ábra) és TIM-3+ NK (18/B ábra) sejteken összehasonlítva az egészséges terhes kontroll azonos sejtpopulációival.
18. ábra. TIM-3+/ TIM-3- CD8+ Tc és NK sejtek CD107a expressziójának összehasonlítása egészséges terhes kontroll és early-onset pre-eclampsiás betegek mintáiból. Medián + interkvartilis + alsó/felső kvartilis terjedelem. Student t-próba, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.
49
Elemezve a két NK sejt szubpopulációt szintén egy szignifikánsan emelkedett cytotoxikus aktivitást mértünk az early-onset pre-eclampsiás nők TIM-3+ NKdim sejtjeinél összehasonlítva az egészséges terhes nők mintáival (19. ábra), NKbright sejtek esetében azonban különbséget nem tapasztaltunk a két vizsgált csoport értékeit illetően (19. ábra).
19. ábra. TIM-3+/ TIM-3- NK sejt szubpopulációk CD107a expressziójának összehasonlítása egészséges terhes kontroll és early-onset pre-eclampsiás betegek mintáiból. Medián + interkvartilis + alsó/felső kvartilis terjedelem. Student t-próba, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.
50
5.5. Megbeszélés A pre-eclampsia pathogenezisében az anyai immunrendszer központi szerepet játszik, de a betegség pre-klinikai és klinikai stádiumait különböző módokon befolyásolja. Elsőként meg kell említeni az implantáció során kialakuló a lokális immunválaszokhoz való elégtelen alkalmazkodást, illetve ezt követően a trophoblast nem kellő mértékű invázióját, amik együttesen eredményezik a későbbiekben kialakuló placenta alacsony oxigén és tápanyag ellátását. A betegség kialakulásához hozzájárul az anyai oldalon, a deciduában az egészséges terhességhez képest megváltozott működésű immunsejtek megjelenése is, melyek elsősorban a veleszületett immunrendszer elemei, úgy mint az NK-, NKT- és γδ T sejtek. A klinikai tünetek a kisméretű és a magzatot nem megfelelően tápláló placenta működésének kompenzálásakor jelennek meg, így a mai vélekedés szerint az elégtelen placentáció az elsődleges oka a pre-eclampsia kialakulásának. A betegség ezen fázisában a placentából az anyai
keringésbe
jutó
intrinsic
faktorok
szisztémás,
nem
specifikus
gyulladásos
immunválaszokat generálnak. Ugyanis a placentából felszabaduló molekulák monocyták és DC-k általi felismerése pro-inflammatorikus cytokinek keringésbe jutásához vezet, ami a gyulladásos válaszok és reakciók irányába tolja el az immunológiai egyensúlyt. Az anya klinikai tüneteket produkál, amíg a placenta az uterusban van, de ezek néha még a szülést követően is fennmaradnak, ami az immunregulációs mechanizmusok elégtelen működésére utalhat. Számos tanulmány igazolta a pre-eclampsiás betegek csökkent Treg arányát [90]–[92], ezek a sejtek ugyanis különböző immunszuppresszív tulajdonságokkal rendelkeznek, úgy mint gátló cytokinek termelése (TGF-β, IL-10) vagy a DC-k gátlása [93]. Eredetileg a TIM-3/Gal-9 interakció funkcionális következményét úgy definiálták, hogy apoptózist indukál a Th1-es sejteken ezáltal gátolva a Th1-es immunválaszokat és az IFN-γ szekréciót. Későbbi kísérletek azonban egyértelművé tették, hogy a kapcsolatnak fontos szerepe
van
a
transzplantációs
immunológiában,
fertőzéseknél,
autoimmunitásban,
gyulladásokban és a tumor immunitásban is. Egyre több kutatás foglalkozik a TIM-3/Gal-9 molekulákkal és kapcsolódásuk funkcionális következményeinek hatásával különböző humán pathológiás állapotokban, terhesség során szerepük azonban kevésbé ismert. Kutatócsoportunk egy korábbi munkájában kimutatta, hogy a pre-eclampsiás betegek aktivált γ/δ T sejtjei emelkedett cytotoxikus potenciállal rendelkeznek, ami együtt járhat a megváltozott TIM-3 expressziós mintázatukkal [90]. Egy nem rég megjelent publikációban allogenikus egérmodellt használva Chabtini és
51
mtsai. a TIM-3 receptort expresszáló, a fetomaternális határon jelen lévő veleszületett immunsejtek toleranciában betöltött szerepére hívják fel a figyelmet [56]. Az egyik TIM-3 és a terhesség kapcsolatát vizsgáló tanulmányban Zhao és mtsai. kapcsolatot véltek felfedezni a vetélés és ezen nők perifériás véréből izolált monocytáinak emelkedett TIM-3 expressziójában [57]. A fenti eredmények alapján elmondható, hogy a TIM-3/Gal-9 útvonal fontos szerepet játszhat a terhesség során kialakuló immunregulációs folyamatokban, továbbá a receptor és a ligandjának megváltozott expressziós szintje kapcsolatba hozható a pre-eclampsia során megfigyelt aktivált Th1-es lymphocytákkal és a túlsúlyba kerülő Th1-es immunválaszokkal. Jelen kutatásunkban a TIM-3 receptor expresszióját és funkcióját tanulmányoztuk early-onset pre-eclampsiás nők perifériás vérében, különös figyelmet fordítva a terhesség második felében a TIM-3 receptort expresszáló lymphocyta szubpopulációk ezen betegség gyulladásos immunválaszaiban betöltött szerepére. Megvizsgálva az early-onset preeclampsiás betegek perifériás véréből izolált sejtjeinek TIM-3 expresszióját szignifikánsan alacsonyabb értéket kaptunk CD8+ Tc, NK és NKdim sejtek esetében összehasonlítva egészséges terhes mintákkal. Érdekes módon a Gal-9 expressziós szintjét elemezve szignifikáns emelkedést tapasztaltunk az early-onset pre-eclampsiás csoport CD8+ Tc, NK és NKbright sejtjeit illetően összehasonlítva az egészséges terhességből származó mintákkal. Kísérletünk folytatásában vizsgálva a sejtek cytotoxikus aktivitását emelkedést figyeltünk meg az early-onset pre-eclampsiás csoport CD8+ Tc és NKdim sejtjeinél. Véleményünk szerint a sejteken early-onset pre-eclampsia során megfigyelt alacsonyabb TIM-3 expresszió teszi lehetővé Gal-9 általi negatív reguláció elmaradását, aminek következménye lehet a Th1 és Th17-es immunválaszok up regulációja továbbá az early-onset pre-eclampsiára jellemző szisztémás gyulladásos immunválaszok túlsúlyba kerülése. Ezzel az állítással ellentétesnek tűnhet az early-onset pre-eclampsiás betegek CD8+ Tc és NK effektor sejtjein mért emelkedett Gal-9 expresszió összehasonlítva az egészséges kontroll csoport értékeivel, de véleményünk szerint ez is alátámasztja a Gal-9 mediálta szabályzó folyamatokban megfigyelhető zavart. Az inkább cytokin termelő [94], szövetbe és nyirokcsomóba vándorló NKbright sejtek immunregulatorikus tulajdonságuk révén lényeges szerepet töltenek be olyan fiziológiás állapotokban, ahol az immuntolerancia kiemelt fontosságú, mint amilyen a terhesség is [95]. Ismert tény, amely szerint a növekvő arányú NKbright sejtek kontakt függő módon képesek az aktivált T sejtek túlélését befolyásolni [95], úgy gondoljuk, hogy az általunk mért emelkedett Gal-9 expressziós szint ezen early-onset pre-eclampsiás betegek perifériás véréből izolált 52
NKbright sejteken egy kompenzáló mechanizmus lehet a szervezet részéről, mellyel ezen sejtek szignifikánsan csökkent arányát próbálja ellensúlyozni. Nemrégen közzétett tanulmányban Bielekova és mtsai. SM betegeknél daclizumab terápia hatására a NKbright sejtek nagymértékű expanzióját figyelték meg, amely egyenes arányt mutatott az agyban lévő gyulladás csökkenésével [96]. Ezen eredményekből kiindulva valószínűsíthető, hogy a daclizumab kezelés elősegítheti a TIM-3/Gal-9 útvonal jövőbeli terápiás módon való felhasználását. Végeredményben elmondhatjuk, hogy az a tény mely szerint a legnagyobb mértékű cytotoxikus választ a különböző lymphocyta szubpopulációban a TIM-3 pozitív sejtek produkálták nyomatékosítja, hogy az early-onset pre-eclampsiával járó szisztémás gyulladásos immunválaszokban a TIM-3 receptornak a szerepe vitathatatlan, továbbá lényeges eleme lehet a terápiás céllal való immunszuppresszió létrehozásában is. További kísérletekre van azonban szükség annak tisztázása érdekében, hogy TIM-3 és a Gal-9 expressziója, illetve kapcsolódásuk hatásmechanizmusa miért mutat eltérő képet az immunválaszokban egészséges terhesség és early-onset pre-eclampsiában.
53
VI.
NK
sejtek
összehasonlító
vizsgálata
sikeres
és
sikertelen
mesterséges
megtermékenyítésen átesett nőkben A “Possible role of natural killer and natural killer T-like cells in implantation after IVF” című közlemény alapján (lásd mellékletek).
6.1. Irodalmi háttér Az NK sejtek terhesség során betöltött fontos szerepét hangsúlyozza, hogy hormonális szabályozás alatt állnak, a menstruációs ciklus luteális szakaszában - amikor az implantáció történik - számuk megemelkedik [97], illetve jelen vannak a terhesség korai szakában - a trophoblast deciduába történő inváziója idején - és nagy számban találhatóak meg az infiltráló trophoblast sejtek körül [98]. Ezzel szemben habituális vetélő nők deciduális és perifériás NK sejtjei fokozott cytotoxicitást mutatnak és kórosan magas a deciduában a NKbright/CD16+ sejtek aránya a NKbright/CD16- sejtekhez képest [99]. A deciduában az anyai eredetű fehérvérsejtek többségét NK sejtek és T sejtek alkotják. Az NK és T sejtek mediálta cytotoxicitás két kontakt-dependens mechanizmus segítségével jöhet létre. Az első a lymphocyták granulumainak exocytosisát jelenti, melyet elsősorban a CD8+ Tc-, NK és lymphokin aktiválta „killer” sejtek használnak. A célsejtettel történő konjugáció után a cytotoxikus granulumok az érintkezési felület oldalára migrálnak és a perforin molekula által a célsejteken okozott pórusokon keresztül azok elhalását okozzák [100]. A második útvonal egy receptor-ligand (Fas/Fas-ligand) kapcsolódáson alapul, ezt a mechanizmust főleg a T- és B lymphocyták, illetve az NK sejtek alkalmazzák a megfelelő liganddal rendelkező célsejtekkel szemben [100]. A cytotoxikus lymphocyták lítikus granulumai, melyek tulajdonképpen szekretoros lysosomáknak tekinthetők, perforint és egyéb szerin proteázokat (pl. granzyme-A és B) tartalmaznak [101]. Perforint tartalmazó granulumok kimutathatóak az NK sejtekben, a γ/δ T lymphocytákban és a CD8+ Tc sejtek szubpopulációjában. A perforin egy kb. 70 kDa-os molekula, mely sejten belül lysosoma-szerű granulumokban tárolódik [102],[103] és szabályozott szekrécióval jut ki az intracelluláris térbe, közvetlenül azután, hogy a lymphocyta a célsejthez konjugálódott [104]. A perforin monomerek a szekréciós fázist követően, Ca2+-ionok jelenlétében funkcionális csatornákká, más néven pórusokká aggregálódnak a célsejtek membránjában, melyek felületén a perforin molekulák számára a phosphorylcholin-lipid molekulák szolgálnak receptorként [105]. Ezen pórusok, hasonlóan a komplementrendszer
aktiválódásához,
a
célsejt
membránjában
annak
megváltozott
permeabilitásához és végül a sejt ozmotikus líziséhez vezetnek. 54
Egészséges terhesekben az NK cytotoxicitás szignifikánsan alacsonyabb, mint a nem terhes populációban, és ez az aktivitás a terminus közeledtével szignifikáns emelkedést mutat [106]. Továbbá, a lymphocyták perforin expressziója a terminus időpontjában szintén szignifikánsabban magasabb szintű, mint az első trimeszter környékén [107]. Az első trimeszterben a perifériás lymphocyták 25-27 %-os perforin pozitivitásával szemben a deciduában ugyanakkor a lymphocyták 55 %-a tartalmaz perforin granulumokat [108]. A perforint expresszáló deciduális lymphocyták többsége funkciójában eltér a perifériás NK sejtektől, hiszen a magas perforintartalom ellenére a lymphocyták cytotoxikus aktivitása mégis alacsony hozzájárulva ezzel a terhesség zavartalan lefolyásához [109]. Az NK sejteken az utóbbi években számos, az MHC molekulák felismerésére képes receptort azonosítottak. Ezek sejtfelszíni fehérjék, amelyek között mind gátló, mind pedig aktiváló jelet továbbító receptorokat is találunk. Az NK sejt receptorok 3 strukturális családba sorolhatók. A Killer immunglubulin like receptors család, melybe egyaránt aktiváló és gátló receptorok is tartoznak. A HLA-C, HLA-B, illetve HLA-A specifikus NK receptorok, illetve a harmadik csoport a C-típusú lektinek. A humán lektin típusú NK-receptorok polimorf, HLA-A, HLA-B, HLA-C molekulákat felismerő heterodimer fehérjék, amelyek CD94-ből és az ahhoz kovalens módon kapcsolódó, az NKG2 családba tartozó molekulákból állnak. Ilyen gátló receptor a CD94/NKG2A, illetve aktiváló jelet továbbít a CD94/NKG2C és a CD94/NKG2D receptor.
20. ábra. NK sejt gátló és aktiváló receptorok funkciója.
55
Az NK sejtek a cytotoxocitás és a cytokin termelés effektor funkciójával rendelkeznek, melyek alkalmazása függ a sejtek felszínén kifejeződő aktiváló és gátló receptorok kombinációjától, főként a specifikus MHC I osztály, illetve a nem MHC természetű ligandoktól. Ha a gátló receptorok vannak túlsúlyban, akkor az inhibitoros funkciók érvényesülnek és a célsejtet nem pusztítják el. Azonban ha az aktiváló receptorok vannak többségben, akkor a sejtek speciális funkciója teljesül, amely a célsejt lízisét és cytokin termelést foglal magában. 6.2. In vitro fertilizáció (IVF) Az asszisztált reprodukciós kezelések (ART), azon belül az IVF és az embrió transzfer ma már igen fontos szerepet játszanak a súlyos, egyéb módon nem kezelhető meddőségi probléma megoldásában. A saját gyermekre vágyó meddő párok utolsó esélye, hogy egy lombikbébi programba bekerülve orvosi segítséggel sikerüljön az utódnemzés. A természetes fogamzások mintegy 30%-a még a beágyazódás előtt elpusztul, további 30%-uk már az implantációt követően, de még a terhesség klinikai jeleinek felismerése előtt vész el, míg a spontán vetélés átlagosan 10%-ban fordul elő, így az élveszülések aránya 30% körülire tehető. Mindezek ismeretében érthető az igény mind a kezelésre jelentkező párok, mind az őket ellátó orvosok részéről arra, hogy az asszisztált reprodukciós kezelés során fogant terhességek várható kimenetelét minél előbb és minél megbízhatóbban lehessen előre jelezni, és amennyiben szükséges, a kezelést ezen információ birtokában módosítani. 2012-ben Magyarországon 4830 IVF kezelést végeztek, ebből 303 embrió beültetés történt a Pécsi Tudományegyetem Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáján [110]. 2012-ben az újszülöttek kevesebb, mint 2 százaléka fogant mesterséges úton [111]. Ezek alapján kimondható, hogy az eljárás hozzáférhető és igen nagy arányban sikeres. Számtalan tanulmány igazolta már, hogy milyen magas eredményességgel tud a kezelés segíteni meddő párokon. Ugyanakkor a hatékonyság mellett, még mindig viszonylag kevés az információ az eljárás biztonságosságáról, esetleges mellékhatásokról, szövődményekről. A fogamzásnak és a sikeres IVF kezelésnek közös kulcspontja a beágyazódó embrió és a méhnyálkahártya közötti interakció zavartalansága, amelyet az endometrium receptivitásával jellemezhetünk. Számos tanulmány foglalkozik azzal, hogy milyen markerek mérésével követhető nyomon a méhnyálkahártya állapota, mennyiben jelezhető előre az, hogy egy adott ciklusban felkészült-e az endometrium a beültetendő embriók befogadására, vagy érdemesebb azokat egy későbbi, a beágyazódás szempontjából kedvezőbb időpontig fagyasztva tárolni. 56
Jelenleg az IVF eljárás egy hormonális kezeléssel kezdődik. Ez a stimulációs fázis, amely során a petefészekben lévő petesejtek érésének fokozása történik. Ezt követően megfelelő tüszőnövekedés esetén a petesejtek ultrahangos ellenőrzés mellett történő leszívását végzik, amelyet a petesejtek megtermékenyítése és tenyésztése követ. A normálisan fejlődő embriók méh üregbe való visszahelyezésére (embrió transzfer) a petesejtszívást követő második-harmadik napon kerül sor (21. ábra). A sikeres megtapadás érdekében az embriók visszaültetése után 2-3 órás fekvés, majd 2-3 hét otthoni pihenés ajánlott.
21. ábra. Az IVF protokoll lépései [112].
6.3. Célkitűzések Jelen kísérletünk során sikeres és sikertelen mesterséges megtermékenyítésen átesett nők perifériás véréből izolált NK-, illetve NK sejt szubpopulációk valamint NKT sejtek összehasonlítását végeztük közvetlenül a beültetés előtt és 1 héttel utána. Részletesen vizsgáltuk az NK sejtek különböző aktiváló receptorainak (NKG2D, CD69, CD160) valamint a TIM-3 receptor expressziós szintjét, illetve változását az eljárás előtt és azt követően. A CD107a és a perforin molekulák elemzésével a vizsgált sejtpopulációk funkcionalitására voltunk kíváncsiak, illetve, hogy van-e valamilyen hatása ezen sejtek működésének a mesterséges megtermékenyítés sikerességében.
57
6.4. Donorok, mintavétel Kísérletünk során 19 nőt vizsgáltunk, akiket a PTE-KK Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika IVF programja keretében kezeltek, megfelelő kivizsgálás után (hormonvizsgálat, cytológia, laparoscopia, hysteroscopia, férj vizsgálata). A programba jelentkezett házaspárok, vagy a feleség (petevezetők elzáródása, ill. hiánya, esetleg egyéb ok), vagy a férj (pl. alacsony spermium szám) részéről meglévő elváltozás miatt természetes úton nem tudtak gyermeket nemzeni. Vizsgálataink során az első mintavétel a stimulációs fázis végén a pete leszívásának napján, míg a második az embriók visszaültetését követő 7. napon történt.
Betegek száma Életkor (évek, átlag) Tuba faktor (%) Apai ok (%) Egyéb (%) Ismeretlen (%) Meddőség hossza (évek) (átlag) Alap FSH szint (IU/ml) Korábbi sikertelen IVF beavatkozások száma Korábbi vetélések száma Nyert petesejtek száma (átlag) Felhasználható embriók száma (átlag) Beültetett embriók száma (átlag)
Sikeres IVF (terhes)
Sikertelen IVF (nem terhes)
pérték
8
11
36,87
35,18
NS
27,27
22,5
NS
45,45
62,5
NS
27,27
25
NS
0
0
NS
6,06
4,95
NS
7,63
6,29
NS
2,37
1,45
NS
0
0
NS
6,6
9,63
NS
4,62
4,45
NS
2,87
2,45
NS
6. táblázat. A kísérletben részt vevő IVF páciensek demográfiai és nőgyógyászati adatai (átlag értékek). Student t-próba, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.
58
6.5. Eredmények 6.5.1. Sikeres és sikertelen mesterséges megtermékenyítésen átesett nők NK és NK sejt szubpopulációinak fenotípusos analízise, illetve aktiváló-gátló receptorainak expressziója Összehasonlítva az IVF előtti és utáni állapotot szignifikáns különbséget csak a sikertelen csoportban mértünk. Ugyanis ezen páciensek perifériás vérében lévő NK sejtek és NK szubpopulációk (NKdim, NKbright) aránya szignifikánsan megemelkedik 1 héttel az IVF procedúra után összehasonlítva az eljárás előtti állapottal (22. ábra). Továbbá 1 héttel a beültetést követően ezek az emelkedett arányban jelen lévő NK sejtek és NK szubpopulációk szignifikánsan nagyobb arányban expresszálják a CD160 és NKG2D receptorokat összehasonlítva az IVF eljárás előtti mintákkal (7. táblázat). Megvizsgálva a sikertelen IVF procedúrán átesett nők NK sejtjeinek TIM-3 receptor (23. ábra), illetve CD69 (7. táblázat) aktivációs marker kifejeződését a két mintavételi időpont között emelkedést tapasztaltunk, ami azonban nem érte el a szignifikáns értéket.
59
Páciensek száma IVF előtt
Sikeres IVF
Sikertelen IVF
8
11
IVF után
p-érték
IVF előtt
IVF után
p-érték
Fenotípusos megoszlás NK sejt
11,09 ± 3,16
11,01 ± 2,8
NS
5,28 ± 0,74
9,66 ± 1,11
p<0,01
NK bright sejt
1,41 ± 0,42
1,67 ± 0,56
NS
0,47 ± 0,07
1,26 ± 0,39
p<0,04
NK dim sejt
9,94 ± 2,85
9,61 ± 2,38
NS
4,88 ± 0,73
8,53 ± 0,88
p<0,01
NK sejt
38,98 ± 3,38
40,22 ± 6,49 NS
43,82 ± 3,37
50,47 ± 3,53
NS
NK bright sejt
44,23 ± 5,61
43,51 ± 9,05 NS
41,93 ± 4,06
54,07 ± 5,73
NS
NK dim sejt
38,26 ± 3,26
39,81 ± 6,49 NS
44,15 ± 3,47
49,52 ± 3,21
NS
NK sejt
2,84 ± 0,7
3,27 ± 0,91
NS
3,51 ± 0,64
4,04 ± 0,82
NS
NK bright sejt
1,38 ± 0,38
1,55 ± 0,82
NS
1,26 ± 0,38
2,24 ± 0,51
NS
NK dim sejt
2,89 ± 0,69
3,31 ± 0,95
NS
3,7 ± 0,7
4,21 ± 0,87
NS
NK sejt
26,31 ± 4,43
24,68 ± 5,69 NS
20,43 ± 3,38
27,71 ± 2,88
p<0,03
NK bright sejt
9,58 ± 1,64
10,22 ± 3,49 NS
6,51 ± 1,52
14,9 ± 3,35
p<0,01
NK dim sejt
28,14 ± 4,69
26,04 ± 6,11 NS
21,25 ± 3,51
28,61 ± 2,84
p<0,05
NK sejt
73,7 ± 9,12
69,93 ± 8,6
50,14 ± 8,35
71,64 ± 9,28
p<0,01
NK bright sejt
84,66 ± 3,63
78,01 ± 6,81 NS
73,1 ± 7,51
79,91 ± 7,15
p<0,03
NK dim sejt
71,77 ± 9,38
68,27 ± 9,07 NS
47,81 ± 8,16
70,71 ± 9,38
p<0,01
TIM-3 expresszió
CD69 expresszió
CD160 expresszió
NKG2D expresszió NS
7. táblázat. NK és NK sejt szubpopulációk fenotípusos analízise sikeres, illetve sikertelen IVF kezelésen átesett nők perifériás vér mintáiból. Átlag ± SEM, párosított t-próba, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.
60
22. ábra. NK és NK sejt szubpopulációk megoszlása sikeres, illetve sikertelen IVF kezelésen átesett nők perifériás vér mintáiból. Átlag ± SEM, párosított t-próba, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05.
23. ábra. NK és NK sejt szubpopulációk TIM-3 expressziója sikeres, illetve sikertelen IVF kezelésen átesett nők perifériás vér mintáiból. Átlag ± SEM, párosított t-próba, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05.
61
6.5.2. Sikeres, illetve sikertelen IVF eljáráson átesett nők NK és NK szubpopulációinak cytotoxikus aktivitása és perforin expressziója Funkcionális tesztjeink során az NK sejtek cytotoxikus aktivitását és perforin termelését vizsgáltuk sikeres és sikertelen IVF-en átesett nőknél összehasonlítva a beavatkozás előtti és utáni állapotot. Perifériás vérből származó mintáinkból a sikertelen IVF kezelésen átesett csoportban az eljárás után szignifikánsan megemelkedett a perforin granulumok száma a NKbright sejteknél (8. táblázat). A cytotoxikus aktivitás vizsgálatakor az NK és NKdim sejtek szignifikánssan emelkedett CD107a expressziót mutattak egy héttel az embrió visszaültetését követően azon pácienseknél, akiknél később sikertelenül zárult a procedúra. (8. táblázat).
Páciensek száma IVF előtt
Sikeres IVF
Sikertelen IVF
8
11
IVF után
p-érték
IVF előtt
IVF után
p-érték
Perforin expresszió NK sejt
52,54 ± 6,53 50,05 ± 4,96
NS
55,59 ± 4,16 57,51 ± 3,23
NS
NK bright sejt
16,75 ±3,92
18,51 ± 5,21
NS
15,29 ± 5,24 24,34 ± 5,49
p<0,02
NK dim sejt
55,51 ± 7,02 52,41 ± 5,25
NS
58,44 ± 4,08 60,00 ± 3,34
NS
NK sejt
15,69 ± 2,6
15,27 ± 3,8
NS
12,48 ± 2,23 15,94 ± 2,57
p<0,02
NK bright sejt
8,73 ± 2,85
10,03 ± 2,48
NS
12,97 ± 2,96 13,95 ± 3,85
NS
NK dim sejt
16,73 ± 2,64 15,68 ± 3,96
NS
12,01 ± 2,49 15,92 ±2,52
p<0,02
CD107a expresszió
8. táblázat. NK és NK sejt szubpopulációk cytotoxikus aktivitása és perforin expressziója sikeres, illetve sikertelen IVF kezelésen átesett nők perifériás vér mintáiból. Átlag ± SEM, párosított t-próba, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.
62
6.5.3. Sikeres, illetve sikertelen IVF procedúrán átesett nők NKT sejtjeinek fenotípusos analízise, receptor és perforin expressziója Kísérletünk során részletesen elemeztük az NKT sejtek felszínén lévő receptorok expressziós szintjét sikeres és sikertelen mesterséges megtermékenyítésen átesett nőknél. Sikertelen beültetést követően szignifikánsan megemelkedett az NKT sejtpopuláció aránya összehasonlítva a beültetést megelőző állapothoz képest (9. táblázat). Megvizsgálva a sejtek perforin
granulumainak
expresszióját
sikeres
IVF
beavatkozást
követően
számuk
szignifikánsan lecsökkent az eljárás előtti állapothoz viszonyítva. Hasonló mintázatot mutatott ezen csoportban a CD160 aktivációs receptor expressziója is. A sikertelen eljáráson átesett nőknél azonban a CD160, illetve egy másik általunk vizsgált aktivációs receptor az NKG2D expressziója szignifikánsan megemelkedik a beavatkozás előtti szinthez hasonlítva (9. táblázat).
Sikeres IVF
Sikertelen IVF
8
11
Páciensek száma IVF előtt
IVF után
3,57 ± 0,67
4,56 ± 1,92
TIM-3
7,15 ± 1,49
CD69
p-érték
IVF előtt
IVF után
p-érték
NS
3,33 ± 1,35
4,26 ± 1,52
p<0,01
6,45 ± 0,98
NS
8,75 ± 1,49
6,45 ± 0,98
NS
5,51 ± 1,87
6,05 ± 1,85
NS
3,88 ± 1,01
4,72 ± 0,81
NS
CD160
3,09 ± 0,82
2,04 ± 0,81
p<0,05
1,57 ± 0,36
2,20 ± 0,5
p<0,04
NKG2D
65,65 ± 8,98
62,03 ± 8,91
NS
41,96 ± 7,27
65,59 ± 9,25
p<0,01
Perforin expresszió
23,38 ± 4,52
13,52 ± 2,38
p<0,02
17,73 ± 2,39
18,41 ± 3,73
NS
Fenotípusos megoszlás NKT sejt
Receptor expresszió
9. táblázat. NKT sejtek fenotípusos analízise sikeres, illetve sikertelen IVF kezelésen átesett nők perifériás vér mintáiból. Átlag ± SEM, párosított t-próba, szignifikáns a különbség ha, p≤0,05. NS: nem szignifikáns.
63
6.6. Megbeszélés Az asszisztált reprodukciós technikák mára rutin nőgyógyászati módszereknek tekinthetőek és habár eredményességük megkérdőjelezhetetlen, a beavatkozások egy jelentős hányada sikertelenül végződik, ami anyagilag és érzelmileg igen megterhelő a programban részt vevő párokra nézve. Az utóbbi időben jelentős kutatások történtek az IVF kezelések hatékonyabbá tételét, illetve a várható eredményük minél pontosabb előrejelzését illetően. Ezek a vizsgálatok elsősorban az IVF-re váró anyák immunprofiljának analízisét jelentik, ugyanis az ismeretlen anyai infertilitás, az ismétlődő spontán abortusz és az implantáció sikertelensége visszavezethető az anyai pathológiás immuntolerancia mechanizmusokra. Az NK sejtek számának és funkcionalitásának elemzése IVF programban részt vevő nőknél egy intenzíven kutatott terület. Beer és mtsai. kimutatták, miszerint a perifériás vér 18% fölé emelkedett NK sejt szintje negatív prognosztizáló faktor többszörös sikertelen IVF kezelésen átesett ismeretlen eredetű infertilis nők esetében [113]. Egy másik tanulmány nem talált szignifikáns különbséget a sikeres és a sikertelen IVF procedúrán átesett nők perifériás NK sejt számát illetően [114], ellenben egy másik kísérletben szintén IVF kezelésen átesett nőknél a perifériás NKdim CD16+ CD69+ sejtek emelkedett cytotoxicitása összefüggött a terhességek sikertelenségével [115]. Egy prospektív vizsgálat során komoly rizikófaktornak minősítették az IVF eljárás sikertelenségét illetően a CD69 és CD161 NK aktivációs marker emelkedett expresszióját, illetve a megnövekedett cytotoxicitást [116]. Kísérletünkben az IVF program során kezelt nők analízisét egy az eddigiektől eltérő módon végeztük. Amellett, hogy különválasztottuk a sikeres és sikertelen IVF eljáráson átesett nőket, további két időpontban a petesejt leszívásának napján, illetve az embrió transzfert követő 7. napon is vizsgáltuk az NK és NKT sejtek megoszlását és tulajdonságaikat. Egy héttel a sikertelen beültetést követően megemelkedett az NK- azon belül a NKdim és a NKbright továbbá az NKT sejtpopulációk aránya is a perifériás vérben. Ugyanezen csoportban magasabb volt a NKbright sejtek perforin expressziója, amit az összes vizsgált sejtpopuláció megnövekedett NK aktiváló receptorainak (CD160, NKG2D) expressziója kísért. Egy 2008as tanulmány szerint a sikertelen IVF csoportban mért emelkedett NKbright sejt arány összefügghet a nem megfelelő deciduális mikrokörnyezettel, ami jelezheti a beágyazódás sikertelenségét [116]. Jelenlegi eredményeink szerint a sikertelen terhesség alatt az emelkedett aktiváló NK sejt receptorok expressziója szoros összefüggést mutat egyéb a témában készült publikációk eredményeivel [117] [118]. Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy a sikeres IVF kezelés előtt az NK sejtek aránya szignifikánsan magasabb, mint a sikertelen beültetést megelőzően, azonban ez az érték 64
nem éri el a Beer mtsai. által leírt abnormális 18%-os arányt [113]. Mindazonáltal feltételezhető, hogy a sikertelen IVF kezelés egyik oka éppen az NK sejtek arányának szignifikáns emelkedése a petenyerés és az embrió transzfert követő 7. napi mintavétel között eltelt időben. A két mintavétel között eltelt rövid idő alatt az NK és NKT sejtek Th1-es irányú változásai mutathatóak ki a sikertelen IVF programban részt vett nőknél, ami összefüggésbe hozható a kezelésük kimenetelével. Ezt alátámasztja a sikertelen embrió beültetést követő mintavétel során mért emelkedett cytotoxikus aktivitás az NK és NKdim szubpopulációk esetében. Vizsgálva a terhes nők követéses kísérletének eredményeit különbséget nem sok esetben találtunk összehasonlítva a két mintavétel eredményeit. Az NKT sejtek CD160 és perforin expressziója azonban szignifikáns csökkenést mutatott a két mintavétel között a sikeres IVF-en átesett nőknél, ami hasznos paraméter lehet a sikertelen IVF kezelésen résztvevő donorok ezen eredményeinek összehasonlításakor. Eddig a témában készült kísérletek és publikációk elsősorban az IVF procedúra sikeressége alapján hasonlította össze a perifériás NK sejtek arányát és tulajdonságait [113],[115],[119]. Jelen kutatásunkban azonban terhesség kimenetelétől függetlenül is a petesejt leszívását követő, illetve az embrió transzfert követő 7. napi mintavétel után vizsgáltuk az NK és NKT sejtek megoszlását és tulajdonságait a korai terhességben, ami fontos adatokkal szolgálhat az embrió sikeres implantációját illetően.
65
VII. Összegzés 1. A TIM-3/Gal-9 útvonal szerepe egészséges terhességben 1.1 Egészséges terhes nők perifériás lymphocytáinak felszínén a TIM-3 receptor expressziója dinamikus változást mutat a terhesség előrehaladtával mind az adaptív, mind a természetes immunitás sejtjeinek felszínén. 1.2 Egészséges terhesség alatt az NK sejtek és azon belül a NKdim szubpopuláció expresszálja legnagyobb arányban a TIM-3 receptort. 1.3 A CD8+ Tc sejtek TIM-3 expressziója nem mutat változást a terhesség első kétharmadában, ugyanakkor a TIM-3 receptort hordozó alpopuláció csökkent proinflammatórikus
cytokintermelése
révén
támogatja
az
anyai
tolerancia
mechanizmusokat. 1.4 A terhesség harmadik trimeszterében TIM-3+ CD8+ Tc sejtek cytotoxicitása fokozódik, kedvező immunológiai feltételeket teremtve a szülés megindulásának a közeljövőben. 1.5 Minden vizsgált csoportban, beleértve a kontroll csoportot is a TIM-3 receptort hordozó NK sejtek cytotoxicitása alacsonyabbnak mutatkozott, mint a receptort nem expresszáló sejteké. 1.6 A terhesség első kétharmadában az NK sejtek TIM-3 expressziója változatlan, ugyanakkor lecsökken a TIM-3+ NKdim sejtek IL-2 termelése, míg a TIM-3+ NKbright sejtek IFN-γ termelése nő. 1.7 A terhesség 3. trimeszterében az NK sejtek és azon belül is az NKdim sejtek fokozott TIM-3 expressziót mutatnak, cytotoxicitásuk megemelkedik. 1.8 Egészséges terhességben már az első trimeszterben jelentősen megnő a szérum szolubilis Gal-9 koncentrációja, amely a terhesség második és harmadik harmadában további növekedést mutat. Ezzel párhuzamosan, a szolubilis Gal-9-et termelő Th sejtpopuláció aránya is megemelkedik a periférián a terhesség utolsó harmadában. Az emelkedett szolubilis Gal-9 szinttel magyarázható a TIM-3+ CD8+ Tc sejtek csökkent pro-inflammatórikus cytokintermelése, valamint a TIM3+ NK és NKdim sejtek csökkent cytotoxikus aktivitása.
66
2. A TIM-3/Gal-9 útvonal lehetséges szerepe pathológiás terhességben 2.1 Early-onset pre-eclampsiás betegek perifériás vérében a CD8+ Tc, NK és NKdim sejtek felszínén csökken a TIM-3 receptor expressziója. 2.2 Early-onset pre-eclampsiás betegek perifériás vérében CD8+ Tc, NK és NKbright sejtek nagyobb arányban expresszálnak Gal-9 molekulát a felszínükön. 2.3 A TIM-3 receptort hordozó CD8+ Tc és NKdim sejtjek cytotoxikus kapacitása fokozódik early-onset pre-eclampsiában, feltételezhetően a csökkent TIM-3 expresszió következtében, amit még a sejtek megnövekedett Gal-9 expressziója sem tud kompenzálni.
3. A TIM-3/Gal-9 útvonal prognosztikai szerepe mesterséges megtermékenyítés során 3.1 In vitro fertilizáció során egy héttel a beültetést követően megemelkedett az NK, és azon belül a NKdim és a NKbright, továbbá az NKT sejtpopulációk aránya a perifériás vérben azokban a nőkben, akiknél az eljárás sikertelen volt. 3.2 A sikertelen mesterséges megtermékenyítésen átesett nők csoportjában magasabb volt a NKbright sejtek perforin expressziója. 3.3 Az IVF eljárás sikertelenségével mutat összefüggést a beavatkozás után az NK és NKT sejteken megnövekedett NK aktiváló receptorok, a CD160 és NKG2D expressziója mindkét szubpopulációt érintve. 3.4 Sem az NK, sem az NKT sejtek TIM-3 expressziójának mértéke nem mutat eltérést sikeres illetve sikertelen IVF eljáráson átesett nők perifériás vérében. 3.5 Az
NK
és
NKdim sejtpopulációk
cytotoxicitásának
megemelkedése
az
embriótranszfer utáni héten összefüggést mutat az eljárás sikertelenségével.
67
VIII. Új eredmények, következtetések 1. Összehasonlítva a terhességi trimesztereket egy csökkent mennyiségű Th1 és Th17es cytokin produkciót mutattunk ki TIM-3 receptort expresszáló CD8+ Tc sejtek esetében összehasonlítva a TIM-3-at nem expressszáló CD8+ Tc sejtekkel. Kísérleteink további részében a TIM-3+ NK sejteknél és a TIM-3+ NKdim szubpopulációnál egy szignifikánsan emelkedett cytotoxikus aktivitást mértünk összehasonlítva a TIM-3- szubpopulációkkal, amit a szérumban keringő Gal-9 molekula emelkedő koncentrációja kísért a terhesség előrehaladtával. Véleményünk szerint a TIM-3 receptor és a keringő Gal-9 a terhesség során eltérő módon hat CD8+ Tc és NK sejtek működésére, erre hivatkozva valószínűsítjük szabályzó funkciójuknak fontosságát a terhesség alatt. 2. Pathológiás terhesség során, early-onset pre-eclampsiás betegek CD8+ Tc-, NK és NKdim sejtjeinek TIM-3 expressziója szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll mintákban. Úgy gondoljuk, hogy ez a csökkent receptor expresszió okozhatja a Gal-9 közvetítette Th1-es immunválaszok down regulációjának elmaradását, amivel szorosan összefügg az early-onset pre-eclampsiás csoport TIM-3+ CD8+ Tc és TIM-3+ NKdim sejtjeinél mért, a kontroll mintákkal összehasonlított emelkedett cytotoxikus aktivitás is. Véleményünk szerint az early-onset pre-eclampsiás betegek csökkent TIM-3-at expresszáló CD8+ Tc és NKdim sejtjein az emelkedett cytotoxikus aktivitás szerepet játszik a betegségre jellemző pro-inflammatorikus immunválaszok túlsúlyba kerülésében. Ezen sejtek emelkedett Gal-9 expressziója a bizonyíték továbbá a receptor-ligand interakció terhességben és earlyonset pre-eclampsiában betöltött lényeges szerepére. 3. Kísérletsorozatunk harmadik részében egy héttel a sikertelen IVF beavatkozást követően a perifériás vér NK és szubpopulációi továbbá az NKT sejtek emelkedett arányát mutattuk ki. Kiindulva, hogy a sikeres IVF procedúra előtt az NK sejtek aránya szignifikánsan magasabb volt feltételezzük, hogy a sikertelen beültetés egyik oka a petenyerés és a beültetést követő 7. nap között eltelt idő alatt megfigyelhető NK sejt expanzió lehet. Vizsgálataink során a TIM-3 receptor expressziót tekintve különbségeket nem tapasztaltunk, azonban a sikertelen IVF-en átesett nőknél, a két mintavételi időpont között az NK és NKT-sejtek emelkedett CD160 és NKG2D receptor expressziói mutathatóak ki, ami utalhat kezelésük kimenetelére továbbá lényeges információt nyújthat az embrió későbbi sikeres implantációját illetően.
68
IX. Az értekezés alapjául szolgáló eredeti közlemények 1.
M. Meggyes, E. Miko, B. Polgar, B. Farkas, Z. Illes, L. Szereday. Peripheral blood TIM-3 positive NK and CD8+ T cells throughout pregnancy: TIM-3/galectin-9 interaction and its possible role during pregnancy. PLoS One 9, e92371 (2014). (Impact factor: 3,534)
2.
E. Miko, M. Meggyes, B. Bogar, N. Schmitz, A. Barakonyi, A. Varnagy, B. Farkas, P. Tamas, J. Bodis, J. Szekeres-Bartho, Z. Illes, L. Szereday. Involvement of Galectin9/TIM-3 pathway in the systemic inflammatory response in early-onset preeclampsia. PLoS One 8, e71811 (2013). (Impact factor: 3,534)
3.
E. Miko, Z. Manfai, M. Meggyes, A. Barakonyi, F. Wilhelm, A. Varnagy, J. Bodis, Z. Illes, J. Szekeres-Bartho, L. Szereday. Possible role of natural killer and natural killer Tlike cells in implantation failure after IVF. Reprod. Biomed. Online 21, 750–6 (2010). (Impact factor: 2.285)
X. Egyéb közlemények 1.
L. Szereday, E. Miko, M. Meggyes, A. Barakonyi, B. Farkas, A. Varnagy, J. Bodis, L. Lynch, C. O’ Farelly, J. Szekeres-Bartho. Commitment of decidual haematopoietic progenitor cells in first trimester pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 67, 9–16 (2012). (Impact factor: 3,317)
2.
M. Meggyes, A. Lajko, T. Palkovics, A. Totsimon, Z. Illes, L. Szereday, E. Miko. Fetomaternal immune regulation by TIM-3/Galectin-9 pathway and PD-1 molecule in pregnant mice. Biology of Reproduction (submitted)
69
XI. Irodalomjegyzék 1. Szereday L, Varga P, Szekeres-Bartho J. Cytokine production by lymphocytes in pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 1997; 38:418–22. 2. Barakonyi A, Miko E, Szereday L, Polgar PD, Nemeth T, Szekeres-Bartho J, Engels GL. Cell death mechanisms and potentially cytotoxic natural immune cells in human pregnancies complicated by preeclampsia. Reprod. Sci. 2014; 21:155–66. 3. Christiansen OB, Lauritsen JG, Andersen ES, Grunnet N. Autoimmune associated recurrent abortions. Hum. Reprod. 1989; 4:913–7. 4. Tilburgs T, Scherjon SA, Claas FHJ. Major histocompatibility complex (MHC)mediated immune regulation of decidual leukocytes at the fetal-maternal interface. J. Reprod. Immunol. 2010; 85:58–62. 5. Hammer A, Hutter H, Dohr G. HLA class I expression on the materno-fetal interface. Am. J. Reprod. Immunol. 1997; 38:150–7. 6. McIntyre JA, Faulk WP. Allotypic trophoblast-lymphocyte cross-reactive (TLX) cell surface antigens. Hum. Immunol. 1982; 4:27–35. 7. Diehl M, Münz C, Keilholz W, Stevanović S, Holmes N, Loke YW, Rammensee HG. Nonclassical HLA-G molecules are classical peptide presenters. Curr. Biol. 1996; 6:305–14. 8. Miller JS. The biology of natural killer cells in cancer, infection, and pregnancy. Exp. Hematol. 2001; 29:1157–68. 9. Zenclussen AC. Regulatory T cells in pregnancy. Springer Semin. Immunopathol. 2006; 28:31–9. 10. Szekeres-Bartho J. Immunosuppression by Progesterone in Pregnancy. 1992. 11. Walsh SW. Preeclampsia: an imbalance in placental prostacyclin and thromboxane production. Am. J. Obstet. Gynecol. 1985; 152:335–40. 12. Ulmsten U. Treatment of normotensive and hypertensive patients with preterm labor using oral nifedipine, a calcium antagonist. Arch. Gynecol. 1984; 236:69–72. 13. Kaplan G, Totsuka A, Thompson P, Akatsuka T, Moritsugu Y, Feinstone SM. Identification of a surface glycoprotein on African green monkey kidney cells as a receptor for hepatitis A virus. EMBO J. 1996; 15:4282–96. 14. Kuchroo VK, Umetsu DT, DeKruyff RH, Freeman GJ. The TIM gene family: emerging roles in immunity and disease. Nat. Rev. Immunol. 2003; 3:454–62. 15. Hughes RAC. Experimental Allergic Encephalomyelitis: A Useful Model for Multiple Sclerosis: Progress in Clinical and Biological Research, vol 146. J. R. Soc. Med. 1985; 78:180. [Accessed December 9, 2014].
70
16. Monney L, Sabatos CA, Gaglia JL, Ryu A, Waldner H, Chernova T, Manning S, et al. Th1-specific cell surface protein Tim-3 regulates macrophage activation and severity of an autoimmune disease. Nature. 2002; 415:536–41. 17. Sabatos CA, Chakravarti S, Cha E, Schubart A, Sánchez-Fueyo A, Zheng XX, Coyle AJ, et al. Interaction of Tim-3 and Tim-3 ligand regulates T helper type 1 responses and induction of peripheral tolerance. Nat. Immunol. 2003; 4:1102–10. 18. Sánchez-Fueyo A, Tian J, Picarella D, Domenig C, Zheng XX, Sabatos CA, Manlongat N, et al. Tim-3 inhibits T helper type 1-mediated auto- and alloimmune responses and promotes immunological tolerance. Nat. Immunol. 2003; 4:1093–101. 19. Kearley J, McMillan SJ, Lloyd CM. Th2-driven, allergen-induced airway inflammation is reduced after treatment with anti-Tim-3 antibody in vivo. J. Exp. Med. 2007; 204:1289–94. 20. Anderson AC, Anderson DE, Bregoli L, Hastings WD, Kassam N, Lei C, Chandwaskar R, et al. Promotion of tissue inflammation by the immune receptor Tim-3 expressed on innate immune cells. Science. 2007; 318:1141–3. 21. Nakae S, Iikura M, Suto H, Akiba H, Umetsu DT, Dekruyff RH, Saito H, et al. TIM-1 and TIM-3 enhancement of Th2 cytokine production by mast cells. Blood. 2007; 110:2565–8. 22. Barondes SH, Castronovo V, Cooper DN, Cummings RD, Drickamer K, Feizi T, Gitt MA, et al. Galectins: a family of animal beta-galactoside-binding lectins. Cell. 1994; 76:597– 8. 23. Cooper DNW. Galectinomics: finding themes in complexity. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1572:209–31. 24. Hirabayashi J, Hashidate T, Arata Y, Nishi N, Nakamura T, Hirashima M, Urashima T, et al. Oligosaccharide specificity of galectins: a search by frontal affinity chromatography. Biochim. Biophys. Acta. 2002; 1572:232–54. 25. Türeci O, Schmitt H, Fadle N, Pfreundschuh M, Sahin U. Molecular definition of a novel human galectin which is immunogenic in patients with Hodgkin’s disease. J. Biol. Chem. 1997; 272:6416–22. 26. Wada J, Kanwar YS. Identification and characterization of galectin-9, a novel betagalactoside-binding mammalian lectin. J. Biol. Chem. 1997; 272:6078–86. 27. Matsumoto R, Matsumoto H, Seki M, Hata M, Asano Y, Kanegasaki S, Stevens RL, et al. Human ecalectin, a variant of human galectin-9, is a novel eosinophil chemoattractant produced by T lymphocytes. J. Biol. Chem. 1998; 273:16976–84. 28. Perillo NL, Marcus ME, Baum LG. Galectins: versatile modulators of cell adhesion, cell proliferation, and cell death. J. Mol. Med. (Berl). 1998; 76:402–12. 29. Perillo NL, Pace KE, Seilhamer JJ, Baum LG. Apoptosis of T cells mediated by galectin-1. Nature. 1995; 378:736–9.
71
30. Yang RY, Hsu DK, Yu L, Ni J, Liu FT. Cell cycle regulation by galectin-12, a new member of the galectin superfamily. J. Biol. Chem. 2001; 276:20252–60. 31. Dai S-Y, Nakagawa R, Itoh A, Murakami H, Kashio Y, Abe H, Katoh S, et al. Galectin-9 induces maturation of human monocyte-derived dendritic cells. J. Immunol. 2005; 175:2974–81. 32. Kasamatsu A, Uzawa K, Nakashima D, Koike H, Shiiba M, Bukawa H, Yokoe H, et al. Galectin-9 as a regulator of cellular adhesion in human oral squamous cell carcinoma cell lines. Int. J. Mol. Med. 2005; 16:269–73. 33. Seki M, Sakata K, Oomizu S, Arikawa T, Sakata A, Ueno M, Nobumoto A, et al. Beneficial effect of galectin 9 on rheumatoid arthritis by induction of apoptosis of synovial fibroblasts. Arthritis Rheum. 2007; 56:3968–76. 34. Seki M, Oomizu S, Sakata K-M, Sakata A, Arikawa T, Watanabe K, Ito K, et al. Galectin-9 suppresses the generation of Th17, promotes the induction of regulatory T cells, and regulates experimental autoimmune arthritis. Clin. Immunol. 2008; 127:78–88. 35. Kashio Y, Nakamura K, Abedin MJ, Seki M, Nishi N, Yoshida N, Nakamura T, et al. Galectin-9 induces apoptosis through the calcium-calpain-caspase-1 pathway. J. Immunol. 2003; 170:3631–6. 36. Zhu C, Anderson AC, Schubart A, Xiong H, Imitola J, Khoury SJ, Zheng XX, et al. The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T helper type 1 immunity. Nat. Immunol. 2005; 6:1245–52. 37. Nagahara K, Arikawa T, Oomizu S, Kontani K, Nobumoto A, Tateno H, Watanabe K, et al. Galectin-9 increases Tim-3+ dendritic cells and CD8+ T cells and enhances antitumor immunity via galectin-9-Tim-3 interactions. J. Immunol. 2008; 181:7660–9. 38. Oomizu S, Arikawa T, Niki T, Kadowaki T, Ueno M, Nishi N, Yamauchi A, et al. Cell surface galectin-9 expressing Th cells regulate Th17 and Foxp3+ Treg development by galectin-9 secretion. PLoS One. 2012; 7:e48574. 39. Mackay IR. Science, medicine, and the future: Tolerance and autoimmunity. BMJ. 2000; 321:93–6. 40. Strom TB, Roy-Chaudhury P, Manfro R, Zheng XX, Nickerson PW, Wood K, Bushell A. The Th1/Th2 paradigm and the allograft response. Curr. Opin. Immunol. 1996; 8:688–93. 41. Anderson GP, Coyle AJ. TH2 and ‘TH2-like’ cells in allergy and asthma: pharmacological perspectives. Trends Pharmacol. Sci. 1994; 15:324–32. 42. Hirashima M, Kashio Y, Nishi N, Yamauchi A, Imaizumi T, Kageshita T, Saita N, et al. Galectin-9 in physiological and pathological conditions. Glycoconj. J. 2004; 19:593–600. 43. Kuchroo VK, Dardalhon V, Xiao S, Anderson AC. New roles for TIM family members in immune regulation. Nat. Rev. Immunol. 2008; 8:577–80. 72
44. Halloran PF. Immunosuppressive drugs for kidney transplantation. N. Engl. J. Med. 2004; 351:2715–29. 45. Marleau AM, Sarvetnick N. T cell homeostasis in tolerance and immunity. J. Leukoc. Biol. 2005; 78:575–84. 46. Zheng XX, Sanchez-Fueyo A, Domenig C, Strom TB. The balance of deletion and regulation in allograft tolerance. Immunol. Rev. 2003; 196:75–84. 47. Wang F, He W, Yuan J, Wu K, Zhou H, Zhang W, Chen ZK. Activation of Tim-3Galectin-9 pathway improves survival of fully allogeneic skin grafts. Transpl. Immunol. 2008; 19:12–9. 48. Naka EL, Ponciano VC, Cenedeze MA, Pacheco-Silva A, Câmara NOS. Detection of the Tim-3 ligand, galectin-9, inside the allograft during a rejection episode. Int. Immunopharmacol. 2009; 9:658–62. 49. Calabresi PA, Tranquill LR, McFarland HF, Cowan EP. Cytokine gene expression in cells derived from CSF of multiple sclerosis patients. J. Neuroimmunol. 1998; 89:198–205. 50. Khademi M, Illés Z, Gielen AW, Marta M, Takazawa N, Baecher-Allan C, Brundin L, et al. T Cell Ig- and mucin-domain-containing molecule-3 (TIM-3) and TIM-1 molecules are differentially expressed on human Th1 and Th2 cells and in cerebrospinal fluid-derived mononuclear cells in multiple sclerosis. J. Immunol. 2004; 172:7169–76. 51. Anon. BD Biosciences FACSCalibur flow cytometer - Features - Applications. 52. Jiang W, Chai NR, Maric D, Bielekova B. Unexpected role for granzyme K in CD56bright NK cell-mediated immunoregulation of multiple sclerosis. J. Immunol. 2011; 187:781–90. 53. Robertson MJ, Ritz J. Biology and clinical relevance of human natural killer cells. Blood. 1990; 76:2421–38. 54. Cooper MA, Fehniger TA, Turner SC, Chen KS, Ghaheri BA, Ghayur T, Carson WE, et al. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood. 2001; 97:3146–51. 55. Oikawa T, Kamimura Y, Akiba H, Yagita H, Okumura K, Takahashi H, Zeniya M, et al. Preferential involvement of Tim-3 in the regulation of hepatic CD8+ T cells in murine acute graft-versus-host disease. J. Immunol. 2006; 177:4281–7. 56. Chabtini L, Mfarrej B, Mounayar M, Zhu B, Batal I, Dakle PJ, Smith BD, et al. TIM-3 regulates innate immune cells to induce fetomaternal tolerance. J. Immunol. 2013; 190:88–96. 57. Zhao J, Lei Z, Liu Y, Li B, Zhang L, Fang H, Song C, et al. Human pregnancy upregulates Tim-3 in innate immune cells for systemic immunity. J. Immunol. 2009; 182:6618– 24.
73
58. Heusschen R, Freitag N, Tirado-González I, Barrientos G, Moschansky P, MuñozFernández R, Leno-Durán E, et al. Profiling Lgals9 splice variant expression at the fetalmaternal interface: implications in normal and pathological human pregnancy. Biol. Reprod. 2013; 88:22. 59. Mor G, Cardenas I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63:425–33. 60. Challis JR, Lockwood CJ, Myatt L, Norman JE, Strauss JF, Petraglia F. Inflammation and pregnancy. Reprod. Sci. 2009; 16:206–15. 61. Kwak-Kim J, Gilman-Sachs A. Clinical implication of natural killer cells and reproduction. Am. J. Reprod. Immunol. 2008; 59:388–400. 62. Golden-Mason L, McMahan RH, Strong M, Reisdorph R, Mahaffey S, Palmer BE, Cheng L, et al. Galectin-9 functionally impairs natural killer cells in humans and mice. J. Virol. 2013; 87:4835–45. 63. Rabinovich GA, Toscano MA. Turning ‘sweet’ on immunity: galectin-glycan interactions in immune tolerance and inflammation. Nat. Rev. Immunol. 2009; 9:338–52. 64. Li Y-H, Zhou W-H, Tao Y, Wang S-C, Jiang Y-L, Zhang D, Piao H-L, et al. The Galectin-9/Tim-3 pathway is involved in the regulation of NK cell function at the maternalfetal interface in early pregnancy. Cell. Mol. Immunol. 2015. 65. Blidner AG, Rabinovich GA. ‘Sweetening’ pregnancy: galectins at the fetomaternal interface. Am. J. Reprod. Immunol. 2013; 69:369–82. 66. Klibi J, Niki T, Riedel A, Pioche-Durieu C, Souquere S, Rubinstein E, Le Moulec S, et al. Blood diffusion and Th1-suppressive effects of galectin-9-containing exosomes released by Epstein-Barr virus-infected nasopharyngeal carcinoma cells. Blood. 2009; 113:1957–66. 67. Mengshol JA, Golden-Mason L, Arikawa T, Smith M, Niki T, McWilliams R, Randall JA, et al. A crucial role for Kupffer cell-derived galectin-9 in regulation of T cell immunity in hepatitis C infection. PLoS One. 2010; 5:e9504. 68. Popovici RM, Krause MS, Germeyer A, Strowitzki T, von Wolff M. Galectin-9: a new endometrial epithelial marker for the mid- and late-secretory and decidual phases in humans. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2005; 90:6170–6. 69. Von Wolff M, Wang X, Gabius H-J, Strowitzki T. Galectin fingerprinting in human endometrium and decidua during the menstrual cycle and in early gestation. Mol. Hum. Reprod. 2005; 11:189–94. 70. Duley L. The global impact of pre-eclampsia and eclampsia. Semin. Perinatol. 2009; 33:130–7. 71. Roberts JM, Pearson GD, Cutler JA, Lindheimer MD. Summary of the NHLBI Working Group on Research on Hypertension During Pregnancy. Hypertens. pregnancy. 2003; 22:109–27. 74
72. Huppertz B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 2008; 51:970–5. 73. Roberts JM, Hubel CA. The two stage model of preeclampsia: variations on the theme. Placenta. 2009; 30 Suppl A:S32–7. 74. Moffett-King A. Natural killer cells and pregnancy. Nat. Rev. Immunol. 2002; 2:656–63. 75. Saito S, Sakai M, Sasaki Y, Nakashima A, Shiozaki A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J. Reprod. Immunol. 2007; 76:30–9. 76. Redman CW, Sargent IL. Latest advances in understanding preeclampsia. Science. 2005; 308:1592–4. 77. Hiby SE, Walker JJ, O’shaughnessy KM, Redman CWG, Carrington M, Trowsdale J, Moffett A. Combinations of maternal KIR and fetal HLA-C genes influence the risk of preeclampsia and reproductive success. J. Exp. Med. 2004; 200:957–65. 78. Redman CWG, Tannetta DS, Dragovic RA, Gardiner C, Southcombe JH, Collett GP, Sargent IL. Review: Does size matter? Placental debris and the pathophysiology of preeclampsia. Placenta. 2012; 33 Suppl:S48–54. 79. Knight M, Redman CWG, Linton EA, Sargent IL. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. BJOG An Int. J. Obstet. Gynaecol. 1998; 105:632–640. 80. Levine RJ, Lam C, Qian C, Yu KF, Maynard SE, Sachs BP, Sibai BM, et al. Soluble endoglin and other circulating antiangiogenic factors in preeclampsia. N. Engl. J. Med. 2006; 355:992–1005. 81. Ishihara N, Matsuo H, Murakoshi H, Laoag-Fernandez JB, Samoto T, Maruo T. Increased apoptosis in the syncytiotrophoblast in human term placentas complicated by either preeclampsia or intrauterine growth retardation. Am. J. Obstet. Gynecol. 2002; 186:158–66. 82. Maynard SE, Moore Simas TA, Bur L, Crawford SL, Solitro MJ, Meyer BA. Soluble endoglin for the prediction of preeclampsia in a high risk cohort. Hypertens. pregnancy. 2010; 29:330–41. 83. Pennington KA, Schlitt JM, Jackson DL, Schulz LC, Schust DJ. Preeclampsia: multiple approaches for a multifactorial disease. Dis. Model. Mech. 2012; 5:9–18. 84. Benyo DF, Smarason A, Redman CW, Sims C, Conrad KP. Expression of inflammatory cytokines in placentas from women with preeclampsia. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001; 86:2505–12. 85. Vince GS, Starkey PM, Austgulen R, Kwiatkowski D, Redman CW. Interleukin-6, tumour necrosis factor and soluble tumour necrosis factor receptors in women with preeclampsia. Br. J. Obstet. Gynaecol. 1995; 102:20–5.
75
86. Sakai M, Shiozaki A, Sasaki Y, Yoneda S, Saito S. The ratio of interleukin (IL)-18 to IL-12 secreted by peripheral blood mononuclear cells is increased in normal pregnant subjects and decreased in pre-eclamptic patients. J. Reprod. Immunol. 2004; 61:133–43. 87. Sargent IL, Borzychowski AM, Redman CWG. NK cells and human pregnancy--an inflammatory view. Trends Immunol. 2006; 27:399–404. 88. Redman CWG, Sargent IL. Pre-eclampsia, the placenta and the maternal systemic inflammatory response--a review. Placenta. 2003; 24 Suppl A:S21–7. 89. Miko E, Szereday L, Barakonyi A, Jarkovich A, Varga P, Szekeres-Bartho J. Immunoactivation in preeclampsia: Vdelta2+ and regulatory T cells during the inflammatory stage of disease. J. Reprod. Immunol. 2009; 80:100–8. 90. Toldi G, Saito S, Shima T, Halmos A, Veresh Z, Vásárhelyi B, Rigó J, et al. The frequency of peripheral blood CD4+ CD25high FoxP3+ and CD4+ CD25- FoxP3+ regulatory T cells in normal pregnancy and pre-eclampsia. Am. J. Reprod. Immunol. 2012; 68:175–80. 91. Darmochwał-Kolarz D, Oleszczuk J. The critical role of Th17 cells, Treg cells and costimulatory molecules in the development of pre-eclampsia. Dev. period Med. 2014; 18:141– 7. 92. Hafeez NAA, Fouda ME-T, Abdel Gawad ER, Assar T, Mansour AI. The role of regulatory T cells in preeclampsia. Egypt. J. Immunol. 2014; 21:45–55. 93. Saito S, Nakashima A, Shima T, Ito M. Th1/Th2/Th17 and regulatory T-cell paradigm in pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63:601–10. 94. Trotta R, Parihar R, Yu J, Becknell B, Allard J, Wen J, Ding W, et al. Differential expression of SHIP1 in CD56bright and CD56dim NK cells provides a molecular basis for distinct functional responses to monokine costimulation. Blood. 2005; 105:3011–8. 95. Poli A, Michel T, Thérésine M, Andrès E, Hentges F, Zimmer J. CD56bright natural killer (NK) cells: an important NK cell subset. Immunology. 2009; 126:458–65. 96. Bielekova B, Catalfamo M, Reichert-Scrivner S, Packer A, Cerna M, Waldmann TA, McFarland H, et al. Regulatory CD56(bright) natural killer cells mediate immunomodulatory effects of IL-2Ralpha-targeted therapy (daclizumab) in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006; 103:5941–6. 97. Ho HN, Chao KH, Chen CK, Yang YS, Huang SC. Activation status of T and NK cells in the endometrium throughout menstrual cycle and normal and abnormal early pregnancy. Hum. Immunol. 1996; 49:130–6. 98. BURTON G. Human Implantation: Cell Biology and Immunology. By Y. W. Loke and Ashley King. (Pp. xiv + 2992; some figures; f50/$80 hardback; ISBN 0 521 44193 5.) Cambridge: Cambridge University Press. 1995. J. Anat. 1997; 190:473–475.
76
99. Yamamoto T, Takahashi Y, Kase N, Mori H. Decidual natural killer cells in recurrent spontaneous abortion with normal chromosomal content. Am. J. Reprod. Immunol. 1999; 41:337–42. 100. Henkart PA. Lymphocyte-mediated cytotoxicity: two pathways and multiple effector molecules. Immunity. 1994; 1:343–6. 101. Shiver JW, Su L, Henkart PA. Cytotoxicity with target DNA breakdown by rat basophilic leukemia cells expressing both cytolysin and granzyme A. Cell. 1992; 71:315–22. 102. Yannelli JR, Sullivan JA, Mandell GL, Engelhard VH. Reorientation and fusion of cytotoxic T lymphocyte granules after interaction with target cells as determined by high resolution cinemicrography. J. Immunol. 1986; 136:377–82. 103. Ortaldo JR, Winkler-Pickett RT, Nagashima K, Yagita H, Okumura K. Direct evidence for release of pore-forming protein during NK cellular lysis. J. Leukoc. Biol. 1992; 52:483–8. 104. Tschopp J, Schäfer S, Masson D, Peitsch MC, Heusser C. Phosphorylcholine acts as a Ca2+-dependent receptor molecule for lymphocyte perforin. Nature. 1989; 337:272–4. 105. Podack ER, Dennert G. Assembly of two types of tubules with putative cytolytic function by cloned natural killer cells. Nature. 302:442–5. 106. Szekeres-Bartho J, Varga P, Pacsa AS. Immunologic factors contributing to the initiation of labor--lymphocyte reactivity in term labor and threatened preterm delivery. Am. J. Obstet. Gynecol. 1986; 155:108–12. 107. Rukavina D, Podack ER, Rubesa G, Spanjol-Pandelo S, Randic L. Down-regulated expression of perforin-positive/CD16+ cells in the peripheral blood lymphocytes in the first trimester of pregnancy and up-regulation at the end of pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 1997; 38:189–96. 108. Rukavina D, Rubesa G, Gudelj L, Haller H, Podack ER. Characteristics of perforin expressing lymphocytes within the first trimester decidua of human pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 1995; 33:394–404. 109. King A, Wooding P, Gardner L, Loke YW. Expression of perforin, granzyme A and TIA-1 by human uterine CD56+ NK cells implies they are activated and capable of effector functions. Hum. Reprod. 1993; 8:2061–7. 110. Oep A. Jelentés asszisztált reprodukciós eljárásokat végző intézmények Asszisztált reprodukciós intézetek mutatóinak , rövidítéseinek magyarázata. 2012; 2008:1–16. 111. Anon. Eurostat - Tables, Graphs and Maps Interface (TGM) table. 112. Anon. Stages in fertility treatment | Thomson Fertility Centre.
77
113. Beer AE, Kwak JY, Ruiz JE. Immunophenotypic profiles of peripheral blood lymphocytes in women with recurrent pregnancy losses and in infertile women with multiple failed in vitro fertilization cycles. Am. J. Reprod. Immunol. 1996; 35:376–82. 114. Thum MY, Bhaskaran S, Bansal AS, Shehata H, Ford B, Sumar N, Abdalla HI. Simple enumerations of peripheral blood natural killer (CD56+ NK) cells, B cells and T cells have no predictive value in IVF treatment outcome. Hum. Reprod. 2005; 20:1272–6. 115. Thum MY, Bhaskaran S, Abdalla HI, Ford B, Sumar N, Shehata H, Bansal AS. An increase in the absolute count of CD56dimCD16+CD69+ NK cells in the peripheral blood is associated with a poorer IVF treatment and pregnancy outcome. Hum. Reprod. 2004; 19:2395–400. 116. Coulam CB, Roussev RG. Correlation of NK cell activation and inhibition markers with NK cytoxicity among women experiencing immunologic implantation failure after in vitro fertilization and embryo transfer. J. Assist. Reprod. Genet. 2003; 20:58–62. 117. Van den Heuvel MJ, Hatta K, Peralta CG, Han VK, Clark DA. CD56+ cells are recruited to the uterus in two waves: at ovulation and during the first 2 weeks after missed menses. Am. J. Reprod. Immunol. 2008; 59:90–8. 118. Ntrivalas EI, Kwak-Kim JY, Gilman-Sachs A, Chung-Bang H, Ng SC, Beaman KD, Mantouvalos HP, et al. Status of peripheral blood natural killer cells in women with recurrent spontaneous abortions and infertility of unknown aetiology. Hum. Reprod. 2001; 16:855–61. 119. Coulam CB, Roussev RG. Increasing circulating T-cell activation markers are linked to subsequent implantation failure after transfer of in vitro fertilized embryos. Am. J. Reprod. Immunol. 2003; 50:340–5.
78
XII. Köszönetnyilvánítás Elsőként témavezetőmnek Dr. Szereday Lászlónak szeretnék köszönetet mondani, aki a kezdetektől fogva egyengeti kutatói pályámat, és akitől rengeteg segítséget és támogatást kaptam az intézetben töltött éveim alatt. Köszönettel tartozom a PTE-KK Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet minden dolgozójának, akik segítették munkámat, illetve prof. Dr. Szekeres-Barthó Júliának, és az általa vezetett Terhességi Immunológiai Kutatócsoportnak. Külön szeretném megköszönni Molnár Évának és Kiss Ágnesnek a kezdeti időszakban nyújtott segítségét mind az alap technikák elsajátítását, mind a csoportba való beilleszkedést illetően. Hálás köszönet Dr. Mikó Évának és Dr. Polgár Beátának, akik hasznos tanácsaikkal segítettek kutató munkámban és dolgozatom megírásában. Végül
szeretném
kifejezni
legszívélyesebb
köszönetemet
családomnak
és
kedvesemnek, akik mindenben támogattak és bíztattak.
79
XIII. Mellékletek
1. Közlemény M. Meggyes, E. Miko, B. Polgar, B. Farkas, Z. Illes, L. Szereday. Peripheral blood TIM-3 positive NK and CD8+ T cells throughout pregnancy: TIM-3/galectin-9 interaction and its possible role during pregnancy. PLoS One 9, e92371 (2014).
2. Közlemény E. Miko, M. Meggyes, B. Bogar, N. Schmitz, A. Barakonyi, A. Varnagy, B. Farkas, P. Tamas, J. Bodis, J. Szekeres-Bartho, Z. Illes, L. Szereday. Involvement of Galectin-9/TIM-3 pathway in the systemic inflammatory response in early-onset preeclampsia. PLoS One 8, e71811 (2013).
3. Közlemény E. Miko, Z. Manfai, M. Meggyes, A. Barakonyi, F. Wilhelm, A. Varnagy, J. Bodis, Z. Illes, J. Szekeres-Bartho, L. Szereday. Possible role of natural killer and natural killer T-like cells in implantation failure after IVF. Reprod. Biomed. Online 21, 750–6 (2010).
80
