Teoretický úvod:
MINERÁLNÍ VÝŽIVA
Praktikum fyziologie rostlin
1
Teoretický úvod: MINERÁLNÍ VÝŽIVA Vedle prvk , které tvo í organické látky – C, H a O – funk ní struktury rostlin obsahují adu dalších prvk , které se v p írod
vyskytují p edevším ve slou eninách anorganických
(nerostných, minerálních). Termín minerální výživa zahrnuje p íjem nezbytných anorganických prvk do rostliny, jejich transport na funk ní místo a vestav ní do struktur nebo vstup do metabolických pochod . Dle množství v sušin rostliny jsou tyto esenciální (nezbytné, nezastupitelné, nenahraditelné) anorganické prvky ozna ovány jako makro- nebo mikroelementy. Makroelementy - N, P, K, Ca, Mg, S jsou v 1 kg sušiny obsaženy v množství v tším než 1 000 mg (1 g) Mikroelementy - Fe, Mn, Zn, Cu, Cl, B, Mo jsou v 1 kg sušiny zastoupeny v množství menším než 100 mg (0,1 g). Nedostatek esenciálních minerálních látek p sobí zpomalení až zastavení r stu, poruchy vývoje, asto se projeví specifickými zm nami tvaru nebo barvy, zasycháním a nekrózami pletiv. Projevy deficience (deficien ní syndrom) jsou pro jednotlivé prvky charakteristické, r zné rostliny jsou však k nedostatku jednotlivých prvk r zn citlivé. Nedostatek kteréhokoli z esenciálních prvk je pro existenci rostliny limitující. Nep ízniv p sobí také nadbytek živin, v krajním p ípad hovo íme o toxicit . Vztah mezi rychlostí fyziologického procesu a dostupnosti konkrétní živiny demonstruje obr. 1.
Obr. 1. Závislost rychlosti fyziologického procesu na dostupnosti živiny (p evzato z Procházka et al. 1998) 2
P íjem živin se realizuje p edevším ko eny, v menší mí e také listy (nap . pi
aplikaci
hnojiva
na
list).
K povrchu ko ene se ionty živin dostávají t emi mechanismy – difusí, hromadným tokem s pohybem vody a intercepcí – pror stáním ko ene do oblastí substrátu, kde ješt živiny
vy erpány
(obr.
nejsou 2).
Dostupnost každé živiny ovliv uje míra její sorpce v p dním komplexu – nejd ležit jšími jsou chemická sorpce (tvorba slou enin o r zné rozpustnosti) a fyzikáln -chemická
Obr. 2. Mechanismy p ísunu živin k povrchu ko ene (p evzato z Brady a Weil 2002)
sorpce na povrchu p dních koloid . P dní koloidy jsou jílové nebo organické
ástice
s velkým specifickým povrchem (10-800 m2 g-1), které nesou na svém povrchu náboje a reverzibiln poutají ionty ve svém okolí (obr. 3).
Obr. 3. P dní koloidy – kaolinit (zástupce k emi itanových jíl ) a mechanismus vým ny iont na povrchu koloidních ástic p evzato z Brady a Weil 2002 (levý obr.) a Taiz a Zeiger 2002 (pravý obr.)
Pro p íjem živin jsou d ležité ko enové vlásky – zv tšují povrch ko ene, pronikají do malých p dních pór a zajiš ují kontakt s p dními ásticemi. Ko enový systém navíc reaguje na dostupnost živin v prost edí – m ní svoji morfologii (rychlost r stu jednotlivých ko en a intenzitu v tvení) s cílem optimáln využít nehomogenní nabídku živin v p dním horizontu.
3
Význam jednotlivých živin Dusík je p ijímán z p dy jako ionty NO3- nebo NH4+ nebo v aminokyselinách. V rostlin je dusík obsažen v proteinových i neproteinových aminokyselinách. Proteinové aminokyseliny tvo í proteiny s funkcí enzymatickou, strukturních nebo regula ní, neproteinové aminokyseliny jsou výchozími substráty pro syntézu dalších látek, nap . kyselina 5aminolevulová je substrátem pro syntézu látek obsahujících pyrolové jádro, tj. chlorofyl a cytochrom . Dusík je obsažen v purinových a pyrimidinových bazích nukleových kyselin a v ad dalších látek primárního i sekundárního metabolismu. Nedostatek dusíku ovliv uje adu d ležitých fyziologických pochod
v etn
asimilace
CO2
a
projevuje se inhibicí r stu
i
vývoje
rostliny.
Pi
nedostatku
dusíku
rostlina investuje do rozvoje systému nadzemní
ko enového na
úkor ásti
–
Obr. 4. R st prýtu a ko en v závislosti na dostupnosti N v prost edí p evzato z Marschner 1995
snaha o zajišt ní dostate ného p ísunu limitující živiny. Fosfor je p ijímán z p dy ve form fosfátového aniontu, který se zabudovává p ímo do organických slou enin. V rostlin je fosfát sou ástí látek s vysokým obsahem energie - ATP, UTP, GPT, CPT a TTP. Tyto slou eniny slouží k syntéze nukleových kyselin nebo reagují s množstvím dalších molekul, jejichž vnit ní energie se tím zvyšuje a je tak umožn n jejich vstup do dalších metabolických proces (nap . fosforylace kyseliny 3-fosfoglycerové na 1,3bisfosfoglycerovou p ed redukcí na 3-P-glyceraldehyd, vznik UDP-glukózy pro tvorbu celulózy, ADP-glukózy pro vznik škrobu, CDP-fosfatidátu pro vznik membránových fosfolipid ). Vedle zm n vnit ní energie molekula navázáním fosfátu získává záporný náboj. U protein fosforylace m ní jejich konformaci, která ovliv uje jejich funk ní vlastnosti, nap . propustnost akvaporinových kanál , enzymatickou aktivitu (místo navázání fosfátu ur uje funkci kináz dependentních na cyklinech v pr b hu bun ného cyklu) nebo lokalizaci v bu ce (transport fytochromu z cytosolu do jádra a p enos signálu). d ležité p i p enosu signál . Strukturn
Fosforyla ní kaskády jsou
je fosfát vázán v nukleových kyselinách a ve
4
fosfolipidech membrán. V semenech je fosfát uložen ve form kyseliny fytové, substituované vápníkem a ho íkem. Fosforylovaný inositol hraje významnou roli p i p enosu signálu. Draslík je p ijímán ve form K+ a neváže se do stabilních struktur. Hraje d ležitou úlohu v osmotických pom rech bu ky a p i objemovém r stu bu ky. Ovliv uje aktivitu n kterých enzym , které katalyzují reakce fotosyntetické a respira ní. Draslík je v rostlin
velmi
pohyblivý a jeho deficience se projevuje p edevším na starších ástech rostliny. Vápník je p ijímán jako dvoumocný kation, strukturn je vázán v bun né st n a st ední lamele p edevším s pektiny. V membránách ovliv uje soudržnost fosfolipid
a schopnost
membrán vázat proteiny. Koncentrace vápníku v cytosolu je udržována velmi nízká (asi 0,2 M), v bun né st n je hladina Ca2+ asi 1000 M, v endoplazmatickém retikulu asi 10 M. Ve vakuole, kde je koncentrace Ca2+ 100 až 1000
M, m že tvo it s anionty organických i
anorganických kyselin nerozpustné soli. V cytosolu se
vápník
reverzibiln
váže
s polypeptidem
kalmodulinem a výrazn ovliv uje aktivitu enzym . Zm na jeho koncentrace v cytosolu tak navozuje metabolické zm ny, které jsou sou ástí p enosu signálu. V t chto procesech vápník funguje jako tzv. druhý posel. Ho ík je p ijímán jako dvoumocný kation a v této podob je distribuován po rostlin . Strukturn je vázán v chlorofylu (Obr. 5.), kde hraje d ležitou úlohu p i interakci se strukturními proteiny anténních komplex . Ovliv uje aktivitu n kterých enzym , nap .
Obr. 5. Vazba Mg v chlorofylu p evzato z Buchanan et al. 2000
Rubisco.
Síra je p ijímána ve form síranového aniontu SO42-, je redukována a zabudovávána do aminokyselin – cysteinu a methioninu. Výrazn ovliv uje konformaci protein a umož uje navázání dalších ligand
(vazba chromoforu s proteinem ve fytochromu). V kombinaci
s železem tvo í tzv. Fe-S centra, struktury d ležité pro p enos elektronu p i fotosyntéze v cytochromovém komplexu a ve fotosystému I a v dýchacím et zci. Je d ležitou složkou n kterých koenzym – koenzymu A, thiaminu a biotinu. Železo je p ijímáno snáze jako Fe2+, v p d se však asto vyskytuje jako Fe3+. Mechanismus využití trojmocného železa je odlišný u trav oproti ostatním rostlinám. Rostliny dvoud ložné a jednod ložné netravního typu redukují Fe3+cheláty p ítomné v rhizosfé e a uvol ují Fe2+ pro p íjem do cytosolu (Obr. 6 vpravo). Trávy vylu ují fytosiderofory - specifické 5
neproteinogenní aminokyseliny, které váží Fe3+. Komplex fytosiderofor-Fe3+ je následn p ijímán do rostliny a v cytoplazm je Fe uvoln no (Obr. 6 vlevo). Také Mn, Cu a Zn jsou p ijímány v chelátové form .
Obr. 6. Mechanismus p íjmu Fe u trav (vlevo) a ostatních rostlin (vpravo) p evzato z Buchanan et al. 2000
Mangan je d ležitou složkou proteinového komplexu rozkládajícího vodu (OEC), který je asociován s fotosystémem II. M
je d ležitá složka struktur p enášejících elektron, nap . plastocyaninu v primární fázi
fotosyntézy nebo v cytochromoxidázovém komplexu v elektrontransportním
et zci p i
dýchání. Zinek je d ležitou strukturní složkou ady enzym a transkrip ních faktor , tzv. zinkové prsty. Chlór hraje d ležitou roli v osmotických pom rech bu ky a stabilizuje komplex rozkládající vodu ve fotosyntetickém aparátu. Bór je nezbytný pro syntézu nukleových kyselin a r st pylových lá ek. P ijímán je jako H3BO3. Molybden je p ijímán jako anion MoO42-. Je vázán v enzymech, nap . v nitrátreduktáze. Hodnocení r stu R st je dynamický proces probíhající v ase, proto se jeho parametry sledují b hem ur itého období. Sledují-li se 2 nebo více soubor , lze provést srovnání ve stejném ase. Jako kriterium r stu se nej ast ji užívá suchá hmotnost = sušina = hmotnost dehydratovaného materiálu, tj. vysušeného do konstantní hmotnosti p i 105°C. erstvá hmotnost je mén spolehlivé kriterium r stu. Velmi d ležité je, aby byl materiál po odebrání vážen co nejd íve a aby u všech srovnávaných variant byly dodrženy stejné
6
podmínky a stejný postup. Z rozdílu erstvé a suché hmotnosti pak lze stanovit obsah vody v materiálu (hydrataci), který se obvykle vyjad uje v % erstvé hmotnosti. Dalšími používanými kriterii r stu jsou délka nebo plocha orgánu.
Literatura: Brady, N.C. and Weil, R. R. The Nature and Properties of Soils. Prentice Hall. 2002 Buchanan, B., Gruissem, W. and Jones, R. (Eds.) - Biochemistry and Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologist. 2000. Marschner, H. - Mineral Nutrition of Higher Plants. Academic Press. London. UK. 1995 Procházka a kol. Fyziologie rostlin. Academia Praha 1998 (kapitola Vodní provoz, autor J. Šantr ek) Taiz, L. and Zeiger, E. Plant Physiology. Sinauer Associates, Inc., Publichers. 2002.
7
Zadání praktických úloh k tématu:
MINERÁLNÍ VÝŽIVA P ehled úloh k vypracování: Úkol 1: Vizuální projevy nedostatku živin 1a) Pomocí powerpointového klí e identifikujte minerální živinu, která je v nedostatku 1b) Prove te biometrickou analýzu rostlin, které byly kultivovány v neúplných živných roztocích
1c) Pomocí analýzy obrazu charakterizujte ko enový systém rostlin kultivovaných v plném živném roztoku a roztoku N-deficientním
8
Úkol 1: Vizuální projevy nedostatku živin (deficien ní syndrom) Cíl: Demonstrovat význam jednotlivých živin pro r st rostlin.
Hypotéza, kterou b hem práce ov íme: Nedostatek ur ité živiny má charakteristický vizuální projev, který souvisí s významem (funkcemi) dané živiny v rostlin i možnostmi její retranslokace v rámci rostlinného t la.
Díl í úlohy:
1a) Pomocí powerpointového klí e identifikujte minerální živinu, která je v nedostatku 1b) Prove te biometrickou analýzu rostlin, které byly kultivovány v neúplných živných roztocích 1c) Pomocí analýzy obrazu charakterizujte ko enový systém rostlin kultivovaných v plném živném roztoku a roztoku Ndeficientním Princip: Rostlina pot ebuje pro sv j optimální rozvoj dostatek všech esenciálních prvk (makro- i mikroelement ). Její r st je proto vždy limitován tou živinou, které je v prost edí nejmén (zákon minima). P i nedostatku se rozvíjí syndrom deficience, soubor vizuálních znak (nap . snížená rychlost r stu, morfologické odlišnosti, barevné zm ny, zasychání list ), charakteristický pro každou živinu v závislosti na jejích funkcích v rostlin a možnostem recyklace v rámci rostlinného t la. Vhodnou metodou pro navození a studium deficience je kultivace rostlin v živném roztoku, postrádajícím n který z esenciálních prvk . V tomto p ípad byly rostliny kultivovány v živném roztoku Hoagland 3. Tento roztok anorganických solí je koncipován tak, aby svým složením poskytoval rostlinám všechny nejd ležit jší esenciální prvky v p im eném množství. Jeden prvek však byl vždy vynechán a rostlina vystavena jeho nedostatku.
9
Laboratorní postup: Pot eby pro úlohy 1a-c: • • • • • • • • •
• • •
rostliny kuku ice kultivované v kompletním živném roztoku rostliny kuku ice kultivované v neúplných živných roztocích powerpointový klí k ur ování deficiencí n žky m ítko laboratorní váhy váženky nebo alobal skener program pro analýzu obrazu NIS Elements s modulem pro zpracování ko enového systému (RootAnalyzator) 0,1% roztok agaru pinzeta program Excel
Úloha 1a) Pomocí powerpointového klí e identifikujte minerální živinu, která je v nedostatku Provedení úlohy 1a): V nádobách jsou p ipraveny rostliny kultivované v kompletním živném roztoku (kontrolní rostliny) a rostliny deficientní. Rostlinný materiál si dob e prohlédn te a pro každý soubor rostlin ur ete pomocí powerpointového klí e, která živina je v nedostatku. Zaznamenejte všechny vizuální projevy nedostatku (vzr st, morfologie, barva list , zasychání). Všímejte si, která
ást rostliny je nejvíce ovlivn na a zkuste vysv tlit pro . Vše zaznamenejte do
protokol .
Úloha 1b) Prove te biometrickou analýzu rostlin, které byly kultivovány v neúplných živných roztocích Provedení úlohy 1b): 1.
Prove te detailní analýzu rostlinného materiálu v jednotlivých variantách. U každé rostliny
stanovte následující charakteristiky: •
délka prýtu (nadzemní ásti rostliny) - m te m ítkem od obilky ke špi ce nejdelšího listu
•
délka ko enového systému - m te m ítkem od obilky ke špi ce nejdelšího ko ene
•
erstvá hmotnost prýtu
•
erstvá hmotnost ko en
2. Hmotnost prýtu a ko en použijte pro výpo et celkové erstvé hmotnosti rostliny a pom ru R/S (z anglického root/shoot), tj. pom ru hmotnosti ko en a nadzemní ásti. 3. Délkové parametry, celkovou hmotnost rostliny a R/S pom r zaznamenejte do tabulky 1, pomocí programu Excel vypo ítejte pr m rné hodnoty a sm rodatné odchylky. Výsledky vyjád ete graficky.
10
U všech sledovaných parametr najd te statisticky významné rozdíly pomocí programu NCSS nebo jiného statistického programu. Statisticky významné hodnoty zaznamenejte do graf .
Tab. 1. Biometrické charakteristiky rostlin délka prýtu (cm) rostlina 1 rostlina 2 rostlina 3 rostlina 4 rostlina 5 pr m r sm rodatná odchylka
kontrola
-N
-P
-Ca
-Mg
-K
- Fe
-P
-Ca
-Mg
-K
- Fe
-P
-Ca
-Mg
-K
- Fe
-Mg
-K
- Fe
délka ko enového systému (cm) rostlina 1 rostlina 2 rostlina 3 rostlina 4 rostlina 5 pr m r sm rodatná odchylka
kontrola
-N
celková erstvá hmotnost rostliny (g) rostlina 1 rostlina 2 rostlina 3 rostlina 4 rostlina 5 pr m r sm rodatná odchylka
kontrola
-N
pom r hmotnosti ko en a nadzemní biomasy rostlina 1 rostlina 2 rostlina 3 rostlina 4 rostlina 5 pr m r sm rodatná odchylka
kontrola
-N
-P
11
-Ca
Úloha 1c) Pomocí analýzy obrazu charakterizujte ko enový systém rostlin kultivovaných v plném živném roztoku a roztoku Ndeficientním Provedení úlohy 1c): 1. Pro analýzu použijte ko eny rostlin z úlohy 2a. 2. Ko eny naskenujte pomocí skeneru, který byl speciáln upraven pro metodu snímání ve vodním sloupci. Jako medium použijte 0,1% agar, který umožní lepší rozprost ení ko en díky v tší hustot . Ko enový systém pe liv rozprost ete, minimalizujete tak k ížení ko en a obtížnost následného vyhodnocení analýzou obrazu. 3. Získaný obrázek analyzujte v programu Lucia G s modulem RootAnalyzator. Postupujte podle p iloženého návodu. Získaná data exportujte do programu Excel. Ze získaných dat vyhodno te následující parametry: celkovou délku ko enového systému délku osy hlavního ko ene po et postranních ko en 1. ádu a 2. ádu Ur ením t chto parametr
získáte p edstavu o uspo ádání ko enového systému v závislosti na
podmínkách kultivace. V protokolech vyhodno te, zda rostlina preferovala spíše délkový r st hlavního ko ene nebo rozvoj laterálních (postranních) ko en .
Vyhodnocení experimentu: Vypracujte protokol, ve kterém vyhodnotíte získaná data. Zamyslete se nad vztahem mezi dostupností živin a morfologií rostliny.
Zkuste odpov d t na následující otázky: O em vypovídá zm na R/S pom ru rostliny? Pro je pro rostliny výhodné zvýšit R/S pom r p i nedostatku dusíku?
Jaké to má d sledky pro p ežívání rostliny v m nících se podmínkách prost edí?
12
