Agronomická fakulta Ústav botaniky a fyziologie rostlin

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav botaniky a fyziologie rostlin

METABOLISMUS 6-BENZYLAMINOPURINU V INDUKCI ORGANOGENEZE IN VITRO Bakalářská práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

RNDr. Ing. Marek Klemš, Ph.D.

Bradáčová Anna

Brno 2007 1

PROHLÁŠENÍ

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma "Metabolismus 6-benzylaminopurinu v indukci organogeneze in vitro" vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.

Datum: Podpis:

2

PODĚKOVÁNÍ

Chtěla bych vyjádřit poděkování vedoucímu své diplomové práce RNDr. Ing. Markovi Klemšovi, Ph.D. za odborné vedení, pomoc a cenné rady poskytnuté při řešení dané problematiky a Zdeňce Prokešové za rady a pomoc při laboratorní práci.

3

ABSTRACT The aim of this work was to study the metabolism of 6-benzyladenine in induction of shoot organogenesis on petunia leaf explants in relation to the dynamics of promoting regenerants, and not least to observe the changes in the levels of endogenous cytokinins during this induction and subsequent visible morphogenesis. The assessment of the effect of cytokinins on shoot organogenesis and the frequency of shoot regeneration (i. e. part of regenerating segments from all segments was quantified in per cent) was observed in time of 0, 5, 14, 17, 19, 24, 34 and 43 days. Cytokinins were quantified in samples collected in time of 0, 2 hours and 43 days from the beginning of the culture on induction medium and/or growth regulators free medium. The content of endogenous cytokinins was determined by ELISA after subsequent extraction, purification and HPLC separation. Spectrophotometric analysis of the levels of chlorophyll “a” and “b” was performed in the beginning of the culture (after 2 hours) and after 43 days. The following facts were find out: The shoot regeneration on petunia leaf segments on the culture medium with BA proceed after 10th day of induction time. The highest frequency of shoot regeneration was observed on the “intensive induction variants”: the “continuous variant” with the 43 days (long-term) culture on induction medium, and on the “subculture variant” with the 5 days culture on induction medium and subculture on the new induction medium for subsequent 38 days culture. The transfer of segments after 5 and 7 days on regulators free MS medium evidently decreased the frequency of shoot regeneration, whereas the subculture on the new fresh induction medium increased the number of regenerated segments comparable to the continuous long-term culture on the medium supplemented by BA. Petunia leaf segments took BA up from the culture medium significantly in the long-term culture. The presence of BA in the culture medium increased the levels of others cytokinins such as meta-topoline riboside, zeatinriboside and isopentenyladenine riboside in the beginning and after the end of long-term culture. Leaf segments on the medium supplemented with BA had the leaf pigments very well preserved . In the short-term culture the content of chlorophyll “a” was increased. The level of chlorophyll “a” in the segments of petunia leaves in the long-term culture

4

decreased to the same level like in the culture on the medium without growth regulators, respectively. We can conclude, that the best and most effective way to achieve induction of shoot organogenesis on the petunia leaf segments is the subculture on the MS medium without growth regulators for the longer time or to cultivate segments for the long time. Key words: shoot formation, petunia, cytokinin, chlorophyll

5

ABSTRAKT

Cílem

práce

bylo

studium

metabolismus

6-benzyladeninu

v

indukci

organogeneze in vitro. Segmenty ze střední části čepelí listů petunie (Petunia hybrida) cv. Lady blue byly kultivovány na indukčním médiu obohaceném o cytokinin (3 µM benzyladenin) a auxin (0,5 µM kyselina 1-naftyloctová). Krátkodobá kultivace segmentů listů na médiu s přídavkem růstových regulátorů trvala 5 nebo 7 dní, zatímco dlouhodobá 43 dní. Po krátkodobé kultivaci byly segmenty pasážovány na MS médium bez růstových regulátorů, nebo znovu na médium s růstovými regulátory. Pro stanovení účinku cytokininů na indukci organogeneze byla hodnocena frekvence regenerace prýtů (tj. podíl regenerujících segmentů z celkového počtu segmentů, vyjádřen v %) v intervalech 0, 5, 14, 17, 19, 24, 28, 34 a 43 dní. Kultivace za účelem odběru vzorků pro stanovení obsahu cytokininů probíhala v intervalech 0, 2 hodiny a 43 dní a to na médiu s růstovými regulátory nebo bez nich. Obsah endogenních cytokininů byl stanoven pomocí metody ELISA po předchozí extrakci, purifikaci a HPLC separaci. Kultivace na stanovení chlorofylu „a“ a „b“ probíhala v intervalech 0 hodin, 2 hodiny a 43 dní. Obsah byl stanoven spektrofotometricky. Regenerace segmentů listů petunie na médiu s BA probíhala do desátého dne indukce organogeneze. Nejvyšší regenerace byla při dlouhodobé kultivaci na indukčním médiu a při 5 denní kultivaci na indukčním médiu a následném přenesení na nové indukční médium. Segmenty listů petunie přijímaly BA s kultivačního média prokazatelně při dlouhodobé kultivaci. Přítomnost BA v médiu zvyšovala také hladiny meta-topolin ribosidu, zeatinribosidu a izopentenyladenin ribosidu na počátku i po skončení dlouhodobé kultivace. Segmenty listu petunie na médiu s obsahem BA velmi dobře zachovaly listová barviva. Při krátkodobé kultivaci se obsah chlorofylu "a" zvýšil, v případě dlouhodobé kultivace se jeho obsah snížil, resp. byla jeho hodnota vysoká stejně jako při kultivaci segmentů bez růstových regulátorů. Klíčová slova: regenerace prýtů, petunie, cytokininy, chlorofyl

6

POUŽITÉ ZKRATKY 2,4-D

2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina

5´-AMP

5´-adenosinmonofosfát

AP-konjugát

konjugát alkalické fosfatázy s cytokininem

BA

6-benzyladenin

BA7G

6-benzyladenin-7-glukosid

BAR

6-benzyladeninribosid

BAR5´MP

6-benzyladeninribosid-5´-monofosfát

BSA

hovězí sérum albumin

C18 Sep-Pak

chromatografická kolonka se sorbentem s nasyceným řetězcem z 18 uhlíků

CDK

cyklin-dependentní kináza

CK

cytokinin

DAG

diacylglycerol

DEAE-celulóza

dietylaminoetylcelulóza

DHZ

dihydrozeatin

DHZR

dihydrozeatinribosid

DNA

deoxyribonukleová kyselina

ELISA

enzymová imunosorbentní analýza

GC

plynová chromatografie

GS-MS

hmotovou spektrometrií

GTP

guanosin-5´-trifosfát

HPLC

vysokoúčinná kapalinová chromatografie

IAA

indolyl-3-octová kyselina

IBA

indolyl-3-máselná kyselina

IM

indukční médium

iP

izopentenyladenin

IP3

inositol-1,4,5-trifosfát

IPR

izopentenyladeninribosid

ipt

izopentenyltransferáza

K

kinetin

MAb

monoklonální protilátka

7

MAPkináza

mitogen activated protein kinase

MemT

meta-metoxytopolin

MemTR

meta-metoxytopolinribosid

MEoT

orto-metoxytopolin

MeoTR

orto-metoxytopolinribosid

MS

MURASHIGE a SKOOG médium

mT

meta-topolin

mTR

meta-topolin ribosid

NAA

1-naftyloctová kyselina

oT

orto-topolin

PAA

fenyloctová kyselina

P-celulóza

fosfocelulóza

PIP2

fosfatidylinozitol-4,5-bisfosfátu

PNPP

p-nitrofenylfosfát

RR

růstové regulátory

TBS

trif-bufferet saline

TFA

trifluoroctová kyselina

tRNA

transferová ribonukleová kyselina

Z

zeatin

ZR

zeatinribosid

8

SEZNAM GRAFŮ graf 1:

Frekvence regenerace při 5 a 7 denní kultivaci na IM a následném přenesení na nové IM s obsahem BA

graf 2:

Frekvence regenerace při 5 a 7 denní kultivaci na IM a následném přenesení na MS médium bez BA

graf 3:

Počet regenerantů na explantát z listu petunie při dlouhodobé kultivaci na BA, při přenesení segmentů po 5 a 7 dnech na nové IM a při přenesení segmentů po 5 a 7 dnech na MS médium

graf 4:

Obsah endogenních cytokininů (BA, BAR, Z, ZR, DHZ, IP, mT, mTR) v segmentech listů petunie kultivovaných na médiu s BA po dobu 2 hodiny (b) a 43 dní (c)

ve srovnání s kontrolní variantou bez kultivace (a) a

kultivací na médiu bez růstových regulátorů (d) graf 5:

Obsah chlorofylu "a" v segmentech listů petunie kultivovaných na indukčním médiu s BA po dobu 2 hodiny a 43dní ve srovnání s kontrolními variantami bez kultivace a kultivací na médiu bez růstových regulátorů

SEZNAM OBRÁZKŮ obr. 1:

Strukturní vzorce cytokininů (CK)

obr. 2:

Schéma metabolismu cytokininů (Dobrev, P. (2001) PhD thesis)

obr. 3:

Schéma stanovení cytokininů metodou ELISA

obr. 4:

Extrakce listových barviv za použití kolonek Sep-pak

obr. 5:

Kultivace v aseptickém prostředí, šikmé agarové MS (MURASHIGE a SKOOG 1962) médium s 5 g.l-1 sacharózy

obr. 6:

Kultivace vzrostlých rostlin v in vitro podmínkách na médiu GAMBORG et al. (1968) s 10 g.l-1 sacharózy a 0,5 g.l-1 aktivního uhlí při laboratorní teplotě 25 ± 1 ºC, po celou dobu na světle (200 µmol.m-2.s-1)

obr. 7:

Kultivace segmentů ze střední části čepelí listů na Petriho miskách, na indukčním MSmédiu obohaceném o cytokinin (3 µM benzyladenin - BA) a auxin (0,5 µM kyselina 1-naftyloctová - NAA)

obr. 8:

Regenerace při 5 denní kultivaci na IM a následném přenesení na MS médium bez BA

9

obr. 9:

Regenerace při 7 denní kultivaci na IM a následném přenesení na MS médium bez BA

obr. 10: Dlohodobá kultivace na IM (43 dnů) obr. 11: Regenerace při 5 denní kultivaci na IM a následném přenesení na nové IM s obsahem BA obr. 12: Regenerace při 7 denní kultivaci na IM a následném přenesení na nové IM s obsahem BA

SEZNAM TABULEK tab. 1:

Hodnocení procesu organogeneze - jednotlivé varianty

tab. 2:

Monochromatická záření pro měření chlorofylu „a“ a „b“

10

OBSAH Abstrakt: anglický, český Použité zkratky Seznam grafů Seznam obrázků Seznam tabulek 1. Úvod ......................................................................................................................... 12 2. Literární přehled ....................................................................................................... 14 2. 1 Fyziologické aspekty morfogeneze rostlin ........................................................ 14 2. 2 Kultivační podmínky......................................................................................... 15 2. 3 Růstové regulátory ............................................................................................ 15 2. 3. 1 Růstové regulátory v organogenezi in vitro ............................................... 16 2. 3. 2 Interakce fytohormonů typu cytokininů a auxinů při řízení vývoje rostlin 17 2. 3. 3 Přenos signálu u cytokininů a auxinů ......................................................... 17 2. 4 Metodické přístupy ke studiu růstových regulátorů .......................................... 18 2. 5 Cytokininy ......................................................................................................... 20 2. 5. 1 Účinky cytokininů v rostlinách .................................................................. 21 2. 5. 2 Biosyntéza cytokininů ................................................................................ 23 2. 5. 3 Metabolismus cytokininů ........................................................................... 24 2. 5. 4 Transport a translokace cytokininů ............................................................ 26 2. 5. 5 Cytokininy v in vitro kulturách .................................................................. 25 2. 5. 6 Benzyladenin .............................................................................................. 27 2. 6 Auxiny ............................................................................................................... 28 2. 6. 1 Účinky auxinů v rostlinách ........................................................................ 28 2. 6. 2 Metabolismus auxinů ................................................................................. 29 2. 6. 3 Transport auxinů ........................................................................................ 30 2. 6. 4 Auxiny v in vitro kulturách ........................................................................ 31 3. Materiál a metody ...................................................................................................... 32 3. 1 Charakteristika rostlinného materiálu ............................................................... 32 3. 2 Experimentální kultivační podmínky ................................................................ 32 3. 3 Experimentální varianty a hodnocení indukce organogeneze ........................... 33 3. 4 Odběr vzorků pro analýzy ................................................................................. 33 3. 5 Stanovení cytokininů ......................................................................................... 33 3. 6 Stanovení chorofylu „a“ a „b“ ........................................................................... 37 3. 7 Statistické hodnocení ........................................................................................ 39 3. 8 Fotodokumentace .............................................................................................. 39 3. 9 Prezentace výsledků bakalářské práce .............................................................. 39 4. Výsledky .................................................................................................................... 40 5. Diskuse ....................................................................................................................... 44 6. Závěr .......................................................................................................................... 46 7. Použitá literatura ........................................................................................................ 48 8. Přílohy......................................................................................................................... 61

11

1. Úvod

Již od počátku 20. století jsou využívány metody, při nichž je možno zkoumat regeneraci izolovaných částí rostlin v aseptických podmínkách. Prostředí, které bylo dopředu zbaveno mikroorganismů, tedy sterilní prostředí, umožňuje dlouhodobě studovat vliv kultivačních podmínek na izolované části rostlin. Ke kultivaci jsou používány různé kultivační nádoby, které byly dříve výhradně ze skla, a proto byl tento přístup nazýván „kulturami in vitro“, přičemž dnešní technologie používají i nádoby z průhledného plastu. Pro rozvoj nových technologických postupů, za využití in vitro kultur, byly zásadní některé objevy týkající se procesů výživy a růstu explantovaných částí rostlin. Chemickou analýzou kalusu tabáku z in vitro kultury bylo odvozeno a propočítáno složení kultivačního média (MURASHIGE a SKOOG 1962). Od postupných empirických přístupů a snah vedoucích k prosté kultivaci rostlinného explantátu, přes odvození regenerace (SKOOG a MILLER 1957) a morfogeneze rostlin pomocí explantací v dřívějším období, směřují recentní experimenty ke studiu molekulární podstaty morfogeneze (YAMAGUCHI et al. 2003). Významnou součástí studia růstu a vývoje rostlin je pochopení účinků především fytohormonů a také růstových regulátorů, které jsou do médií přidávány k indukci různých fyziologických procesů. Regulátory růstu ovlivňují chování kultury buď samostatně, nebo, a to častěji, ve vzájemných kombinacích. Jejich účinek závisí na druhu růstového regulátoru, na délce jeho působení a na jeho koncentraci. V průběhu kultivace se obsah se obsah růstových regulátorů v médiu snižuje. Současně s tím se mění obsahy fytohormonů v explantátu a to kvantitativně i kvalitativně nejenom v průběhu kultivace, ale i při přenesení na nové kultivační médium. Významnou roli hrají v kultivacích in vitro cytokininy. Ty jsou do kultivačních médií většinou přidávány v kombinaci s auxiny. Mohou však působit i samostatně, alespoň v některých fázích kultivace, nebo může jejich účinek silně převládat. Samy cytokininy mohou nacházet uplatnění při indukci tvorby prýtů. Cytokininy mohou indukovat tvorbu adventivních meristémů na segmentech stonků, listů a děloh při kultivaci in vitro. Celý postup kultivace je možno dlouhodobě opakovat, je zde však časové omezení, protože cytokininy při dlouhodobějším působení negativně ovlivňují růst a morfologii regenerantů a značně znesnadňují následné zakořeňování (WERBROUCK et al. 1995). Proto je nutné po určité době, která musí být 12

experimentálně ověřena, začít s novou kulturou od primárního explantátu, který byl izolován z normální rostliny. Benzyladenin je cytokinin využívaný k indukci morfogeneze prýtů v in vitro kulturách, a je často přidávaným růstovým regulátorem v médiích za účelem mikropropagace (GRIEVE et al. 1997). Jeho aktivita v procesu morfogeneze závisí na intenzitě odbourávání a tvorbě benzyladeninu konjugátů a na metabolických systémech dostupných k těmto přeměnám. Exogenní aplikace benzyladeninu vede k intenzivnímu metabolismu a ke změnám hladin endogenních cytokininů, které se na indukci morfogenního

procesu

mohou

také

podílet.

K rychlým

projevům

aplikace

benzyladeninu náleží kromě morfogeneze i procesy oddálení senescence a degradace chlorofylu a ovlivnění translokace látek.

Cílem práce bylo studovat změnu endogenních hladin cytokininů v explantátech listových čepelí petunie (Petunia hybrida) cv. Lady blue. Byla studována přímá organogeneze ve vztahu k příjmu benzyladeninu a změnám ostatních hladin endogenních cytokininů těmito rostlinami, na různých typech indukčních médií lišících se v době kultivace listových explantátů a přenesením buď na nové indukční médium nebo na MS médium. Použití různé doby kultivace a různých kultivačních médií mělo za cíl sledovat různou úroveň frekvence tvorby prýtů.

13

2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2. 1 Fyziologické aspekty morfogeneze rostlin Jednotlivé části rostliny tvoří harmonický celek (integritu). Na jejím vzniku se výrazně podílejí rostlinné hormony. Hlavním projevem celistvosti rostlin jsou růstové korelace, tj. růstové vztahy mezi jednotlivými částmi těla rostliny. K jejich poznání jsou studovány především rozdíly v růstu nějakého orgánu rostliny, pokud je tento orgán na intaktní rostlině nebo pokud je izolován, a tedy vymaněn z růstově korelačních vlivů ostatních orgánů. Protože tyto růstově korelační vlivy jsou do značné míry určovány rostlinnými hormony, můžeme poznávat fytohormonální vliv určitého orgánu buď tak, že jej po odříznutí nahradíme aplikací určitého fytohormonu, nebo tak, že určíme endogenní fytohormonální obsah tohoto orgánu. Zvlášť významnou růstovou korelací je apikální dominance lodyhy, tj. korelace mezi vrcholem lodyhy a růstem postranních pupenů (SACHS a THIMANN 1964). Hlavním korelačním signálem je auxin (IAA), který větvení lodyhy potlačuje. Při iniciaci růstu postranních pupenů hrají klíčovou roli cytokininy. Porušená integrita se obnovuje regenerací. V explantovaných kulturách se velmi často používá pojem regenerace, protože se v kultuře vytvářejí nové útvary, které předtím nebyly makroskopicky pozorovatelné. Základním

předpokladem

regenerace

je

totipotence

rostlinné

buňky

(REINERT a BACKS 1968), tj. schopnost jakékoli plnohodnotné rostlinné buňky dát vznik jakémukoli pletivu i celému rostlinnému organizmu. Aby diferenciovaná, plnohodnotná buňka mohla svoji totipotenci projevit musí dojít k její dediferenciaci (AITCHINSON et al. 1977). To znamená, že se musí strukturně i funkčně vrátit na úroveň zygoty, buňky embryonální nebo meristematické. Zjednodušují se buněčné organely a především se obnovuje dělení. Není-li dělení přísně organizované a není-li nastolena buněčná a posléze orgánová polarita, nedojde k vývinu organizované struktury, ale začne vznikat pouze kalus, soubor diferencovaných i nediferencovaných buněk bez polarity, organizovaného růstu a prostorové orientace (HALPERIN 1969). Hlavním následkem této dediferenciace je u většiny kultur ztráta fotosyntetické schopnosti (SLATER et al. 2003). Na druhou stranu, při dediferenciaci buňky nesmí dojít ke ztrátě, či nevratné inaktivaci sebemenší části genetické informace. Totipotentní vlastnosti vykazují buňky embryonální a meristematické, s minimálním stupněm diferenciace. 14

V umělých podmínkách mohou regenerovat různé struktury ze základů, které již byly založeny na donorové rostlině před izolací explantátu. V explantovaných kulturách se tento proces většinou označuje jako regenerace ze založených základů. Jestliže se základy vytváří teprve během kultivace, jedná se o regeneraci de novo. V obou těchto případech se jedná o regeneraci přímou. O regeneraci nepřímé mluvíme v případě, že dělení meristematických buněk vnesených spolu s explantátem nebo vzniklých dediferenciací vede nejprve k vytváření kalusu a teprve poté k regeneraci nových kultur.

2. 2 Kultivační podmínky Kultivační podmínky umožňují růst a vývoj regenerantů z explantátu. Zahrnují především médium, které představuje zdroj energie, výživy a regulačních látek. Dále k nim patří světelný režim, teplota a plynná fáze kultivačního média (REINERT a BAJAJ 1977). Kultivační médium je exogenním zdrojem růstových regulátorů. Důležitou součástí média jsou minerální živiny, dále organické látky, především cukry, jako zdroj energie a uhlíku, vitamíny, aminokyseliny, případně i další speciální organické látky. Všechny složky živného média se navzájem ovlivňují a společně se podílejí na procesech, které probíhají v kultivovaných pletivech. Teplota a světlo ovlivňují explantovanou kulturu modifikací nejrůznějších biochemických a fyziologických procesů. Osvětlení má vliv především na akumulaci sekundárních metabolitů, kterými jsou nejčastěji antokyany a jiné pigmenty (SEITZ a HINDERER 1988), ale může ovlivňovat i složení jiných sloučenin v kalusových kulturách, např. seskviterpenů v in vitro kultuře Marticaria chamomilla (MULDER-KRIEGER et al. 1988). Standardní teplota používaná k indukci kalusu a růstu kultivovaných buněk in vitro je v rozmezí 17-25 ºC, ale každému rostlinnému druhu může vyhovovat jiná teplota (PIERIK 1997). Průměrné pH se obyčejně upravuje v rozmezí 5-6 před autoklávovaním (PIERIK 1997).

2. 3 Růstové regulátory V rostlinném organismu se růstové regulátory vyskytují přirozeně a nazývají se fytohormony. Podílejí se na regulaci procesů růstu a vývoje (ontogeneze), diferenciaci, regeneraci, organogenezi a zasahují do vzájemného působení všech častí a orgánů živé rostliny. Kromě nativních růstových látek jsou dnes k dispozici i umělé, synteticky

15

připravené regulátory. V obou případech jejich fyziologický účinek závisí na koncentraci. V šedesátých letech minulého století byly růstové regulátory v souvislosti s popisem fyziologických účinků, stimulujících či inhibujících růst a jeho dílčí procesy, rozděleny na stimulátory a inhibitory. K růstovým látkám, které mají ve fyziologickém množství stimulační účinek patří cytokininy, auxiny a gibereliny (KUTINA 1988).

K látkám s inhibičním vlivem patří kyselina abscisová, fenolické

látky a kyselina jasmonová. Fytohormony jsou přítomny v rostlině ve velmi malých množstvích a jsou účinné dle typu již v koncentracích 10-15 až 10-8 M (TARKOWSKI et al. 2004). Přítomnost fytohormonů v místě účinku je dána jejich biosyntézou, rozkladem nebo jinou inaktivací a také transportem vodivými pletivy, apoplastem a symplastem. Jejich působení v buňce je podmíněno vazbou na receptor. Vytvoření komplexu hormonreceptor spouští řetěz biochemických změn, který představuje přenos signálu v buňce (LAURIE a HALFORD 2001). Rostlina vnímá signály ze svého okolí a reaguje na ně. Jsou to zemská tíže, světlo, fotoperioda, teplota, složení vzduchu, voda a minerální živiny, mechanické překážky, patogeny apod. Buňky v rostlině reagují také na signály, které přijímají ze sousedních buněk, a kterým říkáme signály vnitřní. Jsou to fytohormony, cukry, dusíkaté látky, peptidy, proteiny, voda, minerální látky, mechanické tlaky, elektrické signály, teplota, světlo, poranění a další. Signály hormonální jsou přijímány receptory (vazebnými proteiny), tj. specifickými proteiny s vazebnými místy pro určitý signál. Receptory se nacházejí v plazmatické membráně nebo uvnitř buňky. Mezi příjmem signálu a reakcí buňky nebo rostliny probíhá složitý proces přenosu signálu. Představuje změny transportu iontů mezi kompartmenty, regulaci metabolických cest a distribuce metabolitů, regulaci exprese genů, změny v cytoskeletu, hormonální regulaci a nakonec změny růstových parametrů. Na funkci jednotlivých složek příjmu a přenosu signálu závisí citlivost k fytohormonům, která vedle jejich koncentrace spoluurčuje fyziologické reakce na fytohormony.

2. 3. 1. Růstové regulátory v organogenezi in vitro Proces organogeneze je dán poměrem auxinů a cytokininů v kultivačním médiu. Typ a koncentrace auxinů nebo cytokininů nebo jejich vzájemný poměr může dramaticky změnit růstové charakteristiky kultur a akumulaci produktu v kultivovaných rostlinných buňkách (RAO a RAVISHANKAR 2002). Organogeneze kořenů je

16

všeobecně indukována vyšším obsahem auxinů oproti cytokininům v kultivačním médiu a organogeneze prýtů vyšším obsahem cytokininů oproti auxinům (SKOOG a MILLER 1957). Z auxinů se nejčastěji používají syntetické látky: 2,4-D (2,4 dichlorfenoxyoctová kyselina), NAA (1-naftyloctová kyselina), z přirozených IBA (indolyl-3-máselná kyselina) méně IAA (indolyl-3-octová kyselina). Z cytokininů se používají syntetický kinetin (furfurylaminopurin) a thidiazuron (derivát difenylmočoviny), z přirozených BA (6-benzyladenin), iP (izopentenyladenin) či vysoce fyziologicky aktivní mT (metatopolin). 2. 3. 2. Interakce fytohormonů typu cytokininů a auxinů při řízení vývoje rostlin Základní růstové a vývojové procesy rostlin založené na regulaci dělení a diferenciace buněk jsou hormonálně řízeny. Uplatňují se zde zejména dvě skupiny fytohormonů, auxiny a cytokininy. O jejich výsledném účinku rozhoduje jejich vzájemná koncentrace a intenzita přenosu jimi nesených signálů. Přes 40 let uplynulo od objevu, kdy auxiny spolu s cytokininy navodily buněčné dělení a růst v kulturách rostlinných pletiv (SKOOG a MILLER 1957). Následné studie na intaktních rostlinách a izolovaných pletivech ukázaly synergický, antagonistický i vzájemně se ovlivňující vztah mezi těmato dvěma hormony (COENEN a LOMAX 1997). Interakce mezi cytokininy a auxiny je často závislá na rostlinném druhu a na typu pletiva. Různorodost způsobů, jakými auxiny a cytokininy regulují fyziologické odezvy (např. dva hormony působí synergicky v řízení buněčného dělení a antagonicky v kontrole růstu postranních pupenů a kořenových výhonků) naznačuje rozmanitý výchozí mechanismus vzájemné interakce. Hypotézu, že auxiny a cytokininy ovlivňují řadu procesů, podporuje výzkum dvou různých auxin-resistentních mutantů Arabidopsis, aux1 a axr1, u kterých se také prokázala resistence k cytokininům u růstové inhibice kořenů (HOBBIE a ESTELLE 1994). 2. 3. 3. Přenos signálu u cytokininů a auxinů Přenos signálu začíná jeho rozpoznáním specifickým receptorem (vazebným proteinem, resp. vazebným místem vazebného proteinu) na povrchu buněk (plazmalema), nebo na vnitřních membránách či v cytoplazmě. Při interakci signálu na membránovém receptoru dochází k aktivaci membránového GTP-vázajícího proteinu (má tři subjednotky α, β, γ), na podjednotku α se naváže GTP (guanosin-5´-trifosfát), tento komplex se oddělí a zbylé podjednotky β a γ aktivují membránové enzymy 17

syntetizující molekuly druhých poslů. jedním z aktivovaných membránových enzymů (je jich více) je fosfolipáza C, produkty této fosfolipázy C jsou diacylglycerol (DAG), či inositol-1,4,5-trifosfát (IP3) po štěpení fosfatidylinozitol-4,5-bisfosfátu (PIP2). DAG zůstává v membráně a aktivuje proteinkinázu C (přímo mění fosforylaci proteinů – tedy indukuje děj metabolický či morfogenní), IP3 se váže na receptor v endoplazmatickém retikulu (případ auxinů), či na vakuole (případ cytokininů) a dochází k uvolnění iontů vápníku (změně koncentrace iontů CaII+ v cytoplazmě), tyto změny mohou být oscilační, ionty CaII+ jsou nejuniverzálnější signální molekulou. Touto signální cestou je obdobně indukován děj morfogenní či metabolický (UMEDA et al. 2000). Signální dráhy končí u fosforylace či defosforylace proteinů, které vedou k jeho aktivaci či deaktivaci. Často se v signální dráze objevují tzv. MAPkinázy (mitogen activated protein kinase), které interagují s cytoskeletem a účastní se tak přenosu signálu pro regulaci buněčného cyklu (FRANCIS a SORRELL 2001). Review na molekulární mechanismus přenosu signálu cytokininů popsali DERUERE a KIEBER (2002).

2. 4 Metodické přístupy ke studiu růstových regulátorů Pokrok ve výzkumu růstových regulátorů je velmi těsně závislý na vývoji nových metod, a to převážně metod biochemických. Nejčastěji se používají tyto koncepčně odlišné přístupy: •

stanovení vztahů mezi reakcí rostliny a obsahem růstových regulátorů v příslušných orgánech, bez umělého ovlivňování obsahu

•

aplikace syntetického či extrahovaného růstového regulátoru na jistou část rostliny a sledování změn fyziologických procesů

•

experimentální navození nedostatku jistého růstového regulátoru a pozorování nápravné reakce jeho následným dodáním

•

experimentální navození zvýšené produkce růstového regulátoru a pozorování reakcí rostliny V naprosté většině pokusů se vychází z předpokladu, že limitující je jen

koncentrace růstového regulátoru, nikoli kapacita receptorového systému. Tento předpoklad ale nemusí být vždy správný. Další nepříjemnou komplikací pokusů bývá vzájemné ovlivňování několika současně přítomných růstových regulátorů, které lze stěží vyloučit. Některé růstové regulátory mohou také velmi rychle přecházet do méně aktivních či zcela inaktivních konjugovaných forem. 18

Koncentrace rostlinných hormonů v rostlinách je velmi nízká (10-6 až 10-8 M) a proto metody pro jejich stanovení musí být velmi citlivé a navíc dostatečně selektivní. Vlastní stanovení obvykle začíná extrakcí z čerstvého vzorku (alkoholem či acetonem) a převedením odparku do bezvodých organických rozpouštědel. Pak následuje separace a čištění (využívají se především různé chromatografické metody) (RIVIER a CROZIER 1987). Ke konečné kvantitativní detekci vyčištěných vzorků se nabízí celá řada metod s velmi rozdílnou přesností. Biotesty jsou z kvantifikačního hlediska nepřesné, byly však prvními metodami stanovení fytohormonů v rostlinách (SKOOG et al. 1967). Někdy bývají nenahraditelné pro ověření biologické účinnosti přesně definovaných sloučenin, izolovaných fyzikálně-chemickými metodami. Fyzikálně chemické metody dnes zcela převládají. Především je používána kapalinová chromatografie (HPLC), dále plynová chromatografie (GC), někdy i ve spojení s hmotovou spektrometrií (GS-MS). Výhodou těchto metod, jsou kromě značné citlivosti, i menší nároky na čistotu extraktu. Imunologické metody mají extrémní citlivost, nedostižnou jinými postupy. Jejich širšímu využití však brání obtížná příprava a tím i vysoká cena specifických protilátek (imunoglobuliny, které jsou produkované pouze živočišnými buňkami). Také nároky na čistotu extraktů jsou vysoké. Existuje řada modifikací imunologických metod, např. s využitím radioizotopů či enzymů. V případě aromatických cytokininů byl vyvinut originální postup založený na vývoji specifických protilátek rozpoznávajících jednotlivé skupiny aromatických cytokininů. Originální proto, že tento přístup nebyl dosud použit k hledání nových látek v rostlinách, neboť k detekci přirozených látek neznámého původu se většinou využívala kombinace chromatografických technik s biotesty. Vyvinuté protilátky jsou vysoce specifické pro jednotlivé hydroxybenzylaminopuriny a při použití v ELISA testech poskytují velmi citlivý detekční systém s detekčními limity na femtomolární úrovni (STRNAD 1996). Následná kombinace HPLC s těmito specifickými ELISA testy poskytuje rychlou, citlivou a specifickou metodu pro stanovení a detekci velkého spektra isoprenoidních i aromatických cytokininů v částečně přečištěných extraktech rostlinných pletiv. Na základě distribuce imunoreaktivního materiálu v individuálních HPLC frakcích byly v řadě rostlinných extraktů detekovány metabolity BA, ale i jeho hydroxy deriváty (STRNAD et al. 1992a).

19

2. 5 Cytokininy Na počátku padesátých let byly usilovně hledány a testovány látky, které by mohly regulovat rychlost buněčného dělení (cytokineze). Toto úsilí bylo motivováno nejen možnými aplikačními aspekty, ale vycházelo i z potřeby lépe vysvětlit růstověregulační

procesy.

Jedním

z

prvních

používaných

cytokininů

byl

kinetin

(6-furfurylaminopurin), získaný rozkladem DNA, který způsoboval dělení buněk a podle toho byl nazván dle řeckého „kinesis“ – pohyb. Byl připraven synteticky (MILLER et al. 1956) a doposud se ho nepodařilo identifikovat jako nativní cytokinin. Další látka s cytokininovou aktivitou byla identifikována jako N,N´-difenylmočovina (SHANTZ a STEWART 1955). Byla obsažena v kokosovém mléku (tekutý endosperm), které je i dnes často přidáváno jako nedefinovatelná směs do kultivačních médií. Později bylo synteticky připraveno mnoho derivátů močoviny (např. thidiazuron) s vysokou schopností indukovat buněčné dělení (MOK et al. 1985). Teprve v šedesátých letech se skutečně podařilo z rostlin extrahovat přirozeně se vyskytující (nativní) látky s velmi podobnou strukturou a účinky jako měl kinetin. Přirozené cytokininy jsou N6-substituované deriváty adeninu. Jako první byly v rostlinách nalezeny izoprenoidní cytokininy. Z endospermu obilek Zea mays byl izolován zeatin (LETHAM 1963). V následujících letech byla potvrzena chemickou syntézou jeho „trans“ konfigurace hydroxylové skupiny (SHAW et al. 1966). Trans konfigurace podmiňuje vysokou fyziologickou aktivitu, zvláště účinnou při stimulaci buněčného dělení (SKOOG 1973). Ještě poměrně vysokou cytokininovou aktivitu má izopentenyladenin (iP), proto nejpoužívanější izoprenoidní cytokininy v kulturách in vitro jsou zeatin (Z) a izopentenyladenin (iP). Aromatické cytokininy tvoří druhou skupinu přirozených cytokininů. Patří sem benzyladenin (BA) a jeho deriváty s hydroxylovaným benzenovým jádrem v ortoa meta- poloze. Pro hydroxybenzyladeniny, které byly detekovány a identifikovány v listech topolu Populus x canadensis Moench. cv. Robusta, byl navrhnut český název topoliny, a to podle rostlinného objektu, ze kterého byly vyizolovány (STRNAD et al. 1997). Jako nativní sloučeniny byly potvrzeny před 20 lety (HORGAN et al. 1975), ve formě ribosidu byl popsán benzyladeninribosid (BAR) (ERNST et al. 1983). Z fyziologicky aktivních aromatických cytokininů můžeme jmenovat benzyladenin a

jeho

derivát

s

hydroxylovaným

benzenovým

20

jádrem

meta-topolin

(mT)

(WERBROUCK et al. 1996). Orto-topolin (oT) byl také poprvé izolován z listů Populus x canadiensis Moench cv. Robusta (STRNAD et al. 1992b). kinetin (K)

zeatin (Z) N

N NH

N

HN

benzyladenin (BA)

N

O

N

HN

N NH

N CH3

N

HN

NH

N

HOH 2C

obr. 1: Strukturní vzorce cytokininů (CK)

2. 5. 1 Účinky cytokininů v rostlinách Cytokininy jsou deriváty adeninu, vyskytující se v rostlinách jako volné molekuly nebo součást tRNA molekul, a to v koncentracích desítek až stovek ng/g čerstvé hmotnosti (to odpovídá hodnotám cca 500 pmol.g-1 čerstvé hmotnosti rostliny (listy bramboru; BAROJA-FERNÁNDEZ et al. 2002). Regulací hladiny exogenních cytokininů pomocí genových manipulací bylo prokázáno, že endogenní i exogenně aplikované cytokininy vykazují shodné účinky na řadu biologických procesů (LI et al. 1992). Tento přístup rovněž potvrdil, že cytokininy působí na fyziologické procesy v interakci či kooperaci s ostatními hormony, zejména s auxinem (Mc GAW et al. 1988). Cytokininy jsou látky, které v přítomnosti auxinů stimulují buněčné dělení (SKOOG a ARMSTRONG 1970). Stimulují nejen buněčné dělení, ale jsou také regulačními faktory průběhu buněčného cyklu. Množství cytokininů se mění v závislosti na fázi buněčného cyklu, např. jejich množství se přechodně zvyšuje v G2 a M fázi buněčného cyklu (REDIG et al. 1996). Interfáze buněčného cyklu je kontrolována několika komplexy specifických bílkovin - cyklinů a specifických enzymů - cyklin dependentních kináz (CDK). Samostatné podjednotky jsou funkčně inaktivní, aktivace je spojena s fosforylací komponent komplexu. Aktivované komplexy pak mají regulační efekt. Za klíčový mitotický faktor je považován komplex cdc2/cyklin B, který kontroluje přechod z G2 do M fáze buněčného cyklu (VANDENHEUVEL a HARLOW 1993). Z dalších fyziologických účinků cytokininů je důležitá zejména schopnost v interakci s auxinem iniciovat diferenciaci pupenů a kořenů v explantovaných

21

kulturách u řady rostlinných druhů. S různými modifikacemi platí původní schéma SKOOGA a MILLERA (1957), podle kterého vysoký poměr koncentrace cytokininu k auxinu, v kultivačním médiu, stimuluje diferenciaci pupenů a regeneraci prýtů, zatímco opačný poměr je příznivý pro tvorbu kořenů. Jejich vyrovnaný poměr vede většinou k tvorbě nediferenciovaného kalusu. Tento základní poznatek umožňuje regeneraci celých rostlin z jednotlivých buněk a protoplastů, a tím i podání finálního důkazu totipotence rostlinných buněk a našel uplatnění v mikropropagaci rostlin in vitro. Cytokininy určují habituaci buněk. Samotné cytokininy mohou za určitých podmínek autoindukčně zvyšovat svoji vlastní syntézu až po dosažení růstové nezávislosti buněk na exogenním zdroji cytokininů (MEINS et al. 1980). Tento proces zvaný habituace může být základem pro vznik nových míst biosyntézy. Cytokininy ovlivňují růst a morfogenezi rostlin prostřednictvím podílu fyziologicky aktivních a inaktivních metabolitů. Jejich exogenní aplikace vede k intenzivnímu metabolismu, ke změnám hladin endogenních cytokininů a k ovlivnění jejich vývoje. K projevům těchto procesů náleží kromě morfogeneze i procesy oddálení senescence a degradace chlorofylu (KAMÍNEK a LUŠTINEC 1978). Cytokininy výrazně zpomalují stárnutí, což se dá dobře demonstrovat u segmentů listů. Stárnutí izolovaných listů je rychlejší ve tmě než na světle. Světlo brzdí stárnutí tím, že působí otevření průduchů. Necháme-li listy plavat na hladině osmoticky účinného roztoku s vysokou koncentrací (např. 1 mol.l-1 manitolu), dojde k uzavření průduchů a listy pak stárnou stejně rychle na světle i ve tmě (THIMANN a SATLER 1979). Exogenně aplikovaný cytokinin udržuje průduchy otevřené, a tím brzdí stárnutí. TARKOWSKÉ et al. (2003) se podařilo prokázat v listech topolu Populus x canadensis, v Agrobacterium thaliana a u Agrobacterium tumefaciens výskyt 4 nových cytokininů, a to ortometoxytopolinu (MeoT), meta-metoxytopolinu (MemT) a jejich ribosidů (MeoTR, MemTR). Všechny tyto metoxytopoliny vykazovaly velmi vysokou antisenescenční aktivitu, která byla až o 200 % vyšší než u Z a BA (DOLEŽAL et al. 2003). Rovněž snižují apikální dominanci (KAMÍNEK 1997). Cytokininy jsou sloučeniny schopné uvolnit laterární pupeny z inhibice navozené auxinem (ŠEBÁNEK et al. 1991). Cytokininy v tomto případě působí jako antagonisté auxinů, tj. potlačují apikální dominanci. Aplikace cytokininů stimuluje větvení stonku. Po dekapitaci rostlin se zvyšuje obsah cytokininů v úžlabních pupenech, jejichž růst je aktivován.

22

Cytokininy hrají klíčovou roli v kontrole aktivity sinku (BRENNER a CHEIKH 1995). Po jejich aplikaci můžeme pozorovat pohyb značených aminokyselin a cukrů do místa aplikace. Důsledkem zvýšené síly sinku je vyšší konečná biomasa

orgánů

s vysokým obsahem cytokininů. Mezi další účinky patří vznik sekundárních meristémů (ESTRUCH et al. 1991), rovněž se podílejí na iniciaci tvorby semen ( HALMANN 1990) a jejich změny jsou indikátory stresu (KAMÍNEK 1992, COLLIER et al. 2003). 2. 5. 2 Biosyntéza cytokininů Také u cytokininů je obtížné přesné určení místa jejich biosyntézy, neboť nemusí být totožné s místem jejich nejvyšší koncentrace. Nejvyšší obsah cytokininů i jejich tvorba de novo byly zjištěny v kořenových vrcholech (TORREY 1976), odkud jsou rozváděny xylémem do ostatních orgánů. KAMBOJ et al. (1999) prokázali cytokininy v xylému i floému. U některých druhů rostlin byla dokázána tvorba cytokininů i v nadzemních částech. Bylo dokázáno, že listy, apikální meristém (stonek) a nezralá semena mohou také produkovat cytokininy (LETHAM 1994). Nejčastěji však mladé listy a jiné nadzemní orgány s meristémy, v nichž pravidelně zjišťujeme vysokou koncentraci cytokininů, jsou jimi v hojné míře zásobovány z kořenů. Koncentrace cytokininů může být ovlivněna i dalšími hormony, např. vyšší hladiny auxinu a

ethylenu

potlačují

akumulaci

cytokininů,

respektive

aktivují

cytokinin-

oxidázu/dehydrogenázu. Mc GAW et al. (1988) zjistili, že zvýšení koncentrace auxinu jak jeho exogenní aplikací, tak expresí genů kódujících jeho biosyntézu v transgenních buňkách tabáku je provázeno velmi silným snížením metabolické stability a hladiny cytokininů. Cytokininy se vyskytují v rostlinách jako volné molekuly a jako součást některých molekul tRNA, a to vždy vedle 3´-konce antikodonu. Takové tRNA vznikají již na úrovni polynukleotidu vnesením izopentenylového řetězce a následnou hydroxylací za vzniku cis-zeatinu. Volné přirozené cytokininy se vyskytují výhradně v konfiguraci trans, EMERY et al. (1998) však uvádějí i přirozený výskyt cis-izomerů zeatinu a jeho derivátů. Modifikovaná tRNA je potenciálním zdrojem cytokininu, který se může uvolnit při její metabolické degradaci (SKOOG a ARMSTRONG 1970). Byla zjištěna izomerace cis-zeatinu na trans-izomer v embryích Phaseolus vulgaris (MOK et al. 1992).

23

Přímá cesta biosyntézy volných cytokininů byla dlouho známa jen u rostlin transformovaných půdní bakterií Agrobacterium tumefaciens, nesoucí gen pro izopentenyltransferázu. Volné cytokininy vznikají reakcí ∆2-izopentenylpyrofosfátu s 5´-AMP za vzniku N6-(∆2-izopentenyl)-adenozin-5´-fosfátu (AKIYOSHI et al. 1983). V roce 2001 byly poprvé objeveny geny pro izopentenyltransferázu (ipt) ve vyšších rostlinách. V genomu Arabidopsis bylo nalezeno sedm ipt homologů, které byly klonovány a jejich exprese byla potvrzena jak v kořenech, tak v nadzemní části rostliny. Substrátová specifita exprimovaných rostlinných ipt je stejná jako u jejich bakteriálních homologů (KAKIMOTO 2001). 2. 5. 3 Metabolismus cytokininů Základní metabolické cesty cytokininů jsou u většiny rostlin obdobné a stejné rysy metabolismu zůstávají zachovány i v izolovaných částech rostlin, v explantátech. Metabolismus cytokininů spočívá ve: 1. vzájemné přeměně bází, nukleosidů a nukleotidů 2. N-glykosilaci purinu a konjugaci alaninu v poloze N-9 3. O-glykosilaci a acetylaci postranního řetězce 4. redukci dvojné vazby postranního řetězce 5. odštěpení postranního řetězce Různé produkty metabolismu se vyznačují velmi odlišnými vlastnostmi, z nichž zejména polarita je rozhodující pro jejich příjem a translokaci v pletivech a buňkách i pro jejich finální biologický účinek. Existují důkazy, že cytokininy ve formě bází představují vlastní biologicky aktivní formy cytokininů při stimulaci buněčného dělení. Proto konverze ribotidů a ribosidů na báze může mít zásadní význam pro regulaci obsahu fyziologicky aktivních cytokininů v buňce. Tvorba ribosidů a nukleotidů představuje nejdůležitější metabolické reakce cytokininů. Enzymem způsobujícím konverzi volných cytokininových bází na nukleotidy je adeninfosforibosylpyrofosfáttransferáza. Konverzi volných bazí na nukleotidy studovali na Arabidopsis thaliana MOFFATT et al. (1991). Vazba glukózy na dusíkaté atomy purinového skeletu v polohách N-7 a N-9 představuje jejich nevratnou fyziologickou inaktivaci (Mc GAW a HORGAN 1985). Jde zřejmě o inaktivační cestu zejména těch cytokininů, které nemohou být oxidačně odbourány, např. aromatických cytokininů nebo derivátů dihydrozeatinu. Narozdíl od

24

N-glukosidů, jsou O-glukosidy vysoce biologicky aktivní. Tvorba O-glukosidů, které jsou fyziologicky aktivními konjugáty (McGAW et al. 1984) je možná pouze u zeatinu, dihydrozeatinu, meta- a orto-topolinu. Hlavní cestou inaktivace cytokininů je jejich oxidace. Oxidativní degradace cytokininů je katalyzována cytokininoxidázou/dehydrogenázou (MOK a MOK 1994, GALUSZKA et al. 1999), tento enzym byl izolován z mnoha rostlinných pletiv (LALOUE a FOX 1989), přičemž KAMÍNEK a ARMSTRONG (1990) izolovali 2 formy cytokininoxidázy/dehydrogenázy z Phaseolus vulgaris a P. lanatus. Izoprenoidní cytokininy podléhají účinku cytokinnoxidázy/dehydrogenázy (kromě glukosidů cytokininů), jejich degradací vzniká adenin (GALUSZKA et al. 1999), adenosin, fosforylované formy adenosinu a jako odpadní produkt 2-methyl-1,3-butenal, kdežto aromatické

cytokininy

jsou

proti

cytokininoxidáze/dehydrogenáze

odolné.

Pravděpodobně je odbourává jiný enzymatický systém. Substrátem tohoto enzymu jsou volné cytokininy typu zeatinu a izopentenyladeninu a jejich N-glukosidy. O-glukosidy, cytokininy s nasyceným postraním řetězcem (dihydrozeatin) a aromatické cytokininy nejsou cytokinindehydrogenázou štěpeny. Aktivita cytokininoxidázy/dehydrogenázy je často indukována aplikací cytokininů exogenních, ať již těch, které jsou substráty enzymu,

nebo

těch,

které

cytokininoxidázou/dehydrogenázou

štěpeny

nejsou

(MOTYKA a KAMÍNEK 1992).

ribosidy 5

2

prekurzory, příjmové a transportní formy

6

3 7

nukleoti dy

O- glukosidy

aktivní formy

3N-glukosidy

zásobní formy deaktivační formy detoxikační formy

6

4

báze

degradační formy 1

6

1 ?

Ado

Ade

7-, 9N glukosidy

Ado...adenosin (ribosid) Ade...adenin (volná purinová báze)

1. cytokininoxidáza/dehydrogenáza 2. 5´-nukleotiodáza 3. adenosinnukleosidáza 4. adeninfosforibosylpyrofosfáttransferáza 5. adenosinkináza 6. glukosyltransferáza 7. β-glukosidáza ? pravděpodobně enzym 1.

obr. 2: Schéma metabolismu cytokininů (Dobrev, P. (2001) PhD thesis) 25

2. 5. 4 Transport a translokace cytokininů Skutečnost, že nejvyšší obsah cytokininů i jejich tvorba de novo byly zjištěny v kořenových vrcholech (TORREY 1976), podporuje představy o interakci auxinů ,syntetizovaných ve vzrostných vrcholech, a cytokininů, vytvářených v oblasti kořenových meristémů, při determinaci polarity rostlin. Tento koncept předpokládá existenci polárního transportu auxinu a cytokininů. Transport cytokininů jak v kořenech, tak ve stoncích není výrazně polární (JACOBS 1976). Relativně vysoká koncentrace cytokininů byla zjištěna v kořenových exudátech. V intaktních rostlinách byly zjištěny cytokininy ve floémovém (HALL a BAKER 1972) i xylémovém exudátu (SKENE 1975). Transport cytokininů probíhá xylémem z kořenu (zejména jeho vrcholové části), kde probíhá jejích syntéza, do nadzemních částí rostlin (zejména listů). Zde přechází cytokininy do floému a mohou být transportovány do jiných orgánů. Informace o transportu cytokininů z kořenů do lodyh Nicotiana tabacum podala KULAJEVA (1962). Transport cytokininů v xylému a floému je fotoperiodicky regulován, za účasti fytochromu (MACHÁČKOVÁ et al. 1996) a je pravděpodobně velmi těsně propojen s polárním transportem IAA. LETHAM a PALNI (1983) považují za transportní formu cytokininů ribosidy a ribotidy cytokininů. Pro příjem cytokininů rostlinnými buňkami je rozhodující jejich molekulární forma. Velmi dobře jsou přijímány lipofilní cytokininové báze, zatímco pro polární glykosidy a zejména ribosidy nejsou rostlinné membrány permeabilní. Glykosilací přijatých bází dochází v buňce k tvorbě cukerných konjugátů a jejich následnou esterifikací k vzniku ribotidů, které nemohou buňku opustit a jsou v ní akumulovány. Ribotidy a O-glykosidy mohou být metabolicky přeměněny na báze, a představují tak zásobní metabolickou hotovost cytokininů v buňce. Zásobní formou mohou být i cytokininové báze ve vakuole s nízkým pH, kdy dochází k protonizaci imidazolového kruhu purinu a zvýšení polarity molekuly (LALOUE a PETHE 1982). 2. 5. 5 Cytokininy v in vitro kulturách Cytokininy jsou růstové regulátory často používané ke stimulaci růstu a vývoje rostlin v in vitro kulturách (HARDING a SMIGOCKI 1994). Nicméně, reakce rostlin na exogenně dodané cytokininy jsou obvykle komplikovány neznámým obsahem a fyziologickou aktivitou endogenních hormonů (JELIC a BOGDANOVIC 1990).

26

Vzhledem ke stabilitě aromatických cytokininů je BA nejčastěji používaným cytokininem v in vitro kulturách. Řada autorů uvádí široké spektrum vhodných cytokininů pro navození procesu regenerace. V práci JINDROVÉ et al. (1995) je srovnáván vliv izoprenoidních a aromatických cytokininů na morfogenezi adventivních pupenů na listových explantátech Nicotiana tabacum. BA a mT (meta-topolin) indukovali výraznější regeneraci pupenů ve srovnání se zeatinem o 50 % a ve srovnání s izopentenyadeninem a kinetinem až téměř o 100 %. Jako alternativa BA se u indukčních médií pro organogenezi in vitro nabízí meta-topolin. Jde o látku vysoce biologicky aktivní v in vitro kulturách, která u některých druhů vykazuje i 10-krát vyšší morfogenní aktivitu ve srovnání s tradičně používaným BA. Důvodem je zřejmě vyšší polarita ve srovnání s BA, čímž je mT snadněji transportován i metabolizován rostlinnými pletivy. Výsledkem tohoto fenoménu je následné snazší zakořeňování prýtu, jejich minimální malformace a degenerace, což jsou typické vedlejší účinky BA pozorovatelné u in vitro množených rostlin (WERBROUCK et al. 1996). 2. 5. 6 Benzyladenin Cytokinin 6-benzyladenin (BA) patří mezi nativní aromatické cytokininy, podobně jako ortho- a meta-topolin. Ne u všech rostlin ho za normálních podmínek lze nalézt v hojném množství, jeho přítomnost v pletivech je druhově a orgánově specifická (KAMÍNEK 1992). Je jedním z růstových regulátorů běžně používaných v systémech explantátových kultur k indukci organogeneze de novo (VAIBHAV et al. 2001). Je nejpoužívanějším cytokininem pro indukci morfogeneze prýtů v in vitro kulturách, proto je nejčastěji přidávaným růstovým regulátorem v médiích za účelem mikropropagace. Jeho aktivita v procesu morfogeneze závisí na intenzitě odbourávání a tvorbě BA konjugátů a na metabolických systémech dostupných k těmto přeměnám. Podle SAKAKIBARY (2006) je u řady případů aktivita aplikovaných cytokininových konjugátů dána konverzním poměrem mezi konjugáty a bázemi. Přidání vyšší koncentrace BA do živných médií v kombinaci s vyšší koncentrací auxinu vede k zvýšené tvorbě kalusu z buněk okolo řezných ran explantátu (PIERIK 1997). BA je intenzivně metabolizován, což dokládá tvorbu ribosidu, nukleotidu a BA9-glykosidu, kterou sledovali BAYLEY et al. (1989) v izolovaných orgánech Lycopersicon esculentum. Listy už po 2 hodinách expozice metabolizovaly přes 60 % 27

přijatého

14

C-BA na

14

C-BA-9-glukosid. Nejvyšší příjem

14

C-BA byl zaznamenám

kořeny, které po šesti hodinách expozice na médiu přijaly až 30 %

14

C-BA

aplikovaného do média. Ve stonkových explantátech bylo zjištěno až 5 % 14

C-benzyladenosinmonofosfátu a přes 20 % ribosidu

14

C-BAR. Na základě těchto

poznatků řada autorů poukazovala na tyto metabolity jako na transportní formy BA.

2. 6 Auxiny Ze všech rostlinných hormonů byly jako první objeveny auxiny. V roce 1933 byla v lidské moči nalezena látka, která byla nazvána heteroauxinem a později byla identifikovaná jako kyselina indolyl-3-octová (IAA). Dlouhou dobu zůstala jediným známým přirozeným auxinem. Dnes víme, že se v rostlinách vyskytují ještě nejméně tři další organické kyseliny s podobným účinkem, a to kyselina 4-chlorindolyl-3-octová, kyselina indolyl-3-máselná (IBA) a kyselina fenyloctová (PAA). Kromě toho můžeme v rostlinách najít další tři velmi podobné sloučeniny, které však považujeme pouze za prekurzory auxinů (indolylacetaldehyd, indolylacetonitril a indolyletanol). Velmi snadno se oxidují na IAA. Známe však i několik uměle připravených látek s účinkem charakteristickým pro auxiny. Jde o aromatické sloučeniny s karboxylovou skupinou, což jsou zřejmě dva nezbytné předpoklady pro ovlivnění příslušných receptorů v rostlině (např. kyselina 1-naftyloctová (NAA) a 2,4-dichlorfenoxyoctová (2,4-D) ). 2. 6. 1 Účinky auxinů v rostlinách Nejlépe prostudovaným účinkem auxinů v rostlinách je stimulace dlouživého růstu buněk, částečně i rychlosti dělení, a to často již v koncentraci 10-8 M. Stimulace dlouživého růstu je tradičně vysvětlována vlivem auxinů na roztažitelnost buněčné stěny. K tomu dochází pravděpodobně vlivem sníženého pH v buněčné stěně, jako následek zrychlení transportu vodíkových iontů přes plazmalemu, stimulačním působením auxinů na činnost protonových pump. Toto působení ovšem není přímé, ale zprostředkované přes receptory auxinů v plazmatické membráně a řetězec druhých poslů v buňce. Intenzivně zkoumána byla úloha IAA na stimulaci dlouživého růstu buněk v ovesné koleoptili (BATES a CLELAND 1979) a v segmentech epikotylů hrachu (LADO et al. 1977). Účinky IAA jsou spojeny s acidifikací buněčných stěn (HAGER et al. 1971), následkem které nastane uvolňování IAA (THEOLOGIS 1986). Předpokladem stimulačního působení IAA na činnost protonových pump je syntéza 28

specifické skupiny proteinů v počátečních stádiích reakce (BATES a CLELAND 1979). VANDERHOEF (1980) spojoval tuto odpověď na auxin s jeho účinkem na procesy transkripce a translace, současně vedoucí k tvorbě látek nutných pro růst buněčných stěn. Stejně dobře prozkoumaný je kladný vliv zvýšené koncentrace auxinů na růst kořenů, zvláště na jejich větvení a na tvorbu adventivních kořenů. Tato vlastnost má široké praktické využití při zakořeňování řízků rostlin (nejúčinnější bývá kyselina

3-indolylmáselná). Ošetření auxiny může zvýšit procento zakořeněných řízků, urychlit zakořeňování, zvýšit počet a kvalitu kořenů (ŠEBÁNEK et al. 1991). Vliv auxinů na buněčné aktivity se v přírodních podmínkách uplatňuje i při poranění, kdy stimulují tvorbu ochranné vrstvy zkorkovatělých buněk zacelujících ránu. Bylo ale zjištěno, že účinek auxinů na dělení se projevuje pouze za přítomnosti dalších fytohormonů ze skupiny cytokininů. Auxiny jsou také zapojeny do řízení pochodů, kterými rostlina reaguje na jednostranné působení podnětů (gravitropismus, fototropismus). Obtížně vysvětlitelný je podíl auxinů na apikální dominanci (inhibiční vliv v růstu vegetačního vrcholu na růst níže položených pupenů), která je u rostlin běžným jevem. Podle původní představy byla dominance vrcholového meristému vysvětlována vysokou koncentrací auxinů transportovaných z vegetačního vrcholu. Jak je známo, příliš vysoká koncentrace auxinů (zhruba nad 10-4 M) může mít již výrazně inhibiční účinky na růst. Tudíž by mohla brzdit růst a vývoj níže položených pupenů. Nové poznatky svědčí spíše v neprospěch klasické auxinové teorie - mezi stupněm inhibice pupenů a rychlostí přítoku nativních auxinů nebyla zjištěna kladná závislost. Na druhé straně však víme, že jistý podíl auxinů na apikální dominanci je zcela nepochybný. Působí však pravděpodobně v interakci s jinými fytohormony, či nepřímo usměrňováním translokace látek v lýku. 2. 6. 2 Metabolismus auxinů Aktivní formou auxinu je volný auxin, ale většina auxinu v rostlině se nachází ve formě konjugované s nízkomolekulárními látkami (estery, amidy) nebo látkami vysokomolekulárními (glukan, glykoproteiny). I přes méně časté použití IAA jako růstového regulátoru do kultivačních médií je nutné mít na paměti, že se v explantátech může syntetizovat. Přijatá IAA může zůstat ve volné, fyziologicky aktivní formě nebo může být enzymaticky odbourána či konjugována. Proti účinku enzymů s IAAoxidázovou aktivitou je IAA chráněna jinou metabolickou cestou – konjugací 29

s aminokyselinami, glukózou či myoinositolem (COHEN a BANDURSKI 1978). NAA je syntetický auxin. ARANDA et al. (1984) uvádějí, že NAA tvoří s mnoha aminokyselinami konjugované formy. Konjugace je proces reverzibilní, konjugáty slouží jako zásobní a transportní forma a také jako ochrana před degradací. Uvolnění auxinu z konjugátu je ovlivněno signály z prostředí (světlo, gravitace). Ireverzibilní cesty degradace auxinu jsou buď dekarboxylační, katalyzované peroxidázou nebo nedekarboxylační. Přesto, že NAA je syntetickou látkou, je intenzivně přijímána rostlinnými pletivy, transportována a metabolizována. SMULDERS et al. (1990) studovali transport a metabolismus NAA během vývoje květních pupenů u tabáku in vitro. Uvedli, že polární distribuce pupenů a regenerantů je výsledkem polárního transportu NAA v

diferenciaci

květních

pupenů

na

explantátu

(tenkých

pletivových

vrstev

subepidermálních buněk) tabáku. 2. 6. 3 Transport auxinů Auxiny se pohybují v rostlinném organismu z apexu a mladých, vyvíjejících se listů (předpokládaných míst biosyntézy) směrem ke kořenům. Tento směr auxinového transportu je výsledkem polárního umístění specializovaných přenašečových molekul bílkovin v cytoplazmatické membráně. Podle novějších poznatků probíhá transport IAA, nejčastějšího přirozeně se vyskytujícího auxinu, do buňky a z buňky přes plazmalemu za účasti specifického auxinového vstupního přenašeče, respektive výstupního přenašeče. Složky těchto přenašečů byly identifikovány jako translační produkty genů aux1 a pin1. AUX1 protein se podílí na příjmu auxinu do buňky (BENNETT et al. 1996), zatímco PIN1 protein lokalizovaný na bazální cytoplazmatické membráně řídí translokaci auxinu z buňky (GÄLWEILER et al. 1998). Tento transport může být specificky inhibován prostřednictvím mutací genů odpovědných za syntézu proteinových složek těchto přenašečů, nebo působením syntetických látek známých jako inhibitory polárního transportu auxinu. Cílený pohyb IAA v buňce je podle některých výzkumů (MUDAY et al. 2001) umožněn vazbou transportních proteinů na buněčný aktinový cytoskelet a je regulován reverzibilní fosforylací těchto proteinů za účasti protein-kináz a protein-fosfatáz.

30

2. 6. 4 Auxiny v in vitro kulturách Auxiny jsou důležitou složkou kultivačního média nezbytnou pro indukci kalusu (BREGITZER et al. 1995). Nejčastěji se v in vitro kulturách používá kyselina 2,4dichlorfenoxyoctová (2,4-D), kyselina 1-naftyloctová (NAA) a kyselina indolyl-3octová (IAA). (2,4-D) je syntetický auxin velmi často používaný v in vitro kulturách, a to nejčastěji na indukci tzv. somatické embryogeneze. Pro účely zakládání kalusových a buněčných suspenzích kultur se často používají vyšší koncentrace 2,4-D v kombinaci s vysokými koncentracemi cytokininů. Stimulační efekt 2,4-D byl v buněčné suspenzní kultuře zjištěn při biosyntéze karotenoidů v buňkách mrkve (MOK 1976), a při produkci antokyanů v kalusových kulturách Oxalis linearis (MEYER a VAN STADEN 1997). V některých případech však byl popsán inhibiční vliv 2,4-D na produkci sekundárních metabolitů v buněčných suspenzních kulturách (RAO a RAVISHANKAR 2002). V takových případech je potřebné 2,4-D nahradit jiným auxinem např. NAA nebo IAA. NAA je používaná v in vitro kulturách pro indukci morfogeneze kořenů nebo dediferenciaci. Výhodou NAA oproti IAA je, že nepodléhá oxidativní dekarboxylaci IAA-oxidázou. Morfogeneticé účinky NAA úzce souvisí s transportem a akumulací, stejně jako s interakcí s dalšími růstovými regulátory (COENEN a LOMAX 1997). Absorbce NAA do rostlinné buňky probíhá hlavně volnou difůzí, zatímco její translokace z buněk se uskutečňuje hlavně specifickými přenašeči (DELBARRE et al. 1996). V dužnině stonku tabáku je NAA intenzivně přijímána už v první hodině expozice (ABBAS et al. 1995). Navázaná NAA je rychle metabolizována. SMULDERS et al. (1990) uvedli, že až 80 % celkové navázané NAA je metabolizováno už po 6 hodinách expozice.

31

3. MATERIÁL A METODY 3. 1 Charakteristika rostlinného materiálu Jako donorový experimentální materiál byly použity segmenty ze střední části čepelí listů petunie (Petunia hybrida) cv. Lady blue pěstované in vitro v dlouhodobé kultuře s pravidelnými subkultivacemi. Během sterilní preparativní práce byly segmenty izolovány z dospělých listů stáří 3 týdnů. Pro experimentální práci byly rostliny odvozeny kultivací v aseptickém prostředí. Semena petunií byla povrchově sterilizována ve flow-boxu. Nejprve byla semena ponechána jednu minutu ve směsi 50 ml sterilní vody, 50 ml etanolu a 20 ml peroxidu vodíku. Poté byla semena třikrát opláchnuta ve sterilní vodě. Následovala sterilizace semen 8 minut ve směsi 15 ml přípravku Savo a 85 ml sterilní vody. Poté byla semena třikrát opláchnuta sterilní vodou, osušena a vyseta na šikmé agarové MS (MURASHIGE a SKOOG 1962) médium s 5 g.l-1 sacharózy (viz. obr. 5 a, b). Vzrostlé rostliny byly kultivovány v in vitro podmínkách na médiu GAMBORG et al. (1968) s 10 g.l-1 sacharózy a 0,5 g.l-1 aktivního uhlí při laboratorní teplotě 25 ± 1 ºC, po celou dobu na světle (200 µmol.m-2.s-1) (viz. obr. 6 a, b). Vegetační vrcholy se dvěma vyvinutými listy byly používány pro založení nové donorové kultury rostlin poskytující listy.

3. 2 Experimentální kultivační podmínky Segmenty ze střední části čepelí listů byly kultivovány na Petriho miskách (10 segmentů na jedné misce), na nepřetržitém světle (200 µmol.m-2.s-1) a při teplotě 25 ± 1 ºC, na indukčním MS médiu obohaceném o cytokinin (3 µM benzyladenin - BA) a auxin (0,5 µM kyselina 1-naftyloctová - NAA) (viz. obr. 7). Krátkodobá kultivace segmentů listů na médiu s přídavkem růstových regulátorů trvala 5 nebo 7 dní, zatímco dlouhodobá 43 dní. Po krátkodobé kultivaci byly segmenty pasážovány na MS médium bez růstových regulátorů, nebo znovu na médium s růstovými regulátory (viz. experimentální varianty). Kultivace za účelem odběru vzorků pro stanovení obsahu cytokininů probíhala v intervalech 0 a 2 hodiny a 43 dní a to na médiu s růstovými regulátory nebo bez nich. Kultivace na stanovení chlorofylu „a“ a „b“ probíhala v intervalech 0 hodin, 2 hodiny a 43 dní.

32

3. 3 Experimentální varianty a hodnocení indukce organogeneze Pro stanovení účinku cytokininů na indukci organogeneze byla provedena dlouhodobá kultivace (43 dní). Byl hodnocen proces indukce organogeneze na segmentech listů z kultivace na médiu s obsahem BA, kde byly explantáty celou dobu kultivace, nebo byly z indukčního média pasážovány po 5 a 7 denní indukci, buď na nové indukční médium, nebo na MS médium (viz. tab. 1). Během této doby byla hodnocena frekvence regenerace prýtů (tj. podíl regenerujících segmentů z celkového počtu segmentů, vyjádřen v %) v intervalech 0, 5, 14, 17, 19, 24, 28, 34 a 43 dní.

dlouhodobá kultivace (43 dní) µM NAA a 3 µM BA

indukční médium s 0,5

tab.1: Hodnocení procesu organogeneze - jednotlivé varianty

přenos na nové indukční médium po 5 dnech přenos na nové indukční médium po 7 dnech přenos na MS médium po 5 dnech přenos na MS médium po 7 dnech

3. 4 Odběr vzorků pro analýzy Vzorky pro stanovení obsahu endogenních hladin cytokininů v segmentech listů petunie byly odebírány z krátkodobé kultivace po 0 a 2 hodinách, a dlouhodobé kultivace po 43 dnech, a to z kultivace na médiu s růstovými regulátory (RR) i bez růstových regulátorů. Všechny vzorky byly očištěny od zbytků média, osušeny a zváženy. Vzorky pro stanovení cytokininů byly po zamražení lyofilizovány. Vzorky ke stanovení chlorofylu „a“ a „b“ byly odebírány v časových intervalech 0 a 2 hodiny a 43 dní a to z médií s růstovými regulátory.

3. 5 Stanovení cytokininů V segmentech listů petunie byl stanoven obsah endogenních cytokininů pomocí metody ELISA (STRNAD 1996) po předchozí extrakci, purifikaci (MACHÁČKOVÁ ET AL. 1993) a HPLC separaci (přístroj firmy Ecom, 25 cm kolona Phenomenex C 18, 5 µm).

33

a) extrakce Po homogenizaci lyofolizovaného rostlinného materiálu a extrakci v modifikovaném Bieleskiho činidle (metanol : chloroform : voda = 13 : 5 : 2) následuje centrifugace homogenátu po doplnění extraktu o polovinu objemu vodou. Takto získaný supernatant obsahuje cytokininy (vodný metanol) oddělené od chloroformu (obsahující barviva, lipofilní látky aj.). Postup: 1. cca 1g čerstvého materiálu resp. lyofilizovaného byl homogenizován v třecí misce s tekutým dusíkem a následně převeden do modifikovaného Bieleskiho činidla 2. extrakce přes noc při – 20 °C 3. homogenát byl třepán 1 hodinu při + 4 °C 4. extrakt byl doplněn o poloviční objem vodou s nízkou vodivostí 5. centrifugace po dobu 20 minut při 3500 g 6. supernatant byl odpařen a sediment rehomogenizován v 100% metanolu 7. rehomogenizovaný

sediment

byl

znovu

vytřepán

a

centrifugován,

supernatanty byly spojeny b) purifikace Po odpaření vodného metanolu do vodného zbytku následuje štěpení ribotidů cytokininů kyselou fosfatázou, iontoměničová chromatografie a chromatografie na reverzní fázi (MACHÁČKOVÁ et al. 1993). Iontoměničová chromatografie za použití P-celulózy oddělí cytokininový extrakt (CK vyšší kladný náboj) při pH 3,00 od látek s negativním nábojem. Při chromatografii na reverzní fázi a to na DEAE-celulóze spojené s C18 kolonkou (Sep-Pak) se cytokininy zachytí na C18 sorbentu, odkud jsou eluovány methanolem a následně zkoncentrovány odpařením methanolu. Před nástřikem na HPLC jsou vzorky rozpuštěny (200 µl 0,05% TFA) a filtrovány. Postup: 1. supernatant byl odpařen po druhé centrifugaci do vodné fáze 2. cytokininy byly rozpuštěny v 0,04 M acetátamonném pufru (pH 6,5) a ribotidy cytokininů štěpeny kyselou fosfatázou (1 mg/vzorek) 1 hodinu při 300 rpm (na třepačce) 3. pH vzorků bylo upraveno na 3 kyselinou octovou 34

4. iontoměničová chromatografie na koloně P – celulózy (cytokininy byly zachyceny na P – celulóze) 5. cytokininy byly eluovány z P – celulózy 0,2 M amoniakem 6. pH vzorků bylo upraveno na 6,5 7. chromatografie na reverzní fázi – cytokininy byly zachyceny na Sep-Paku 8. cytokininy byly eluovány ze Sep-Paku metanolem 9. eluát byl odpařen na rotační vakuové odparce do sucha c) HPLC separace HPLC separace (přístroj firmy Ecom) cytokininových bází a jejich ribosidů probíhala na koloně Phenomenex C 18 (25 cm) s velikostí pórů 5 µm a průtokem mobilní fáze 1000 µl/min, se složením mobilní fáze A: metanol, B: 0,05 % TFA (gradient: 0 – 3 min 15 % A, 3 – 11 min 40 % A, 11 – 16 min 60 % A). Jednotlivé frakce po sobě následujících cytokininů se sbíraly dle příslušných retenčních časů a UV signál byl detekován při 260 nm. Frakce byly odpařeny do sucha a pro ELISA kvantifikaci rozpuštěny v TBS pufru (900 µl). d) stanovení metodou ELISA Ke stanovení cytokininů se používají polyklonální protilátky vůči ribosidům cytokininů (STRNAD 1996). Principem ELISA stanovení je kompetice ve vazbě cytokininu z rostlinného extraktu a cytokininu značeného enzymem (alkalická fosfatáza) na specifickou protilátku. Substrátem sloužícím k vlastnímu stanovení fosfatázy je pak nitrofenylfosfát (PNPP) a absorbance se odečítá při 405 nm. Test se provádí

pv

jamkách mikrotitračních destiček. Postup začíná navázáním protilátek na stěny jamek. Po inkubaci se přebytečné protilátky vymyjí a pipetuje se standartní cytokinin, cytokinin izolovaný z rostlinného extraktu a cytokinin konjugovaný s alkalickou fosfatázou. Přidá se konstantní množství substrátu. Po krátkodobé inkubaci (15 - 60 minut) je enzymatická reakce zastavena hydroxidem draselným. Po měření absorbance a sestavení kalibrační křivky se odečítá přesné množství cytokininů ve vzorcích. Obsah cytokininů je nepřímo úměrný absorbanci naměřené v roztocích jednotlivých jamek mikrotitrační destičky v porovnání s řadou standardů, minimální a maximální vazbou protilátky.

35

Postup: 1. do každé jamky mikrotitrační destičky bylo pipetováno 150 µl protilátky (5 µl MAb na 15 ml uhličitanového pufru na desku) vícekanálovou elektronickou pipetou, destička byla uzavřena a inkubace proběhla při teplotě 4 °C přes noc 2. destička byla vyprázdněna a promyta redestilovanou vodou (vychlazenou) 3. destička byla potáhnuta 200 µl BSA/jamku (20ml/desku) a inkubována

1

hodinu při 25 °C 4. destička byla vyprázdněna a promyta redestilovanou vodou 5. bylo naneseno 50 µl TBS (celá deska), 50 µl vzorku a 50 µl standardů

(v

TBS) 6. pipetováno 50 µl traceru (AP-cytokinin konjugát v BSA, ředění 2,5 ml/5ml BSA na desku) do všech jamek s výjimkou jamek ponechaných pro blank 7. naneseno 100 µl BSA a 50 µl TBS do jamek pro blank, pro maximální vazbu 100 µl TBS a 50 µl AP-cytokinin konjugátu 8. míchání 1 minutu, inkubace 1 hodinu při 25 °C 9. destička byla vyprázdněna a promyta TBS (4x) 10. pipetováno 150 µl PNPP/jamka do všech jamek (PNPP v uhličitanovém pufru 1mg/ml, 15ml/deska) 11. inkubace 1 hodinu při laboratorní teplotě 12. barevná reakce byla blokována 50 µl KOH (NaOH) 13. absorbance byla měřena při 405 nm

E E E

E

E

E

inkubace promytí

kompetice specifická protilátka

E

inkubace promytí

imunoprecipitace E

E

cytokinin značený enzymem

enzymová reakce chromogen barevný produkt enzym. reakce

cytokinin

obr. 3: Schéma stanovení cytokininů metodou ELISA

36

3. 6 Stanovení chorofylu „a“ a „b“ V segmentech listů petunie byl stanoven obsah chlorofylu „a“ a „b“ spektrofotometricky dle PORRA et al. (1989). a) extrakce barviv Lipofilní vlastnosti listových barviv umožňují jejich vlastní extrakci

z

rostlinného materiálu pomocí organických rozpouštědel. Účinnost extrakce zvyšuje dokonalá homogenizace (v tekutém dusíku nebo použití jemnozrnného křemenného písku) za současné neutralizace extraktu hořečnatými či vápenatými ionty. V kyselém prostředí (tedy bez neutralizace) dochází k odštěpení kationtu hořčíku z molekuly chlorofylu a k malé sterické změně porfyrinového kruhu a současně s tím ke změně zabarvení dohněda. Homogenát je možno filtrovat či centrifugovat pro oddělení vysokomolekulárních látek. C18-separace je efektivní chromatografická rozdělovací metoda (adsorbční chromatografie). Pomocí chromatografických patronek Separon (C18 Sep-Pak), které obsahují silikagel s nasycenými C18 uhlovodíky je možno z metanolického extraktu zachytit listová barviva a ty pak následně eluovat nepolárním rozpouštědlem (např. acetonem). Uplatňuje se zde interakce polárního extrakčního činidla s hydrofobními barvivy s velkými molekulami, které jsou zachyceny na hydrofobní stacionární C18 fázi. Při následné eluci jsou barviva i vhodně zakoncentrována.

Postup: 1. asi 0,2 g čerstvého materiálu (+ CaCO3 na špičku nože) bylo homogenizováno na prach pomocí tekutého dusíku, k homogenátu bylo přidáno 10 ml methanolu a rozetřeno 2. extrakt byl slit do skleněné zkumavky a centrifugován 5 minut 3. Sep-Pak byl aktivován prokapáním postupně 10 ml metanolu, pak 10 ml destilované vody a nakonec vysušením (protlačením vzduchu) 4. supernatant byl prokapán přes aktivovaný Sep-Pak (C18 kolonka, viz schéma níže) 5. barviva zachycená na Sep-Paku byla eluována 0,5 – 1 ml acetonu (zakoncentrování)

37

obr. 4: Extrakce listových barviv za použití kolonek Sep-pak b) spektrofotometrie Spektrofotometrie jednotlivých listových barviv je vhodná kvantitativní metoda absorpční analýzy fotosyntetických pigmentů. Principem metody je měření tzv. absorbance, která vyjadřuje absorpci monochromatického záření při jeho průchodu absorpční vrstvou (tj. skleněnou kyvetou s extraktem či eluovaným barvivem). Absorpce se zvyšuje se zvyšujícím se obsahem absorbujícího prostředí. Naměřené hodnoty absorbance se pak dosazují do vztahů pro výpočty koncentrací jednotlivých barviv. Postup: 1. spektrofotometr byl nastaven na příslušnou vlnovou délku (viz. tab. 2) 2. byl naměřen blank – 1 ml acetonu 3. postupně byly změřeny všechny vzorky na absorbanci 4. a následovně byly vypočteny koncentrace chlorofylu „a“ a „b“ dle následujících vzorců ca=12,7.A663 - 2,69.A645 cb=22,9.A645 - 4,68.A663 kde v rovnici pro výpočet koncentrace chlorofylu „a“ je hodnota 12,7 molární absorbční koeficient pro chlorofyl „a“ při vlnové délce 663 nm a 2,69 je molární absorbční koeficient pro chlorofyl „b“ při vlnové délce 645 nm a hodnoty A663 a A645 jsou naměřené hodnoty absorbance. Obdobně lze vyjádřit veličiny pro rovnici výpočtu koncentrace chlorofylu „b“ (ve výsledcích neuvedeno).

38

tab. 2: Monochromatická záření pro měření chlorofylu „a“ a „b“ monochromatická záření pro měření chlorofyl „a“ ……….663 nm chlorofyl „b“ ………645 nm

3. 7 Statistické hodnocení Pro stanovení frekvence regenerace byly segmenty kultivovány v 5 opakováních v počtu 10 segmentů na Petriho misku a statisticky vyhodnoceny pomocí Studentova ttestu. Pro stanovení obsahu cytokininů byly vždy odebírány 2 vzorky rostlinného materiálu od každé varianty a obsah cytokininů byl stanovován v každém vzorku dvakrát. Stejně byla opakování provedena i pro obsah chlorofylu „a“ a „b“.

3. 8 Fotodokumentace Fotografická dokumentace byla zaznamenána na digitální fotoaparát Nikon COOLPIX 2200. Jednotlivé fotografie s popisy jsou k dispozici v příloze.

3. 9 Prezentace výsledků bakalářské práce Kapitola 4 „Výsledky“ bakalářské práce není členěna na subkapitoly. Dle zadání bakalářské práce bylo náplní studium literatury, příprava rešerše a založení vstupních experimentů, jejichž výsledky jsou uvedeny v rámci jediné kapitoly.

39

4. VÝSLEDKY

Segmenty listů petunie regenerovaly na médiu s BA do desátého dne indukce organogeneze (graf 1). Největší procento regenerantů bylo na médiu při dlouhodobé kultivaci a při pasážování segmentů po 5 dnech na nové indukční médium (IM), kdežto kultivace na IM po předchozí 7 denní kultivaci nedosahovala tak vysokého procenta regenerace (obr. 12 a), b)) (graf 1). Krátkodobá indukce na médiu s BA a přenesení segmentů po 5 a 7 dnech na MS médium snižovalo regeneraci (graf 2). Regenerace segmentů při dlouhodobé kultivaci na BA (obr. 10 a), b)) a při přenesení po 5 dnech na nové IM (obr. 11 a), b)) byla srovnatelná bez statistické průkaznosti (graf 1). Při přenesení segmentů po 5 dnech na MS médium (obr. 8 a), b)) byla regenerace vyšší, než když byly segmenty přeneseny po 7 dnech na MS médium (obr. 9 a), b)) (graf 2). Z grafů 1 a 2 vyplývá, že narozdíl od přenesení segmentů po 5 a 7 dnech na MS médium, kdy se regenerace tak výrazně nezvyšuje, přenesení na nové IM regeneraci zvyšuje srovnatelně s regenerací dlouhodobou na médiu s BA.

100

100

%

75

75

50

50

25

25

%

dny

dny

0

0 0 IM

0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 5 dní IM/IM

7 dní IM/IM

graf 1: Frekvence regenerace při 5 a 7 denní kultivaci na IM a následném přenesení na nové IM s obsahem BA

IM

5 10 15 20 25 30 35 40 45 5 dní IM/MS

7 dní IM/MS

graf 2: Frekvence regenerace při 5 a 7 denní kultivaci na IM a následném přenesení na MS médium bez BA

Z grafu 3 vyplývá, že největší vliv cytokininů na tvorbu prýtů na jednotlivých explantátech měla 5 denní kultivace na IM a následné přenesení na nové IM. 7 denní

40

kultivace a následná pasáž na IM a dlouhodobá kultivace na IM měla stále ještě poměrně vysoké procento regenerantů na explantát oproti 5 a 7 denní kultivaci na IM a následném přenesení na MS médium.

počet prýtů / segment

6 5 4 3 2 1 0 5 dní IM/MS

graf 3:

7 dní IM/MS

IM

5 dní IM/IM

7 dní IM/IM

Počet regenerantů na explantát z listu petunie při dlouhodobé kultivaci na BA, při přenesení segmentů po 5 a 7 dnech na nové IM a při přenesení segmentů po 5 a 7 dnech na MS médium

Obsah endogenních cytokininů (BA, BAR, Z, ZR, DHZ, DHZR, IP, IPR, mT a mTR) popisují grafy 4a), b), c), d). Na počátku experimentu byla v segmentech listů nalezena nepatrná množství endogenních cytokininů, zvýšený byl především obsah zeatin ribosidu (ZR) (graf 4a). Při 2 hodinové kultivaci ZR přítomen nebyl, byl však zjištěn zvýšený výskyt izopentenyladeninu (IP), benzyladeninu (BA), meta-topolinu (mT) a jejich ribosidů (graf 4b). U dlouhodobé kultivace došlo k poklesu meta-topolin ribosidu (mTR), obsah BA se nepatrně zvýšil a obsah ZR se výrazně zvýšil v porovnání s kultivací 2 hodiny na IM (graf 4c). a) Výchozí stav (kontrola) 60

ng/ml

50 40 30 20 10 0 BA

BAR

Z

ZR

DHZ

41

DHZR

IP

IPR

mT

mTR

b) Kultivace 2 hodiny 60

ng/ml

50 40 30 20 10 0 BA

BAR

Z

ZR

DHZ

DHZR

IP

IPR

mT

mTR

c) Dlouhodobá kultivace 60

ng/ml

50 40 30 20 10 0 BA

BAR

Z

ZR

DHZ

DHZR

IP

IPR

mT

mTR

IPR

mT

mTR

d) Médium bez růstových regulátorů 60

ng/ml

50 40 30 20 10 0 BA

graf 4:

BAR

Z

ZR

DHZ

DHZR

IP

Obsah endogenních cytokininů (BA, BAR, Z, ZR, DHZ, IP, mT, mTR) v segmentech listů petunie kultivovaných na médiu s BA po dobu 2 hodiny (b) a 43 dní (c) ve srovnání s kontrolní variantou bez kultivace (a) a kultivací na médiu bez růstových regulátorů (d)

Účinek cytokininů na oddálení degradace chlorofylů byl v případě BA velmi dobře znatelný a zachoval v explantátech listová barviva. Po krátkodobé kutivaci segmentů listů došlo ke zvýšení obsahu chlorofylu „a” (chlorofyl „b“ byl měřen také, ale vzhledem k podobným hodnotám není uváděn). V případě dlouhodobé kultivace se

42

obsah chlorofylu “a” snížil, resp. byla jeho hodnota vysoká stejně jako při kultivaci segmentů bez růstových regulátorů, tak jak to je patrné z grafu 5.

Chlorofyly 0,5

mg

0,4 0,3 0,2 0,1 0

BA / 2 hodiny

graf 5:

BA / dlouhodobá kultivace

kontrola

médium bez RR

Obsah chlorofylu "a" v segmentech listů petunie kultivovaných na indukčním médiu s BA po dobu 2 hodiny a 43 dní ve srovnání s kontrolními variantami bez kultivace a kultivací na médiu bez růstových regulátorů

43

5. DISKUZE Organogeneze in vitro je proces závislý na růstových regulátorech obsažených v kultivačním médiu. Jde-li o organogenezi prýtů je rozhodující podíl regulačních aktivit předpokládaný v koncentraci, délce působení a typu cytokininu obsaženém v médiu (FEITO et al. 1995). Dalším významným faktorem je utilizace cytokininu tj. jeho příjem a obsah aktivních forem respektive aktivních metabolitů (KAMÍNEK et al. 1997). Cílem mé práce bylo vyzkoušet vstupní experiment pro studium metabolismu benzyladeninu s ohledem na podíl fyziologicky aktivních a neaktivních metabolitů BA. Jako vhodná modelová rostlina byla pro indukci organogeneze vybrána petunie, na které byly současně studovány i osudy endogenních a exogenně aplikovaných cytokininů (AUEROVÁ et al. 1992, MOTYKA et al. 1996). V mém experimentu regenerovaly segmenty listů petunií na médiích s BA do desátého dne indukce organogeneze. To je dlouhá doba například ve srovnání se segmenty listů tabáku, které regenerovaly na indukčním médiu s BA ve čtvrtém až šestém dni (DHALIWAL et al. 2003). Z výsledků a doložených fotografií je však zřejmé, že pokud byla subkultivace provedena na indukční médium je frekvence regenerace vyšší než byla–li subkultivace provedena na médium bez růstových regulátorů. Také množství regenerantů na explantát ze subkultivace na indukční médium je v tomto případě vyšší a dokonce vyšší než v případě indukce organogeneze bez výměny indukčního média. To odpovídá výsledkům kterých dosáhli RAO et al. 1996 v podobé multiplikaci regenerantů avšak na rostlinách Pavlownia tomentosa. Je možné, že při výměně indukčního média je explantátům dostupný benzyladenin, který neprošel inaktivací metabolismem. Příjem a metabolismus 3H-BA popisuje ve své práci KLEMŠ et al. (2000). V práci uvádějí vznik 3H-BAR, 3H-BA7G a také 3H-BAR5´MP. Popisují především intenzivní tvorbu 3

H-BA7G a s tím spojenou inaktivaci v procesu indukce organogeneze. Je známo, že exogenně aplikované cytokininy narušují hormonální homeostázi

a především aktivují cytokininoxidázu/dehydrogenázu (AUEROVÁ et al. 1999). S tím také dochází ke změně endogenních cytokininů. V segmentech listů petunií na počátku experimentu byla nalezena jen nepatrná množství endogenních cytokininů, především však zeatin ribosid. Ten při krátkodobé kultivaci segmentů na indukčním médiu zjištěn nebyl, v tomto případě však byly zjištěny nižší obsahy izopentenyladeninu, benzyladeninu, meta-topolinu a jejich ribosidů. V případě dlouhodobé kultivace poklesl

44

pouze obsah meta-topolin ribosidu, obsah benzyladeninu se nepatrně zvýšil a obsah zeatin ribiosidu se výrazně zvýšil oproti krátkodobé kultivaci na indukčním médiu. Mezi izoprenoidními cytokininy jsou známy vzájemné metabolické konverze (HABERER a KIEBER 2002), mezi aromatickými však ne. Vysvětlení možných změn si tak pravděpodobně vyžaduje více analýz a cíleně zaměřený experiment pro tento složitý účel. Orientační analýzy obsahu chlorofylu byly provedeny za účelem ověření zda-li použitá koncentrace benzyladeninu v médiu vyhovuje kultivaci segmentů listů a zda-li dochází k zachování fotosyntetických pigmentů během kultivace Vysoké koncentrace exogenních cytokininů také mohou působit toxicky. Účinek cytokininů na oddálení degradace chlorofylů byl velmi dobře znatelný v případě krátkodobé kutivace segmentů listů. V případě dlouhodobé kultivace se obsah chlorofylu “a” snížil, resp. byla jeho hodnota vysoká stejně jako při kultivaci segmentů bez růstových regulátorů. Na základě výsledků frekvence regenerace bude v navazující diplomové práci řešena problematika metabolismu BA a stanovení podílu aktivních a neaktivních metabolitů BA, včetně změn obsahu endogenních cytokininů. Dlouhodobá kultivace na indukčním médiu bude srovnána v těchto aspektech s variantou se subkultivací na indukčním médiu či na médiu bez růstových regulátorů. Bude sledována dynamika podílu metabolitů BA. Stanovení obsahu chlorofylů a endogenních cytokininů bude prováděno vždy ve stejném čase analýzy metabolitů BA. Rozdíly v regeneraci in vitro a aktivitě cytokininů budou dle možností doplněny mikroskopickými preparáty dokládajícími výskyt meristematických center v segmentech listů jako primárních explantátech. Budou vyjádřeny časové relace procesů indukce organogeneze, tvorby meristematických center, metabolismu a degradace BA a viditelné organogeneze.

45

6. ZÁVĚR Benzyladenin (BA) je nejčastěji používaným cytokininem pro indukci morfogeneze prýtů a mikropropagaci v in vitro kulturách. Navíc jeho exogenní aplikace mění v explantáteh hladiny endogenních cytokininů, které se na indukci morfogenního procesu mohou také podílet. Cílem této práce bylo studovat metabolismus 6-benzyladeninu v indukci organogeneze prýtů na explantátech listů petunie ve vztahu k dynamice tvorby regenerantů a sledovat změny endogenních cytokininů v průběhu této indukce a následnou viditelnou morfogenezi. Segmenty ze střední části čepelí listů petunie (Petunia hybrida) cv. Lady blue byly kultivovány na indukčním MS médiu obohaceném o cytokinin (3 µM BA) a auxin (0,5 µM NAA). Krátkodobá kultivace segmentů listů na médiu s přídavkem růstových regulátorů trvala 5 nebo 7 dní, zatímco dlouhodobá 43 dní. Po krátkodobé kultivaci byly segmenty pasážovány na MS médium bez růstových regulátorů, nebo znovu na médium s růstovými regulátory. Pro stanovení účinku cytokininů na indukci organogeneze byla hodnocena frekvence regenerace prýtů (tj. podíl regenerujících segmentů z celkového počtu segmentů, vyjádřen v %) v intervalech 0, 5, 14, 17, 19, 24, 28, 34 a 43 dní. Kultivace za účelem odběru vzorků pro stanovení obsahu cytokininů probíhala v intervalech 0, 2 hodiny a 43 dní a to na médiu s růstovými regulátory nebo bez nich. Obsah endogenních cytokininů byl stanoven pomocí metody ELISA po předchozí extrakci, purifikaci a HPLC separaci. Stanovení chlorofylu „a“ a „b“ bylo provedeno na počátku kultivace a v intervalech 2 hodiny a 43 dní, spektrofotometricky. Byly zjištěny následující skutečnosti: •

Regenerace segmentů listů petunie na médiu s BA probíhala do desátého dne indukce organogeneze. Nejvyšší regenerace byla při dlouhodobé kultivaci na indukčním médiu a při 5 denní kultivaci na indukčním médiu a následném přenesení na nové indukční médium. Přenesení segmentů po 5 a 7 dnech na MS médium regeneraci zřetelně snižovalo, zatímco přenesení po 5 a 7 dnech na nové indukční médium regeneraci zvyšovalo srovnatelně s dlouhodobou kultivací na médiu s BA.

46

•

Segmenty listů petunie přijímaly BA s kultivačního média prokazatelně při dlouhodobé kultivaci. Přítomnost BA v médiu zvyšovala také hladiny ostatních cytokininů jako meta-topolin ribosidu, zeatinribosidu a izopentenyl-adenin ribosidu na počátku i po skončení dlouhodobé kultivace.

•

Segmenty listu petunie na médiu s obsahem BA velmi dobře zachovaly listová barviva. Při krátkodobé kultivaci se obsah chlorofylu "a" zvýšil, v případě dlouhodobé kultivace se jeho obsah snížil, resp. byla jeho hodnota na stejné úrovni jako při kultivaci segmentů bez růstových regulátorů.

Zvýsledků vyplývá, že segmenty listů petůnie nelze pasážovat po krátkodobé kultivaci na MS médium, jelikož nedochází k indukci organogeneze v tak krátkém čase.

47

7. POUŽITÁ LITERATURA •

ABBAS, E., BORKOVEC, V., PROCHÁZKA, S. and HAVEL, L. (1995): Translocation of nutritional and growth regulating substances in vitro to the developing roots and shoots of cucumber explants. In: BALUŠKA, F. et al. (eds.), Structure and Function of Roots, Netherlands, 253-256.

•

AITCHINSON, P.A., MACLEOD, A.J. and YEOMAMAN, M.M. (1977): Growth patterns in tissue (callus) cultures. In: Street, M. E. (ed.): Plant Tissue and Cell Culture, pp. 267-306. Blackwell Scientific Publishers, Oxford, London, Edinburgh, Melbourne.

•

AKIYOSHI, D.E., MORRIS, R.O., HINZ, R., MISCHKE, B.S., KOSUGE, T., GARFINKEL,

D.J.,

GORDON,

M.P.

and

NESTER,

E.W.

(1983):

Cytokinin/auxin balance in crown gall tumors is regulated by specific loci in the T-DNA. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80, 407-411. •

ARANDA, G., TABET, J.C., LEGUAY, J.J. and CABOCHE, M. (1984): Identification of 1-NAA-L-aspartate amide as the major metabolite synthesised by tobacco mesophyll protoplasts incubated in the presence of the auxin analogue

•

1-NAA. Phytochem. 23, 1221-1223.

AUEROVÁ, C.A., COHEN, J.D., LALOUE, M., and COOKE, T.J. (1992): Comparison of benzyladenine metabolism in two petunia hybrida lines differing in shoot organogenesis. Plant Physiol. 98, 1035-1041.

•

AUEROVÁ, C.A., MOTYKA, V., BŘEZINOVÁ, A. and KAMÍNEK, M. (1999): Endogenous cytokinin accumulation and cytokinin oxidase activity during shoot organogenesis of Petunia hybrida. Physiol. Plant. 105 (1), 141-147.

•

BAROJA-FERNÁNDEZ, E., AGURREOLEA, J., MARTÍNKOVÁ, H., HANUŠ, J. and STRNAD, M. (2002): Aromatic cytokinins in micropropagated potato plants. Plant Physiol. Biochem. 40, 217-224.

•

BATES, G.W. and CLELAND, R.E. (1979): Protein synthesis and auxininduced growth: inhibitor studies. Planta 145, 437-442. 48

•

BAYLEY, A.D., VAN STADEN, J., MALLETT, J.A. and DREWES, S.E. (1989): The in vitro metabolism of 8-14C-benzyladenine by excised organs of tomato plants. Plant Growth Regul. 8, 193-204.

•

BENNETT, M.J., MARCHANT, A., GREEN, H.G., MAY, S.T., WARD, S.P., RILLNER, P.A., WALKER, A.R., SCHULTZ, B. and FELDMANN, K.A. (1996): Arabidopsis AUX1 gene: A permease-like regulator of root gravitropism. Science 273, 948-950.

•

BREGITZER, P., CAMPBELL, R.D. and WU, Y. (1995): Plant regeneration from barley callus: Effect of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and phenylacetic acid. Plant Cell, Tiss. Org. Cult. 43, 229-235.

•

BRENNER, M.L. and CHEIKH, N. (1995): The role of hormones in photosynthate partitioning and seed filling, in: DAVIES, P J. (Ed.), Plant Hormones: Physiology, Biochemistry and Molecular biology, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 649-670.

•

COENEN, C. and LOMAX, T.L. (1997): Auxin-cytokinin interactions in higher plants: old problems and new tools. Trends Plant Sci. 2 (9), 351-356.

•

COHEN, J.D. and BANDURSKI, R.S. (1978): The bound auxins: protection of indole-3-acetic acid from peroxidase- catalysed oxidation. Planta 139, 203-208.

•

COLLIER, M.D., SHEPPARD, L.J., CROSSLEY, A. and HANKE, D.E. (2003): Needle cytokinin content as a sensitive bioindicator of N pollution in Sitka spruce. Plant Cell Envir. 26 (12), 1929-1939.

•

DELBARRE, A., MULLER, P., IMHOFF, V. and GUERN, J. (1996): Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells. Planta 198, 532-541.

•

DERUERE, J. and KIEBER, J.J. (2002): Molecular mechanisms of cytokinin signaling. Plant Growth Regul. 21 (1), 32-39.

49

•

DHALIWAL, H.S., RAMESAR-FORTNER, N.S., YEUNG, E.C., and THORPE, T.A. (2003): Competence, determination, and meristemoid plasticity in tobacco organogenesis in vitro. Can. J. Bot. 81, 611-621.

•

DOLEŽAL, K., TARKOWSKI, P., TARKOWSKÁ, D., POPA, I., HOLUB, J. and STRNAD, M. (2003): Isolation, identification and biological activity of new endogenous cytokinin class. In Plant Biology 2003 - the 2003 annual meeting of the American Society of Plant Biology. Honolulu, Hawaii USA: American Society of Plant Physiologists, pp. 150.

•

EMERY, R.J.N., LEPORT, L., BARTON, J.E., TURNER, N.C.M and ATKINS, C.A. (1998): cis-Isomers of cytokinins predominate in chickpea seeds throughout their development. Plant Physiol. 117 (4), 1515-1523.

•

ERNST, D., SCHAFER, W. and OESTERHELT, D. (1983): Isolation of a new naturally occuring cytokinin 6-benzylaminopurine riboside from an anise cell culture Pimpinella anisum L., Planta 195, 222-228.

•

ESTRUCH, J., PRINSEN, E., VAN ONCKELEN, H., SCHELL J. and SPENA, A. (1991): Viviparous leaves produced by somatic activation of inactive cytokinin - synthesizing gene. Science 254, 1364-1372.

•

FEITO, I., RODRIGUEZ, A., CENTENO, M.L., SANCHEZTAMES, R. and FERNANDEZ, B. (1995): Effect of applied benzyladenine on endogenous cytokinin content during the early stages of bud development of kiwifruit. Physiol. Plant. 95 (2), 241-246.

•

FRANCIS, D. and SORRELL, D.A. (2001): The interface between the cell cycle and plant growth regulators: a mini review. Plant Growth Regul. 33 (1), 1-12.

•

GALUSZKA, P., FRÉBORT, I., ŠEBELA, M., STRNAD, M. and PEC, P. (1999): Cytokinin oxidase: the key enzyme in the biodegradation of cytokinins. pp. 39-48. In: STRNAD, M., PEC, P., BECK, E. H, (eds.), Advances in Regulation of Plant Growth and Development, Peres Publ., Prague

50

•

GÄLWEILER, L., GUAN, CH., MÜLLER, A,. WISMAN, E., MENGEN, K., YEPHREMOV, A. and PALME, K. (1998): Regulation of polar auxin transport by AtPIN1 in Arabidopsis vascular tissue. Science 282, 2226-2229.

•

GAMBORG, O.L., MILLER, R.A. and OJIMA, K. (1968): Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50, 151-158.

•

GRIEVE, T.M., GARTLAND, K.M.A. and ELLIOTT, M.C. (1997): Micropropagation of commercially important sugar beet cultivars. Plant Growth Regul. 21 (1), 15-18.

•

HABERER, G. and KIEBER, J.J. (2002): Cytokinins. New insights into a classic phytohormone. Plant Physiol. 128 (2), 354-362.

•

HAGER, A., MENZEL, H. and KRAUSS, A. (1971): Versuche der Hypothese zur Primärwirkung des Auxins beim Streckungswachstum. Planta 100, 47-75.

•

HALL, S.M. and BAKER, D.A. (1972) : The chemical composition of Riccinus phloem exudate. Planta 106, 131-140.

•

HALMANN, M. (1990): Synthetic plant-growth regulators. Adv. Agron. 43, 47105.

•

HALPERIN, W. (1969): The use of cultured tissue in studying developmental problems. Can. J. Botany 51, 1801-1806.

•

HARDING, S.A. and SMIGOCKI, A.C. (1994): Cytokinins modulate stress response

genes

in

isopentenyl

transferase-transformed

Nicotiana

plumbaginifolia plants. Physiol. Plant. 90, 327-333. •

HOBBIE, L., and ESTELLE, M. (1994): Genetic approaches to auxin action, Plant Cell Environ. 17, 525-540.

•

HORGAN, R., HEWETT, E.W., HORGAN, J.M., PURSE, J.G. and WAREING, P.F. (1975): A new cytokinin from Populus x Robusta. Phytochem. 14, 1005-1009. 51

•

JACOBS, W.P. (1976): Apolar movement of zeatin through coleus petioles and pisum roots as estimated by bioassay and radioactive labeling. Am. J. Bot. 63 (5), 571-577.

•

JELIC, G. and BOGDANOVIC, M. (1990): The relationship between chlorophyll accumulation and endogenous cytokinin in the greening cotyledons of Pinus nigra, Am. Plant Sci. 71, 153-157.

•

JINDROVÁ , M. , KUBALÁKOVÁ , M. and STRNAD , M. (1995): Vliv cytokininů na morfogenezi u listových explantátů Nicotiana tabacum var. Samsun. In: VII. dni fyziológie rastlín (zborník abstraktov) Nitra 1995, pp. 66.

•

KAKIMOTO, T. (2001): Identification of plant cytokinin biosynthetic enzymes as dimethylallyl diphosphate: ATP/ADP isopentenyltransferases. Plant Cell Physiol. 42, 677-685.

•

KAMBOJ, J.S., BLAKE, P.S., QUINLAN, J.D., BAKER, B.A. (1999): Identification and quantification by GC-MS of zeatin and zeatin riboside in xylem sap from rootstock and scion of grafted apple trees. Plant Growth Regul. 28, 199-205.

•

KAMÍNEK, M. (1992): Progress in cytokinin research. Trends Bitech. 10, 159164.

•

KAMÍNEK, M. (1997): CYTOKININY, in: PROCHÁZKA, S. and ŠEBÁNEK, J. (ed): Regulátory rostlinného růstu. Academia Praha. 5, 43-76.

•

KAMÍNEK, M. and ARMSTRONG, D.J. (1990): Genotypic variation in cytokinin oxidase from phaseolus callus-cultures. Plant Physiol. 93 (4), 15301538.

•

KAMÍNEK, M. and LUŠTINEC, J. (1978): Sensitivity of aok leaf chlorophyll retention bioassay to natural and biosynthetic cytokinins. Biol. Plant. 20, 377382.

52

•

KAMÍNEK, M., MOTYKA, V. and VAŇKOVÁ, R. (1997): Regulation of cytokinin content in plant cells. Physiol. Plant. 101 (4), 689-700.

•

KLEMŠ, M., BALLA, J., MACHAČKOVÁ, I., EDER, J. and PROCHÁZKA, S. (2000): The uptake and metabolism of 3H-benzylaminopuirine in tobacco (Nicotiana tabacum L.) and cucumber (Cucumis sativus L.) explants. Plant Growth Regulation 31, 135-142.

•

KULAJEVA, O.N. (1962) : The effect of roots on leaf metabolism in relation to the action of kinetin on leaves. Sov. Plant Physiol. 9, 182-188.

•

KUTINA, J. (1988): Regulátory růstu a jejich využití v zemědelství a zahradnictví. Státní zemědělské nakladatelství, Praha, 1987, pp. 416.

•

LADO, P., RASI-CALDOGNO, F. and COLOMBO, R. (1977): Effect of cycloheximide on IAA- or FC-induced cell enlargement in pea internode segments. Plant Sci. Lett. 9, 93-101.

•

LALOUE, M. and FOX, J.E. (1989) : Cytokinin oxidase from wheat. Partial purification and general properties. Plant Physiol. 90, 899-903.

•

LALOUE, M. and PETHE, C. (1982): In: WAREING, P.F., (ed.): Plant Growth Substances 1982. Acad. Press, London, 185-195.

•

LAURIE, S. and HALFORD, N.G. (2001): The role of protein kinases in the regulation of plant growth and development. Plant Growth Regul. 34 (3), 253265.

•

LETHAM, D.S. (1963): Zeatin, factor inducing cell division from Zea mays. Life Sci. 8, 596-599.

•

LETHAM, D.S. (1994): Cytokinins as phytohormones - sites of biosynthesis, translocation, and function of translocated cytokinin. In: Cytokinins: Chemistry, Activity, and Function (MOK, D. W. S. and MOK, M. C., eds). Boca Raton, FL. USA: CRC Press, pp. 57-80.

53

•

LETHAM, D.S. and PALNI, L.M.S. (1983): The biosynthesis and metabolism of cytokinins. Annu. Rev. Plant Physiol. 34, 163-197.

•

LI, Y., HAGEN, G. and GUILFOLYE, T.J. (1992): Altered morphology in transgenic tobacco plants that overproduce cytokinins in specific tissues and organs. Dev. Biol. 153, 386-399.

•

MACHÁČKOVÁ, I., EDER, J., MOTYKA, V., HANUŠ, J. and KREKULE, J. (1996): Photoperiodic control of cytokinin transport and metabolism in Chenopodium rubrum. Physiol. Plant. 98, 564-570.

•

MACHÁČKOVÁ, I., KREKULE, J., EDER, J., SEIDLOVÁ, F. and STRNAD, M. (1993): Cytokinins in photoperiodic induction of flowering in Chenopodium species. Physiol. Plant. 87, 160-166.

•

Mc GAW, B.A. and HORGAN, R. (1985): Cytokinin metabolism and the control of cytokinin activity. Biol. Plant 27 (2-3), 180-187.

•

Mc GAW, B.A., HORGAN, R., HEALD, J.K., WULLEMS, G.J. and SCHILPEROORT, R.A. (1988): Mass spectrometric quantitation of cytokinins in tobacco crown-gall tumours induced by mutated octopine Ti plasmids of Agrobacterium tumefaciens. Planta 176 (2), 230-234.

•

Mc GAW, B.A., SCOTT, I.M. and HORGAN, R. (1984): Metabolism and biosynthesis of the cytokinins. In: The Biosynthesis and Metabolism of Plant Hormones (A. CROZIER and J. HILLMAN, eds.). Society of Experimental Biology, Seminar Series 23. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 105134.

•

MEINS, F., LUTZ, J. and BINNS, N.A. (1980): Variation in the competence of tobacco pith cells for cytokinin-habituation in culture. Differentiation 16 (1), 7175.

•

MEYER, H. and VAN STANDEN, J. (1997): The in vitro production of an anthocyanin from callus cultures of Oxalica linearis. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 40, 51-287. 54

•

MILLER, C.O., SKOOG, F., OKUMURA, F.S., von SALTZA, M.M. and STRONG, F.M. (1956): Isolation, structure and synthesis of kinetin, a substance promoting cell division. J. Amer. Chem. Soc. 78, 1375-1380.

•

MOFFATT , B., PETHE , C. and LALOUE , M. (1991): Metabolism of benzyladenine is impaired in a mutant of Arabidopsis thaliana lacking adenine phosphoribosyl-transferase activity. Plant Physiol. 95, 900-908.

•

MOK, D.W.S. and MOK, M.C. (1994): Cytokinin chemistry, activity and function, CRC Press. Inc.

•

MOK, D.W.S., MOK, M.C., MARTIN, R.C., and BASSIL, N.V. (1992): Zeatin metabolism in Phaseolus: Enzymes and genes. In: Progress in Plant Growth Regulation. C. M. KARSSEN, L. C. VAN LOON, AND D. VREUGDENHIL (eds.). Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. pp. 597-606.

•

MOK, M. (1976): Carotenoid synthesis in tissue cultures of Dacus carota. J. Am. Soc. Hort. Sci. 101, 422-429.

•

MOK, M.C. and MOK, W.S. (1985): The metabolisme of 14C-thidiazuron in callus tissue of Phaseolus lanatusL. Physiol. Plant. 65, 427-432.

•

MOTYKA, V. and KAMÍNEK, M. (1992): Characterization of cytokinin oxidase from tobacco and polar callus cultures. In: KAMÍNEK, M., MOK, D. W. S. and ZAŽÍMALOVÁ, E., (eds): Physiology and Biochemistry of Cytokinins in Plants. SPB Acad. Publishing, The Hague, 33-39.

•

MOTYKA, V., FAISS, M. STRNAD, M., KAMÍNEK, M. and SCHMÜLLING, T. (1996): Cahrnges in cytikinin content and cytokinin oxidase activity in response to derepression of ipt gene transcription in transgenic tobacco calli and plants. Plant Physiol. 112, 1035-1043.

•

MUDAY, G.K. and DELONG, A. (2001): Polar auxin transport: controlling where and how much. Trends Plant Sci. 6, 535-541.

55

•

MULDER-KRIEGER, T., VERPOORTE, R., SVENDSE, A., SCHEFFER, J. (1988): Production of essential oils and flavours in plant cell and tissue cultures. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 13, 85-114.

•

MURASHIGE, T. and SKOOG, F. (1962): Arevised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497.

•

PIERIK, R.L.M. (1997): In vitro culture of higher plants. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht – Boston – London, pp. 348.

•

PORRA, R.J., THOMPSON, W.A. and KRIEDERMANN, P.E. (1989): Determination of acurate extinction coefficients and simultaneous equations for assayingchlorophylls a and b extracted with different solvents: verification of the concentartion of chlorophyll standarts by atomic absorption spectroscopy. Biochim Biophys Acta 975, 384-394.

•

RAO, C.D., GOH, C.J. and KUMAR, P.P. (1996): High frequency adventitious shoot regeneration from excised leaves of Paulownia spp. cultured in vitro. Plant Cell Rep. 16 (3-4), 204-209.

•

RAO, S.M. and RAVISHANKAR, G.A. (2002): Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnol. Adv. 20, 101-153.

•

REDIG, P., SHAUL, O., INZE, D., VAN MONTAGU, M. and VAN ONCKELEN, H. (1996): Levels of endogenous cytokinins, indole-3-acetic acid and abscisic acid during the cell cycle of synchronized tobacco BY-2 cells. FEBS Lett. 391, 175-180.

•

REINERT, J. and BAJAJ, Y.P.S. (1977): Plant cell, tissue and organ culture. pp. 803.

•

REINERT, J. and BACKS, D. (1968): Control of totipotency in plant cells growing in vitro. Nature 220, 1340-1341.

•

RIVIER, L. and CROSIER, A. (1987): Principles and practice of plant hormone analysis (Vol. 2). Academic Press, INC, London, pp. 303.

56

•

SACHS, T. and THIMANN, K.V. (1964): Release of lateral buds from apical dominance. Planta 201, 939-940.

•

SAKAKIBARA,

H.

(2006):

Cytokinins:

Activity,

biosynthesis,

and

translocation. Annu Rev Plant Biol 57, 431-449. •

SEITZ, H.U. and HINDERER, W. (1988): Anthocyanins. In: CONSTABEL, F. and VASIL, I. Eds.): Cell culture and somatic cell genetics of plants. Vol. 5. Academic Press, San Diego, USA, 49-76.

•

SHANTZ, E.M. and STEWARD, V.C. (1955): The identification of Compound a from coconut milk as 1,3-diphenylurea. J. Amer. Chem. Soc. 77, 6351-6353.

•

SHAW, G., SMALLWOOD, B.M. and WILSON, D.V. (1966): Purines, pyrimidines and imidaroles, XXIV. Syntheses of zeatin, a naturally occuring adenine derivate with plant cell promoting activity and its 9-β-D ribofuranoside. J. Chem. Soc., 921-926.

•

SKENE, K.G.M. (1975): Cytokinin production by root as a factor in the control of plant growth. In: The development and function of roots. Ed. J.G. TOREY and D.T. CLARSON. Academic Press, London-New York-San Francisco, 365396.

•

SKOOG , F. and MILLER , C.O. (1957): Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. In The biological action of Growth Substances ( H.K. PORTER , ed.) , pp. 118-131. Acad. Press , New York.

•

SKOOG, F. (1973): A survey of cytokinins and cytokinin antagonist with reference to nucleic acid and protein metabolism. Biochem. Soc. Symp. 38, 195215.

•

SKOOG, F., and ARMSTRONG, D.J. (1970): Cytokinins. Ann. Rev. Plant Physiol. 21, 359-364.

57

•

SKOOG, F., HAMZI, H.Q., SZWEYKOWSKA, A.M., LEONARD, N.J., CARRWAY, K.L., FUGII, T., HELGESON, J.P. and LOEPPKY, R.N. (1967): Cytokinins – structure/activity relationship. Phytochemistry 6 (9), 1169-1967.

•

SLATER, A., SCOTT, N.W.and FOWLER, M.R. (2003): Plant biotechnologyThe genetic manipulation of plants. 1st Ed. Oxford: Oxford University Press, 368.

•

SMULDERS , M. J. M., VEN, E. T. W. M., VAN DE CROS, A. F. and WULLEMS, G. J. (1990): Metabolism of 1-naphtaleneacetic acid in explants of tobacco: Evidence for release of free hormone from conjugates., J. Plant Growth Regul. 9, 27-34.

•

STRNAD, M. (1996): Enzyme immunoassays of N6-benzyladenine and N6(meta-hydroxybenzyl)adenine cytokinins. J. Plant Growth Regul. 15, 179-188.

•

STRNAD, M., HANUŠ, J., VANĚK, T., KAMÍNEK, M. and HANKE, D.E. (1997): Meta-topolin, a highly active aromatic cytokinin from poplar leaves (Populus x canadensis Moench., cv. Robusta). Phytochem. 45, 213-218.

•

STRNAD, M., PETERS, W., BECK, E. and KAMÍNEK, M. (1992b): Immunodetection and identification of N6-(o-hydroxybenzylamino)purine as naturally occurring cytokinin in Populus x canadensis cv. Robusta leaves. Plant Physiol. 99, 74-80.

•

STRNAD, M., VEREŠ, K., HANUŠ, J. and SIGLEROVÁ, V. (1992a): Immunological methods for quantification and identification of cytokinins. pp. 437-446. In: KAMÍNEK, M., MOK, M.C.C., ZAŽÍMALOVÁ, E. (eds.), Physiology and Biochemistry of Cytokinins in Plants, SPB Academic Publ., The Hague.

•

ŠEBÁNEK, J., KLIČOVÁ, S., KRÁLÍK, J., PSOTA, V., VÍTKOVÁ, H., KUDOVÁ, D. and REINÖHL V. (1991): The effect of paclobutrazol on the level of endogenous IAA in relation to the rooting of cuttings and abscission of petioles. Biochemie und Physiologie der Pflanzen 187 (1), 89-94.

58

•

TARKOWSKÁ, D., DOLEŽAL, K., TARKOWSKI, P., ÅSTOT, C., SCHMÜLLING, T., HOLUB, J., FUKSOVÁ, K., SANDBERG, G. and STRNAD, M. (2003): Identification of new aromatic cytokinins in Arabidopsis thaliana, poplar leaves and Agrobacterium tumefaciens strains by LC-(+)ESIMS and capillary liquid chromatography/frit - fast atom bombardment mass spectrometry. - Physiol. Plant. 117, 579-590.

•

TARKOWSKI, P., DOLEŽAL, K. and STRNAD, M. (2004): Analytical methods in cytokinin research. Chemické listy 98 (9), 834-841.

•

THEOLOGIS, A. (1986): Rapid gene regulation by auxin. Ann. Rev. Plant Physiol. 37, 407-438.

•

THIMANN, K.V. and SATLER, S.O. (1979): Relation between leaf senescence and stomatal closure – senescence in light. Proc. Natl. Acad. Sci. 76 (5), 22952298.

•

TORREY, J.G. (1976): Root hormones and plant-growth. Rev. Plant Physiol. 27, 435-459.

•

UMEDA, M., UMEDA-HARA, C. and UCHIMIYA, H. (2000): A cyclindependent kinase-activating kinase regulates differentiation of root initial cells in Arabidopsis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97 (24), 13396-13400.

•

VAIBHAV, T., KAVINDRA, N.T. and BRAHMA, D.S. (2001): Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Baccopa monniera. Plant. Cell Tiss. Org. Cult. 66, 9-16.

•

VANDENHEUVEL, S.V.D. and HARLOW, E. (1993): Distinct roles for cyclindependent kinases in cell cycle control. Science 262, 2050-2054.

•

VANDERHOEF, L.N. (1980): Auxin-regulated elongation: A summary hypothesis In: F SKOOG, ed. Plant Growth Regulation Substances 1979, pp. 9096. Berlin-Heidelberg-new York: Springer Verlag.

59

•

WERBROUCK, S.P.O., STRNAD, M., VAN ONCKELEN, H.A. and DEBERGH, P.C. (1996): Meta-topolin, an alternative to benzyladenine in tissue culture. Physiol. Plant. 98, 291-297.

•

WERBROUCK, S.P.O., VANDERJEUGT, B., DEWITTE, W., PRINSEN, E., VANONCKELEN, H.A. and DEBERGH, P.C. (1995): The metabolism of benzyladenine in Spathiphyllum floribundum schott-petite in relation to acclimatization problems. Plant Cell Rep. 14 (10), 662-665.

•

YAMAGUCHI,

M.,

KATO,

H.,

YOSHIDA,

S.,

YAMAMURA,

S.,

UCHIMIYA, H. and UMEDA, M. (2003): Control of in vitro organogenesis by cyclin-dependent kinase activities in plants. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 100 (13), 8019-8023.

60

8. Přílohy A. Fotodokumentace B. Abstrakty

61

A. Fotodokumentace

obr. 5 a) b) Kultivace v aseptickém prostředí, šikmé agarové MS (MURASHIGE a SKOOG 1962) médium s 5 g.l-1 sacharózy

obr. 6 a) b) Kultivace vzrostlých rostlin v in vitro podmínkách na médiu GAMBORG et al. (1968) s 10 g.l-1 sacharózy a 0,5 g.l-1 aktivního uhlí při laboratorní teplotě 25 ± 1 ºC, po celou dobu na světle (200 µmol.m-2.s-1)

62

obr. 7: Kultivace segmentů ze střední části čepelí listů na Petriho miskách, na indukčním MS médiu obohaceném o cytokinin (3 µM benzyladenin - BA) a auxin (0,5 µM kyselina 1-naftyloctová - NAA)

obr. 8 a) b) Regenerace při 5 denní kultivaci na IM a následném přenesení na MS médium bez BA

obr. 9 a) b) Regenerace při 7 denní kultivaci na IM a následném přenesení na MS médium bez BA

63

obr. 10 a) Dlohodobá kultivace na IM (43 dnů)

b)

obr. 11 a) b) Regenerace při 5 denní kultivaci na IM a následném přenesení na nové IM s obsahem BA

obr. 12 a) b) Regenerace při 7 denní kultivaci na IM a následném přenesení na nové IM s obsahem BA

64

B. Abstrakty Vliv skladování a chemického ošetření na dormanci a rašení hlízek mečíků (Gladiolus hybridus hortensis) Dundálková, L., Bradáčová, A., Klemš, M., Vítková, H., Prokešová, Z., Fišerová, H. and Procházka, S. Ústav biologie rostlin, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická Univerzita, Zemědělská 1, 613 00 Brno Dormance hlízek (zahradnicky brutu) mečíků Gladiolus začíná v průběhu jejich růstu a vývoje pod vlivem podmínek zkracující se fotoperiody. Rašení dormantních hlízek je stimulováno chemickými (gibereliny) a fyzikálními (nízká teplota, krátký den) faktory. Cílem práce bylo studovat vztah kyseliny abscisové, etylenu a úrovně dormance hlízek mečíků po sklizni v období od října do dubna. K posouzení dormance hlízek byla využita kultivace hlízek in vitro po předchozím skladování při teplotách +4 °C nebo +20 °C. Obsah kyseliny absci sové byl stanoven radioimunoanalyticky a produkce etylénu plynovou chromatografií. Při in vitro kultivaci hlízek ošetřených giberelinem (30 µM) nebo fluridonem (inhibitor biosyntézy ABA, 1,5 µM) byla dormance přerušena, aplikace kyseliny abscisové (4 µM) dormanci prohlubovala. ABA od začátku kultivace zpomalovala rašení nadzemní části rostlin i kořenů a navíc redukovala jejich růst. Hlízky ošetřené fluridonem a giberelinem měly zkrácenou dormanci. Dlouhodobé skladování hlízek při +20 °C zesilovalo dormanci, bez snížení jejich vi tality či ztráty hmotnosti. Účinek giberelinu se projevil hlavně stimulací růstu nadzemní části. Obsah kyseliny abscisové byl v průběhu období říjen až leden vysoký a později se snižoval, produkce etylénu byla v průběhu dormance nejnižší a na jejím konci se zvyšovala.

65

Hladiny cytokininů a aktivity β -glukosidázy a cytokinin dehydrogenázy během indukce regenerace prýtů in vitro Zdeňka Prokešová1, Marek Klemš1, Anna Bradáčová1, Jiří Malbeck2, Alena Trávníčková2, Václav Motyka2, Stanislav Procházka1 1 Ústav biologie rostlin,Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Zemědělská 1, 613 00 Brno, ČR 2 Ústav experimentální botaniky, Akademie věd České republiky, Rozvojová 263, 165 02 Praha 6 – Lysolaje, ČR

Byl studován příjem a metabolismus hydroxylovaných cytokininů zeatinu (Z) a dihydrozeatinu (DHZ) a aktivity enzymů cytokinin dehydrogenázy a βglukosidázy v segmentech listů standardního a transgenního tabáku (transformovaného k produkci cytokinin-specifické β-glukosidázy) během indukce tvorby prýtů in vitro. Dále byla sledována frekvence tvorby prýtů (počet regenerujících explantátů vyjádřený v %) během 30-denní kultivace na indukčním médiu (IM; Murrashige-Skoog médium obohacené o růstové regulátory) a frekvence regenerace během 5-denní kultivace na IM a následné 25-denní kultivace na médiu bez růstových regulátorů (IM/MS). Frekvence regenerace segmentů listů transgenního tabáku v subkultivační variantě IM/MS dosahovala po 30 dnech kultivace 60 % (IM s DHZ /MS) a 75 % (IM se Z/MS), u segmentů listů standardního tabáku byla pouze 45 % (IM s DHZ /MS) a 50% (IM se Z /MS). Frekvence tvorby prýtů dosahovala u segmentů listů obou linií na obou IM 100 % již v 16. dni kultivace. Segmenty listů tabáku obou linií obsahovaly během sledovaného období (0, 2, 8, 20 a 48 hodin a 30 dní od počátku kultivace) více cytokininů, pokud byly kultivovány na médiu s DHZ. Příjem cytokininů z média dosahoval na počátku indukce organogeneze svého maxima po 8 hodinách kultivace na médiu se Z a plynule rostl až do 48. hodiny na médiu s DHZ. Obsah aktivních cytokininů v segmentech listů kultivovaných na médiu se Z korespondoval s jejich příjmem a klesal po 8 hodinách indukce, v segmetech listů kultivovaných na médiu s DHZ došlo ke snížení mezi 8. a 20. hodinou indukce. Obsah zásobních, detoxifikačních a deaktivačních forem cytokininů s délkou kultivace vzrostl několikanásobně zejména v segmentech listů kultivovaných na médiu s DHZ. Pozvolnější nárůst obsahu O-glukosidů oproti segmentům listů standardního tabáku byl zaznamenán v segmentech listů transgenního tabáku současně se zvyšující se aktivitou β−glukosidázy. Aktivita cytokinin dehydrogenázy v segmentech listů tabáku v průběhu indukce organogeneze vzrůstala na počátku kultivace, ke konci klesala. Ačkoli DHZ je segmenty listů tabáku lépe přijímán i metabolizován a obsah aktivních forem cytokininů je vyšší v segmentech kultivovaných na médiu s DHZ, segmenty listů tabáku regenerují lépe na médiu se Z, který patří v biotestech k nejaktivnějším cytokininům.

Poděkování Tato práce byla podpořena grantem Ministerstva školství mládeže a tělovýchovy ČR, FRVŠ 4/167a Grantovou agenturou MUAF IGA 4/4 .

66

SCREENING OF PHYSIOLOGICAL ACTIVITY OF 6-BENZYLAMINOPURINE DERIVATIVES IN REGENERATION IN VITRO SCREENING FYZIOLOGICKÉ AKTIVITY DERIVÁTŮ 6-BENZYLAMINOPURINU V REGENERACI IN VITRO Bradáčová, A., Dundálková, L., Prokešová, Z., Klemš, M. and Procházka, S. Department of Plant Biology, Faculty of Agronomy, Mendel University of Agriculture and Forestry, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Czech Republic E-mail: [email protected], [email protected]

ABSTRACT The topic of the work was to study a physiological activity of 6-benzylaminopurine (BA) derivatives in induction of organogenesis in vitro adherent to metabolites formed directly in plant tissues, respectively. 6-benzylaminopurine riboside (BAR), 6-benzylaminopurine riboside monophosphate (BAR5´MP) and 6-benzylaminopurine7-glucoside (BA7G) were aplicated into MS cultivation medium and the induction of organogenesis was observed in 30 days. The comparable cytokinin activity in induction of organogenesis in vitro showed BA and BAR5´MP, less active was BAR. The level of endogenous cytokinins was highest in explants cultivated on the medium with BA and BAR5´MP. The content of chlorophyll during the in vitro cultivation decreased in all variants, mainly in explants cultivated on BA7G. Key words: shoot formation, petunia, cytokinin, chlorophyll

ABSTRAKT Cílem práce bylo sledovat fyziologickou aktivitu derivátů 6-benzylaminopurinu (BA) v indukci organogeneze in vitro, a to látek, které vznikají jako metabolity přímo v rostlinných pletivech.

3µM koncentrace 6-benzylaminopurinribosidu (BAR), 6-

benzylaminopurinribosid-5´-monofosfátu

(BAR5´MP)

a

6-benzylaminopurin-7-

glukosidu (BA7G) byla aplikována do kultivačního média MS a po dobu 30 dnů byla sledována indukce organogeneze, obsah chlorofylu a endogeních cytokininů. Srovnatelně aktivní s BA byl v indukci organogeneze in vitro BAR5´MP, o něco méně aktivní byl BAR. Obsah endogenních cytokininů byl nejvyšší v explantátech kultivovaných na BA a BAR5´MP. Množství chlorofylu při kultivaci in vitro klesalo ve všech variantách, nejvýrazněji však na médiu s BA7G. Klíčová slova: regenerace prýtů,, petunie, cytokininy, chlorofyl

67