Téma: IZOLACE DNA Z ROSTLIN, DIRECT A NESTED PCR SPECIFICKÝMI A UNIVERZÁLNÍMI PRIMERY, RFLP Ing. Jana Fránová, Dr., Biologické centrum AV ČR v.v.i. Teorie: Zatímco do devadesátých let minulého století byly pro detekci fytoplazem využívány zejména metody založené na DNA hybridizaci, v současnosti je hlavním prostředkem pro detekci a identifikaci fytoplazem PCR. Univerzální i skupinově specifické primery pro detekci fytoplazem byly odvozeny od sekvence 16S rRNA genu, a později od sekvencí pro geny ribozomálních proteinů, SecY a Tuf genů a genů kódujících proteiny asociované s membránami fytoplazem (imp). Nezbytným předpokladem úspěšné PCR amplifikace fytoplazmové DNA je izolace celkové DNA z rostliny či vektora v dostatečné kvalitě. Pro jednu PCR reakci se většinou používá cca 20 ng templátové DNA. Schaff et al. (1992) uvádí obecné podmínky polymerázové řetězové reakce pro detekci fytoplazem: počáteční denaturace 94 °C – 2 min, 35 amplifikačních cyklů (denaturace 94 ºC – 1 min, nasedání primerů 50 ºC – 2 min, syntéza řetězců 72 ºC – 3 min), na závěr reakce následuje krok dosyntetizování řetězců při 72 ºC – 10 min. PCR technika je velmi citlivá, ale vzhledem k nízkému titru fytoplazem je pro přesnou diagnózu nezbytné její citlivost ještě zvýšit, což je možné provedením tzv. nested-PCR, kdy amplifikační produkt první reakce slouží jako templát pro následnou amplifikaci. Nevýhodou nested-PCR je vyšší pravděpodobnost kontaminace, a tedy získání falešně pozitivních výsledků. Obvykle je prvním stupněm PCR tzv. direct PCR, při níž se většinou užívají primery P1/P7 (Deng a Hiruki, 1991; Schneider et al., 1995), které amplifikují 16S-23S rDNA o délce cca 1800 bp. Pro zvýšení citlivosti a odstranění inhibičních látek se produkt naředí (1:29 až 1:50 sterilní destilovanou vodou) a amplifikuje v tzv. nested PCR s vnitřními primery. V nested PCR se používají různé kombinace primerů, podmínkou je, aby druhý vnitřní pár primerů byl umístěn uvnitř PCR produktu získaného v první (direkt) amplifikaci. Nejčastěji používané primery (oligonukleotidy) pro detekci fytoplazem jsou uvedeny v tabulce 1A. Pro určení diverzity a přesnější identifikaci fytoplazem se dále využívají oblasti genomu fytoplazem mimo oblast 16SrDNA-23SrDNA. Příkladem PCR s primery odvozenými od neribozomálních sekvencí je amplifikace genů pro ribosomální proteiny rpl22 a rps3. Pro skupinu žloutenky aster (16SrI) se používají primery rpF1/R1 (Lim a Sears, 1992) a v následné nested reakci primery rp(I)F1(A)/rp(I)R1(A) (Lee et al., 2004) a pro skupinu proliferace jabloně (16SrX) primery rpAP15f/rpAP15r (Martini et al., 2006; Martini et al., 2008). Pro identifikaci fytoplazem je možné využít amplifikace tuf genu, který kóduje elongační faktor EF-Tu, s primery Tuf1f/r a primery fTufu/rTufu, nebo fTufAY/rTufAY v nested PCR (Schneider et al., 1997). V případě fytoplazmy stolburu je možné pro detekci a identifikaci využít primery G35p/m, které amplifikují chromosomální sekvence genu pro helikázu (Davis et al., 1992). Sekvence neribozomálních primerů jsou uvedeny v tabulkách 1B a C. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
1
Přestože PCR je nejcitlivější, specifický a rychlý způsob detekce fytoplazem, v praxi se někdy setkáváme s nespecifickou amplifikací, kdy produkty neodpovídají očekávané velikosti nebo vzniká více produktů nebo dokonce může dojít k amplifikaci DNA jiného organismu (Skrzeczkowski et al., 2001; Navrátil et al., 2005; Navrátil et al., 2007). Velkým problémem mohou být i kontaminace vzorků a reagencií vedoucí k chybně pozitivním výsledkům; na druhé straně, podlimitní koncentrace fytoplazmové DNA ve vzorku nebo přítomnost inhibičních látek může vést k falešně negativním výsledkům. Pro odhalení falešně pozitivních reakcí (ne kontaminací v laboratoři) je nezbytné výsledek PCR detekce potvrdit RFLP analýzou produktu nebo sekvenováním. RFLP analýza Pro rozlišení skupin a podskupin jsou amplifikované segmenty fytoplazmové DNA štěpeny různými restrikčními enzymy, např. AluI, HhaI, MseI, KpnI, RsaI, SspI, TruI. Naštěpené produkty jsou separovány pomocí horizontální elektroforézy v agarózovém gelu nebo vertikální elektroforézy v akrylamidovém gelu, barveny etidium bromidem (SyberGreenem nebo GelRedem) a vizualizovány UV transiluminátorem. Porovnáním restrikčních spekter s kontrolními vzorky nebo literárními údaji je možné přesně identifikovat danou fytoplazmu (Lee et al., 1998).
Tab. 1A: Sekvence primerů (5´3´), které specificky amplifikují fytoplazmovou 16S ribosomální DNA Označení primeru a sekvence
Literatura
P1 P7
AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT CGTCCTTCATCGGCTCTT
Deng a Hiruki, 1991 Schneider et al., 1995
F1 B6
AAGACGAGGATAACAGTTGG TAGTGCCAAGGCATCCACTGTG
Davis a Lee, 1993 Padovan et al., 1995
cca 1650 bp
F1 R0
AAGACGAGGATAACAGTTGG GGATACCTTGTTACGACTTAACCCC
Davis a Lee, 1993 Lee et al., 1993
cca 1330 bp
F2n R2
GAAACGACTGCTAAGACTGG TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG
Gundersen a Lee, 1996 Lee et al., 1993
cca 1200 bp
fU5 rU3
CGGCAATGGAGGAAACT TTCAGCTACTCTTTGTAACA
Lorenz et al., 1995 Lorenz et al., 1995
cca 850 bp
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
Velikost produktu cca 1800 bp
2
Tab. 1B: Sekvence primerů (5´ 3´), které specificky amplifikují fytoplazmovou DNA ribosomálních proteinů L22, S3 Označení primeru a sekvence
Literatura
rpF1 rpR1
Lim a Sears, 1992 Lim a Sears, 1992
GGACATAAGTTAGGTGAATTT ACGATATTTAGTTCTTTTTGG
rpF1(A) TTTTCCCCTACACGTACTTA rpR1(A) GTTCTTTTTGGCATTAACAT
Lee et al., 2004 Lee et al., 2004
rpAP15f AGTGCTGAAGCTAATTTGG rpAP15r TGCTTTTTATAGCAAAAGGTT
Martini et al., 2008
Velikost produktu cca1240 bp
cca 1210 bp
cca 900 bp
Tab. 1C: Sekvence primerů (5´3´), které specificky amplifikují fytoplazmovou DNA tuf genu a genu pro helikázu Označení primeru a sekvence Velikost produktu fTuf 1 CACATTGACCACGGTAAAAC rTuf 1 CCACCTTCACGAATAGAGAAC
Literatura Schneider et al., 1997
Velikost produktu cca 1080 bp
fTufAY GCTAAAAGTAGAGCTTATGA rTufAY CGTTGTCACCTGGCATTACC
Schneider et al., 1997
cca 950 bp
fTufu rTufu
CCTGAAGAAAGAGAACGTGG CGGAAATAGAATTGAGGACG
Schneider et al., 1997
cca 840 bp
G35p G35m
TAACACTGTGGAAGCTCA CGTCAATGGCTAATCGAT
Davis et al., 1992
cca 1250 pb
Protokoly – izolace DNA kity a chloroform-fenolovou metodou - direct , nested PCR - RFLP
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
3
Izolace DNA z rostlin kitem DNeasy Plant Mini QIAGEN -
všechny centrifugační kroky provádět při pokojové teplotě pokud je nutné, rozpusťte usazeniny v pufrech AP1 a AP3/E koncentrátech při 65 ºC (před přidáním ethanolu!) přidat ethanol do pufrů AW a AP3/E (96-100%) předehřát termoblok na 65 ºC
1. V misce rozhomogenizovat vzorek (0,1 g) s tekutým dusíkem na prach. Hned přenést pomocí špachtličky do 1,5 ml epp s kulatým dnem. Vzorek nechat roztát. (Překročení doporučeného množství materiálu snižuje výtěžnost a čistotu DNA). 2. Přidat 400 µl pufru AP1 a 4 µl RNase A. Vortex. Shluky pletiva by bránily dostatečnému rozpuštění pletiva. (Nemíchat pufr AP1 a RNase A před použitím!) 3. Inkubovat 10 min při 65 ºC. Během inkubace převracet epp 2-3x. 4. Přidejte k lyzátu 130 µl pufru AP2. Promíchat a inkubovat 5 min na ledu. 5. Centrifuga 5 min při 20.000 x g (14.000 rpm) 6. Pipetovat lyzát – supernatant na QIAshredder Mini Spin kolonku (fialová) umístěnou ve 2 ml sběrné zkumavce. Centrifuga 2 min při 20.000 x g (14.000 rpm), event. opakovat centrifugaci při zvýšených otáčkách a čase. 7. Přenést proteklou frakci do čisté zkumavky (nepřiložená) bez porušení peletu. 8. Přidat 1,5 objemu pufru AP3/E (přidán ethanol 96-100% do koncentrátu) a ihned promíchat. 9. Přenést 650 µl směsi do DNeasy Mini spin kolonky v 2 ml sběrné zkumavce. Centrifuga 75s při 6.000 x g (8.000 rpm). Proteklou část vylít, znovu použít sběrnou zkumavku. 10. Opakovat tento krok se zbytkem vzorku. Vyhodit proteklou část a sběrnou zkumavku. 11. Umístit kolonku do čisté 2 ml sběrné zkumavky (přiložená). Přidat 500 µl pufru AW (přidán 96-100% ethanol), centrifuga 1 min při 6.000 x g. Odstranit proteklou část a znovu použít sběrnou zkumavku v následujícím kroku. 12. Přidat dalších 500 µl pufru AW. Centrifuga 2 min při 20.000 x g k vysušení membrány. Pozn.: Odstraňte opatrně kolonku ze sběrné zkumavky tak, aby nepřišla do kontaktu s proteklou částí. Po promytí pufrem AW je membrána u DNeasy Mini kolonky většinou slabě zbarvená (tmavé zbarvení signalizuje příliš velké množství rostlinného vzorku) 13. Přenést kolonku do čisté 1,5 ml nebo 2 ml zkumavky, přidat 40 -100 µl AE přímo na membránu. Inkubovat 5 min při pokojové teplotě. 14. Centrifuga 75 s při 6.000 x g. Opakovat tento krok. Pokud požadujete vyšší koncentraci DNA, je třeba zredukovat množství promývacího roztoku na 50 µl. (Nepromývat membránu 2x v jedné dávce AE!) Dodatek: Pufry AP3/E a AW jsou dodány jako koncentráty. Přidejte ethanol (96-100 %) podle pokynů k získání pracovního roztoku. (Nepoužívejte denaturovaný líh!!!) EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
4
Izolace DNA z rostlin kitem Nucleospin Nahřát blok na 65 ºC Dusík do termosky Pufry před použitím ručně promíchat Vysterilizované misky, tloučky, špachtle vyndat z mrazáku těsně před použitím 1,5 ml eppendorfky s kulatým dnem, špičky s filtrem Rnázu dát na led Led 1. Do mističky dát cca 0,1 g rostlinného materiálu, zalít dusíkem a pomocí tloučku rozhomogenizovat na prach. 2. Pracovat na ledu. Přidat 400 µl PL1 pufru do 1,5 ml eppendorfky. 3. Přidat špachtlí vzorek, v rukavicích! Měnit rukavice. 4. Vortex, když je to moc husté, přidat ještě pufr PL1 5. Přidat 10 µl Rázy ( tu předtím stočit) 6. Vortex 7. Dát na 10 minut na termoblok na 65 ºC, po inkubaci termoblok nastavit na 70 ºC 8. Připravit fialové kolonky a 2 ml epp z kitu, dát do sebe, popsat 9. Vzorek přelít do fialové kolonky 10. Centrifuga 11000 ot./5 min 11. Do 1,5 ml epp nepipetovat 450 µl PC 12. Po centrifugaci odpipetovat čirou tekutinu bez peletu do připravené epp PC pufrem (pokud se vzorek nepřefiltroval, zopakovat centrifugaci) 13. Vortex, trochu stočit 14. Přepipetovat do zelených kolonek (opět s 2 ml nucleospin epp) 15. Centrifuga 11000 ot./75s 16. Tekutinu odlít do kádinky, pracovat již jen s filtrem, vždy otřít po vylévání epp do buny 17. Přidat 400 µl PW1 18. 11000 ot./75s 19. Vylít tekutinu 20. Přidat 700 µl PW2 21. 11000 ot./75s 22. Vylít tekutinu 23. Přidat 200 µl PW2 24. 11000ot./2 min 25. Vylít tekutinu, vyhodit epp, filtr se nesmí namočit 26. Přendat zelenou kolonku do 1,5 ml epp 27. Namíchat si do jedné 1,5 ml epp na 1 vzorek 40 µl PE (dát raději více, něco se odpaří), dát ohřát do termobloku na 70 ºC 28. Pipetovat 40 µl PE přímo na kolonku 29. Inkubace hned na 70 ºC/5 min 30. 11000 ot./75 s 31. Přepipetovat ze spodní epp 40 µl zpět na kolonku EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
5
32. 11000 ot./75 s 33. Vyhodit kolonku, popsat epp 34. Dále PCR
Izolace DNA z rostlin – chloroform/fenol 1. Připravit si Grinding pufr (1-2 dny je možné jej uchovávat v ledničce) 2. 2-3 g čerstvé tkáně rostlin (žilky listů) rozmělnit na prášek v předchlazené třecí misce s tekutým dusíkem a hned přidáme 14 ml Grinding pufru. 3. Propasírovat přes silon trychtýřem do 50-ti ml centrifugačních zkumavek. Tuhé zbytky spláchnout opět 7 ml Grinding pufru a opět propasírovat. Zkumavky stavět do ledové tříště. 4. Předchladit centrifugu na 4 ºC, rotor číslo 158, centrifugace filtrátu 13.000 ot./20 min nebo 20.000 RCF/20 min. 5. Vylít supernatant, nechat pelet. Přidat 4 ml extrakčního pufru a 80 µl proteinázy K (koncentrace 5 mg/ml) nebo 40 µl proteinázy K (koncentrace 10mg/ml). Opatrně pelet nesuspendovat (míchat pod hladinou, nečeřit). 6. Přidat440 µl 10% Sarkosylu a promíchat. 7. Inkubace 1-2 hod. ve vodní lázni při 55 ºC – zkumavky mít zakryté alobalem ve stojánku, hladina tekutiny ve zkumavce musí být pod vodou, používat destičku na dolévání. Po vyndání z lázně nechat zkumavky ochladnout (před vkládáním do centrifugy). 8. Centrifugace 8.000 ot./15 min, 4 ºC, rotor č 158. Supernatant slít do malých 10-ti ml zkumavek. 9. Přidat 0,6 objemu izopropanolu C3H8O asi 2,5 ml, se supernatantem opatrně promíchat pasterkou, zakrýt alobalem. Na 30 min dát do mrazáku (-20 ºC) nebo přes noc do ledničky. 10. Centrifugace ot/15 min nebo 7.500 RCF při 4ºC, rotor číslo 111. (Zkumavky dávat do rotoru číslem ven, pak při vylévání obsahu číslem nahoru). Opatrně vylít supernatant, pelet je rosolovitý.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
6
11. K peletu přidat 3 ml 1xTE pufru a 75 µl 20% SDS a 30 µl proteinázy K (vyndat z mrazáku) – dát do středu hladiny a opatrně promíchat. Inkubovat 1 hodinu při 37 ºC (vodní lázeň, používat destil. vodu) 12. Přidat 525 µl 5M NaCl 13. Přidat 420 µl roztoku 10% CTAB/NaCl. Dobře promíchat a inkubovat ve vodní lázni 10 min při 65 ºC. Zkumavky přikrýt alobalem. Pak nechat zchladnout. 14. Přidat chloroform-izoamylalkohol 24:1 v adekvátním množství (asi 4 ml). Dobře promíchat a centrifugovat při 7.500 RCF/10 min. Případně krok opakovat, až je vidět mezifrakce (3 oddělené vrstvy). 15. Čistý supernatant (horní fáze) přenést do nové kyvety a přidat 2 ml fenolu (balónovou pipetou, spodní fáze) a 2 ml chloroformu. Opatrně promíchat pasterkou. Centrifugovat 8.000 ot. nebo 7.500 RCF / 10 min. 16. Přednést supernatant (horní fáze) do nové Yvety a přidat 2,5 ml izopropanolu C3H8O (z mrazáku) pro precipitaci nukleové kyseliny, 15x převracet. Inkubovat 2 hod při -20 ºC (v mrazáku) nebo přes noc v ledničce. 17. Centrifugovat při 11.000 ot. nebo 10.300 RCF / 20 min při teplotě 4 ºC. Měl by sednout pelet (skoro neviditelný). Supernatant opatrně vylít, aby se neutrhl pelet. 18. Pelet omýt 1 ml 70% ethanolu (uložen v mrazáku). Ihned přelít i s peletem do 1,5 ml eppendorfky, centrifugovat při 11.000 ot. nebo 10.300 RCF / 15 min, při 4 ºC. Vylít ethanol a nechat sušit při pokojové teplotě 20 ºC asi 15 – 30 min. 19. Vysušený pelet (nesmí být cítit ethanolem) nesuspendovat v 50 µl 1xTE pufru (u rybízu 25 µl). Pufrem opláchnout tu stranu eppendorfky, kde je pelet. Procvrnkat, stočit, popsat a uložit do lednice. 20. Namíchat roztoky DNA na změření absorbance: do sterilních eppendorfek dát 99 µl sterilní vody + 1 µl izolované DNA, procvrnkat, stočit. 21. Měření absorbance na spektrometru při 260 nm. 22. Výpočet koncentrace DNA c = 2/A260 x5 , např.: 2/(0,666 x 5) = 0,6 23. Podle vypočtené koncentrace namíchat ředěné roztoky DNA do zelených epp, celkový objem roztoku je 100 µl ( např.: c = 0,6 tedy 0,6 µl izolované DNA + 99,4 µl sterilní vody, procvrnkat, stočit. 24. Dále PCR
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
7
PCR direct 1. Vzorky s DNA dát na led. 2. Připravit si Master Mix, primery a sterilní vodu, nechat rozmrznout, potom dát na led! 3. Příprava PCR mixu (uvedeno množství na jednu reakci) - 12,5 µl Master Mixu (např:. Fermenstas, Top Bio) - 10,5 µl sterilní vody - 0,5 µl primeru 1 - 0,5 µl primeru 2 - Vortex, stočit 4. Do PCR eppendorfky nepipetovat 24 µl tohoto mixu + 1 µl DNA, pak procvrnkat, stočit a dát do cycleru. Přidat slepý vzorek (24 µl mixu + 1 µl sterilní vody) pro kontrolu. 5. Po skončení amplifikace vzorky nanést na agarózový gel. 6. Příprava gelu (velká vanička na 32 vzorků): - 0,53 g agarózy + 60 ml TBE 1x, rozvařit na čirý gel - Gel lehce zchladit, pak přidat 6 µl Gel Redu, promíchat, nalít do vaničky, dát hřeben. - Nechat tuhnout cca 20 min. - Pak opatrně vytáhnout hřeben a gel zcela ponořit do nádoby na elektroforézu, s pufrem TBE 1x. 7. Nanášení vzorků: - na parafilm připravit kapky barvy (BF modř, voda, glycerol) asi 2 µl. - ze vzorku odebrat 6 µl, propipetovat s kapičkou barvy a dát na gel. - Nakonec nanést Marker (2 µl + 2 µl barvy). 8. Pustit elektroforézu na 110 V a cca 32 min. 9. Gel vyfotit ve fotokomoře. Vyhodnocení.
PCR nested 1. PCR produkt naředit 1:29, tedy 1 µl PCR produktu + 29 µl sterilní vody do 1,5 ml eppendorfek, procvrnkat, stočit. 2. Příprava PCR mixu (uvedeno množství na jednu reakci) - 12,5 µl Master Mixu (např:. Fermenstas, Top Bio) - 10,5 µl sterilní vody - 0,5 µl primeru 1 - 0,5 µl primeru 2 - Vortex, stočit 3. Do PCR eppendorfky nepipetovat 24 µl tohoto mixu + 1 µl DNA, pak procvrnkat, stočit a dát do cycleru. Přidat slepý vzorek (24 µl mixu + 1 µl sterilní vody) pro kontrolu. 4. Po skončení amplifikace vzorky nanést na agarózový gel. 5. Pustit elektroforézu na 110 V a cca 32 min. 6. Gel vyfotit ve fotokomoře. Vyhodnocení. EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
8
RFLP 1. Enzymy, pufr a BSA se uchovávají v mrazáku. BSA a pufr se nechají volně rozmrazit, enzym musí být stále na ledu. 2. Připravit si eppendorfky 1,5 ml pro namíchání reakce. 3. Dle rozpisu (uvedeno u každého enzymu) namíchat jednotlivé komponenty do 1,5 ml epp, množství PCR produktu se určí dle síly proužku na PCR gelu (2 až 9 µl). Celkový objem roztoku je 15 µl (doplněno sterilní vodou). (např.: štěpení MseI: Pufr 3 µl BSA 2 µl Voda 7,5 µl PCR produkt 2 µl enzym (MseI) 0,5 µl 4. 5. 6. 7.
Promíchat, lehce stočit. Epp obalit parafilmem, aby se neotevřela. Vzorky dát inkubovat to termostatu nebo vodní lázně, teplota 37 ºC min. 16 hodin Vypracovat protokol Po inkubaci vzorky stočit a dát do ledničky, po zchlazení jsou vzorky připraveny k nanášení na akrylamidový gel.
8. Skla, hřeben, spacery důkladně umýt saponátem, lihem, destilovanou vodou a osušit 9. Sestavit aparaturu pro nalévání gelu. 10. Příprava gelu : 6 ml sterilní vody 837,5 µl TBE 10x 1,75 ml akrylamidu 129,1 µl roztoku APS (0,1 g APS/1ml H2O) 4 µl TMD Vše promíchat pipetou a ihned nalít mezi skla, vložit hřeben, nikde nesmí být bubliny, Nechat tuhnout cca 15 min. 11. Po vyjmutí hřebenu skla přisvorkovat do nádoby na elektroforézu (pufr TBE 1x), dírky po hřebenu důkladně vypláchnout pomocí pasterky pufrem TBE 1x 12. Nanášení vzorku (4 µl barvy Blue/Oranže 6x Loading Dye + celý vzorek), nakonec nanést Marker 13. Pustit elektroforézu na 120 V, cca 90 min 14. Vyjmout skla, sundat gel a vložit ho na 15 min do barvící lázně (50 ml H 2O + 15 µl Gel Red), barvit v chladu a temnu 15. Po obarvení gel přendat do misky s vodou a pak vyfotit ve fotokomoře.
EKOTECH - Metody detekce rostlinných patogenů
9
