CLP – ANALYSIS OF MOLECULAR MARKERS DNA ISOLATION, RAPD, AFLP, PCR-RFLP – CZECH VERSION
IZOLACE ROSTLINNÉ DNA ***
I. Mikroextrakce celkové DNA I. 1. CTAB metoda podle Williams a kol. (1992) Vzorky rostlinné genomické DNA se extrahují z děložních lístků nebo mladých pravých listů. 1 g tkáně se homogenizuje v tekutém dusíku v třecí misce na jemný prášek a smísí se s 1 ml CTAB extrakčního pufru a 0,4 ml chloroformu. Je možné provádět homogenizaci čerstvé rostlinné tkáně přímo v CTAB extrakčním pufru v mikrocentrifugační zkumavce (eppendorfce). Hrubý homogenát se zahřeje na 55°C na dobu 10 minut a poté se na stolní mikrocentrifuze oddělí hrubé části vzorku. Centrifugace probíhá 15 min. při 14000g. Supernatant se přenese do čisté mikrozkumavky a přidá se 1,2 objemu isopropanolu (vychlazeného na teplotu -20°C). Precipitát nukleových kyselin se oddělí centrifugací (30 min při 14000g) a omyje 1 ml 70% čistého etanolu. Po osušení se pelet DNA rozpustí ve 100 µl pufru - 10 mM Tris-HCl, pH=7,5 a 0,1 mM EDTA. I. 2. Extrakce Kirby roztokem podle Coveye a Hulla (1981) K analýze se používá 0,5 g tkáně (3 listové terčíky), která se rozruší homogenizací v tekutém dusíku v třecí misce na jemný prášek. Opět je možné provádět homogenizaci čerstvé tkáně bez použití kapalného dusíku - listové terčíky se rozdrtí v mikrocentrifugační zkumavce a k hrubému homogenátu se přidá Kirby roztok. Po homogenizaci následuje vlastní extrakce DNA. Homogenizovaná tkáň se přenese do mikrozkumavky (2 ml) a přidá se Kirby roztok [1% tri-izopropyl naftalen sulfat - sodná sůl (detergent), 6% 4-amino-2hydroxybenzoová kyselina - sodná sůl (chelatující činidlo - PAS), 50 mM Tris-HCl pH=8,3, 6% fenol (nasycen 200mM Tris-HCl, pH=7,0), 10mM EDTA a 0,1% 8hydroxyquinolin] - v poměru 1 ml Kirby roztoku na 1 g rostlinné tkáně (0.5 ml na 3 terčíky). Vortexování 30 s, centrifugace 5 min/14000g. Suspenze se dvakrát extrahuje roztokem fenol-chloroform (1:1 k natantu) za účelem purifikace - odstranění proteinů, fáze se separují centrifugací (5 min/14000 g). Nukleové kyseliny se vysráží a peletují v 1/10 objemu supernatantu (30 µl na 300 µl natantu) 3 M roztoku octanu sodného a 80% vychlazeného etanolu (900 µl) minimálně 20 min. Po osušení se DNA pelet rozpustí ve 100 µl sterilované vody.
1
I. 3. SDS extrakce podle Edwardse a kol. (1991) a podle Millera a McDonalda (1994) Edwards: 0,5 g listové tkáně se homogenizuje ve 100 µl extrakčního pufru (200 mM TrisHCl, pH=7,5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5 % SDS) v mikrocentrifugační zkumavce. K homogenátu se přidá 300 µl extrakčního pufru a homogenát se 5 s vortexuje. Tato extrakční směs může být ponechána při laboratorní teplotě i déle než 1 hodinu, dokud nejsou všechny vzorky homogenizovány. Extrakt je centrifugován 1 min/13 000 rpm a 300 µl supernatantu je přeneseno do čisté eppendorfky. K supernatantu byla přidána směs chloroform : isoamylalkohol (24 : 1) v poměru 1 : 1 k supernatantu a tento krok byl zopakován. K supernatantu je přidáno 300 µl isopropanolu vychlazeného na -20°C a směs se ponechá 2 min. precipitovat. Následuje centrifugace 5 min./13000 rpm a ve vakuu osušený pelet se rozpustí ve 100 µl TE pufru (10 mM Tris-HCl, pH=7,5, 0,1 mM EDTA). DNA je stabilní ve 4°C déle než 1 rok. Pro 50 µl PCR reakci se doporučuje 2,5 µl vzorku, pro starší tkáň se množství templátu zvyšuje až na 25 µl. Miller a McDonald: Tato metoda je vhodná pro mikroextrakci DNA ze semen (u brukvovitých rostlin s vyšším obsah oleje v semeni je nutné před homogenizací odstranit - šetrným lisováním za studena). 5 - 10 semen (podle velikosti) je rozdrceno mezi filtračními papíry a 20 mg rozdrceného semene je přeneseno do mikrocentrifugační zkumavky. Rozdrcená tkáň se homogenizuje po přidání 100 µl extrakčního pufru (200 mM Tris-HCl, pH=7,5, 288 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5 % SDS). Následuje další macerace - přidání 900 µl extrakčního pufru a promíchávání špičkou. Směs je 30 s vortexována a 2 min při 10144 g centrifugována. DNA se precipituje po přidání 900 µl vychlazeného ethanolu k supernatantu po dobu 2 min. DNA je poté peletována centrifugací po dobu 7 min./10144 g a pelet je osušen ve vakuu - 15 min. a rozpuštěn ve 100 µl TE pufru (10 mM Tris-HCl, pH=7,5, 1 mM EDTA). II. Extrakce celkové DNA II.1. Extrakce DNA pomocí DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) Metoda je založena na principu purifikace DNA pomocí specielních mikrokolon – na první koloně dochází k zachycení proteinů, polysacharidů, detergentu a dalších nečistot, na druhé koloně dochází z zachycení DNA a jejímu následnému vymytí elučním roztokem.
2
3
4
5
Rostlinnou tkáň můžeme rozdrtit v tekutém dusíku. Pokud nepoužíváme tekutý dusík, rozdrtíme rostlinnou tkáň homogenizátorkem přímo v eppendorfce. Maximální množství rostlinné tkáně, které můžeme použít je 100 mg, Přidáme 400 μl pufru AP1* a 4 μl RNázy A (20 mg/ml). Důkladně protřepeme (vortex). Pozn.: Nesmí zůstat žádné hrudky! Směs inkubujeme 10 min při 65°C, během inkubace eppendorfku 2-3x převrátíme. Přidáme 130 μl pufru AP2, promícháme a inkubujeme 5 min. na ledu. Pozn.: Někdy může dojít k vytvoření velmi viskózního lyzátu, kdy mohou vzniklé sraženiny zapříčinit „stříhání“ DNA. V takovémto případě je vhodné většinu sraženin odstranit centrifugací 5 min při maximálních otáčkách. Supernatant dát do QIAshredder kolonek a pokračovat krokem 5. Lyzát aplikujeme do QIAshredder kolonek a centrifugujeme 2 min. při 8000 rpm. Pozn.: Při aplikaci lyzátu do kolonek je nutné odstřihnout špičku pipety!!!. Přes filtr projde do sběrné nádobky i malá část mrtvých buněčných tkání a sraženin, kde vytvoří pelet. Opatrně, neporušit pelet v kroku 6! Přeneseme přefiltrovanou frakci do eppendorfek. Pozn.: Většinou získáme 450 μl lyzátu. Je-li ho méně, přepočteme množství činidel přidávaných v kroku 7. Přidáme 0,5 dílu pufru AP3* a 1 díl etanolu (96-100%) k vyčištění lyzátu a promícháme pomocí pipety. Př.: 450 μl lyzátu + 225 μl pufru AP3 + 450 μl etanolu. Aplikujeme 650 μl směsi z kroku 7 (včetně sraženin) do DNeasy kolonek, centrifugujeme 1 min. při ≥ 8000 rpm a odstraníme přefiltrovanou frakci. Opakujeme krok 8 se zbývajícím vzorkem, odstraníme přefiltrovanou frakci i centrifugační zkumavky. DNeasy kolonky umístíme do nových centrifugačních zkumavek, přidáme 500 μl pufru AW do DNeasy kolonky, centrifugujeme 1 min. při ≥ 8000 rpm a odstraníme přefiltrovanou frakci. Přidáme 500 μl pufru AW do DNeasy kolonky, centrifugujeme 2 min. při maximálních otáčkách až do vysušení membrány v kolonce, odstraníme přefiltrovanou frakci i centrifugační zkumavky. Pozn.: DNeasy kolonky vyndáme opatrně z centrifugačních zkumavek, aby nedošlo ke kontaminaci vzorku etanolem obsaženým ve filtrátu. Přeneseme DNeasy kolonky do 1,5 ml (2 ml) eppendorfek a přidáme 100 μl pufru AE* (zahřátého na 65°C) přímo na membrány kolonek a centrifugujeme 1 min. při ≥ 8000 rpm. Pozn.: Při velkém množství DNA (> 20 μg) přidáme 200 μl, při malém zakoncentrujeme, tj. přidáme jen 50 μl. Opakujeme znovu krok 12. Pozn.: Aby se předešlo zředění eluátu lze použít nové eppendorfky!!! Do 1,5 ml eppendorfek nesmí být eluováno více než 200 μl, aby nedošlo ke kontaktu DNeasy kolonek s eluátem. Pufry předehřejeme na 65oC.
6
II.2. Izolace DNA z rostlinných tkání s použitím Invisorb Spin Plant Mini Kit (INVITEK) V eppendorfce zhomogenizujeme cca 60 mg rostlinné tkáně. Homogenát přeneseme do 1,5ml reaction tube a přidáme 400μl Lysis Buffer P a 20μl proteinázy K. Vortexujeme a necháme 30 min. inkubovat při 65°C. Během inkubace 2 – 3krát promícháme. Připravíme si Spin Filter do 2,0ml Receiver Tube. Vzorky přeneseme na Spin Filter. Centrifgujeme 10min při 12000 rpm. Pokud je to nutné přidáme 40μl Rnázy A (10mg/ml), vortexujeme a necháme 5 min. inkubovat při pokojové teplotě. Přidáme 200μl Binding Buffer P a vortexujeme. Umístíme nové Spin Filter do 2,0ml Receiver Tube, přeneseme vzorky a 1 min. inkubujeme. Centrifugujeme 1 min. při 12000 rpm. Odstraníme filtrát a Spin Filter umístíme zpět do 2,0ml Receiver Tube. Přidáme 550μl Wash Buffer I a centrifugujeme 1 min. při 12000 rpm. Odstraníme filtrát a Spin Filter umístíme zpět do 2,0ml Receiver Tube. Přidáme 550μl Wash Buffer II a centrifugujeme 1 min. při 12000 rpm. Odstraníme filtrát a Spin Filter umístíme zpět do 2,0ml Receiver Tube. Krok opakujeme. Nakonec centrifugujeme 2 min. při 12000 rpm kvůli odstranění ethanolu. Spin Filter umístíme do nových 1,5ml Receiver Tube a přidáme 50 – 100μl předehřátého na 65°C Elution Buffer D. Inkubujeme 3 min při pokojové teplotě. Centrifugujeme 1 min. při 10000 rpm. Pokud chceme vytvořit 1. a 2. eluát přidáme 50μl předehřátého na 65°C C. Inkubujeme 3 min při pokojové teplotě. Centrifugujeme 1 min. A postup opakujeme znovu s dalšími 50μl Elution Buffer D, ale do nové 1,5ml Receiver Tube. Vznikne nám tak 50μl 1. a 2. eluátu. Elution Buffer D předehřejeme na 65°C
7
II.3. Metoda extrakce DNA s CTAB Tato metoda slouží k extrakci velkého objemu DNA pro účely standardizace RAPD analýzy. Metoda popsaná Amassino, modifikace Č. Budějovice je založena na schopnosti CTAB (cetyltrimetylamoniumbromid) vytvářet komplex s nukleovými kyselinami,který je při vysoké koncentraci solí rozpustný (0,7M NaCl), ale při snížené koncentraci solí (0,45M NaCl) vytváří sraženinu (Murray a Thompson 1980). CTAB zároveň působí jako detergenční činidlo, které uvolňuje DNA z membrán a proteinů. Na základě rozdílné rozpustnosti CTAB v porovnání s DNA je lze oddělit a získat dostatečně čistou rostlinnou DNA. 5 g listů se zmrazí a homogenizuje v tekutém dusíku v třecí misce na jemný prášek. Prášek se přenese do 50 ml centrifugační zkumavky a přidá se 2x extrakční pufr v poměru 1 ml na 1 g tkáně a 1 g PVPP (2% CTAB pufr: 100 mM TrisHCl, pH=8,0, 50 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 2% 2-mercaptoetanol), pufr je předehřátý na teplotu 56°C, 20 µl mercaptoetanolu je přidáno na 1 ml pufru přímo do centrifugační zkumavky. Směs se jemně smísí a inkubuje se ve vodní lázni 30-60 minut při 56°C. Po inkubaci se směs vyjme z termostatu a při laboratorní teplotě se nechá stát dalších 30 minut. Následuje deproteinizace přidáním 1/3 objemu chloroform/isoamylalkoholu (24:1). Po jemném promísení se homogenát centrifuguje (10’/2700rpm/20°C). Horní fáze se odebere a přenese se do čisté zkumavky a přidá se extrakční pufr (1/10 objemu 10% CTAB - 0,7 M NaCl a 1/3 objemu chloroform/isoamylalkohol). Po centrifugaci (10'/2700rpm/20°C) se tento krok opakuje. Pečlivě se odebere horní fáze a přidá se 1x precipitační pufr (1% CTAB, 50 mM TrisHCl, pH=8,0, 10 mM EDTA, 1% 2-mercaptoetanol), jemně se promísí a nechá se proběhnout precipitace 1-2 hodiny při pokojové teplotě. Vysrážená DNA se peletuje centrifugací 20'/2700/20°C. Po odstranění supernatantu se k peletu přidá 10 ml maceračního roztoku (160ml etanolu, 2 ml 1M TrisHCl, pH 8,0, 0,4 ml 5M LiCl) a sterilní destilovaná voda do konečného objemu 200 ml a nechá se působit při pokojové teplotě působit 1-2 hodiny. Po centrifugaci 10'/2700rpm/20°C, promytí v 70% etanolu a vysušení se pelet rozpustí v 200 500 µl destilované vody a uloží se do mrazáku při -20°C. Podrobná metodika - izolace rostlinné DNA pomocí CTAB podle Williams et al. 1992 Chemikálie: 2x CTAB (cetylamonium bromid) β-merkaptoethanol fenol-chloroform-IAA (25 : 24 : 1) chloroform-IAA (isoamylalkohol) (24 : 1) 1x TE pufr sterilní octan amonný
8
isopropanol 100 % ethanol 70 % ethanol Rnáza-A Protokol: Připravíme si roztok 2x CTAB a 1% merkaptoethanolu, na jeden vzorek počítáme 500 μl roztoku. Připravený roztok dáme předehřát na 65 °C. Do sterilních 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek (eppendorfek) dáme rostlinnou tkáň (cca 100 mg), ze které chceme izolovat DNA. Pro lepší drcení tkáně přidáme sterilní křemičitý písek. Ke každému vzorku přidáme 500 μl předehřátého pufru, tkáň rozdrtíme a promícháme s pufrem. Necháme 45 minut inkubovat při 65 °C. Během inkubace každých cca 15 minut lehce promícháme. Přidáme 500 μl směsi fenol-chloroformu-IAA, 10 minut protřepáváme. Centrifugujeme 5 minut maximální rychlostí při pokojové teplotě. Do nových eppendorfek odpipetujeme vodní fázi. Přidáme 500 μl směsi chloroformu-IAA, 10 minut protřepáváme. Centrifugujeme 5 minut maximální rychlostí při pokojové teplotě. Do nových eppendorfek přepipetujeme vodní fázi. Přidáme 2/3 objemu isopropanolu (přibližně 250 μl). 2–3x lehce promícháme. Dáme na 30 minut do mrazáku (-20 °C), čas nepřesahujeme ! Centrifugujeme 5 minut při 4 °C maximální rychlostí. DNA by se měla zachytit na dně eppendorfky. Odstraníme supernatant. Pelet usušíme. Přidáme 300 μl 1x TE a necháme 30–60 minut inkubovat při 37 °C. Přidáme 20 μl 7,5 M octanu sodného a 600 μl ledového (z mrazáku) 100 % ethanolu. 2–3x lehce promícháme. Vzorky dáme do mrazáku (-20 °C) minimálně na 20 minut, maximálně na 12 hodin (větší výtěžnost DNA). Vzorky vyndáme z mrazáku a 10 minut centrifugujeme maximální rychlostí při 4 °C. DNA by měla vytvořit viditelný pelet na dně eppendorfky. Odstraníme supernatant (pipetujeme 2x). Necháme dobře usušit. Přidáme 400 μl ledového 70 % ethanolu. 2 – 3x lehce promícháme. Centrifugujeme 2 minuty maximální rychlostí při teplotě 4 °C. Okamžitě odstraníme všechen supernatant . Vzorky necháme dobře usušit (cca 10 min). Podle množství peletu (DNA) přidáme 20–200 μl 1x TE pufru nebo sterilní vody. Pro dokonalé přečištění můžeme zopakovat postup od bodu 5. Přidáme 1 μl Rnázy-A a necháme 30 minut inkubovat ve 37 °C.
9
Modifikované metody izolace DNA z rostlinné tkáNĚ založené na CTAB metodě II.4. Izolace rostlinné DNA pomocí CTAB a současného přidání PVPP (polyvinylpolypyrrolidon) podle Kirschner (ústní sdělení) Protokol: Připravíme si roztok 2x CTAB a 1% merkaptoethanolu, na jeden vzorek počítáme 500 μl roztoku. Připravený roztok dáme předehřát na 65 °C. Do sterilních 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek (eppendorfek) dáme rostlinnou tkáň (cca 100 mg), ze které chceme izolovat DNA. Pro lepší drcení tkáně přidáme sterilní křemičitý písek. Ke každému vzorku přidáme 500 μl předehřátého pufru a cca 50 mg PVPP (polyvinylpolypyrrolidon), tkáň rozdrtíme a promícháme s pufrem. Dále pokračujeme podle bodu 4 viz. CTAB izolace. II.5. Izolace rostlinné DNA pomocí 10 % TAB pufru podle Smithson (nepublikovaný rukopis) Protokol: Připravíme si roztok 2x CTAB a 1% merkaptoethanolu, na jeden vzorek počítáme 500 μl roztoku. Připravený roztok dáme předehřát na 65 °C. Do sterilních 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek (eppendorfek) dáme rostlinnou tkáň (cca 100 mg), ze které chceme izolovat DNA. Pro lepší drcení tkáně přidáme sterilní křemičitý písek. Ke každému vzorku přidáme 500 μl předehřátého pufru, tkáň rozdrtíme a promícháme s pufrem. Necháme 45 minut inkubovat při 65 °C. Během inkubace každých cca 15 minut lehce promícháme. Přidáme 500 μl směsi fenol-chloroformu-IAA, 10 minut protřepáváme. Centrifugujeme 5 minut maximální rychlostí při pokojové teplotě. Do nových eppendorfek odpipetujeme vodní fázi. Přidáme 400 – 500 μl 10 % CTAB (zahřátého na 65 °C) a promícháme. Dále pokračujeme podle bodu 5 viz. CTAB izolace.
10
II.6. Extrakce DNA Kirby roztokem Metoda obdobná postupu I.2. - extrakce probíhá z většího množství rostlinné tkáně, v tomto případě je nutné používat homogenizaci v kapalném dusíku. Extrakce rostlinné DNA Kirbyho roztokem (podle Coveye a Hulla 1981) Kirbyho roztok:
1 % Tri-izopropyl naftalen sulfát (sodná sůl) 6 % 4-amino-2-hydroxybenzoová kyselina 50 mM Tris-HCl (pH = 8,3) 6 % fenol (nasycen 200 mM Tris-HCl, pH = 7) 10 mM EDTA doplníme destilovanou vodou do 100 ml další chemikálie viz. CTAB izolace
Protokol: Rostlinnou tkáň dáme do eppendorfky, přidáme sterilní křemičitý písek a 500 μl extrakčního pufru (Kirbyho roztoku). Tkáň rozrušíme a 30 s vortexujeme. Centrifugujeme 5 minut maximální rychlostí při pokojové teplotě. Můžeme odpipetovat vodní fázi bez zbytků tkáně a přepipetovat ji do nových eppendorfek. Dále postupujeme podle protokolu viz. CTAB izolace od bodu 5.
11
II.7. SDS extrakce podle EDWARDSE et al. 1991 Chemikálie: 200 mM Tris-HCl (pH = 7,5) 250 mM NaCl 25 mM EDTA 0,5 % SDS chloroform-IAA (24 : 1) isopropanol TE pufr (10 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 0,1 mM EDTA) Protokol: 0,5 g listové tkáně homogenizujeme ve 100 µl extrakčního pufru v mikrocentrifugační zkumavce (eppendorfce). K homogenátu přidáme 300 µl extrakčního pufru a 5 s vortexujeme. Tato extrakční směs může být ponechána při laboratorní teplotě i déle než 1 hodinu, dokud nejsou všechny vzorky homogenizovány. Extrakt centrifugujeme 1 min. při 13 000 rpm a 300 µl supernatantu přeneseme do čisté eppendorfky. K supernatantu přidáme 300 µl isopropanolu vychlazeného na -20°C a směs necháme 2 min. precipitovat. Centrifugujeme 5 min. při 13000 rpm. Ve vakuu osušený pelet rozpustíme ve 100 µl TE pufru. DNA je stabilní ve 4°C déle než 1 rok. Pro 50 µl PCR reakci se doporučuje 2,5 µl vzorku, pro starší tkáň se množství templátu zvyšuje až na 25 µl.
12
II.8. Izolace rostlinné DNA podle Jobese, Hurleye a Thiena 1995 Chemikálie: 100 mM octan sodný (pH = 4,8) 100 mM EDTA (pH = 8,0) 500 mM NaCl mM DTT 2 % (w/v) PVP (polyvinyl-pyrrolidon) pH upravit na 5,5 bezprostředně před použitím přidat proteinázu K (100 μg/ml) 5 M octan draselný (pH = 4,8) TE pufr 20 % (w/v) SDS 1 M DTT 5 M NaCl 100 % isopropanol 70 % ethanol 95 % ethanol fenol-chloroform-IAA (25 : 24 : 1) chlororofm-IAA (24 : 1) sterilní voda Protokol: Připravíme si roztok extrakčního pufru, ke kterému přidáme proteinázu K (10 mg/ml). Na jeden vzorek počítáme 0,1 g rostlinné tkáně, 1 ml extrakčního pufru a 50 μl proteinázy K. Připravený roztok dáme předehřát na 55 °C. Do sterilních eppendorfek dáme rostlinnou tkáň (cca 0,1 g), ze které chceme izolovat DNA a homogenizujeme ji homogenizátorkem. Přidáme 1 ml extrakčního pufru smíchaného s protinázou K a znovu promícháme homogenizátorkem. Vortexujeme asi 15 s. Vzorky dáme inkubovat do 55 °C na 60 minut. Přidáme 80 μl 20 % SDS, promícháme, znovu vortexujeme a necháme 1–2 hodiny inkubovat při 55 °C. Centrifugujeme 10 minut při 14 000 rpm, při 4 °C. Supernatant přepipetujeme do nové eppendorfky a přidáme 1/3 objemu (cca 300 μl) acetátu draselného (pH = 4,8). Lehce promícháme (nevortexujeme) a dáme na 30 minut do –20°C. Centrifugujeme 10 minut při 14 000 rpm, při 4 °C. Supernatant přepipetujeme do nové ependorfky a přidáme 0,6 objemu (cca 600 μl) isopropanolu. Lehce promícháme a dáme na 30 minut do –20°C. Centrifugujeme 10 minut při 14 000 rpm, při 4 °C. Odstraníme supernatant a pelet rozpustíme ve 200 μl sterilní vody. Pokud se pelet špatně rozpouští, dáme vzorky inkubovat do 37 °C cca 30 minut.
13
Přidáme 0,5 objemu (cca 100 μl) 5M NaCl a dobře promícháme. Potom přidáme 2,0 objemu (cca 400 μl) ledového (z mrazáku) 95 % ethanolu a necháme 30 minut inkubovat při –20°C. Centrifugujeme 10 minut při 14 000 rpm, při 4 °C. Odstraníme supernatant a pelet rozpustíme v 500 μl sterilní vody. Pokud se pelet špatně rozpouští, dáme vzorky inkubovat do 37 °C cca 30 minut. Přidáme 500 μl směsi fenol-chloroformu-IAA a 10 minut protřepáváme. Centrifugujeme 5 minut při 14 000 rpm, při pokojové teplotě. Přepipetujeme vodní fázi do nové eppendorfky (cca 500 μl) a přidáme 500 μl směsi chloroform-IAA a 10 minut protřepáváme. Centrifugujeme 5 minut při 14 000 rpm, při pokojové teplotě. Přepipetujeme vodní fázi do nové eppendorfky a přidáme 0,6 objemu (cca 250 μl) isopropanolu. Vzorky necháme inkubovat 30 minut při –20 °C. Centrifugujeme 10 minut při 14 000 rpm, při 4 °C. Odstraníme supernatant a pelet omyjeme cca 300 μl 70 % ethanolu. Centrifugujeme 5 minut při 14 000 rpm, při 4 °C. Odstraníme ethanol a pelet osušíme. DNA rozpustíme v TE pufru nebo sterilní vodě.
14
II.9. Izolace rostlinné DNA metodou NaI podle Ishizawy et al. 1991 Chemikálie: 6 M NaI 13 mM EDTA 0,5 % sodium N-laurolyl sarkosine 26 mM Tris-HCl (pH = 8,0) 40 % isopropanol 100 % isopropanol 100 % ethanol octan sodný TE pufr Rnáza-A Protokol: Do sterilní eppendorfky dáme rostlinnou tkáň, ze které chceme izolovat DNA a přidáme 300 μl extrakčního pufru. Necháme inkubovat 15 minut při 60 °C. Centrifugujeme 5 minut při 10 000 rpm, při pokojové teplotě. 200 μl supernatantu smícháme s 200 μl 100 % isopropanolu a necháme 15 minut inkubovat při pokojové teplotě. Centrifugujeme 5 minut při 10 000 rpm, při pokojové teplotě. Odstraníme supernatant a pelet osušíme. Přidáme 1 ml 40 % isopropanolu. Centrifugujeme 5 minut při 14 000 rpm, při pokojové teplotě. Odstraníme isopropanol a pelet osušíme a rozpustíme ve 100 μl TE osahující RNázu- A (1 μg/μl), při 60 °C 30 minut. Přidáme 1/10 objemu (cca 10 μl) octanu sodného a 2/1 objemu (cca 200 μl) 100 % ethanolu a dáme na 20 minut (možno i přes noc) do –20 °C. Centrifugujeme 5 minut při 14 000 rpm, při 4 °C. Odstraníme supernatant, pelet usušíme a rozpustíme v TE nebo sterilní vodě.
15
II.10. Tissue from PCR podle NESVADBA 2001 Chemikálie:
0,25 N NaOH 0,25 N HCl 0,5 M Tris-HCl (pH = 8,0)
Protokol: Do sterilní eppendorfky dáme rostlinnou tkáň (cca 2 x 2 mm), ze které chceme izolovat DNA. Přidáme 40 μl 0,25 N NaOH. Ve vodní lázni povaříme 30 s. (Optimum muže být různé pro různé typy tkání, ale pro rostlinná pletiva je 30 s optimální.) Neutralizujeme přidáním 40 μl 0,25 N HCl a 20 μl 0,5 M Tris- HCl (pH = 8,0) Ještě 2 minuty povaříme. Pokud nepřipravujeme ihned PCR reakci, musíme před začátkem znovu 2 minuty povařit.
16
RAPD ANALÝZA U BRUKVOVITÝCH ROSTLIN ***
Odrůdy jsou v prvé řadě identifikovány na základě pěstitelských, morfologických a fyziologických popisů. V genetickém výzkumu se používají k identifikaci odrůd biochemické markerovací systémy založené na analýze isoenzymů a zásobních proteinů. V poslední době se objevuje stále více aplikací molekulárních markerů na úrovni DNA. V roce 1984 byla poprvé použita metoda PCR (Saiki et al., 1988), jejíž obrovský rozvoj vedl k vývoji několika metod. Jednou z těchto metod je RAPD (random amplified polymorphic DNA) analýza, vytvářející fylogeneticky konzervované produkty, specifické pro jedince, náhodně rozdělené v genomu templátové DNA (Williams et al., 1990). Mendelistická segregace, stabilita a dominantní dědičnost RAPD markerů byla pozorována u geneticky různých plodin, např. u sóji, ječmene a vojtěšky (Williams et al., 1990; Echt et al., 1992; Tinker et al., 1993). Úroveň genetického rozlišení RAPD markerů je ekvivalentní RFLP při určení genetických příbuzných vztahů mezi liniemi Brassica oleracea L. a B. napus L. (dos Santos et al., 1994; Hallden et al., 1994). RAPD markery byly úspěšně používány v genetickém fingerprintingu, při analýze odrůd různých druhů, mezi nimi Brassica (Demeke et al., 1992; Jain et al., 1994). Dále jsou využitelné při analýze původů (Scott et al., 1992; Lerceteau et al., 1997) a genetickém mapování (Reiter et al., 1992; Uzunova et al., 1995). RAPD protokol PCR reakce byla prováděna v objemu 25 µl obsahující 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50mM KCl, 2 mM MgCl2 , 1% Triton X-100, 100µM každého dATP, dCTP, dGTP a dTTP, 1 U Taq polymerázy (Promega nebo DNazymeII - Finnzymes), 10 pM primeru (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA) a 25 ng templátové DNA. Schéma pipetování: 2,5 µl 10x reakčního pufru 0,5 µl dNTPs 1-2 µl DNA 4 µl primeru 0,2 µl DNA polymerázy dH2O voda do objemu 25 µl
17
Amplifikace DNA probíhala v termocykleru PROGENE (Techne - Cambridge, Ltd.). Použitý termální cyklus: 93°C (5 min) pro počáteční separaci DNA řetězců 45 cyklů: 92°C (1 min) - denaturační teplota 35°C (2 min) - nasedací teplota 74°C (3 min) - elongační teplota konečná elongační teplota 74°C (10 min). TAKARA – používaná v současné době PCR reakce byla prováděna v objemu 25 µl obsahující 1x reakční pufr, 100µM každého dATP, dCTP, dGTP a dTTP, 1 U Taq polymerázy (TaKaRa), 10 pM primeru (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA) a 25 ng templátové DNA. Schéma pipetování: 2,5 µl 10x reakčního pufru 2,0 µl dNTPs 1-2 µl DNA 4 µl primeru 0,2 µl DNA polymerázy dH2O voda do objemu 25 µl Amplifikace DNA probíhala v termocykleru PTC-100 (MJ Research). Amplifikační produkty byly analyzovány elektroforézou na 1,5% agarózových gelech (v TBE pufru) a detekovány barvením ethidium bromidem. Doba trvání elektroforézy byla při napětí 70V 2,5 - 3 hodiny. Gely byly fotografovány pod UV světlem pomocí IMAGE. Jako marker byl používán PCR marker, 100 bp marker a Lambda DNA/EcoRI + HindIII marker. Náhodné primery používané pro identifikaci odrůd a DH linií rodu Brassica pro RAPDs Primer (Primer) Sekvence (Sequence) CAGGCCCTTC OPA-01 AGTCAGCCAC OPA-03 GGGTAACGCC OPA-09 CAGCACCCAC OPA-13 GTTTCGCTCC OPB-01 TGCTCTGCCC OPB-06 GTAGACCCGT OPB-11
18
OPB-17
AGGGAACGAG
Vyhodnocení Získané elektroforeogramy jsme zpracovávali s využitím barevného stolního scaneru s vysokou rozlišovací schopností (600 dpi) a speciálního softwaru - GelManager for Windows (BioSystematica, U.K.) pro vyhodnocování. Obrázky byly upraveny v programu Adobe Photoshop 4.0 před vlastním hodnocením. Výsledkem analýzy spekter je seskupení podobných spekter na základě výpočtu podobnostní matice - koeficientů podobnosti každého vzorku se všemi ostatními z vybrané databáze. Výsledky matice byly pak podrobeny clusterové analýze (UPGMA - unweighted pair group method averages) a výsledky jsou zobrazeny jako dendrogramy.
19
ANALÝZA SLG GENU U ŘEPKY OLEJKY (BRASSICA NAPUS) METODOU PCR-RFLP ***
Metoda PCR-RFLP kombinuje amplifikaci určitého specifického úseku genomové DNA a následné štěpení amplifikovaného produktu různými restrikčními endonukleázami. Po elektroforetické separaci na gelu lze detekovat polymorfismus uvnitř sekvencí, které se jinak v počtu bází příliš neliší. SLG (S-locus glycoprotein; NASRALLAH ET AL. 1985) Jedná se o gen, který se podílí na průběhu autoinkompatibilní reakce (zábrana samosprášení) u některých druhů rostlin z čeledi Brassiceae. Tento gen se nachází na tzv. S-lokusu. Je známo několik desítek variant SLG genu. Výsledky analýz SLG genu pomocí metody PCR-RFLP lze využít jako molekulární marker pro identifikaci autoinkompatibilních rostlin a odlišení jednotlivých haplotypů. SLG geny u rodu Brassica lze rozdělit do dvou tříd. SLG třídy I pocházejí z dominantních haplotypů, k jejich amlifikaci se používají primery PS5 a PS15. Po amplifikaci dostaneme produkt o velikosti asi 1 300 bp. U Brassica napus se jedná o nefunkční gen, pravděpodobně v důsledku mutace. Naamplifikování tohoto genu z určitého haplotypu automaticky tedy znamená autokompatibilní fenotyp. K amplifikaci genů SLG II z recesivních haplotypů je nutné použít odlišné primery – PS3 a PS21. Výsledkem je produkt o velikosti asi 1 100 bp. Jedná se o funkční gen. Jednotlivé AI haplotypy mají odlišná štěpná místa pro jednotlivé restrikční endonukleázy v tomto SLG genu. PCR SLG of class I general reaction mixture for PCR (total 25 μl): 1,5 μl genomic DNA – template ( ≈ 75 μg ) 2,5 μl 10 x PCR Buffer (TaKaRa) 2 μl dNTP Mixture (TaKaRa) 0,25 μl (0,0125 nmol) primer PS 5 0,25 μl (0,0125 nmol) primer PS 15
20
0,2 μl (1 U) Taq DNA polymerase (TaKaRa) up to 25 μl (18,3 μl) sterillized distilled water SLG of class II general reaction mixture for PCR (total 25 μl): 3 μl genomic DNA – template ( ≈ 150 μg ) 2,5 μl 10 x PCR Buffer (TaKaRa) 2 μl dNTP Mixture (TaKaRa) 0,19 μl (0,0095 nmol) primer PS 3 0,19 μl (0,0095 nmol) primer PS 21 0,2 μl (1 U) Taq DNA polymerase (TaKaRa) up to 25 μl (16,92 μl) sterillized distilled water
primers: PS 5 (for SLG of class I) PS 15 (for SLG of class I) PS 3 (for SLG of class II) PS 21 (for SLG of class II)
sequences ( 5´→ 3´): ATG AAA GGC GTA AGA AAA ACC TA CCG TGT TTT ATT TTA AGA GAA AGA GCT ATG AAA GGG GTA CAG AAC AT CTC AAG TCC CAC TGC TGC GG
termal cycling denature et 93°C for 1 min anneal et 58°C for 2 min polymerize et 72°C for 3 min - this 3 temperatures repeat 35 times 4°C until gel electrophoresis or restriction
(elongation)
21
RFLP restriction enzymes: EcoR I, Mbo I, Msp I, Afa I (Rsa I) reaction: 22 μl PCR 2,5 μl 10 x reaction Buffer 0,5 – 1 μl enzyme (≈ 5 U) ± 1 μl 0,02 % BSA reaction temperature : 37 ° C for 4 hrs (in thermocycler) Agarose gel electrophoresis preparation of 2 % gel: 2 g of agarose + 100 ml of 1 x TBE (or TAE) buffer heat up until the agarose melts competely cool down (60 °C) and add 2 μl of ethidium bromid solution (0,2 μg/ml of gel) and mix 3. pour the cooled, liquified agarose into the gel mold, put the wells and allow it to solidify loading : 25 μl PCR after restriction add 4 μl loading buffer (0,25 % bromophenol blue and 40 % (w/v) sucrose in H2O) and mix 2. load DNA with loading buffer in the wells by pipetting 3. include one (or two) lane of DNA molecular-weight markers ( 1μl of 100 bp λ markers + 20 μl H2O + 4 μl loading buffer) electrophoresis: Add a sufficient volume of the 1 x buffer (TAE or TBE) to the electrophoresis chambe to cover the gel 1 – 2 mm. Perform electrophoresis at 30 V for 30 min and then at 80 V for 2,5 – 3 hrs. Visualization Place the gel on UV light box and photograph.
22
Ukázka fotografie PCR-RFLP genu SLG: (amlifikace genu SLG třídy I, štěpení restriktázou Mbo I, separace na 2 % agarózovém gelu)
23
PCR-RFLP ANALÝZA U MYKORHIZNÍCH HUB ***
Extrakce DNA se provádí pomocí kitu DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN podle standardního protokolu.Vzorky DNA jsou uchovávány při -20°C. Pro PCR se používají univerzální primery ITS1 a ITS4: ITS1 (5’–3’) - TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4 (5’–3’) - TCCTCCGCTTATTGATATGC (White et al. 1990). Schéma pipetování PCR reakce (TAKARA): 2,5 µl reakčního pufru 0,5 µl dNTPs 0,25 + 0,25 µl primeru (ITS1, ITS4) 0,2 µl DNA polymerázy 1 µl DNA dH2O voda do objemu 25 µl Amplifikace DNA probíhá v termocykleru PTC - 100 (MJ RESEARCH) s následujícími parametry: 94°C (2 min) pro počáteční separaci DNA řetězců a 35 cyklů: 94°C (30 sek.) - denaturace, 62°C (3 min) - annealing primerů, 72°C (1 min) - elongace. Termální cyklus je zakončen elongační teplotou 72°C (10 min). Amplifikované PCR produkty jsou použity pro RFLP analýzu. Digesce amplifikovaných fragmentů DNA je prováděna pomocí různých restrikčních endonukleáz (MboI, HinfI a EcoRI) tak, že 15 µl PCR produktu je smícháno s 2 µl bufferu, 0,5 µl restrikční endonukleázy a doplněno 2,5 µl H2O do konečného objemu 20 µl. Směs je inkubována v termocykleru 6 hod při 37°C. Produkty po štěpení jsou separovány pomocí PAGE (10% polyakrylamidový gel v TBE pufru) a detekovány ethidium bromidem. Doba trvání elektroforézy je 6 hodin při napětí 150 V. Gely jsou fotografovány pod UV světlem. Získané elektroforeogramy jsou zpracovávány pomocí speciálního software BioProfil 1D+ pro vyhodnocování molekulárních dat.
24
AFLP ANALÝZA ***
Technika AFLP (Amplification Fragment Lenght Polymorphism - polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů) je modifikací RFLP, která pro konečné zviditelnění fragmentu používá PCR. Dochází tak ke kombinaci specifičnosti restrikčního štěpení se snadností PCR. Tato metoda spočívá v selektivní amplifikaci sub-souboru restrikčních fragmentů po štěpení celkové genomové DNA restrikčními enzymy. Polymorfismus se zjišťuje na základě rozdílů ve velikosti amplifikovaných fragmentů po separaci na PAGE. Oproti metodám RFPL a RAPD má řadu výhod, mezi nejdůležitější patří generování velkého množství markerů. Kromě využití pro identifikaci genotypů kulturních rostlin je cílena zejména pro účely mapování významných kvalitativních a kvantitativních znaků. Tato metoda nachází uplatnění také při studiu biodiverzity a přípravě markerů. AFLP generuje dominantní markery a představuje velký počet signálů v jedné reakci.
25
AFLP protokol Pozn. Označení STOP krok znamená, že v tomto kroku je možné sled reakcí přerušit. Polymeráza není součástí kitu. 1. Restikční štěpení genomické DNA komponenty 5X reakční pufr kontrolní DNA rajčete (100ng/μl) DNA vzorku (250ng v ≤ 18μl) EcoR I/Mse I destilovaná voda celkový objem μl
kontrola μl 5 2,5 2 15,5 25
vzorky μl 5 ≤18 2 doplnit 25 25
Všechny komponenty smícháme v 1,5 ml eppendorfce a krátce centrifugujeme. Vzorky necháme inkubovat 2 h při 37°C. Po inkubaci zahřejeme vzorky na 15 min. na 70°C, aby došlo k inaktivaci restrikčních enzymů. Vzorky dáme na led a po té krátce centrifugujeme.
2. Ligace adaptorů Ke vzorkům po restikčním stěpení přidáme: komponenty adapter ligation solution T4 DNA ligase
objem μl 24 1
Vzorky promícháme při pokojové teplotě, krátce centrifugujeme a potom inkubujeme 2 h při 20°C. Ředění 1:10 Ze vzorků po ligaci odebereme 10μl reakční směsi a přidáme 90μl TE pufru, dobře promícháme. Zředěné i nezředěné vzorky uchováváme při –20°C pro další použití. STOP krok
26
3. Preamplifikační reakce komponenty zředěný templát DNA pre-amp primer mix 10X PCR pufr plus Mg Taq DNA polymeráza (5U/μl) celkový objem μl
objem μl 5 40 5 1 51
Vzorky promícháme, krátce centrifugujeme a dáme preamplifikovat (program AFLP 1). Reakční cyklus: 20 cyklů: 94°C – 30s 56°C – 60s 72°C – 60s Ředění 1:50 Ze vzorků po preamplifikaci odebereme 3μl reakční směsi a přidáme 147μl TE pufru, dobře promícháme. Zředěné i nezředěné vzorky uchováváme při –20°C pro další použití. STOP krok 4. Selektivní AFLP amplifikace Pozn. Pro neradioaktivní detekci nepoužíváme značení primerů radioaktivním fosforem 32P nebo 33 P, ale ředíme primer EcoR I. Ředění primeru EcoR I: odebereme 18μl primeru a přidáme 32μl destilované vody. „Mix 1“ (na 10 vzorků) komponenty ředěný primer EcoR I Mse I primer celkový objem μl
objem μl 5 45 50
„Mix 2“ (na 10 vzorků) komponenty destilovaná voda 10X PCR pufr plus Mg Taq DNA polymeráza (5U/μl) celkový objem μl
objem μl 79 20 1 100 27
Z DNA, kterou jsme po preamplifikaci naředili 1:50, Mix 1 a Mix 2 připravíme reakční směs pro selektivní amplifikaci. komponenty objem μl DNA ředěná po preamplifikaci 1:50 a/nebo 5 kontrolní preamplifikavaná DNA rajčete (součást kitu) Mix 1 (primery/dNTP) 5 Mix 2 (Taq DNA polymeráza/pufr) 10 20 celkový objem μl Vzorky promícháme, krátce centrifugujeme a dáme amplifikovat (program AFLP 2). Reakční cyklus: 1 cyklus: 94°C – 30s 65°C – 30s 72°C – 60s 12 cyklů: při, kterých během annealingu v každém kroku klesne teplota o 0,7°C, tzn. cyklus 2. 94°C – 30s 64,3°C – 30s 72°C – 60s atd. 23 cyklů: 94°C – 30s 56°C – 30s 72°C – 60s STOP krok
Separace amplifikovaných produktů na sekvenační elektorforéze Po PCR přidáme ke vzorku (20μl) 16μl 98% formamidu a 4μl Loading buffer. Před nanášením na gel necháme vzorky denaturovat 3 min při 90°C (denaturaci opakujeme vždy před další separací na gelu). Po denaturaci vzorky zchladíme na ledu.
28
Příprava sekvenační elektroforézy Roztoky: Bind silane: 4 ml bind silane rozmícháme v 1 l ultračisté vody (lze opakovaně použít) Pozn. Při přípravě sekvenační elektroforézy a PAGE pracujeme pouze s ultračistou vodou (UHP water) Obě skla, která se používají pro sekvenační elektroforézu, spacery a hřeben důkladně umyjeme detergentem a pečlivě odstraníme případné zbytky gelu. Po osušení skel, spacerů a hřebenu, vše opláchneme v ultračisté vodě a po té ve 100% ethanolu. Spodní sklo (to, na kterém po ELFO zůstává gel) vložíme na 1 h do roztoku bind silane a necháme ho „silanizovat“ tzn. že na skle se vytvoří vrstva, která po té váže gel. Sklo opláchneme ultračistou vodou a potom 100% ethanolem. Na vrchní sklo (to, které odpuzuje gel) nalijeme cca 5 ml repel silane, dobře rozetřeme po skle, tak aby po celé ploše vznikla tenká vrstva a necháme 15 min působit. Sklo opláchneme ultračistou vodou. Sestavení skel pro sekvenační elektroforézu Na spodní „bind“ sklo položíme k dlouhým okrajům spacery a přiložíme vrchní „repel“ sklo tou vrstvou, kterou jsme potřeli repel silane. Soupravu pečlivě urovnáme a spojíme svorkami na jedné z dlouhých a jedné z krátkých stran. Tu stranu, na které není žádná ze svorek důkladně zalepíme přes hranu izolepou, tak aby skla zůstala pevně spojena. Svorky přendáme a postup opakujeme na druhé nezalepené straně. Když jsou obě dlouhé strany zalepené, zalepíme spodní stranu skel. Dbáme na to, aby tato strana byla velmi pečlivě zalepená, jinak gel bude vytékat. Spodní rohy skel zalepíme dvakrát popřípadě třikrát. Příprava denaturačního PAGE – DNA gelu Chemikálie: 10% persíran amonný: 0,1g do 1ml vody (připravujeme čerstvý před každou ELFO) 100ml gelu připravíme podle tabulky, vše smícháme, zahříváme ve vodní lázni při 55°C (pozor ochlazuje se) po dobu 3 min, objem doplníme do 100ml. AC/BIS 30% 5X TBE voda močovina
ml ml ml g
6% 20 20 24,7 42
8% 26,6 20 18,1 42
10% 33,3 20 11,4 42
29
Z takto připraveného gelu odebereme 10ml přidáme 60μl 10% persíranu amonného a 5μl TEMEDU. Gel ihned nanášíme pipetou mezi skla, tak aby nevznikly žádné bubliny. Tato vrstva gelu má po ztuhnutí zabránit vytékaní zbývajícího gelu. Když spodní vrstva dobře ztuhne přidáme ke zbývajícím 90ml gelu 540μl 10% persíranu amonného a 45μl TEMEDU a pomocí střičky gel naneseme mezi skla, tak aby nevznikly žádné bubliny. Gel naneseme přesně k okraji vyříznutí vrchního skla, přebytečný gel odstraníme a přesah spodního skla očistíme, aby ne něm neulpívaly zbytky gelu. Hřeben zasuneme mezi skla asi 4mm hluboko tou stranou, na které nejsou zuby. Gel necháme ztuhnout. Trubičku ze střičky ihned umyjeme, aby v ní gel neztuhnul a neucpal ji. Pre-run sekvenační elektroforézy Když je gel dobře ztuhlý odstraníme izolepu ze spodní části, skla vložíme do vany a připevníme je k vaně pomocí svorek. Do vany nalijeme 1X TBE pufr a prázdný gel necháme cca 15 – 20 min běžet při 1800V. Vlastní elektroforéza Po pre-run vypneme proud, vyndáme hřeben a do štěrbiny, kterou hřeben v gelu vytvořil, naneseme Loading buffer, po té vsuneme zpátky hřeben tou stranou, na které jsou zuby, tak hluboko, aby hřeben vytvořil mezi skly sloty pro vzorky. Do slotů naneseme vzorky (které jsme těsně před tím denaturovali) cca 3 - 4μl a necháme ELFO běžet při 1800V (cca 1 h). Po doběhnutí ELFO vypneme proud, odpojíme zdroj (!!!) a vyndáme skla. Odstraníme izolepu, vyndáme spacery a opatrně od sebe odlepíme skla. Na spodním „bind“ skle by měl zůstat gel. Barvení stříbrem Roztoky: Fix/stop solution (10 % kyselina octová): 100 ml kyseliny octové přimícháme do 900ml ultračisté vody Staining solution: 1 l ultračisté vody, 1 g AgNO3, 1 ml formaldehydu Developing solution (vývojka): 30 g NaCO3, 1 l ultračisté vody, těsně před použitím přidáme 1,5 ml formaldehydu a 200 μl 1 % thiosulfátu sodného 1% thiosulfát sodný: 0,01 g do 1 ml vody (připravujeme čerstvý před každou ELFO)
30
Spodní sklo, na kterém zůstal gel vložíme do fix/stop solution a 20 min oplachujeme a třepeme. V tomto roztoku může gel zůstat přes noc bez třepání. STOP krok Gel přeneseme do nové misky a 3krát 5 min dobře oplachujeme ultračistou vodou za současného třepání. Gel ponoříme do staining solution a 30 min barvíme a třepeme. Po barvení gel 15 s oplachujeme ultračistou vodou a po té ho vložíme do vychlazeného developing solution, ke kterému jsme přidali 1,5 ml formaldehydu a 200 μl 1 % thiosulfátu sodného. 6 – 7 min omýváme, dokud nejsou proužky dobře viditelné. Po zviditelnění proužků přeneseme gel zpět do fix/stop solution a 3 min necháme působit, aby došlo k ukončení vyvíjecí reakce. Gel 2krát 5 min omyjeme ve vodě. Gel překryjeme celofánem, necháme uschnout a po té oscanujeme. Získaný elektroforeogram je takto připraven k hodnocení. Všechny pomůcky důkladně umyjeme.
31
Příprava sekvenační elektroforézy - Piešťany Roztoky: Při přípravě sekvenační elektroforézy a PAGE pracujeme pouze s ultračistou vodou (UHP water) Obě skla, která se používají pro sekvenační elektroforézu, spacery a hřeben důkladně umyjeme detergentem a pečlivě odstraníme případné zbytky gelu. Po osušení skel, spacerů a hřebenu, vše opláchneme v ultračisté vodě a po té ve 100% ethanolu. Spodní sklo (to, na kterém po ELFO zůstává gel) potřeme roztokem Bind silane a necháme ho „silanizovat“ tzn. že na skle se vytvoří vrstva, která po té váže gel. Roztok – 3 ml vody + 40 µl led. kys. octové + 40 µl Bind Silane. Roztok naneseme pipetou na sklo, rozetřeme, po zaschnutí přetřít 100% ethanolem. Na vrchní sklo (to, které odpuzuje gel) nalijeme cca 2-3 ml Repel silane, dobře rozetřeme po skle, tak aby po celé ploše vznikla tenká vrstva, po zaschnutí přetřít 100% ethanolem. Sestavení skel pro sekvenační elektroforézu Na spodní „bind“ sklo položíme k dlouhým okrajům spacery a přiložíme vrchní „repel“ sklo tou vrstvou, kterou jsme potřeli repel silane. Soupravu pečlivě urovnáme a spojíme svorkami, zalepí se pouze horní okraje skel – u „uší“. Příprava denaturačního PAGE – DNA gelu Chemikálie: AC/BIS 30% 5X TBE voda močovina
ml ml ml g
6% 20 20 24,7 42
8% 26,6 20 18,1 42
10% 33,3 20 11,4 42
Smíchat vodu, AC/BIS, TBE, nalít horký roztok močoviny (močovinu rozehřát v mikrovlnce), nechat vychladit v mrazáku, jinak moc rychle tuhne. k vychlazenému roztoku – na 100 ml přidat 500 µl 10 % PSA + 150 µl TEMED. 10% persíran amonný: 0,1g do 1ml vody (připravujeme čerstvý před každou ELFO) Roztok nalijeme do mírně šikmých skel (2-3 cm šikmina), po nalití se položí do roviny, snad to ztuhne a nevyteče. Přes noc na skla položit vlhký filtrák, vatu a alobal.
32
Hřeben zasuneme mezi skla asi 4mm hluboko tou stranou, na které nejsou zuby. Gel necháme ztuhnout. Pre-run sekvenační elektroforézy Když je gel dobře ztuhlý odstraníme izolepu ze spodní části, skla vložíme do vany a připevníme je k vaně pomocí svorek. Do vany nalijeme 1X TBE pufr a prázdný gel necháme cca 15 – 20 min běžet při 1000V. Vlastní elektroforéza Vsuneme hřeben tou stranou, na které jsou zuby, tak hluboko, aby hřeben vytvořil mezi skly sloty pro vzorky. Do slotů naneseme vzorky (které jsme těsně před tím denaturovali) cca 3 - 4μl a necháme ELFO běžet při 1000V, 39 mA a 38 W. Nanášecí pufr LB: 4.8 g močovina, 10 ml voda, 0,05 g BPB, 10 µl 10 M NaOH, důkladně rozmíchat, min. 30 min., trvanlivost 2 týdny. LB se smíchá se vzorkem v poměru 1 : 1. Po doběhnutí ELFO vypneme proud, odpojíme zdroj (!!!) a vyndáme skla. Odstraníme izolepu, vyndáme spacery a opatrně od sebe odlepíme skla. Na spodním „bind“ skle by měl zůstat gel. Barvení stříbrem Roztoky: Fix/stop solution (10 % kyselina octová): 200 ml kyseliny octové přimícháme do 1800ml ultračisté vody, vychlazené Staining solution: 2 l ultračisté vody, vychlazená, 2 g AgNO3, 3 ml formaldehydu Developing solution (vývojka): 50 g NaCO3, 2 l ultračisté vody, těsně před použitím přidáme 3 ml formaldehydu a 400 μl thiosulfátu sodného (10 mg/ml), vychlazený roztok, 6 min. před použitím do mrazáku 1% thiosulfát sodný: 0,01 g do 1 ml vody (připravujeme čerstvý před každou ELFO) Spodní sklo, na kterém zůstal gel vložíme do fix/stop solution a 25 min** třepeme. Gel přeneseme do nové misky a 2x 5 min** dobře oplachujeme vychlazenou ultračistou vodou (1 l). Gel ponoříme do staining solution a 25 min** barvíme a třepeme. Po barvení gel 10-15 s oplachujeme vychlazenou ultračistou vodou (2 l), velmi intenzivně se protřepává a po té ho vložíme do vychlazeného developing solution, ke kterému jsme přidali 3 ml formaldehydu a 400 μl thiosulfátu sodného. 5-6 min velmi intenzivně
33
protřepáváme, v chlaďáku, ve tmě, při červeném fotosvětle. Barvit do objevení se skvrn, pak fixovat – fix/stop solution, 30 min, pak sušit. Všechny pomůcky důkladně umyjeme. ** velmi intenzivní třepání s velkou amplitudou Všechny pomůcky důkladně umyjeme.
34
HYBRIDIZACE A NERADIOAKTIVNÍ DETEKCE DNA – SOUTHERN BLOTT + ALKPHOS DIRECT ***
35
Elektroforéza – agarózový gel v 1x TBE pufru Blot - na pozitivně nabitou nylonovou membránu – HYBOND N+ přenos pomocí alkalického pufru Elfo – po ukončení elektroforézy vyfotit gel (na UV jen po nezbytně nutnou dobu) oříznout gel gel přenést do ATB na 15 min, mírně třepat přenést do nového ATB na 20 min, mírně třepat odstříhnout membránu (ostré nůžky, nesahat, označit polohu –levý spodní roh) položit membránu na povrch dH2O ! dokud se nezvlhčí přenést membránu na 5 min do ATB – ponořit připravit transfer – ručníky, buna – suchý W 3MM – vlhký W 3MM – folie – membrána – gel (orientace jako při elfo) – folie – vlhký W 3MM – most z filtráků – závaží 2 hod transfer, zvlhčovat filtrák - ATB membránu protáhnout v 2x SSC v případě alkalického transferu a Hybond N+ není potřeba croslinkovat DNA na membránu nablottovanou membránu je možno vložit do sterilního W 3MM a mikroténového sáčku do lednice
36
Příprava sondy po elektroforéze vyříznout band sondy z gelu – co nejmenší a co nejmenší expozice na UV (nestrkat nos a oči moc blízko k UV) izolace DNA z gelu pomocí GelElute Kit – Sigma přidat Gel Solubilization pufr – 300 µl na 100 mg gelu 10 min v 50-60°C, protřepávat přenést na kolonku, stočit promýt přidat eluční pufr změřit koncentraci DNA a upravit na 20 ng/µl Značení sondy DNA – koncentrace 20 ng/µl denaturace DNA – 10 µl DNA 5 min povařit, zchladit 5 min na ledu, krátce stočit přidat 20µl cross-linkeru do 80 µl vody (lze uchovat 1 týden v lednici) k DNA přidat 10 µl reaction pufru, lehce promíchat přidat 2 µl labeling reagent, lehce promíchat přidat 10 µl cros-linkeru (pracovní konc.), lehce promíchat, stočit inkubace 30 min při 50°C lze uchovávat na ledu 2 hod Hybridizace hybridizační pufr – součást kitu přidat: NaCl na konc. 0.5 M blocking reagent na 4% Salmon sperm (100 µg/ml = 10 µl/ml hybridizačního roztoku) na 200 ml hybridizačního roztoku: 8 g blocking reagent 5.84 g NaCl velmi špatně se rozpouší, nesmí se vysrážet, rozdělit do alikvot a dát zamrazit 0.25 ml/cm3 pufru předehřátého na 60°C prehybridizace 30 min přidat sondu 5-10 ng/ml hybridizace přes noc Wash 2-5 ml / cm2 – WASH I, 10 min při 60°C opakovat WASH II, 5 min při pokojové teplotě opakovat
37
Detekce membránu nechat okapat, položit na folii, přidat substrát substrát 25µl / cm2 poňahňat 3 min při pokojové teplotě vložit do kazety s filmem – Hypefilm MCL po cca 1 hod – vyvolat – 3 min ve vývojce (Fomadon R09, ředit 1:20), 10 min v ustalovači (Fomafix, ředit 1:5) REPROBING BLOTS Blots which have been used to generate a signal on film can be reprobed several times. Due to the length of the light output in this system, it is first necessary to 'strip' the blots of old probe before starting second, and subsequent hybridizations. Blots can be stripped using the following method. For blots detected with ECF substrate, start at step 1. For blots detected with CDP-Star, step 1 can be omitted. 1. Incubate blots in absolute alcohol ( 99% ethanol) at room temperatures with agitation (1ml/cm2, 2x10 minutes). 2. Incubate blots in 0.5%(w/v) SDS solution at 60°C for 60 minutes. 3. Rinse blot in 100mM Tris pH 8.0 for 5 minutes at room temperature. Membranes should be kept moist between reprobings, for example wrapped in SaranWrap, and stored in a refrigerator at 2-8°C. The limit to the number of reprobings is likely to be governed by physical damage to the blots. It is therefore recommended that blots are always handled carefully.
38
Detekce
39
Pufry: Alkaline transfer buffer 0.4 N NaOH 1 M NaCl 20x SSC 175.3 g NaCl 88.2 g Na-citrát rozpustit v 800 ml vody, upravit pH na 7.0 (HCl) doplnit na 1 l Neutralization buffer II 0.5 M Tris-HCl, pH=7.2 1 M NaCl Hybridization buffer Add NaCl (analytical grade) to the hybridization buffer to give a concentration of 0.5M. Add blocking reagent to a final concentration of 4%(w/v). Immediately, mix thoroughly, to get the blocking reagent into a fine suspension. Continue mixing at room temperature for 1-2 hours on a magnetic stirrer or roller mixer. This buffer can be used immediately or stored in suitable aliquots at -15°C to -30°C. Primary wash buffer (1 litre) – WASH I močociva 2M 120g SDS 0.1% 1g Na phosphate pH7.0 50mM 100 ml 0.5M Na3PO4 NaCl 150mM 8.7g MgCl2 10ml 1.0M MgCl2 Blocking reagent 0.2% 2g 0.5M Na2PO4 -
39.0025 g 500 ml vody pH=7.0 – pomocí NaOH
Secondary wash buffer - 20x stock – WASH II Tris base 1M 121g NaCl 2M 112g Adjust pH to 10.0. Make up to 1 litre with water. This can be kept for up to 4 months in a refrigerator at 2-8°C. Secondary wash buffer – working dilution Dilute stock 1:20 and add 2ml/l of 1M MgCl2 to give a final concentration of 2mM magnesium in the buffer. This buffer should not be stored.
40
