TEKNIK EKSTRAKSI TERBAIK UNTUK ISOLASI KAEMFEROL DARI DAUN SIRSAK (Annona muricata)
WENNY NURWENDARI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Teknik Ekstraksi terbaik untuk Isolasi Kaemferol dari Daun Sirsak (Annona muricata)” adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, November 2014 Wenny Nurwendari NIM G44124010
ABSTRAK WENNY NURWENDARI. Teknik Ekstraksi Terbaik untuk Isolasi Kaemferol dari Daun Sirsak. Dibimbing oleh IRMANIDA BATUBARA dan SUMINAR SETIATI ACHMADI. Daun sirsak mengandung beragam senyawa yang memiliki aktivitas hayati, salah satunya kaemferol sebagai antikanker. Dalam upaya mengisolasi kaemferol, dilakukan 12 macam ekstraksi guna mencari teknik ekstraksi terbaik untuk isolasi kaemferol dari daun sirsak. Ekstrak yang dihasilkan diuji toksisitasnya terhadap larva Artemia salina. Semua ekstrak bersifat toksik, karena memiliki nilai LC50 kurang dari 1000 ppm. Ekstrak dengan kandungan total fenolik dan total flavonoid yang tinggi, kandungan tanin yang rendah, dan warna spot kromatografi lapis tipis kaempferol yang pekat dipilih untuk analisis kromatorafi cair kinerja tinggi guna mengetahui kadar kaemferolnya. Ekstrak sonikasi daun sirsak residu n-heksana dipilih sebagai teknik ekstraksi terbaik untuk isolasi kaemferol dari daun sirsak dengan kandungan kaemferol dan kuersetin masing-masing 1.22% dan 0.50%. Selain kandungan kaemferol dan kuersetin yang tinggi dibandingkan dengan teknik ekstraksi yang lain, teknik ekstraksi sonikasi daun sirsak residu nheksana dipilih karena waktu ekstraksinya yang singkat dan jumlah senyawa pengotornya yang lebih sedikit. Kata kunci: kaemferol, ekstraksi, daun sirsak, KCKT.
ABSTRACT WENNY NURWENDARI. The Best Extraction Technique for Kaempferol Isolation from The Soursop Leaves (Annona muricata). Supervised by IRMANIDA BATUBARA and SUMINAR SETIATI ACHMADI. Soursop leaves contain various compounds that have biological activity such as kaempferol as anticancer. Twelve extraction techniques were performed to obtain the best extraction technique for kaempferol isolation from the soursop leaves. Toxicity of extracts was tested against Artemia salina larvae. All extracts were toxic because they showed LC50 value less than 1000 ppm. The extract with high content of total phenols and total flavonoids, low content of tannin, and intense color of spot on thin layer chromatograph was selected for high performance liquid chromatography analysis. Sonication extraction of n-hexane residues was chosen as the best extraction technique for kaempferol isolation from the soursop leaves with kampferol and quercetin content of 1.22% and 0.50%, respectively. In addition to high content of kaempferol and quercetin, sonication was chosen due to the shortest extraction time and the least impuriteies. Key words: kaempferol, extraction, soursop leaves, HPLC.
TEKNIK EKSTRAKSI TERBAIK UNTUK ISOLASI KAEMFEROL DARI DAUN SIRSAK (Anonna muricata)
WENNY NURWENDARI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
Judul Skripsi Nama NIM
: Teknik Ekstrak Terbaik untuk Isolasi Kaemferol dari Daun Sirsak (Annona muricata) : Wenny Nurwendari : G44124010
Disetujui oleh
Dr Irmanida Batubara, Msi Pembimbing I
Prof Ir Suminar Setiati Achmadi, PhD Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Segala puji dan rasa syukur Penulis panjatkan atas segala karunia kesehatan dan kemudahan yang dilimpahkan oleh Allah SWT selama proses penyusunan karya ilmiah dengan judul “Teknik Ekstraksi Terbaik untuk Isolasi Kaemferol dari Daun Sirsak (Annona muricata)“. Karya ilmiah ini disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan pada bulan Desember 2013 hingga Agustus 2014 di Laboratorium Kimia Analitik dan Laboratorium Bersama, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor, dan Pusat Studi Biofarmaka IPB, Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Irmanida Batubara, MSi. dan Prof. Ir. Suminar Setiati Achmadi, PhD. selaku pembimbing yang telah memberikan arahan, bimbingan, motivasi, dan doa selama penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Almarhum Bapak, Mama, Kakak-kakak tersayang Wiwin dan Anna yang telah memberikan doa, semangat, kasih sayang, dan dukungan selama masa studi hingga proses penyusunan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Pusat Studi Biofarmaka selaku pemberi dana dan laboran Laboratorium Kimia Analitik IPB. Semoga Allah SWT memberikan balasan atas segala amal yang diperbuat dan senantiasa menyertai hamba-Nya dengan kasih dan sayang-Nya. Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan manfaat.
Bogor, Oktober 2014 Wenny Nurwendari
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
Ruang Lingkup Penelitian
2
METODE
2
Alat dan Bahan
2
Preparasi Daun Sirsak
2
Kadar Air
2
Ekstraksi
3
Uji Toksisitas dengan Metode BSLT
3
Penentapan Kadar Tanin
4
Penetapan Kadar Fenolik Total
5
Penetapan Kadar Flavonoid Total
5
Identifikasi Keberadaan Kaemferol dengan KLT
5
Pengukuran Kadar Kaemferol dengan KCKT
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
Kadar Air
6
Ekstraksi
6
Toksisitas Ekstrak terhadap Larva Artemia salina
7
Kadar Fenolik Total
8
Kadar Tanin
9
Kadar Flavonoid Total
9
Identifikasi Keberadaan Kaemferol
9
Kadar Kaemferol SIMPULAN DAN SARAN
10 12
Simpulan
12
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
13
LAMPIRAN
15
RIWAYAT HIDUP
31
DAFTAR TABEL 1 Rendemen ekstrak daun sirsak 2 LC50, fenolik total, tanin, flavonoid total ekstrak daun dan residunya 3 Kadar kaemferol dan kuersetin ekstrak terpilih
7 8 11
DAFTAR GAMBAR 1 Kromatogram KLT ekstrak daun sirsak dan residunya 2 Kromatogram larutan standar dan larutan ekstrak daun dan residunya 3 Struktur kimia kaemferol dan kuersetin
10 11 12
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Bagan alir penelitian Hasil determinasi sampel Kadar air Rendemen BSLT Kadar tanin Kadar fenolik total Kadar flavonoid total Kadar kaemferol
15 16 17 18 19 21 23 26 29
PENDAHULUAN Latar Belakang Tanaman sirsak (Annona muricata) merupakan salah satu tumbuhan yang banyak ditemukan di negara-negara tropis, seperti Indonesia. Dalam bidang pangan, tanaman ini ditanam secara komersial untuk diambil buahnya. Selain dimanfaatkan sebagai bahan pangan, buah sirsak digunakan untuk mengatasi disenteri, bisul, wasir, kekurangan vitamin C, dan antikejang (Mardiana dan Ratnasari 2011). Tidak terbatas pada buahnya, daun sirsak juga dilaporkan memiliki beberapa manfaat seperti menurunkan kadar gula dalam darah (Aziz et al. 2003), memperbaiki sistem imun (Dewi et al. 2007), dan mengatasi kanker (Mustariani 2011). Beberapa penelitian melaporkan ekstrak daun sirsak mengandung senyawa flavonoid dan fenolik seperti kuersetin, katekin, dan kaemferol (Santos dan Salatino 2000). Berdasarkan hasil penelitian Vega et al. (2007), senyawa golongan flavonoid daun Annona dioca, salah satu spesies sirsak mampu menghambat pertumbuhan sel kanker karsinoma Ehrlich. Penelitian tentang senyawa kaemferol yang terdapat di dalam daun sirsak belum banyak dilakukan. Kaemferol memiliki struktur yang hampir sama dengan kuersetin, keduanya merupakan senyawa flavonoid golongan flavonol. Senyawa golongan flavonoid dikenal memiliki berbagai aktivitas hayati. Penggabungan kaemferol dan kuersetin diharapkan akan memberikan aktivitas hayati yang lebih kuat. Kaemferol di alam berada dalam bentuk kaemferol glikosida yang memiliki banyak aktivitas hayati seperti antiradang, anticendawan (Ozçelik 2006), antioksidan (Teffo et al. 2010), dan antidiabetes (Zang et al. 2011). Aktivitas suatu bahan dapat diketahui dengan uji toksisitas larva udang (BSLT). Uji BSLT digunakan sebagai uji pendahuluan untuk mengetahui potensi farmakologi suatu senyawa bahan alam. Selain biaya yang murah, metode ini juga merupakan penapisan awal yang dapat disempurnakan oleh uji hayati lainnya yang lebih spesifik setelah senyawa aktif bahan alam dapat diisolasi. Kaemferol dari bahan alam dapat dipisahkan melalui ekstraksi. Berbagai macam teknik ekstraksi kaemferol telah banyak dikembangkan. Selain teknik ekstraksi yang berbeda, kaemferol dapat diekstraksi dengan menggunakan pelarut yang berbeda. Menurut Erosa-Rejon et al. (2010) kaemferol dapat diekstraksi dengan teknik maserasi menggunakan pelarut etanol. Kaemferol juga dapat diekstraksi dengan pelarut metanol menggunakan beberapa teknik ekstraksi, seperti maserasi dengan bantuan sonikasi (Tang et al. 2001), teknik soxhletasi (Loizo et al. 2007), dan teknik refluks (Zang et al. 2011). Penggunaan teknik ekstraksi dan pelarut yang beragam menyebabkan rendemen ekstrak kaemferol yang dihasilkan juga beragam. Oleh karena itu, diperlukan percobaan untuk menentukan teknik ekstraksi kaemferol dari daun sirsak yang paling sederhana, murah, cepat, dan menghasilkan rendemen ekstrak yang tinggi.
2 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan menentukan teknik ekstraksi terbaik untuk mengisolasi kaemferol dari daun sirsak (Annona muricata) dan membandingkan kadar kaemferol dengan kadar kuersetin di dalam ekstrak tersebut.
Ruang Lingkup Penelitian Metode penelitian diringkaskan dalam diagram alir pada Lampiran 1 yang meliputi preparasi sampel, penentuan kadar air (AOAC 2006), ekstraksi daun sirsak, uji toksisitas ekstrak dengan BSLT, uji kadar tanin, uji kadar fenolik total, uji kadar flavonoid total, uji kromatografi lapis tipis (KLT), dan analisis kadar kaemferol menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).
METODE Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan antara lain KCKT, spektrofotometer ultraviolettampak (UV-Vis) Hitachi U-2800, spektrofotometer 20D+, bejana kromatografi, dan lampu ultraviolet Camag Repostar 3. Bahan-bahan yang digunakan antara lain daun sirsak (Lampiran 2) dari kebun Biofarmaka Bogor, standar kaemferol dari Nacalai, standar kuersetin, larva Artemia salina, dan pereaksi Folin-Ciocalteu.
Preparasi Sampel (Mustiarini 2011) Daun sirsak dibersihkan dengan air. Selanjutnya daun dikeringkan dalam oven dengan suhu 50 oC selama 72 jam. Setelah itu, daun sirsak kering digiling dan diayak menggunakan pengayak 80 mesh agar diperoleh bentuk serbuk.
Kadar Air (AOAC 2006) Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105 ⁰C selama 3 jam kemudian didinginkan di dalam desikator dan ditimbang bobotnya. Sebanyak 3 gram sampel ditimbang di dalam wadah yang telah diketahui bobotnya. Wadah berisi sampel dikeringkan di dalam oven pada suhu 105 ⁰C selama 3 jam kemudian didinginkan di dalam desikator dan ditimbang bobotnya. Proses pengeringan dilakukan hingga bobot konstan. Rumus kadar air sebagai berikut: Kadar air % =
𝑊1 − 𝑊2 × 100% 𝑊1
3 W1 = bobot sampel sebelum pengeringan (g) W2 = bobot sampel setelah pengeringan (g)
Ekstraksi Ekstraksi Daun Sirsak (A–D) Maserasi. Serbuk daun sirsak sebanyak 100 g diekstraksi dengan 500 mL pelarut etanol sebanyak 3 kali pada suhu ruang dalam waktu 1 minggu, selanjutnya sampel disaring dan dipisahkan. Ekstrak kemudian dipekatkan dengan penguap putar hingga menghasilkan ekstrak A (Erosa-Rejon et al. 2010). Maserasi dengan Sonikasi. Serbuk daun sirsak sebanyak 100 g diekstraksi dengan 500 mL pelarut air–metanol (85:15) dengan bantuan sonikasi sebanyak 3 kali dalam waktu 3 jam, selanjutnya sampel disaring dan dipisahkan. Ekstrak kemudian dipekatkan dengan penguap putar hingga menghasilkan ekstrak B (Tang et al. 2001). Refluks. Serbuk daun sirsak sebanyak 100 g diekstraksi dengan 500 mL pelarut metanol 70% pada suhu 60–70 ºC dalam waktu 3 jam. Ekstrak kemudian dipekatkan dengan penguap putar hingga menghasilkan ekstrak C (Zang et al. 2011). Soxhlet. Serbuk daun sirsak sebanyak 100 g diekstraksi dengan 500 mL pelarut metanol 70% menggunakan rada soxhlet. Ekstrak kemudian dipekatkan dengan penguap putar hingga menghasilkan ekstrak D (Loizzo et al. 2007). Ekstraksi Daun Sirsak (Ekstrak E–L) Soxhletasi dengan n-Heksana. Serbuk daun sirsak sebanyak 800 g diekstraksi dengan menggunakan pelarut n-heksana. Larutan ekstrak tidak dianalisis, sedangkan residu dibagi dua menjadi residu 1 dan residu 2. Residu 1 dibagi menjadi 4 bagian untuk diekstraksi lebih lanjut. Metode ekstraksi yang digunakan sama dengan yang dipakai untuk mendapatkan ekstrak A–D, tetapi dengan menggunakanan 250 mL pelarut. Ekstrak yang diperoleh berturut-turut disebut ekstrak I–L. Soxhletasi dengan Etil Asetat. Residu 2 n-heksana diekstraksi dengan pelarut etil asetat. Larutan ekstrak tidak dianalisis, sedangkan residu dibagi menjadi 4 bagian untuk diekstraksi lebih lanjut. Metode ekstraksi yang digunakan sama dengan yang dipakai untuk mendapatkan ekstrak A–D, tetapi dengan menggunakanan 250 mL pelarut. Ekstrak yang diperoleh berturut-turut disebut ekstrak E–H.
Uji Toksisitas dengan Metode BSLT (Krishnaraju et al. 2005) Penetasan telur Artemia salina Wadah penetasan disiapkan lalu dimasukkan air laut dan telur udang, diinkubasi pada suhu kamar (26–30 ºC) selama 48 jam dengan keadaan aerasi konstan. Setengah bagian wadah penetasan diletakkan pada tempat gelap, sedangkan setengah bagian lainnya diberi sumber cahaya. Larva yang telah menetas akan bergerak ke sisi wadah dengan sumber cahaya. Larva dikumpulkan dengan pipet dan dipisahkan dari telur ke dalam wadah lain yang berisi air laut.
4 Pengujian Sebanyak 10 ekor larva dimasukkan ke dalam sumur uji yang telah berisi 4.5 mL air laut, kemudian ditambahkan larutan ekstrak sebanyak 0.5 mL. Larutan ekstrak yang digunakan dibuat dengan ragam konsentrasi 1–5000 μg/ml. Setiap konsentrasi diulang sebanyak 3 kali dan digunakan 1 kontrol tanpa penambahan ekstrak. Jumlah larva udang yang mati pada suhu ruang diamati setelah 1 hari (24 jam), kemudian konsentrasi letal 50% (LC50) dihitung dengan persamaan berikut: Kematian larva % =
jumlah larva mati - jumlah larva kontrol mati ×100% jumlah larva uji
Persamaan regresi y = a + bx dibuat antara konsentrasi ekstrak (x) dan persen kematian larva (y), lalu nilai LC50 ditentukan sebagai nilai x pada saat y = 50.
Penetapan Kadar Tanin (Sulastri 2009) Pembuatan Larutan KMnO4 0.1000 N Kristal KMnO4 ditimbang sebanyak 1.6001 g kemudian dilarutkan dengan 500 mL akuades, dididihkan selama 10–15 menit, kemudian disimpan selama 1 malam. Setelah itu, larutan disaring dan ditambahkan akuades hingga volume 500 mL. Larutan KMnO4 perlu distandardisasi sebelum dipakai. Standardisasi Larutan KMnO4 0.1000 N Kristal asam oksalat ditimbang sebanyak 0.3150 g dan dilarutkan dengan akuades sampai volume 50 mL. Larutan dipipet sebanyak 10 mL ke dalam Erlenmeyer, lalu ditambahkan 5 mL H2SO4 4 N dan dipanaskan sampai 70 oC. Selanjutnya, dalam keadaan panas dititrasi dengan larutan KMnO4 sampai warna ungu dari tetesan larutan tidak hilang, lalu dicatat volume titrasinya. Standardisasi diulang 3 kali. Normalitas larutan KMnO4 dapat dihitung menggunakan persamaan berikut: KMnO4=
W (mg) × FP BE asam oksalat (mg/mg ekuivalen ) × Volume KMnO4
Keterangan: W = Bobot kristal asam oksalat (mg) BE = bobot ekuivalen asam oksalat (63 mg/mg ekuivalen) FP = Faktor pengenceran (10/50) Penetapan Kadar Tanin Ekstrak daun ditimbang sebanyak 0.5 g, ditambahkan air 50 mL, dan dipanaskan pada suhu 40–60 oC selama 30 menit. Setelah dingin, larutan disaring dan ditambahkan larutan indigokarmin, kemudian dititrasi dengan larutan KMnO4 0.1 N. Setiap kali penambahan, 1 mL KMnO4 hingga warna berubah dari biru menjadi hijau. Selanjutnya titrasi dilakukan tetes demi tetes hingga warna hijau
5 menjadi kuning emas. Kadar tanin dapat dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut: FP (A − B) × KMnO4 × 0.00416 % Tanin = × 100% Bobot sampel (g) FP = Faktor pengenceran A = Volume KMnO4 untuk sampel (mL) B = Volume KMnO4 untuk blangko (mL) [KMNO4] = Konsentrasi KMnO4 yang telah distandardisasi (N) 0.00416 = Faktor koreksi, 1 mL KMnO4 0.1 N setara dengan 0.00416 gram tanin
Penetapan Fenolik Total (Apsari dan Susanti 2011) Sebanyak 25 mg ekstrak daun dilarutkan sampai volume 25 mL dengan campuran metanol–air (1:1). Larutan ekstrak yang diperoleh dipipet 300 µL, ditambahkan 1.5 mL reagen Folin-Ciocalteu (1:10), dan dikocok. Setelah itu didiamkan selama 3 menit dan masing-masing larutan ditambah 1.2 mL Na2CO3 7.5%, dikocok agar homogen. Larutan diukur absorbansnya pada panjang gelombang 765 nm.
Penetapan Kadar Flavonoid Total (Depkes RI 2000) Sebanyak 200 mg ekstrak daun dilarutkan dalam aseton dengan penambahan heksametilenatetramina (HMT) 2%. Lalu dihidrolisis menggunakan HCl 25% pada suhu 80 oC selama 30 menit. Hasil hidrolisis dipartisi menggunakan etil asetat. Fraksi etil asetat ditampung, lalu ditambahkan AlCl3 2% sehingga membentuk warna fluoresens yang absorbansnya diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada λ 425 nm.
Identifikasi Keberadaan Kaemferol dengan KLT Sebanyak 15 mg ekstrak dihidrolisis dengan menggunakan HCl 4 N, kemudian dipartisi dengan etil asetat. Fraksi etil asetat ditampung, kemudian pelarut diuapkan. Ekstrak yang dihasilkan ditambahkan 1 mL metanol. Larutan sampel dan standar (Sebanyak 1 mg standar kaemferol dilarutkan ke dalam 1 mL metanol) ditotolkan pada pelat silika gel, kemudian dielusi dengan eluen klorofom–metanol 9.75:0.25. Hasil elusi diamati di bawah lampu ultraviolet pada λ 366 nm.
6 Pengukuran Kadar Kaemferol dengan KCKT (Wang dan Helliwell 2001) Sistem KCKT Sistem yang digunakan meliputi, kolom C18, fase gerak 30% asetonitril dan 70% dapar KH2PO4 0.025 M yang ditambah H3PO4 sampai pH 2.5. Sistem elusi isokratik, dengan laju alir 1.0 mL/menit, dan luas puncak diukur pada 370 nm. Penyiapan Standar Standar kaemferol dan kuersetin masing-masing 5 mg dilarutkan dengan metanol untuk membuat larutan standar induk dengan konsentrasi 500 ppm, kemudian dibuat deret larutan standar dengan konsentrasi 5 dan 50 ppm. Larutan standar disaring dengan menggunakan kertas saring Millipore 0.45 µm. Larutan yang dihasilkan diinjeksikan sebanyak 20 µL ke dalam KCKT. Hidrolisis Sampel Ekstrak dihidrolisis dengan HCl 4 M, lalu dipartisi dengan etil asetat. Fraksi etil asetat ditampung, lalu diuapkan pelarutnya, kemudian dilarutkan dengan metanol. Larutan disaring menggunakan kertas saring Millipore 0,45 µm, lalu diinjeksikan sebanyak 20 µL ke dalam KCKT. Analisis sampel diulang 2 kali.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air Penetapan kadar air berguna untuk mengetahui ketahanan suatu bahan sehingga dapat diperkirakan cara penyimpanan terbaik untuk menghindari pengaruh aktivitas jamur (mikrob). Rerata kadar air serbuk daun sirsak kering sebesar 2.83%. Syarat kadar air untuk simplisia tanaman obat menurut Depkes RI (1995) tidak boleh lebih dari 10%. Kadar air yang terkandung lebih kecil dari 10% menunjukkan kestabilan optimum bahan akan tercapai dan pertumbuhan mikrob dapat dikurangi sehingga dapat memperpanjang masa simpan tanaman kering (Winarno 2002). Air yang terkandung dalam serbuk daun sirsak dihilangkan dengan pemanasan pada suhu 105 oC. Menurut Harjadi (1993), pemanasan pada suhu 100–105 oC akan menghilangkan air yang terikat secara fisis di dalam suatu bahan. Perhitungan kadar air disajikan pada Lampiran 3.
Ekstraksi Ekstraksi senyawa aktif dari tanaman obat adalah pemisahan secara fisis atau kimiawi dengan menggunakan cairan atau padatan. Pelarut alkohol telah banyak digunakan pada penelitian senyawa flavonoid sebelumnya. Pelarut alkohol lazim digunakan dalam proses ekstraksi awal karena kemampuannya melarutkan komponen polar maupun nonpolar (Harborne 1987). Daun sirsak dihaluskan hingga berukuran 80 mesh. Hal ini bertujuan meningkatkan luas permukaan sehingga ekstraksi berlangsung lebih efisien. Sebelum dilakukan beberapa uji,
7 ekstrak yang diperoleh dihitung rendemennya. Penentuan rendemen berfungsi mengetahui jumlah metabolit sekunder yang terbawa oleh pelarut tersebut, tetapi komponen yang terkandung tidak dapat diketahui. Tabel 1 Rendemen ektstrak dari daun sirsak dan residunya Sampel
Daun
Residu n-heksana
Residu etil asetat
Ekstraksi
Rendemen (%)
Maserasi Sonikasi Refluks Soxhletasi Maserasi Sonikasi Refluks Soxhletasi Maserasi Sonikasi Refluks Soxhletasi
10.04 9.16 6.88 18.64 9.67 9.81 6.11 17.36 3.18 4.09 4.73 12.76
Rendemen yang dihasilkan oleh setiap teknik ekstraksi pada residu ekstraksi menurun dibandingkan dengan pada serbuk daun (Tabel 1). Hal ini menunjukkan adanya beberapa senyawa yang terekstraksi dalam pelarut n-heksana dan etil asetat. Teknik soxhletasi menghasilkan rendemen paling tinggi karena teknik tersebut bersifat sinambung dan pelarut yang digunakan selalu dalam keadaan segar sehingga meningkatkan efektivitas ekstraksi. Setelah dihitung rendemennya, ekstrak diuji BSLT, kadar tanin, kadar total fenolik, dan total flavonoid, serta diuji KLT, dan KCKT. Perhitungan rendemen ekstrak daun dan residunya disajikan pada Lampiran 4.
Toksisitas Ekstrak terhadap Larva Artemia salina LC50 merupakan konsentrasi senyawa bioaktif yang dapat menyebabkan kematian 50% populasi hewan uji. Hasil uji BSLT pada Tabel 2 menunjukkan bahwa semua ekstrak daun sirsak memiliki nilai LC50 kurang dari 1000 ppm. Menurut Meyer et al. (1982), suatu ekstrak dikatakan toksik jika memiliki nilai LC50 kurang dari 1000 ppm setelah waktu kontak 24 jam, sedangkan menurut Krishnaraju et al. (2005), suatu ekstrak dikatakan aktif berpotensi sebagai antikanker jika nilai LC50 kurang dari 1000 ppm. Oleh karena itu, dapat dinyatakan bahwa ekstrak daun sirsak dari setiap teknik ekstraksi aktif dan berpotensi sebagai antikanker. Ekstrak soxhlet secara umum memiliki nilai LC50 yang paling rendah, hal ini menunjukkan bahwa ekstrak soxhlet memiliki nilai toksisitas yang paling tinggi. Perhitungan nilai LC50 ekstrak daun dan residunya disajikan pada Lampiran 5.
8 Tabel 2 LC50, fenolik total, dan flavonoid total ekstrak daun sirsak Ekstraksi
Maserasi Sonikasi Refluks Soxhletasi Maserasi Sonikasi Refluks Soxhletasi Maserasi Sonikasi Refluks Soxhletasi
LC50 (ppm)
Tanin (%)
Fenolik total (%)
Dari tahap ekstraksi daun secara langsung 13.94 ± 0.08 209.20 ± 13.89 7.59 ± 0.09 14.28 ± 0.05 128.49 ± 2.91 5.18 ± 0.12 10.35 ± 0.05 79.09 ± 1.52 4.98 ± 0.05 12.89 ± 0.08 46.07 ± 4.26 5.59 ± 0.06 Dari tahap ekstraksi daun residu n-heksana 10.41 ± 0.02 455.07 ± 14.05 4.93 ± 0.07 11.41 ± 0.04 150.56 ± 2.72 4.59 ± 0.16 8.69 ± 0.09 93.10 ± 4.46 6.24 ± 0.06 16.44 ± 0.02 152.40 ± 3.26 6.96 ± 0.08 Dari tahap ekstraksi daun residu etil asetat 9.63 ± 0.14 300.09 ± 5.86 4.84 ± 0.05 8.55 ± 0.11 647.98 ± 11.21 6.74 ± 0.17 6.16 ± 0.14 299.90 ± 7.09 6.87 ± 0.13 8.20 ± 0.06 197.64 ± 8.86 3.78 ± 0.05
Flavonoid total (%) 10.25 ± 0.03 4.46 ± 0.01 1.72 ± 0.03 7.05 ± 0.07 5.60 ± 0.11 4.50 ± 0.07 0.88 ± 0.01 2.27 ± 0.00 0.81 ± 0.01 1.12 ± 0.00 0.85 ± 0.00 0.63 ± 0.01
Kadar Fenolik Total Uji fenolik total dilakukan untuk mengetahui kadar senyawa polifenol di dalam daun sirsak. Prinsip dari metode ini adalah terbentuknya kompleks berwarna biru sebagai hasil reaksi antara senyawa fenolik dan reagen FolinCiocalteu yang dapat diukur absorbansnya pada panjang gelombang 765 nm. Senyawa fenolik bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu dalam suasana basa agar terjadi disosiasi proton pada senyawa fenolik menjadi ion fenolat. Untuk menciptakan kondisi basa tersebut, ditambah Na2 CO3 7,5% (Apsari dan Susanti 2011). Reaksi yang terjadi tidak spesifik, sehingga tidak dapat digunakan untuk membedakan jenis senyawa golongan polifenol. Warna larutan akan semakin pekat seiring dengan meningkatnya konsentrasi ion fenolat. Pada penentuan kadar fenolik total, digunakan larutan standar asam galat atau asam 3,4,5-trihidroksibenzoat (C6H2(OH)3CO2H) dengan variasi konsentrasi 10, 20, 30, 40, 50, dan 60 µg/mL, kemudian dibuat kurva kalibrasi (Lampiran 6). Persamaan regresi yang dihasilkan dari kurva kalibrasi standar digunakan untuk menghitung besarnya kadar fenolik total di dalam ekstrak berdasarkan besarnya absorbans. Hasil analisis disajikan pada Tabel 2. Kadar fenolik total pada residu etil asetat lebih rendah dibandingkan dengan ekstrak lain untuk setiap teknik ekstraksi. Ekstrak dengan total fenolik tinggi dipertimbangkan untuk digunakan pada tahap isolasi kaemferol.
9 Kadar Tanin Kadar tanin pada penelitian ini diukur dengan metode titrimetri menggunakan KMnO4 sebagai titran. Kadar tanin yang diperoleh dari setiap ekstraksi berbeda. Kadar tanin paling tinggi diperoleh pada ekstrak maserasi daun sirsak tanpa perlakuan soxhletasi n-heksana, sedangkan kadar tanin terendah yaitu ekstrak soxhsletasi residu etil asetat (Tabel 2). Secara umum, ekstrak residu etil asetat mengandung kadar tanin yang paling rendah. Hal ini menujukkan adanya sebagian tanin yang hilang ketika daun diekstraksi dengan pelarut etil asetat. Tanin merupakan salah satu metabolit sekunder yang terkandung dalam daun sirsak (Nurjanah 2014). Tanin termasuk ke dalam senyawa fenolik yang memiliki beberapa aktivitas, seperti antidiare, antikanker, dan anti–HIV (Sumarawati dan Hussaana 2010). Toksisitas tanin dalam ekstrak daun sirsak akan berpengaruh pada nilai LC50, sehingga kadar tanin dalam masing-masing ekstrak perlu ditentukan. Ekstrak dengan nilai LC50 rendah dan kadar tanin yang rendah dipertimbangkan untuk digunakan pada tahap isolasi kaemferol. Perhitungan kadar tanin ekstrak daun dan residunya disajikan pada Lampiran 7.
Kadar Flavonoid Total Uji total flavonoid dilakukan sebagai pendekatan yang baik dalam pemilihan teknik ekstraksi untuk isolasi kaemferol dari daun sirsak. Kaemferol merupakan senyawa golongan flavonoid, sehingga ekstrak dengan kadar total flavonoid tinggi dipertimbangkan untuk digunakan pada tahap isolasi kaemferol. Total flavonoid pada ekstrak daun diperoleh dengan cara memasukkan nilai absorbans ekstrak pada kurva standar kuersetin. Ekstrak dengan total flavonoid tertinggi yaitu ekstrak maserasi, namun nilainya menurun setelah dilakukan perlakuan soxhletasi dengan n-heksana dan etil asetat. Ekstrak refluks memiliki kadar total flavonoid yang paling rendah dibandingkan ekstrak yang lain (Tabel 2). Perhitungan kadar total flavonoid ekstrak daun dan residunya disajikan pada Lampiran 8. Flavonoid di alam berada dalam bentuk flavonoid glikosida, sehingga perlu dihidrolisis terlebih dahulu dengan penambahan suatu asam, yaitu HCl. Proses hidrolisis oleh asam akan memutus ikatan antara flavonoid dengan senyawa gula membentuk flavonoid aglikon yang bersifat lebih non polar, sehingga perlu dipartisi dengan pelarut etil asetat. Flavonoid aglikon akan membentuk kompleks berwarna dengan AlCl3 yang dapat diukur absorbansnya pada panjang gelombang 425 nm.
Identifikasi Keberadaan Kaemferol Kromatografi lapis tipis merupakan cara sederhana pada identifikasi senyawa flavonoid. Data yang diperoleh berupa harga Rf dan warna spot kromatogram. Prosedur uji dengan KLT dilakukan untuk mengidentifikasi adanya senyawa kaempferol di setiap ekstrak daun sirsak dengan cara membandingkan nilai Rf sampel dengan standar kaemferol. Selain untuk analisis kualitatif, uji KLT juga dapat digunakan sebagai uji semikuantitatif suatu senyawa dengan cara
10 membandingkan ukuran dan intensitas warna spot yang muncul antara sampel dan standar. Fase diam yang digunakan adalah silika gel yang dilekatkan pada pelat aluminium, sedangkan eluen yang digunakan adalah klorofom–metanol (9.75:0.25). Deteksi spot dilakukan dengan lampu UV 366 nm. Kromatogram yang dihasilkan dari uji KLT disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1 Kromatogram hasil uji KLT ekstrak daun sirsak dan residunya (dari kiri ke kanan), standar kaemferol, ekstrak maserasi daun, Ekstrak maserasi residu n-heksana, Ekstrak maserasi residu etil asetat, Ekstrak sonikasi daun, Ekstrak sonikasi residu n-heksana, Ekstrak sonikasi residu etil asetat, Ekstrak refluks daun, Ekstrak refluks residu n-heksana, Ekstrak refluks residu etil asetat, Ekstrak sokslets residu etil asetat, Ekstrak sokslets residu n-heksana, Ekstrak sokslets daun. Keberadaan kaemferol dalam ekstrak ditandai dengan adanya spot yang memiliki Rf yang sama dengan standar kaemferol. Rf standar kaemferol pada uji KLT ini adalah 0.10. Dilihat dari kromatogram yang dihasilkan, semua ekstrak mengandung kaempferol, tetapi jumlahnya berbeda. Ekstrak residu etil asetat mengandung kaemferol yang lebih sedikit dibandingkan dengan ekstrak daun sirsak yang lain. Hal ini dapat dilihat dari kepekatan warna spot yang lebih pudar dan ukuran spot yang lebih tipis. Ekstrak yang dihasilkan dari ekstraksi daun sirsak langsung, tanpa perlakuan soxhletasi n-heksana dan etil asetat menghasilkan banyak spot. Hal ini menunjukkan senyawa yang terekstraksi untuk setiap teknik ekstraksi tersebut lebih beragam dibandingkan dengan ekstrak daun sirsak residu n-heksana dan residu etil asetat, karena pada ekstrak residu nheksana dan etil asetat ada sebagian senyawa yang hilang ketika diekstraksi dengan pelarut n-heksana dan etil asetat. Adanya senyawa yang larut dalam nheksana dan etil asetat akan mengurangi jumlah senyawa yang tidak diinginkan. Hal ini lebih disukai, karena akan mempermudah tahap isolasi kaemferol. Kadar Kaemferol Analisis KCKT dilakukan untuk mengetahui kadar kaemferol dalam 5 ekstrak terpilih yaitu ekstrak maserasi, sonikasi, dan soxhletasi daun sirsak,
11 ekstrak maserasi dan sonikasi residu n-heksana. Selain kaemferol, senyawa kuersetin juga diukur kadarnya menggunakan KCKT. Kadar kaemferol dan kuersetin pada ekstrak diperoleh dengan cara memasukkan nilai luas puncak ekstrak pada kurva standar. Ragam konsentrasi standar yang digunakan yaitu 5, 50, dan 500 ppm. Hasilnya disajikan pada Tabel 3. Tabel 3 Kadar kaemferol dan kuersetin ekstrak terpilih Tahap ekstraksi Daun Residu n-heksana
Ekstrak
Kaemferol (ppm)
Kuersetin (ppm)
Maserasi Sonikasi Soxhletasi Maserasi Sonikasi
1.02 ± 0.01 0.84 ± 0.01 0.43 ± 0.01 1.11 ± 0.01 1.22 ± 0.01
0.42 ± 0.01 0.36 ± 0.01 0.19 ± 0.01 0.44 ± 0.01 0.50 ± 0.01
Kelima ekstrak yang diuji KCKT dipilih berdasarkan nilai LC50 yang rendah, kadar tanin yang rendah, kadar fenolik total yang tinggi, kadar flavonoid total yang tinggi, dan warna spot KLT yang pekat. Pada Tabel 3, kelima ekstrak yang diuji memiliki kadar kaemferol yang lebih tinggi dibandingkan kuersetin. Hal ini menunjukkan bahwa kadar kaemferol di dalam daun sirsak lebih tinggi dibandingkan kuersetin. Kadar kaemferol dan kuersetin terendah dari kelima ekstrak ialah dari ekstrak soxhletasi, sedangkan ekstrak dengan kadar kaemferol dan kuersetin tertinggi ialah dari ekstrak sonikasi residu n-heksana. Kromatogram dapat dilihat pada Gambar 2. Kromatogram ekstrak sonikasi residu n-heksana memiliki puncak yang paling tinggi. Pada teknik ekstraksi yang sama, kadar kaemferol dan kuersetin ekstrak residu n-heksana lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak daun. Perhitungan disajikan pada Lampiran 9.
uV
Kuersetin
Kaemferol
Standar 50 ppm Ekstrak maserasi daun Ekstrak maserasi residu n-heksana Ekstrak soxhletasi daun Ekstrak sonikasi daun Ekstrak sonikasi residu n--heksana
Waktu retensi (menit)
Gambar 2 Kromatogram larutan standar dan larutan ekstrak daun dan residunya Puncak pertama yang muncul menunjukkan senyawa kuersetin, sedangkan puncak kedua menunjukkan senyawa kaemferol. Menurut Wang dan Heliwell (2001), kuersetin memiliki waktu retensi yang lebih singkat dibandingkan kaemferol pada pengukuran KCKT fase terbalik, karena senyawa kuersetin bersifat lebih polar dibandingkan senyawa kaemferol. Sifat polar dari kuersetin
12 dipengaruhi oleh struktur kuersetin yang memiliki gugus hidroksil yang lebih banyak dari kaemferol (Gambar 3).
(a)
(b)
Gambar 3 Struktur kimia kaemferol (a) dan kuersetin (b)
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Teknik ekstraksi terbaik untuk mengisolasi kaemferol dari daun sirsak yaitu sonikasi dengan menggunakan pelarut metanol–air (85:15), sebelumnya daun sirsak disoxhlet dengan n-heksana. Ekstrak dari teknik ekstraksi tersebut mengandung 1.22% kaemferol dan 0.50% kuersetin.
Saran Disarankan fraksionasi terhadap ekstrak terbaik agar diperoleh senyawa kaemferol murni. Selain itu, disarankan pengujian toksisitas fraksi tersebut terhadap larva Artemia salina agar diketahui nilai LC50 senyawa kaemferol murni dan pengukuran kadar kaemferol hasil fraksionasi dengan KCKT sehingga diketahui kadar kaemferol sebelum dan sesudah fraksionasi.
DAFTAR PUSTAKA [AOAC] The Association of Official Analytical Chemist. 2006. Official Methods of Analysis. Ed ke-18.Washington DC(US): Association of Official Analytical Chemist. [Depkes RI] Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Materia Medika Indonesia. Jilid VI. Jakarta(ID): Direktorat Jendral, Pengawasan Obat dan Makanan. Apsari PD, Susanti H. 2011. Perbandingan kadar fenolik total ekstrak metanol kelopak merah dan ungu bunga rosella (Hibiscus sabdariffa, Linn) secara
13 spektrofotometri. Fakultas Farmasi dan Fakultas Kesehatan Universitas Ahmad Dahlan. Aziz AR, Hasneli Y, Woferst R. 2003. Efektifitas air rebusan daun sirsak (Annona muricata) terhadap kadar gula darah pada penderita diabetes mellitus tipe II. Bibliography 37(1): 1-10. Dewi LK, Widyarti S, Rifa‟I M. 2007. Pengaruh pemberian ekstrak etanol daun sirsak (Annona muricata L.) terhadap jumlah sel T CD4+ dan CD8+ pada timus (Mus musculus). Jurnal Biologi Univ. Brawijaya: 24-26. Erosa-Rejon G, Pena-Rodriguez LM, dan Sterner O. 2010. Isolation of kaempferol-3-rutinoside from the leaf extract of Sideroxylon foetidissimum Subsp. Gaumeri. Revista Latinoamericana de Quimica 38(1):8-11. Harborne JB. 1987. Metode fitokimia. Padmawinata K, penerjemah. Bandung (ID): ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methods. Krishnaraju AV, Rao TVN, Sundararaju D, Vanisree M, Tsay HS, dan Subbaraju GV. 2005. Assessment of bioactivity of Indian medicinal plants using brine shrimp (Artemcx ia salina) lethality assay. International Journal of Applied Science and Engineering. 3(2): 125-134. Loizzo MR, Said A, Tundis R, Rashed K, Statti GA, Hufner A, dan Menichini F. 2007. Inhibition of Angiotensin Converting Enzyme (ACE) by flavonoids isolated from Ailanthus excelsa (Roxb) (Simaroubaceae). Phytother. Res. 21(1):32-36. Mardiana L, Ratnasari J. 2011. Ramuan dan Khasiat Sirsak. Jakarta (ID): Penebar Swadaya. Mustariani BAA. 2011. Potensi kaempferol daun sirsak sebagai penghambat poliferasi sel kanker raji [tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Ozçelik B, Orhan I, Toker G. 2006. Antiviral and antimicrobial assessment of some selected flavonoids. Z Naturforsch C 61(9):632-638. Santos DYAC, Salatino MLF. 2000. Foliar flavonoids of annonaceae from Brazil: taxonomic significance. Phytochemistry 55(1):567-573. Sulastri T. 2009. Analisis kadar tannin ekstrak air dan ekstrak etanol pada biji pinang sirih (Areca Catechu. L). Jurnal Chemica. 1(10): 59-63. Tang Y, Lou F, Wang J, Li Y, dan Zhuang S. 2001. Coumaryl flavonol glycosides from the leaves of Ginko biloba. Phytochemistry. 58:1251-1256. Teffo LS, Aderogba MA, dan Eloff JN. 2010. Antibacterial and antioxidant activities of four kaempferol methyl ethers isolated from Dodonaea viscosa Jacq. Var. angustifolia leaf extracts. South African Journal of Botany. 76(2):25-29. Vega MRG. 2007. Flavonoids from Annona dioca leaves and their effects in Ehrlich carcinoma cells, DNA-topoisomerase I and II. Journal Brazzil Chemistry Society 18(8):1554-1559. Wahyuni WT. 2010. Pengoptimuman dan validasi sidik jari kromatografi cair kinerja tinggi ekstrak Phylanthus niruri L. [Thesis]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Wang H, Helliwell K. 2001. Determination of flavonols in green tea and black tea leaves and green tea infusions by high-performance liquid chromatography. Food Research International. 34(2): 223-227. Zang Y, Sato H, Igarashi K. 2011. Anti-diabetic effect of a kaempferol glycosiderich fraction from unripe soybean (Edamame, Glycine max L. Merrill.
14 „Jindai‟) leaves on KK-A mice. 2011. Biosci. Biotechnol. Biochem. 75(9):1677-1684. Zuhud E. 2010. Kanker Lenyap Berkat Sirsak. Jakarta: AgroMedia Pustaka.
15 Lampiran 1 Diagram alir penelitian Daun Sirsak
Serbuk 80 mesh
Ekstraksi
Sokslet (n-heksana)
Maserasi
Refluks Sonikasi
Residu
Soxhletasi
Maserasi
Refluks Sonikasi
Sokslet (etil asetat)
Residu
Maserasi
Refluks Sonikasi
Soxhletasi
Ekstrak
Rendemen, Uji BSLT, Uji Tanin, Uji Total Fenolik, Uji Total Flavonoid, Identifikasi Kaemferol dengan KLT
Analisis KCKT
Ekstraksi terbaik
Soxhletasi
16 Lampiran 2 Hasil determinasi sampel
17 Lampiran 3 Kadar air Ulangan 1 2 3 Rerata
Bobot cawan Bobot cawan + sampel (g) kosong (g) Awal Akhir 2.0305 1.9792 1.9641
5.0310 4.9801 4.9644
4.9457 4.8952 4.8801
Bobot sampel (g) Kadar air (%) awal akhir 3.0005 2.9152 2.84 3.0009 2.9160 2.83 3.0003 2.9160 2.81 2.83
Contoh perhitungan: Kadar air % =
bobot sampel awal - bobot sampel akhir ×100% bobot sampel awal =
(3.0005 - 2.9152)g ×100% 3.0005 g = 2.84 %
18 Lampiran 4 Rendemen Ekstraksi Maserasi Sonikasi Refluks Soxhletasi Maserasi Sonikasi Refluks Soxhletasi Maserasi Sonikasi Refluks Soxhletasi
Bobot sampel Wadah Wadah + Ekstrak (g) (g) kosong (g) ekstrak (g) Tahap ekstraksi daun sirsak langsung 100.0654 74.5622 84.3196 9.7574 99.9947 36.9106 45.8086 8.8980 100.0044 74.7527 81.4412 6.6885 100.0029 74.1997 92.3131 18.1134 Tahap ekstraksi daun sirsak residu n-heksana 49.9879 74.4350 79.1327 4.6977 50.0001 38.0991 42.8652 4.7661 49.9867 37.8473 40.8163 2.9690 50.0001 37.4319 45.8681 8.4362 Tahap ekstraksi daun sirsak residu etil asetat 100.0059 36.8917 39.9785 3.0868 50.0047 37.5489 39.5360 1.9871 50.0003 37.8950 40.1921 2.2971 49.9996 36.8634 43.0656 6.2022
Contoh perhitungan: Rendemen % =
bobot ekstrak × 100% bobot sampel × (100 − Kadar air) =
bobot ekstrak × 100% bobot sampel × (100 − Kadar air) =
9.7574 g × 100% 100.0654 g × (100 − 8.44)% = 10.04 %
Rendemen (%) 10.04 9.16 6.88 18.64 9.67 9.81 6.11 17.36 3.18 4.09 4.73 12.76
19 Lampiran 5 BSLT
Ekstrak
Maserasi
Sonikasi
Refluks
Soxhletasi
Maserasi
Sonikasi
Refluks
Konsentrasi Konsentrasi larutan induk ekstrak (ppm) (ppm)
Larva mati
I II III Tahap ekstraksi daun sirsak langsung 18.1000 2 3 2 36.2000 3 3 3 724 72.4000 5 5 6 434.4000 7 7 7 579.2000 8 8 8 64.6760 1 2 2 85.1000 3 2 3 3404 108.9280 4 4 4 129.3520 6 5 5 149.7760 6 6 6 44.3560 4 3 4 64.8280 5 5 4 3412 85.3000 5 6 5 109.1840 6 6 6 129.6560 6 7 7 12.2400 1 3 3 21.4200 4 4 4 612 39.7800 5 5 4 58.1400 6 6 6 76.5000 6 7 7 Tahap ekstraksi daun sirsak residu n-heksana 308.5600 3 4 3 406.0000 5 5 5 3248 519.6800 6 5 6 617.1200 6 7 6 714.5600 7 7 7 69.1600 1 2 2 101.0800 4 3 4 2128 133.0000 4 5 5 170.2400 5 6 5 202.1600 8 6 7 58.2400 5 4 5 108.1600 5 6 5 1248 266.2400 7 6 6 316.1600 8 7 6
LC50 rerata
209.20 ± 13.89
128.49 ± 2.91
79.09 ± 1.52
46.07 ± 4.26
455.07 ± 14.05
150.56 ± 2.72
93.10 ± 4.46
20
Soxhletasi
Maserasi
Sonikasi
Refluks
Soxhletasi
366.0800 9 7 7 80.8080 3 3 2 118.1040 4 4 4 3108 155.4000 5 5 4 189.9120 5 7 7 236.2080 8 7 8 Tahap ekstraksi daun sirsak residu etil asetat 124.0200 2 3 3 181.2600 3 4 3 3816 238.5000 4 4 4 305.2800 5 5 5 362.5200 6 6 6 320.8400 2 1 2 468.9200 4 4 3 4936 617.0000 5 5 5 789.7600 6 6 6 937.8400 7 8 8 123.1100 2 2 3 179.9300 3 3 4 3788 303.4000 5 5 4 359.8600 6 6 6 416.6800 7 7 7 116.2720 3 3 2 169.9360 4 3 5 4472 223.6000 5 6 6 286.2080 7 8 7 339.8720 8 9 9
152.40 ± 3.26
300.09 ± 5.86
647.98 ± 11.21
299.90 ± 7.09
197.64 ± 8.86
Contoh perhitungan: Persamaan regresi ekstrak maserasi daun sirsak langsung ulangan I y = a + bx y = 29.132 + 0.0915x x =
y − 29.132 0.0915
Nilai LC50 ekstrak maserasi 50 − 29.132 x = = 228.3600 ppm 0.0915
21 Lampiran 6 Kadar Tanin a) Standardisasi KMNO4 Ulangan 1 2 3 Rerata RSD
Volume asam oksalat (mL) 10.00 10.00 10.00
Volume H2SO4 Volume KMnO4 (mL) (mL) 5.00 9.95 5.00 9.95 5.00 10.00
Konsentrasi KMnO4 (N) 0.1007 0.1007 0.1002 0.1005 0.0002
Contoh perhitungan: Bobot asam oksalat = 0.3156 g KMnO4 =
bobot asam oksalat (mg) BE asam oksalat(mg/ekuivalen ) × volume KMnO 4 (mL) × FP 315.6 (mg) = 63 (mg/ekuivalen ) × 9.95 (mL) = 0.1007 N
b) Penentuan kadar tanin ekstrak daun sirsak Ekstrak
Maserasi
Sonikasi
Refluks
Soxhletasi
Maserasi
Bobot ekstrak Volume KMnO4 Ulangan Tanin rerata (%) (g) sampel (mL) Dari tahap ekstraksi daun 1 7.30 0.3916 7.59 ± 0.09 2 7.30 3 7.20 1 7.40 0.1157 5.18 ± 0.12 2 7.50 3 7.40 1 8.70 0.2758 4.98 ± 0.05 2 8.60 3 8.70 1 7.90 0.4169 5.59 ± 0.06 2 8.00 3 7.90 Dari tahap ekstraksi residu n-heksana 1 7.35 0.3488 4.93 ± 0.07 2 7.50 3 7.40
22 1 14.70 0.6624 2 14.20 3 14.80 1 18.20 0.3669 2 18.17 3 18.40 1 7.80 0.2685 2 7.70 3 7.80 Dari tahap ekstraksi residu etil asetat 1 7.90 0.3916 2 7.80 3 7.80 1 5.10 0.1157 2 5.20 3 5.20 1 16.60 0.2758 2 16.30 3 16.20 1 7.00 0.4169 2 7.10 3 7.10
Sonikasi
Refluks
Soxhletasi
Maserasi
Sonikasi
Refluks
Soxhletasi
Contoh perhitungan: Tanin % =
FP (A − B) × 0.00416 × 100% bobot ekstrak (g) =
10 (7.30 − 3.30) mL × 0.00416 × 100% 0.2187 (g) = 7.65%
4.59 ± 0.16
6.24 ± 0.06
6.96 ± 0.08
4.84 ± 0.05
6.74 ± 0.17
6.87 ± 0.13
3.78 ± 0.05
23 Lampiran 7 Kadar fenolik total a) Kurva kalibrasi Konsentrasi induk Volume induk (µg/mL) (mL) 0.20 0.40 0.60 502 0.80 1.00 1.20
Konsentrasi standar (µg/mL) 10.0400 20.0800 30.1200 40.1600 50.2000 60.2400
Absorbans 0.067 0.109 0.199 0.226 0.315 0.353
0.400 0.350
Absorbans
0.300 0.250
y = 0.005x + 0.004 R² = 0.984
0.200 0.150 0.100 0.050 0.000 0.0000
10.0000
20.0000
30.0000
40.0000
50.0000
60.0000
70.0000
Konsentrasi standar (µg/mL) Gambar Kurva Kalibrasi standar asam galat b)
Penentuan kadar fenolik total ekstrak daun sirsak Ekstrak Bobot ekstrak (g)
Maserasi
0.0226
Sonikasi
0.0192
Refluks
0.026
Ulangan
Absorbans
Dari tahap ekstraksi daun 1 0.321 2 0.323 3 0.320 1 0.278 2 0.280 3 0.277 1 0.272 2 0.272
Konsentrasi flavonoid (%)
13.94 ± 0.08
14.28 ± 0.05 10.35 ± 0.05
24
Soxhletasi
Maserasi
Sonikasi
Refluks
Soxhletasi
Maserasi
Sonikasi
Refluks
Soxhletasi
3 0.275 1 0.206 0.0158 2 0.208 3 0.209 Dari tahap ekstraksi residu n-heksana 1 0.266 0.0252 2 0.267 3 0.266 1 0.264 0.0229 2 0.266 3 0.266 1 0.212 0.0237 2 0.211 3 0.207 1 0.311 0.0187 2 0.311 3 0.312 Dari tahap ekstraksi residu etil asetat 1 0.254 0.026 2 0.250 3 0.259 1 0.194 0.0226 2 0.200 3 0.198 1 0.152 0.0248 2 0.158 3 0.160 1 0.170 0.0202 2 0.168 3 0.171
Contoh perhitungan ekstrak maserasi daun ulangan 1 Persamaan regresi y = a + bx y = 0.004 + 0.005x x =
y − 0.004 0.005
12.89 ± 0.08
10.41 ± 0.02
11.41 ± 0.04
8.69 ± 0.09
16.44 ± 0.02
9.63 ± 0.14
8.55 ± 0.11
6.16 ± 0.14
8.20 ± 0.06
25 Konsentrasi fenolik total (µg/mL) x =
0.321 − 0.004 = 63.4000 µg/mL 0.005
Konsentrasi fenolik total (g/g ekstrak) Konsentrasi fenolik (µg/mL) × 10−6 (µg/g) × volume sampel (mL) × FP × 100% bobot ekstrak (g) 63.4000 (µg/mL) × 10−6 (µg/g) × 25.00 (mL) × 2 = × 100% 0.0026 (g) = 13.94% =
26 Lampiran 8 Kadar flavonoid total a)
Kurva kalibrasi standar kuersetin
Absorbans
Tabel Standar kuersetin Konsentrasi Absorbans standar (ppm) 0.5000 0.015 1.0000 0.033 5.0000 0.183 10.0000 0.360 15.0000 0.539 25.0000 0.902
1.000 0.900 0.800 0.700 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0.0000
y = 0.0361x - 0.0017 R² = 1
5.0000
10.0000
15.0000
20.0000
25.0000
30.0000
Konsentrasi standar kuersetin (ppm) Gambar Kurva kalibrasi standar b)
Kadar total flavonoid sampel Ekstrak
Bobot Konsentrasi Rerata konsentrasi Ulangan Absorbans ekstrak (g) flavonoid total (%) (%)
Maserasi
0.2014
Sonikasi
0.2003
Refluks
0.2015
Dari tahap ekstraksi daun 1 0.598 10.30 2 0.593 10.22 3 0.594 10.24 1 0.513 4.45 2 0.516 4.47 3 0.514 4.46 1 0.202 1.75
10.25 ± 0.03
4.46 ± 0.01 1.72 ± 0.03
27
Soxhletasi
0.2007
Maserasi 0.2005
Sonikasi
0.2014
Refluks
0.2001
Soxhletasi
0.2014
Maserasi 0.2007
Sonikasi
0.2008
Refluks
0.2007
Soxhletasi
0.2006
2 0.194 1.68 3 0.200 1.73 1 0.827 7.15 2 0.811 7.01 3 0.809 6.99 Dari tahap ekstraksi residu n-heksana 1 0.665 5.76 2 0.637 5.51 3 0.640 5.54 1 0.532 4.59 2 0.514 4.43 3 0.518 4.47 1 0.286 0.87 2 0.291 0.88 3 0.294 0.89 1 0.398 2.27 2 0.398 2.27 3 0.398 2.27 Dari tahap ekstraksi residu etil asetat 1 0.254 0.79 2 0.264 0.82 3 0.262 0.81 1 0.392 1.12 2 0.392 1.12 3 0.389 1.12 1 0.278 0.85 2 0.279 0.85 3 0.280 0.85 1 0.180 0.61 2 0.188 0.63 3 0.188 0.63
Contoh perhitungan ekstrak maserasi daun
Konsentrasi flavonoid (ppm) y = 0.0361 − 0.0017x x =
y − 0.0017 0.0598 − 0.0017 = = 16.6122 ppm 0.0361 0.0361
7.05 ± 0.07
5.60 ± 0.11
4.50 ± 0.07
0.88 ± 0.01
2.27 ± 0.00
0.81 ± 0.01
1.12 ± 0.00
0.85 ± 0.00
0.63 ± 0.01
28
=
Konsentrasi flavonoid (%) Kons.(ppm)10−6 (L/mL)(g/mg) × 50mL × (25/10)(100/5) × FP × 100% Bobot ekstrak (g)
16.6122(mg/L)10−6 (L/mL)(g/mg) × 50mL × (25/10)(100/5) × 2 = × 100% 0.2014 (g) = 10.30%
Konsentrasi flavonoid rerata (%)
=
Konsentrasi flavonoid (ulg 1 + ulg 2 + ulg 3) 3
=
(10.30 + 10.22 + 10.24)% 3
= 10.25%
29 Lampiran 9 Kadar Kaemferol a) Pengukuran standar Larutan standar 5 ppm standar 50 ppm standar 500 ppm
Luas puncak Kuersetin Kaemferol 390065 317879 3678346 3121401 37557416 33031575
Konsentrasi (ppm) Kuersetin Kaemferol 4.9 5.1 49 51 490 510
Contoh perhitungan: Bobot standar kuersetin = 4.9 mg Bobot standar kaempferol = 5.1 mg Kons. std kuersetin =
Kons. std kaemferol =
b)
Bobot standar kuersetin (mg) 4.9 (mg) = = 490 ppm Volume labu (L) 0.01 (L) Bobot standar kaemferol (mg) 5.1 (mg) = = 510 ppm Volume labu (L) 0.01 (L)
Hasil pengukuran ekstrak Kaemferol
Tahap ekstraksi
Ekstrak Maserasi
Daun sirsak langsung
Sonikasi Soxhletasi
Daun sirsak residu nheksana
Maserasi Sonikasi
Ulg 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
Luas puncak Konsentrasi Konsentrasi rerata kaemferol (ppm) (%) 1922532 31.1091 1.02 ± 0.01 1910572 30.9250 1565765 25.6156 0.84 ± 0.01 1576024 25.7736 755217 13.1347 0.42 ± 0.01 748799 13.0355 2116288 34.0926 1.11 ± 0.01 2105359 33.9243 2335337 37.4656 1.22 ± 0.01 2321661 37.2550
30
Kuersetin
Tahap ekstraksi
Ekstrak
Ulg
Maserasi Daun sirsak langsung
Sonikasi Soxhletasi
Daun sirsak residu nheksana
Maserasi Sonikasi
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
Luas puncak Konsentrasi Konsentrasi rerata kuersetin (ppm) (%) 971690 13.0681 0.42 ± 0.01 950981 12.7981 831496 11.2403 0.36 ± 0.01 813647 11.0076 425147 5.9425 0.19 ± 0.00 425117 5.9421 1016299 13.6497 0.44 ± 0.01 999763 13.4341 1165572 15.5958 0.50 ± 0.01 1120115 15.0032
Contoh perhitungan: Ekstrak maserasi daun ulangan 1 Konsentrasi kaemferol (ppm) ekstrak maserasi Persamaan regresi : y = - 97788 + 64942.97 x y + 97788 1922532 + 97788 x = = = 31.1091 ppm 64942.97 64942.97 Konsentrasi kaemferol (%) Konsentrasi (ppm) × volume (mL) × 10−3 L/mL = × 100% Bobot ekstrak (mg) =
31.1091 (mg/L) × 10.00 (mL) × 10−3 L/mL × 100% 30.6 (mg)
= 1.02%
31
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 16 Desember 1991 sebagai putri ketiga dari almarhum Bapak H. Acu Sulaeman dan Ibu Hj. Mumung Kuswati. Penulis lulus dari SMA Negeri 6 Bogor pada tahun 2009 dan pada tahun yang sama diterima di Akademi Kimia Analisis (AKA) Bogor. Penulis lulus dari AKA Bogor dengan predikat Sangat Memuaskan pada tahun 2012 dan melanjutkan pendidikan S1 melalui Program Alih Jenis Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor (IPB) pada tahun 2012. Selama menjalani masa perkuliahan di AKA Bogor, Penulis pernah mengikuti kegiatan Pelatihan Pengantar Sistem Manajemen Lingkungan (ISO 14001) dan Pelatihan Pengantar Sistem Manajemen Mutu (ISO 9001:2001). Penulis melakukan Praktik Kerja Lapang di PT Aventis Pharma dengan judul laporan Analisis Tablet Antihistamin Siap Kemas di PT Aventis Pharma.
