Tartalomjegyzék
1. Bevezetés .............................................................................................................................................................3 2. A MexAB-OprM rendszer összetevőinek struktúrája ....................................................................................5 3. A gyógyszerkilökés mechanizmusa ...................................................................................................................7 4. Célkitűzések ........................................................................................................................................................9
5. Felhasznált sejtek, plazmidok és eljárások .................................................................................................... 10 5.1. Baktérium sejtek, plazmidok és növesztési körülmények ...................................................................... 10 5.2. PCR – Polimeráz láncreakció (Polymerase Chain Reaction) ................................................................. 12 5.3. Plazmid készítés ..................................................................................................................................... 13 5.4. Agaróz gél-elektroforézis ....................................................................................................................... 14 5.5. DNS transzformáció ............................................................................................................................... 14 5.6. Glicerin törzs (stock) készítése ............................................................................................................... 14 5.7. Fehérje expresszálása és ISOV gyártás .................................................................................................. 15 5.8. Fehérje-koncentráció meghatározás ....................................................................................................... 16 5.9. Fehérje tisztítás....................................................................................................................................... 16 5.10. SDS PAGE ........................................................................................................................................... 17 5.11. Élősejt-mérgezéses vizsgálat (Cytotoxicity Assay) .............................................................................. 17 5.12. Western Blot......................................................................................................................................... 18
6. Eredmények ...................................................................................................................................................... 19 6.1. Fehérje expressziós eredmények ............................................................................................................ 19 6.2. Az OprM mutánsok ................................................................................................................................ 20 6.3. Vizsgálati eredmények ........................................................................................................................... 24 6.4. Saját fejlesztésű Western Blot detektálás ............................................................................................... 27
1
7. Összefoglalás ..................................................................................................................................................... 30 8. Köszönetnyilvánítás ......................................................................................................................................... 32
9. Függelék ............................................................................................................................................................ 33 9.1.Vegyszerek és rövidítések ....................................................................................................................... 33 9.2. Az OprM és mutánsai His-tag mentes aminosav szekvenciája .............................................................. 39
10. Referenciák ..................................................................................................................................................... 40 11. Megjegyzések .................................................................................................................................................. 42
2
1. Bevezetés Az antibiotikumok korának hajnalán egy ismert állatorvos, James Herriot úgy írta le a penicillin hatását egy beteg birkán, hogy „A csoda a szemünk láttára zajlik le”. Sajnálatos módon azonban napjainkban jelentősen szűkülni kezdenek az antibiotikumok használatának lehetőségei, mivel azok a kórokozók, amelyek ellen a gyógyászatban alkalmazták őket, többnyire rezisztenssé váltak az alkalmazott antibiotikumokra. Az egyik ilyen baktérium a Gram negatív aerob Pseudomonas aeruginosa [1].
A
rángógörcsben szenvedő betegek legnagyobb halálozási rátáját ez a baktérium okozza [2]. A krónikus betegeknél
a tüdő mélyebb járataiban is megjelenő
kiterjedt, nyálkás
baktériumtelepek lényegében kiirthatatlanok, mivel antibiotikum rezisztensek. A P. aeruginosa rengeteg fertőzést okoz a legyengült immunrendszerrel rendelkezők esetében, mint pl. a HIV- és rákbetegeknél, és a súlyos égési sérülést szenvedőknél. Az utóbbi két esetben a fertőzés valószínűsége igen nagy (50% körüli). A baktérium mérgező fehérjéket termel, ami gyengíti a páciens immunrendszerét, és károsítja a szöveteket: így például a szembe kerülve vakságot okozhat [3]. Az antibiotikum rezisztenciáért két fő oka van: a sejtmembrán nehéz átjárhatósága, és az úgynevezett gyógyszerpumpák (drugpump) [4]. A P. aeruginosa könnyen további hatóanyagokkal szemben képes rezisztenciát kifejleszteni. Így ez jelentősen megnehezíti a fertőzések hatásmechanizmusának vizsgálatát főként azért, mert egyetlen gyógyszerre való rezisztencia keresztrezisztenciával több gyógyszerrel szemben is ellenállóvá teszi a sejtet [3]. A gyógyszerrezisztencia kialakulásában a gyógyszerpumpa játssza a legfőbb szerepet, hiszen hiába tennénk átjárhatóbbá a sejtfalat, ha a pumpa minden hatóanyagot kipumpál a sejtből, a gyógyszer semmilyen gyógyító hatást nem fog tudni kifejteni. Néhány pumpa csak a specifikus gyógyszereket, gyógyszercsoportokat ismeri fel, míg a gyógyszerrezisztenciáért felelős pumpák képesek felismerni a gyógyszerek széles skáláját és eltávolítani azokat a sejtből. Így képesek a sejten belüli gyógyszerkoncentrációt a toxikus szint alá csükkenteni, ezáltal bármiféle gyógyszeres kezelés hatástalanná válik. A Gram negatív baktériumokban, mint az Escherichia coli és a Pseudomonas aeruginosa a gyógyszerrezisztenciát aktív és passzív részből álló makromolekuláris pumpák segítik elő [5]. Ezek a rendszerek a következő részekből állnak: belső membrán komponens, csatornaképző külső membrán faktor és egy periplazma-beli fúziós membránfehérje. Ezzel meg is teremtik a közvetlen kapcsolatot a külső térrel a két membránon át. 3
A Pseudomonas aeruginosa-ban több háromkomponensű szerkezetet azonosítottak. A legjobban karakterizált és a gyógyszerrezisztenciáért leginkább felelős a sejtmembránokon áttörő MexAB-OprM rendszer [1.Ábra].
1.Ábra: MexAB-OprM rendszer felülnézeti modellje.
Jelen kutatás hosszú távú célja, hogy megértsük a MexAB-OprM pumpa szerkezetét, működését, és ezek után olyan gyógyszereket tudjunk tervezni, amelyek hatásosan veszik fel a harcot a gyógyszerrezisztenciáért felelős pumpákat tartalmazó baktériumokkal.
4
2. A MexAB-OprM rendszer összetevőinek struktúrája A MexAB-OprM rendszer szerkezetét röntgen-diffrakcióval határozták meg (PDB: 1WP1) [6]. Az egyes alkotóelemeket külön-külön állították elő, majd fehérje kristályt növesztettek belőle, végül röntgen-diffrakcióval megállapították térszerkezetüket. Így derült ki, hogy az OprM tag 100Å magas, és 6-8Å széles hordó alakú résszel rendelkezik [7]. A MexA és MexB (PDB: 1VF7 és 2V50) [6] térszerkezetét is röntgen-diffrakcióval térképezték fel [8,9].
2. Ábra: A két membrán között elhelyezkedő MexA (kék), a belső membránban található MexB (sárga) és a külső membránban található OprM (zöld) pumparendszer szerkezeti modellje a röntgen-diffrakciós szerkezetekből felépítve. (PDB: 1VF7, 2V50, 1WP1)[6]
5
MexA A MexA egy periplazma-beli összekapcsoló fehérje négy, lineárisan rendezett szubdoménből (kompakt, kvázi-független feltekeredési egységből) áll: α-helikális rész, egy lipoil domén, egy β-hordó és egy β-kanyar. Az α-helikális rész egy tipikus coiled-coil (csavart csavar) szerkezet [2.Ábra] [7].
MexB A korábbi kutatásokból már kiderült, hogy a MexB trimereket alkot [8,11]. A 3. ábra az egész MexB trimer struktúráját ábrázolja a membrán síkjából nézve. A három kiemelkedő domén, és a belső membrán körülbelüli pozíciója is fel van tüntetve. Egy MexB monomer ki van színezve [2.Ábra].
OprM A MexB taghoz hasonlóan az OprM is trimereket alkot, két doménnel [9]: membránkötődési ponttal rendelkező β-hordó és az üregformáló α-hordó. Az α-hordó egy αhélixekből álló gyűrű, ami elszigeteli az oldószerrel telt üreget a periplazmától. A fehérje periplazma felöli vége össze van szűkülve, hogy meggátolja a gyógyszer bármiféle mozgását mindaddig, amíg a konformációs változások következtében egy nyitott állapot nem jön létre [2.Ábra]. Amit a MexAB-OprM komplex funkcionalitásáról tudunk, nagy mértékben az Escherichia coli-ban
megtalálható AcrAB-TolC gyógyszerpumpáról szerzett ismeretekből merítjük
[10].A MexB és az AcrB homológiát mutat. A MexA és OprM fehérjéknek is van E.coli -ban előforduló megfelelője: AcrA és TolC.
6
3. A gyógyszerkilökés mechanizmusa
A kristályszerkezetek és az AcrAB-TolC modelljei kínálnak belátást abba, hogy egy proton hogyan aktiválja a pumpát. Valószínűsíthetőleg a MexAB-OprM azonos mechanizmus alapján működik. A legújabb bizonyítékok alátámasztják egy perisztaltikus pumpa modelljét [10] (5. Ábra). Az AcrB kristályszerkezetében a trimer három monomerje nagyjából azonos konformációval bír, és három állapotot vehet fel, amelyek ciklikusan váltják egymást. Trimerenként csak egyetlen monomer (a kötő monomer) képes szubsztrátot megkötni. Másik monomer a kilökő monomer. A harmadik a szubsztrát kilökődése utáni fázisban lévő monomer átmenetet mutat a két állapot között (átengedő állapot). A kilökő monomer központi α-hélixe közel 15o-ban hajlik a kötő monomer felé. Ez nyitja fel a kötő monomer kötő oldalát a szubsztrát bejáratához, majd a kilökő monomer becsapódásával lehasítja, és kilöki a szubsztrátot a TolC hordója felé. A gyógyszer belépése a periplazmából kötő és belépési állapotban engedélyezett, kilökő állapotban gátolt. A három különböző konformáció lehetővé teszi a három lépéses mechanizmust, melyhez proton-aktiváció szükséges. A TolC kinyílása valószínűsíthetően az AcrA-val történő kötődésből adódó konformációváltozás hatására történik meg [5.Ábra]. A gyógyszerkilökő mechanizmus első lépésében a szubsztrát belép az átengedő monomer előcsarnokába. Ezek után a monomer kötési állapotra vált, és a gyógyszer áttranszportálódik a hidrofób kötési zsákba. Végül a monomer a kilökő állapotba vált, és a gyógyszert továbbítja a TolC felé. Proton átjutása segíti a konformációs átrendeződést a kilökési állapotból az átengedő állapotba. A pumpába passzív módon a citoplazmából is be tud áramlani a szubsztrát, így a citoplazmából és a periplazmából is el tudja távolítani a mérgező anyagot a pumpa.
7
5. Ábra: a, Sematikus felülnézeti kép az ArcB trimerjéről, a perisztaltikus pumpa mechanizmusáról. b, Sematikus oldalnézeti kép a kötő és kilökő monomer, és a transzlokálódott proton útjáról. [12,13,14]
8
4. Célkitűzések A gyógyszer-rezisztencia hatalmas akadálya annak, hogy a Pseudomonas aeruginosa által fertőzött betegek rendesen kezelhetőek legyenek. A nagy telepekben megjelenő baktérium főként a benne található aktív gyógyszerpumpának köszönhetően antibiotikum-rezisztenssé válik, ezért az általánosan használt antibiotikumok hatástalanná váltak, így egyre sürgetőbb egy új, specifikus gyógyszer kifejlesztése, amelyet a pumpa rezisztencia-mechanizmusa nem tud eltávolítani a sejtből. Annak érdekében, hogy kifejlesztésre kerülhessen egy antibiotikumrezisztenciát
megszüntető
anyag,
először
tanulmányozni
kell
a
MexAB-OprM
gyógyszerpumpát. A projekt célja:
-Expresszálni az OprM fehérjét -Két további mutáns OprM-et kódoló plazmid előállítása -Az így létrehozott fehérjét kódoló DNS-eket bejuttatva más sejtekbe, élősejt-mérgezéses vizsgálatokat végezni.
A távolabbi cél, hogy a már meglévő MexA-MexB fehérjekomplexre sikerüljön a harmadik tagot is in vitro rákötni, így előállítva a MexAB-OprM pumpát. Az előzetes kutatások alapján kiderült, hogy ehhez minél nyitottabb kapcsolódási véggel rendelkező OprM molekulák szükségesek. Ezért mutáljuk a vad-típusú OprM-et kódoló plazmidot, majd a nyitottság mértékéről élősejt-mérgezéses vizsgálatokkal győződünk meg.
9
5. Felhasznált sejtek, plazmidok és eljárások 5.1. Baktérium sejtek, plazmidok és növesztési körülmények Ebben a kutatásban használt E.coli sejtek és plazmidok az 1. és 2. táblázatban vannak összefoglalva. A MexA, MexB és OprM fehérjéket kódoló plazmidok mindegyike tartalmazott egy antibiotikum rezisztencia markert, egy IPTG-vel [Függ.] (izopropil-β-Dtiogalaktopiranozid) indukálható fehérjetermelő rendszert, és egy 6 hisztidinből álló hisztidin toldalékot (His-tag). Az alkalmazott antibiotikum a Kanamycin [Függ.] (25µg/ml, Fluka). Minden egyéb anyag (ha más nincs feltüntetve) Sigma termék. A növesztéshez használt táptalajok minden esetben autoklávban voltak sterilizálva. Az autokláv egy olyan berendezés, mely nyomás alatt vízgőzzel sterilizál. Lényege, hogy a vizet 126oC -ra hevíti, majd 15 percig tartja a hőmérsékletet. Ez alatt a bele helyezett folyadék, vagy edény sterilizálódik. A folyamat végén a berendezés visszahűl. A C41(DE3) sejteket a pOprMH-t kódoló DNS-el fehérje expresszálásra Luria Bertani (LB) medium (FormediumTM) táptalajban növesztettem, amihez kanamycint (25μg/ml-végleges koncentráció) adtam. A sejtszaporítást 37°C-on 200rpm fordulatszámú, rázató inkubátorban végeztem.
1. Táblázat: Az általam alkalmazott E. coli sejtek E. coli sejt
Jellemzés
Referencia / Forrás
DH5α
Klónozásra
Bioline
C41(DE3)
Speciálisan fehérje expresszálásra és membrán-proteinek termelésére
BL21(DE3)
Fehérjék expresszálására
BW25113
Élősejt mérgezéses vizsgálatokhoz
ΔTolC (DE3)
(Cytotoxicity assay)
10
Miroux and Walker (1996)
Promega
H. Venter
2.Táblázat: Az előállított plazmidok
Plazmid
Jellemzés
pET41a(+)
Kontroll plazmid
Rezisztencia
Referencia /
marker
Forrás
Kanamycin
Novagen
MexA pET41a(+)-be pMexAH
klónozva 28b(+) N-terminális His-tag, és trombin hasítási
Venter H Kanamycin
(nem publikált)
hellyel OprM pET 41a(+)-be pOprMH
klónozva C-terminális 6-His
Venter H Kanamycin (nem publikált)
toldalék
pOprMH Y421F
pOprMH D433A
pOprMH Y421F
Kanamycin
pontmutációval
pOprMH Y421F
Kanamycin
pontmutációval
11
Ebben a tanulmányban
Ebben a tanulmányban
5.2. PCR – Polimeráz láncreakció (Polymerase Chain Reaction) A folyamat során néhány azonos DNS láncból több százezer, vagy millió darabot állíthatunk elő. Az eljárás a termális ciklusokon alapszik, amely felfűtések és lehűtések sorozata. A primerek (rövid DNS szakaszok) elengedhetetlen fontosságúak az eljáráshoz. Láncreakciónak azért nevezhetjük, mivel a DNS exponenciálisan növekvő mennyiségben keletkezik. Az általam végzett PCR termeléshez 1µl 1mM előre (forward) és 1µl 1mM vissza (reverse) primer, 20 µl 10xPfu puffer, 8µl 10mM dNTP mix (dNTPs)[Függ.], 3 µl DNS, és a legvégén 4µl Pfu [Függ.] enzim (mind Stratagene termék) szükséges. Ezeket összeelegyítve egy kis Eppendorfba raktam, majd egy PCR gépbe tettem (Eppendorf Mastercycler Gradient). A fűtési ciklus a következő: denaturáció
94oC
120s
denaturáció
94 oC
30s
anelláció
55 oC
30s
elongáció
68 oC
240s
1X
elongáció
68 oC
420s
∞
hűtés
4 oC
∞
1X
25X
Az Oprm-et kódoló DNS már rendelkezésemre állt (kanamicin rezisztens génnel), amikor elkezdtem a kutatást, de a két mutánst még elő kellett állítani. A PCR során 55 oC-on a következő oligonukleotidokat (primereket) használtam: OprM Y421F mutánshoz F: 5’ GACAAGCGCTTTCGCACGGGGGTGGACAAC 3’ R: 5’ CCCCGTGCGAAAGCGCTTGTCGGCGAGC 3’ OprM D433A mutánshoz F: 5’ GACCCTGCTCGCCGCGCAACGCTCGCTGTTC 3’ R: 5’ GCGTTGCGCGGCGAGCAGGGTCAGGTAG 3’
12
A termelés 55oC-os anellációs hőmérsékleten történt [6.Ábra].
6.Ábra: Pontmutáció előidézése: a, Pontmutáció helyét kiválasztom b,c, A mutációt tartalmazó forward F (előre) és reverse R (hátra) primerek a megfelelő helyre jutnak és kicserélik az eredeti DNS részletet Pfu polimeráz segítségével d, Létrejön a pontmutációt tartalmazó DNS
5.3. Plazmid készítés A plazmid egy extrakromoszomális kettős szálú DNS molekula. Az OprM-et kódoló DNSt már régebben
pET41a(+) (Venter H, nem publikált adat) sejtekbe transzformálták. A
plazmidot pHOprM-nek neveztem el, és JM109-es E. coli sejtben szaporítottam.A kinyert plazmidot szekvenáltattuk, hogy megbizonyosodhassak róla, hogy tényleg a megfelelő mutáns aminosav-szekvenciáját tartalmazza. A megfelelő, plazmid készítésre optimalizált E. coli BL21(DE3) és C41(DE3) sejtekbe transzformáltam. Agaróz gél elektroforézishez a plazmidot a Sigma GenElute Plasmid Miniprep Kit-tel tártam fel.
13
5.4. Agaróz gél-elektroforézis A DNS és RNS láncok méret szerinti elválasztását és detektálását lehetővé tevő folyamat. Lényege, hogy etídium-bromidos (karcinogén és mutagén) [Függ.] agaróz mátrixban az elektromos tér hatására a negatívan töltött DNS és RNS molekulák a pozitív töltés felé mozdulnak el. Nagyobb méretű DNS láncok lassabban, a kisebb méretűek gyorsabban képesek vándorolni az agaróz mátrixban. Így megfelelő idő elteltével szeparálódnak tömeg (és alak) szerint. Detektálásuk optikailag, UV fényben történik, mivel a DNS-hez hozzákötődik az etídium-bromid, ami UV fényben lumineszkál. A DNS-t elektroforézis útján mutattam ki, 1%-os agaróz gél mátrixban, amelyhez 1,5µM etídium-bromidot adtam. A futtató puffer TAE puffer (89mM Tris bázis, 89mM ecetsav, 2mM EDTA [Függ.]). A futtató berendezés a Bio-Rad gyártmányú. A DNS nagyságát 1kb DNA Ladder (Promega) segítségével határoztam meg. 5.5. DNS transzformáció Az a folyamat, mely során a kompetens sejtbe (olyan sejt, ami képes arra, hogy környezetéből DNS-t vegyen fel) az idegen DNS-t bejuttatjuk. A BL21 (DE3) és C41 (DE3) kompetens E. coli sejtekbe a következőképpen transzformáltam a plazmidot: 1µl plazmidot adtam 100µl kompetens sejtszuszpenzióhoz. Ügyelve, hogy a sejteket nagyon óvatosan kezeljem a teljes eljárás folyamán. Jégen tartottam 30 percig, majd hősokkot alkalmaztam: 42°C-os vízben tartottam 45 másodpercig, ezzel késztetve a sejteket arra, hogy felvegyék a plazmidot. Majd 2 percig szobahőmérsékleten állni hagytam. Mindezek után 800µl SOC [Függ.] táptalajt adtam hozzá, és inkubátorban 37°C-on rázattam 110rpm-mel 60 percen keresztül. Ezek után a sejtek már készen álltak arra, hogy kikenjem LB medium agar [Függ.] lemezre. Az agar lemezekre kikent baktériumokat 37°C-on növesztettem egy éjszakán át. Az egyedi kolóniákat egyenként 5ml kanamycines (25µg/ml – végleges koncentráció ) LB medium [Függ.] táptalajba tettem. 5.6. Glicerin törzs (stock) készítése A kanamycines (25µg/ml) LB medium táptalajban felnevelt sejtekből 500µl-t és 50%-os 500µl glicerinből törzs szuszpenziót (stockot) készítettem, melyet -80oC-on tároltam, hogy később is kikenhessem, és szaporíthassam a sejteket, hogy bármikor reprodukálhatóak legyenek a kísérletek.
14
5.7. Fehérje expresszálása és ISOV gyártás Fehérje biológiai előállítása élő sejtekben. OprM expresszálásához a C41(DE3) sejteket használtam. LB táptalajt kevertem, és autoklávozás után kanamycint (25µg/ml) adtam hozzá. Az egész éjszakán át szaporított sejtekből 2ml-t fecskendeztem minden mintához, majd szobahőmérsékleten szaporítottam a sejteket 200rpm-el rázatva, mindaddig amíg elérték az OD660 ~0.8 értéket (OD: Optikai denzitás. A fényabszorbanciás mérés eredménye arányos a vizsgált folyadékban lévő élő sejtek mennyiségéve.). Ekkor indukáltam IPTG-vel [Függ.] (1mM). A folyamat, során egy kémiai anyaggal (IPTG) arra kényszerítünk egy sejtet, hogy szaporodás helyett főként a célfehérjét termelje meg. 2 óra múlva a sejteket centrifugálással kiülepítettem (Beckman GS3 rotor,15 perc, 6500rpm, 4oC). A sejteket újra felszuszpendáltam 0,1M KPi
[Függ.] pH=7,0 oldattal. Újra
lecentrifugáltam a sejteket (Beckman GS3 rotor 25perc, 4000rpm, 4oC). A felülúszót leöntöttem, majd a sejteket ismét felszuszpendáltam 0,1M KPi pH=7,0 oldattal, majd DNáz [Függ.] (10μg/ml) és 10mM MgSO4 hozzáadása után a szuszpenziót kétszer átvezettem egy ún. French pumpán (French press) mindig jégen hűtve (Basic Z 0,75-kilowatt Benchtop Cell Disruptor, Constant Systems, Northants, UK) 20 kPsi (138MPa) nyomást alkalmazva. Ez egy olyan berendezés, amelynek működésének lényege, hogy a belehelyezett mintát egy dugattyúval nagy (20-50 kPsi) (138-337 MPa) nyomással megnyomja, és egy tű hegyén préseli keresztül. Ekkor a minta hirtelen nyomáscsökkenést szenved, és a benne található sejtek roncsolódnak. A sejtek ekkor úgynevezett ISO ( In-Side Out – Kifordított) sejtekké és sejttörmelékké változnak, amit több biokémiai in vitro vizsgálatban használnak. A pumpa alkalmazását követően 15 percig szobahőmérsékleten hagytam, hogy hasson a DNáz. Először lassabb centrifugálást alkalmaztam, hogy a sejttörmelék kiülepedjen (Evolution RC26 SS34 rotor,10000 rpm, 10 perc, 4°C). A felülúszót újra lecentrifugáltam nagy sebességgel (Evolution RC26 Ti70 rotor, 40000 rpm, 40 perc, 4°C). A leülepedett anyagot 50mM KPi pH=7,0 oldattal felszuszpendáltam, mely még 10% glicerint is tartalmazott. 20µl-t elraktam fehérje koncentráció meghatározásra, és SDS gélelektroforézisre. A maradékot 1,5ml-es részletekben hűtőben -80oC-on tároltam későbbi felhasználásra.
15
5.8. Fehérje-koncentráció meghatározás A fehérjekoncentrációt a Bio-Rad DC Protein Assay Kit-tel határoztam meg. Hígítási sort készítettem (standard), majd a készletben lévő anyagokkal elvégeztem a reakciót (a meghatározandó anyaggal is). Ez egy színváltozással járó reakció, amely során karakterisztikus kék színű oldat jön létre, így spektrofotométerrel vizsgáltam a mintákat 750nm-en az oldatok fény-abszorbanciáját. Az így kapott értékkel kalibráló egyenest tudtam számolni, majd ebből az ismeretlen fehérjekoncentráció is könnyedén kiszámolható volt. 5.9. Fehérje tisztítás A fehérjéket az ISOV-ből ( In-Side Out Vesicle – Kifordított sejt: a French pumpa hatására létrejövő kifordított sejt-hólyagok) nyertem ki. A fehérje tisztításhoz szükséges gyantát háromszor, ötszörös gyantatérfogatú ioncserélt vízzel mostam (MilliQ készülékkel ionmentesítve), hogy az esetleges alkoholmaradványokat eltávolítsam a gyantából, ami denaturálhatná a fehérjémet. Ezután egyensúlyba hoztam a gyantát: kétszer mostam ötszörös gyantatérfogatú A mosó pufferrel [Függ.]. A gyantát mindig gravitációs úton szedimentáltam. Az elroncsolt sejteket (5mg/ml) szolubilizáló pufferben [Függ.] rázattam jégen hűtve egy órán keresztül, hogy szolubilizáljam a fehérjét a membránból. A szuszpenziót lecentrifugáltam, hogy eltávolítsam a fel nem oldódott fehérjét (Evolution RC26 Ti70 rotor, 40 perc, 45 000 rpm, 4°C). A felülúszót a Ni-NTA gyantán szűrtem, miközben a célfehérjém rákötődött (1ml gyanta / 10mg His toldalékos fehérje). Azért alkalmaztam ezt a gyantát, mivel a Ni2+ ion a célfehérjémben is fellelhető His-tag toldalékhoz tud koordinálódni, így megkötve a tisztítandó fehérjét. Majd a gyantát hússzoros gyanta térfogatú A mosó pufferrel, majd 30-40 gyanta térfogatú B mosó pufferrel mostam [Függ.]. Az imidazol kompetitív kötődéssel leszorította a fehérjét a gyantáról: A gyantát kétszeres gyanta térfogatú hasító pufferrel [Függ.] mostam, és 500µl tisztított fehérje oldatot gyűjtöttem.
16
5.10. SDS-PAGE SDS poli-akrilamid gél elektroforézis (SDS PAGE). Poli-akrilamid gélt készítettem (alul szeparáló gél, fölül koncentráló gél). Az alkalmazott, rövidítéssel feltüntetett anyagok a [Függ.]-ben is fellelhetők. Törzsoldat
Szeparáló gél
Koncentráló gél
3,75ml
0,625ml
3,75ml (pH=8,8)
1,25ml (pH=6,8)
10% SDS
150µl
50 µl
H2O
7,2ml
3ml
10% APS
75µl
25 µl
TEMED
23µl
5 µl
40% akrilamid bis mix 1,5M Tris puffer
A fehérje méretét a 175kDa (New England Biolabs) marker segítségével határoztam meg. A cellát Bio Rad készülékben állítottam össze. A gélt Coomassie Blue oldattal festettem meg (0.1% Coomassie
Brilliant Blue, 45%
metanol,
10%
ecetsav).
A
gélt
ezután
tintamentesítettem (10% metanol, 10% ecetsav, H2O) 5.11. Élősejt-mérgezéses vizsgálat (Cytotoxicity Assay ) A megfelelő plazmidot tartalmazó E. Coli sejteket kanamycines (25µg/ml) LB medium táptalajban neveltem 1 órán keresztül 96 lyukú mikro tálcán végeztem a kísérletet. Minden lyukba 100µl kanamycines (25µg/ml) LB táptalajt mértem. Az első oszlopba 250µg/ml végső koncentrációban, és minden egyes következőbe az előtte lévő fele végső koncentrációnyi mérgező anyagot raktam. Az utolsóba nem raktam mérgező anyagot. A három mérgező anyag: etídium-bromid, novobiocin, oxacillin (A novobiocin és az oxacillin antibiotikumok [Függ.], és mivel ezekre az antibiotikumokra nem volt rezisztencia kódolva a sejtek DNS-eiben, így sejtjeinkre nézve mérgezőek). Ezeket külön-külön alkalmaztam. Végül 100-100µl növesztett sejtet is hozzáadtam az egyes lyukakhoz. Természetesen előtte minden sejtet tartalmazó oldatnak megnéztem az OD-ját 660nm-es hullámhosszon, és egyforma koncentrációra hígítottam őket. 17
A tálcákat 37oC-os rázó inkubátorba raktam 22 órán keresztül 150rpm-en. 22 órányi szaporítás után a Versa Max microplate reader nevű géppel leolvastam a tálca minden egyes lyukában lévő folyadék fény-abszorbanciáját 620nm-es hullámhosszon. Azért ezeket a mérgező anyagokat használtam, mivel így egyszerre 3 különböző mérgezési formát is kipróbálhattam, hiszen az etídium-bromid mutagén, az oxacillin a sejtfal szintézisét gátolja, míg a novobiocin ATPáz gátló antibiotikum. 5.12. Western Blot Ezt az eljárást arra használjuk, hogy kis mennyiségű fehérjét is ki lehessen mutatni. Az eljárás során először a kimutatandó fehérje oldatból kivett mintát SDS gélelektroforézissel szeparálom. A gélt transzfer pufferbe áztatom 10 percre (Western Blot Transfer buffer, 10X, Pierce), majd egy előre gyártott elektroforizáló tálcába helyezem, melyben már az a membrán is benne van, amelyre a fehérjét át akarjuk vinni (iBolot Transfer Mini Stack, Invitrogen), és iBlot (Invitrogen) gépen a 7 perces programmal a membránra juttatom a fehérjét. A membránt ezek után 25ml TBST [Függ.] oldattal mosom, amely 5% tejport tartalmaz (frissen elkészítve, 30 percig). Ezt követően kétszer 10 percig TBST oldattal mosom a membránt, majd egész éjszakán át 4oC-on 5ml TBST oldatban rázatom, mely 1/1000 arányban His-antitestet tartalmaz. Másnap háromszor mosom a membránt 10 percig TBST-vel, majd 25ml TBST oldatba áztatom 1 órára, amely 1/5000 arányban anti-egér antitestet tartalmaz. Ezt követően ismét háromszor mosom a membránt 10 percig TBST-vel. Végül 2-2ml kemolumineszcens készletben található 1-es ill. 2-es oldattal mosom (ECL kit, Geneflow), majd szobahőmérsékleten hagyom. 5 perc elteltével a membránt kiemelem a folyadékból, és egy műanyag tokba rakom, majd fotófilmmel vagy digitálisan (lásd később) detektálom.
18
6. Eredmények
6.1. Fehérje expressziós eredmények Először az OprM-et kódoló vektorral dolgoztam. A vektort C41(DE3) E.coli sejtekbe transzformáltam. Elvégeztem az expresszálást és a megtermelt fehérje koncentrációjának meghatározását is [7.Ábra].
7.Ábra: Fehérje koncentráció meghatározásához használt kalibrációs görbe (Fehérje koncentráció a 750nm-es fényabszorbancia függvényében)
Tisztítás
során
a
szennyezőanyagoktól
megszabadultam,
és
0,45ml
2,5mg/ml
koncentrációjú fehérje oldathoz jutottam, melyet szűrő segítségével koncentráltam (megszabadultam a fölösleges oldószertől), így ebből a termelésből 150µl 7,45mg/ml koncentrációjú tiszta OprM oldatot [8.Ábra] sikerült előállítani, melyet a későbbiekben tömegspektrometriai vizsgálatokra is kitűnően lehet majd használni.
19
8.Ábra: SDS PAGE az OprM fehérjéről tisztítás után. A 175kDa marker a kép bal oldalán látható
6.2. Az OprM mutánsok A vad-típus tanulmányozása után a mutánsokra összpontosítottam. Az OprM egyik mutánsában a 421. helyen lévő tirozint fenil-alanin (Y421F mutáns) [9. Ábra], míg a másikban a 433. helyen lévő aszparaginsavat alanin váltja fel (D433A mutáns) [10. Ábra] . Ahhoz, hogy részletesen tudjuk tanulmányozni a pumpát, in vitro kell előállítanunk. Sajnos idáig ez nem sikerült, mivel nagyon nehezen kötődött az OprM a MexAB komplexhez in vitro. Az eddigi kísérleti eredményeinkből tudjuk, hogy akkor kapcsolódik könnyebben az OprM a pumpa többi tagjához, ha nyitottabb periplazma-beli véggel rendelkezik. Ennek eléréséhez pontmutációs helyeket terveztem meg. Azért mutáltam ezeket az aminosavakat.
20
A
B
C
9.Ábra: OprM szalagmodellje a membrán síkjából (A), illetve alulról nézve (B) D222 aminosavval és a Y421 mutációs ponttal, valamint a két aminosav között létrejött H-híd, és annak nagysága (C) (PDB: 1WP1)[6]. (A monomer egységek más-más színűek (B).)
21
A
B
C
10.Ábra: OprM szalagmodellje a membrán síkjából (A), illetve alulról nézve (B) az R436 aminosavval és a D433 mutációs ponttal, valamint köztük létrejött H-hidak, és azok nagysága (C) (PDB: 1WP1)[6]. (A monomer egységek más-más színűek (B).)
22
A D433A mutánst azért választottam, mivel ez a pumpa legszűkebb részén található, és a szomszédos láncban 436. helyen lévő argininnel igen erős kettős H-kötést (sóhidat) alkot. A változástól azt várom, hogy a láncok között lévő erős összetartó erő megszűnésével nyitottabb lesz a mutáns. Az Y421F mutánst azért választottam, mivel az OprM homológjában (TolC) ugyanez a mutáció egy nyitottabb konformert eredményezett (és nem utolsó sorban a monomer két hélixe közti hidrogén hidat is lerombulunk így elősegítve a nyíltabb szerkezetet). A PCR termelés során sikerült előállítanom a mutáns DNS-eket [11.Ábra]. A DNS-ek a szekvenálás során is jónak bizonyultak, így a kész vektorokat DH5α kompetens sejtekbe transzformáltam, majd E.coli BW25113 ΔTolC (DE3) sejtekbe későbbi vizsgálatra. Az OprM-et és a másik két mutánst kódoló DNS-t mind E.coli BW25113 (DE3) ΔTolC sejtekbe transzformáltam. Ezek olyan E.coli sejtek, melyek DNS-éből a TolC-t kódoló DNS szakaszt eltávolították. (ez az OprM-hez hasonló pumpa részlet az E.coli baktériumban).
11.Ábra: OprM mutánsok plazmidjai (nyilak mutatják) agaróz mátrixban Control: 1kb DNA Ladder (Promega)
23
6.3. Vizsgálati eredmények Annak tesztelésére, hogy sikerült-e nyitottabb konformációt kapnunk, elvégeztem az élősejt-mérgezéses vizsgálatot BW25113ΔTolC (DE3) E.coli sejtekkel. Ha az E. coliban megjelenik az OprM fehérje, akkor a sejt „lyukacsossá” válik, így több gyógyszer jut be a sejtbe. Ennek következtében ha egy nyitottabb OprM fehérje expresszálódik a sejtben, akkor már kisebb külső gyógyszer koncentráció hatására is elpusztulnak a sejtek. Így azt várjuk, hogy az OprM mutánsokat a sejtbe juttatva sokkal érzékenyebbek lesznek a baktériumok a gyógyszerekre (mérgezésre), hiszen abban bízunk, hogy nyitottabb mutánsokat sikerült létrehoznunk. Mind a 2 mutánssal (D433A, Y421F), a vad-típusú OprM-mel, és a kontroll plazmidot (amikben nem volt OprM-et kódoló DNS - Pet41) tartalmazó sejtekkel is elvégeztem az élősejt mérgezéses vizsgálatot (Cytotoxicity assay).A szaporodott sejtek mennyiségét OD-ját spektrofotométerrel 620nm-en monitoroztam. Minél több sejt élte túl a mérgezést, annál nagyobb volt a sejtek fényelnyelő képessége 620nm-en. Az eredményeket a [12/A-C.Ábra]-k mutatják be.
12/A. Ábra : Az oxacillines mérgezéses vizsgálat eredménye vizuálisan.
24
12/B. Ábra : A novobiocines mérgezéses vizsgálat eredménye vizuálisan.
12/C.Ábra: Az etídium-bromidos mérgezéses vizsgálat eredménye vizuálisan.
25
A Pet41, a vad típusú OprM és az Y421F plazmidot tartalmazó sejtek a vizsgálat végén azonos körülmények között szinte azonosan viselkedtek. Ebből arra következtethetünk, hogy a vad típusú OprM és az Y421F mutációt tartalmazó OprM is hasonlóan zárt. Viszont rögtön szembetűnik, hogy az OprM D433A mutánsát tartalmazó sejtek nagyon rezisztensekké váltak. Az ezt alátámasztó eredményeket [3. Táblázat] foglalja össze. A minimum mérgezési koncentráció nem más, mint az a legkisebb mérgezőanyag koncentráció, amikor már az élő sejtek mennyisége csökken az eredetileg hozzáadottakhoz képest (OD620 < 0,2).
Minta
Oxacillin (µM)
Novobiocin (µM)
EtBr (µM)
Kontroll (Pet41)
3,9
3,9
7,8
OprM
3,9
3,9
7,8
OprM Y421F
1,95
3,9
7,8
OprM D433A
125
31,25
31,25
3. Táblázat: Minimum mérgezési koncentrációk a vizsgált sejtek és anyagok függvényében
Ez egy elég meglepő eredmény, mivel még a kontroll plazmidot tartalmazó sejteknél is rezisztensebbek lettek az OprM D433A mutánst tartalmazó sejtek. Ez csupán egy féleképpen lehetséges: Az OprM molekulák összekapcsolódtak az E.coliban meglévő AcrA-AcrB komplexekkel, lényegében helyettesítve homológját, a TolC fehérjét. Az így kialakult pumpa működésének köszönhető, hogy ekkora rezisztenciát tapasztalunk. Ez igen érdekes jelenség, melynek okát eddig nem térképezték fel. Így az összekapcsolódás okát pontosan nem ismerjük. Ezért erre a fehérjére koncentráltam, és további lépéseket tettem, hogy megérthessem különös viselkedését.
26
Először megnéztem, hogy mekkora mennyiségű OprM D433A képes ekkora rezisztenciát okozni. Ezért a vad típusú OprM-et, az Y421F és a D433A mutánst tartalmazó sejteket LB medium táptalajban növesztettem 37oC-on. A sejtekben expresszálódott fehérjét a vad típusú OprM -hez hasonló módon vontam ki, majd elvégeztem rajta egy Western Blot analízist, mellyel megláthattam, melyik fehérje milyen mennyiségben expresszálodik az élősejt mérgezéses vizsgálatokkal megegyező sejtekben, ugyanolyan körülmények között, mint amilyen körülmények között végeztem a mérgezést (azonos táptalaj, azonos típusú sejtek, azonos expresszálási hőmérséklet). 6.4. Saját fejlesztésű Western Blot detektálás A Western Blot megjelöléséhez kemolumineszcens készletet használtam. Ennek a megjelölésnek a detektálásához elterjedten fotófilmet használnak, ami meglehetősen drága, és sok szennyezőanyagot teremt. Így kifejlesztettem egy eljárást, ami gyorsabb, pontosabb eredményt ad, olcsóbb és szennyező melléktermék nélkül láthatóvá válik a végeredmény. Gyorsabb, mivel egyetlen képet kell készíteni, nem kell előhívással bajlódni, nem kell minden egyes blotnál a helyes expozíciós időt kikísérletezni. Továbbá egyetlen kép elkészítésével a fényerő megváltoztatásával létrehozható a filmen különböző exponálási időkkel készített kép. Pontosabb, mivel a kép felbontása lényegesen jobb, és nagyítható. Tehát gradiens gél esetén a kalibráló egyenes kiszámítása jóval pontosabb. Olcsóbb, mivel a használat során nem kell nyersanyagot venni, szemben a régi technológiával, ahol blotonként több ezer forintba került. És nem csak a használat sokkal olcsóbb, hanem a detektáló berendezés is. Szennyező melléktermék nélküli, mivel végig digitális eszközöket használunk, így nem kell semmi vegyszer. A tárolás és a katalogizálás is sokkal könnyebb így. Ezeken túl az eredmény kép sokkal szebb, színesebb, publikációkban, előadásokon sokkal jobban mutat, mint a régi fekete-fehér kép. A detektálást nagy fényérzékenységű fényképezőgéppel végeztem ( Gép: Nikon D40X Objektív: Nikon 35mm f 1.8). A fotózás körülményei: Először egy normál fényviszonyok között készült képet csináltam a blotról automata üzemmódban Ezt követően egy hosszú expezíciós képet csináltam sötétben, ugyanabból a szögből (f 1.8, ISO 800, Exp. 7 perc).
27
A két képet egymásra vetítettem (Picasa3 szoftver segítségével), így a marker is és a lumineszkáló fehérje is láthatóvá vált. Ezt szoftveresen rögzítettem, majd feliratozva kaptam az eredmény ábrát [13. Ábra].
Trimer OprM
Monomer OprM
13.Ábra: Digitálisan detektált Western Blot az OprM-ről és az OprM Y421F valamint az OprM D433A mutánsokról
Az ábráról látszik, hogy a vad típusú és az Y421F OprM mutánsok hasonló mennyiségben expresszálódtak. Viszont a D433A mutáns nagyon alulexpresszálódott. Lényegében csak a trimerek számítanak, mert csak a trimer pumpa tud pumpaként üzemelni. 28
Ám láthatjuk, hogy szinte nem is expresszálódott trimer D433A mutáns. Egy még érzékenyebb lumineszcens próbálval kimutatható, hogy expresszálódik trimer D433A OprM, de a lényeg ebből a képből is látszik: Nagyon kevés D433A OprM is nagy rezisztenciát tud okozni. Szeretnénk rájönni, hogy mi történt pontosan a D433A OprM-mel a sejtben, azaz nyitott lett-e, rákapcsolódott-e és hogyan az AcrA-AcrB komplexre. Ezért további vizsgálatoknak vetjük majd alá a fehérjét: szeretnénk nagyobb mennyiségben, tisztán előállítani ezt a mutánst, és egykristályt növesztve belőle, röntgen-diffrakcióval meghatározni a pontos szerkezetét. Ezzel fény derülhet a fent említett kérdésekre adható válaszokra. Ezért C41-es termelő sejtekbe transzformáltam az OprM D433A mutánst kódoló DNS-t, és hosszas kísérletezés után sikerült optimalizálnom a termelési körülményeket. Sajnos továbbra is küzdenem kell azzal, hogy nagyon kevés trimer OprM képződik, így sok sejtet kell termelnem céljaim eléréséhez. A termelés ezen írás elkészítése közben is folyik, az eddigi eredmények bíztatóak, de további kutatás szükséges ahhoz, amíg pontos választ tudunk majd adni, miért viselkedik így ez a fehérje.
29
7. Összefoglalás Munkám során az MexAB-OprM fehérje komplex OprM részét vizsgáltam normál, és mutáns formában. A normál OprM fehérjét sikerült nagy tisztaságban, nagy koncentrációban előállítani. Összesen 150µl 7,5mg/ml koncentrációjú OprM-et sikerült expresszálni, és tisztán előállítani, melyet később akár tömegspektrometriai vizsgálatokra is lehet használni. Az OprM két mutáns DNS-ét előállítottam pontmutációval, szaporítottam őket, amiből sikerült jelentős mennyiséget eltárolni a további vizsgálatokhoz. Azért készítettük a mutáns DNS-eket, hogy a segítségükkel nyitottabb szerkezetű OprM molekulákat állíthassunk elő, melyek jobban kapcsolódnak a MexAB komplexhez. A DNS-eket vizsgálati sejtekbe (ΔTolC) transzformáltam, és az így előállított sejtekkel elvégeztem több élősejt-mérgezéses vizsgálatot is, melyekből érdekes, figyelemfelkeltő eredmények születtek. A pumparészek nem működtek minden esetben a várakozásoknak megfelelően. Az előzetes várakozásokkal ellentétben, az egyik mutáns (OprM D433A) olyan kísérleti eredményeket mutatott, mely szerint összekapcsolódik az E.coli-ban található AcrA-AcrB pumpakolplexxel, melynek megmagyarázása további kutatás tárgyát képzi. Kiderült, hogy a normál OprM és az OprM Y421F tartalmú sejtek szinte azonosan viselkedtek, mint amikben nem volt semmilyen OprM. Ez feltételezhetően azért lehet, mert az OprM egy zártabb konformációban volt jelen, hasonlóan az Y421F mutánshoz, melynél a mutáció nem vezetett lényegesen nyitottabb szerkezethez. Az eredmények fényében a munkám folytatásaként az OprM D433A fehérjét további vizsgálatoknak vetettem alá, mely során egy saját fejlesztésű detektálási módszer segítségével kiderült, hogy nagyon kis mennyiségű mutáns fehérje is képes nagy rezisztenciát okozni. Ezért jelenleg azon dolgozok, hogy nagyobb mennyiségben előállítsam a mutáns fehérjét, melyhez sikerült az optimális expresszálási körülményeket kidolgoznom, és jelenleg a nagyobb mennyiségű fehérje tisztításán dolgozok. Ezt követően megkísérlem kikristályosítani és röntgen-diffrakciós vizsgálatoknak alávetni a fehérje egykristályokat. Amennyiben bíztató eredmények születnek (a D433A mutáns nyitottabb szerkezetűnek mutatkozik) a mutáns fehérje felhasználásával megkísérlem összeállítani a MexA-MexB-OprM pumpát. Amennyiben vizsgálatok zártabb szerkezetet állapítanak meg, és a pumpát nem sikerül in vitro előállítani, az eredmények alapján a jövőben megtervezek egy várhatóan még nyitottabb 30
OprM-et kódoló DNS-t, mellyel sikerül is előállítanom azt. Ezen kívül még több mutánst szeretnék megvizsgálni, a távolabbi cél, a MexA-MexB-OprM pumpa in vitro előállításának érdekében. Ezért miközben az OprM D433A mutánsának expresszálási körülményeit optimalizáltam, előállítottam a pumpa fúziós fehérjéjét (MexA) mind normál vad típusú, mind nitrogén- (N15) és szénjelölt (C13) vad típusú formában. Miután megtisztítottam a jelölt fehérjét, E.coli lipidekbe transzformáltam, szilárd fázisú NMR vizsgálatokhoz. Az új ismeretek fényében pontosabb képet alkothatunk majd a pumpa in vitro összeállításának optimális körülményeiről, és működéséről, amely segítségével olyan gyógyszert
tervezhetünk,
amivel
megszüntethetjük
a
Pseudomonas
aeruginosa
gyógyszerrezisztenciáját. Így a munkám hozzájárulhat sok ember meggyógyításához és életének megmentéséhez.
31
8. Köszönetnyilvánítás
Köszönet Dr. Henrietta Venternek, aki lehetőséget biztosított laborjában a kutatómunka megtervezésére és elvégzésére. Köszönet Prof. Dr. Perczel Andrásnak és Dr. Harmat Veronikának, akik támogatták, hogy Cambridge-ben végezhessem kutatásomat, és végig figyelemmel kísérték munkámat. Továbbá köszönet mindenkinek, aki ötletekkel, tanácsokkal és építő kritikával segítette a kutatás előmenetelét.
32
9. Függelék
9.1.Vegyszerek és rövidítések
’’A” mosó puffer 50mM Kpi pH=8,0, 5% glicerin, 0,3M NaCl, 20mM imidazol pH=8,0, 1% OG [Függ.]
APS (ammónium-peroxo-diszulfát)
’’B’’ mosó puffer 20mM K-HEPES pH=7,5, 5% glicerin, 0,3M NaCl, 20mM imidazol pH=8,0, 1% OG [Függ.]
DNáz Dezoxiribonukleáz DNS emésztő enzim. Marhák hasnyálmirigyéből állítják elő, Sigma termék.
dNTPs A 4 dezoxi-nukleozid-trifoszfátot tartalmazza: dATP, dCTP, dGTP, dTTP
33
EDTA (etilén-diamin-tertaecetsav)
Etídium-bromid Mutagén, a DNS láncok közé beépülő fluoreszcens festék. DNS gél elektroforézisnél UV fényben lumineszkáló festékként alkalmazzák (ennek segítségével látható a DNS az agaróz mátrixban). Élősejtmérgezéses vizsgálatoknál (Cytotoxicity assay) pedig mérgező anyagként használják.
Fehérje szolubilizációs puffer 10mM Bis-Tris pH=7,2, 20% glicerin, 0,5M NaCl, 2% OG [Függ.](Melford), 10mM imidazol pH=8,0
Hasító puffer 20mM K-HEPES pH= 7,5, 5% glicerin, 250mM Imidazol pH=8,0, 0,3M NaCl, , 1% OG
34
HEPES (2-[4-(2-hidroxietil)piperazin1-il]etánszulfonsav)
IPTG (izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranozid)
Kanamycin
K-HEPES HEPES Kálium sója.
Kpi Egy puffer, ami K2HPO4 és KH2PO4 megfelelő arányú oldata. Arányuk attól függ, mekkora pH-t akarunk beállítani.
35
LB medium Sejt táptalaj. 1L elkészítéséhez 12g tripton, 5g élesztő és 10g NaCl és víz kell. LB medium agar Úgy készül, hogy az LB medium agar oldatot autoklávba helyeztem, majd miután 60oC-ra hűlt, hozzáadom 25µg/ml végső koncentrációban az antibiotikumot (esetünkben kanamycint), és műanyag petricsészékbe öntöm, majd hűtőben tárolom későbbi felhasználásra. Novobiocin ATPáz működését gátló antibiotikum.
OG (β-D-Oktil-glüközid)
Oxacillin Sejtfal szintézisét gátló antibiotikum.
36
Pfu Nagy hatásfokú DNS polimeráz enzim.
SDS (nátrium-dodecil-szulfát)
Na+
SOB (Super Optimal Broth) Egy speciálisan E.coli baktérium növesztésére kifejlesztett táptalaj, melybe triptont, élesztőt, NaCl-ot és KCl-ot adtak. Én a Melford cég által előre gyártott táptalajt használtam.
SOC 500µl SOB (Melford), 0,5% glükóz Szolubilizáló puffer 50mM Kpi pH=8,0, 5% glicerin, 0,3M NaCl, 20mM imidazol pH=8,0, 2,5% OG [Függ.]
10X TBS 500ml 1M TRIS pH=7,4 , 300ml 5M NaCl , 200ml H2O
10X TBST (TBS-Tween) 50ml 10X TBS, 448ml H2O, 2,5ml 20% Tween-20 oldat (frissen kell készíteni, és védeni a fénytől)
37
TEMED (tetra-metil-etilén-diamin)
Tripton (Pepton) Állatok tejéből és húsából fehérje bontó enzimekkel bontott anyag. Az így kapott, porlasztva szárított anyag kis peptideket, zsírokat, fémeket, sókat, vitaminokat és sok más biológiailag fontos vegyületet tartalmaz. A triptont (peptonokat) a baktériumok táptalajának elkészítéséhez alkalmaztam.
Tween-20 (Poliszorbát-20)
Bis-Tris (Bis-(2hidroxi-etil)-amino-tris(hidroximetil)metán)
38
9.2. Az OprM és mutánsai His-tag mentes aminosav szekvenciája 1- MKRSF
LSLAV
AAVVL
SGCSL
IPDYQ-25
26-RPEAP
VAAAY
PQGQA
YGQNT
GAAAV-50
51-PAADI
GWREF
FRDPQ
LQQLI
GVALE-75
76-NNRDL
RVAAL
NVEAF
RAQYR
IQRAD-100
101-LFPRI
GVDGS
GTRQR
LPGDL
STTGS-125
126-PAISS
QYGVT
LGTTA
WELDL
FGRLR-150
151-SLRDQ
ALEQY
LATEQ
AQRSA
QTTLV-175
176-ASVAT
AYLTL
KADQA
QLQLT
KDTLG-200
201-TYQKS
FDLTQ
RSYDV
GVASA
LDLRQ-225
226-AQTAV
EGARA
TLAQY
TRLVA
QDQNA-250
251-LVLLL
GSGIP
ANLPQ
GLGLD
QTLLT-275
276-EVPAG
LPSDL
LQRRP
DILEA
EHQLM-300
301-AANAS
IGAAR
AAFFP
SISLT
ANAGT-325
326-MSRQL
SGLFD
AGSGS
WLFQP
SINLP-350
351-IFTAG
SLRAS
LDYAK
IQKDI
NVAQY-375
376-EKAIQ
TAFQE
VADGL
AARGT
FTEQL-400
401-QAQRD
LVKAS
DEYYQ
LADKR
YRTGV-425
426-DNYLT
LL
RSLFT
AQQQL
ITDRL-450
451-NQLTS
EVNLY
KALGG
GWNQQ
TVTQQ-475
476-QTAKK
EDPQA
A két mutációs pont:
Y421F és a D433A.
DAQ
39
10. Referenciák
[1] Hancock RE. , Pub.med. S 93-9 1998.aug.27. Resistance mechanism in Pseudomonas aeruginosa and other nonfermentative gram-negative bacteria. [2] Todar’s online textbook of bacteriology, http://textbookofbacteriology.net/pseudomonas.html [3] http://www.sciencedaily.com/releases/2000/03/000307090602.htm [4] Poole K. Clin. Microbiol. Infect. 10:12–26. 2004. Efflux-mediated multiresistance in gram-negative bacteria.
[5] Nehme and Poole. Journal of Bacteriology, p. 6118–6127 Vol: 18, No.18 Sept. 2007, Assembly of the MexAB-OprM multidrug pump of Pseudomonas aeruginosa: Component interactions definied by the study of pump mutant suppressors [6] www.pdb.org [7] Akama H, J.Biol.Chem. v279 pp. 52816-9 2004. Crystal structure of the drug discharge outer membrane protein, OprM, of Pseudomonas aeruginosa: dual modes of membrane anchoring and occluded cavity end
[8] Sennhauser G, J.Mol.Biol. v389 pp. 134-45, 2009. Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa. [9] Akama H. J.Biol.Chem. v279 pp. 25939-42, 2004. Crystal structure of the membrane fusion protein, MexA, of the multidrug transporter in Pseudomonas aeruginosa [10] Nelson P Barrera, Nature Methods 6, 585 – 587, 2009. Mass spectrometry of membrane transporters reveals subunit stoichiometry and interactions [11] Martin Symmons, PNAS 2009.február 27. The assembled structure of a complete tripartite bacterial multidrug efflux pump,
[12] http://www.tanpaku.org/e_icsg2008/09_05.php [13] Satoshi Murakam, Nature 419, 587-593 2002.október 10. Crystal structure of bacterial multidrug efflux transporter AcrB
40
[14] Blair and Piddock, Current Opinion in Microbiology 12:512–519, 2009. Structure, function and inhibition of RND efflux pumps in Gram-negative bacteria [15] Maxsim L., Science p.197, 2010 .október. Bacteria use type IV pili to walk upright and detach from surfaces [16] X Z Li, Antimicrob Agents Ch. 39(9) 1948-1953 1995. szeptember Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa [17] Keith Poole, Antimicrobial agents and chemotherapy p. 2021-2028 1996. szeptember Expression of the Multidrug resisntace operon MexA-MexB-OprM in Pseudomonas aeruginosa
41
11. Megjegyzések
42
