Tarsza fajok (Isophya, Orthoptera) összehasonlító elemzése mtDNS analízissel és aktivitásvizsgálattal DIPLOMAMUNKA
Készítették: Boros Melinda és Szloboda Anita V. éves biológia-környezettan szakos hallgatók
Témavezetők: Dr. Vadkerti Edit, PTE TTK Állatökológia Tanszék Dr. Putnoky Péter, PTE TTK Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék
PÉCS, 2007.
TARTALOM
OLDAL
1. BEVEZETŐ
4.
2. CÉLKITŰZÉS
5.
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
6.
3.1. mtDNS vizsgálat
6.
3.1.1. Minták származási helye
6.
3.1.2. Isophya DNS tisztítása
7.
3.1.3. A DNS minőségének ellenőrzése
8.
3.1.4. Polimeráz láncreakció
8.
3.1.5. Agaróz gélelektroforézis és DNS-fragment izolálás
9.
3.1.6. Orthoptera és Isophya specifikus primerpárok tervezése
9.
3.1.7. DNS-szekvenciák meghatározása
11.
3.1.8. A szekvenciák statisztikai kiértékelése
12.
3.2. 24 órás aktivitásvizsgálat
13.
3.2.1. Mintavétel módja
13.
3.2.2. A 24 órás aktivitásvizsgálat kivitelezése
13.
3.2.3. Adatok értékelése
14.
4. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 4.1. mtDNS vizsgálatok
15. 15.
4.1.1. Isophya specifikus primerpár tervezése
15.
4.1.2. mtDNS vizsgálat
18.
4.2. 24 órás aktivitásvizsgálat 5. ÖSSZEFOGLALÁS
20. 27.
2
6. SZAKMÓDSZERTANI FEJEZET (BOROS MELINDA) 6.1. Bevezetés: A diplomadolgozat témáinak rövid ismertetése
29. 29.
6.2. A diplomadolgozat témáinak a biológia tantárgy oktatásában való alkalmazásának lehetőségei 6.3. A terepi munka alkalmazása az oktatásban
30. 31.
6.3.1. A terepgyakorlatot előkészítő foglalkozások
31.
6.3.2. Terepgyakorlat Éger-völgyben
36.
6.3.3. A terepgyakorlatot lezáró foglalkozás
38.
6.4. Mellékletek
40.
6.5. Összefoglalás
44.
6.6. Köszönetnyilvánítás
44.
7. SZAKMÓDSZERTANI FEJEZET (SZLOBODA ANITA) 7.1. Bevezetés
45. 45.
7.2. A diplomadolgozat témáinak a biológia tantárgy oktatásában való alkalmazásának lehetőségei
46.
7.3. Melléklet
56.
7.4. Befejezés
59.
8. IRODALOM
60.
9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
62.
3
1. BEVEZETŐ Magyarországon hat tarsza (Isophya, Orthoptera) faj él (Szövényi et al. 2001, Heller et al. 2004), melyek rejtőzködő életmódú, esti-éjjeli aktivitású, röpképtelen, polifág szöcskék (Szövényi et al. 2001). A magyar tarsza (Isophya costata Brunner von Wattenwyl, 1878) és a Stys tarszája (I. stysi Čejchan, 1958) fokozottan védett. A pusztai tarsza (I. modesta Frivaldszky, 1867), a kárpáti tarsza (I. camptoxypha (Fieber, 1853) - I. brevipennis Brunner von Wattenwyl, 1878 syn.n.) és az illír tarsza (I. modestior Brunner von Wattenwyl, 1882) védett, az erdei tarsza (I. kraussi Brunner von Wattenwyl, 1878) nem védett. Mivel a hat fajból öt védett, illetve fokozottan
védett, kétségtelen, hogy a fajok alaposabb megismerése, valamint a vizsgálatok során nyert adatok eredményesen felhasználhatóak a természetvédelmi munka megszervezésében. A hazai tarsza fajokról az elmúlt pár évben több szempontból is készült összehasonlító elemzés. Nyárády és Antal (2005) OTDK dolgozatukban négy faj (I. modesta, I. modestior, I. costata és I. camptoxypha) habitatpreferenciáját, morfometriáját vizsgálták, valamint három faj (I. modesta, I. costata és I. camptoxypha) egy-egy egyedével mitokondriális DNS (mtDNS) analízist végeztek.
Vadkerti (2005) mind a hat hazai tarsza fajjal készített
összehasonlító elemzést morfometriájuk és izoenzimvizsgálat alapján. A fenotípus-, és izoenzimvizsgálatok koherens képet mutattak a vizsgált populációkról, de a fajok evolúciós kapcsolatának a tisztázása további vizsgálatokat tesz szükségessé. Bár az izoenzimvizsgálat közelrokon fajoknál magas diverzitási értékekkel alkalmas lehet evolúciós kapcsolatok feltárására (Hillis ed. 1996), azonban elsősorban fajon belüli és populációk közötti variabilitás analízisére javasolják és alkalmazzák (Thorpe & Solé-Cava 1994). Filogenetikai vizsgálatoknál kétségtelenek a nukleinsav, közöttük is kiemelt helyen a mitokondriális DNS szekvenciák felhasználásának előnyei. A nukleinsav szekvenciák nyilvánvaló előnyei a következők: (1) a nukleotidok (amelyek tkp. „jellegekként” értékelhetőek) az egyed által kódolt információ alapvető egységei (2) viszonylag könnyű a molekuláris szintű evolúciós folyamatok
szempontjából
releváns
információ
kinyerése
és
beépítése
(3)
a
szekvenciaevolúciót viszonylag könnyű modellezni, a modellek tesztelése módszeresen történhet (4) a nyerhető adatok potenciálisan hatalmas számban produkálhatók (Hillis ed. 1996). Napjainkban a DNS vizsgálatok alkalmazása sokszor nélkülözhetetlen a faji szintű meghatározásokhoz.
A
mitokondriális
DNS
sokirányú
felhasználása
az
evolúciós
kutatásokban bebizonyította, hogy a legtöbb felmerülõ probléma esetén felhasználása 4
ígéretes. Az egészen rövidtávú elválások kivételével minden vizsgálati szinthez megtalálható a megfelelõ szakasz, amely PCR technika segítségével megsokszorozható, szekvenciája meghatározható, és több egyednél összevethetõ. A mtDNS nagyobb mennyiségben fordul elő a sejtekben, mint a nukleáris genom, így kisebb minta felhasználásával is megfelelő minőségű PCR terméket kaphatunk. A mtDNS anyai úton öröklődik; alkalmas az evolúciós kapcsolatok tisztázására, mivel a kódoló és nem kódoló régiók mutációs rátája nagyon eltérő. A kutatásokhoz univerzális primerek állnak rendelkezésre, melyeket a már ismert mitokondriális szekvenciájú fajok konzerválódott DNS szakaszaira terveztek. Kutatásunk kiterjedt az Isophya fajok aktivitásának vizsgálatára is, mely egyedülállónak tekinthető, hiszen - tudomásunk szerint - tarsza fajokra ez eddig még nem történt meg. Napszakos aktivitásuk és életmódjuk pontosabb megismeréséből nyert információk védelmük szempontjából elsődleges fontosságúak, hiszen így például zavarásuk elkerülhető.
2. CÉLKITŰZÉS 1. A magyarországi 6 tarsza faj evolúciós viszonyainak analízise mtDNS vizsgálattal, valamint az általunk és a korábban kapott kutatási eredmények összevetése. 2. A
tarsza
fajok
viselkedésmintázatának
összehasonlító
elemzése
24
órás
aktivitásvizsgálattal.
5
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. mtDNS vizsgálat 3.1.1. Minták származási helye A hat magyarországi tarsza faj tíz populációjából dolgoztunk fel mintát három különböző földrajzi régióból (1. ábra). A három I. costata egyed a Mecsekből (Kovácsszénája illetve Orfű) és Battonyáról származott. Szintén a Mecsekből gyűjtötték az I. camptoxypha (Hetvehely), és az I. modestior (Kovács-szénája) egy-egy vizsgált példányát, valamint az I. modesta két egyedét (Misina illetve Kővágószőlős). Az I. stysi a Zemplénből (Gyertyán-kút), az I. kraussi minták a Zempléni-hegységből (Almási-rét) származtak.
I. camptoxypha ○ I. costata ▲ I. modesta □ I. modestior ◊ I. kraussi X I. stysi ●
X ●
▲◊ ○▲ □ □
▲
1. ábra. A minták származása a mtDNS vizsgálatokhoz
6
3.1.2. Isophyia DNS tisztítása A mtDNS vizsgálatokban a 16S rRNS és a NADH-dehidrogenáz 1 (ND1) alegységét kódoló régiókat (2. ábra) használtuk fel összehasonlításra. Az analízisbe bevont egyedeket feldolgozás előtt 75%-os alkoholban tároltuk. A tisztítást egy a növényi molekuláris vizsgálatokban sikerrel alkalmazott kloroformos eljárás alapján végeztük (Lodhi et al, 1994).
2. ábra. Az mtDNS összehasonlításra felhasznált szakasza: 16S rRNS és a NADH-dehidrogenáz 1 (ND1) alegységét kódoló régió
A munka során a vizsgált szövetdarabot kimosott, alkohollal kiégetett mozsárban szétdörzsöltük, majd két részletben hozzáadott 1,2 ml CEP-PVP oldattal homogenizáltuk, és 2 ml-es
eppendorf-csőbe
pipettáztuk.
A
CEP-PVP
oldat
összetétele:
2%
CTAB
(cetyltrimethylammonium bromide), 100 mM TRIS, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 0,5% βmerkaptoetanol, 5 mg/ml PVP (polyvinylpyrrolidone). Alapos összerázás után 1 órán át 65oC-on inkubáltuk, majd 1ml kloroform hozzáadása és centrifugálás (5’ 12000 rpm) következett. A felülúszót új csőbe pipettáztuk, majd az előző lépést megismételtük. A 800 µl felülúszóhoz 0,5 térfogat (továbbiakban tf) (400 µl) 5 M NaCl-ot és 0,6 tf (780 µl) izopropanolt mértünk. Óvatos forgatás, majd centrifugálás (5’ 12000 rpm) után 400 µl 70%-os etanollal mostuk a csapadékot, majd ismét centrifugáltuk (5’ 12000 rpm) a mintákat. A csapadékot 200 µl TE oldatban (50 mM TRIS, 20 mM EDTA, pH:7,5) oldottuk fel és 2 µl 10 mg/ml DNáz mentes (forralt) RNáz oldatot adtunk hozzá. 20 perc szobahőmérsékleten történt inkubálás után a csöveket jégbe helyeztük, majd 0,1 tf (20 7
µl) 10% SDS és 1 tf (200 µl) 7,5 M ammónium-acetát oldatot adtunk hozzá. Ezek után legalább 20 percre -20oC-ra helyeztük a mintákat. Centrifugálás (5’ 12000 rpm) után 400 µl felülúszóból 0,6 tf (240 µl) izopropanol segítségével kicsaptuk a DNS-t, centrifugáltuk (5’ 12000 rpm), majd 400 µl 70%-os etanollal mostuk, majd ismét centrifugáltuk (5’ 12000 rpm) a csapadékot. A DNS-t 50 µl ioncserélt vízben vettük fel. 3.1.3. A DNS minőségének ellenőrzése A DNS-koncentráció és a fehérje szennyezettség mértékének meghatározásához spektrofotométerrel (GeneQuant II) megmértük az oldatok hígításainak optikai denzitását 260 és 280 nm hullámhosszon. Az OD260/OD280 arány mindig 1,6 és 2,0 között volt. A DNS preparátumokból vett mintákat kezelés nélkül agaróz gélen is elválasztottuk, hogy az enzimreakciót gátló esetleges más szennyezést kimutassuk. 3.1.4. Polimeráz láncreakció Az
összehasonlítani
kívánt
mtDNS
szakaszok
felsokszorozása
polimeráz
láncreakcióval (PCR) történt, Taq polimeráz segítségével. Munkánk során több programot teszteltünk, a leghasználhatóbbak adatait az 1. táblázat tartalmazza. Az alkalmazott oligonukleotid primerek jellemzőit a 2. táblázat foglalja össze. 1. táblázat. A PCR reakcióknál alkalmazott programok ACR-1
ACR-4
PP-ORT
1.
180 sec. 95°C
180 sec. 95°C
94oC, 1:30
2.
30 sec. 95°C
30 sec. 95°C
94oC, 0:30
3.
30 sec. 55°C
30 sec. 53°C
57oC, 0:30
4.
30 sec. 72°C
30 sec. 72°C
72oC, 0:50
5.
goto 2. x33
goto 2. x33
goto 2. x4
6.
end
end
94oC, 0:30
7.
55oC, 0:30
8.
72oC, 0:50
9.
goto 6. x4
10.
94oC, 0:30
11.
53oC, 0:30
12.
72oC, 0:50
13.
goto 10. x25
14.
72oC, 2:00
15.
end
8
2. táblázat. A PCR reakciókhoz használt primerek jellemzői
név ND1-ACR 16S-ACR 16s-ORT ND1-ORT ISO-ND1 ISO-16S
érintett gén ND1 16S rRNS
szekvencia tagaattagaagatcaaccag acatgatctgagttcaaaccg gcgacctcgatgttggatta attcaccttcagcaaaatcaaaag tgaccatcctgcaattattactg cctttaaatccttacatgatctgag
Tm1 (oC) 49,9 55,2 54,4 53,3 53,2 51,8
referencia Pashley 1992 Vogler 1993 jelen dolgozat jelen dolgozat jelen dolgozat jelen dolgozat
(1) Tm: olvadási hőmérséklet
3.1.5. Agaróz gélelektroforézis és DNS-fragment izolálás A DNS-minták elválasztására agaróz gélt használtunk, követve az általános módszertani leírásokat (Sambrook et al., 1989). Molekulaméret markerként PstI enzimmel emésztett λ fág DNS-t és 100 bp-os „létrát” (ladder) alkalmaztunk. Az izolálni kívánt fragment elé az agaróz gélbe Whatman DE 81 papírdarabot helyeztünk és 15 perc (60V) elektroforézis után azt a gélből eltávolítottuk. A fragmentet tartalmazó papírt eppendorfcsőbe tettük, és a DNS-t kétszer 50 µl 1 M NaCl oldattal eluáltuk. A DNS kicsapása 0,1 tf 3 M Na-acetát oldat (pH: 7,0) és 0,6 tf izopropanol hozzáadásával történt. 20 perces -20°C-os inkubálás után lecentrifugáltuk (5’ 12000 rpm), szárítottuk és 400 µl 70%-os etanollal mostuk. Újabb centrifugálást és szárítást követően 20 µl desztillált vízben oldottuk fel a csapadékot. 3.1.6. Orthoptera és Isophya specifikus primerpárok tervezése Az Orthoptera specifikus, „külső primerek” (16S-ORT és ND1-ORT) tervezéséhez a nukleotidszekvencia adatbázisban a következő mtDNS szekvenciákat használtuk fel: Gryllotalpa orientalis (mtDNS NC_006678), Locusta migratoria (mtDNS NC_001712), Periplaneta fuliginosa (mtDNS NC_006076), Sclerophasma paresisensis (mtDNS NC_007701), Tamolanica tamolana (mtDNS NC_007702), Timema californicum (mtDNS DQ241799). A szekvenciák illesztése után két konzerválódott, egymástól mintegy 900 bp távolságra lévő régióhoz terveztük a 16S-ORT és ND1-ORT primereket, a nevüknek megfelelően a 16S rRNS és ND1 gének szekvenciáihoz illesztve (4.1.1. fejezet). Az új „belső”, Isophya specifikus primereket (ISO-16S, ISO-ND1) az 16S-ORT és ND1-ORT primerek segítségével minden Isophya fajból felsokszorozott és klónozott szekvenciák meghatározása és illesztése révén terveztük meg, ahogy azt a 4.1.1. fejezet leírja.
9
In vitro DNS-technikák mtDNS-fragmentek klónozása Isophya fajokból A 16S-ORT és ND1-ORT primerek és PCR segítségével mind a hat vizsgált faj 1-1 egyedéből származó DNS preparátumokból felsokszoroztuk a megfelelő DNS-szakaszokat. Az I. stysi és az I. kraussi a Zempléni-hegységből, az I. costata, I. camptoxypha, I. modesta és az I. modestior a Mecsekből származtak (gyűjtés pontos helye a 3.1.1. fejezetben). A PCR-fragmenteket, tisztítás és izolálás után, a pJET1 vektorba (GeneJET PCR Cloning Kit,
FERMENTAS)
klónoztuk a használati utasítás szerint, majd meghatároztattuk az
inszertálódott DNS-szakaszok bázissorrendjét mindkét irányból. E célra a kitben lévő primereket (Forward és Reverse Sequencing Primer) használtuk fel. A DNS-minták restrikciós emésztését Sambrook és mtsai szerint végeztük (Sambrook et al., 1989) a FERMENTAS cég termékeit használva. Kettős emésztés esetén, ha az enzimek nem vágtak egy bizonyos összetételű pufferben, az első enzimreakció után a minta DNS tartalmát kicsaptuk 0,1 tf 3 M Na-acetát (pH:7,0) és 2 tf etanol (96%) hozzáadásával minimum 20 percig inkubáltuk -20°C-on, majd 5 perc centrifugálás és 70% etanolos mosás, szárítás után 30 µl steril desztillált vízbe vettük fel. Ez után végeztük el a második enzimreakciót. A ligálási reakciókat 20-25 µl térfogatban, 50-100 ng vektor és fragment DNS és 1x T4 DNS ligáz puffer (40 mM TrisHCL, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, pH: 7,8) segítségével végeztük el. A reakciókhoz ragadós végek esetén 0,01 U, tompa végek összekapcsolása esetén 0,5 U T4 DNS ligáz enzimet (FERMENTAS) használtunk. Az elegyet legalább 2 órán át, szobahőmérsékleten (22oC) inkubáltuk a transzformáció előtt. Plazmid DNS transzformálás Egy transzformáláshoz 100 µl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket -80°C-ról jégre tettük, és 15 perc elteltével hozzáadtuk a transzformációhoz használt DNS-t. 30 percig jégen inkubáltuk, majd hősokkot alkalmaztunk (3 perc, 37°C). Ez után 400 µl LB tápfolyadékot adtunk a sejtekhez, és 1 órán át 37°C-on tartottuk a mintákat. A baktérium-szuszpenzióból 100-100µl-t szélesztettünk szelektív táptalajra (LB-Amp). A szelektív táptalajon kinőtt 1-1 jól elkülönült telepet kiválasztottunk, és 3 ml LB-Amp tápfolyadékban felszaporítottuk plazmid DNS izoláláshoz.
10
Plazmid DNS izolálása A plazmid DNS-t 3-3 ml LB tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében éjszakán át növesztett E. coli sejtekből Ish-Horowicz és Burke (Ish-Horovicz and Burke, 1981) módszerének módosított változata szerint preparáltuk. 1,5 ml kultúrát eppendorf-csõbe tettünk és a sejteket centrifugálással leülepítettük. A tisztítás során minden centrifugálás 5 percig tartott, 12000 fordulatszámmal, szobahőmérsékleten. A sejteket 100 µl TEG oldatban (25 mM TrisHCL, 10 mM EDTA, 50 mM glükóz pH: 8,0) felszuszpendáltuk. A feltárást 200 µl NS oldat (0,2 N NaOH, 1% SDS) hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig 0°C-on inkubáltuk, majd 160 µl jéghideg Na-acetát oldatot (3 M, pH: 4,8) adtunk hozzájuk és az oldatot erõsen összeráztuk. 5 perc 0°C inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, és a felülúszóból 320 µl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS-t. 20 perc -20°C inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, szárítottuk, és 100 µl Tris-Ac pufferben (50 mM Tris, 100 mM Na-acetát, pH: 8,0) feloldottuk. Ezután 200 µl etanollal a DNS-t ismét kicsaptuk, centrifugáltuk, szárítottuk az előzőekhez hasonló módon, majd 30-50 µl RNáz tartalmú desztillált vízben (100 µg/ml forralt RNázA) oldottuk fel. Restrikciós emésztésekhez 1-10 µl preparátumot használtunk fel, az adott plazmid kópiaszámának függvényében. A DNS-szekvencia meghatározáshoz a preparátumokat további lépésekben tisztítottuk. Az előzőek szerint készített 50 µl plazmid preparátumhoz 0,1 tf 10% SDS oldatot és 1 térfogat 0oC-os 7,5 M NH4-acetát oldatot adtunk és 15 percig inkubáltuk jégen. Ezután a csapadékot lecentrifugáltuk, és a felülúszóból 0,6 tf izopropanol hozzáadásával kicsaptuk a plazmid DNS-t (-20°C, 20 perc inkubálás). Centrifugálás, etanolos mosás, szárítás után a tisztított DNS-t 40 µl desztillált vízben vettük fel. A preparátumok minőségét agaróz gélelektroforézis segítségével ellenőriztük általában 1 µl minta felhasználásával. 3.1.7. DNS-szekvenciák meghatározása Számos Isophya szekvenciát a két primer felhasználásával előállított PCR-fragment izolálása és direkt szekvenálása révén határoztunk meg. Ezekben az esetekben mindig két független PCR-reakciót végeztünk, ugyanabból a DNS-mintából. A két fragmentet, agaróz gélen történt ellenőrzés után, 1:1 arányban összekevertük és izoláltuk. Ezek után a szekvencia meghatározása azzal a két primerrel történt, amelyeket a PCR-reakcióban is alkalmaztunk. Ezzel a módszerrel ki tudtuk küszöbölni a Taq polimeráz által elkövetett esetleges hibák megjelenését a meghatározott szekvenciákban.
11
A munkánk során tisztított plazmid DNS minták és PCR fragmentumok nukleotid szekvenciáját a megfelelő oligonukleotidok segítségével a MTA Szegedi Biológiai Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumában határozták meg. A részszekvenciákat a Chromas Pro (www.technelysium.com.au/ChromasPro.html) program segítségével ellenőriztük, javítottuk és a Lasergene (DNA Star Inc.) program segítségével illesztettük össze. Az sokszoros szekvencia illesztéseket, törzsfaelemzéseket a ClustalW illetve a PAUP programok segítségével végeztük el. 3.1.8. A szekvenciák statisztikai kiértékelése A felhasznált DNS-szekvenciaadatokhoz általunk végrehajtott kísérletek során jutottunk. A filogenetikai fa „gyökeresítésére” olyan, a vizsgált taxonokhoz („ingroup” = belcsoport) rendszertanilag kapcsolódó „outgroup-ot” = külcsoportot választottunk, amely evolúciósan távolabb álló a belcsoporttól, mint annak tagjai egymástól, ezért „outsider”-ként a Locusta migratoria sáska faj mitokondriális DNS-szekvencia adatait használtuk (Hochkirch, 2001). Az elemzésbe mindkét csoport tagjait bevontuk. A szekvenciák összerendezését (alignment) elsőként ClustalW v1.7 program segítségével végeztük el (Thompson és mts., 1994). A DNS szekvenciákat ezután GeneDoc v2.3 (Nicholas és mts., 1997) programmal újrarendeztük és javítottuk, a megfelelő DNS szekvenciát alapul véve. Az alignmentek optimalizálása után kialakult réseket (gap), a végső filogenetikai analízisek során, mint hiányzó karakterek kezeltük. A kladisztikai analíziseket PAUP* 4.0 szoftver (Swofford, 2001) Windows® XP® verziójával készítettük a „legnagyobb takarékosság” (Maximum Parsimony - későbbiekben: MP) módszerét alkalmazva. Általában a parszimónia módszerek az evolúciós fa ágainak összhosszúságát minimalizálják. Olyan fát keresünk, amely a lehető legkisebb számú karakterállapot változást (evolúciós lépést - továbbiakban „egység”) teszi szükségessé a leszármazási viszonyok megmagyarázásához (Podani, 1997). A kapott filogenetikai fa pontosságának és megbízhatóságának tesztelését bootstrap (Felsenstein, 1985) vizsgálattal végeztük. Ez egy modern számítógép-intenzív újramintavételezési módszer, amelyben kiindulásként feltételezzük, hogy a mintában lévő m egységre kapható gyakoriságeloszlás a lehető legjobban képviseli az eredeti populációban levő gyakoriságot. Bootstrap konszenzus fát eredményez a változók bootstrap újramintavételezésével előállított alternatív fák egyesítése. Ezt követően minden elágazást összehasonlítunk az eredeti fa elágazásaival. Eltérés esetén az adott elágazás 0 értéket kap, míg egyezőség esetén 1-et. Ezt több százszor megismételve az így kapott bootstrap érték százalékban fejezi ki, hogy hány esetben
12
egyezett az adott elágazásban a kapott filogenetikai fa az eredetivel (Nei és Kumar, 2000). A 85– 100% bootstrap értékeket magasnak tekintettük, az adott elágazás topológiáját alátámasztottnak vettük. 75–84% bootstrap érték mérsékelten, míg 50–74% csak alacsonyan támogatja az adott elágazás kapott topológiáját (Motley és mts., 2005). A kapott filogenetikai fa statisztikai értékelése magában foglalja a konzisztencia-indexet (CI; consistency index; Kluge és Farris, 1969) és az összetartozási-indexet (RI; retention index; Farris, 1989) is. Mindkét index a homoplázia mértékét mutatja az adott filogenetikai fában. CI = 1, ha a fában a lehetséges minimum fordul elő: a karakter nem utal homopláziára. CI = 0,5 kétszer annyi változás következett be, mint amennyire minimálisan szükség van. RIj = 1, ha egyáltalán nincs homoplázia, RIj = 0, ha az összes szünapomorfiát homoplázia okozza (Podani, 1997).
3.2. 24 órás aktivitásvizsgálat 3.2.1. Mintavétel módja Az Isophya fajok gyűjtését az I. kraussi esetében a Zempléni-hegységben (2006. 07. 04.); az I. camptoxypha, I.costata, I. modesta és az I. modestior esetében pedig a Mecsekben végeztük (2006. 07. 06.) (gyűjtés helye a 3.1.1. fejezetben). Az öt tarsza faj mintáit fűhálózással, egyedi megkereséssel és hang alapján való detektálással gyűjtöttük be. Feladatunkat nagyban nehezítette, hogy rövid időn belül kellett fajonként 5 hím és 5 nőstény egyedet begyűjtenünk. Az Isophya rejtőzködő életmódú, ezért legsikeresebb módszernek a hang alapján történő megkeresés bizonyult. A hímek által kiadott hang alapján az öt tarsza faj egyértelműen elkülöníthető, lokalizálható és a hímek közelében a nőstények is könnyebben fellelhetők. Az Isophya jól strukturált gyepekben illetve bokrokban fordul elő, így a fűhálózással történő begyűjtés igen nehézkes volt. 3.2.2. A 24 órás aktivitásvizsgálat kivitelezése Az öt tarsza fajnak összesen 50 egyedét vettük be az aktivitásvizsgálatba - így statisztikailag értékelhető mennyiséggel dolgoztunk -, fajonként 10 egyedet figyeltünk meg (5 hím, 5 nőstény). A vizsgálathoz 25 db 5 literes befőttes üveget használtunk, melyeknél a természetközeli élettér kialakítása volt a célunk. Az üvegekbe aljzatként kb. 3 ujjnyi vastagon homokot
13
tettünk, ezzel biztosítva a nőstények számára a petézés lehetőségét. Az aljzatba 1-1 málnavesszőt dugtunk, mely növény leveleit előzetes vizsgálataink alapján mind az 5 tarsza faj elfogyasztja. Az üvegedényeket hálóval fedtük le a megfelelő szellőzés végett, illetve, hogy az állatok ki ne másszanak. A páratartalom biztosítására a homokot a kísérlet megkezdése előtt meglocsoltuk. Az aktivitásvizsgálat kezdete előtt két órával fajonként egy hím és egy nőstény egyedet helyeztünk az edényekbe, így volt idejük akklimatizálódni, a kísérleti körülményekhez hozzászokni. Az állandó 22ºC-os hőmérsékletet légkondicionálóval biztosítottuk, hogy a hőmérsékletingadozás ne befolyásolja viselkedésüket (Ábrahám 1999). A mesterséges fény alkalmazását kerültük, de a gyűjtés során szerzett tapasztalatokból tudtuk, hogy nem zavarja őket, a mozgás sokkal inkább. Minden
egyes
állatot
fél
percig
figyeltünk
harminc
perces
időközökkel.
Megfigyeléseinket egy előre elkészített és az üveg elé helyezett táblázatban rögzítettük. Bináris adatokkal dolgoztunk, tehát csupán azt figyeltük, hogy az állat mutatja-e az adott viselkedésmintázatot vagy sem. Az általunk vizsgált viselkedések a következők voltak: táplálkozás, mászás, petézés, antenna mozgatása, láb mozgatása, ciripelés, párosodás, spermatofór evés és egyéb (mi a tisztálkodást figyeltük). A vizsgált mintázatokat a korábban már 4 fajjal végzett 24 órás megfigyelés alapján választottuk ki (Vadkerti Edit nem publikált adatai). 3.2.3. Adatok értékelése A táblázatban kapott adatokat Excell táblázatba vittük be. fajonként
kiszámoltuk,
hogy
az
egyedek
hány
százaléka
Egy adott időpontra produkálta
az
adott
viselkedésmintázatot. Az így kapott adatokat transzponáltuk az SPSS.11. program futó átlag (moving averages) opcióját alkalmazva (Ábrahám 1999). Ez az analízis lehetővé teszi egy adott időintervallum alatt megfigyelt adatok értékelését a kiugró értékek (mint „zaj”) tompításával. A tompítás az egymás mellett lévő adatok átlagolásával (Time series, Smoothing) történik. Az így módosított értékeket ábrázoltuk grafikusan. A százalékban kifejezett értékekkel hierarchikus clusteranalízist is végeztünk (Between-groups linkage, Squared Euclidean distance) és az eredményt dendogramon ábrázoltuk, szintén az SPSS.11. program segítségével.
14
4. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK 4.1. mtDNS vizsgálatok 4.1.1. Isophya-specifikus primerpár tervezése Kezdetben a PCR reakcióban egy nemzetközi adatbázisból kiválasztott rokon fajokra jól bevált primerpárral dolgoztunk. Néhány Isophya fajnál sikerült is eredményeket kapnunk, de több esetben a kísérletek nem adtak megfelelő terméket ezért új, az Isophya fajokra specifikusabb primerek tervezését láttuk szükségesnek. Ehhez mindegyik fajból meg kellett határoznunk egy hosszabb, a 16S – ND1 régiót lefedő DNS-szakasz szekvenciáját ún. „külső primerek” segítségével, majd az így kapott szekvenciákat egymáshoz illesztve meg kellett keresnünk a „belső primerek” tervezéséhez legideálisabb, mind a hat faj esetében konzerválódott,
lehetőleg azonos
szekvenciájú
DNS-szakaszokat.
Ezek
egymáshoz
viszonyított helyzetét úgy kellett meghatároznunk, hogy az általuk felsokszorozott DNSszakasz a két primerrel egész hosszában „elolvasható” legyen (500-600 bp). A „külső primerek” tervezéséhez a nukleotidszekvencia adatbázisban a következő mtDNS szekvenciákat használtuk fel: Gryllotalpa orientalis (mtDNS NC_006678), Locusta migratoria
(mtDNS
Sclerophasma
NC_001712),
paresisensis
(mtDNS
Periplaneta
fuliginosa
NC_007701),
(mtDNS
Tamolanica
NC_006076),
tamolana
(mtDNS
NC_007702), Timema californicum (mtDNS DQ241799). A szekvenciák illesztése után két konzerválódott, egymástól mintegy 900 bp távolságra lévő régióhoz terveztük a 16S-ORT (3. ábra) és ND1-ORT primereket (2. táblázat). A megszintetizáltatott „külső” primerek, és egy speciális PCR program segítségével sikerült is mind a hat Isophya faj DNS-mintájából a megfelelő régiót felsokszorozni (6. ábra). A kísérlethez mind a hat vizsgált fajból 1-1 egyedet használtunk fel (gyűjtés helye a 3.1.1. fejezetben). A PCR-fragmenteket tisztítás és izolálás után, a pJET1 vektorba (GeneJET PCR Cloning Kit,
FERMENTAS)
klónoztuk a használati utasítás szerint, majd meghatároztattuk az
inszert DNS-szakaszok bázissorrendjét mindkét oldalról. E célra a kitben lévő primereket (Forward és Reverse Sequencing Primer) használtuk fel. Ezen a módon szert tettünk egy 900 bp hosszú szekvenciára minden faj esetén. Ezeket a szekvenciákat egymással illesztve ki tudtuk választani azokat a konzerválódott szakaszokat,
15
amelyek mintegy 500 bp távolságra esnek egymástól és alkalmasak a 16S-ND1 régió felsokszorozására (7. ábra) és a pontos szekvencia megállapítására. A primerek tervezéséhez felhasznált régiókat mutatja a 4. és 5. ábra. Az új belső primereket (ISO-16S, ISO-ND1) úgy határoztuk meg, hogy közel essenek az elsőként alkalmazott primerek pozícióihoz, de jobban illeszkedjenek az Isophya konszenzus szekvenciához. Az 5. ábrán látható, hogy az ND1-ACR primerhely, közel a vele komplementer primer 3’ végéhez négy bázisban is eltér az Isophya konszenzus szekvenciától. Ez magyarázza az eredeti primer rosszabb használhatóságát.
3. ábra. A 16S-ORT primer tervezése. Go: Gryllotalpa orientalis, Lm: Locusta migratoria, Pf: Periplaneta fuliginosa, Sp: Sclerophasma paresisensis, Tt: Tamolanica tamolana, Tc: Timema californicum.
I. camptoxypha I. stysi I. modestior I. costata I. modesta I. kraussi
4. ábra. Az ISO-16S primer tervezése
I. camptoxypha I. stysi I. modestior I. costata I. modesta I. kraussi
5. ábra. ISO-ND1 primer tervezése
16
st
ladder
cam
mior
ma
kr
co
λ
6. ábra. Az Isophya fajok mtDNS templátszekvenciáján „külső” (16S-ORT, ND1-ORT) primerekkel végrehajtott PCR reakciók eredménye (sorrend: st – I. stysi, ladder, cam – I. camptoxypha, mior – I. modestior, ma – I. modesta, kr – I. kraussi, λ fág DNS PstI enzimmel emésztve és co – I. costata)
ladder
cam
st
mior
ma
kr
co
7. ábra. Az Isophya fajok mtDNS templátszekvenciáján „belső” (ISO-16S, ISO-ND1) primerekkel végrehajtott PCR reakciók eredménye (sorrend: ladder, cam – I. camptoxypha, st – I. stysi, mior – I. modestior, ma – I. modesta, kr – I. kraussi és co – I. costata)
17
4.1.2. mtDNS vizsgálat Az elemzéshez felhasznált fragmenteket az 1. táblázatban található ACR-1 PCR program és az általunk tervezett új „belső” primer alkalmazásával nyertük. A PCR-ban a polimeráz okozta hibák elkerülése miatt két független reakcióból származó terméket mértünk össze. A bázissorrend leolvasása a két primer segítségével, két oldalról történt. Mindkét oldali leolvasás ugyanazt a szekvenciát eredményezte, az így kapott végleges szekvenciákat használtuk fel összehasonlításra (8. ábra). a2 K1 K2 x s r c1 c2 c3 a1 L
: : : : : : : : : : :
* 20 * 40 * 60 * 80 ..........-.....................--.....................................................-.............................G..--.A..............................................A....-.............................G..--.A..............................................A....-.............................A..--.A..............................................G....-........................A.......--.......G.............T..........................AT....T ................................--.....................................................-................................--.................................................G...-................................--.................................................G...-................................--.....................................................-................................--.....................................................-.........................A.GAA.A...A..AT...A.......C.........TA..A.AA.....T...T.A..TA..G. CGTGAGCCAGgTCGGTTTCTATCCttAtt Tt T TTtaTaTtTTAGTACgAAAgGACCAagTAtTttAAATAaTTTaTtT tTT
: : : : : : : : : : :
84 85 85 85 87 85 85 85 85 85 89
a2 K1 K2 x s r c1 c2 c3 a1 L
: : : : : : : : : : :
* 100 * 120 * 140 * 160 * 1 ..--....................................A....................-.......G................... ----...............C.........................................-..T..AAG................... ----...............C.........................................-..T..AAG................... ----........T......C...............T.........................-..T...AG................... ..--T.......G.....................................C..........-........................... .---..............................................C..........-........................... -.--..............................................C..........-........................... -.--..............................................C..........-........................... -.--..............................................C..........-........................... ..--....................................A....................-.......G................... ....A....A..T.T.....................AA.CA............TT.........TTT.TTC....AA.........TAA gATTAtTA TaACTA TTTGGCAGATAAGTGcctTg ATTTAGAAT CAaaTATGTA AT agt tTACAggTAGTATTGActt
: : : : : : : : : : :
170 169 169 169 173 170 170 170 170 171 178
a2 K1 K2 x s r c1 c2 c3 a1 L
: : : : : : : : : : :
80 * 200 * 220 * 240 * 260 .............A................G..................C.....A....................G............ ..C.C...G.....A..G...................A..A..C........T...........G....................A..G ..C.C...G.....A..G...................A..A..C........T...........G....................A..G ........G.....A......................A..A..C........T...........G...............C.T..A..G .................................................C.....A....................G............ .......................A...............................A....................G............ ..........G.......................A......................................A.....A......... ..........G.......................A......................................A.....A......... ..........G.......................A......................................A.....A......... .............A................G..................C.....A....................G............ T......T.....TA.GTT...TT...AT.T...A..A..A...........T..AA.TA.AG.T..T.....A..T..AA.......T gAtAtGAa T TT Ta gTGTggTAAgaT TTT TT TT AT ATTTG GT TT gTggGgaT GCaTTTTT AC TT tTgGA CG
: : : : : : : : : : :
259 258 258 258 262 259 259 259 259 260 267
a2 K1 K2 x s r c1 c2 c3 a1 L
: : : : : : : : : : :
* 280 * 300 * 320 * 340 * ...........A....................T...........A...........G.....G....................A..... .....................G......................T....................A..A....GG.....T........ .....................G......................T....................A..A....GG.....T........ ...........G.........G..........A...........T..................T.A..A.....G.....T........ ...........G....................T.......................G........A..C.................... ...........G.........G.............................A....A..........................A..... .....A..................................................C..............G................. .....A..................................................C................................ .....A..................................................C................................ ...........A....................T...........A...........G.....G....................A..... ..A..A.....A........C.....A.....T..A.....G..T..G...T.....A.......A.....TAGT.....TA.T..... AAgGT TTAGG TATATTCAa TTCGtAAGGG CCtAATAAaGT GGaTTTgTAGG cTTCCtcA CC TTag GATGC tT AAATT
: : : : : : : : : : :
348 347 347 347 351 348 348 348 348 349 356
a2 K1 K2 x s r c1 c2 c3 a1 L
: : : : : : : : : : :
360 * 380 * 400 * 420 * 440 ........G................................................C.......................A....... A...................TC..................G....................A.....A.AC.......A........G. A...................TC..................G....................A.....A.AC.......A........G. A...............A..AGC..GGGGG...........G.......C............A.....A.AC.......A........G. .....T...........T...................................................A................... ........G........................................................................A....... ...............T......................................................................... ...............T......................................................................... ...............T......................................................................... ........G...........T............................................................A....... A...TGT.....ACAAC.TAT...TT..A.A..T......T....A........T..A......T..AAT...A.A..AT....G...A TTTacaA GGAggg gcgg CCcatttTgTCaAATTAT TTTTgTAtTATTTaTCtCCT TTgTT g TAtTtTT gC TTaTT g
: : : : : : : : : : :
437 436 436 436 440 437 437 437 437 438 445
a2 K1 K2 x s r c1 c2 c3 a1 L
: : : : : : : : : : :
* 460 * 480 * 500 * 520 * .....G.......C...................................C...C................................... .T..A...........T...........G....................A..G..A.................A...........T... .T..A...........T...........G....................A..G..A.................A...........T... GT..A........C..T.....G........GG...........C.G..A..G....................A.....G.....A... ................G....................................C................C.................. .....G.............CA......................C.........C................................... .....T.....................................C..............C..........................G... .....T.....................................C..............C..........................G... .....C.....................................C..............C..........................G... .....G.......C...................................C...C................................... .T..AG.T....T...T...T.....TATA.G.G.......C-C...T.G..T..A..--..C..........T...T.GA....T... t TG TaATTTa CC TAtgTaACTgt tTattTTCTTTTaa tTagG TT T TT tTTtTATGTTGtAC AGAaTagGAGT TAT
: : : : : : : : : : :
526 525 525 525 529 526 526 526 526 527 531
8. ábra. A mtDNS vizsgálatban összehasonlított Isophya fajok szekvenciái. (a - Isophya modesta, K - I. kraussi, x - I. camptoxypha, s - I. stysi, r - I. modestior, c - I. costata, L – Locusta migratoria)
18
A végső, filogenetikai analízisbe bevont mátrix 535 karaktert tartalmazott, amelyek közül 345 (64,5%) konstans, 114 (21,3%) változó, de parszimóniailag nem informatív, és 76 (14,2%) a parszimónia vizsgálatban informatív volt. A 16S rRNS és NADH-dehidrogenáz 1 régió MP analízisével kapott 256 azonos értékű filogenetikai törzsfa 265 egység hosszúságú, konzisztencia index (CI) 0,8906 abban az esetben, ha az összes karaktert bevontuk az elemzésbe, ezek kizárásával CI = 0,7914, az összetartozási index (RI) 0,8424. A végső konszenzus fát a 9. ábra mutatja. A dendogramból egyértelműen leolvasható, hogy mind a hat Isophya faj teljesen elkülönül a Locusta migratoria-tól, illetve, hogy az I. camptoxypha és az I. kraussi, valamint a másik négy Isophya faj két külön clustert alkot. Ez utóbbin belül az I. stysi és az I. modestior, illetve az I. modestior és az I. modesta egymáshoz való viszonyának bootstrap támogatottsága alacsony, kapcsolatuk nem egyértelmű. Azonban a korábbi morfometriai és izoenzimvizsgálatok alapján az I. stysi és az I. modestior szintén egymás mellé került a törzsfán (Vadkerti 2005). A származástani viszonyuk tisztázásához több egyed, illetve több lókusz bevonására van szükség. Az I. camptoxypha és az I. kraussi bootstrap értékei magasak, a közöttük lévő származástani kapcsolatot a korábbi izoenzim- és morfometriai vizsgálatok is alátámasztják (Vadkerti 2005). A 2005-ben elvégzett morfometriai vizsgálatok eredménye alapján készített diszkriminancia analízis szerint e két faj egyértelműen elkülönül a többitől az egyik tengely mentén. Locusta migratoria
Isophya stysi
59 I. modestior
54 I. modesta 2
100
100
I. modesta 1
I. costata 3
98 I. costata 1
96
74 I. costata 2
I. camptoxypha
92 I. kraussi 2
100 I. kraussi 1
9. ábra. A teljes 16S rRNS és NADH-dehidrogenáz 1 régió filogenetikai analízisével kapott MP konszenzus filogenetikai fa. A bootstrap értékek az egyes elágazások alatt és felett láthatók.
19
4.2. 24 órás aktivitásvizsgálat A tarsza fajok ciripelése éjjeli aktivitást mutat (10. ábra). A ciripelés 17 órától hajnali 6 óráig szinte folyamatos. Az I. kraussi, az I. camptoxypha és az I. costata kora este rövid időtartam alatt nagy aktivitásváltozást mutat. Az I. modestior és az I. modesta fajok átlagosan később válnak aktívvá és aktivitáscsúcsuk (max. 30%) is alacsonyabb a többi fajhoz képest, melyek aktivitáscsúcsa 70-100% között van. Napközben csak a I. camptoxypha, I. modestior és a I. kraussi fajok egyedei ciripeltek. Csak az I. camptoxypha aktivitása érte el az 50%-ot. 100
I. camptoxypha I. costata I. modesta I. modestior I. kraussi
80
%
60
40
20
0 1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
10. ábra. Tarsza fajok ciripelési aktivitása %-ban kifejezve
A hierarchikus clusteranalízis az I. modesta és az I. modestior fajokat ciripelési aktivitásuk alapján egy clusterba sorolta, viszonylag közel egymáshoz (11. ábra). A másik három faj külön clusterba került, de távol egymástól.
FAJ
Num
0 5 10 15 20 25 +---------+---------+---------+---------+---------+
I. modesta 1 I. modestior 3 I. kraussi 4 I. costata 5 I. camptoxypha 2
20
11. ábra. Tarsza fajok dendogramja ciripelésük aktivitása alapján
A tarsza fajok antennájuk mozgatása alapján szintén éjjeli aktivitásúnak mondhatóak (12. ábra). Délután három és öt óra között drasztikusan megnő mindegyik fajnál az antenna mozgatásának aktivitása, a csúcs fajtól függően 22 (I. camptoxypha) és hajnali 4 óra (I. costata) közé tehető. Az I. kraussi aktivitása napközben sem esett 20% alá.
100
I. camptoxypha I. costata I. modesta I. modestior I. kraussi
80
%
60
40
20
0 1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
12. ábra. Tarsza fajok antennamozgatási aktivitása %-ban kifejezve
A hierarchikus clusteranalízis eredménye szerint az I. camptoxypha az I. kraussi fajhoz, míg az I. modesta az I. modestior fajhoz hasonlít leginkább antenna mozgatási aktivitásuk alapján (13. ábra). Az I. costata külön ágba került távol a többi fajtól.
FAJ
Num
0 5 10 15 20 25 +---------+---------+---------+---------+---------+
I. camptoxypha 2 I. kraussi 4 I. modesta 1 I. modestior 3 I. costata 5
21
13. ábra. Tarsza fajok dendogramja antenna mozgatásának aktivitása alapján
A vizsgált fajok lábuk mozgatása alapján viszonylag egyenletes és csekély aktivitást mutatnak (14. ábra). Az aktivitás egyik fajnál sem éri el a 40%-ot. Az eredmények véleményünk szerint elsősorban a mintavételtől függnek, mivel a láb mozgatását, mint aktivitást elkülönítettük a mászástól és a tisztálkodástól. Ennek ellenére fontosnak tartjuk kiemelni, hogy míg napközben több alkalommal is inaktívak lehetnek lábuk mozgatása alapján a fajok, a 17 és 24 óra közti időszakban mindegyik faj aktivitást mutat. 100 90
I. camptoxypha I. costata I. modesta I. modestior I. kraussi
80 70 60
%
50 40 30 20 10 0 1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
14. ábra. Tarsza fajok lábmozgatási aktivitása %-ban kifejezve
A láb mozgatási aktivitás alapján a hierarchikus clusteranalízis az I. modesta és I. modestior fajokat egy clusterba sorolta, viszonylag kis távolsággal, míg a többi faj távol került mind tőlük, mind egymástól (15. ábra).
FAJ I. modesta I. modestior I. camptoxypha
Num 1 3 2
0 5 10 15 20 25 +---------+---------+---------+---------+---------+
22
I. kraussi
4
I. costata 5 15. ábra. Tarsza fajok dendogramja láb mozgatásának aktivitása alapján
A vizsgált tarsza fajok mászási aktivitásuk alapján éjjeli fajoknak mondhatóak (16. ábra). Mindegyik fajnak meredeken nő az aktivitása 17 órától és szintén meredeken csökken hajnali 5 órától. Legalacsonyabb az I. modestior aktivitása, melynek maximuma 20%, napközben 10 és 20 óra között pedig a vizsgálat alapján nem mozog. Az I. costata aktivitása a legmagasabb, maximuma 80% felett van.
100
I. camptoxypha I. costata I. modesta I. modestior I. kraussi
80
%
60
40
20
0 1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
16. ábra. Tarsza fajok mászási aktivitása %-ban kifejezve
A hierarchikus clusteranalízis eredményei alapján (17. ábra) az I. modesta, I. modestior és I. camptoxypha egy clusterbe került, míg tőlük nagy távolságra az I. kraussi és I. costata egy clustrerben van. Ez utóbbi két faj egymástól is viszonylag nagy távolságra van.
FAJ
Num
0 5 10 15 20 25 +---------+---------+---------+---------+---------+
I. modesta 1 I. modestior 3 I. camptoxypha 2
23
I. kraussi 4 I. costata 5 17. ábra. Tarsza fajok dendogramja mászásuk aktivitása alapján
A lábmozgással kapcsolatos aktivitások (mászás, lábmozgatás, tisztálkodás) együttes elemzése – mely így összevonva pontosabb képet ad ezen viselkedésmintázatukról - szintén a fajok éjszakai aktivitását erősíti meg (18. ábra). A fajok 17 órától 20 óráig egyre aktívabbak, az aktivitási maximumok 19 és hajnali 4 óra közé esnek fajtól függően. Legmagasabb aktivitást az I. kraussi és I. costata mutat. 100
I. camptoxypha I. costata I. modesta I. modestior I. kraussi
80
%
60
40
20
0 1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
18. ábra. Tarsza fajok mászási, lábmozgatási és tisztálkodási aktivitása összesítve %-ban kifejezve
A hierarchikus clusteranalízis eredményei alapján (19. ábra) az I. modesta, I. modestior és I. camptoxypha itt is egy clusterbe került, míg tőlük nagy távolságra az I. kraussi és I. costata egy clustrerben van. Ez utóbbi két faj egymástól is viszonylag nagy távolságra van.
FAJ
Num
0 5 10 15 20 25 +---------+---------+---------+---------+---------+
I. modesta 1 I. modestior 3
24
I. camptoxypha
2
I. kraussi 4 I. costata 5 19. ábra. Tarsza fajok dendogramja mászási, lábmozgatási és tisztálkodási összesített aktivitásuk alapján
A vizsgált tarsza fajok táplálkozásuk alapján nem mutatnak nagy különbséget az éjszakai és nappali aktivitás között (20. ábra). Mindegyik fajra jellemző, hogy az aktivitás maximum 30%, és ez 0 óra és déli 12 óra közé esik. 100 90
I. camptoxypha I. costata I. modesta I. modestior I. kraussi
80 70
%
60 50 40 30 20 10 0 1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
20. ábra. Tarsza fajok táplálkozási aktivitása %-ban kifejezve
A hierarchikus clusteranalízis eredményei alapján (21. ábra) az I. modesta, I. costata, I. modestior és I. camptoxypha egy clusterbe került, míg tőlük nagy távolságra van az I. kraussi.
FAJ
Num
0 5 10 15 20 25 +---------+---------+---------+---------+---------+
I. modesta 1 I. costata 5 I. modestior 3 I. camptoxypha 2
25
I. kraussi 4
21. ábra. Tarsza fajok dendogramja táplálkozásuk aktivitása alapján
Az összesített aktivitási görbe (22. ábra) 17 órától meredeken nő, az aktivitási maximum 21 és 23 óra közé esik, majd a meredekség fokozatosan csökken reggel 6 óráig. Kivétel ez alól az I. costata, melynek aktivitása hajnali 4 órakor is ugyan olyan magas, mint 23 órakor. A fajok aktivitási minimuma 14 és 17 óra közé esik. Szabadtéri körülmények között ez az időszak a legmelegebb napszak, és valószínűleg a fajok adaptálódtak az abiotikus körülményekhez, mely evolúciósan genetikailag rögzített viselkedésmintázatot alakított ki. Bár a megfigyelés standard hőmérsékleti körülmények között történt, viszonylag zárt térben, véleményünk szerint utóbbira vezethető vissza a tapasztalt aktivitásmintázat. 100 90
I. camptoxypha I. costata I. modesta I. modestior I. kraussi
80 70
%
60 50 40 30 20 10 0 1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
22. ábra. Tarsza fajok összesített aktivitása %-ban kifejezve
A hierarchikus clusteranalízis az I. modesta és az I. modestior fajokat összesített aktivitásuk alapján egy clusterba sorolta, viszonylag közel egymáshoz (23. ábra). A másik három faj külön clusterba került, ezen belül is az I. camptoxypha az I. kraussi fajhoz áll közelebb. FAJ I. camptoxypha
Num 2
0 5 10 15 20 25 +---------+---------+---------+---------+---------+
26
I. kraussi 4 I. costata 5 I. modesta 1 I. modestior 3 23. ábra. Tarsza fajok dendogramja összesített aktivitásuk alapján
5. ÖSSZEFOGLALÁS Kutatásunk során a magyarországi hat tarsza faj (Isophya camptoxypha, I. costata, I. modesta, I. modestior, I. kraussi, I. stysi) evolúciós viszonyainak analízisét végeztük el mtDNS vizsgálattal, valamint öt faj (az I. stysi kimaradt az elemzésből) bevonásával összehasonlító elemezést végeztünk 24 órás viselkedésmintázatuk alapján. Az evolúciós analízishez a mtDNS 16S és NAD1 régió, mintegy 500 bp hosszúságú szakaszát vizsgáltuk. A molekuláris munka során új primereket terveztünk, mivel a nemzetközi adatbázisokban közölt primerek nem megfelelően illeszkedtek a vizsgálni kívánt DNS szakaszokhoz. Első lépésben „külső” primereket terveztünk nemzetközi adatbázisból nyert rokon fajok szekvenciái alapján, majd ezek segítségével PCR technika alkalmazásával szaporítottuk fel a megfelelő szakaszokat mind a hat fajnál. Klónozással nyertünk megfelelő mennyiségű és minőségű DNS-t, majd szekvenálás után kiválasztottuk azt a DNS szakaszt, mely mind a 6 fajnál alkalmas lehet egy új primer megtapadásához. Erre a régióra tervezett „belső” primerrel már nagyobb biztonsággal sikerült kinyernünk az összehasonlítani kívánt fragmentet. Jelen dolgozatban a hat hazai tarsza faj 10 egyedének mtDNS 16S rRNS és NADHdehidrogenáz 1 régiójának alapján készítettük el filogenetikai törzsfájukat MP analízissel. Eredményünket összevetve morfometriai és izoenzimvizsgálatok adataiból készített törzsfákkal az Isophya stysi és az I. modestior, illetve az I. camptoxypha és az I. kraussi esetén a származástani kapcsolat alátámasztottnak látszik. De mivel a bootstrap értékek nem mindenhol erősítik meg a fajok egymáshoz való viszonyát, több egyed és más lókuszok bevonását látjuk szükségesnek ahhoz, hogy pontosabb képet kapjunk a fajok rokonsági fokáról. A 24 órás aktivitásvizsgálatba öt fajt vontunk be, 10-10 egyeddel. Az adatokat egyrészt „futó átlag” módszerrel értékeltük, majd grafikusan ábrázoltuk. Az eredmények alapján kimutattuk, hogy a tarszák több viselkedéstípus szerint is éjjeli aktivitású állatok, hasonló aktivitási mintázattal. Azonban a táplálkozási és a táplálkozással kapcsolatos mozgási 27
aktivitások nappal is jellemzik a fajokat, tehát éjjeli aktivitásuk részben cáfolt. Másrészt a fajonként átlagolt adatokból hierarchikus clusteranalízist végeztünk. Az öt mintázattípus összesített adataiból készített dendogram szerint az I. camptoxypha és az I. kraussi, valamint az I. modesta és az I. modestior viselkedésmintázata hasonlít legjobban. A mtDNS analízis és a 24 órás aktivitásvizsgálat összesített eredményeiből nyert dendogramok alapján az I. modesta és az I. modestior, illetve az I. camptoxypha és az I. kraussi az egymáshoz legközelebb álló fajok.
28
6. SZAKMÓDSZERTANI FEJEZET (BOROS MELINDA) 6.1. Bevezetés: A diplomadolgozat témáinak rövid ismertetése Diákköri munkám során hallgatótársammal együtt a magyarországi tarsza (Isophya, Orthoptera) fajok összehasonlító elemzését végeztem el mitokondriális DNS (mtDNS) analízis és 24 órás aktivitás-vizsgálat alapján. Hazánkban hat tarsza faj él. A tarszák az egyenesszárnyúak rendjébe tartozó, esti-éjjeli aktivitású, rejtőzködő életmódú, röpképtelen, polifág szöcskék. A hat faj közül kettő a magyar tarsza (Isophya costata Brunner von Wattenwyl, 1878) és a Stys tarszája (I. stysi Čejchan, 1958) fokozottan védett, három a pusztai tarsza (I. modesta Frivaldszky, 1867), a kárpáti
tarsza (I. camptoxypha (Fieber, 1853) és az illír tarsza (I. modestior Brunner von Wattenwyl, 1882) védett, nem védett az erdei tarsza (I. kraussi Brunner von Wattenwyl, 1878). Mivel a hat fajból öt védett, illetve fokozottan védett, így kétségtelen, hogy a vizsgálatuk során nyert információk akár a természetvédelmi munka megszervezésében is hasznosak lehetnek. Kutatásaink megkezdése előtt szükségessé vált a fajok begyűjtése. A tanszéken már korábban megkezdődött a tarszák vizsgálata, így jó néhány alkoholban tartósított egyed rendelkezésünkre állt a molekuláris analízishez, de az aktivitásvizsgálathoz élő példányokra volt szükségünk. Mivel védett fajokról van szó, gyűjtésükhöz engedély szükséges. A tarsza fajok a hímek által kiadott hangok alapján egyértelműen elkülöníthetők, a terepen detektálhatók. Mivel rejtőzködő, éjjeli aktivitású állatok, így gyűjtésük elsősorban hang alapján való egyedi megkereséssel történt. A fűháló alkalmazását nehezítette, hogy a tarszák jól strukturált gyepekben illetve bokrokban fordulnak elő. A mtDNS számos tulajdonsága miatt alkalmas az evolúciós kapcsolatok elemzésére. Munkánkban a 16S rRNS és NADH-dehidrogenáz enzim 1 alegységét kódoló mtDNS szakasz felhasználásával számítógépes programok segítségével szerkesztettünk filogenetikai törzsfát. A hat faj származástani kapcsolatát nem sikerült pontosan tisztázni, bár eredményeinket korábbi kutatások részben alátámasztották. A 24 órás aktivitásvizsgálatba öt fajt vontunk be, fajonként öt párral, azaz tíz-tíz egyeddel. A megfigyelés kezdete előtt két órával az állatokat páronként egy-egy ötliteres dunsztosüvegbe helyeztük, melyekbe aljzatként homokot tettünk, a homokba táplálékként és mozgási felületként is szolgáló málnavesszőt szúrtunk. A vizsgálat során minden egyes egyednél nyolc viselkedésformát figyeltünk meg. Eredményeinket fajonként összesítve szoftverek segítségével grafikusan ábrázoltuk, és adatainkból dendogramot készítettünk. Kimutattuk, hogy a vizsgált állatok szaporodást szolgáló viselkedéseik alapján éjjeli
29
aktivitásúak, hasonló aktivitási mintázattal. A dendogram alapján a fajok között aktivitásuk szerinti hasonlóságot állapíthattunk meg. 6.2. A diplomadolgozat témáinak a biológia tantárgy oktatásában való alkalmazásának lehetőségei A fenti leírásból kiderül, hogy kutatásaink a biológia tudományának több területére is kiterjedtek, ennek megfelelően több ponton is kapcsolható akár az általános, akár a középiskolai tananyaghoz. Például gimnázium 12. évfolyamában Az élőlények öröklődése c. témakörhöz köthetők a molekuláris vizsgálatokban alkalmazott géntechnológiai módszerek, az állatok megfigyelése pedig a 10. évfolyamon Az állatok szabályozó működése c. témakörön belül alkalmazható. A terepen szerzett ismeretek, a tarszák gyűjtése, azonosítása akár 6. osztályban a hazai életközösségek tanulásához, a mezők életközössége című részhez jól kapcsolható, illetve a 7. és 10. évfolyamon az élőlények rendszerezésénél, az ízeltlábúak törzsének tárgyalásánál bemutatható. Mivel a fontosnak tartom az oktatás során a diákok személyes élményeken alapuló ismeretszerzését, a természet aktív megismerését, ezért esett választásom a terepi munka, az állatok begyűjtése során szerzett tudás, tapasztalat oktatói munkában való alkalmazására. Ezt egy az általános iskola 7. osztályos (életkori sajátságoknak megfelelő változtatásokkal a 10. évfolyamos) biológia szakkörös tanulói számára szervezett terepgyakorlat, illetve az azt előkészítő és lezáró foglalkozások keretein belül valósítanám meg. A terepen egy vízi és egy szárazföldi élőhely gerinctelen, elsősorban ízeltlábú állataival, gyűjtésükre alkalmas módszerekkel ismerkednének meg a tanulók, majd a gyűjtött állatok határozására kerülne sor, ami jól illeszkedik az állatrendszertan témakörhöz (7. és 10. évfolyam). A patakokban előforduló gerinctelen állatok jól tükrözik az adott víz állapotát, a víz minősége ez alapján egy egyszerű vízminősítő lap segítségével meghatározható. Fontos, hogy a diákok megértsék, hogy egy adott terület élőlényeinek megismerése nélkülözhetetlen ahhoz, hogy felmérjük a térség természeti értékeit, azok állapotát, mert így bizonyosodhatunk meg arról, hogy szükséges-e a terület megóvása érdekében intézkedéseket tenni, esetleg a területet védelem alá helyezni. Azért, hogy mindezt belássák a tanulók, az előkészítő foglalkozások során elemezzük az emberi beavatkozások természetre gyakorolt hatásait, illetve tisztázunk néhány természetvédelemmel kapcsolatos alapfogalmat. A terepmunka és a felkészítő foglalkozások alatt megszerzett ismeretek jól illeszkednek a Nemzeti Alaptanterv Ember és természet műveltségi területéhez. A választott téma alkalmazása során a kiemelt fejlesztési feladatok közül lehetőség nyílik az énkép és 30
önismeret, a testi és lelki egészség, a tanulás és a környezeti nevelés megvalósítására, illetve az
említett
dokumentumban
megfogalmazott
kulcskompetenciák,
mint
például
a
kommunikációs és az együttműködési készség, valamint a problémamegoldó képesség fejlesztésére. A
kerettantervben
(Az
alapfokú
nevelés-oktatás
kerettantervei,
2000)
megfogalmazottak szerint az általános iskolában a biológia oktatásának célja, „hogy a tanulók tájékozottak legyenek a földi élővilág sokféleségéről, valamint az emberek és biológiai környezetük közötti kapcsolatrendszerről”, illetve „képesek legyenek az egészséges életvezetésre”. Ennek érdekében a pedagógusnak számos feladatot kell megvalósítania, mint például a hazai élőlények rendszerezése; vizsgálati módszerek elsajátításán, gyakoroltatásán keresztül az önálló ismeretszerzés képességének és igényének kialakítása; valamint annak nyilvánvalóvá tétele, hogy „az elsajátítandó tudás nem elsősorban önmagáért szükséges, hanem azért, hogy megértsék, és ennek alapján tudják befolyásolni a környező világ jelenségeit” a tanulók. Úgy gondolom, minderre lehetőség nyílik az általam választott téma feldolgozása, a terepgyakorlat és az azt előkészítő és lezáró foglalkozások során. 6.3. A terepi munka alkalmazása az oktatásban 6.3.1. A terepgyakorlatot előkészítő foglalkozások A terepgyakorlat előtt szükséges legalább két előkészítő szakköri foglalkozás (2x60 perc) beiktatása, ahol tisztázunk néhány a természetvédelemmel kapcsolatos fogalmat, ezen kívül a tanulók térkép segítségével megismerkednek a terepmunka helyszínével (Éger-völgy), röviden megbeszéljük a terepi teendőket, és hogy milyen felszereléssel érkezzenek, felelevenítjük az ízeltlábúakról tanultakat, a diákok megismerkednek a határozókönyv használatával. A tanulók a fontosabb fogalmakat, tudnivalókat munkanaplójukba jegyezik le. (Az alábbiakban a foglalkozások vázlatos menetét, a lényegesebb feldolgozandó témákat, az alkalmazandó eszközöket és módszereket, a képzés során megvalósítandó célokat közlöm.) Évfolyam: 7. évfolyam, szakköri foglalkozás (kb. 12 fő) A foglalkozás időtartama: 2x60 perc A foglalkozások során megvalósítandó célok: Oktatási célok: A tanulók lássák be, hogy milyen következményekkel jár az ember beavatkozása a természetbe. Ismerjenek meg néhány a természetvédelemmel kapcsolatos fogalmat (természetvédelem, védett egyed és faj, nemzeti park, tájvédelmi körzet, 31
természetvédelmi terület), tudjanak említeni hazai nemzeti parkokat, tájvédelmi körzeteket, természetvédelmi területeket. Lássák be, hogy a természet védelmének megvalósításához szükséges megismerni az adott objektumot, és ismerkedjenek meg erre alkalmas módszerekkel (ízeltlábúak gyűjtése, felismerése, határozása). Nevelési célok: -értelmi nevelés: új ismeretek tanítása során intellektuális képességek fejlesztése, tudásvágy felkeltése -környezeti nevelés: az emberi beavatkozás természetre való hatásának elemzése, a természet védelme érdekében megvalósítható lépések megtárgyalása során -természetvédelemre nevelés, erkölcsi nevelés és esztétikai nevelés: hazánkban előforduló természeti értékek említésén, védelmük fontosságának hangsúlyozásán, illetve a természetben való helyes viselkedés megbeszélésén keresztül Képzési célok: -önismeret és empatikus készség fejlesztése a szerepjáték során -jártasság szerzése a térképhasználatban, ízeltlábúak határozásában -együttműködő készség, problémamegoldó képesség fejlesztése a szerepjáték és a páros munka alatt -jegyzetelési és kommunikációs készség fejlesztése Anyagok és eszközök: szerepkártyák, fólia, írásvetítő, Védett értékeink c. plakátsorozat, Magyarország természetvédelmi térképe, A Mecsek turista térképe, fogalmakat tartalmazó kártyák vagy feladatlap, Simon T.-Csapody V.(1990): Kis növényhatározó, Tankönyvkiadó, Bp.; leírás a terepen szükséges felszerelésről, fűháló, ízeltlábú preparátumok, képek, Varga Z. (1983): Állatismeret, Tankönyvkiadó, Bp.; Dr. Móczár L. (1975): Kis állathatározó, Tankönyvkiadó, Bp., a természetjárás tízparancsolata fénymásolaton (Békefi-Bosnyák, 1. sz. melléklet)
32
Idő
A foglalkozás menete I. Természetvédelemmel megbeszélése
kapcsolatos
Módszer
Eszköz, Cél
fogalmak
0-15. 1.Bevezetésként motiváló, ráhangoló játék perc Szerepjáték (Nyiratiné) segítségével elemezzük, hogy milyen szerepjáték hatással lehet az emberi beavatkozás, pl. egy építkezés az élőlényekre. A játék alatt a tanulók egy erdei életközösség tagjainak bőrébe bújhatnak, és átgondolják, hogy az adott élőlényre hogyan hat a beavatkozás. tanári A játék megbeszélése: -megtárgyaljuk a játék során tapasztaltakat, kinek mennyire kérdések, beszélgetés volt nehéz a feladat, a tanulók szerint ki volt a legügyesebb -összeszedjük, hogy az erdő lakóit hogyan érinti a beavatkozás -napjainkban lakóhelyünk környékén megvalósítandó hasonló hatású esemény említése (Tubes, lokátor) 1520. perc
2. Beszélgetés az élővilág védelméről Az előző játék jó alkalmat ad arra, hogy megbeszéljük, beszélgetés hogyan valósítható meg az élőlények védelme (fajok védetté nyilvánítása, területek védelem alá helyezése), ill. hogy miért fontos ez (emberiség érdekeit szolgálhatja, hiszen nem tudhatjuk, melyik növény jelenthet táplálék-, energia- vagy gyógyító forrást a jövőben, esztétikai okok stb.). Rá kell világítani arra is, hogy az egyes élőlények egymásra utaltan élnek egy-egy közösségben, így fontos, hogy megőrizzük a természet sokféleségét, gazdagságát.
2045. perc
3. Védett objektumok típusaink ismertetése, fogalmak közlés, tisztázása (Békefi-Bosnyák) Tisztázandó fogalmak: tanulói Természetvédelem: társadalmi tevékenységek összessége, jegyzetelés melyeknek célja a természet értékeinek, rendszereinek a védelme Védett egyed és faj: természetes környezetben élő ritka növény- és állatfajok, egyedszámuk kicsi, kis területen fordulnak elő, a kipusztulás veszélyével fenyegetett fajok Pl.: magyar kikerics, magyar tarsza, fűrészlábú szöcske stb. (plakátról vagy maguktól a tanulók is mondjanak) Nemzeti park (NP): legsokoldalúbb természetvédelmi kategória, az ország legjelentősebb, közel természetes állapotában megtartott területeinek a megőrzésére, bemutatására szolgál. Hazai és nemzetközi előírásoknak is meg kell felelnie. Pl.: Duna-Dráva Nemzeti Park
szerepkártyák önismeret, problémamegoldó képesség fejlesztése, értelmi, erkölcsi, környezeti, természetvédelemre való nevelés környezeti és természetvédelemre való nevelés
fólia, írásvetítő, Védett értékeink c. plakátsorozat, Magyarország természetvédelmi térképe jártasság a térképhasználatban, együttműködő készség fejlesztése
33
Tájvédelmi körzet (TK): A védett táj legjellemzőbb tulajdonságainak megőrzésére szolgál. Területén csak a táj jellegét nem zavaró tevékenységek folytathatók. Hazai előírásoknak kell megfelelnie. Pl.: Kelet-Mecsek TK Természetvédelmi terület (TT): természeti ritkaságok védelmét szolgáló kisebb kiterjedésű terület. Lehetnek az előző két területen belül a legveszélyeztetettebb értékek védelmére szolgáló szigorúan védett területek. Pl.: Jakab-hegy -A tanulók keressenek példákat a védett fajokra, területekre páros munka plakát és térképek segítségével. 4555. perc
4. A védendő értékek kategóriáinak megismerése (BékefiBosnyák) tanári -Megbeszéljük, példákkal szemléltetjük, hogy a növényi és kérdések, állattani értékeken túl még milyen kategóriái lehetnek a beszélgetés védendő értékeknek (földtani, víztani, kultúrtörténeti, tájképi értékek).
5560. perc
5. Összefoglalás -Összefoglalásként párosíthatjuk a fogalmak meghatározását rögzítés és a hozzá tartozó fogalmakat kártyák segítségével.
fogalmakat és meghatározásukat tartalmazó kártyák
II. A terepgyakorlaton szükséges ismeretek megbeszélése 0-5. perc
1. Bevezetés: Az élővilág megismerésének fontossága -Néhány szóban felelevenítjük az előző órán hallottakat, közlés, majd megtárgyaljuk, hogy ahhoz hogy valamit védetté beszélgetés nyilvánítsanak, hogy védelmében hatékonyan el tudjanak járni, meg kell ismerni az adott élőhelyet, élőlényt, objektumot. Ezt szolgálja pl. az adott területről meglévő adatok felkutatása, ill. a különböző mintavételi eljárások, amik közül néhánnyal megismerkedhetnek a terepi munka során.
5-15. 2. A terepgyakorlat helyszínének megismerése perc -A terepgyakorlat helyszínének megnevezése (Éger-völgy), megkeresése térképen. -Megbeszéljük, hogy Éger-völgy, az Éger-patak mentén, a Nyugat-Mecsekben helyezkedik el, nevét az ott előforduló égerfákról kapta. Kikeressük az enyves égert határozóból, a kép alapján jellemezzük (Békefi-Bosnyák).
páros munka tanári kérdések, frontális osztályfoglalkoztatás
környezeti és természetvédelemre való nevelés
A Mecsek turistatérképe, Simon T.-Csapody V.: Kis növényhatározó (140141. o.)
34
-Levelei milyen erezetűek? Ez alapján a zárvatermők melyik osztályába tartozik? Milyen a levéllemez széle? A fiatal hajtások tapintása enyves, innen kapta a nevét. -Milyen típusú a porzós virágzat? -A nyáron zöld termős virágzatból ősszel feketésbarna tobozka fejlődik. Törzse sötétbarna, hosszanti repedésekkel. A terepen mindezt élőben megfigyeljük.
(visszamutató koncentráció)
1520. perc
3. A terepmunka rövid ismertetése -Az élővlág fajgazdagsága igen nagy, ezért a tudósok egyes közlés állat- és növénycsoportok kutatására specializálódnak. A gyakorlaton mi a gerinctelen állatokra, azon belül is egy csoportra, az ízeltlábúakra fogunk koncentrálni elsősorban. -A terepi munka rövid ismertetése (ízeltlábúak gyűjtése két helyszínen, felismerése az Állatismeret c. könyv alapján, vízminősítés), az öltözék és a szükséges felszerelés megbeszélése (leírást kapnak). Fűháló bemutatása. Ha fűháló nem áll a szakkörösök rendelkezésére, célszerű házi feladatnak kiadni az elkészítését a paraméterek megadásával.
2030. perc
4. Az ízeltlábúakról tanultak felelevenítése Az ízeltlábú osztályok (rákok, rovarok, pókszabásúak) egyegy képviselőjének képével vagy preparátumával és tanári kérdések segítségével felelevenítjük az osztályok főbb jellemzőit (testtájak, testfelépítés), összeszedjük az ízeltlábúak közös jegyeit (ízelt láb, szelvényezett test, kitinváz, vázhoz belülről tapadó izmok, vedlés).
3055. perc
5. A határozást, felismerést segítő könyvek bemutatása, frontális határozás gyakorlása Az Állatismeret és a Kis állathatározó c. könyvek osztályfogbemutatása, a határozó használatának ismertetése, határozás lalkoztatás a tanár irányításával, preparátum segítségével, a diákok párosával követik a menetét. Felmerülő fogalmak tisztázása.
5560. perc
6. A foglalkozás zárása Egyeztetjük kik dolgoznak párban a terepen, kik vállalják a beszélgetés fűháló elkészítését (ha szükséges), erről kérjünk visszajelzést. Megbeszéljük, hogy a terepen ügyelünk egymás és környezetünk épségére. A gyerekek otthoni tanulmányozásra fénymásolatban megkapják a természetjárás tízparancsolatát (Békefi-Bosnyák).
frontális osztályfoglalkoztatás (visszamutató belső koncentráció)
leírás a terepen szükséges felszerelésről, fűháló
ízeltlábú preparátumok, képek
Állatismeret, Kis állathatározó, ízeltlábú preparátumok, a természetjárás tízparancsolata fénymásolat (1. sz melléklet)
35
6.3.2. Terepgyakorlat Éger-völgyben A terepi munkálatokat érdemes egy hétvégi délelőttre tervezni májusban, találkozó az uránvárosi autóbusz állomáson, ahonnan a 22-es számú busszal mehetünk az Éger-völgy megállóig. A helyszín alkalmas vízi és szárazföldi ízeltlábúak gyűjtésére, a patak sekély, jól megközelíthető, így a diákok is bátran munkálkodhatnak. A pataktól nem messze, Éger-tetőn fűhálózásra alkalmas területet, tisztást találunk. A munka során a diákok fényképeket készítenek, melyeket a lezáró foglalkozáson a plakát készítéséhez felhasználnak. A fotósoknak három témát érdemes megadni: 1. Gyűjtési módok, 2. Ízeltlábúak a vízben 3. Ízeltlábúak a szárazföldön. A terepmunka időtartama: kb. 2,5 óra Helyszín: Éger-völgy A terepgyakorlat alatt megvalósítandó célok: Oktatási célok: A diákok sajátítsanak el néhány ízeltlábúak gyűjtésére alkalmas módszert, szerezzenek gyakorlatot az ízeltlábúak felismerésében, az elméleti órákon megtanultakat alkalmazzák a gyakorlatban. Ismerjék fel az állatok életmódja és testfelépítése közötti összefüggéseket. Szerezzenek jártasságot a terepnapló készítésében. Nevelési célok: -értelmi nevelés: megszerzett ismeretek alkalmazásával intellektuális képességek fejlesztése, tudásvágy felkeltése -egészséges életmódra nevelés a természetben, szabadlevegőn való időtöltés során -esztétikai, erkölcsi és természetvédelemre nevelés a természet szépségének, értékeinek megismerésén, a helyes viselkedés ösztönzésén keresztül Képzési célok: -együttműködő készség fejlesztése a páros és csoportos munka alatt -megfigyelőképesség, leíró készség fejlesztése, kutatótevékenység gyakorlása a gyűjtés és felismerés során -jegyzetelési és kommunikációs készség fejlesztése Anyagok és eszközök: elsősegély doboz, fényképezőgép, terepnapló, madzag, zsírkréta, papírlapok, ragasztószalag, gyűjtés eszközei (lehetőleg két vagy három diákra jusson egy darab): műanyag szűrő, kis edények (margarinos, tejfölös dobozok, fejenként kettő), fél literes dunsztosüveg kilyuggatott tetővel, papírcsíkokkal, fűháló, karó, Varga Z. (1983): 36
Állatismeret, Tankönyvkiadó, Bp.; Dr. Móczár L. (1975): Kis állathatározó, Tankönyvkiadó, Bp.; vízminősítő lap (National River Watch vagy a BISEL kiadványa, 2., 3., 4. számú melléklet) Idő
A foglalkozás menete
0-30. Előkészítés, ráhangolás perc -Megbeszéljük, mit olvastak otthon a diákok a természetben való helyes viselkedésről, felelevenítjük a helyszínről hallott ismereteket. -A tanulók naplójukba írják fel a helyszínt, dátumot, időjárást. -Megkeressük a völgynek nevet adó enyves égert, kéregmintázatot készítünk, levelet, termést gyűjtünk. 3090. perc
Módszer beszélgetés, tanulói jegyzetelés, páros munka
Ízeltlábúak gyűjtése -A létszámtól és az eszközök számától függően együtt vagy a csoportalakét helyszínen két csoportban is dolgozhatunk (ebben az kítás esetben szükséges még egy kolléga beszervezése). -Ellenőrizzük, hogy mindenkinek megvan-e a felszerelése!
Eszköz, Cél erkölcsi nevelés
zsírkréta, papír, ragasztószalag;
-Az adott helyszínen (patak, tisztás) a gyűjtés bemutatása, közlés, hangsúlyozva, hogy az állatokat megfigyelésre, határozásra magyarázat gyűjtjük, majd visszaengedjük élőhelyükre. Gyűjtés a patakban: Olyan szakaszt keresünk, ahol a tanulók is könnyen megvalósíthatják a feladatot. Köveket, ágakat emelünk ki, műanyag szűrővel a patak aljzatába merítünk, a vízzel átmossuk, a fogott állatokat vízzel félig töltött edénybe helyezzük. Gyűjtés a tisztáson: egy madzaggal kijelölt sáv mentén elindulunk, a fűhálóval jobbról, balról erőteljes lendítésekkel gyűjtjük be az állatokat (sávtranszekt). A megfogott ízeltlábúakat a hálóból dunsztos üvegbe ürítjük.
műanyag szűrő, edények, dunsztosüvegek, fűháló, madzag, karó
páros munka, beszélgetés, megfigyelés magyarázat
együttműködő, megfigyelőképesség fejlesztése
-Tanulók munkája: a gyűjtést 20-30 percig végzik párosával, hármasával. Közben megfigyeljük, megbeszéljük a vízi és a szárazföldi ízeltlábúak közti különbségeket, hogyan alkalmazkodtak az adott környezethez (az élettér, mozgásformák és testfelépítés kapcsolata). -Hogyan mozognak az ízeltlábúak a vízben/szárazföldön? -Mozgásformának megfelelően milyen típusú végtagokkal rendelkeznek? (szárnyak, ugróláb) -Milyen színűek a vízben/tisztáson talált állatok? Mit szolgálhat a környezethez hasonló, illetve a feltűnő színű kültakaró? -Mit tanultunk, mivel lélegeznek a vízben élő/szárazföldi ízeltlábúak? Megfigyeljük, hogy egyes vízi lárváknál a test oldalán helyezkednek el a kopoltyúk, másoknál nem látható, a testen belül találhatóak meg (tracheakopoltyú).
37
90150. perc
A gyűjtött állatok felismerése, vízminősítés -A begyűjtött állatokat a tanulók párosával a vízminősítő lap és az Állatismeret könyv alapján tanári segítséggel felismerik, azonosítják, az eredményt füzetükben rögzítik. Segítségként legyen kéznél határozó könyv. -A vízi élőlényeknél megfigyeljük, hogy a kérészlárváknak három, fonalszerű faroknyúlványa van, az álkérész lárvának kettő, a kis szitakötő lárváknak szintén három, de rövidebb, nem fonalszerű. A szitakötő lárváknál megfigyeljük a fogó szájszervként szolgáló álarcot (tanár mutassa be, sérülést okozhat). Felhívjuk a figyelmet a különböző kérészlárvák életmódja és testének alakja közti összefüggésekre (úszótorpedó, sodráskedvelő, kúszó-lapított, ásó-hengeres). -A vízminősítő lap szerint a gyűjtött állatok alapján elvégezzük a patak vízének minősítését. Megbeszéljük, hogy minél jobb a vizek minősége, annál több élőlénynek ad életteret.
páros munka beszélgetés, megfigyelés
közös munka
A terepgyakorlat zárása -Az állatokat visszaengedjük természetes élőhelyükre.
begyűjtött állatok, Varga Z.: Állatismeret, Dr. Móczár L.: Kis állathatározó, vízminősítő lap együttműködő, megfigyelőképesség, jegyzetelő készség fejlesztése
6.3.3. A terepgyakorlatot lezáró foglalkozás A lezáró foglalkozás alatt érdemes összegezni a terepi munkálatok alatt szerzett ismereteket, élményeket, és plakát formájában maradandó emléket készíthetünk a gyakorlatról. A foglalkozás időtartama: 60 perc A foglalkozások során megvalósítandó célok Oktatási célok: A plakát készítése során a szakkör alatt szerzett ismeretek áttekintésével diákok lássák át az elvégzett terepmunka értelmét. Nevelési célok: -értelmi nevelés a plakátkészítés alatt az ismeretek összegzése során -erkölcsi nevelés a csoportban való helyes viselkedésre való ösztönzésen keresztül -esztétikai nevelés a plakát készítése, értékelése során Képzési célok: -együttműködési és kommunikációs készség fejlesztése a csoportmunka alatt -manuális készség fejlesztése a plakátkészítés során -előadói és beszédkészség gyakorlása a plakátrészletek bemutatásakor
38
Anyagok és eszközök: terepnapló, térképrészlet Éger-völgyről, az enyves éger terepen begyűjtött levele, termése, az elkészített kéregmintázat, rajzlapok, karton lap a plakátnak, ragasztó, olló, színes ceruzák, filcek, terepen készült fényképek Idő
A foglalkozás menete
Módszer
Eszköz, Cél
Plakát készítése a terepgyakorlatról 0-5. perc
1. Előkészítés Az előzetesen kiválogatott fotók segítségével felelevenítjük a beszélgegyakorlat eseményeit (hol jártunk, mit és hogyan tés vizsgáltunk, mit szolgálhat egy adott terület élőlényeinek a megismerése).
fényképek
5-40. 2. Plakátkészítés perc -A tanulók három csoportot alkotva három témát dolgoznak kooperatív (eszközök az Anyagok fel, plakátrészletet készítenek, amit a munka végén csoportés eszközök elhelyeznek egy nagyméretű kartonlapra. A szükséges munka részben) eszközöket a három csoport asztalára előre kikészítjük, a együttműkökülön asztalon elhelyezett fényképekből a csoportok egy-egy dési, tagja válogasson. kommu1. csoport: A helyszín bemutatása (elhelyezkedés, elnevezés) nikációs, 2. csoport: Gyűjtés a réten (módja, gyűjtött állatok) manuális 3. csoport: Gyűjtés a patakban (módja, gyűjtött állatok, készség vízminősítés) fejlesztése, értelmi, erkölcsi, esztétikai nevelés
4055. perc
3. A három csoport bemutatja munkáját egymásnak
tanulói előadás
plakátrészletek előadói és beszédkészség gyakorlása
5560. perc
4. Az elkészült plakát közös értékelése Kinek melyik rész, miért tetszik a legjobban.
beszélgetés
plakát esztétikai nevelés
39
6.4. Mellékletek 1. számú melléklet: A természetjárás tízparancsolata (Békefi-Bosnyák) 1. Érezzétek magatokat otthon a természetben, de viselkedjetek vendégként! 2. Csak a kijelölt úton közlekedjetek! 3. Zivatar idején ne álljatok fa alá! 4. Tüzet csak a megengedett időben és kiépített tűzrakóhelyen gyújtsatok! 5. Vigyázzatok vizeink tisztaságára! Nyitott kutakból sohase igyatok. 6. Az erdőben csendben és figyelmesen haladjatok! 7. Öltözzetek mindig az időjárásnak megfelelően és rétegesen! 8. Barátkozzatok a természettel, mert csak így ismerhetitek meg szépségét, értékét! 9. Minden védett természeti értékre úgy vigyázzatok, mintha utolsó hazai példányát látnátok! 10. Őrizzétek meg a természet harmónikus rendjét, csak élményeiteket (feljegyzés, rajz, fotó stb.) vigyétek magatokkal!
40
2. számú melléklet: BISEL (Biotikus Index a Középiskolai Oktatásban, forrás: www.bisel.hu) I.
Indikátorcsoportok
II.
III.
érzékenység
taxonszám
IV. összes taxon száma 0-1
2-5
6 - 10
11- 15
>16
Biotikus Index ≥2
-
7
8
9
10
1
5
6
7
8
9
≥2
-
6
7
8
9
1
5
5
6
7
8
≥2
-
5
6
7
8
1
3
4
5
6
7
4
≥1
3
4
5
6
7
5
≥1
2
3
4
5
-
6
≥1
1
2
3
-
-
7
≥1
0
1
1
-
-
1 Álkérészek (Plecoptera)
Erezett kérészek (Heptageniidae)
2 Házas tegzesek (Trichoptera)
3 Sapkacsigák (Ancylidae)
Fenékjáró poloska (Aphelocherius)
Szitakötők (Odonata)
Kérészek (Ephemeroptera) kivétel a Heptageniidae
Bolharák (Gammaridae)
Puhatestűek (Mollusca) kivétel Sphaeridae és Ancylidae
Víziászka (Asellus)
Piócák (Hirudinea)
Gömbkagylók Poloskák (Sphaeridae) (Hemiptera) (kivétel az
Aphelocheirus)
Csővájó féreg (Tubificidae) Árvaszúnyogok (Chironomus thummi–plumosus)
Herelégy / pocikféreg (Syrphidae)
41
3. számú melléklet: A biotikus index értelmezése osztály
Biotikus Index
Szín
Megnevezés
I.
10-9
kék
nem szennyezett
II.
8-7
zöld
enyhén szennyezett mérsékelten szennyezett –
III.
6-5
sárga
- kritikus helyzet
IV.
4-3
narancs
erősen szennyezett
V.
2-1
vörös
nagyon erősen szennyezett
42
4. számú melléklet: Vízminősítő lap (National River Watch)
43
6.5. Összefoglalás Az elmúlt néhány évtizedben egyre nagyobb hangsúlyt kapott az élővilág sokféleségének, a Föld természeti értékeinek a megőrzése, védelme. Ahhoz, hogy ezt hatékonyan megvalósíthassuk fontos, hogy minél több információval rendelkezzünk egy adott élettérről, élőhelyről, az élőlényekről. A természettudományos tantárgyak keretein belül az alapórákon a diákok bővíthetik elméleti tudásukat, de sokszor gyakorlati ismeretek szerzésére nincs mód. Az általam választott téma, a terepen tartott szakköri foglalkozás az élővilág iránt fokozottabban érdeklődő gyerekek számára ad lehetőséget az állatvilág egy csoportjának, az ízeltlábúaknak alaposabb megismerésére, gyűjtési módszerek elsajátítására. A szabadlevegőn való tevékenykedés azon kívül, hogy új ismereteket és maradandó élményt nyújt a tanulóknak, hozzájárul az egészséges életmód, a természet szeretetének és tudatos védelmének kialakításához, alkalmat ad arra a diákoknak, hogy rácsodálkozzanak a természet szépségére, az élőlények sokféleségére. 6.6. Köszönetnyilvánítás Szeretnék köszönetet mondani Scheitler Adriennek, Dr. Stranczinger Szilviának és Dr. Vadkerti Editnek a munkám során nyújtott segítségért, hasznos tanácsokért.
44
7. SZAKMÓDSZERTANI FEJEZET (SZLOBODA ANITA) 7.1. Bevezetés Kutatásaink során a hat magyarországi tarsza faj (Isophya camptoxypha, I. costata, I. modesta, I. modestior, I. kraussi és I. stysi) evolúciós viszonyainak analízisét végeztük mtDNS analízissel, valamint összehasonlító elemzést készítettünk öt faj bevonásával 24 órás viselkedésmintázatuk alapján. A tarsza fajok esti-éjjeli aktivitású, rejtőzködő életmódú, röpképtelen – így alacsony diszperziós és kolonizációs képességű – polifág szöcskék. A hat faj közül kettő fokozottan védett (I. costatata és I. stysi), három védett (I. camptoxypha, I. modesta és I. modestior) és egy faj (I. kraussi) nem védett. Védettségi státuszukból egyértelmű, hogy a kutatásunk során nyert
információk
rendkívül
hasznosak
lehetnek
a
természetvédelmi
munka
megszervezésében. A mtDNS vizsgálatokban korábban begyűjtött és alkoholban tartósított egyedeket vizsgáltunk. Az evolúciós viszonyok elemzéséhez a 16S rRNS és a NADH-dehidrogenáz enzim 1 alegységét kódoló mtDNS szakaszokat használtuk fel. Munkánk során új primereket terveztünk, melyek segítségével már nagyobb biztonsággal sikerült kinyernünk az összehasonlítani kívánt – mintegy 500 bázispár hosszúságú – fragmentet. Az általunk kapott filogenetikai törzsfa ugyan mutatott egyezést a korábbi kutatások eredményeivel, azonban a származástani kapcsolatokat nem sikerült pontosan tisztázni; ehhez további lókuszok, illetve egyedek bevonására lenne szükség. A 24 órás aktivitásvizsgálatba öt fajt vontunk be (az I. stysi kimaradt az elemzésből, mivel nem állt rendelkezésünkre megfelelő mennyiségű minta), fajonként 10 egyedet vizsgáltunk. A mintákat fűhálózással és hang alapján történő detektálással gyűjtöttük. A kísérlet kezdete előtt két órával fajonként egy hím és egy nőstény egyedet helyeztünk a 25 db öt literes befőttesüveg mindegyikébe. Az üvegedényekbe aljzatként homokot tettünk, az aljzatba táplálék gyanánt egy-egy málnavesszőt dugtunk, ezzel biztosítottuk számukra a mozgásteret is. Minden egyes állatot fél percig figyeltünk harminc perces
időközökkel,
megfigyeléseinket
táblázatban
rögzítettük.
Összesen
nyolc
viselkedésmintázatot vizsgáltunk. Az adatok feldolgozása során egy adott időpontra fajonként kiszámoltuk, hogy az egyedek hány százaléka mutatta az adott viselkedésmintázatot, majd a megfelelő szoftver
45
segítségével módosított értékeket grafikonon ábrázoltuk, valamint a százalékos értékekből dendogramot készítettünk. A korábbi feltevést, miszerint a tarszák esti-éjjeli aktivitásúak részben sikerült cáfolnunk; mivel véleményünk szerint ez csak a párválasztással kapcsolatos viselkedés esetén egyértelmű. A kapott dendogram részben megerősítette a mtDNS vizsgálat eredményeit, de itt is további egyedek bevonására van szükség a pontosabb eredmények érdekében.
7.2. A diplomadolgozat témáinak a biológia tantárgy oktatásában való alkalmazásának lehetőségei Diplomamunkánk - melyet csoporttársammal közösen készítettünk - több ponton is kapcsolódik az általános, valamint a középiskolás tananyaghoz.
Szakdolgozatunk
molekuláris biológia része a gimnázium 12. évfolyamában „Az élőlények öröklődése” témakörön belül „A géntechnológia” és „A géntechnológia gyakorlati alkalmazásai” fejezetekbe építhető be, mely témakör az általános iskola 8. osztályában már előkerül, bár jóval egyszerűbb formában. Az általunk végzett 24 órás aktivitásvizsgálat, vagyis a megfigyelés, mint kísérleti módszer – a méréssel és vizsgálódással történő tapasztalatszerzés, az eredmények megfelelő értelmezése - a kerettanterv szerint már az általános iskola 7-8. évfolyamában is fontos szerepet kap. A gimnáziumban az állatok megfigyelése a 10. évfolyamon „Az állatok szabályozó működése” témakörön belül jelenik meg, így itt az általunk végzett 24 órás aktivitásvizsgálatnak egy egyszerűsített változata is kivitelezhető lenne szakköri foglalkozás keretében. A diplomamunka szakmódszertani fejezetét úgy készítettem el, hogy az megfeleljen a gimnáziumi kerettantervnek - valamint az érettségi követelményeknek -, így óravázlatom témája „Az élővilág evolúciója” témakörön belül „Az evolúció bizonyítékai” tanítási egység. E tanítási egység anyaga a gimnáziumokban gyakran használt - Dr. Lénárd Gábor: Biológia III. - tankönyvben nem jelenik meg, én mégis úgy gondolom, e tananyag rendkívül fontos a diákok korábbi ismereteinek összegzésében, tudásuk bővítésében. Célom, hogy a tanulók egy átfogó képet kapjanak az evolúció közvetett és közvetlen bizonyítékairól, illetve, képesek legyenek a molekuláris biológiai kutatások eredményeként kapott törzsfák alapfokú értelmezésére.
46
ÓRAVÁZLAT
Készítette: Szloboda Anita Biológia-környezettan
V.
évf. 47
Tanítás helye: Babits Mihály Gyakorló Gimnázium és Szakközépiskola Tanítás ideje: 2007. 05. 30. / 1. óra, 7.50 - 8.35 Tanít: Szloboda Anita Osztály: 12. D (biológia tagozatos osztály) Témakör: Az élővilág evolúciója Előző óra: A fajok kialakulása Következő óra: Összefoglalás: Az evolúció genetikai alapjai Tanítási egység: Az evolúció bizonyítékai Óratípus megnevezése: Vegyes típusú óra Oktatási feladatok: A tanuló értse meg az evolúció fogalmát, lényegét. Ismerje meg az evolúció közvetlen és közvetett bizonyítékait, képes legyen ezek bemutatására példák segítségével. Ismerje meg a kőzetek és élőlények kormeghatározásának módjait. Tudja, hogy miért van szükség a molekuláris törzsfák készítésére, képes legyen a törzsfa alapszintű elemzésére. Nevelési feladatok: Esztétikai nevelés: - táblavázlat készítésével - helyesen vezetett, szép, átlátható füzet alapján - fólia használatával Értelmi nevelés: - az ok-okozati viszonyok, összefüggések megláttatása - az emlékezés fejlesztése révén. Erkölcsi nevelés: - az önálló gondolkodásra, munkára nevelés révén Képzési feladatok: -
Szóbeli előadó készség fejlesztése.
-
Gondolkodás fejlesztése a tanári magyarázat által.
-
Jegyzetelés készségének fejlesztése az órai munka alapján.
-
Ábraelemző készség fejlesztése a molekuláris törzsfa segítségével.
48
Szemléltető eszközök: -
Táblavázlat: az evolúció közvetlen bizonyítékai, az evolúció közvetett bizonyítékai
-
Fólia: Darwin-pintyek adaptív radiációja, az evolúció közvetlen bizonyítékai, molekuláris törzsfa
Kellékek: -
Írásvetítő
-
Kréta, szivacs
-
Mutatópálca
-
Fóliák
-
Kártyák
49
I. Óra eleji rendtartó intézkedések
7.50
Köszönés, jelentés. II. Osztályfoglalkoztatás
7.51
Az előző órán megismerkedtetek a fajok kialakulásának különböző formáival, ezen evolúciós folyamatokat számos példa Ráhangolás a feleletre segítségével tárgyaltuk meg. - A fajok kialakulásának mely formája látható a fólián? Kinek a Fólia (1. sz. melléklet) nevéhez köthető ez a jól ismert példa? Darwin-pintyek adaptív Esztétikai nevelés radiációja.
Frontális osztálymunka
A mai felelő feladata: Ismertesse az izoláció (szaporodási izoláció) és az adaptív radiáció jelentőségét példákkal; valamint Erkölcsi nevelés mutassa be a konvergens és divergens fejlődést szintén egy-egy példa segítségével. Ismétlő kérdés: genetikai rátermettség III. A felelet értékelése és osztályozása
7.59
IV. Motiváció
8.00
- Tudjátok-e, hogy kinek a nevéhez fűződik az elhíresült állítás, Beszélgetés miszerint a biológiában minden csak az evolúció fényében nyer Frontális osztálymunka értelmet? Ezt Theodosius Dobzhansky – orosz genetikus, Értelmi nevelés zoológus - mondta - Mit gondoltok, mit jelent ez az állítás? 8.02 V. Célkitűzés A mai órán az evolúció közvetlen és közvetett bizonyítékaival
Közlés Esztétikai nevelés
fogunk megismerkedni. Nyissátok ki a füzetet és írjátok fel, az evolúció bizonyítékai. 8.03 VI. Átvezetés
Közlés
Először is nézzük meg mit is jelent az evolúció. Az evolúció kifejezés általánosan olyan változási folyamatot jelöl, amely
50
bizonyos
törvényszerűségek
szerint,
egy
irányban,
visszafordíthatatlanul megy végbe, és minőségi változásokat eredményez. Tehát az evolúció egy fejlődési folyamat, az egymást követő változások sorozata. Ez a fejlődési folyamat kétféle lehet: egyszerűbb állapotból a bonyolultabb állapot felé, Frontális osztálymunka
vagy pedig a bonyolultabb szervezet egyszerűsödik le. - Tudtok ez utóbbira példát mondani? A virág redukciója. Ahhoz, hogy a változások sorát pontosan megállapíthassuk meg kell ismernünk a rendelkezésünkre álló evolúciós bizonyítékokat.
8.05
VII. Részcélkitűzés Tehát a
következőkben
megnézzük
milyen
közvetlen Közlés
bizonyítékok állnak rendelkezésünkre. A fólián látható ábrák Frontális osztálymunka Fólia (2. sz. melléklet)
segítségével szedjük össze közösen, mik tartozhatnak ide. Az evolúció közvetlen bizonyítékai a földtörténet korábbi
idejéből fennmaradt ősmaradványok, mely leletek vizsgálatával, Tanári előadás kutatásával az őslénytan (paleontológia) foglalkozik. A fenyők elterjedésének köszönhetjük például a megkövült Táblavázlat
(3.
sz.
gyantából kialakult borostyánkőbe ágyazott állati maradványokat. melléklet) Földünk
állandóan
fagyos
területein
pedig
jégbe
zárt Esztétikai nevelés
élőlénymaradványokra bukkantak. Pl. a XX. Században több mamut tetemet is találtak Szibéria jegében. A
legismertebb
maradványok
a
fosszíliák,
melyek
tulajdonképpen az üledékes kőzetekben található kövületek. Ezen belül megkülönböztethetünk élő-, valamint vezérkövületeket. - Mit gondoltok, mik lehetnek az élő kövületek?
Frontális osztálymunka
Olyan élőlényekre használjuk az élő kövület kifejezést, Közlés melyek hosszú idő óta változatlan formában élnek. - Tudtok erre példát mondani korábbi tanulmányaitokból? (pl. Frontális osztálymunka bojtosúszójú hal, hidasgyík, Nautilus, mamutfenyő, cikászfenyő, páfrányfenyő) A
vezérkövületek
pedig
olyan
maradványok,
melyek Közlés
segítségével egy korszak kőzeteit lehet azonosítani, ilyenek pl.
51
Trilobiták, Ammoniták, amőbaszerű egysejtűek, virágporszemek. Az evolúció kutatásában – az egymást követő változások sorának
felállításában
-
nagy
szerepe
van
a
kor
meghatározásának, aminek köszönhetően megtudhatjuk, hogy a leletek hány éve alakultak ki, mikor élt az élőlény, melynek maradványa előkerült. A relatív kormeghatározás lényege, hogy az ősmaradványok Tanári előadás egymásutániságát, keletkezési sorrendjét megállapítsák. Például, megnézik, hogy az üledékes kőzetek mely rétegeiből kerültek elő a leletek, és ez alapján következtetnek kialakulásuk sorrendjére. Általában a fiatalabb maradványok a későbbi, vagyis a felszínhez közelebbi üledékrétegekben találhatóak. Az abszolút kormeghatározás során az ősmaradványok hozzávetőleges korát állapítják meg. E körmeghatározásnak kétféle módját nézzük meg a következőkben. A radioaktív kormeghatározás alapja, hogy a magmás kőzetekben előforduló radioaktív izotópok mennyisége a bomlás során – a felezési idő alatt – a felére csökken; ez az érték az izotópra jellemző állandó. A kőzetek meghatározására a rubídium-stroncium módszert alkalmazzák. Mivel a bomlás meglehetősen lassú, ezért ezzel a módszerrel több százmillió vagy akár milliárd éves kőzetek kora is megállapítható. Az élőlények korának meghatározására pedig a radioaktív 14-es Közlés szénizotópon alapuló radiokarbon módszert alkalmazzák. Ennek lényege, hogy a légköri szén-dioxid a stabil, nem bomló 12-es Tanári magyarázat szénizotóp mellett állandóan azonos arányban radioaktív 14-es Értelmi nevelés szénizotópot is tartalmaz. Ez az izotóp a kozmikus sugárzásoknak köszönhetően folyamatosan képződik és a radioaktivitás révén állandóan fogy is. A légkörből a 12-es és a 14-es szénatomokat tartalmazó szén-dioxid a fotoszintézis során beépül a növények szerves anyagaiba, és a tápláléklánc útján valamennyi élőlényben megjelenik. Az élőlények pusztulását követően a 14-es szénizotóp a radioaktív bomlás miatt fogyni kezd, a 12-es szénizotóp
52
mennyisége viszont változatlan marad. A két izotóp arányából megállapítható, hogy mennyi idő telt el az ősmaradványt létrehozó
élőlény
pusztulása
óta.
A
radioaktív
bomlás Közlés
meglehetősen gyors folyamat, ezért csak 50 ezer évesnél fiatalabb leletek korát lehet e módszerrel megállapítani, mert az idősebb maradványokban a 14-es szénizotóp mennyisége már nem mérhető pontosan. A gyors lebomlás miatt az élőlények lágy szöveteiből kövületek nem képződhettek, de helyenként, életnyomok (pl. mászásnyomok, lábnyomok) és lenyomatok fennmaradtak a szerencsés földtani körülményeknek köszönhetően. A Földünkön lezajló események pontos feltárásában azonban nagy gondot jelent, hogy minél távolabbra tekintünk vissza a Föld történetébe, annál kevesebb lelet áll rendelkezésünkre, hiszen az idő előrehaladtával a maradványok roncsolódása, eltűnése egyre nagyobb mértékű. 8.18
VIII. Részösszefoglalás
- Soroljátok fel, mik tartoznak az evolúció közvetlen bizonyítékai Frontális osztálymunka közé? Mondjatok egy-egy példát is!
Értelmi nevelés
- Miért fontos a kormeghatározás az evolúció kutatásában? Mely két fő típusát említettük? 8.20
IX. Átvezetés
Amennyiben közvetlen evolúciós bizonyítékok nem állnak Közlés rendelkezésünkre,
egyéb
eszközökhöz
folyamodhatunk
az
evolúciós kapcsolatok bizonyítására, vagyis megvizsgálhatjuk a közvetett bizonyítékokat. X. Részcélkitűzés
8.21
Tehát a következőkben áttekintjük a közvetett evolúciós Közlés bizonyítékokat. Sok tudományterület sokféle eredménye sorolható Táblavázlat ide, ezek közül említünk meg néhányat.
(4.
sz.
melléklet)
53
Ide soroljuk a biokémiai bizonyítékokat. Nézzük meg Esztétikai nevelés közösen, melyek lehetnek ezek. Mint tudjátok, az élőlények sejtes felépítésűek és a sejtek Beszélgetés alapszabása (sejthártya, citoplazma, örökítő anyag) megegyezik; valamint a sejtekben lezajló legfontosabb anyagcsereutak (erjedés, biológiai oxidáció, nukleinsav- és fehérjeszintézis) a különböző élőlénycsoportokban nagyon hasonló módon mennek végbe. Ezen kívül, a fehérjék szintézisét meghatározó kódszótár Közlés az egész élővilágban univerzális: az örökítő anyag egyes bázishármasai
ugyanannak
az
aminosavnak
a
beépülését
határozzák meg minden élőlény sejtjeiben. Ez valamennyi élőlény közös származást támasztja alá. Így rendkívül fontos a DNSvizsgálatok szerepe is az evolúció kutatásában. A különböző élőlények örökítő anyagának bázissorrendjét összehasonlítva következtetni lehet a ma élő fajok rokonságának mértékére, mivel az élőlények DNS-állományának eltérései alapozzák meg a testfelépítés és az egyedfejlődés eltéréseit is. Közvetett bizonyítékok még a molekuláris törzsfák, melyek a Közlés kormeghatározásra és a rokonsági kapcsolatokra utaló ábrák. A molekuláris
vizsgálatok
révén
az
élőlények
rokonsági
összefüggései megállapíthatók. A különböző fajok azonos molekulájának
aminosavsorrendjét
megismerve
és
összehasonlítva rájöttek, hogy a fajok bizonyos mennyiségű aminosavban különböznek egymástól, mely révén következtetni lehet a rokonsági kapcsolatokra, az elágazási pontokra, amelyből eljuthatunk
a
jelenlegi
állapotra.
Minél
több
bázisban
különböznek, annál távolabbi rokonok. A molekuláris törzsfákról könnyen leolvasható a fajok közötti rokonsági kapcsolat. - Mi látható a fólián? Molekuláris törzsfa.
Fólia (5. sz. melléklet)
- Gondoljátok végig, milyen rokonsági kapcsolat lehet a törzsfán Frontális osztálymunka látható fajok között! Vajon mely fajok állnak legközelebb Értelmi nevelés egymáshoz, illetve melyek lehetnek az egymással legtávolabbi rokonok?
54
Végül tekintsük át vázlatosan, hogy milyen szervezettani és Közlés fejlődéstani bizonyítékok vannak: - Ide tartoznak, egyrészt a homológ szervek, melyek azonos felépítésű, de különböző működést végző szervek; ezek fejlődésre utaló bélyegek; pl. a négylábú gerincesek mellső végtagjai. - Mint azt már tanultátok, az embriók fejlődése hasonló, pl. cápa, gőte, csirke, juh, ember egyedfejlődése kezdetén nagy a hasonlóság, azonban később a különbségek egyre kifejezettebbek. - Ilyen bizonyíték lehet még két faj hasonló betegsége; pl. az emberszabású majmok, a majmok és az ember egyaránt megkapja a szifiliszt és a tbc-t. XI. Összefoglalás
8.30
Most mindenki kap egy kártyát, melyen egy fogalom vagy egy Osztályfoglalkoztatás élőlény neve szerepel. Gondoljátok végig, hogy az adott fogalom Kártyák
(6.
sz.
vagy élőlény hova tartozik a táblavázlatban! Majd egyesével melléklet) gyertek a táblához, és a mágnesek segítségével helyezzétek fel a Értelmi nevelés kártyátokat a megfelelő helyre, szükség esetén rövid indoklással! A következő óra összefoglalás. Nézzétek át „Az evolúció genetikai alapjai” fejezetet a könyv és a füzet segítségével! XII. Óra végi rendtartó intézkedések
8.34
Az osztály munkájának értékelése, elköszönés.
55
7.3. Melléklet: 1. számú melléklet: Darwin-pintyek adaptív radiációja.
2. számú melléklet: Az evolúció közvetlen bizonyítékai
Borostyánba zárt termesz
Cédrushajtás lenyomata
A lábasfejűek kövületei
Ősállat lábnyomai (ipolytarnóci lelőhely)
56
3. számú melléklet: Táblavázlat A. Az evolúció közvetlen bizonyítékai a) jégbe vagy borostyánba zárt élőlények b) kövületek •
élő kövületek
•
vezérkövületek
•
kormeghatározás - relatív - abszolút: radioaktív és radiokarbon
c) lenyomatok
4. számú melléklet: Táblavázlat B. Az evolúció közvetett bizonyítékai a) biokémiai bizonyítékok •
élőlények sejtes felépítése
•
anyagcsereutak hasonlóak
•
a genetikai kód általános érvényű
•
minden élőlény örökítő anyaga a DNS
b) molekuláris törzsfa: kormeghatározásra és rokonsági kapcsolatokra utaló ábrák c) szervezettani és fejlődéstani bizonyítékok •
homológ szervek
•
embriók hasonló fejlődése
•
két faj hasonló betegsége
57
5. számú melléklet: Molekuláris törzsfa
pusztai tarsza illír tarsza stys tarszája magyar tarsza kárpáti tarsza erdei tarsza k. vándorsáska
6. számú melléklet: A kártyákon szereplő fogalmak és élőlények bojtosúszójú hal, hidasgyík, Nautilus, mamutfenyő, cikászfenyő, páfrányfenyő, Trilobiták, Ammoniták, amőbaszerű egysejtűek, virágporszemek, lábnyomok, 14-es szénizotóp, rubídium-stroncium módszer, felezési idő, négylábú gerincesek mellső végtagjai, élőlények kormeghatározása, kőzetek kormeghatározása, kagylók, csontok, fatörzsek, levelek, aminosavsorrend, rokonsági kapcsolatok, elágazási pontok, egyedfejlődés kezdetén hasonlóak, fejlődésre utaló bélyegek, ősgyíkmadár, magmás kőzet
58
7.4. Befejezés Az általam kitűzött oktatási, képzési és nevelési feladatokat megvalósítva a tanulók egy átfogó képet kaphatnak az evolúció bizonyítására vonatkozóan. Az óra tervezése során alapvető célként tűztem ki a diákok korábbi ismereteinek, tudásának logikus láncolatba fűzését, biológiai műveltségük fejlesztését, illetve, hogy a megszerzett tudás felhasználásával képesek legyenek a manapság egyre nagyobb teret hódító áltudományos gondolkodás felismerésére, kritikus fogadására és cáfolására.
59
8. IRODALOM Ábrahám L. and Vas J. (1999): Preliminary Report on Study of the Daily Activity Pattern of Neuroptera in Hungary Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica 34 (1-2), 153-164. Dr. Békefi I., Bosnyák M. (1998): Barátunk a természet, Tanári kézikönyv természetvédelmi szakkör vezetéséhez DK-Dunántúl területére, Janus Pannonius Tudományegyetem, University Press, Pécs Felsenstein, J. (1985): Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 39: 783-791. Heller K. G., Oci K. M., Grein G. and Ingrisch S. (2004): The Isophya species of Central and Western Europe (Orthoptera: Tettigonioidea: Phaneropteridae). Tijdschr. Ent. 147: 237-258. Hillis D. M., Moritz C., Mable B. K. (ed.) (1996): Molecular systematics. Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massachusetts 654 pp. Hochkirch A. (2001): A Phylogenetic Analysis of the East African Grasshopper Genus Afrophlaeoba Jago, 1983 (Orthoptera: Acridoidea: Acrididae). Dissertation, Cuvilier Verlag, Göttingen: 194 pp. Ish-Horovicz D. and J. F. Burke (1981). Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res. 9: 2989-2998. Kluge A. G. and Farris J. S. (1969): Quantitative phyletics and the evolution of anurans. – Systematic Zoology 18: 1-32. Dr. Lénárd Gábor: Biológia III. Nemzeti Tankönyvkiadó RT, Budapest, 2003 Lodhi M. A., Guang-Ning Ye, Weeden N. F. and Reisch B. I.. (1994): A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars, Vitis species and Ampelopsis. Plant Molecular Biology Reporter 12(1): 6-13. Motley T. J., Wurdack K. J. and Delprete P. G. (2005): Molecular Systematics of the Catesbaeeae Chiococceae complex (Rubiaceae): Flower and fruit evolution and biogeographic implications. Amer. J. Bot. 92(2): 316-329. Dr. Móczár L. (1975): Kis állathatározó, Tankönyvkiadó, Bp Nei M. and Kumar S. (2000): Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford University Press, New York p. 126-127.
60
Nicholas K. B., Nicholas H. B. and Deerfield D. W. (1997): GeneDoc: analysis and visualization of genetic variation. EMBNEW News 4: 14-14. Nyárády K., Antal F. (2005): Tarsza fajok (Orthoptera, Tettigoniidae, Isophya) variabilitása Baranya-megyében (TDK dolgozat). Nyiratiné Németh I. (2004): Módszertani kézikönyv nemcsak környezeti nevelőknek, Magyar Környezeti Nevelési Egyesület, Budapest Pashley D. P., Ke L. D. (1992): Sequence evolution in the ribosomal and ND1 genes in Lepidoptera: implications for phylogenetic analysis. Molecular Biology and Evolution 9:1061-1075. Dr. Perendy Mária: Biológiai témavázlatok. (1. kiadás) Nemzeti Tankönyvkiadó, Budapest, 2000 Podani J. (1997): Bevezetés a többváltozós biológiai adatfeltárás rejtelmeibe. Scientia Kiadó, Budapest. 412 pp. Sambrook J., E. F. Fritsch et al. (1989): Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Simon T.-Csapody V. (1990): Kis növényhatározó, Tankönyvkiadó, Bp. Swofford D. L. (2001): PAUP*. Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods) Version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. Szövényi G., Nagy B., Orci K. M. (2001): Isophya szöcskepopulációk Magyarországon. Isépy I., Korsós Z., Papp I. (szerk.) II. Kárpát-medencei Biológiai Szimpózium (Előadások
összefoglalói).
A
Magyar
Biológiai
Társaság
és
a
Magyar
Természettudományi Múzeum Kiadványa, Budapest, 255-258. Thompson J. D., Higgins D. G. and Gibson T. J. (1994): CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. – Nucleic Acids Res. 22: 4673–4680. Thorpe J. P., Solé-Cava A. M. (1994): The use of allozyme electrophoresis in invertebrate systematics. Zoologia Scripta 23, 3-18. Vadkerti E. (2005): Isophya (Orthoptera) fajok Magyarországon: populációbiológia, morfometria (Ph.D. értekezés, Debrecen), 101 pp. Varga Z. (1983): Állatismeret, Tankönyvkiadó, Bp. Vogler A.P., DeSalle R. (1993): Phylogeographic petterns in costal north american tiger beetles (Cicindela dorsalis Say) inferred from mitochondrial DNA sequences Evolution 47 (4) 1192-1201.
61
www.bisel.hu www.okm.gov.hu/letolt/kozokt/ii/biologia2.rtf www.okm.gov.hu/letolt/kozokt/nat2003/kr/02_bevezetojavveg.rtf www.sulinet.hu
9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozunk a DDNP Igazgatóságának, hogy a kutatáshoz engedélyezte az egyedek begyűjtését, továbbá Vadkerti Editnek, Dr. Putnoky Péternek, Dr. Hoffmann Gyulának és Stranczinger Szilviának a munkánk során nyújtott segítségükért.
62
