Az északi pocok mtdns kontroll régiójának elemzése

Az északi pocok mtDNS kontroll régiójának elemzése

DIPLOMADOLGOZAT

készítette: ANTAL FERENC biológus hallgató

témavezető: Dr. PUTNOKY PÉTER PTE TTK Biológiai Intézet Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék

PÉCS, 2005.

Az északi pocok kontroll-régió DNS-szekvenciája - 2

Tartalomjegyzék 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.1. Az északi pocok 1.2. A mitokondrium és a mitokondriális DNS

13 13 15

2. CÉLKITŰZÉSEK

18

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Mintavétel 3.2. DNS-izolálás 3.3. Polimeráz láncreakció (PCR) 3.4. Gélelektroforézis 3.5. DNS-fragment izolálás 3.6. Kompetens sejtek készítése 3.7. Ligálási reakció 3.8. Transzformáció 3.9. Plazmid DNS izolálás, „miniprep” 3.10. Plazmid DNS emésztés restrikciós endonukleázokkal 3.11. DNS-szekvenálás 3.12. A szekvenciaadatok értékelése

19 19 19 19 11 11 11 11 12 12 13 13 13

4. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 4.1. Heterológ primerek tervezése és az mtDNS izolálása 4.2. A tervezett primerekkel felsokszorozhatók a megfelelő mtDNS régiók 4.3. Fajspecifikus primerek tervezése és a szekvencia meghatározása 4.4. M. oeconomus D-loop szekvenciák az adatbázisokban 4.5. A kis-balatoni északi pocok populáció előzetes elemzése 4.6. Szekvenciaeltérések más fajokhoz képest 4.7. Felmerülő kérdések, folyamatban lévő kísérletek

14 14 15 17 19 21 21 25

5. ÖSSZEFOGLALÁS 6. RÖVIDÍTÉSEK 7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 8. FELHASZNÁLT IRODALOM8.

26 27 28 29


1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS Charles Darwin óta sok biológus álma az, hogy a Földön található összes organizmus evolúciós történetét rekonstruálja és azt egy törzsfa formájában összegezze. Kezdetben csupán a fosszilis leleteket használták a probléma megoldására. Később az összehasonlító morfológia és fiziológia is felkerült az alkalmazott eljárások közé. Ezen módszerek azonban elégtelennek bizonyultak egyrészt azért, mert a fosszíliák helyenként hiányosak, másrészt azért, mert a morfológiai és fiziológiai karakterek olyannyira bonyolultak, hogy nem képesek tiszta képet nyújtani az evolúciós változásokat illetően. A molekuláris biológia eredményei ezt a helyzetet megváltoztatták. Az organizmusok evolúciós leszármazása tanulmányozható a DNS molekulájuk összehasonlításával. Ez az eljárás számos előnnyel rendelkezik a klasszikus módszerekhez

képest.

Olyan

összevetéseket

tesz

lehetővé,

amelyek

korábban

elképzelhetetlenek voltak. Minden organizmus genomja nukleotidok hosszú szekvenciájából áll és a morfológiai karaktereknél sokkal több filogenetikai információt tartalmaz. A mitokondriális DNS szekvenciák összehasonlítását az utóbbi három évtizedben számos alkalommal alkalmazták, és ma is alkalmazzák a megfelelő következtetések levonására a fajok és populációk evolúciós és demográfiai múltját, illetve jelenlegi állapotát illetően. Célunk az, hogy komplex képet kapjunk az északi pocok hazai populációinak állapotáról mitokondriális DNS-szekvenciák vizsgálatával. Az elkövetkező oldalakon e munka kezdeti lépéseit szeretnénk bemutatni. 1.1. Az északi pocok Az északi pocok (Microtus oeconomus) egy 23 alfajjal rendelkező holarktikus elterjedésű rágcsáló, az egyetlen olyan Microtus faj, amely egyaránt előfordul Észak-Amerikában és Eurázsiában. A jelenlegi előfordulása Alaszkától Észak-Ázsián át egészen Nyugat-Európáig húzódik, ahol számos szigetszerű populációt foglal el (Mitchell-Jones et al. 1999). Az utolsó eljegesedés idején Európában egyetlen nagy egyesült populációban élt a mai Közép-Európa jelentős részén. A jégtakaró visszahúzódásával a habitat északi és keleti irányban kiszélesedett, hátrahagyva számos szétszórt reliktum populációt (Ligtvoet, 1985). Magyarországon lokálisan veszélyeztetett, fragmentálódott és izolálódott populációkban fordul elő. A szétszórt populációk jégkori reliktumok és különböznek a leggyakrabban előfordulóktól. Napjainkban csak 3 fennmaradt populáció található a Nyugat-Dunántúlon (Papp et al. 2000), amelyek a M. oeconomus méhelyi alfajt reprezentálják (Éhik, 1928). A Nemzeti Biodiverzitás-monitorozó Rendszer a kiválasztott monitorozandó objektumoknak


megfelelően különböző léptékben szervezett monitorozási projektekben kívánja megvalósítani hazánk biodiverzitásának hosszabb távú vizsgálatát (Láng, 1997). Ennek megfelelően az összesen tíz projektből álló rendszerben fontos szerepet kapott a Kis-Balaton II. ütem élővilágának monitorozása. Az egyik fő feladat az északi pocok, M. oeconomus elterjedésének pontos megismerése, illetve annak vizsgálata, hogy a vízminőség védelmi rendszernek milyen hatása van a kiválasztott mintaterületek kisemlős-közösségére a diverzitás és az időben történő változás tekintetében. Az izolált populációk kipusztulásának valószínűsége negatív összefüggést mutat a populáció méretével. A környezeti tényezők változása és a demográfiai ingadozások jelentősen befolyásolják a populációk génállományát és a populáció sérülékenységét növelő genetikai erózióhoz vezethetnek (Bijlsma and Loeschke, 1997; Gaines and Whittam, 1980). Az európai populációk genetikai felépítését korábban már tanulmányozták kromoszóma polimorfizmus, izoenzim (Leijs et al., 1999), DNS ujjlenyomat (Stacy et al,. 1994), mikroszatellit (Papp et al., 2000; Van De Zande et al., 2000) elemzések segítségével, valamint szekvencia analízissel (DeWoody, 1999). Az ukrajnai populációkon a nukleáris katasztrófa nyomán kariotípusos, citogenetikai és szekvencia vizsgálatokat végeztek (DeWoody et al., 1999). A hazai populációk genetikai konstitúciójáról jelenleg nem áll rendelkezésre adat.

1.1.1. ábra: Az északi pocok


1.1.2. ábra: A M. oeconomus méhelyi elterjedése

1.2. A mitokondrium és a mitokondriális DNS A mitokondriumok központi szerepet játszanak a sejtek életében. A legtöbb eukarióta sejtben számos mitokondrium található, amelyek a mitokondriális DNS-molekula számos példányát hordozzák. Ezen sejtszervecskék képesek a sejten belül elmozdulni, osztódni és fúzionálni (Bereiter-Hann and Voth, 1994). Együttesen a citoplazma több mint 25%-át is tartalmazhatják. A mitokondriumok számos anyagcsereútvonalban érdekelt eukarióta sejtszervecskék, legfontosabb funkciójuk az oxidatív foszforilációs rendszeren keresztüli ATP előállítása (Attardi and Schatz, 1988). Az oxidatív foszforiláció melléktermékeként keletkeznek reaktív oxigénformák, például szuperoxidok, hidrogén-peroxidok és szerves hidroperoxidok, melyek károsíthatják a DNS-molekulákat, lipideket illetve fehérjéket. A sejtszervecskék jellegzetes módon, anyai úton öröklődnek, mivel megtermékenyítéskor a spermiummal

a

petesejtbe

jutó

példányok

megsemmisülnek

egy

ubiquitin-függő

mechanizmus révén (Sutovsky et al., 1999; Sutovsky et al., 2000). A mitokondrium önálló genommal rendelkezik, amely az emlősökben kettős szálú, kör alakú DNS-molekula (1.2.1. ábra). A két lánc bázisösszetétele olyan mértékben eltér egymástól, hogy a két lánc céziumklorid egyensúlyi sűrűséggrádiens centrifugálással szétválasztható: H (heavy, azaz nehéz) és L (light, azaz könnyű) láncot különböztethetünk meg. A láncokat a guanin-, illetve citozintartalmuk alapján választják el. A mitokondriális és a nukleáris genom számos tulajdonságában eltér egymástól, mint például az öröklődés


módjában, a rekombináció fokában, az intronok méretében és számában, a mutációs rátában, a javító mechanizmusokban stb. (Scheffler, 1999).

1.2.1. ábra: A mitokondriális genom felépítése. A kontroll régió a Pro és Phe tRNS gének között található, helyét nyíl jelzi.

Amíg a mitokondriális genomban minden századik, addig a nukleáris genomban csak minden ezredik bázis mutat eltérést. A mitokondriális DNS mutációs rátája jóval nagyobb a nukleáris DNS mutációs rátájánál, nagyjából 2% egymillió évenként (Brown et al., 1979). A mitokondriális genom körülbelül 93%-a kódoló szekvencia, csupán nagyon rövid intronok találhatók benne. Harminchét gént hordoz, amelyek átlagos hossza 450 bázis. Nem kötődnek hozzá hisztonok és más fehérjék, így kevésbé védett a mutagén hatásokkal szemben. A mitokondriumból hiányzik az excíziós javító rendszer is, ami a létrejött mutációkat javítaná. A DNS szekvenciák sokkal szabályszerűbben változnak a morfológiai és a fiziológiai karakterekhez képest (Li, 1997), habár bizonyos esetekben a morfológiai és genetikai evolúciós ráták között korreláció mutatható ki (Omland, 1997). A mitokondriális DNS az állatok evolúciós kutatásának népszerű molekuláris markere. Alkalmas törzsfejlődési vizsgálatok elvégzésére, valamint a populációk szerkezetének, dinamikájának és molekuláris evolúciójának tanulmányozására is (Avise, 1994). A molekula


minden része egy közös leszármazás azonos történeti mintázatában részesül (Wilson et al., 1985). Az mtDNS génjei eltérő evolúciós rátákat mutatnak, aminek következtében széles időskálán képesek megfelelő felbontást nyújtani (Hillis et al., 1996). Ezidáig számos taxon teljes mtDNS szekvenciáját határozták meg, amelyek segítségével úgynevezett „univerzális primereket” fejlesztettek. (Kocher et al., 1989). Ezen oligonukleotidok nagymértékben konzerválódottak és olyan taxonokhoz is hozzáférést biztosítanak, amelyekről még nem áll rendelkezésre genetikai háttér-információ (Palumbi, 1996). A leghosszabb nem kódoló szakasz az úgynevezett kontroll régió vagy D-loop, amely mintegy 1000-1600 bázispár terjedelmű, és a H lánc átíródási kezdőpontjának a közelében helyezkedik el. E terület jellegzetessége hogy a H lánc replikációja során ideiglenesen egy három szálból álló struktúra keletkezik, és az átmenetileg egyszálúvá vált régi H lánc a jelen lévő oxigén szabadgyökök mutagén hatásával szemben érzékennyé válik. A szabadgyökök leginkább pontmutációkat okoznak. Amennyiben a mutáció nem kódoló régiót érint, akkor az nem szelektálódik ki és új mitokondriális DNS polimorfizmusként mutatható ki az utódokban. A kontroll régióra – a kódoló funkció hiányából következően - nem nehezedik szelekciós nyomás, így az itt bekövetkező mutációk nagy gyakorisággal rögzülnek. Ezáltal a szakaszra jellemző mutációs ráta a nukleáris genoménak több mint tízszerese.


2. CÉLKITŰZÉSEK Munkánkat megelőzően nem állt rendelkezésre korrekt szekvencia az északi pocok teljes kontroll régiójáról. A korábbi vizsgálatok leginkább a kontroll régiótól 5’ irányban található citokróm b génre irányultak és csak részben érintették a D-loop-ot. Célunk 1) elsődlegesen az északi pocok mtDNS kontroll régió nukleotid sorrendjének pontos meghatározása volt. 2) A szekvencia ismeretében a következő kitűzött lépés egy polimorfizmusra történő előzetes vizsgálat elvégzése volt a M. oeconomus méhelyi kis-balatoni populációján. 3) Mindezek mellett célul tűztük ki a kontroll régiótól 3’ irányban elhelyezkedő 12 S rRNS gén szekvenciájának meghatározását, amely a jövőben hasznos alapot szolgáltathat fajok közötti rokonsági viszonyok vizsgálatára.


3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Mintavétel A minták Dr. Horváth Győző munkája révén kerülhettek hozzánk további feldolgozásra. A mintavétel helyszíne a Kis-Balaton volt, ahol a 76-os műút két oldalán a Középső keresztcsatornától északi irányban, illetve az út déli oldalán lettek kihelyezve a csapdák. Az állatok befogása 11x11-es csapdahálóval, kvadrát módszerrel történt, ahol is a csapdák egymástól 5 méterre helyezkedtek el. Az egyedekből lábujjperc mintát vételeztek, majd az állatokat szabadon engedték. A mintákat a terepen abszolút alkoholba helyezték. Az ujjpercek tárolása laboratóriumi körülmények között, -20 °C-on történt. 3.2. DNS-izolálás Az izoláláskor a Chelex-eljárás lépéseit követtük (Walsh et al., 1991). A szövetmintákat kimosott, majd alkohollal kiégetett mozsárban szétmorzsoltuk, ezután eppendorf-csőbe szuszpendáltuk. 200 µl 5%-os Chelex-szuszpenziót (háromszorosan ioncserélt vízben szuszpendálva; Chelex: SIGMA C-7901) adtunk a csövekhez. Munkánk során minden esetben molekuláris munkára alkalmas, sterilizált ioncserélt vizet használtunk. A mintákat 30 percre 56 °C-ra helyeztük, majd 10 másodpercig kémcsőkeverővel rázattuk. A következő lépés egy 8 percig tartó 100 °C-os inkubáció volt, amit újabb rázatás követett. Ezt követően a csöveket 3 perc hosszan 12000 rpm fordulattal centrifugáltuk eppendorf centrifugában, végül a DNS-t tartalmazó felülúszót új csőbe pipettáztuk. Az izolátumokat -20 °C-on tároltuk. 3.3. Polimeráz láncreakció (PCR) A polimeráz láncreakció specifikus nukleotid szekvenciák felsokszorozására szolgáló in vitro enzimatikus eljárás. A módszert Mullins és munkatársai írták le (Mullins et al., 1986), habár az alapelveket már korábban lefektették (Kleppe et al., 1971). A reakció alkalmazásával két oligonukleotid primer által behatárolt DNS szakaszt sokszoroztunk meg egy hőstabil DNS polimeráz és számos egymást követő szintézis ciklus segítségével. Egy ciklus három lépését a szálak szétválasztása (denaturálás), a primerek kötődése (annealing) és az új szálak bioszintézise (extension) alkotja, melyek eltérő hőmérsékletet igényelnek. A mitokondriális templátszekvenciát polimeráz láncreakcióval sokszoroztuk meg. A megismerendő DNS–szakasz méretéből kifolyólag több fragmentre osztottuk fel azt, és több primerpár alkalmazásával végeztük mind a PCR-t, mind a szekvencia meghatározására irányuló kísérleteket. A tervezett primereket az 1. táblázat, az alkalmazott PCR programokat a


2. táblázat mutatja. A PCR reakció összetétele: 0.2 mM dNTP, 1 x Taq puffer, 1.5 mM MgCl2, 0.1-1 µM primer(ek), 10 pg – 1 µg templát DNS, 2.5 U Taq polimeráz reakciónként 10x Taq puffer: 100 mM TRIS (pH 8.8 25 °C-on), 500 mM KCl, 0.8%Nonidet P40 A klónozáshoz használt mintákat Pfu polimeráz segítségével sokszoroztuk meg, amely reakció összetétele a következő volt: 0,2 mM dNTP, 1x Pfu puffer, 0.1-1 µM primer(ek), 50 pg-1µg templát DNS , 1.25 U Pfu polimeráz reakciónként. 10x Pfu puffer: 200 mM Tris-HCl (pH 8.8 25°C-on), 100mM (NH4)2SO4, 100mM KCl, 1% Triton X-100, 1 mg/ml BSA, 20mM MgSO4. 1. táblázat: A PCR reakciókhoz tervezett oligonukleotidok Oligonukleotid neve

Nuleotidszekvencia

Számított Tm (°C)

cb-11

CCCCATATTAAACCCGAATG

58,8

12s-2

TAAGCATAGTGGGGTATCTAATCC

57,5

tg52

GACATGAAAAATCATCGTTG

53,5

tp31

TAATTAGAATATCAGCTTTGG

49

tf52

AGCAAAGCACTGAAAATGC

56,3

tp51

CACCCAAAGCTGATATTCTA

52,6

tf31

CCATCTAAGCATTTTCAGTGC

57,3

12s3

GCTTACCTTGTTACGACTTATCTC

55,5

d-31

TAATACATGCTTATATGCTAGG

49,3

d-52

TGGTTCATCGTCCATACG

55,8

d-32

GGGCATGGGCTGATTAG

57,1

2. táblázat: A PCR reakcióhoz tervezett programok 1.

2.

3.

1. lépés

40 sec. - 94°C

60 sec. - 94°C

40 sec. - 94°C

2. lépés

40 sec. - 52°C

40 sec. - 94°C

40 sec. - 58°C

3. lépés

50 sec. - 72°C

40 sec. - 50°C

50 sec. - 72°C

4. lépés

33x ismétlés, 1-3 lépés

90 sec. - 72°C


5. lépés

Vége


Vége

6. lépés

-

60 másodperc - 20°C

-

7. lépés

-

Vége

-


3.4. Gélelektroforézis Az elválasztandó DNS-mintához 5x STOP oldatot adtunk (10% ficoll-400, 0,25 M EDTA pH 8.0, 0.2% brómfenolkék), amely a végtérfogat 1/5-ét tette ki. Az elektroforézist 1%-os agaróz minigélen végeztük (60x78 mm), ellenőrzéskor 60 V-, fragmentizoláláskor 40 V feszültség mellett. Az elektroforézishez TBE puffert használtunk. A minták festődését a kész gélfőzetbe tett etídium-bromiddal (0,1 µg/ml) biztosítottuk. Kontrollként PstI enzimmel emésztett λ fág DNS-t alkalmaztunk. 5xTBE törzsoldat: 10 mM EDTA, 450 mM Tris-borate 3.5. DNS-fragment izolálás Az izolálandó fragment elé a gélbe Whatman DE81 papírt tettünk, ami 15 perces (60V) elektroforézis során a fragmentet megkötötte. A papírt eppendorf csőbe helyeztük és a DNS mintát kétszer egymás után 50 µl 1M NaCl oldat segítségével eluáltuk. A DNS kicsapása 10 µl 3M Na-acetát oldattal (pH 7,0) és 75 µl izopropanollal történt (0,1 térfogat; 0,6 térfogat), majd a csapadékot 20 percig tartó -20 °C hőmérsékletű inkubálás után centrifugáltuk. Ezt követően a mintákat 70%-os etanollal (200-400 µl) mostuk, majd újra centrifugáltuk. Ezután az alkoholt leöntöttük, majd a DNS-csapadékot 37°C-on szárítottuk és 20 µl ioncserélt vízben oldottuk fel . 3.6. Kompetens sejtek készítése A kompetens sejtek készítéséhez E. coli XL1-blue törzset használtunk. 200 ml SOB táptalajban (2% Bacto trypton, 0,5% Yeast extract, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, pH 6,8-7,0) éjszakán át 19°C-on növesztett baktériumkultúrát 10 percre jégre tettük, ezután mindig 0°Con dolgoztunk. A sejteket 10 perces centrifugálással (4000 rpm) gyűjtöttük össze, majd 80 ml hideg TB pufferben (10 mM PIPES, 15 mM CaCl2, 250 mM KCl pH 6,7) szuszpendáltuk fel. Tíz percig jégen inkubáltuk, majd centrifugáltuk és 20 ml jéghideg TB pufferben szuszpendáltuk. A szuszpenzióhoz 8% dimetil szulfoxifot (DMSO) adtunk, végül a sejteket eppendorf-csövekbe szétosztva -80°C-on tároltuk (Inoue et al., 1990). 3.7. Ligálási reakció A ligálási elegyet háromszorosan ioncserélt víz, 10x ligáz puffer (500 mM TrisHCL, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP, pH 7,6), vektor DNS oldat és fragment DNS oldat felhasználásával állítottuk össze. A reakcióhoz T4 DNS ligázt használtunk és az elegyet minimum 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk.


3.8. Transzformáció 200 µl kompetens sejtet használtunk fel egy transzformáláshoz. A sejteket -80°C-ról jégre tettük és 15 perc elteltével hozzáadtuk a transzformálandó mintákat. 20 percig jégen inkubáltunk, majd 3 perces 37°C-os hősokkot alkalmaztunk. Ezt követően 800 µl LB tápoldatot adtunk a sejtekhez. Egy óra 37°C-os inkubáció után a sejteket szelektív táptalajra szélesztettük (Inoue et al., 1990). A táptalajba 40 µl 100 mM-os IPTG (isopropylthio-β-D galactoside) és 40 µl 20mg/ml koncentrációjú Xgal (5-bromo-4-chloro-3-inodyl-β-Dgalactopiranoside dimetil-formamidban) oldatot tettünk és a fehér színű (feltehetően inszertet tartalmazó) telepekkel folytattuk a munkát. 3.9. Plazmid DNS izolálás, „miniprep” Az izolálást 3-3 ml LB táptalajban egy éjszakán keresztül növesztett sejtekből végeztük. (Ish-Horovicz and Burke, 1981). 1.5 ml kultúrát eppendorf-csőbe mértünk, a sejteket centrifugálással ülepíttetük, majd felszuszpendáltuk 100 µl TEG oldatban (25 mM TrisHCL, 10 mM EDTA, 50mM glükóz pH 8,0). A feltárást 200 µl NS oldat (0,2 M NaOH, 1% SDS) hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig jégen (0°C) inkubáltuk, majd 160 µl 0°C-os Naacetát oldatot pipettáztunk az elegyhez, amivel a kromoszómális DNS-t, illetve a fehérjéket denaturáltuk. A keletkezett csapadékot 5 perc 0°C-os inkubáció után lecentrifugáltuk és a felülúszóból 320 µl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS mintákat. Tíz perc -20 °C-os inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, mostuk (400 µl 70%-os etanol) és szárítottuk. A csapadékot 100 µl Tris-acetát (50 mM TrisHCL, 100 mM Na-acetát, pH 8,0) oldatban feloldottuk, majd 200 µl 96%-os etanollal ismét kicsaptuk. Tíz perc 0°C-os inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, szárítottuk, majd 30 µl ioncserélt vízben oldott RNase (100 µg/ml RNaseA) oldatban vettük fel. A szekvenálásra küldött plazmid preparátumok tisztítása a következőképpen zajlott: A mintákhoz 0,1 térfogat SDS-t (nátrium-dodecil-szulfát) és 1 térfogat 0 °C-os 7,5 M NH4acetátot adtunk, majd tizenöt percig 0°C-on állni hagytuk. Ezt követően a csöveket centrifugáltuk és a felülúszót új csőbe pipettáztuk. A mintákhoz 0,6 térfogat izopropanolt adtunk, majd 20 percre -20 °C-ra helyeztük őket. Ezután a csöveket centrifugáltuk és leöntöttük a felülúszót. Hozzáadtunk 400µl etanolt, amit újabb centrifugálás követett. Az alkoholt leöntöttük, a csapadékot 37 °C-on szárítottuk és 40µl ioncserélt vízben feloldottuk. A folyamat során végig jégen dolgoztunk.


3.10. Plazmid DNS emésztés restrikciós endonukleázokkal A tisztított DNS-ből 0,1 - 0,2 µg-ot használtunk az emésztésekhez. A mintákhoz 15 µl enzim oldatot adtunk, amelynek az összetétele a gyártó által megadott paramétereknek megfelelő volt. Az emésztés 37 °C-on zajlott és legalább 1 órán át tartott. A keletkezett termékeket agaróz gélelektroforézissel választottuk el. 3.11. DNS-szekvenálás A szekvenálási reakció a didezoxinukleotid láncterminációs eljáráson alapult ( Sanger et al., 1977). Az oligonukleotid a PCR reakcióhoz hasonlóan az egyszálú templát DNS szekvenciához kötődik. Az ezt követő polimerizáció véletlenszerűen szakad meg a rendszerben elenyésző mennyiségben jelen lévő 3’ OH csoporttal nem rendelkező didezoxinukleotid trifoszfát láncbaépülésének következtében. A sikeres reakció a jelölt termék lineáris megsokszorozódását eredményezi (Hillis et al., 1996) Az izolált fragmentek szekvenciájának meghatározása a MTA Szegedi Biológiai Központ DNS-Szekvenáló Laboratóriumában történt. 3.12. A szekvenciaadatok értékelése A munkához felhasznált DNS-szekvenciaadatokhoz saját kísérletek illetve a szekvenciaadatbázisokban végzett keresés útján jutottunk. A szekvenálási eredményeket a „DNASTAR” cég „LASERGENE” programcsomagjának felhasználásával javítottuk, szereltük össze, illetve illesztettük egymáshoz. Az általunk meghatározott 1860 bp szekvenciát az AJ616853 szám alatt regisztrálták az EMBL Nukleotidszekvencia Adatbázisban.


4. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 4.1. Heterológ primerek tervezése és az mtDNS izolálása A munka kezdetén szekvenciaspecifikus oligonukleotid primerekre volt szükségünk ahhoz, hogy a mitokondriális szekvencián PCR-reakciókat tudjunk végrehajtani további vizsgálatok céljából. Munkánkat megelőzően a DNS-szekvencia adatbázisok nem tartalmaztak korrekt, a teljes kontroll régiót lefedő szekvenciaadatokat. A korábban mások által végzett szekvenciameghatározások a D-loop-tól 5’ irányban található citokróm b génre irányultak, illetve részlegesen érintették a kontroll régió bal oldalát. Tehát kezdetben nem volt lehetőség arra, hogy fajspecifikus primereket tervezzünk. Éppen ezért az első oligonukleotid primereket rokon fajok ismert szekvenciaadatainak felhasználásával terveztük meg. A felhaszált mitokondriális szekvenciák adatait foglalja össze a 3. táblázat. 3. táblázat: A primertervezéshez felhasznált rokon fajok, és mtDNS szekvenciáik regisztrációs száma faj

adatbázis azonosító

Myoxus glis – nagy pele Mus musculus – háziegér Oryctolagus cuniculus – üregi nyúl Rattus norvegicus – vándorpatkány

NC_001892 J01420 NC_001913 X14848

A kiválasztott szekvenciák illesztése után olyan részeket kerestünk a D-loop két oldalán, amelyek többé-kevésbé konzerválódottak és ez által alkalmasak olyan primerek tervezésére, amelyek alkalmazásával az ismeretlen szekvenciájú kontroll régiót és annak környezetét izolálni lehet. A D-loop-on kívül, a tőle 5’ irányban elhelyezkedő citokróm b és tRNS-Pro gének, illetve a tőle 3’ irányban található tRNS-Phe és 12S rRNS gének meghatározására is terveztünk primereket. A 4.1.1. ábrán a tP51-es oligonukleotid tervezésének menete látható. A 3.

táblázatban

említett

rokon

fajok

adatbázisban

fellelhető

hasonló

szekvenciáit

összeillesztettük és konszenzus részeket kerestünk a kontroll régió bal oldalánál. A kiemelt rész tekintetében a vándorpatkány és az üregi nyúl szekvenciája megegyezik, a háziegér egy, míg a nagy pele négy eltérést mutat, amely különbségeket a képen lefedtük. A tP51 primer szekvenciájául a vándorpatkány és az üregi nyúl megegyező szekvenciáját választottuk.


4.1.1. ábra: A tP51 primer tervezése. A tRNS-Pro gént lefedő DNS-szakaszok illesztése után kiválasztott konzerválódott szekvenciát, amely egyben a tP51 primer szekvenciája is, jelzi a sötétebb háttér. A konszenzustól eltérő bázisokat kitakartuk. Mglis: Myoxus glis, Mmusc: Mus musculus, Ocuni: Oryctolagus cuniculus, Rnorv: Rattus norvegicus (lásd még 3. táblázat). A polimeráz láncreakciót megelőző pocok-DNS izolálása az anyagok és módszerek fejezetben leírtaknak megfelelően, a Chelex-módszer lépéseit követve zajlott. A kontroll régió szekvenciájának PCR-reakcióval történő felsokszorozására a tP51, tF31 primerpár szolgált. A 4.1.2. ábrán látható a kontroll régió és környezetére tervezett heterológ primerek elhelyezkedése. A primerek nukleotid szekvenciái az 1. táblázatban találhatók.

4.1.2. ábra: A tervezett heterológ primerek helyzete. A nyilak a primerek által indított reakció irányát jelzik

4.2. A tervezett primerekkel felsokszorozhatók a megfelelő mtDNS régiók A tervezett nem fajspecifikus oligonukleotid primerekkel sikeres PCR reakciókat hajtottunk végre a kontroll régió területén, illetve a környező gének szekvenciáján (4.2.1. ábra). A D-loop bázissorrendjét nem lehet egy-egy szekvenálási reakcó segítségével mindkét irányban, teljes hosszúságában meghatározni, mert túlságosan hosszú. A tP51-tF31 primerpárral végrehajtott PCR reakció után ugyanezekkel a primerekkel elvben mindkét irányból 5-600 bázispárnyi terület "leolvasására" van csak lehetőség (4.2.1. ábra). Azt


terveztük, hogy a D-loop középső részén kapott, mindkét irányból leolvasott korrekt szekvenciát fogjuk fajspecifikus primerek tervezésére felhasználni. Azonban az említett heterológ primerpárral végrehajtott polimeráz láncreakció termékének szekvenálása nem az elvárásoknak megfelelően sikerült. Csak a baloldalról lehetett a felsokszorozott DNS szakasz szekvenciáját meghatározni. A jobb oldali szekvenálási reakció valamivel száz bázispár után egy GC gazdag részen elakadt (4.2.2. ábra), aminek következtében nem kaptunk a kontroll régió jobb oldaláról értékelhető részszekvenciát. Így a baloldalról származó egyszálú szekvenciát használtuk fel fajspecifikus belső oligonukleotidok tervezésére.

4.2.1. ábra : A tP51-tF31 primerpárral végrehajtott PCR reakció eredménye. A kép bal oldalán a kontrollként használt PstI enzimmel hasított λ fág DNS-e látható

4.2.2. ábra: A tP51-tF31 primerpárral létrehozott DNS fragment szekvenciájának meghatározása a PCR primerekkel


4.3. Fajspecifikus primerek tervezése és a szekvencia meghatározása Az előző pontban leírtaknak megfelelően a kontroll régió bal oldaláról indított szekvenálási reakcióban sikeresen leolvasott szekvencia felhasználásával lehetőségünk nyílt arra, hogy a D-loop területére fajspecifikus belső primereket tervezzünk, amelyek segítségével 5' és 3' irányban is folytatni lehetett a szekvencia pontos meghatározását. Két oligonukleotid primert terveztünk (d-52 és d-32), amelyek lehetővé tették, az eredeti PCR primerekkel együtt, a tP51-tF31 DNS fragment szekvenciájának mindkét szálon való meghatározását. A 4.3.1. ábra a kontroll régió területére tervezett összes primer elhelyezkedését ábrázolja.

4.3.1. ábra: A kontroll régió nem fajspecifikus és fajspecifikus primerei. A primerek szekvenciáját az 1. táblázat tartalmazza. Az imént említett két fajspecifikus oligonukleotidon kívül később még egy fajspecifikus primert terveztünk, a d-31-est. A ciokróm b és a 12S rRNS gének területére tervezett belső oligonukleotidok (Cb11 és 12S-2) a D-loop belső primereivel együtt alkalmazva fontos szerepet játszottak a kontroll régió két oldalára tervezett primerek (tP51;tF31) helyein a szekvencia pontos meghatározásában. A kontroll régió jobb oldalán a nukleotidszekvencia meghatározása nehézségekbe ütközött egy GC gazdag régió miatt, ahogy az már az első szekvenálási reakciónál is látszott (4.2.2. ábra). A terület szekvenciáját csak úgy sikerült megállapítani, hogy a tP51-tF31 primerpárral létrehozott PCR-terméket plazmid vektorba építettük, és E. coli baktériumba transzformáltuk. Az izolált, inszert DNS tartalmú plazmidokat küldtük szekvenálásra. A polimeráz láncreakció termékét közvetlenül templátként alkalmazva, a d-52 és tF31 primerekkel több próbálkozás ellenére sem sikerült értékelhető szekvenciát kapni, mert a reakció mindkét oldalról a GC gazdag (attccccccccccggccttcccaggct) szekvenciában elakadt. Ennek magyarázatát egyenlőre


nem találjuk, hiszen a szekvencia nem túl hosszú és nem rejt olyan fordított ismétlődést a környezete, amely indokolhatná e jelenséget.

4.3.2. ábra: A kontroll régió felsokszorozása heterológ és specifikus primerekkel. A reakciók során heterológ és fajspecifikus oligonukleotidokat alkalmaztunk kétféle összetételben: az 1-es számmal jelölt sáv a tP51-d32 primerpárral végrehajtott PCR reakciót mutatja, míg a 2-es számú sáv a d52-tF31 oligonukleotidokkal kivitelezett reakciót jelöli. A kép jobb oldalán a kontrollként szolgáló Pst I enzimmel emésztett λ fág DNS látható.

A PCR reakciók termékeinek szekvenáltatása után a különböző szekvenciarészletek elemzésével és összeillesztésével hozzájutottunk a vizsgált terület korrekt szekvenciájához, amelynek összesített képe a 4.3.3. ábrán látható. A meghatározott szekvencia kódoló régióinak és a D-loopnak a koordinátáit a 4. táblázat tartalmazza.


4.3.3. ábra: A kontroll régió és környezetének szekvenciája. Regisztrációs szám: AJ616853

4. táblázat: A gének és régiók helyzete a meghatározott szekvenciában koordináta (bp) 1-16 17-925 926-991 992-1860

gén / régió tRNS-Pro (részleges) D-loop tRNS-Phe 12S rRNS (részleges)

4.4. M. oeconomus D-loop szekvenciák az adatbázisokban A kontroll régió szekvenciájának megállapítása után összevetettük azt az adatbázisban fellelhető más populációk idevonatkozó szekvenciáival. Mint azt már korábban említettem, munkánkat megelőzően az adatbázisok nem tartalmaztak olyan szekvenciaadatokat, amelyek a M. oeconomus-ból származtak és a teljes kontroll régiót lefedték volna. Csupán a D-loop bal oldaláról találtunk részleges adatokat. Az összehasonlítás eredményét a 4.4.1. ábra tükrözi. Az „n241” jelű szekvenciát mi határoztuk meg, míg az „aj00988” megjelölésű egy norvég M. oeconomus populáció egy egyedét reprezentálja. A téglalappal bekeretezett bázisok a mi szekvenciánktól való eltéréseket mutatják. Az összehasonlítás pontosságát csökkenti, hogy a norvég populációból származó szekvencia csak részleges és ráadásul hibákat is tartalmaz. A 286. pozícióban „N” betű található, ami minden kétséget kizáróan szekvenálási hibából ered. A 240. és a 267. pozíciónál hiányjel van, amely vagy egy-egy bázis delécióját jelenti – ez


könnyen elképzelhető, mert a kontroll régió nem kódoló terület -, vagy szintén szekvenálási hiba eredménye.

4.4.1. ábra: A meghatározott szekvencia egy részletének összehasonlítása egy norvég mintával. Ez is mutatja, hogy a pontosabb populáció genetikai elemzésekhez szükséges a D-loop szekvenciájának korrekt meghatározása, hogy a megfelelő fajspecifikus primer megtervezése után a vizsgált egyedekből a szekvencia mindkét irányban meghatározható legyen. Munkánk révén lehetővé vált a tP51 és d-32 primerek segítségével az északi pocok D-loop szekvenciák bal oldali részének pontos meghatározása, mintegy 500 bp hosszan. Előzetes kísérletként a kis-balatoni északi pocok populáció néhány további egyedének szekvenciáját határoztuk meg.


4.5. A kis-balatoni északi pocok populáció előzetes elemzése Miután a korrekt szekvencia a rendelkezésünkre állt, kiszélesítettük a munkát a kontroll régió tekintetében. Több egyednél megvizsgáltuk a D-loop bal oldalán található hipervariábilis régiót esetleges eltérések után kutatva. Ezidáig kilenc egyed tekintetében ismerjük a D-loop eme területét. A szekvenálás eredményeinek elemzése eddig nem tárt fel eltérést, a szekvenciák teljes azonosságot mutatnak. A variabilitásnak a vizsgált egyedeknél tapasztalt hiánya az anyai leszármazási vonalak kis számára utal. A jövőben további egyedeknél is meg kívánjuk vizsgálni az említett területet, hogy elegendő

mennyiségű

adattal

rendelkezzünk

populációbiológiai

következtetések

megállapításához. 4.6. Szekvenciaeltérések más fajokhoz képest A kontroll régió szekvenciáját összehasonlítottuk más, a Microtus nemzetségbe tartozó fajokéval is. Ennek eredményét mutatja a 4.6.1. ábra. Az általunk meghatározott szekvenciától (PTE_sh.seq) való eltérést a bekeretezett bázisok jelzik. A különbségek száma fajonként változó, azonban a szekvenciaadatok többsége nem nyújt korrekt összehasonlítási alapot, mert szekvenálási hibákat tartalmaz. A hibás pozíciókban itt is „N” betű található. Egyedül a M. mexicanus szekvenciája az, amelyik hibáktól mentes és ennél fogva megbízható elemzést tesz lehetővé. A M. mexicanus szekvenciával elvégzett összehasonlító elemzést a 4.6.2. ábra mutatja. A szekvencia korrekt és lefedi az egész kontroll régiót. A D-loop jobb és bal oldalán található hipervariábilis régiók eltérő mértékű különbözőséget mutatnak a két szekvencia esetében: a baloldalon 60, míg a jobb oldalon 129 eltérést tapasztaltunk. Ez arra enged következtetni, hogy a kontroll régió jobb oldala az evolúció során valószínűleg gyorsabban változik. Ezt támasztja alá a más rágcsálókkal végzett összehasonlítás is (4.6.3. ábra), amely itt csupán szemléltető jellegű, de jól érzékelhetően láttatja a kontroll régió jobb oldalát érintő nagyobb számú eltérést.


4.6.1. ábra: A D-loop részleges szekvenciájának összehasonlítása a nemzetség más fajaival.


4.6.2. ábra: A kontroll régió szekvenciájának összehasonlítása a M. mexicanus szekvenciájával. A téglalapokkal részlegesen letakart bázisok eltérnek az általunk megállapított szekvenciától.


4.6.3. ábra: A D-loop teljes szekvenciájának összevetése rokon rágcsálók szekvenciájával. A sötét hátterű betűk mutatják a szekvencia eltéréseket az általunk meghatározott kontroll régió szekvenciájához képest. A szekvencia második felében jóval több különbség látható. M_oeco_D: M. oeconomus, M_mexi_D: M. mexicanus, M_musc_D: Mus musculus, R_norv_D: Rattus norvegicus


4.7. Felmerülő kérdések, folyamatban lévő kísérletek A vizsgálatoknak még koránt sincs vége. A kontroll régió bal oldalán kilenc egyedből rendelkezünk korrekt szekvenciával. Célunk az, hogy további egyedeknél is meghatározzuk e terület szekvenciáját, hogy populációbiológiai szempontú következtetések megállapításához megfelelő mennyiségű adattal rendelkezzünk. A fajok közötti összehasonlító elemzések eredményei arra utalnak, hogy a kontroll régió jobb oldalán lévő hipervariábilis régió gyorsabban változik a baloldalon találhatónál, ami felveti annak lehetőségét, hogy a jobb oldal szekvenciájának elemzése esetleg alkalmasabb populációbiológiai vizsgálatok elvégzésére, mivel valószínűleg érzékenyebb felbontást eredményez. A D-loop ezen részének vizsgálata azonban meglehetősen nehézkes, mint ahogy arról a 4.3. résznél már beszámoltunk. A további vizsgálatok során szeretnénk e probléma leküzdésével átfogó képet kapni a kontroll régió jobb oldalán található hipervariábilis régióról megfelelő számú egyed mtDNS-ének megvizsgálásával.


5. ÖSSZEFOGLALÁS Az északi pocok (Microtus oeconomus) egy 23 alfajjal rendelkező holarktikus elterjedésű rágcsáló, az egyetlen Microtus faj, amely egyaránt előfordul Észak-Amerikában és Eurázsiában. Az utolsó eljegesedés idején Európában egyetlen nagy, egyesült populációban élt a mai Közép-Európa jelentős részén. A jégtakaró visszahúzódásával a habitat északi és keleti irányban kiszélesedett, hátrahagyva számos lefűződött reliktum populációt. Magyarországon fokozottan védett, lokálisan veszélyeztetett, fragmentálódott és izolálódott populációkban fordul elő. Napjainkban csak 3 fennmaradt populáció található a NyugatDunántúlon, amelyek a M. oeconomus méhelyi alfajt reprezentálják. A genetikai variációk tanulmányozása kiemelkedő fontossággal bír a célpopulációk jellemzése szempontjából. A hazai populációk genetikai összetételéről jelenleg nem áll rendelkezésre adat. A genetikai variációk vizsgálatához a mitokondriális DNS (mtDNS) egyes szakaszainak elemzése is alkalmas. A mitokondriális genom kevésbé védett a mutagén hatásokkal szemben és a mitokondriumból hiányzik az excíziós javító rendszer is. Ezért adott idő alatt több mutáció halmozódhat fel benne, mint a nukleáris genomban. A leghosszabb nem kódoló szakasz az 1000-1600 bázis hosszúságú kontroll régió (D-loop). Az itt létrejövő összes mutáció rögzül, mivel erre a területre nem nehezedik szelekciós nyomás. Ezért a D-loop különösen alkalmas a populációk genetikai változatosságának vizsgálatára. Célunk a teljes kontroll régió DNS szekvenciának meghatározása, és hazai populációkban található változatok megismerése. Elsőként meghatároztuk az mtDNS mintegy 1860 bp hosszúságú szekvenciáját, mely a 908 bp hosszú kontroll régión kívül tartalmazza a tRNAPhe és a 12S rRNS géneket is. A korrekt szekvencia ismeretében, fajspecifikus primerekkel, kilenc egyedből meghatároztuk a kontroll régió bal oldali felének szekvenciáját. Ezek elemzése nem tárt fel egyetlen eltérést sem, ami a vizsgált populáció alacsony genetikai változatosságára utal. A teljes kontroll régiót összehasonlítva más rokon fajok hasonló szekvenciájával megállapítottuk, hogy a jobb oldali régióban kétszer több az eltérő bázisok száma. Ezért elemzése valószínűleg érzékenyebb populációgenetikai vizsgálatokat tesz lehetővé. A kontroll régiótól 3’ irányban elhelyezkedő 12S rRNS gén szekvenciájának csaknem teljes meghatározása a fajok közötti rokonsági vizsgálatokhoz szolgáltathat jó alapot a jövőben.


6. RÖVIDÍTÉSEK Amp

ampicillin

ATP

adenozin-trifoszfát

DNS

dezoxi-ribonukleinsav

EDTA

etilén-diamino-tetra-acetát

IPTG

izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid

mtDNS

mitokondriális dezoxi-ribonukleinsav

PCR

polimeráz láncreakció

SDS

nátrium-dodecil-szulfát

Tris

tris-(hidroxi-metil)-amino-metán

X-gal

5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranozid


7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Putnoky Péternek a munka irányításáért és az alkalmazott molekuláris módszerek elsajátításában nyújtott segítségéért. Köszönetet mondok Dr. Horváth Győzőnek a felhasznált minták rendelkezésre bocsátásáért, valamint Dr. Hoffmann Gyulának és Mátics Róbertnek a rengeteg hasznos tanácsért, továbbá a tanszék munkatársainak a technikai háttér folyamatos biztosításáért. Köszönöm

a

Környezetvédelmi

és

Vízügyi

Minisztérium

Természetmegőrzési

Főosztályának és a Balaton-felvidéki Nemzeti Park Igazgatóságának a munkához nyújtott támogatást.


8. FELHASZNÁLT IRODALOM

Attardi, G., and Schatz, G. (1988) Biogenesis of mitochondria. Annu Rev Cell Biol 4: 289333. Avise, J.C. (1994) Molecular Markers, Natural History, and Evolution. New York: Chapman and Hall. Bereiter-Hann, J., and Voth, M. (1994) Dynamics of mitochondria in living cells: shape changes, dislocations, fusion, and fission of mitochondria. Microscopy Research Techniques 27: 198-219. Bijlsma, R., and Loeschke, V. (1997) Environmental Stress, Adaptation and Evolution. Basel: Birkhäuser Verlag. Brown, W.M., George, M.J., and Wilson, A.C. (1979) Rapid evolution of animal mitochondrial DNA. ,. PNAS 76: 1967-1971. DeWoody, J.A. (1999) Nucleotide variation in the p53 tumor-suppressor gene of voles from Chernobyl, Ukraine. Mutat. Res. 439: 25-36. Éhik, J. (1928) Einige Daten zur Saugertierkunde Ungarns. Annls hist. -nat. Mus. Natn. hung. 25: 195-203. Gaines, M.S., and Whittam, T.S. (1980) Genetic changes in fluctuating vole populations: selective vs. non-selective forces. Genetics 96: 767-778. Hillis D. M., Mable B. K., Larson A., Davis S. K. & E. A. Zimmer (1996): Nucleic Acids IV: Sequencing and Cloning. In: Hillis D. M., Moritz C. & B. K. Mable (eds.): Molecular Systematics. 2nd Ed. Sinauer, Sunderland, USA. pp: 321-381 Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96: 23-28.


Ish-Horovicz, D., and Burke, J.F. (1981) Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res. 9: 2989-2998. Kleppe K., Ohtsuka E., Kleppe R., Molineux I. & H. G. Khorana (1971): Studies on polynucleotides XCVI. Repair replication of short synthetic DNA’s as catalysed by DNA polymerases. Journal of Molecular Biology 56: 341-361 Kocher T. D., Thomas W. K., Meyer A., Edwards S. V., Pääbo S., Villablanca F. X. & A. C. Wilson (1989): Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: Amplification and sequencing with conserved primers. Proceedings of the national Academy of Sciences, USA 86: 6196-6200 Láng, E. (1997) Bevezetés: A Nemzeti Biodiverzitás-monitorozó Rendszer. In Informatikai alapozás. Nemzeti Biodiverzitás-monitorozó Rendszer I. Horváth, F., Rapcsák, T. and Szilágyi, G. (eds). Budapest: Magyar Természettudományi Múzeum. Leijs, R., Van Apeldoorn, R.C., and Bijlsma, R. (1999) Low genetic differentiation in northwest European populations of fhe locally endangered root vole, Microtus oeconomus. Biological Conservation 87: 93-48. Li W.-H. (1997): Molecular Evolution. Sinauer, Sunderland. 488 pp. Ligtvoet, W. (1985) The Root Vole, Microtus oeconomus, done in a hole. De Levende Natuur, 86: 2-7. Mitchell-Jones, A.J., Amori, G., and Bogdanowicz, W. (1999) The Atlas of European Mammals, . San Diego, USA: Academic Press Inc. Mullis K. B., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G. & H. Erlich (1986): Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 5(1): 263-273 Omland K. E. (1997): Correlated rates of molecular and morphological evolution. Evolution 51(5): 1381-1393


Palumbi S. R. (1996): Nucleic Acids II: The Polymerase Chain Reaction. In: Hillis D. M., Moritz C. & B. K. Mable (eds.): Molecular Systematics. 2nd Ed. Sinauer, Sunderland, USA. pp. 205-247 Papp, T., Gubányi, A., and Rácz, G. (2000) Establishing Microsatellite Analysis for locally endangered populations of root vole (Microtus oeconomus). - Acta zool. hung. 46: 259-264 Sanger F., Nicklen S. & A. R. Coulson (1977): DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 74: 5463-5467 Scheffler, I.E. (1999) Mitochondria. New York: John Wiley & Sons Inc. Stacy, J.E., Refseth, U.H., Thorensen, M., Ims, R.A., Stenseth, N.C., and Jakobsen, K.S. (1994) Genetic variability among root voles (Microtus oeconomus) from different geographic regions: populations can be distinguised by DNA fingerprinting. Biol J Linnean Society 52: 273-286. Sutovsky, P., Moreno, R.D., and Schatten, G. (1999) Ubiquitin tag for sperm mitochondria. Nature 402: 371. Sutovsky, P., Moreno, R.D., Ramalho-Santos, J., Dominko, T., Simerly, C., and Schatten, G. (2000) Ubiquitinated sperm mitochondria, selective proteolysis, and the regulation of mitochondrial inheritance in mammalian embryos. Biol Reprod 63: 582-590. Van De Zande, L., Van Apeldoorn, R.C., Blijdenstein, A.F., De Jong, D., Van Delden, W., and Bijlsma, R. (2000) Microsatellite analysis of population structure and genetic differentiation within and between populations of the root vole, Microtus oeconomus in the Netherlands. Molecular Ecology 9: 1651-1656. Walsh, P.S., Metzger, D.A., and Higuchi, R. (1991) Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques 10: 506513.


Wilson A. C., Cann R. L., Carr S. M., George M. Jr., Gyllensten U. B., Helm-Bychowski K., Higuchi, R. C., Palumbi S. R., Prager E. M., Sage R. D. & M. Stoneking (1985): Mitochondrial DNA and two perspectives on evolutionary genetics. Biological Journal of the Linnean Society 26: 375-400

Az északi pocok mtdns kontroll régiójának elemzése

Recommend Documents