BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari 2010 hingga Maret 2011.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan pada penelitian ini yaitu mata tunas aksilar dari batang tanaman aglaonema varietas Pride of Sumatera yang berasal dari genus Aglaonema dan famili Araceae. Tanaman aglaonema yang digunakan adalah tanaman yang memiliki delapan sampai 10 lembar daun (Gambar 3).
Gambar 3. Tanaman Aglaonema Pride of Sumatera sebagai Sumber Eksplan
Media dasar yang digunakan yaitu dari komposisi Murashige dan Skoog (MS). Komposisi media MS disajikan pada lampiran. Bahan pemadat digunakan
11
agar. Zat pengatur tumbuh yang digunakan antara lain sitokinin (BAP dan BA) dan auksin (2,4-D dan NAA). Bahan lain yang ditambahkan pada media yaitu air kelapa. Bahan untuk mengatur pH yaitu larutan HCl 1 N dan KOH 1 N. Bahanbahan yang digunakan untuk sterilisasi antara lain natrium hipoklorit 5%, alkohol, fungisida dengan bahan aktif mankozeb 80%, fungisida dengan bahan aktif benomil 50%, bakterisida dengan bahan aktif streptomisin sulfat 20%, antibiotik amoxicillin, dan cefotaxime. Bahan penutup botol yaitu plastik dan karet gelang. Bahan-bahan lain yang digunakan antara lain spiritus, tisu, korek api, dan aquadestilata. Alat-alat yang digunakan dalam membuat media yaitu labu takar, gelas ukur, pipet, pipette filler, timbangan, magnetic stirrer, dan pH meter. Alat untuk sterilisasi botol dan media yaitu autoklaf. Alat-alat yang digunakan ketika menanam antara lain pinset, gunting, scalpel, lampu spiritus, botol semprot, cawan petri, orbital shaker, dan laminar air flow cabinet. Alat-alat yang digunakan untuk menyimpan botol kultur yaitu rak kultur dan lampu TL 20 watt sebagai sumber penyinaran dengan suhu ruang 23 ± 2 °C.
Metode Penelitian
Penelitian ini menggunakan perlakuan faktorial disusun dalam rancangan lingkungan acak lengkap dengan dua faktor. Faktor pertama yaitu perlakuan 2,4-D dengan konsentrasi 1 dan 2 mg/l. Faktor kedua yaitu perlakuan BAP dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, dan 10 mg/l. Penelitian ini terdiri dari 10 kombinasi perlakuan dengan tiga ulangan untuk masing-masing kombinasi perlakuan, sehingga terdapat 30 satuan percobaan. Setiap satu satuan percobaan terdiri dari satu botol kultur dengan tiga buah eksplan per botol kultur, sehingga terdapat 90 satuan amatan.
12
Tabel 1. Kombinasi Perlakuan BAP dan 2,4-D pada Percobaan Induksi Mata Tunas Aksilar Aglaonema Pride of Sumatera Secara In Vitro 2,4-D (mg/l) 1 2
2 A1B1 A2B1
4 A1B2 A2B2
BAP (mg/l) 6 A1B3 A2B3
8 A1B4 A2B4
10 A1B5 A2B5
Model rancangan statistika yang digunakan adalah: Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk Keterangan: Yijk
=
nilai sampel karena pengaruh 2,4-D konsentrasi ke-i, BAP konsentrasi ke-j, dan ulangan ke-k
µ
=
nilai rataan umum
αi
=
nilai akibat pengaruh perlakuan 2,4-D konsentrasi ke-i (i = 1, 2)
βj
=
nilai akibat pengaruh perlakuan BAP konsentrasi ke-j (j = 1, 2, 3, 4, 5)
(αβ)ij =
nilai akibat pengaruh interaksi 2,4-D konsentrasi ke-i dan BAP konsentrasi ke-j
εijk
=
nilai pengaruh galat pada perlakuan 2,4-D konsentrasi ke-i, BAP konsentrasi ke-j, dan ulangan ke-k
Pengolahan data dilakukan dengan uji F menggunakan program Statistical Analysis System (SAS). Perlakuan yang berpengaruh nyata pada uji F diuji lanjut menggunakan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf 5%.
Pelaksanaan Penelitian
Persiapan Sumber Bahan Tanaman
Tanaman aglaonema sebelumnya telah diberi perlakuan repotting pada media campuran sekam dan pakis yang sudah disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 0.175 bar selama 60 menit. Perbandingan campuran sekam dan pakis yaitu 1 : 1 (v/v). Penyemprotan 2 g/l fungisida (bahan aktif 80% mankozeb), 2 g/l fungisida (bahan aktif 50% benomil), dan 2 g/l bakterisida
13
(bahan aktif 20% streptomisin sulfat) dilakukan seminggu dua kali di seluruh bagian tanaman selama satu bulan. Air yang digunakan untuk mengencerkan fungisida dan bakterisida adalah air steril.
Sterilisasi Alat
Alat tanam yang digunakan di dalam laminar yaitu pinset, gunting, dan scalpel. Peralatan dicuci bersih dan dibungkus dengan kertas kemudian bersamasama dengan botol kultur disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 0.175 bar selama 60 menit. Permukaan laminar disterilkan dengan menyemprotkan alkohol 70% lalu dibersihkan dengan tisu. Semua alat yang digunakan disemprot dengan alkohol 70% sebelum dimasukan ke dalam laminar. Alat-alat direndam dengan alkohol dan dibakar diatas api lampu spiritus sebelum menanam agar alat tetap steril.
Pembuatan Media
Media yang digunakan ada dua jenis, yaitu media awal dan media perlakuan. Media awal yang digunakan yaitu media MS dengan penambahan 5 mg/l BA, 0.5 mg/l NAA, dan 100 ml/l air kelapa. Media perlakuan yaitu media MS yang diberi penambahan 2,4-D, BAP, dan 100 ml/l air kelapa. Langkah pertama dalam pembuatan media yaitu membuat larutan stok. Komposisi larutan stok MS disajikan pada Lampiran 1. Larutan-larutan stok MS dipipet ke dalam sebuah labu takar sesuai dengan volume yang dibutuhkan untuk membuat satu liter media MS, kemudian ditambah 100 ml air kelapa dan zat pengatur tumbuh sesuai dengan perlakuan masing-masing. Larutan media tersebut kemudian ditambah aquadestilata sampai mencapai tanda tera. Nilai pH media diatur dengan pH meter hingga mencapai 5.9 dengan menambahkan KOH atau HCl 1 N. Selanjutnya media ditambahkan 7 g/l agar-agar dan dimasak hingga mendidih. Setelah mendidih media dimasukkan ke dalam botol kultur steril sebanyak 25 ml/botol. Botol kultur ditutup dengan plastik bening dan karet. Sterilisasi media di dalam botol kultur dengan menggunakan autoklaf pada
14
suhu 121°C dengan tekanan 0.175 bar selama 20 menit. Media selanjutnya disimpan di ruang penyimpanan media.
Penanaman
Tanaman sumber eksplan yang sudah diberi perlakuan penyemprotan selama satu bulan kemudian dipotong seluruhnya sehingga hanya batang tanaman dekat pangkal akar yang tersisa. Batang dicuci dengan air steril dan dimasukkan ke dalam botol berisi air steril. Botol tersebut kemudian dimasukkan ke dalam laminar. Batang dipotong-potong dengan scalpel sehingga dalam satu eksplan terdapat satu mata tunas. Selanjutnya eksplan disterilisasi dengan merendam dalam larutan alkohol 70% selama satu menit, lalu dilanjutkan disterilisasi dengan sterilan berbahan aktif natrium hipoklorit 5% dengan konsentrasi 15% selama 15 menit, sterilisasi tahap akhir dengan merendam di larutan konsentrasi 10% selama 10 menit. Kemudian eksplan dibilas dengan air steril. Selanjutnya eksplan direndam di dalam larutan dengan campuran bahan-bahan sebagai berikut: fungisida berbahan aktif mankozeb 80% dengan konsentrasi 2 g/l, fungisida berbahan aktif benomil 50% dengan konsentrasi 2 g/l, bakterisida berbahan aktif streptomisin sulfat 20% dengan konsentrasi 2 g/l, antibiotik amoxicillin dengan konsentrasi 1000 mg/l, dan cefotaxime dengan konsentrasi 1000 mg/l. Eksplan direndam dengan larutan tersebut selama 24 jam sambil dikocok dengan menggunakan orbital shaker. Eksplan yang sudah steril ditanam di dalam botol kultur berisi media awal dengan menggunakan pinset yang sudah steril. Tiap botol berisi tiga eksplan. Setelah eksplan ditanam, botol segera ditutup dengan plastik dan karet kemudian disimpan di rak kultur. Rak kultur diterangi dengan lampu TL dengan intensitas cahaya 1000 Cd sebagai sumber penyinaran dengan suhu ruang 23 ± 2 °C, 24 jam terang/hari. Setelah satu minggu, eksplan yang steril disubkultur ke media perlakuan untuk diamati respon pertumbuhannya.
15
Pengamatan
Pengamatan terhadap pertumbuhan eksplan aglaonema dilakukan setiap minggu selama 12 minggu (1 – 12 MST). Parameter yang akan diamati antara lain: 1. Persentase eksplan yang terkontaminasi Persentase kontaminasi dihitung dengan cara membandingkan jumlah eksplan yang terkontaminasi dengan jumlah eksplan dari suatu perlakuan dikalikan 100%. 2. Persentase eksplan yang mati Persentase eksplan yang mati dihitung dengan cara membandingkan jumlah eksplan yang mati dengan jumlah eksplan dari suatu perlakuan dikalikan 100%. 3. Waktu munculnya mata tunas 4. Jumlah mata tunas Jumlah mata tunas dihitung dari 1 - 12 MST. 5. Panjang mata tunas Panjang mata tunas dihitung pada akhir pengamatan (12 MST) dengan cara mengeluarkan eksplan dari botol kultur. Panjang mata tunas diukur dengan menggunakan penggaris.
