Szelekciós lehetőségek a búza minőség-orientált nemesítésében fehérjekémiai és DNS markerekkel

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Vegyészmérnöki Kar Biokémiai és Élelmiszertechnológiai Tanszék

Szelekciós lehetőségek a búza minőség-orientált nemesítésében fehérjekémiai és DNS markerekkel

Ph. D. ÉRTEKEZÉS RAKSZEGI MARIANN

Témavezető: Dr. Bedő Zoltán az MTA levelező tagja Konzulens: Prof. Lásztity Radomir Professzor emeritus

MTA Mezőgazdasági Kutatóintézete Martonvásár, 2004. szeptember

Tartalomjegyzék

Old alsz

Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék Oldalszám

1 2 3

Bevezetés______________________________________________________________________________3 Rövidítések jegyzéke_____________________________________________________________________4 Irodalmi áttekintés______________________________________________________________________6 3.1 Endospermium specifikus fehérjék jelentősége a búzanemesítésben___________________________6 3.1.1 A sikérfehérjék jelentősége______________________________________________________6 3.1.1.1 A sikérfehérjék minősége__________________________________________________6 3.1.1.2 A sikérfehérjék mennyisége_______________________________________________10 3.1.2 A szemkeménység és a puroindolin fehérjék jelentősége______________________________14 3.2 A keményítő szerepe és jelentősége a búzanemesítésben___________________________________20 3.3 Két biotechnológiai módszer jelentősége és alkalmazása a búzanemesítésben__________________26 3.3.1 Molekuláris markertechnológia__________________________________________________27 3.3.2 Géntechnológiai módszerek____________________________________________________33 4 Célkitűzések__________________________________________________________________________39 5 Módszerek___________________________________________________________________________40 5.1 Növényi anyagok_________________________________________________________________40 5.2 Módszerek______________________________________________________________________40 5.2.1 Fehérjeanalitikai módszerek____________________________________________________40 5.2.2 A tészta minőségi tulajdonságainak vizsgálata______________________________________41 5.2.3 A keményítő tulajdonságainak vizsgálata__________________________________________42 5.2.4 DNS alapú vizsgálatok________________________________________________________43 5.2.5 Statisztikai elemzések_________________________________________________________44 6 Eredmények és értékelésük______________________________________________________________45 6.1 Egyes HMW glutenin gének túltermelésének hatása a búza minőségére___________________45 6.1.1 Növényi anyagok_____________________________________________________________45 6.1.1.1 1Dx5 alegység túltermelésének vizsgálatához felhasznált anyagok________________45 6.1.1.2 1Bx7 alegység túltermelésének vizsgálatában használt törzsek____________________46 6.1.2 1Dx5 HMW glutenin gén túltermelésének hatása a búza minőségére_____________________47 6.1.2.1 1Dx5 HMW glutenin génnel transzformált búzafajta fehérjeösszetételének vizsgálata_47 6.1.2.2 A környezet hatása az 1Dx5 HMW glutenin génnel transzformált búzafajta reológiai tulajdonságaira_________________________________________________________50 6.1.2.3 Dagasztási kísérletek az 1Dx5 HMW glutenin génnel transzformált búzafajta lisztjével__ 51 6.1.2.4 Értékelés______________________________________________________________55 6.1.3 A Bx7 tartalékfehérje alegység menniységi vizsgálata________________________________57 6.1.3.1 Az 1Bx7 tartalékfehérje túltermelő genotípusok és utódnemzedékeik fehérje összetételének vizsgálata_________________________________________________57 6.1.3.2 Értékelés______________________________________________________________63 6.2 Szemkeménység és a puroindolin gének hatása a búza minőségére________________________65 6.2.1 Az endospermium szerkezet és a puroindolin fehérje vizsgálatokban felhasznált törzsek_____65 6.2.2 Egyes technológiai tulajdonságok és a szem endospermium szerkezetének változása eltérő generációkban a búzánál (Triticum aestivum L.)_____________________________________65 6.2.3 Értékelés____________________________________________________________________68 6.2.4 A puroindolinok jelentősége az endospermium szerkezettel kapcsolatos vizsgálatokban______70 6.2.5 Értékelés____________________________________________________________________75 6.3 A keményítő szintézisét szabályozó enzim jelentősége és a keményítő tulajdonságainak variabilitása egy régi magyar búzafajta, a Bánkúti 1201 populációban____________________78 6.3.1 GBSS enzimfehérje vizsgálatokba bevont törzsek___________________________________78 6.3.2 A Bánkúti 1201 törzsek keményítő összetételének vizsgálata__________________________78 6.3.3 Értékelés___________________________________________________________________84 7 Eredmények összefoglalása és következtetések______________________________________________85 7.1 Tartalékfehérje alegységek mennyiségi tulajdonságainak hatásai a búza és a liszt funkcionális és reológiai tulajdonságaira________________________________________________________85 7.2 Az eltérő endospermium szerkezet következményei és a puroindolinok szerepe a búzafajták tulajdonságainak meghatározásában________________________________________________87 7.3 A keményítő tulajdonságainak diverzitás vizsgálata a beltartalmi tulajdonságok variabilitásának növelésére________________________________________________________89 8 Irodalomjegyzék_______________________________________________________________________92 Függelék_________________________________________________________________________________110

Old alsz

1. Bevezetés

1

BEVEZETÉS

A búza (Triticum aestivum L.) egyedi tulajdonságait a benne levő sikérfehérjék biokémiai és mechanikai tulajdonságainak köszönheti, melyek hálót hoznak létre a tésztában és ezáltal meghatározzák annak rugalmasságát és nyújthatóságát. Ennek megfelelően a búza minőségének javítása érdekében a nemesítők először és elsősorban a sikérfehérje összetétel megváltoztatását tűzték ki célul. A búzaliszt és a tészta tulajdonságait azonban a sikérfehérjéken kívül az endospermiumban megtalálható más komponensek - mint például egyéb fehérjék, a keményítő vagy a lipidek - is befolyásolhatják. Az endosperm fehérjéi különböző kovalens és nem kovalens kötésekkel, kölcsönhatásokat alakítanak ki egymással, egyes szénhidrátokkal és lipidekkel és ezáltal is hatással vannak a búza és a liszt minőségére. A fehérjék mellett a keményítő minőségmeghatározó szerepét hosszú ideig nem ismerték fel, mivel a keményítőt az endosperm semleges töltetének tekintették. E nézőpont akkor változott meg amikor a feldolgozóipar részéről felmerült az igény alacsony amilózatartalmú búza nemesítésére. Az amilóz mennyiségét a keményítőben a keményítőszintézis enzimeinek aktivitása határozza meg. Más fehérjék, mint például a keményítőszemcsék felületéhez kötődő puroindolinok az endospermiumszerkezet kialakításában játszanak szerepet és így közvetett módon ugyancsak befolyásolják a búza és a liszt minőségét. A búza endospermiumában megjelenő minőség meghatározó fehérjék génjei hasznos genetikai markerek a nemesítés számára. Különösen igaz ez azokra a génekre, melyeknek terméke relatíve nagy mennyiségben termelődik és halmozódik fel a búzaszemben. Ezek között megkülönböztetünk endospermium specifikus fehérjéket, szénhidrát metabolizmusban, sejt -osztódásban, -növekedésben, -metabolizmusban részt vevő és stresszhatásra adott válaszként termelődő fehérjéket. A búzanemesítés sikere nagyban függ attól, hogy a rendelkezéskre álló új technológiákat felhasználja-e a nemesítő a szelekció során. A növényi biotechnológia elsősorban két lehetőséget kínál a szelekció hatékonyságának növelésére. Ezek, a molekuláris marker fejlesztés és alkalmazás valamint a genetikai módosítás módszerei. E technikák a szekvenciák szintjén jelentkező genetikai variabilitás detektálásán alapulnak és e génszinten jelentkező különbségek használhatók fel például a megfelelő keményítő és fehérje összetétellel rendelkező búzafajták kiválasztására. Munkánk során célul tűztük ki azoknak a fehérjekémiai és DNS markereknek valamint biotechnológiai módszereknek a vizsgálatát és alkalmazhatóságát, melyek hasznos segédeszközök lehetnek a búza minőség-orientált nemesítésében.

Old alsz

2. Rövidítések jegyzéke

2 Act1 ADP ADPG AFLP ATP Bar BE bp BSA BWBD BWPR CaMV 35S CAPS CAT CBB DBE ddNTP DNS dNTP DSC DTT E. coli EST G G1P GBSS GSP GUS HI HMW-glutenin Kb KDa LMW-glutenin LTP MALDI-TOF MAT MBW MT NIR PCR PinA Pinb pmi

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

rizs aktin promótere adenozil difoszfát ADP-glükóz amplifikált fragmentum hossz-polimorfizmus (amplified fragment length polimorphisms) adenozil trifoszfát foszfinotricin alapú gyomírtószerekkel szemben rezisztenciát adó enzim génje amilopektin elágazásait létrehozó enzim (branching enzyme) bázispár DNS- keverékek szegregálásának analízise (bulk segregant analysis) görbeszélesség 3 perccel PR után (bandwidth breakdown, Mixográf) görbeszélesség PR-nél (bandwidth at peak resistance, Mixográf) karfiol mozaikvírus promótere amplifikált termékek restrikciós hasításával nyert polimorfizmus kloramphenicol-acetiltranszferáz Coomassie-Brillant Blue amilopektin elágazásait megszüntető enzim (debranching enzyme) didezoxi nukleotid trifoszfát dezoxiribonukleinsav dezoxinukleotid trifoszfát (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) keményítő gélesedéséhez szükséges energia meghatározására alkalmas termometriás módszer (Differential Scanning Calorimetry) dithiothreitol Escherichia coli genetikailag kifejeződő DNS-szekvencia duzzadási index (Alveográf) glükóz-1-foszfát keményítőszemcséhez kötött keményítő szintáz enzim (granule bound starch synthase) szem puhaságát meghatározó fehérje (grain softness protein) β-glükuronidáz enzimet kódoló gén keménység index (hardness index) nagy molekulatömegű glutenin (high molecular weight) kilobázispár kilo Dalton kis molekulatömegű glutenin (low molecular weight) lipideket szállító fehérjék (lipid transfer protein) Matrix assisted laser desorption/ionisation-Time of flight mass spectrometry szelekciós markergének eltávolítására kifejlesztett vektorrendszer (multi-auto transformation) maximális csúcsszélesség (maximum bandwidth, Mixográf). tésztakialakulási idő (mixing time, Mixográf) közeli infravörös spektroszkópia (near infrared spectroscopy) polimeráz láncreakció (polimerase chain reaction) puroindolin-a génje puroindolin-b génje foszfomannóz izomeráz gén Old alsz

2. Rövidítések jegyzéke

PR PSI PVDF QTL RAPD RBD RFLP RP-HPLC RVA SCAR SDS SDS-PAGE SE-HPLC SNAP SNP SS SSR STS Ta TBE TCA TMBW Ubi1 W

tészta keveréssel szembeni ellenállása (peak resistance, Mixográf) részecskeméret index (particle size index) polivinilidén difluorid mennyiségi jelleget meghatározó lokusz (qualitative trait locus) random képződött polimorf DNS (randomly amplified polymorphic DNA) tészta ellágyulása (resistance breakdown, Mixográf) restrikciós fragmentum hossz polimorfizmus (restriction fragment length polimorphism) fordított fázisú - nagy nyomású folyadék kromatográfia (Reversed Phase – High Pressure Liquid Chromatography) Gyors keményítőviszkozitást meghatározó készülék (Rapid Visco Analyser) feltárt szekvenciájú amplifikált régiók (sequence-characterized amplified region) Na-dodecil-szulfát Na-dodecilszulfát poliakrilamid gélelektroforézis méretkizárásos – nagy nyomású folyadék kromatográfia (Size Exclusion – High Pressure Liquid Chromatography) Single nucleotide amplified polymorphism egyetlen nukleotid eltérésen alapuló polimorfizmus (single nucleotide polymorphism) keményítő szintáz (starch synthase) egyszerű szekvencia ismétlődés (simple sequence repeat) szekvenciával jelölt hely kapcsolási hőmérséklet (annealing temperature) tris-borát-EDTA tartalmú puffer triklór-ecetsav maximális csúcsszélesség kialakulásáig eltelt idő (time to maximum bandwidth, Mixográf) kukorica ubikitin promótere deformációs munka (Alveográf)

Old alsz

3. Irodalmi áttekintés

3 3.1

IRODALMI ÁTTEKINTÉS

Endospermium specifikus fehérjék jelentősége a búzanemesítésben

3.1.1 A sikérfehérjék jelentősége 3.1.1.1. A sikérfehérjék minősége A búza őrlésével kapott liszt, 70-80% keményítőt, 10-15% fehérjét és 1-2% lipidet tartalmaz, melyek közül a fehérje bír a legfontosabb szereppel a funkcionális tulajdonságok meghatározásában. Osborne (1907, 1924) a növényi szövetekben előforduló egyszerű fehérjék négy fő csoportját különböztette meg oldhatóságuk alapján: az albuminok, a globulinok, a prolaminok és a glutelinek csoportját. Ez a csoportosítási mód később korrekcióra szorult, hiszen számos glutelin fehérjéről kiderült, hogy szerkezetüket tekintve a prolaminokhoz hasonlóak, de alkoholban nem oldható, diszulfidhidakkal stabilizált nagy molekulatömegű polimereket képeznek (Shewry és Tatham, 1990). A búza sikér fehérjéi (kb. 50 komponens) többségében alkoholban oldható tartalékfehérjék, ezeket hívjuk ma prolaminoknak. Mind a gliadinok, mind a glutenin fehérje alegységek prolaminok, mivel alkohol-víz (70% etanol, 50% i-propanol) elegyben oldódnak vagy természetes állapotukban, vagy a molekulákat összekötő diszulfid hidak redukálása után. A prolaminok mellett kisebb mennyiségben megtalálhatók a víz- és sóoldható albuminok és globulin fehérjék is. A legtöbb gabonaféle prolaminjai tartalmaznak kénben szegény és kénben gazdag fehérjéket. A búza kénben szegény prolaminjai az ω-gliadinok, melyek az összes prolamin frakció kb. 10%-t teszik ki. Az ω-gliadinok egy kis csoportja egyes genotípusokban monomerként, másokban LMW alegységeként viselkedik, azaz egy pontmutáció révén rendelkezik egy ciszteinnel, így képes diszulfid hidak kialakításra. Ezt a csoportot LMW – D alegységeknek nevezik (Payne és mtsai., 1988, Masci és mtsai., 1993). Molekulatömegük 44-78 kDa között változik, aminosav összetételük alapján jellemzően glutaminból, glutaminsavból, prolinból és fenilalaninból állnak. Másodlagos szerkezetüket tekintve a molekula kompakt szerkezetű, a szerkezeti vizsgálatok főleg β-fordulatok (β-turn) jelenlétére utalnak a repetitív régióban. A kénben gazdag tartalékfehérjék az összes prolaminfrakció kb. 80%-át teszik ki. Molekulatömegük 36 és 44 kDa között változik. Szerkezetbeli különbségeik alapján három csoportba oszthatóak: γ-gliadinok, α-gliadinok és aggregált, S-ben gazdag prolaminok (kis molekulatömegű (LMW-gluteninek) (Shewry és Tatham 1999). A γ-gliadinok legtöbbje monomer, molekuláikat 4 belső diszulfid- híd stabilizálja. C-terminális doménjük α-hélix szerkezettel rendelkezik, de a repetitív régió β-fordulatokból álló laza spirálja (β-spirál)

Old alsz


következtében a molekula pálca alakú. Az α-gliadinok szintén monomerek, melyek a γgliadinokhoz hasonló másodlagos szerkezeti elemekkel rendelkeznek, de a molekulák annál sokkal kompaktabb szerkezetűek (Popineau és Pineau, 1988). Az aggregált, S-ben gazdag prolaminok képezik az LMW-gluteninek B csoportját. Ezek olyan polimer molekulák, melyeket intra- és intermolekuláris diszulfidhidak stabilizálnak. A szerkezeti vizsgálatok alapján a C-terminális rész α-hélix szerkezettel rendelkezik, míg a repetitív régió β-spirálja a többi S-ben gazdag prolaminhoz viszonyítva kevésbé egységes (Shewry és Tatham, 1990). A búza endospermium nagy molekulatömegű prolaminfrakciója, a HMW-gluteninek szintén csak polimer formában találhatóak meg a búzaszemben. Kenyérbúzában általában 3-5 fehérjealegységből felépülő polimerek figyelhetőek meg, melyek stabilitását intra- és interspecifikus S-S hidak biztosítják (Lawrence és Shepherd, 1980). A fehérjealegységek molekulatömege 67-88 kDa között változik. Aminosav összetételük alapján nagy glicin, glutamin és prolin tartalommal jellemezhetőek (Shewry és Tatham, 1990). Molekulatömegük és aminosav szekvenciájuk alapján két csoportra oszthatóak: az x-típusú alegységek molekulatömege 83-88 kDa, az y-típusú alegységek mérete pedig 67-74 kDa között változik (Payne és mtsai., 1981). Másodlagos szerkezetük a többi kénben gazdag prolaminhoz hasonló. A terminális domének α-hélix szerkezettel rendelkeznek, míg a repetitív szakasz β-spirál szerkezetű, melynek megfelelően a HMW-glutenin alegységek is pálca alakúak. Klasszikus és molekuláris genetikai vizsgálatok alapján a búza prolaminok génjei az 1-es és 6-os homeológ kromoszóma csoport komplex lokuszain, géncsaládokban kódoltak (Shewry és mtsai., 1984, Payne és mtsai., 1984a). A géncsaládok jelenléte a prolaminok nagy változatosságát, polimorfizmusát vonja maga után. Különböző gabonafélék S-ben gazdag prolaminjainak C-terminális szekvenciáit vizsgálva Kreis és munkatársai (1985a, b) megállapították, hogy ezeknek a fehérjéknek a kialakulása több egymást követő evolúciós folyamat eredménye. A kénben szegény prolaminokat kódoló gének az 1-es kromoszóma rövid karján a Gli-1 (ω-gliadinok), Gli-A3 és Gli-B3 lokuszban lokalizáltak (ω-gliadinok és LMW glutenin-D alegységek). A kénben gazdag prolaminokat kódoló gének az 1-es kromoszóma rövid karján valamint a 6-os kromoszómán helyezkednek el. A Gli-1 lokuszon lokalizáltak a γ-gliadinokat, a Glu-3 lokuszon az LMW-glutenin B- és C alegységeket, és a 6os kromoszóma Gli-2 lokuszán az α-gliadinokat kódoló gének (1. táblázat). A HMW glutenin fehérjealegység gének az 1 homoeológ kromoszóma hosszú karján, három különböző lókuszon kódoltak (Glu-A1, Glu-B1, Glu-D1) és minden lokusz két különböző szorosan

Old alsz


kapcsolt gént tartalmaz (x, y típus) (Harberd és mtsai., 1986). Ennek megfelelően a hexaploid búzában hat HMW glutenin gén van jelen, melyből az 1Bx, a 1Dx és 1Dy minden búzafajtában kifejeződik, míg az 1Ax és az 1By alegységek csak egyes genotípusokban expresszálódnak (Shewry és Tatham, 1997). Az 1Ay alegységek aestivum genotípusokban nem mutathatóak ki, de más vad búzafajokban, pl. T. dicoccoides vagy T. urartu fajtákban expresszálódnak. A Glu-A1y gén működőképes változatát megtalálták néhány svéd hexaploid nemesítési törzsben (Margiotta és mtsai.,1996), ahova valószínüleg a nemesítés folyamata során keresztezésre használt vad fajból jutott be a gén. 1. táblázat A búza tartalékfehérje génjeinek kromoszómális elhelyezkedése Géncsalád Kénben szegény prolaminok

Lokusz Gli-1

Kromoszóma 1A, 1B, 1D rövid kar

Kódolt fehérjék ω-gliadinok

Gli-A3, Gli-B3

1A, 1B rövid kar

Gli-1

1A, 1B, 1D rövid kar

ω-gliadinok/ LMW glutenin – D alegységek γ-gliadinok

Glu-3

1A, 1B, 1D rövid kar

Gli-2

6A, 6B, 6D

Glu-1

1A, 1B, 1D hosszú kar

Kénben gazdag prolaminok

HMW-prolaminok

LMW-glutenin B- és C alegységek α-gliadinok HMW glutenin alegységek

A tészta dagasztása során, a kenyérminőség kialakulásában szerepet játszó prolaminok, olyan összefüggő fehérjemátrixot hoznak létre a keményítő szemcsék körül, mely víz hatására térhálósodik és létrehozza a sikért. A tészta kb. 10 %-át kitevő sikér közel 80 %-a (száraz a.) fehérje, a többi része főként keményítőből és lipidekből áll. Víz hozzáadásakor a liszt komponensei között versengés alakul ki, melynek eredményeként a fehérjék mellett a keményítő a hozzáadott vízmenniység mintegy 46%-át köti meg, de jelentősen hozzájárulnak a víz abszorpciójához a pentozánok is, melyek saját tömegük tízszeresének megfelelő vízmennyiséget képesek megkötni. A keverésnek fontos szerepe van a homogenitás és a hidratáció kialakulásában, hisz általa folyamatosan új felületek jönnek létre és közben különböző fizikai és kémiai kölcsönhatások alakulnak ki. A sikérmátrixban alapvetően három kölcsönhatás típust különböztethetünk meg. Ezek a fehérje-fehérje, fehérje-lipid és a fehérjeszénhidrát között kialakult kölcsönhatások. A búza funkcionális tulajdonságai nemcsak az egyes sikérfehérje típusok jelenlététől és az általuk kialakított szerkezetétől, hanem ezek egymással

és

az

egyéb

komponensekkel

(lipidekkel,

szénhidrátokkal)

kialakított

kölcsönhatásaitól is függenek (Lásztity 1996, Payne 1987, Shewry és mtsai. 1992).

Old alsz


A sikérfehérjék között háromféle kovalens kötéstípus jöhet létre. Ezek az aminosavakon belüli kötések, a peptidkötések és a diszulfidkötések. A tészta reológiai tulajdonságainak kialakulásánál a diszulfidkötések és egyes esetekben a peptid kötések játszanak fontos szerepet (Bushuk 1998). A diszulfid hidak viszonylag stabil keresztkötéseket képeznek a polipeptid láncokon belül és a láncok között, továbbá stabilizálják a hidrogén és a hidrofób kötéseket. A dagasztás során a polipeptid láncok közötti diszulfidhidak mobilizálhatók, azaz felbomlás után képesek új molekulákon belüli és molekulák közötti keresztkötések kialakítására. A diszulfidhidak ezen tulajdonságát különböző redukciós-reoxidációs kísérletekkel bizonyították be (Békés és mtsai. 1994a, Panozzo és mtsai 1994). A polimerek közötti keresztkötöttség mértéke meghatározza a tészta rugalmasságát, hiszen a S-S hidak számának kis mértékű megváltozása a reológiai tulajdonságok jelentős változásához vezet. A kovalens kötések mellett kialakulnak hidrogén kötések, hidrofób és ionos kölcsönhatások is a sikérhálón belül. A hidrogén kötések a térhálós szerkezet stabilizálásában játszanak fontos szerepet, kialakulásukat a tartalékfehérjék nagy glutamintartalma, valamint a keményítőben és a pentozánokban levő hidroxilcsoportok biztosítják (Wrigley és mtsai., 1998). Megfigyelték, hogy a fehérje-keményítő kölcsönhatás a sikérfehérje tartalom növelésével és a lipidek eltávolításával erősödik, ugyanakkor nem sikérfehérje adagolásával (szója, napraforgó) illetve a pH növelésével csökken (Cumming és Tung 1975). A hidrogén kötések jelenlétét bizonyítja, hogy a karbamiddal történő kezelés (mely a hidrogén kötéseket bontja) a reológiai tulajdonságok drasztikus változásához vezet. A kötések nyújtóerő hatására átrendeződnek. A tartalékfehérjék apoláris oldalláncai között kialakuló hidrofób kölcsönhatások a tészta plasztikus és elasztikus tulajdonságainak kialakulását segítik elő (Pomeranz 1988). A sikér fehérjék közül a gliadinok főként hidrofób kölcsönhatásokat alakítanak ki egymással és a sikér mátrixba beépülő lipidekkel. Az így kialakuló lipid kettős réteg biztosítja a tészta plasztikusságát, míg a fehérjék közötti szerkezetstabilizáló kötések kialakulása hozzájárul a tészta rugalmasságához. A lipidek a hidratált komplex szerves részét képezik. A dagasztás, kelesztés és a sütés során gáz-víz és gáz-olaj felületek alakulnak ki melyek stabilizálása lipidek és lipid-fehérje komplexek bevonásával történik (Marion és Dubreil 1998). A poláris lipidek jelenléte hozzájárul a kenyértérfogat növekedéséhez, míg a trigliceridek vagy a szabad zsírsavak

csökkentik

a

kenyértérfogatot.

Egyes

fehérjék

a

lipidekkel

spontán,

energiabefektetés nélkül képesek kölcsönhatásba lépni. Ezeket a fehérjéket nevezzük lipidkötő fehérjéknek (LBP-lipid binding proteins). Ebbe a csoportba tartoznak a thiononek, a ligolinek vagy az S-fehérjék is (Békés és Smied 1981). Egyes vizsgálatok szerint ezek a fehérjék

diszulfidhidak

és

hidrofób

kölcsönhatásokon

keresztül

a

sikérhálóba Old alsz


polimerizálódnak és részt vesznek a sikérszerkezet kialakításában (Okada és mtsai 1987). Megfigyelték, hogy detergensek liszthez adagolásával a kenyérbélzet szerkezete javítható. Ez azt bizonyítja, hogy a búza lipidösszetételének módosítása, vagyis a poláris lipidek arányának növelése

pozitív

hatással

van

a

kenyér

szerkezetére.

A

poláris

lipidek

térfogatnövelő/habstabilizáló hatásukat egyes fehérjék jelenlétében (pl. puroindolinek) tudják érvényesíteni (Hamer és mtsai 1990). A sikér fehérjéinek viszonylag kevés az ionizálható oldallánca, de ionos kötések kialakulhatnak mind a lipidek, mind a pentozánok ionos csoportjaival. A sikérmátrixnak és kölcsönhatásainak tehát jelentős szerepe van a tészta reológiai tulajdonságainak,

rugalmasságának

és

nyújthatóságának

kialakulásában.

Ezeknek

a

tulajdonságoknak a kialakulása és a köztük levő egyensúly elengedhetetlen a kenyérkészítés során. 3.1.1.2. A sikérfehérjék mennyisége A búza minőségének meghatározására nem elegendő csupán a búza tartalékfehérje allélösszetételének tanulmányozása, hanem azok abszolút mennyiségeinek ill. relatív arányainak ismeretére is szükséges (Marchylo és mtsai. 1989, Sutton 1991, Seilmeier és mtsai. 1991). Számos kutató vizsgálta a glutenin és a gliadin alegységek arányának komplex hatását a tészta reológiai tulajdonságaira, nyújthatóságára (Uthayakumaran és mtsai. 2000a, Ahmad 2000, Singh és mtsai. 1990). Eredményeik alapján megállapították, hogy a gliadin tartalom növelése a tésztakialakulási idő (MT), a tésztarezisztencia (PR), a nyújtással szembeni maximális ellenállás (Rmax) és a kenyértérfogat csökkenését eredményezi, miközben a tészta ellágyulása gyorsul és nyújthatósága nő (Uthayakumaran és mtsai. 2001, Fido és mtsai. 1997). A HMW és LMW gluteninek mennyiségi arányainak megváltoztatása az ’in vitro’ polimerek molekulatömeg eloszlásában és a búza funkcionális tulajdonságaiban okoz változásokat. Beasley és mtsai (2001) szerint a HMW homopolimerekből felépülő tészta erősebb, az LMW glutenin homopolimerekből felépülőnél. A glutenin alegységekkel végzett keverési és dagasztási vizsgálatokban, a HMW/ LMW arány növekedésével nőtt a MT, PR, Rmax és a kenyértérfogat értéke, míg az ellágyulás és a nyújthatóság csökkent (Uthayakumaran és mtsai. 2000b). Reoxidációs kísérletekkel is bizonyították, hogy a HMW-glutenin mennyiségének növelése a sikérerősség javulását eredményezi (Schropp és Wieser 1996, Wieser és mtsai. 1994a,b). Számos kutatócsoport vizsgálta a HMW- és LMW-glutenin alegységek jelenlétének hatását a funkcionális tulajdonságokra külön-külön és együttesen. Tanulmányozták a különböző alegységek szinergisztikus és additív hatásait ’in vitro’ módszerekkel, szisztematikusan Old alsz


változtatva a fehérje összetételt a búzalisztből kinyert tisztított fehérjekomponensek liszthez adagolásával (Uthayakumaran és mtsai 2002, Beasley és mtsai 2002). Megállapították, hogy a Glu-D1-en kódolt HMW gluteninek (5+10) hatása szignifikánsan nagyobb a tészta tulajdonságaira, mint a Glu-B1-en kódolt alegységeké (17+18), valamint azt hogy a Glu-A1 által kódolt 1-es alegység befolyásolta a legkisebb mértékben a búzaliszt funkcionális tulajdonságait. HMW-glutenin alegység-kombinációk esetében a 17+18 (Glu-B1) és 5+10 (Glu-D1) allélek együttes jelenléte szignifikánsan pozitívabb hatású volt a tésztaerősségre, mint akár a 20 (Glu-B1) és 2+12 (Glu-D1) allélek vagy keverékeik jelenlétének hatása. Békés és mtsai. (1994b,c) ellenőrzött reoxidációs eljárás mellett fehérjéket építették be a Glu-D1 alegységeket eredetileg nem tartalmazó lisztbe. Tapasztalataik szerint az x és y-típusú alegységek együttes beépítése szinergetikus hatást gyakorolt a mixográfos tulajdonságokra. Uthayakumaran és mtsai. (2000b) hasonló kísérleteket végeztek a Glu-1B lokuszról származó 7 és 8 alegységek beépítésére is. A Glu-D1 5 és Glu-D1 10 alegységek együttes beépítésekor tapasztalt szinergikus hatásokkal ellentétben a Glu-B1 7 alegység tésztaerősségre gyakorolt hatása nagyobb volt, mint akár a 8-as alegység, akár a 7+8 együttes beépítésekor tapasztalt hatások. Megfigyelések szerint az LMW-gluteninek közül a Glu-A3c és Glu-B3b alléleket együttesen hordozó genotípusok szignifikánsan nagyobb extenzográfos Rmax értékekkel rendelkeztek, mint a Glu-A3e és Glu-B3c alléleket együttesen hordozó fajták. Azokban az esetekben, ahol egy pozitív és egy kevésbé pozitív hatású alléllel kombinálódott, az Rmax a két szélső érték közötti volt (Gupta és mtsai. 1994, Gupta és MacRitchie 1994). Ugyancsak szignifikáns kölcsönhatásokat mutattak ki a Glu-1 és Glu-3 lokuszok között a szedimentációs értékre vonatkozóan Rodriguez-Ouijano és Carrillo (1996). Gupta és mtsai. (1994) szerint a búzagenotípusok reológiai tulajdonságai megbecsülhetőek a Glu-1 és Glu-3 allélösszetételük alapján. Vizsgálataikban a Glu-1 lokusz 60%-ban, a Glu-3 lokusz 20%-ban míg a lokuszkölcsönhatások

10%-ban

járultak

hozzá

a

tészta

stabilitásban

mutatkozó

különbségekhez. Az egyes Glu-1 és Glu-3 lokuszok közötti kölcsönhatások túlmutatnak a lokuszok additív hatásán, vagyis egy allél relatív hatását befolyásolja az is, hogy a többi lokuszon milyen allélek találhatók. A jelenlegi álláspont szerint a HMW gluteninek ’in vivo’ és ’in vitro’ körülmények között is erősen korrelálnak a tészta erősségével, míg az LMW gluteninek és a gliadinok a tészta nyújthatóságát határozzák meg (Shewry és mtsai 2003, Uthayakumaran és mtsai 2002).

Old alsz


A búza sütőipari tulajdonságait, egyes nagy molekulasúlyú (HMW) glutenin alegységek jelenléte és az egyes alegységek relatív mennyisége egyaránt befolyásolják (Payne és mtsai. 1987, Lawrence és mtsai 1988, MacRitchie és mtsai. 1991). A Glu-B1–en kódolt HMW gluteninek közül a Bx7 számos kenyér- és durumbúza fajban fordul elő (Shewry és mtsai. 1992, Lookhart és mtsai. 1993) és minőség meghatározó szerepének vizsgálata napjainkban különösen nagy figyelmet kap. A Bx7 alegység rendszerint a By8 vagy a By9 alegységgel együtt jelenik meg, ezért minőségre kifejtett hatásának vizsgálatakor sem választható el ytípusú párjától. Az általánosan elfogadott dogma szerint az x- és y- típusú HMW glutenin gének egy kópiában fordulnak elő a genomban, amit eddig megbízhatóan senki nem bizonyított. A 80-as évek közepén néhány szerző (Forde és mtsai. 1985, Harberd és mtsai. 1986) próbálta megbecsülni a HMW glutenin gének számát, de bizonyításig senki nem jutott el. D’Ovidio és mtsai. (1997) kimutatták Southern blot analízist követő denzitometriás méréssel, hogy a Red River 68’ fajtában a Bx7 allélnek megfelelő DNS sáv intenzitása duplája más, fajták Bx7 génjére kapott sáv intenzitásának. A szerzők arra következtetnek, hogy a gén két kópiában van jelen ebben a fajtában. A megnövekedett génkópiaszám pedig megnövekedett fehérje expressziót eredményezett. A Bx7 fehérje túltermelésre magyarázatot nem adtak, mivel nem zárható ki, hogy az egyik kópia pszeudogén. Eredményüket más hasonló tulajdonságú fajtára eddig senkinek nem sikerült igazolnia. A Glenlea kanadai búzafajtában a Bx7 alegység génje egyetlen kópiája van jelen, ennek ellenére mégis túltermelő Bx7 alegységre nézve. Különbséget találtak normál Bx7 termelő genotípusok tartalékfehérje génjei között is. Így például a Cheyenne Bx7 génje 30 bp-al rövidebb a Chinese Spring génjénél. Marchylo és mtsai. (1992) szerint legalább kétféle 1Bx7 fehérje létezik a különböző fajtákban, melyeket 7 és 7*-nak nevezett el. A 7* alegység körülbelül a teljes HMW glutenin tartalom 27%-t (pl. Cheyenne), míg a 7-es a 41%-át alkotja (pl. Chinese Spring). A Bx7 alegység mennyiségének növekedése végeredményben a tészta rugalmasságának és ellenállásának növekedését vonja maga után (Lukow és mtsai 1992). A tartalékfehérje összetétel azonosítása és a fajtákban előforduló allélek izolálása lehetővé teszi a fajtában rejlő jó sütőipari és technológiai tulajdonságok modern búzafajtákba történő beépítését (Cloutier és mtsai. 1998). Amint a a fentiekből összefoglaltakból kitűnik a búza minőségét a sikér fehérjéinek minősége és mennyisége is befolyásolja. De mit is jelent a búzaminőség? Maga a búzaminőség komplex fogalom, mely alatt a búzaliszt alkalmasságát értjük különböző végtermékek (kenyér, tészta, keksz, stb.) előállítására. Ez alapján a búza minőségét a nyersanyag őrlési, kémiai és reológiai Old alsz


tulajdonságai valamint a gyártási technológia egyaránt meghatározzák, illetve meghatározzák azt is, hogy milyen termék készülhet az adott búzafajtából. A magyar búza szabvány az étkezési búza két nagy csoportját különbözteti meg, a javító és a malmi minőségű búzák csoportját. Ezen belül a feldolgozóipar igényeinek megfelelően több minőségi csoport különböztethető meg. Európában és Magyarországon a búzanemesítés kenyérbúza centrikus. Megjegyzendő azonban, hogy tájegységenként/országonként különböző kenyértípusokat állíthatnak elő, melyek egyben más-más technológiai paramétereket is igényelnek. Igy például más országok kenyereihez és egyéb termékeihez viszonyítva a magyar kenyér nagyobb dagasztási igényt, hosszabb fermentációt és erősebb tésztát követel. A búzaliszt egy részét a tésztaiparban használják fel, az itt támasztott minőségi követelmények a nedvessikér tartalom és a reológiai tulajdonságok tekintetében nem olyan szigorúak, mint a kenyér gyártásánál, az őrlési technikának azonban annál nagyobb szerepe van a száraztészta gyártásához szükséges minőség kialakításában. A legfontosabb tulajdonságok, amelyeket figyelembe vesznek a hamutartalom (mely nem lehet nagyobb 0.5%-nál) és a liszt szemcsemérete. A búza ritkább és speciálisabb felhasználását jelenti a búzasör gyártása, melyhez alacsony fehérjetartalmú és alacsony esésszámú búzafajták használata szükséges. A számos felhasználási cél közül a fentiekben csak néhányat említettem meg ugyan, de már ez is tükrözi, hogy Európában, mely termőterületét tekintve kis méretűnek számít egyszerre többféle tulajdonságra nemesít a nemesítő hiszen viszonylag kis termőterületen megtermelt búzafajták széles szortimentjét kell biztosítania a feldolgozóipar számára. Amerika, Kanada és Ausztrália, mely Európával szemben hatalmas termőterülettel rendelkezik a búza termesztésében földrajzi megosztást hoztak létre. Ez azt jelenti, hogy a különböző minőségi csoportba tartozó búzafajtákat másmás egymástól távoleső területeken termesztik és így elkerülik a különböző minőségtípusok véletlen keveredését is. Amerikában például hat minőségi csoportot hoztak létre, melyek közül a nagy fehérje tartalmú, erős sikérrel rendelkező ’hard red winter’ típust az ország középső régiójában termesztik, míg a durumot északon, a keksz és tésztagyártásra alkalmas ’soft white’ típust észak-nyugaton termesztik. Speciális igények a világ más részein is utolérik a nemesítőt. Az ázsiai országok tésztái például, meglehetősen eltérő összetételű és minőségű búzafajtákat igényelnek. Ezeknek a termékeknek a minőségét elsősorban nem a sikér, hanem sokkal inkább a keményítő összetétele határozza meg. Igy például az úgynevezett ’Japonese noodle’ tésztaféle gyártása a waxy típusú amilóz mentes búza nemesítését és termesztését igényli. 3.1.2 A szemkeménység és a puroindolin fehérjék jelentősége Old alsz


A búza minőségének legfontosabb meghatározói ugyan a sikérfehérjék, az elsődleges szempont, ami alapján megkülönböztetjük és szelektáljuk a búzafajtákat a nemesítés korai szakaszaiban az a szemkeménység. A búzaszem endospermium szerkezete meghatározza a liszt részecskeméretét és sűrűségét, a keményítősérülés mértékét, a vízabszorpciót, a lisztkihozatalt valamint behatárolja a végfelhasználás lehetőségeit is. Az endospermium szerkezet ebből következően a búza egyik legfontosabb tulajdonsága, mely meghatározza a feldolgozóipar számára a fajta felhasználhatóságát. Az endospermium szerkezet vagy másképp a búzaszem relatív keménysége vagy puhasága a szem deformációval szembeni ellenállását jelenti. Ez a definíció a Single Kernel Characterization System (SKCS) keménységmérési módszeren alapszik. A készülék azt az erőt méri, ami a szem két felület közötti összeroppantásához szükséges (Worzella és mtsai 1939, Osborne és mtsai 2001). Egy kevésbé közvetlen definíció szerint az endospermium szerkezet azt mutatja meg, hogy hogyan viselkedik a búza őrlés, a liszt pedig a feldolgozás során. A részecske méret index (PSIparticle size index) az őrlés után a szitán átment liszt tömegét adja meg a teljes mennyiség százalékában. Keményszemű búzák esetén ez az érték kisebb, mint a puhaszemű búzák esetén. A búzaszem keménységét a szem endospermiuma határozza meg, melynek fehérje/keményítő mátrix-al kitöltött sejtjeit sejtfal választja el egymástól (Mares és Stone 1973). A szem keménységét és acélosságát gyakran használják egymás szinonimájaként annak ellenére, hogy más-más tulajdonságot jellemeznek. Az acélosság a szem vágási felületének vizuális leírását jelenti. Az acélos vagy üveges búza endospermiuma tömör és légbuborék mentes. A nem acélos szem fehér, lisztes, endospermiumának folytonosságát légbuborékok szakítják meg (Dexter és mtsai 1989). Parish és Halse (1968) szerint a hőmérséklet, a fényintenzitás, a szem kiszáradásának mértéke és a nitrogén ellátottság mind befolyásolják az acélosságot. Nelson és mtsai (1995) szerint az acélosságot a környezeti hatások mellett genetikai faktorok is meghatározzák. Fénymikroszkópos vizsgálatok alapján mind a puha, mind a keményszemű búzafajtákban kimutattak nagy, pálcika alakú (A-típusú) valamint ennél kisebb, kör alakú (B-típusú) keményítőszemcséket (Bechtel és mtsai 1993). Elektron mikroszkópos (SEM) vizsgálatokkal pedig azt állapították meg, hogy a puhaszemű fajták keményítőszemcséinek felületéhez több molekula kötődik, mint a keményszeműekéhez. Ezek közül a felülethez kötődő extra fehérjéknek tulajdonítanak szerepet a fehérje és a keményítő mátrix közötti adhézió kialakulásában (Barlow és mtsai 1973). A búzaszemben a keményítő mellett mintegy 10-13% tartalékfehérje található, azonban azt kizárták, hogy a fehérje

Old alsz


alegységeknek illetve azok mennyiségének nagy hatása lenne a szem keménységére (Bietz 1987). A közönséges búza (T. aestivum) genotípusok közül a puhaszemű típusok őrlés során finomszemcsés porszerű lisztet adnak, míg a keményszemű típusokból durvább liszt őrölhető (Biffen 1908). A két típus közötti eltérést főként az okozza, hogy őrléskor a keményszemű fajták szemtermése a sejtfalak mentén aprózódik, míg a puhaszeműek esetében maga a sejt is több darabra esik szét (Hoseney és mtsai. 1988). Őrlés során a keményszemű búzák szemcsemérete nagyobb, mint a puhaszeműeké, és jelentősebb mechanikai sérüléseket szenvednek. A nagyobb mértékű keményítősérülés nagyobb vízfelvételi kapacitással jár együtt. Ebből következően a búza endospermiumának szerkezete alapvetően determinálja egy adott genotípus technológiai minőségét, fontos jellemzője a búza malom- és sütőipari minőségének és egyben megbízható előrejelzése a belőle származó liszt minőségi és mennyiségi

tulajdonságainak.

A

kemény

endospermium

szerkezet

tehát

feldolgozástechnológiai okoknak köszönhetően áll összefüggésben a nagy lisztkihozatallal, a nagyobb mértékű keményítősérüléssel, a liszt nagyobb vízfelvevő képességével, a kenyértérfogattal, a kenyér minőségi jellemzőivel (bélzet, magasság stb, Pomeranz és Williams, 1990) és a fehérjetartalommal (Bedő és mtsai. 1998,1995, Vida és Bedő 1999). A keményszemű búzafajtákat leginkább kenyérkészítésre vagy péksütemény gyártására, míg a puhaszeműeket keksz-, cukrász- vagy sör-ipari célra használják. Genetikailag egyetlen fő gén határozza meg a szem keménységét, pontosabban a puhaságát (Morrison és mtsai 1989). Kromoszóma szubsztitúciós vonalakkal bizonyították, hogy a szem endospermium szerkezetében fellépő különbség gyakorlatilag egy, az 5D kromoszóma rövid karján elhelyezkedő úgynevezett Ha (hardness) gén expressziójának köszönhető (Mattern és mtsai 1973). Egyetlen fő gén jelenléte azonban ellentmond a búza allohexaploid tulajdonságának (T. aestivum) (2n=6x=42 kromoszóma, AABBDD genom), mivel a legtöbb gén háromszoros homológ szériában létezik, minden genomban egyszer. A Ha gén tehát valószínűsíthetően a búza 5A és 5B kromoszómáján is jelen van, de nem fejeződik ki. Ezért keményebbek például a hexaploid búzánál a tetraploid durum búzák (Triticum turgidum L. var. Durum) (2n=4x=28 kromoszóma, AABB), mivel hiányzik belőlük a D genom. Genetikailag kemény búzák közé sorolható a legtöbb tetraploid faj (pl. Triticum durum, T. turgidum, T. dicoccoides és T. polonicum) és a hexaploid T. aestivum faj számos képviselője. Sourdille és mtsai (1996) a 2A, 2B, 5B és 6D kromoszómán is kimutattak szemkeménységet Old alsz


befolyásoló régiókat. További tanulmányok kimutatták, hogy az előbbieken túlmenően más régiók is szerepet játszanak a búza endosperm szerkezetének szabályozásában. Ezek a régiók a 4D és 4B kromoszómán lokalizáltak (Osborne és mtsai 2001, Giroux és mtsai 2000). A búza keménységét tehát valószínüleg több gén együttes hatása alakítja ki, de ezidáig egyedül az 5D kromoszómán található Ha lokuszban detektáltak variabilitást. A nemesítés során egy búzafajta szemkeménysége függ a keresztezési partnerek szemkeménységétől. E tulajdonság heritabilitása Davis és mtsai. (1961) szerint kemény x puhaszemű kombináció esetén 0.60, Pearson és mtsai. (cit. Barabás és mtsai. 1987) kísérleteiben 0.72 volt. Jolly és mtsai. (1996) kísérleteiben a puhaszemű jelleg domináns tulajdonságként öröklődött, a hasadási arány 3:1 lett a puha : keményszemű genotípusok javára. A genetikai tényezőkön kívül a szem endospermium szerkezetét számos egyéb faktor, a környezet (Symes 1965), a szemnedvesség (Obuchhowski és Bushuk 1980), a pentozánok (Bettge és Morris 2000) és más vízoldható frakciók (Simmonds és mtsai 1973) valamint a lipidek (Panozzo és mtsai. 1993, Morrison és mtsai. 1989) jelenléte is befolyásolja. A keménységi csoportba sorolás a felsorolt faktorok hatására általában nem változik meg. A környezet hatása lehet nagy, de a genotípus hatása ennél mindig jóval jelentősebb. A szemkeménység genetikai hátterén túl a pontos biokémiai és molekuláris háttér sokkal nagyobb fejtörést okoz a kutatóknak. A legtöbb tanulmány a Ha lokusz 15 kDa-os termékét, a kemyényítő szemcsék felületéhez kötött friabilin fehérjét vizsgálja. A friabilint a keményítőszemcsék felületéről SDS oldattal mossák le és SDS-PAGE gélen választják el. A puhaszemű búzákban a friabilin nagy mennyiségben megtalálható, a keményszemű fajtákban azonban vagy kevéssé vagy egyáltalán nem expresszálódik (pl. durum) (Greenwell 1986). Ez a 15 kDa-os friabilinnek vagy GSP-nek (Grain Softness Protein) elnevezett fehérje volt az első biokémiai marker, melyet az endospermium szerkezetének vizsgálatára használtak (Jolly és mtsai 1993). Az első hipotézis szerint a friabilin, a keményítő és a fehérjemátrix közötti határfelületen helyezkedik el és szabályozza a köztük levő kölcsönhatás erősségét. Puhaszemű búzafajtákban, ahol a friabilin nagyobb mennyiségben található a keményítőszemcsék felületéhez kötődve, a keményítő és a fehérjemátrix könnyebben elválasztható egymástól, mint keményszeműek esetén (Greenwell 1992). Jolly és mtsai (1993) antitestek felhasználásával kimutatták, hogy a friabilin nagy része a sikér frakcióban található a keményítő vizes kimosása után, azonban a keményítő felületéhez kötött friabilin vizsgálatakor tudtak csak különbségeket kimutatni a puha és keményszemű fajták között. Darlington és mtsai (2000) szintén kimutatták, hogy a keményszemű búzákban a friabilin nagy része a Old alsz


fehérjemátrixban található. Kromatográfiás módszerrel a friabilineket komponenseire bontották (Day és mtsai 1999). A két fő komponens a puroindolin-a és a puroindolin-b. Nterminális szekvenálással bebizonyították, hogy a búzaszem Triton-X100-ban oldodó fehérjéi azonosak a puroindolin a és b gének termékeivel. Rahman és mtsai (1994) egy harmadik komponenst is azonosítottak, amelyet GSP-1-nek neveztek el és ezen felül további minor komponensek lehetséges keménységmeghatározó szerepéről is beszámoltak már (Oda és Schofield 1997). A puroindolin név a görög ’puros’=búza és a triptofán gyűrűjének ’indolin’ elnevezéséből származik. Kezdetben azt gondolták, hogy a puroindolinok a növény védekezési mechanizmusában vesznek részt, mivel szerkezetük és extrakciós tulajdonságaik a számos mikroorganizmusra és állati sejtre toxikus hatású thioninekéhez hasonló. Ezért a puroindolinek jelentőségét mezőgazdasági szempontból a patogének, gombák elleni rezisztencia kialakításában látták, de jelentőséget tulajdonítottak minőségre kifejtett hatásuknak is. A patogénekkel szemben kialakított rezisztenciát bizonyítja, hogy a T. aestivum és a T. durum betegség ellenálló képessége nagy mértékben különbözik egymástól, például kalászfuzárium fertőzöttség tekintetében. Az átlagosan 12.8 kDa molekulatömegű puroindolinek ciszteinben gazdag polipeptidek, melyek egy egyedi triptofánban gazdag domént tartalmaznak (Blochet és mtsai. 1993). A keményítő felületéhez kötött puroindolin-a és b szekvenciái 55% hasonlóságot mutatnak, triptofánban gazdag doménjeik eltérnek egymástól. A puroindolin-a öt triptofánt és három bázisos aminósavat (WRWWKWWK), míg a puroindolin-b három triptofánt és két bázisos aminósavat tartalmaz (WPTKWWK) (Gautier és mtsai 1994). A puroindolin-a és b hexaploid búzában specifikusan a fejlődő magban fejeződik ki a fejlődés korai szakaszától. Tetraploid durum búzában fehérje expresszió egyáltalán nincs, mivel génjeik sincsenek jelen a genomban (Gautier és mtsai 1994, 2000). Mindez öszhangban van azzal a megállapítással, hogy a puroindolin gének a D genomon lokalizáltak. Bár a tetraploid és hexaploid búzafajták A és a B genom donorját nem azonosították még teljes bizonyossággal, az összes lehetséges jelölt tartalmazza a puroindolin géneket (Jagtap és mtsai 1993). A puroindolin gének jelenlétének vagy hiányának kérdése a búza A és B genomján ezidáig nem tisztázott. Megállapították azonban, hogy a puroindolin-a az 5D kromoszóma rövid karjának végére térképeződik és génje szorosan kapcsolt a Ha lokusszal (Sourdille és mtsai 1996). A puroindolin-b együtt szegregál a puroindolin-a-val és szintén szorosan kapcsolt a Ha lokusszal. A puroindolin gének valamennyi vizsgált diploid búzafajban megtalálhatók (Gautier és mtsai 2000) valamint zabban (Tanchak és mtsai. 1988) és árpában (hordoindolinek, Beecher és mtsai. 2001) is találtak a puroindolinekhez hasonló szekvenciákat. Igrejas és mtsai (2000) megállapították, hogy mindkét puroindolinn gén Old alsz


expressziója genetikailag meghatározott, de a környezet a puroindolin-a gén expresszióját jobban befolyásolja, mint a puroindolin-b génét. A friabilin harmadik komponensét a GSP-1-t emésztéssel találták meg Jolly és mtsai. (1993). Szekvenciája nagy hasonlóságot mutat a zab avenin fehérjéivel (50%) és a puroindolin génekkel is (45% és 49% a puroindolina és b-vel), azonban csak két triptofán aminosav van a triptofánban gazdag domén régiójában. Kimutatták, hogy a GSP-1 szintén szorosan kapcsolt a Ha lokusszal (Turner és mtsai 1999). Monoklonális

antitestekkel

megállapították,

hogy

a

puroindolin-a

elsősorban

a

keményítőszemcsék és a fehérjemátrix közötti határfelületen helyezkedik el, míg a puroindolin-b elsősorban zárványok formájában az aleuron rétegben van és feltételezhetően a keményítő felületén is megtalálható (Dubriel és mtsai 1998). Transzgénikus rizs növényekben a puroindolin-b promoterét felhasználva megállapították, hogy a gén kifejeződik (ezesetben GUS) az aleuron rétegben, az endospermium keményítőjén, a szkutellumban és a pericarpban azonban a szárban, gyökérben, levélben és a pollenben nem (Digeon és mtsai. 1999). A puroindolinek biológiai funkciójukat feltételezhetően lipidkötő képességükkel töltik be. Ezt a feltételezést megerősíti az a tény, hogy egy a szabad poláros lipidek mennyiségét szabályozó lokusz (Fpl-2) a Ha lokusszal kapcsolt (Panozzo és mtsai 1993) valamint az a tény is, hogy a puroindolinok elsődleges szerkezete az LTP-hez hasonló. A puroindolin-lipid kölcsönhatás oldatban jelenik meg vagyis a lipidkötés a levegő-víz határfelületen jön létre (Marion és mtsai 1994). A feldolgozás során a puroindolinek lipidkötő képességének több szempontból is különös jelentősége van. A puroindolinek egyedi tulajdonsága, hogy természetes állapotukban jó habképző tulajdonsággal rendelkeznek és gátolják a poláris és semleges lipidek habdestabilizáló hatását. A kenyérkészítés során ezért ezek a fehérjék részt vesznek a tészta reológiai tulajdonságainak és a kenyér térfogatának kialakításában. Kis mennyiségű puroindolint adagolva a tésztához azt tapasztalták, hogy a kenyérbélzet szerkezete megváltozott (Dubriel és mtsai 1997, Douliez és mtsai 2000), és ezzel együtt a tészta nyújthatósága és ellenállósága is (Dubriel és mtsai 1998). A söriparban, a puroindolinek az újbóli habosodáshoz járulnak hozzá, melyet a semleges és a poláris lipidek megszüntettek. Számos búzafajta puroindolin-a és b génjét szekvenálták már meg világszerte (Douliez és mtsai 2000, Lillemo és mtsai 2000, Turnbull és mtsai 2000, Giroux és mtsai 1998). Ennek eredményeként a puroindolin-b különböző mutációit azonosították, melyek a búza endospermium szerkezetével szoros összefüggésben állnak. Giroux és Morris (1997) publikálták az első eredményeket a puroindolin-b gén mutációjáról, melyben egy glicin-szerin pontmutáció típusról számoltak be. Megállapították, hogy nem minden keményszemű fajta Old alsz


tartalmazta a mutációt, de minden fajta, mely tartalmazta azt, kemény volt (Giroux és Morris 1998). A keményszemű búzafajták, melyek nem tartalmaztak mutációt ezesetben nem termeltek puroindolin-a fehérjét sem. A puroindolin-a hiányát tehát szintén a kemény szemmel hozták összefüggésbe (Giroux és Morris 1998, Turnbull és mtsai 2000). Egyéb mutációkat is azonosítottak a puroindolin-b esetén. Lillemo és Morris (2000) leucin-prolin és triptofán-arginin mutációt azonosított a génben (2. táblázat). Az észak-európai régió búzafajtáira a leucin-prolin mutáció, míg a triptofán-arginin mutáció típus csak a svéd és holland őszi búzafajtákra jellemző. Az észak–amerikai tavaszi búzafajtákban a glicin-szerin mutáció, míg az őszi búzákban a puroindolin-a hiánya fordul elő leggyakrabban. Giroux és Morris (1997) szerint a puroindolin-a hiánya vagy a puroindolin-b mutációi megváltoztatják a puroindolinek lipidkötő képességét és ez hatással van a membránok száradására, és ezáltal a szem keménységére. Turnbull és mtsai (2000) találtak olyan búzafajtákat, amelyekben a glicin-szerin mutáció hiánya ellenére normál mennyiségű puroindolin-a termelődött. Ez azt jelenti, hogy a szekvenciában és a puroindolinok mennyiségében megjelenő fent említett különbségek hatására nem lesz szükségszerűen kemény a búzafajta. Feltehetőleg egy további faktor is szerepet játszik a kemény fenotípus kialakulásában. Transzformált rizs vizsgálatok során megfigyelték, hogy a puroindolin-a és b a szemkeménységet külön-külön is csökkentik. Együttes jelenlétük esetén szinergisztikus hatás figyelhető meg. További kísérletekkel azt is bebizonyították, hogy az 5D kromoszóma bevitele nagyobb mértékben változtatja meg a durum búza szemkeménységét, mint csupán a puroindolin gének beépítése (Krishnamurthy és mtsai 2001). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az 5D kromoszóma rövid karján más gének is jelen vannak, melyek fontosak a szemkeménység szabályozásában. 2. táblázat Azonosított puroindolin mutációk összefoglaló táblázata 1 2 3 4 5 6 7 8

3.2

PinA Pina-D1a Pina-D1b Pina-D1a Pina-D1a Pina-D1a Pina-D1a Pina-D1a Pina-D1a

PinB Pinb-D1a Pinb-D1a Pinb-D1b Pinb-D1c Pinb-D1d Pinb-D1e Pinb-D1f Pinb-D1g

Molekuláris változások ismeretlen Gly-46→Ser-46 Leu-60→Pro-60 Trp-44→Arg-44 Trp-39→stop codon Trp-44→stop codon Cys-56→stop codon

Fenotípus puha, vad-típus kemény, pina null kemény kemény kemény kemény, pinb null kemény, pinb null kemény, pinb null

Referencia Giroux és Morris 1997 Giroux és Morris 1998 Giroux és Morris 1997 Lillemo és Morris 2000 Lillemo és Morris 2000 Morris és mtsai. 2001 Morris és mtsai. 2001 Morris és mtsai. 2001

A keményítő szerepe és jelentősége a búzanemesítésben

A búzaminőség fő meghatározójának évtizedekig a sikérfehérjéket tartották, míg a keményítőt a búza endosperm semleges töltetének tekintették. A keményítő minőség meghatározó szerepe hosszú ideig ismeretlen volt. Ez a szemlélet megdőlt, amikor megjelentek az úgynevezett

Old alsz


„Japonese noodle”-ról szóló tanulmányok, melyek szerint a „noodle” minőség elsődleges meghatározója a keményítő (Oda és mtsai. 1980, Iriki és mtsai. 1987). Ezek az úgynevezett „waxy” vagy „részlegesen waxy” tulajdonsággal rendelkező búzafajták a nemesítési programok fontos részét képezik elsősorban az ázsiai országokban és Japánban. Az utóbbi években előtérbe kerültek az egészséges táplálkozás elérését szorgalmazó törekvések is. Ennek keretében a magas amilóz tartalmú búzafajták nemesítése lett a cél az úgynevezett ’rezisztens’, emésztésnek ellenálló keményítő mennyiségi arányának növelése érdekében. A keményítő a búzaszem szárazanyag tartalmának 65-70%-t alkotja, és ez egyben a búzaliszt fő alkotóeleme is. A búzakeményítő glükóz egységekből épül fel, melyek alapvetően α-1,4 kötésekkel kapcsolódnak össze és létrehozzák az amilóz lineáris láncát. Ugyanakkor α-1,6 kötésekkel láncelágazások jönnek létre és kialakul a nagy polimerizáltsági fokú erősen elágazó óriásmolekula, az amilopektin. Hexaploid búzában és durumban a két polimer közül az amilóz a keményítő 18-35%-t alkotja, az amilopektin ennek megfelelően 68-75%-t. Az úgynevezett waxy típusú búza amilózt gyakorlatilag nem tartalmaz (Nakamura és mtsai. 1995). A keményítő a búza endospermiumában szemcsék formájában raktározódik. Képződésének búzában két periódusa van. Az első periódus 3-7 nappal virágzás után indul, melynek során nagy méretű, úgynevezett A típusú szemcsék keletkeznek. A második periódus az endospermium fejlődésének középső szakaszában van, ekkor jelennek meg a kisebb méretű B típusú keményítő szemcsék (Briarty és mtsai 1979). Számos tanulmány vizsgálja egy harmadik típus, az úgynevezett C típus jelentőségét is (Bechtel 1990). Az A és a B típusú szemcsék szorosan kapcsolódnak egymáshoz a búza endospermiumában. Általánosságban a keményítő szemcsék gömb alakúak, 0.5-1 µm átmérővel, de sugárirányban 2-4 µm-esre is megnőhet az átmérőjük. Ennél pontosabb megközelítés az A és B típusú szemcséket külön kezeli. Az A típusú szemcsék kialakulása során a szemcse két oldalán kidudorodások jönnek létre a szemcse egymással szemközti oldalain, peremén pedig egy bemélyedés vagy rovátka látható. Növekedése során a szemcse átmérője először sugárirányban nő míg el nem érte maximumát, majd a két oldalon található kidudorodások irányában növekszik, amíg a végleges lencse alakú formát fel nem vette (Evers 1971). A B típusú szemcsék gömb alakúak maradnak, ekvatoriális irányú növekedést ebben az esetben nem figyeltek meg (Parker 1985). A keményítőszemcsék két további komponenst tartalmaznak. A szemcsék belsejében egyrészt megtalálhatók a keményítőszintézis enzimei (Denyer és mtsai 1995, Rahman és mtsai 1995), másrészt az amilózzal komplexet képző lipidek is (Morrison és Gadan 1987). A keményítő Old alsz


gélesedése során ezeknek a lipideknek fontos szerepük van a kölcsönhatások kialakításában. A száraz endospermiumban a keményítőszemcse típusok tulajdonságai és mennyiségi arányai, a keményítőtartalom, a keményítőszemcsék méreteloszlása és alakja, az amilopektin szerkezete, az amilóz/amilopektin aránya, valamint a szemkeménység, a lipidek jelenléte, sőt a keményítőmátrixot közrefogó más komponensek jellemző tulajdonságai mind-mind meghatározzák a keményítő funkcionális tulajdonságait. A szem keménysége például meghatározza a keményítőszemcsék és az endospermium törését az őrlés során, és ily módon befolyásolja a búzaliszt felhasználhatóságát. A keményítő bioszinézis folyamata gabonafélékben a glükóz-1-foszfát (G1P) prekurzor képződésével kezdődik. A szukrózból képződött G1P első lépésben ADP glükózzá (ADPG) alakul miközben ATP-ből ADP képződik ADPG(PP) pirofoszforiláz hatására. Az ADPG számos keményítő szintézisben résztvevő enzimnek szubsztrátja. Ezek az enzimek az amilóz és az amilopektin szintézisében oly módon vesznek részt, hogy az ADPG glükozil csoportjai a pre-keményítőmolekulák

nem-redukáló

végével

összekapcsolódnak.

A

kialakult

keményítőpolimeren ezután elágazások jönnek létre, az úgynevezett „branching” enzimek közreműködésével. Az amilopektin végső szerkezetének kialakításában az elágazásokat bontó úgynevezett „debranching” enzimek vesznek részt (James és mtsai 1995, Mouille és mtsai 1996, Nakamura és mtsai 1996a, Nakamura és mtsai 1996b). A keményítő szintáz enzimeknek gabonafélékben legalább négy csoportját különböztették meg. Ezek a keményítő felületéhez kötött keményítő szintáz (GBSS-granule bound starch synthase, Shure és mtsai 1983), valamint a keményítő szintáz SSI, SSII és SSIII enzimek (SS-starch shyntase, Knignt és mtsai 1998, Harn és mtsai 1998, Gao és mtsai 1998, Craig és mtsai 1998). A GBSS elsősorban az amilóz szintézisében játszik szerepet, míg az SSI, SSII és SSIII enzimek elsősorban az amilopektin szintéziséért felelősek. A gabonafélékben két „branching” enzimet azonosítottak (BEI és BEII, Flipse és mtsai 1996, Safford és mtsai 1998). Kukoricában a BEIInek két formája is van (a és b). A „debranching” enzimek (DBE) szerepe a keményítő szintézisében még nem tisztázott. Feltételezhetően az amilopektin elágazásainak számát csökkentik (1. ábra) (Ball és mtsai 1996, Nakamura és mtsai 1996c). 1. ábra

A keményítő bioszintézis folyamata

Old alsz


A búzakeményítő végső funkcióját a feldolgozóiparban tölti be. Az élelmiszeriparban a keményítőnek fontos szerepe van a kovászolt, lapos és egyéb kenyérféleségek valamint a keksz, a tészta, a sütemények, egyes helyi specialitások minőségének kialakításában. Az élelmiszeriparon kívül keményítőt használnak a papír és a textiliparban, ahol a keményítő szemcsemérete meghatározó faktor. Ezen felül szubsztrátként használják például a glükózszirup vagy különböző ragasztóanyagok gyártásánál. A búzakeményítő végső tulajdonságaihoz számos tényező járul hozzá. Alapvetően meghatározza a keményítő tulajdonságait a búza genotípusa, a környezeti hatások és a feldolgozási folyamatok - így az őrlés, főzés, hőkezelések valamint a tárolás ideje és hőmérsékelete. Hatásukra ugyanis változhat a szemcseméret, a keményítősérülés mértéke, a liszt vízfelvétele, a reológiai tulajdonságok, a keményítő gélesedése és duzzadása, a viszkozitás vagy a rezisztens keményítő mennyisége. A keményítő tulajdonságainak meghatározásában számos gén vesz részt. Enzimológiai tanulmányokban megállapították, hogy a keményítő mennyiségének kialakításában az ADPGPP az egyik meghatározó enzim (Neuhaus és mtsai 1990). Az ADPGPP egy teramer enzim, két nagy és két kisebb alegységből áll. Ezeket főként rizsben és kukoricában vizsgálták (Anderson és mtsai 1991, Hannah és mtsai 1998). Stark és mtsai (1992) bakteriális ADPGPP gént juttattak be burgonyába és azt tapasztalták, hogy hatására a burgonya keményítőtartalma nőtt. Az, hogy egy ilyen típusú módosítás hasonló eredményeket eredményezne gabonafélékben is, egyenlőre vitatott. Az ADPGG az amiloplasztban vagy a citoplazmában jelenik meg. Kukorica és árpa esetén bizonyított, hogy az ADPGPP a keményítőszintézis fő meghatározó enzime, búzában még nem bizonyított (Denyer és mtsai 1996, Thorbjornsen és

Old alsz


mtsai 1996). Az SS és BE enzimek aktivitása szintén növelik a keményítő mennyiségét az endospermiumban. A búzaszem keménysége, a keményítő minőségének egyik legfontosabb meghatározója, mivel meghatározza a keményítősérülés mértékét őrlés során. A búza keményítő és a fehérjemátrix között adhézió jön létre, mely puhaszemű búzákban kisebb, mint a keményszemű típusokban. Ebből következően őrlés során a kemény búzaszemek keményítősérülése nagyobb, mivel benne a keményítőszemcsék törnek. A sérült keményítőszemcsék több vizet kötnek meg, ily módon a keményszemű búzafajták kenyérkészítésre alkalmasabbak (lsd 3.1.2 fejezet). A keményítőszemcsék méretének és alakjának hatását a búza minőségére számos tanulmány vizsgálta. A tészta reológiai tulajdonságaira a keményítőszemcsék méreteloszlásának várhatóan nagy hatása van, hiszen a B típusú keményítőszemcsék, kis szemcseméretüknek köszönhetően nagyobb felületen tudják megkötni a fehérjéket, lipideket és a vizet. Larsson és Eliasson (1997) megállapították, hogy a kis méretű keményítőszemcsék a tészta nyújthatóságát növelik, míg a nagy méretű keményítőszemcsék a tészta nyújtással szembeni ellenállását fokozzák. Megállapították azt is, hogy tisztított B típusú keményítőszemcsét tartalmazó liszt keverési ideje hosszabb és vízfelvétele nagyobb, mint a csak tisztított A típusú keményítőszemcsét tartalmazó liszté. A keményítőszemcsék felületi tulajdonságainak szerepét a reológiai tulajdonságok meghatározásában Sebecic és mtsai (1995) vizsgálták. Hosszú ideje feltételezik, hogy a keményítő szintéziséhez szükség van egy iniciátor fehérjére. Az emlős állatoknál a glikogén bioszintézis iniciátora a glikogenin. Glikogeninhez hasonló szekvenciákat búzából is izoláltak már (Pater és mtsai 1997), ezek valószínüleg részt vesznek a keményítőszintézis iniciálásában. A keményítőszemcsék összetételét és alakját szabályozó faktorok még nem ismertek, de megfigyelték,

hogy

a

két

tulajdonság

együtt

változik.

A

nagy

amilóztartalmú

kukoricakeményítőben például a szemcsék alakja deformált, megnyúlt, míg normál amilóztartalom, normál gömbalakú szemcsével párosul. Ennek oka az lehet, hogy a nagy amilóztartalom megváltoztatja a szemcsék közötti kölcsönhatásokat. Búzában is találtak torzult keményítőszemcsét olyan búzafajtában, melyből hiányzott az SSII enzimmel kapcsolatban álló sgp-1 gén (Yamamori és mtsai 1998). Itt feltételezhetően az amilopektin szerkezetének megváltozása okozza a keményítőszemcsék alakjának megváltozását. A keményítő lipidtartalma csupán 1%, ennek ellenére mégis hatással vannak a keményítő viszkozitási tulajdonságaira és a minőségére (Morrison 1988). A keményítő egyik legfontosabb feldolgozóipari tulajdonsága, a víz és hő hatására bekövetkező gélesedése. A vízfelvétel után a kristályos régiók (amilopektin) teljesen Old alsz


felolvadnak, a keményítőszemcsék megduzzadnak, és a keményítő viszkozitása megnő. A gélesedés és a szemcsék duzzadásában az amilopektin szerkezetének jelentős szerepe van. Ezt bizonyították transzformációs kísérletekkel is (Ng és mtsai 1997, Edward és mtsai 1999, Lloyd és mtsai 1999). Röntgen diffrakciós vizsgálatokkal kimutatták, hogy waxy és normál amilóz tartalmú búzafajtákban A típusú szorosan rendeződött kristályok találhatók, míg a burgonyában B típusú, hüvelyesekben C típusú keményítő található leginkább. 2. ábra

A búza keményítőszemcsék különböző méret típusainak bemutatása

A röntgendiffrakciós képben látható különbség a lánchosszban megjelenő különbségekben és az amilopektin frakció elágazási pontjainak elrendeződésében keresendő (Lloyd és mtsai 1999). Morrison (1993) szerint a keményítő duzzadására a legnagyobb hatása az amilóznak van, azonban további tanulmányok kimutatták, hogy a duzzadási térfogat és a keményítő viszkozitása az amilóztartalom változtatása nélkül is módosul waxy búzák esetén (Crosbie és mtsai 1991, 1992, 1993, Zhao és mtsai 1998). A keményítő polimerek molekulatömege és elágazásainak mértéke hatással van a búzaliszt egyes reológiai tulajdonságaira, például a viszkozitásra (Munsted és Laun 1981, Fischer és mtsai 1997, McLeish és Larson 1998, Inkson és mtsai 1999). A molekulatömeg és az elágazások számának növekedése a maximális viszkozitást növelik. A keményítő viszkozitásának mérésére Rapid Visco Analyser (RVA) készüléket használnak. A készülék méri a keményítő ellenállását a nyíróerő hatásával szemben meghatározott hőmérsékeltprofil mellett (Walker és mtsai 1988). A hőmérsékletprofil általában egy felfűtési (50 °C / 95°C), tartási és egy hűtési (95°C / 50°C) szakaszból áll. A végső viszkozitás az amilóz/amilopektin kölcsönhatásának erősségét tükrözi a gélben. Gélesedés során nagyobb amilóz tartalmú búzakeményítő esetén erősebb gélt kapunk, waxy búza esetén azonban gél helyett sokszor

Old alsz


csak viszkózus folyadék keletkezik. Az amilóz és amilopektin hatása a viszkozitásra és a gél erősségére szinergisztikus (Jane és Chen 1992). Az elágazások nélküli amilóz polimer (0.28x105 Da) láncai összekapcsolódnak, duppla hélixes szerkezetet hoznak létre. Ennek következtében az amilóz hő hatására ki tud csapódni és opálos gél keletkezik (Gidley 1989, Leloup 1992, Hermansson és mtsai 1996). Az amilopektin (590x106 Da) nem hoz létre szoros kölcsönhatásokat, oldalláncaival összekapcsolódva egy hálózatot hoz létre, nehezen csapódik ki ezért egy áttetszőbb és hígabb gélt képez (Millard és mtsai 1999, Cameron és mtsai 1994). A amilopektin polimerben történő kis változások a fizikai tulajdonságok szignifikáns megváltozását eredményezik. A keményítőszintézis enzimeinek vizsgálatához, funkciójuk és hatásuk pontosabb megértéséhez különböző mutációkat hoztak létre a kutatók. A vizsgálatok alapján a BEI enzim 88 kDa molekulatömeggel rendelkezik és 14 exont tartalmaz. Hosszabb láncú molekulákra hat, mint a BEII, az endospermium kialakulásának későbbi szakaszaiban jelenik meg és a keményítőszemcséken belül nem található meg (Morell és mtsai 1997, Rahman és mtsai 1999, 1997, Gao és mtsai 1996). A BEII enzim az amilóz tartalmat befolyásolja, hiánya a keményítő szerkezetében okoz változásokat (Mizuno és mtsai 1993). Génje 2-es kromoszómán kódolt a búza esetén (Gale és mtsai 1997). Megfigyelték, hogy a BEIIb hiánya magas amilóztartalmú mutánsokat hoz létre kukoricában (Boyer és mtsai 1980) és rizsben (Bhattacharyya és mtsai 1990). A 75 kDa-os SSI a búza oldható frakciójában és a keményítőszemcsékben is megtalálható, 15 exont tartalmaz. Az enzim termelését szabályozó gén a 7-es kromoszómán található és ez a gén a struktúrgénnel azonos. A keményítő felületéhez kötött 100, 108 és 115 kDa-os fehérjéket Li és mtsai (1999) az SSII enzimként azonosították, Yamamori és mtsai (1998) pedig megállapították, hogy ezeknek a 7A, 7B és 7D kromoszómán kódolt izoformoknak a hiánya esetén rendellenes keményítő keletkezik, de az amilóz tartalom ugyanakkor nem változik jelentősen. Burgonyában az SSII és SSIII enzimek mennyiségének csökkenése a keményítő szerkezetbeli változását okozza, az amilopektin hosszú és rövid láncainak száma ugyanis nagy mértékben megnő (Edwar és mtsai 1999, Lloyd és mtsai 1999). A DBE enzim a glükóz polimerek elágazásait szünteti meg az α-1,6 kötések felbontásával. Az enzim hiányakor az egyszerű cukrok felhalmozódnak az endospermiumban, és erősen elágazó glükózpolimer, úgynevezett fitoglikogén keletkezik (Mouille és mtsai 1996, Ball és mtsai 1996). A 60 kDa-os GBSS vagy waxy fehérje az amilóz szintézisében játszik fontos szerepet és ezáltal legfontosabb meghatározója az amilóz/amilopektin arányának. A keményítőben az amilóz és amilopektin aránya meghatározza a keményítő fizikai-kémiai Old alsz


tulajdonságait és ezáltal a búza végfelhasználását is. Az amilóz szintézisében kulcsszerepet játszó keményítőszemcséhez kötött enzim a waxy gén terméke. A kenyérbúzában három waxy lókuszon kódolt (Wx-A1, Wx-D1, Wx-B1), melyek a 7A és a 7D kromoszóma rövid karján valamint a 4A (a 7B kromoszómáról transzlokációval helyeződött át) kromoszóma hosszú karján helyezkednek el (Yamamori és mtsai. 1994, Nakamura és mtsai. 1993a). Emellett az ADP-glülóz-glükoziltranszferáz és a BEII enzim is részt vesz az amilóz szintézisében. Az amilóz mennyisége és a waxy allélek jelenléte között korrelációt mutattak ki. A waxy mutánsok, amelyek nem expresszálják a GBSS fehérjét nem szintetizálnak amilózt sem. Amennyiben a keményítő amilózmentes, úgy a búzafajtát waxy típusúnak mondjuk, míg egy vagy két null-allél esetén és csökkent amilóz tartalom mellett „részlegesen waxy” genotípusról beszélünk (Yamamori és mtsai. 1994, Nakamura és mtsai. 1993b). A GBSS enzimnek számos különböző formája van hexaploid búzában a diploid vad fajok A, B, D genomján talált fehérjék génjeivel összhangban (Yan és mtsai 2000). A GBSS gén hatékony azonosítása fontos része a nemesítési programoknak mióta megtalálták az összefüggést a GBSS gén hiánya (4A kromoszóma, Wx-B1), a keményítő duzzadása és a noodle tészta minősége között (Zhao és mtsai 1998). A Rapid Visco Analyser (RVA) –rel mért paraméterek alkalmasak a normál és a waxy és részlegesen waxy genotípusok megkülönböztetésére, de a nem-waxy búzafajták között mérhető különbségek általában kicsik (Boggini és mtsai. 2001). A módszer megfelel a waxy genotípusok azonosítására, azonban ennél egyszerűbb és megbízhatóbb lehetőséget nyújt a DNS alapú szelekció. A GBSS-t kódoló szekvenciák ismerete lehetővé tette a lókuszok azonosítására alkalmas tesztek kifejlesztését (Zhao és mtsai. 1998). A PCR technikán alapuló módszer mindhárom lókusz azonosítására alkalmas, mivel a primerek három eltérő méretű fragmentet adnak. A PCR termékek gélelektroforézises elválasztásával kimutatható a gének esetleges deléciója. 3.3 A

Két biotechnológiai módszer jelentősége és alkalmazása a búzanemesítésben búza

termésmennyiségének

és

minőségének

javításában

a

hagyományos

növénynemesítésnek még mindig meghatározó szerepe van, azonban az elmúlt évtizedben a növényi biotechnológiában bekövetkezett módszertani fejlődés eredményeként lehetővé vált gyökeresen új növénynemesítési programok tervezése és elindítása. Az új technológiák, melyek az agronómiailag fontos gének azonosításán és azok kifejeződésének módosításán alapulnak, egyre jelentősebb szerepet kapnak a növénynemesítésben. A biotechnológia alapvetően két új lehetőséget kínál a búza egyes tulajdonságainak javítására. Egyik a molekuláris markerek fejlesztésén és alkalmazásán alapul, míg a másik lehetőség a Old alsz


géntechnológiai módszerek alkalmazása. A biotechnológiai úton történő nemesítés célja általában a növény ellenálló képességének növelése a különböző abiotikus és biotikus stresszekkel szemben valamint a búzaszem minőségi tulajdonságainak javítása, különös tekintettel a fehérje és a keményítő összetételre. 3.3.1 Molekuláris markertechnológia A molekuláris marker technológia számos új lehetőséget kínál a szelekciós módszerek hatékonyságának növelésére. Ezek a technológiák a szekvenciák szintjén jelentkező genetikai változatosság felismerésén alapulnak. Amennyiben az eltérést mutató szekvencia egy fontos tulajdonságot meghatározó gén közelében helyezkedik el, úgy a gén felhasználható a keresett tulajdonságot hordozó gén jelenlétének vagy hiányának kimutatására. Ennek a becslésnek a megbízhatósága függ a két gén genetikai kapcsoltságától. A molekuláris markerek egy gén jelenlétének

megállapításán

kívül

alkalmasak,

specifikus

tulajdonságok

genetikai

szabályozásának vizsgálatára, a növények szelekciójára és a növény genetikai térképezésére is. A molekuláris markerekkel segített nemesítés és szelekció komplexitásához három fő tényező járul hozzá. A búza nemesítése során a sok specifikus végfelhasználási cél és a specifikus minőségi követelmények egy olyan kényszerpályára terelik a nemesítést, melynek következtében a diverzitás csökken. Ez a tény bonyolítja a molekuláris markerek kifejlesztését és alkalmazását. A búza genetikai diverzitása vagy változatossága összességében a nemesítés során az elmúlt néhány évtizedben nőtt. Nem így volt ez a háború előtti időszakban, amikor sokszor ugyanaz a tájfajta foglalta el a vetésterület több, mint 50%-át. A különböző tájfajtáknak pedig maximum két-három őse volt csupán szemben a mai fajtákkal melyeknek akár több, mint 100 őse is lehet. Amennyiben meghatározott felhasználási célnak megfelelő búzafajtát nemesítünk, a célbavett minőségi tulajdonságot illetve az azt meghatározó gént tekintve a diverzitás valóban csökkeni fog, azonban emellett megőrizhetjük a genom többi részének diverzitását. A másik problémát a búza (T. aestivum) genomjának nagy mérete (16x109 bp) okozza, melynek következtében számos technika (pl. Southern hibridizáció) alkalmazása nehézkessé válik. A búza három genommal (A, B, D) rendelkezik, melynek következtében előfordul, hogy a markerek (pl. RFLP) külön-külön mintázatot adnak minden genomra. Általában azonban csak egy genom ad polimorfizmust egy adott reakcióban. A harmadik problémát a búza genomjának kis mértékű polimorfizmusa adja, következtében ugyanis nagyobb számú markerre van szükség mint rizs vagy árpa esetén (Chao és mtsai 1989, Lui és mtsai 1990). A polimorfizmus mértéke a különböző genomokban eltérő. A különböző fajták D genomja Old alsz


között például olyan kicsi a különbség, hogy ezt a genomot sokkal nehezebb térképezni, mint a többit. A mikroszatellit markereket speciálisan az egyes genomokra tervezték (D genom, Pestova és mtsai 2000). Bár a búzát nehéz térképezni, hexaploid volta mégis ad néhány előnyt a többi fajhoz képest, genomjának allohexaploid tulajdonsága következtében például nagyon jól tolerálja az egyes kromoszómák hiányát (Endo és Gill 1996). Számos publikáció született már a búza kapcsoltsági térképéről (Röder és mtsai 1998a,b, Dubkovsky és mtsai 1996, Pestova és mtsai 2000, Peng és mtsai 2000, Nelson és mtsai 1995). Ezek közül a Syntetic x Opata keresztezés vagy más néven ITMI térképező populáció genetikai térképe ma a nemzetközileg elfogadott referencia (Pestsova 2000), mely főként RFLP és SSR markerekkel készült. Az

egyedek

DNS

szekvenciáinak

variabilitás

vizsgálatára

számos

technika

áll

rendelkezésünkre. Ezek a módszerek alapvetően három csoportba sorolhatóak: Southern hibridizáción alapuló technikák (RFLP), PCR alapú technikák (RAPD, AFLP, SSR) és az egyetlen nukleotidváltozásra létrejött polimorfizmuson alapuló technikák (SNP) csoportjába. Búza esetén kezdetben leggyakrabban, RFLP, RAPD majd később SSR és AFLP módszereket kezdtek használni. Ezek közül a polimorfizmus megállapítására az RFLP és az SSR markerek a leghatékonyabbak (Parker és mtsai 2002, Paull és mtsai 1998), azonban ez utóbbit használják inkább, mivel a RAPD reakcióhoz jóval nagyobb mennyiségű DNS-re (5 µg) van szükség és a detektálás is nehézkesebb. Az RFLP módszer hátrányos tulajdonságai következtében egyre kevésbé használatos, helyette a PCR alapú technikák terjednek el. Az SSR markerek 1-6 nukleotid rövid ismétlődő egységeiből állnak. Magasabbrendű szervezetekben mindenütt jelen vannak, de típusuk és gyakoriságuk a fajok között változó. Nagy számban és elosztva helyezkednek el a genomban és az összes többi marker között a legnagyobb mértékű polimorfizmust adják. Az SSR reakciók előnye, hogy kis mennyiségű DNS-t igényelnek, és nagy mértékű polimorfizmust adnak. A módszer automatizálható, ismételhetősége jó, a polimorfizmus detektálása egyszerű. A leggyakrabban használt SSR markerek az (AC)n és (AG)n ismétlődéseket tartalmazzák. A polimorfizmust az allélek közötti méretbeli különbségek adják, ez pedig az ismétlések számbeli eltérésének köszönhető. Az SSR markerek helyét a genetikai térképen a legtöbb gabonafélében megállapították már (Liu és mtsai 1996, Korzun és mtsai 1997, Stephenson és mtsai 1998), és a polimorfizmus mértékéről is számos tanulmányban beszámoltak (Röder és mtsai 1995, Plaschke és mtsai 1995, Bryan és mtsai 1997, Bohn és mtsai 1999, Parker és mtsai 2001). Megállapították, hogy a polimorfizmus detektálása sok faj közül a búzában a legnehezebb (Röder és mtsai 1998a, Old alsz


Stephenson és mtsai 1998, Pestsova és mtsai 2000). Ugyanazon SSR markerek használata különböző fajokban megnöveli a marker értékét és csökkenti a költségeket, a búza mikroszatellitek azonban általában nem használhatók pl. árpában is (Röder és mtsai 1995) hozzá külön SSR primerkészlet létrehozása szükséges. Abban az esetben, ha sok gén szekvenciája ismert, a szekvencia adatbázis alapján lehetőség nyílik új markerek tervezésére (Powell és mtsai 1996), sőt a genetikai térképek elkészítése után még könnyebbé válik az új markerek fejlesztése. Az ESTs (Expressed Sequence Tags), cDNS és genomiális szekvenciák elérhetősége is potenciális forrásai új SSR markerek kifejlesztésének. Az SSR markerek alkalmasak egy genetikai térkép vázának elkészítéséhez, a közöttük levő régiók részletes térképezésére azonban más markerek használata pl. AFLP ajánlott. Az AFLP technikát géntérképek készítésére és a gének kapcsoltságának megállapítására használják. A polimorfizmus szintje AFLP markerekkel búzában 12.8% (Chalmers és mtsai 2001). A polimorfizmust a pontmutációk, inszerciók vagy deléciók adják. Az AFLP markereket különböző restrikciós enzimkombinációk felhasználásával állították elő. Gyakoriságuk és eloszlásuk a búza különböző genomjaiban eltérő (Marino és mtsai 1996, Röder és mtsai 1998b). Mivel az AFLP markerek által térképezett régiók az RFLP markerekkel lefedett régión kívül esnek, lehetővé válik a genom nagyobb lefedése. Gabonafélékben hat bázispárt felismerő és hasító enzimet használnak, példul EcoRI és a PstIet, melyeket az MseI enzimmel kombinálják. Szelektív PCR-el amplifikálnak 100-150 terméket, olyan primerekkel, melyek +2 és +3 bázist tartalmaznak. A választott enzimkombináció befolyásolja a polimorfizmus mértékét. A PstI/MseI enzimkombináció használatakor nagyobb mértékű polimorfizmust kapunk, mint EcoRI/MseI enzimkombináció esetén. A termékek detektálásához, fluorescenszen vagy [33P]-jelölt primerek használata szükséges, vagy ezüstfestéssel tehetjük láthatóvá a termékeket. Az STS markerek (Sequence Tagged Sites) számos előnnyel rendelkeznek a hagyományos RFLP markerekhez képest. A módszer relatíve egyszerűbb, nagyobb a hatékonysága és kevesebb DNS-t igényel (Erpelding és mtsai 1996). Ismert szekvenciájú DNS szakasz másolására és felszaporítására alkalmas. Ezeknek a markereknek a tervezése különösen fontos, amikor agronómiailag jelentős tulajdonságokat kódoló génekben találunk variabilitást. Az STS markerek az SSR-al ellentétben más fajokban is használhatók. Az STS primereknek különböző fajtái vannak. Megkülönböztetünk SSR, gén-specifikus és SNP (single nucleotide polimorphisms) markereket. A gén specifikus markereket, mint arra nevük is utal, ismert génszekvenciákban megjelenő polimorfizmus kimutatására tervezik. A polimorfizmust vagy a PCR reakció termékeinek méretbeli különbsége adja, vagy a PCR termékének emésztésével Old alsz


kapjuk restrikciós endonukleázokkal. A genom kódoló részeinél nagyobb polimorfizmust adnak az intronok vagy a szekvenciák 5’ és 3’ végeinek azon részei, melyek nem íródnak át. Széleskörben használt génspecifikus marker például a GBSS (granule bound starch synthase) gén markere. Az SNP marker technika magába foglalja bázispár változások azonosítását és PCR alapú módszerek kidolgozását a polimorfizmus azonosítására. A markereknek ezt a típusát egyre inkább használják a növényi genomikában. Az SNP markereket ’in silico’ tervezik, olyan esetekben, amikor ugyanazon gén különböző fajtákból izolált, különböző alléljeinek szekvenciái rendelkezésre állnak. Az SNP-k detektálására számos módszert alkalmaznak. Taqman próbát (Morin és mtsai 1999), fluorescenszen jelölt ddNTP-t, restrikciós enzim polimorfizmust (Neff és mtsai 1998), MALDI-TOF tömegspektroszkópiát (Griffin és Smith 2000), microarray hibridizációt (Hirschhorn és mtsai 2000), DHPLC-t (Gross és mtsai 1999) és SNAP technikát (Drenkard és mtsai 2000). Számos gazdaságilag fontos tulajdonság génjéhez kapcsolt molekuláris markert azonosítottak már világszerte. Ezeknek a tulajdonságoknak és a kapcsolt markereknek a listája megtalálható McIntosh (1998) génkatalógusában. CAPS, SCAR és STS markereket fejlesztettek ki RFLP és RAPD markerekből, hogy alkalmassabbá tegyék őket a szelekcióra. Ezeknek a markereknek egy része betegségellenállóság lokuszaival kapcsolt más részük a búza minőségi tulajdonságaival hozhatók összefüggésbe (Helguera és mtsai 2000, Liu és mtsai 1999, Seyfarth és mtsai 1999, Vágújfalvi és mtsai 2000, Ahmad 2000, Parker és Langridge 2000). Marker fejlesztése általában olyan tulajdonságokra történik, amelyeket egy vagy csak néhány gén szabályoz és amelyet igen-nem alapon lehet jellemezni (pl. ellenálló vagy nem). Azok a tulajdonságok, amelyek két határérték között egyenletesen elosztva vesznek fel értékeket mennyiségi tulajdonságoknak nevezzük. Ez az eloszlás köszönhető egyrészt annak, hogy az adott tulajdonságot több gén együttes hatása alakítja ki, másrészt a környezet is befolyásolja értékét. A mennyiségi tulajdonságokat szabályozó gének lokuszaival kapcsolt markerek azonosítása (QTL) komplex feladat. A QTL térképezés komplett kapcsoltsági térképek elkészítéséhez kötött. Amennyiben a mennyiségi tulajdonságot a környezet befolyásolja, úgy több termőhely adatainak figyelembevétele szükséges. A QTL analízishez szükséges statisztikai módszereket Liu és mtsai (1998) valamint Eckermann és mtsai (2001) mutatják be. A QTL analízisnek alávetett tulajdonságok, olyan mennyiségi tulajdonságok, amelyekre a hagyományos növénynemesítéssel nehéz lenne szelektálni, a búza agronómiai és minőségi tulajdonságainak javítása szempontjából azonban fontosak. Ilyen tulajdonságok az abiotikus stressztényezőkkel szembeni ellenálló képesség és számos a feldolgozóipar szempontjából

Old alsz


fontos tulajdonság. A QTL elemzés előnye, hogy lehetővé teszi a tulajdonság genetikai komponenseinek szétválasztását (Jefferies és mtsai 2000). A búza nemesítése során különböző vizsgálatokat végzünk a minőségi tulajdonságok megállapítására. A nemesítés korai szakasziban azonban sokszor olyan kis mennyiségű anyag áll rendelkezésünkre, amely nem teszi lehetővé a minőségi vizsgálatok elvégzését és így a minőségi szelekció sem oldható meg. Ezen kívül problémát jelent, hogy a szárazság, a fagykárok vagy az aratás előtti eső nagy mértékben torzítják a minőségi vizsgálatok eredményeit. Az is problémát jelent, hogy számos minőségi tulajdonság örökölhetősége kis mértékű. Ezen okokból következően nem meglepő, hogy a tulajdonságokkal kapcsolt markerek használata napjainkban egyre inkább elterjed. A tészta reológiai tulajdonságait alapvetően a tartalékfehérje összetétel határozza meg. Számos tanulmányból ismerjük a búzafajták gliadin, HMW- és LMW-glutenin összetételét és ezek összefüggéseit különböző reológiai tulajdonságokkal. Ez alapján a fehérjeallél összetétel ismeretében meg tudjuk becsülni a liszt sütőipari tulajdonságait is (Payne és mtsai 1979, Hamer és mtsai 1992). A tartalékfehérjéket kódoló gének nagy részét már klónozták és megszekvenálták. A szekvenciák felhasználásával DNS alapú markereket terveztek az allélek azonosítására (D’Ovidio és Anderson 1994, Ahmad 2000). A DNS alapú markerek így kiváltják az SDSPAGE fehérjealapú elválasztást. A búzaszem fehérjetartalma kereskedelmi szempontból fontos tulajdonsága. Prasad és mtsai (1999) megállapították, hogy egy a 2DL kromoszómán található QTL szabályozza a fehérjetartalmat és ezt használják fel SSR markerként. Egy további markert is azonosítottak, melynek a 6BS kromoszómán található a lokusza. Hatására a fehérjetartalom a termésmennyiség csökkenése nélkül nő (Joppa és mtsai 197, Mesfin és mtsai 2000, Khan és mtsai 2000). A búza szemkeménysége szintén minőség meghatározó tulajdonság. A keménységet kódoló Ha lokusz az 5DS kromoszómán található. Megállapították, hogy a Ha lokusz által kódolt puroindolin gének mutációi összefüggésben vannak a szemkeménységgel (Lillemo és Morris 2000). Ezt a genetikai különbséget használják ki PCR alapú tesztek kifejlesztésére. A markerek, a szemkeménység és a minőség összefüggéseit még ma is széleskörűen tanulmányozzák (Martin és mtsai 2000, Turnbull és mtsai 2000). QTL analízis alapján további szemkeménységgel kapcsolt markereket találtak (Campbell és mtsai 1999, Perretant és mtsai 2000). Campbell és mtsai (1999) a szem morfológiai tulajdonságait szabályozó markert azonosítottak, míg a lisztkihozatallal összefüggésben három markert is találtak (Parker és mtsai 1999). A szemszín fontos kritérium tésztaféleségek gyártásánál. A sárga szinű lisztet a tészták, míg a fehér szinű lisztet a kenyér készítésénél kedvelik. Parker és Landridge (2000) a 7A kromoszómán található lokusz AFLP

Old alsz


markeréből fejlesztettek STS markert a szemszínnel összefüggésben. A minőségi tulajdonságok közül a keményítő tulajdonságával összefüggésben azonosítottak a 4A, 7A és 7D kromoszómákon egy-egy allélt (Zhao és mtsai 1998, Shariflou és Sharp 1999). A null allélal rendelkező waxy fajták felismerése amilózmentes vagy csökkent amilóz tartalmú búza nemesítésére ad lehetőséget. A molekuláris markerek fejlesztésére két módszer létezik. Egyik a teljes genetikai térkép elkészítésén, a másik a DNS-keverékek szegregálásának analízisén (BSA) alapul. BSA-val a markerek fejlesztésének költsége kisebb, használata azonban korlátozott, mivel csak egy vagy két gén által meghatározzott tulajdonságokra alkalmazható. A marker fejlesztésének első lépése a vizsgált tulajdonság genetikai hátterének vizsgálata. Második lépésben kiválasztják a szülőket a keresztezéshez, majd a keresztezés során létrehozzák az utódpopulációt, melynek magját felszaporítják. Ezután vagy elkezdik a térképezést vagy megvizsgálják az egyedek fenotípusos tulajdonságait és a keresett tulajdonságra azonos egyedekből DNS-keveréket hoznak létre. A térkép készítését fenotípusos jellemzés, majd QTL elemzés követi, míg a DNS-keverékek vizsgálatával markereket azonosítanak. A molekuláris markereket a búzanemesítésben használják a genetikai diverzitás vizsgálatára. Ennek jelentősége abban rejlik, hogy az agronómiailag fontos fenotípusos vagy mennyiségi tulajdonságok alapján megkülönböztetett búzafajták különbözőségét genetikailag is igazolják. Az igy kapott eredmények alapján választják ki a keresztezési partnereket. A szülői tulajdonságok ismeretében az utódnemzedék összetétele is megbecsülhető (Smith és mtsai 1984, Grafius és mtsai 1956). A genetikai hasonlóság direkt módon meghatározható a biokémiai és molekuláris markerekkel (Smith és mtsai 1991). Előnyük, hogy a genetikai variabilitás számszerűsíthető jellemzését teszik lehetővé. Bár a markerek hasznos eszközei a genetikai diverzitás vizsgálatának és segítenek megérteni, hogy a különböző tulajdonságok milyen genetikai szabályozás alatt állnak, fő szerepüket a nemesítésben a szelekció során töltik be. Hatékony használatukhoz megfelelő technikai felszereltséggel kell rendelkezni, és nem utolsó szempont a könnyen használható, hatékony és relatíve olcsó markerek kiválasztása sem. A markerszelekció a jövőben nagyon fontos lesz a transzgénikus növények azonosításában, szelekciójában is (Landridge és mtsai 2001). 3.3.2 Géntechnológiai módszerek Old alsz


Napjainkban a versenyképes búzafajták előállítása egyre inkább igényli a klasszikus nemesítési és modern biotechnológiai módszerek kombinációját (Bedő és mtsai. 1998, McIntosh 1998). A növényi biotechnológia fejlődésével lehetővé vált olyan gének bevitele is a genetikai állományba, melyek búzával nem keresztezhető szervezetekből származnak. A géntechnológiával segített nemesítés célul tűzte ki többek között, hogy megváltoztassa a búza táplálkozástani és feldolgozás-technológiai minőségét, csökkentse a gyomok és kártevők következtében fellépő termésveszteséget, növelje a környezeti hatásokkal szembeni ellenállóképességet (Lazzeri és mtsai. 1997, Vasil 1998, Pellegrineschi és mtsai. 2000). Az első sikeres búza transzformációs eredményeket Vasil és mtsai. (1992) publikálták. Azóta több csoport számolt be újabb és újabb transzgénikus genotípus előállításáról. A sütőipari minőség javítására HMW glutenin alegység fehérjéket kódoló génekkel transzformáltak búzát Barro és mtsai. (1997), Blechl és mtsai. (1998), He és mtsai. (1999) és Rooke és mtsai (1999). A búzakeményítőben az amilóz/amilopektin arányt Baga és mtsai. (1999b) változtatta meg géntechnológiai módszerrel. Különböző génekkel sikerült növelni a rezisztenciát gombák (Pellegrineschi és mtsai. 2000), rovarok (Alpeter és mtsai 1999, Stoger és mtsai 1999) és vírusok (Karunarate és mtsai 1996) ellen, illetve gyomirtó szerekkel szemben (DeBlock és mtsai 1997). A jelenlegi módszereknél a transzformáció stabilitása erősen függ a módosítandó genotípustól, a növény szövettenyésztésbe vont részétől és a szövettenyésztés körülményeitől (Potrykus 1991). A búza transzformáció hatékonysága az irodalmi adatok szerint általában kisebb, mint 1 százalék (Alpeter és mtsai 1996b), bár néhány genotípussal 4-17 százalékot is elértek (Xia és mtsai 1999, Rasco-Gaunt és mtsai 2001). A sikeres, bizonyított transzformációknál sokszor komoly probléma a transzgén instabilitása (Cannell és mtsai 1998, Barro és mtsai 1998) és a részleges génexpresszió (Blechl és mtsai 1998, Alvarez és mtsai 2000). A búza transzformálására a génágyús (biolisztikus) módszer napjainkban a legelterjedtebb. Vasil és mtsai (1992) első sikeres kísérlete óta számos laboratórium kísérletezik különböző eredetű búzakallusz belövésével (Weeks és mtsai 1993, Becker és mtsai 1994, Nehra és mtsai 1994, Alpeter és mtsai 1996a, Srivastava és mtsai 1996). A biolisztikus módszeren kívül más eljárásokkal is lehet gabonaféléket transzformálni. Cheng és mtsai (1997) számoltak be először Agrobacterium tumefaciens közvetítette stabil génátvitelről búzába. A közlemény ellenére ez a módszer nem terjedt el, bár több laboratóriumban is próbáltak megbízható eljárást kifejleszteni, de többnyire csak átmeneti génexpressziót mutattak ki, illetve a transzgénikus kalluszból nem tudtak növényt regenerálni. Az Agrobacterium közvetítette búza transzformációt befolyásoló paramétereket Amoah és mtsai (2001) vizsgálták részletesen tranziens expresszióban. Weir és mtsai (2001) négy független Old alsz


transzgénikus

búza

növényt

kaptak

szkutellumból

Agrobacterium

közvetítette

transzformálással. Hátrányainak kiküszöbölésével az egyik leghatékonyabb módszerré válhat a búza transzformálásában. Közvetlen géntranszferről számolt be He és Lazerri (1998), akik az elektroporáció körülményeit optimalizálták búzára. Serik és mtsai (1996) szilicium-karbid tűkkel transzformáltak érett búzaembriót. Pollentömlő eljárással is próbáltak már idegen gént bejuttatni búzába ennek eredményeiről Chong és mtsai. számoltak be 1998-ban. A géntranszformációhoz jól működő ’in vitro’ növényi rendszer szükséges. A regenerálódó képesség, és így a transzformáció hatékonysága is nagymértékben függ a genotípustól, a kalluszképzésre

felhasznált

növényi résztől

és

a

szövettenyésztés

körülményeitől.

Regenerálható búza szövetkultúra többféle növényi rész felhasználásával is létrehozható, legyen az ivarsejt, szomatikus sejt, növényi szövet vagy szerv. Ilyen növényi rész a teljes szem, érett és éretlen embrió, izolált szkutellum, éretlen virágzat (Rasco-Gaunt és Barcelo 1999), éretlen levél, mezokotil, hajtáscsúcs merisztéma (Zhang és mtsai 1999), koleoptilcsomó és gyökér. Jelenleg éretlen embrióból kiindulva érik el a legjobb eredményeket. Számos tanulmány foglalkozik az in vitro szövettenyésztés körülményei közül a kallusz- és embrióindukcióra, valamint a növény regenerációra használt táptalajok összetételével (Perl et al 1992, Rasco-Gaunt et al 1999a, Zhang és mtsai 1999, Murashige és Skoog 1962, Karsai és mtsai 1993, 1994a, 1994b, Puolimatka és Pauk 1999, 2000, Barnabás ás mtsai. 2000, 2001), így a megfelelő citokin/auxin hormon arány (Barro és mtsai 1998), a különböző cukor illetve cukoralkohol koncentráció (Chen és mtsai 1998a), a különböző fémion kiegészítők (pl. ezüst) (Cho és mtsai 1999, Zhang és mtsai 1999), szénforrások (Zhang és mtsai 1999), a szövettenyésztés időtartamának (Takumi és Shimada 1996), a hőmérsékletnek és a fényintenzitásnak regenerációs képességet befolyásoló hatásával. (Tamás és mtsai 2000, Rasco-Gaunt és mtsai 1999a). A génbevitel után a transzformált sejteket nem transzformált sejtek veszik körül. A transzformáció döntő lépése azon sejtek szelektálása és felszaporítása, melyekben a transzgén nemcsak integrálódott a nukleáris genomba, de expresszálódik is. Az ilyen sejtek azonosítása markergénekkel lehetséges. Ezek legtöbbször rezisztenciagének, melyek ellenállóvá teszik a növényt antibiotikumokkal vagy herbicidekkel szemben. Ezen toxinok a vadtípusú sejtek növekedését gátolják, vagy elpusztítják azokat, míg a transzgénikus sejtek életképessége megmarad. A rezisztencia szelekciós markergének egyik csoportja az aminoglikozid alapú antibiotikumokkal szemben biztosít rezisztenciát (Jelenska és mtsai 2000), míg a legtöbbször Old alsz


használt herbicid rezisztencia gén a bar (Basta/bialaphos resistance) gén (Barro és mtsai 1998, Iser és mtsai 1999, Kohli és mtsai 1999, Pauk és mtsai 1998, Rasco-Gaunt és mtsai 1999b). Széles körben elterjedtek ezek a szelekciós markergének, bár negatív mellékhatásaik lehetnek (Bregitzer és mtsai 1998). Az antibiotikum és a herbicid rezisztencia markergének mellett megjelentek az úgynevezett funkcionális szelekciós gének, melyek ártalmatlanok mind a fogyasztókra, mind a környezetre. A pozitív funkcionális szelekció (Haldrup és mtsai 1998) olyan stratégia, amely a transzgénikus sejteknek metabolikus előnyt ad a nem transzformált sejtekkel szemben. A búza transzformációnál is használt egyik pozitív szelekciós rendszerben az E. coli baktériumból származó foszfomannóz izomeráz (pmi) gén a markergén (Wright és mtsai 2001), mely átalakítja a növények számára nem hasznosítható mannóz-6-foszfátot a metabolizálható fruktóz-6-foszfáttá. Mivel a szelekciós marker szekvenciák jelenléte gyakran nem kívánatos a transzgénikus növényekben, napjainkban a figyelem azon technikák fejlesztésére irányul, melyekkel a szelekciós markergének eltávolíthatók a transzgénikus növényekből. Ez elérhető normál szegregációval (Komari és mtsai 1996), de sokkal ígéretesebb a homológ rekombináció közvetítette gén kiütés (gene knockout) módszere. Ez utóbbi megvalósítására dolgozták ki a MAT (multi-auto-transformation) vektor rendszert (Ebinuma és mtsai. 1997, Sugita és mtsai. 1999). A látható markergének, vizuálisan detektálható enzimaktivitással rendelkező fehérjéket, vagy színes pigmentet, illetve fluoreszcens fehérjét kódoló gének, melyek az átmeneti génexpresszió tanulmányozására alkalmasak. Ebbe a marker csoportba tartoznak a glükuronidáz (uidA/GUS) (Jefferson 1987), a CAT (Chibbar és mtsai 1991), a luciferáz (Baruah-Wolff és mtsai 1999) enzimeket kódoló gének, az antocián akkumuláció (Chawla és mtsai 1999), a medúzaeredetű GFP (green fluorescent protein, Vain és mtsai 1998, Tamás és mtsai 1999, Stewart 2001) vagy a korallból származó vörösen fluoreszkáló fehérje génje (pDsRed, Clontech, Jach és mtsai 2001). Az eukarióta sejtekből származó promóterek teszik lehetővé a többnyire bakteriális eredetű markergének és a különböző élőlényekből származó hasznos gének átíródását a transzgénikus növényben. A különböző promótereken keresztül térben és időben is szabályozható a transzgének megnyilvánulása. A konstitutív promóterek akkor használhatók, ha a növény minden szövetében, illetve valamennyi fejlődési állapotában magas szintű génexpresszió elérése a cél. A leggyakrabban használt konstitutív promóterek a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S rRNS promótere (CaMV 35S) (Odell és mtsai 1985), a rizs Act1 promótere (Barro és mtsai 1998, Mc Elroy és mtsai 1991) vagy a kukorica ubiquitin (Ubi1) promótere (Barro és mtsai 1998, Christensen és mtsai 1992, Stoger és mtsai 1999). A szövetspecifikus promóterek Old alsz


a transzgén kifejeződését csak specifikus szövetekben, illetve meghatározott fejlettségi állapotban engedélyezik. Endospermium-specifikus expressziót eredményeznek például a HMW glutenin alegységgének (1Ax1, 1Dx5) promóterei (Alpeter és mtsai 1996a, Barro és mtsai 1997, He és mtsai 1999) vagy a GBSS (granule-bound starch synthase) promóterek (Russell és mtsai 1997). Az indukciós promóterek speciális külső változás hatására indítják el a génexpressziót. Így léteznek patogének által, sérüléssel (Kyozuka és mtsai 1991, Lyznik és mtsai 1995, Molina és mtsai 1996, Vasil és mtsai 1992, Leckband és Loerz 1998), valamint kémiailag indukált (Greenland és mtsai 1997, Caddick és mtsai 1998). promóterek. Ezek a promóterek szabályozzák a növényben azoknak a fehérjéknek a génjeit, melyek részt vesznek a stressz káros hatását csökkentő élettani folyamatokban. A génbeviteli módszerek közvetlen és közvetett eljárásokra csoportosíthatók. A közvetett génátvitelnél az idegen DNS bejuttatása közvetítő organizmussal (pl. Agrobacterium sp.) érhető

el.

A

talajlakó

Agrobacterium

tumefaciens

és

A.

rhizogenes

prokarióta

mikroorganizmusok képesek genetikailag transzformálni növényi sejteket. Az A. tumefaciens tumor-indukáló plazmidjának (Ti plazmid), illetve az A. rhizogenes gyökér-indukáló plazmidjának (Ri plazmid) egy darabja (transzfer DNS, vagy T-DNS) be tud épülni a növény genetikai állományába. Más transzformációs módszerrel összevetve az Agrobacterium közvetítette génbevitel előnye az egyszerűség, hatékonyság és gazdaságosság. Az eljárással nagy méretű, meghatározott végű DNS fragmentumokat lehet kis kópiaszámban a növény kromoszómájába integrálni. Az így transzformált egy- és kétszikű növények általában jó termőképességgel rendelkeznek (Tingay és mtsai 1997, Cheng és mtsai 1997). Az Agrobacterium fajok ígéretes génközvetítőnek számítanak, de további módszerfejlesztésre van szükség, hogy búzánál is elterjedten használják őket. Rizsnél és kukoricánál a transzformáció hatékonysága 5-25% (Cheng és mtsai 1998, Toki 1997), míg árpánál és búzánál 2-6% (Tingay és mtsai 1997, Xia és mtsai 1999) volt ezzel a módszerrel. Jelenleg az Agrobacterium közvetítette búza transzformáció hatékony alkalmazása (>1%) csak néhány kivételesen jól regenerálódó genotípusra korlátozódik. Modell genotípus például a Bob White, melyet az Agrobacterium a búzafajták közül talán a legnagyobb mértékben képes fertőzni. A sikeresen transzformált gabonafélék célszövete legtöbbször az éretlen embrió szkutelluma (Cheng és mtsai 1997, Tingay és mtsai 1997), illetve a belőle származó kallusz volt (Hiei és mtsai 1994). A biolisztikus transzformációt, mely jelenleg is a legelterjedtebb közvetlen génbeviteli módszer, Sanford (1988) fejlesztette ki. A módszer alapja, hogy nagynyomású gáz (eredetileg puskaporrobbanás) juttatja a mikrohordozókra felvitt DNS-t az intakt sejtekbe, Old alsz


szövetekbe, illetve szervekbe. Különösen előnyös ez a módszer olyankor, amikor biológiai gátak akadályozzák más hatékony módszerek, mint például az Agrobacterium közvetítette Ti plazmid, vagy a protoplaszt transzformáció használatát. Jó lehetőséget kínál a rendszer a hosszadalmas szövettenyésztési folyamatok lerövidítésére is. A hélium gázzal működő ágyú (Kikkert 1993) széles körben elterjedt standard készülék. Újabb fejlesztésű (Chaure és mtsai 2000) a kézi részecskeágyú, mely lehetővé teszi a transzgén átvitelét az intakt növény szöveteibe is. A biolisztikus technika jelenleg a legmegbízhatóbb és a leghatékonyabb módszer termékeny, transzgénikus egyszikű növények előállítására (Alpeter és mtsai 1996b, Barro és mtsai 1997, Blechl és Anderson 1996, De Block és mtsai 1997, Rasco-Gaunt és mtsai 2001). Ezzel a módszerrel állították elő az első kereskedelmi forgalomba került genetikailag módosított (GM) gabonafajtákat (Reppelin és mtsai 2001). Gabonaféléknél vagy rögtön izolálás után juttatják be a DNS-t a növényi részekbe (Barro és mtsai 1997), vagy a kalluszokat transzformálják (Vasil és mtsai 1992). A transzgén expresszióját erősen befolyásolják a biolisztikus eljárás fizikai és kémiai paraméterei (pl. az aranyszemcse mérete, He gáz nyomása stb., Rasco-Gaunt és mtsai 1999a, Harwood és mtsai 2000). Pauk és mtsai (1998) számoltak be az első magyar in vitro módszerrel herbicid-rezisztenssé alakított búza genotípusról. Kísérletükben a bar gént génágyúval juttatták be éretlen embrió eredetű kalluszokba, majd rezisztens növényeket szelektáltak. A bar gén expresszióját PAT próbával mutatták ki, így a szelekciót követően hat független transzformánst kaptak. A 0,1 százalékos bialaphos permetezéssel szemben rezisztens növények termőképes szemeket képeztek. A herbicid rezisztens növények előállítása mellett egyre fontosabbak a búza minőségének javítását célzó transzformációs kutatások. A HMW-glutenin alegységek gyakorlati és gazdasági fontosságának köszönhetően nem meglepő, hogy a HMW-glutenin alegység gének bevitele a búza transzformációs kísérletek elsődleges céljává vált. A HMW glutenin alegység gének felhasználása a különböző búza genotípusok transzformálására, megnöveli az adott HMW fehérje alegység mennyiségét és megváltoztatja a szem funkcionális tulajdonságait (Blechl and Anderson. 1996, Alpeter és mtsai 1997, Barro és mtsai 1997, 2003, Alvarez és mtsai 2000). Így például az 1Ax1 transzgén a sütőipari tulajdonságok javulását eredményezi, míg az 1Dx5 transzgén annak romlásához vezet (Darlington és mtsai 2003). A B73-6-1 az egyik legintenzívebben tanulmányozott módosított glutenin összetétellel rendelkező transzgénikus búza vonal (Barro és mtsai 1997). A B73-6-1 vonal 10-15 extra kópiát tartalmaz az 1Dx5 HMW glutenin génből, mely a kódolt fehérje mennyiségét négyszeresére növeli (Rooke és mtsai 1999, Popineau és mtsai 2001, Barro és mtsai 1997, Old alsz


Butow és mtsai 2003). A tartalékfehérjék funkcionális vizsgálata mellett nagyon fontos a gének expresszióját befolyásoló promóterek tanulmányozása is. Vibók és mtsai (1999) transzgénikus rizsben vizsgálták a búza γ-gliadin génjének szövetspecifikus kifejeződését. A rizs actin1 promóterből és a búza γ-gliadin génből hibrid konstrukciót készítettek, és ehhez kapcsolták a β-glükuronidáz riporter gént (gusA). A hibrid konstrukciót génágyús módszerrel juttatták a rizsbe, majd tanulmányozták a GUS gén expresszióját a növény különböző szöveteiben. A számos módszertani nehézség és a fogyasztói reakciók miatt, a növényi transzformáció módszerében még további jelentős fejlődés várható a közeljövőben.

Old alsz

4. Célkitűzések

4

CÉLKITŰZÉSEK

A martonvásári búzanemesítési program alapvetően a kemény endospermium szerkezetű, jó malom- és sütőipari minőségű fajták nemesítési hagyományait követi. A közelmúltban megjelent számos publikáció bizonyítja a tartalékfehérjék jelentőségét a búza minőségének kialakításában (Bedő és mtsai. 1995, Juhász és mtsai. 2003). A búza komplex minőségét azonban sok tényező együttes hatása alakítja ki. Jelentős hatása van a minőségre többek között a búza endospermiumában megtalálható, az endospermium keménységét befolyásoló fehérjéknek vagy a biológiailag aktív enzimfehérjéknek is. Jelen tanulmányban célul tűztük ki annak vizsgálatát, hogy a búza endosperm egyes fehérjéi és azok expressziós szintjei milyen hatással vannak a sütőipari minőségre, majd ezen túlmenően a fehérjék felhasználási lehetőségét kerestük a búzanemesítésben molekuláris markerszelekciós vizsgálatokra.

1. 1Dx5 HMW glutenin génnel transzformált genotípuson HPLC technikákkal vizsgáltuk a tartalékfehérje alegységek mennyiségi arányainak megváltozását, majd e változás technológiai és reológiai tulajdonságokra kifejtett hatását

2. 1Bx7 fehérjét túltermelő genotípusokat és a velük létrehozott keresztezési programok utódnemzedékeit vizsgáltuk HPLC technikával. Vizsgáltuk a törzsekben a túltermelés mértékét és lehetőséget kerestünk az alegység túltermelés alapján molekuláris markerszelekciós vizsgálatokra 3. Vizsgálataink során arra is kerestünk választ, hogy különböző hasadó generációkban végzett szelekció során a szem endospermium szerkezetétől függően hogyan változnak az egyes technológiai tulajdonságok

4. Hexaploid valamint néhány kontroll diploid és tetraploid, búzával rokon vad faj szemkeménységét és néhány minőségi jellemzőjét vizsgáltuk, majd a keménységet meghatározó puroindolin gének jelenlétét és azok mutációtípusait azonosítottuk molekuláris markerek felhsználásával

5. Vizsgálatot végeztünk arra voatkozóan, hogy a HMW tartalékfehérje összetétel alapján heterogén Bánkúti 1201 törzsek, keményítő tulajdonságaikat tekintve is heterogének-e, és ha igen a különbségek összefüggésbe hozhatóak-e az egyik leggyakrabban használt marker, a GBSS markerével talált variabilitással.

Old alsz

5. Módszerek

5 5.1

MÓDSZEREK

Növényi anyagok

A felhasznált anyagok leírása a könnyebb áttekinthetőség kedvéért az eredmények és értékelésük fejezetben az egyes fejezetek előtt található. 5.2

Módszerek

5.2.1 Fehérje analitikai módszerek A különböző búzafajták tartalékfehérje összetételének (HMW- és LMW-gluteninek), valamint az egyes fehérje alegységek mobilitás- és intenzitásbeli különbségeinek megállapítására SDSpolyacrylamid gélelektroforézist használtunk (Jackson és mtsai. 1996). Ugyancsak ezt a technikát alkalmaztuk a búza Tritonban oldodó friabilin fehérjéinek elválasztására. A tartalékfehérje alegységeket Singh és mtsai. (1991) módszere alapján nyerjük ki. Első lépésben a gliadinokat 70% etanollal extraháltuk, majd ezt követően a glutenineket dithiotreitollal redukáljuk 0.08 M-os Tris-HCl (pH 8.0) pufferben és jódacetamiddal alkileztük. A mintaoldó puffer 2%(w/v) SDS-t, 0.2 M Tris-t (pH=8), 40% glicerint, 4 mg brómfenolkéket, 0.3 % dithiotreitolt és ugyanennyi jódacetamidot tartalmazott. A 15 kDa-os friabilin extrakciójához Bordier (1981) módszerét használtuk, ahol első lépésben kinyertük az 1% Triton-X114-t (10mM Tris/150 mM NaCl pH 7.5) tartalmazó pufferben oldodó komponenseket, majd a 37 °C-os vízfürdő hatására elváló detergensben gazdag alsó fázisból acetonnal csaptuk ki a fehérjéket. Szárítás után a csapadékot 2%(w/v) SDS-t, 0.2 M Tris-t (pH=6,8), 40% glicerint és 4 mg brómfenolkéket tartalmazó mintaoldó pufferben vettük fel. A fehérje alegységek elválasztására Lawrence és Shepherd (1980) módszerét használtuk A tartalékfehérje alegységek elválasztását 180x160x1 mm méretű gélen, Hoefer SE 600 típusú vertikális gélelektroforézis rendszerben, Power Supply EC 4000P tápegységgel, 12%-os akrilamid gélen, pH 8.0 TRIS-glicin tartalmú pufferben végezzük. A futtatás 8 mA/gél állandó áramerősség mellett 16 órán át folyt. A gél festése Coomassie G250 festékkel történt. A gél mosásához Brij 35 oldatot használtunk. A géleket szkennelés után 10 %-os esetsavas glicerin oldatban tároltuk. Molekulatömeg standardként 10 kDa-os fehérjelétrát használtunk (GibcoBRL, 10-200 kDa). A HMW-gluteninek azonosítását Payne és Lawrence (1983) leírása alapján végeztük. A HMW glutenin alegységek relatív mennyiségének megállapításához Marchilo és mtsai. (1989) módosított RP-HPLC módszerét használtuk. Ennek alapján 50 mg lisztből 1 ml 70V/V%-os etanollal, majd kétszer 1 ml 50% (v/v)-os propanollal extraháltuk a gliadinokat. A

Old alsz

5. Módszerek

glutenin polimereket 1 ml 1 % (m/v) DTT-t tartalmazó pufferrel [50% (v/v) propanol, 2 M karbamid és 0.2 M Tris-HCl (pH=6.6)] redukáltuk, majd 10 µl 4-vinyl-piridinel alkiláltuk. Centrifugálást és szűrést (0.45 µm PVDF szűrőn) követően a főleg HMW és LMW- glutenin alegységekből álló szűrletet Supercosil LC-308 (300A, 3.5%carbon, 5µm, 5x4.6) oszlopon választottuk el. A gliadin, glutenin és az albumin+globulin tartalom meghatározására Batey és mtsai. (1991) SE-HPLC módszerét használtuk. 10 mg lisztet szuszpendáltunk 1 ml 0.5% (v/v) SDS-foszfát pufferben (pH 6.9) és 15s-ig szonikáltuk. Centrifugálás után a felülúszót 45 µm PVDF szűrőn átszűrtük. Az elválasztást Phenomenex BIOSEP-SEC 4000 oszlopon végeztük. A futtatást acetonitril pufferben végeztük [0.05 % (v/v) triflourecetsav és 0.05 % (v/v) acetonitril). 10 perc futtatási idővel (2 ml/perc áramlási sebesség). A fehérjéket 214nm hullámhosszon detektáltuk. 5.2.2 A tészta minőségi tulajdonságainak vizsgálata A búza funkcionális és reológiai tulajdonságainak vizsgálatára a Közép-Kelet Európai búzaminőség vizsgálati módszerek mellett a világszerte széles körben használt standard búza és tésztavizsgálati módszereket alkalmaztuk. Ezek a következők: Perten SKCS 4100 (AACC 55-31), Perten Inframatic 8611 (ICC 202, 159), Perten Falling Number System 1500 (ISO 3093-1982), Kjeltec 1035 Analyzer (ICC105/2), Glutomatic 2200 (ICC 137/1), Zeleny szedimentációs teszt (ICC 116/1), Brabender Farinográf (ICC115/1), 10g Mixográf (AACC Method 54-40) és Chopin Alveográf (ICC 121). A felsorolt és a nem szabványos módszerekhez a következő megjegyzések szükségesek: A gyors és rutinszerű vizsgálatok közül az egyik leggyorsabb méréstechnika a közeli infravörös spektroszkópia (NIR). A Foss Tecator 1241 és Perten Inframatic 8611 készüléket azonos évben és termőhelyen termett 40 búzafajta minőségi adatai alapján évente kalibráltattuk. Teljes szemre a kalibrációt nedvesség-, fehérje-, nedves sikér- tartalom, Zeleny szedimentáció, szemkeménység és a szemszínt (L, a, b) jellemző paraméterekre végeztettük el. Őrleményre és lisztre, nedvesség-, fehérje-, nedves sikér-tartalom, szemkeménység, Zeleny-, SDS-szedimentáció és farinográfos vízfelvétel kalibrációval rendelkezünk. A minta előkészítését Perten 3100 Laboratory Mill darálóval és CHOPIN CD1 Laboratory Mill malommal végeztük.

Old alsz

5. Módszerek

Az SDS szedimentáció megállapításásra SOLTEK Automata SDS Sedimentációs Tesztet (SDS System, Calibre Control International Ltd., Warrington) használtunk. Perten 3100 laboratóriumi malmon leőrölt mintából 3g ± 0.1g örleményt összekevertünk 25 ml de-ionizált vízzel 30 °C-os vízfüdőben. Az így készült szuszpenzióhoz 15másodperc után 25 ml SDStejsav oldatot adtunk és további 15 másodpercig kevertük a mintát. A teszt tizedik percében leolvassuk az üledék térfogatát ml-ben. A 10 g-os mixográf alkalmazása a farinográfhoz hasonlóan a tészta dagasztás közbeni viselkedésének, reológiai tulajdonságainak vizsgálatára alkalmas berendezés, mely különösen hasznos és informatív minőség szelekciós eljárás a nemesítés korai generációiban. A hozzáadott víz mennyiségének meghatározásánál a liszt nedvességtartalmán kívül a fehérjetartamat is figyelembe vesszük (ellentétben a farinográffal). A készülékkel mért legfontosabb paraméterek a következők: keverési idő (MT), ellenállás a csúcsnál (PR), ellenállás 3 perccel a csúcs után (RBD), görbeszélesség a csúcsnál (BWPR), görbeszélesség 3 perccel PR után (BWBD), maximális csúcsszélesség kialakulásáig eltelt idő (TMBW) és a maximális csúcsszélesség (MBW). A búzaszemek méret szerinti osztályozottságát az MSZ 6367/4-86 magyar szabvány szerint határoztuk meg 50 g mintából, 2.8, 2.5 és 2.2 mm-es lyukméretű szitákkal. 5.2.3. A keményítő tulajdonságainak vizsgálata A keményítő kimosását lisztből a következőképpen végeztük. Lisztből (200 g) és desztillált vízből (110 ml) tésztát készítettünk, melyet a sikér hidratációját követően Glutomatic 2200 készülékkel addig mostunk amíg tiszta vizet nem kaptunk (Perten Instruments AB, Sweden). A keményítő szuszpenziót 10 percig centrifugáltuk (5000 rpm) majd a felülúszót leöntöttük. A csapadék felső elszineződött rétegét lekapartuk. A maradék kemény fehér csapadékot újraszuszpendáltuk és jéghideg vízzel kétszer mostuk. A keményítőt végül lefagyasztottuk és fagyasztva szárítottuk. A keményítő viszkozitásának hő hatására bekövetkező változását (Pasting viscosities) Rapid Visco Analyser (RVA-3D, Newport Scientific Pty. Ltd., Warriewood, NSW, Australia) készülékkel mértük. A mérés ismételhetősége ± 5 RVU körül változott. A méréshez egy 20 perces hőmérséklet profilt használtunk, mely tartalmaz egy 2 perces tartást 50 ºC-on, 6 perc felfűtési szakaszt, 4 perces tartást 95 ºC-on, 4 perces hűtést és végül egy 50 ºC-os tartást (AACC 1991, Batey és mtsai 1997). Enzim inhibítorként liszt és keményítőminták esetén is ezüst nitrátot (12 mM) használtunk.

Old alsz

5. Módszerek

Liszt vagy keményítő és víz 1:2 arányú elegyét rozsdamentes acél tégelyben hővel kezeltük és a gélesedéshez szükséges hőmennyiséget Pyris 1 differential scanning caloriméterrel (DSC, Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA) mértük. A hőmérséklet profil a következő volt: 1 perc tartás 20 ºC-on, fűtés 20ºC -ról 140ºC -ra 10ºC/perc, 1 perc tartás 140ºC –on és hűtés 140ºC -ról 20ºC -ra 10ºC/perc. Az amilóz/amilopektin arányt Batey and Curtin (1996) módszere alapján határoztuk meg. Huszonöt mg keményítőt gélesítettünk 1 M-os NaOH-val és inkubáltuk jéghideg ecetsav és izo-amiláz (Megazyme) tartalmú 0.05 M-os nátrium acetát pufferben (pH=4), majd forralással denaturáltuk a keményítőt. Elválasztás előtt ioncserélő gyantát és PVDF szűrőt használtunk. Az amilózt és az amilopektint HPLC oszlopon Waters Ultrahydrogel 250 oszlopon (No. 11525) választottuk el. A mozgó fázis 0.05 M ammónium acetát puffer (pH=5.2), az áramlási sebesség 0.5 ml/perc a futtatási idő pedig 40 perc volt. 5.2.4 DNS alapú vizsgálatok A búza genomi DNS-t 100 mg levélből izoláltuk Qiagen DNEasy Kit használatával. A DNS analízishez 10 µl-es PCR reakciót állítottunk össze, mely 0.5-0.5 µM forward és reverse primert, 200-300 µM dNTP-t (dGTP, dATP, dTTP, dCTP), 1xPerkin Elmer PCR puffert, 0.03U/µl Taq DNS polimerázt (Promega) és 0.5-2.5 ng/µl templát DNS-t tartalmazott. A mintákat első lépésben 95°C-on 5 percig denaturáltuk, majd 36 ciklusban (94 °C 30 sec, Tm °C 25 sec, 72°C 30 sec) felszaporítottuk a DNS-t, végül 5 perc 72°C-os lépéssel fejeztük be a reakciót. A reakció körülményeit primerenként optimalizáltuk. A reakció termékeit 12% agaróz gélen futtatuk meg TBE pufferben. Molekuláris markerszelekciót végeztünk a Bx7 tartalékfehérje alegység túltermelésének, a puroindolin-a és a puroindolin-b fehérjék génjeinek és a waxy allélek jelenlétének kimutatására. 3. táblázat A PCR reakcióhoz használt primerek listája Primer neve Bx7 F Bx7 R primpa1 F primpa3 R primpb1 F primpb3 R Wx-F Wx-R

Primer szekvenciája 5’-TTT TAC CCA AAC CCC AAC TG-3’ 5’-CAC GCC ATC ACT AAT ATT CCA C-3’ 5'-GCC CTC TTC CTC ATA GGA C-3' 5'-TGC CGG GGA TGT TGC AGG G-3' 5'-ACC TTA TTC CTC CTA GCT C-3' 5'-GGG AAC TTG CAG TCG GCG C-3' 5’- ACT TCC ACT GCT ACA AGC GCG GGG T-3’ 5’ –GCT GAC GTC CAT GCC GTT GAC GAT G-3’

Primerpárok Bx7F-Bx7R primpa1-primpa3 primpb1-primpb3 WxF-Wx-R

PCR termék 1Bx7 Puroindolin-a Puroindolin-b Waxy-D1, Waxy-A1, Waxy-B1

Származása Gárdonyi és mtsai 2003 Gárdonyi és mtsai 2003 saját tervezés saját tervezés saját tervezés saját tervezés Urbano és mtsai 2000 Urbano és mtsai 2000

Termék mérete (bp) 386 420 421 1031, 953, 935

Tm © 60 55 55 65-55 Old alsz

5. Módszerek

A puroindolin-b génjének klónozásához a PCR termékeket TOPO vektorba ligáltuk (Invitrogen, TOPO TA Cloning Kit) majd a ligátumot elektroporációval (BIO-RAD E.coli Gene Pulser) E.Coli JM-109-es kompetens sejtbe juttattuk. A transzformált ligátumot inkubálás után ampicillin tartalmú LB táptalajra szélesztettük (pH=7, 10mg tripton, 5mg élesztő extraktum, 10mg NaCl, 15g agar, 100mg ampicillin/l). Az XGal/Iptg (kék/fehér) szelekción átjutott kolóniákat LB tápoldatba átoltottuk majd 37 °C-on egy éjszakán át rázattuk. A plazmidokat ezután Wizard Plus SV Minipreps (Promega) Kit-tel nyertük ki. Az így nyert plazmid DNS-el az univerzális forward primer felhasználásával szekvenáló PCR reakciót állítottunk össze.

A puroindolin-b gének 420 bp-os termékének szekvenálásához a szekvenáló PCR reakciót Big Dye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) felhasználásával állítottuk össze. Az 5 perces 95°C-os denaturáció után 28 ciklus (95°C 30 sec, 55°C 20 sec, 60°C 4 perc) majd 8 ciklusban (95°C 30 sec, 60°C 4 perc) szaporítottuk fel a DNS-t. A szekvenálást ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) szekvenálóval végeztük. 5.2.5 Statisztikai elemzések A statisztikai elemzést SPSS for Windows 10.0 (SPSS Inc., Chicago, USA) statisztikai programcsomag és Microsoft Excell segítségével végeztük. A B73-6-1 transzformáns vonal technológiai és reológiai tulajdonságainak értékelésére egy és kéttényezős varianciaanalízist végezünk (2000-2003). A Bx7 túltermelésre vizsgált 113 törzs tartalékfehérjéinek elemzésekor Bartlett próbát és egytényezős varianciaanalízist végeztünk. A keménységi csoportok minőségi tulajodonságait Pearson korrelációval és többmintás t próbával (Duncan teszt) vizsgáltuk. A keményítő tulajdonságaira általános statisztikai elemzést és Hierarhikus Klaszter Analízis végeztünk.

Old alsz

6. Eredmények és értékelésük

6 6.1

EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

Egyes HMW glutenin alegységek túltermelésének hatása a búza minőségére

6.1.1 Növényi anyagok A különböző tartalékfehérje alegységek túltermelésének minőségre kifejtett hatását vizsgáltuk természetes állapotában túltermelő és biolisztikus úton túltermelővé tett genotípusok felhasználásával. 6.1.1.1 1Dx5 alegység túltermelésének vizsgálatához felhasznált anyagok Az L88-6 az Olympic és a Gabo búzafajták keresztezéséből származó egyik izoform, mely öt különböző HMW-glutenin gént expresszál (1Ax1, 1Bx17+1By18, 1Dx5+1Dy10). A törzs, mely eredetileg is tartalmazza az 1Dx5 HMW-glutenin gént, megfelelő alany a tartalékfehérje alegység túltermelésének vizsgálatára. Transzformálásával, melyhez 1Dx5 HMW-glutenin gént használták fel angol kutatók, előállították a B73-6-1 törzset (IACR-Rothamsted, Harpenden, UK, Barro és mtsai, 1997). Ezer éretlen búza szkutellumot transzformáltak PDS1000/He génpuskával 1100 psi nyomáson. A belövéshez használt plazmidok egyike tartalmazta az 1Dx5 HMW-glutenin gént, míg a másik (pAH25) a szelekciós markergént (bar, herbicid rezisztenciát létrehozó gén), a látható markergént (uidA, β-glukuronidázt kódoló gén) és a kukorica ubikitin génjének promóterét tartalmazta. Szelekciós táptalajként 2 mg/l Lfoszfinotricint használtak, mely a BASTA növényvédőszer aktív alkotóeleme. 4. táblázat

Dagasztáshoz használt búzafajták tészta stabilitási és nyújthatósági adatai Tulajdonságok (2002)

SDS-PAGE

HMW glutenin alegységek

Perten Inframatic 8611 Fehérje tartalom [%[ MT [sec] PR [A.U.%] Mixográf BWPR [A.U.%] BWBD [A.U.%] RBD [A.U.%] P [mm] W [*10-4 J] Alveográf G [cm3] P/L

Mv Magdaléna 1Ax2*, 1Bx7+1By9, 1Dx2+1Dy12 16.52 162.60 59.00 19.50 6.90 11.10 102.70 165.40 14.70 2.34

Mv Marsall 1Ax2*, 1Bx7+1By9, 1Dx5+1Dy10 15.10 154.80 53.00 17.30 6.70 12.40 72.82 151.60 17.52 1.17

Lona 1Ax1, 1Bx17+1By18, 1Dx2+1Dy12 15.89 202.10 52.20 27.20 16.30 12.10 53.90 256.63 30.97 0.28

A keverési és dagasztási kísérletekhez használt kereskedelmi forgalomban levő búzafajták közül a tavaszi Lona kiváló sütőipari minőséggel és nagy tésztanyújthatósággal rendelkezik. Az Mv Magdaléna keményszemű minőségjavító búzafajta, nagy sikértartalommal (>35%), farinográfos értékszámmal és sikérterüléssel. Az Mv Marsall egy korai, keményszemű Old alsz


búzafajta, mely az Mv Magdalénánál kisebb fehérje, farinográfos értékszám és sikérterülés értékekkel rendelkezik. A keveréshez használt három fajta HMW glutenin összetétele különböző (4. táblázat). A transzgénikus B73-6-1, az eredeti, nem transzformált L88-6 és a Lona tavaszi búzafajtát hat (2000) és nyolc (2001, 2002) ismétlésben vetettük el. A talaj csernozjom típusú (pH 6.8-7.2) az elővetemény borsó volt. Erős szárazság volt áprilistől a kísérlet mindhárom évében (2000, 2001, 2002), így az aratás két-három héttel korábban kezdődött a szokásosnál. 2001-ben aratás előtt nagyobb mennyiségű csapadék esett. A teljes kísérletet gyomírtószerrel (15 g/ha Granstar 75% tribenuron metil tartalommal) és rovarölőszerrel (2 dl/ha Sumialfa 5% eszfenvalerát tartalommal) kezeltük. Gombaölőszerrel (1 l/ha Amistar 250g/l azoxisztrobin tartalommal) 3-4 ismétlést kezeltünk minden évben. Betegség nem jelent meg a kísérletben a 2000 évi sárgarozsda járvány idején sem. Vizsgálatainkat négy, esetenként -különösen a vizsgálat első évében- két ismétlésben végeztük. Vizsgálataink részét képezték az L88-6 és a B73-6-1 angol és ausztrál termőhelyekről származó lisztmintái is. 6.1.1.2 1Bx7 alegység túltermelésének vizsgálatához használt törzsek A vizsgálat alapját képezték a Bánkúti 1201 törzsei, a kanadai Glenlea és az N93-3026 genotípusok, valamint ezek keresztezéséből származó F3-F4 törzsek. A Bánkúti 1201 mindhárom törzse (11295, 11310, 11314) 2* 7+9 2+12 fehérjeallél összetételű volt. A Bánkúti 1201 keresztezéseiből 113 szántóföldi szelekció során kiválasztott törzset vizsgáltunk (2002). Ezek közül 48 keresztezés az Mv Magdalénával (közülük 19, 18, 11db sorban a fent említett három Bánkúti 1201 törzzsel), 20 az Mv Magvassal (5, 9, 6), 41 az Ukrainkával (13, 14, 14) és 4 az Emmával (3, 1, 0) történt (5. táblázat). A vizsgálat során valamennyi mintából 3-3 párhuzamost mérést végeztünk. 5. táblázat A keresztezéshez használt búzafajták (OE=overexpression) Fajták Bánkúti 1201 Glenlea N93-3026 Mv 2 Ukrainka Mv Magvas Mv Emma Mv Magdaléna

Glu-A1

Glu-B1

Glu-D1

2* 2* 2* 2* 1 1 N/2* 2*

7+9 7+8OE 7+8OE 7+8 7+8 7+9 7+9 7+9

2+12 5+10 5+10 5+10 5+10 5+10 5+10 2+12

Fehérjetartalom% (FOSS) r2=0.8 16,2 16,2 15,2 15,2 14,8 14,3 15,2 16,2

A Glenlea és a Glenlea típusú N93-3026 vonalak valamint a kontrollként használt Red River túltermelőek Bx7 alegységre nézve. Normál Bx7 termelő kontrollok a Chineese Spring és a

Old alsz


Cheyenne búztafajták voltak.A Kjeldahl fehérje és a Foss Tecator készülékkel mért fehérjetartalom közötti korrelációs együttható értéke 0.8 volt. 6.1.2 1Dx5 HMW glutenin gén túltermelésének hatása a búza minőségére 6.1.2.1 1Dx5 HMW glutenin génnel transzformált búzafajta fehérjeösszetételének vizsgálata A kenyérbúza liszt HMW glutenin arányának valamint funkcionális tulajdonságainak javítása céljából Barro és mtsai. (1997) 1Dx5 HMW glutenin génnel végeztek transzformációt. Az 1Dx5 transzgént az L88-6 elnevezésű búzavonalba vitték be, mely maga is tartalmazta az 1Dx5 HMW glutenin gént. SE- és RP- HPLC analízis alapján összehasonlítottuk a transzgénikus B73-6-1 vonal és a kontroll L88-6 vonal fehérje összetételét a különböző fehérje csoportok abszolút mennyisége alapján, ng fehérje/mg liszt egységekben megadva (6. táblázat, 3. ábra). Eredményeink alapján a B73-6-1 transzgénikus vonal négyszeres mennyiségben túltermeli az 1Dx5 HMW glutenin gént melynek következtében a Dx/Dy arány 14-re nőtt, míg a nem transzformált kontroll vonal Dx/Dy aránya megközelítően 3 volt. Emelett további szignifikáns eltéréseket találtunk a fehérjeösszetételben, mely változások az 1Dx5 extra kópiáinak tulajdoníthatók. Így az Ax, By és Dy gének expressziós szintje megközelítően azonos mértékben, 30%-al csökkent, míg a Bx gén expressziója alig változott. Mindezek az egyedi fehérjealegységek szintjén jelentkező változások a Dx/Dy és a Bx/By arány különböző mértékű megváltozását okozták. A HMW gluteninek teljes mennyiségének megnövekedését nem követte az LMW gluteninek expressziós szintjének csökkenése. Az LMW gluteninek expressziós szintje kisebb mértékben ugyan, mint a HMW glutenineké, de nőtt és a növekedés ezesetben is szignifikáns volt (128%). A glutenin alegységek összmennyiségének növekedését a gliadin fehérjék mennyiségének mintegy 10%-os csökkenése kompenzálta a transzgénikus mintákban. A gliadinok mennyiségének csökkenése azonban szignifikánsan kisebb az Ax, By és Dy típusú HMW gluteninek mennyiségének csökkenésénél. Ezen változások hatására nem csak a Dx/Dy arány, de a HMW/LMW és a glutenin/gliadin arány is megnőtt a transzformáció következtében. A HMW/LMW arány 0.48ról 0.66-ra, míg a glutenin/gliadin arány 0.82-ről 0.95-re nőtt. A glutenin polimerek méretének és

összetételének

megismerésével

lehetővé

válik

a

liszt

minőségének

irányított

megváltoztatása a végfelhasználási igényeknek megfelelően. 6. táblázat B73-6-1 és az L88-6 fehérje összetételének összehasonlítása (2003, 2001 átlag) L88-6

B73-6-1

Old alsz


Glutenin/gliadin HMW/LMW Dx/Dy Bx/By HMW-GS LMW-GS Ax Bx Dx By Dy

0.82 0.48 2.58 4.14 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 %

0.95 0.66 14.67 5.24 177.53 % 128.56 % 72.88 % 96.47 % 404.74 % 76.23 % 71.04 %

* Az egyes fehérje csoportok mennyisége az L88-6 százalékában kifejezve, a HPLC mérés pontossága ±0.1%

Meghatároztuk a transzformált növény fehérje összetételét SDS-PAGE és RP-HPLC módszerekkel és megállapítottuk, hogy a transzgén a vizsgált három generáción keresztül stabilan öröklődött (3. ábra). Egy az 1Ax1-nél valamivel nagyobb molekulatömegű halvány sáv jelent meg a transzgénikus vonalban tartalékfehérjéinek SDS-PAGE-n történt elválasztásakor, de ezen alegység ezidáig még nem azonosított. Egyes minták esetén tartalékfehérje alegységek hiányát is megfigyeltük, az egyedeket azonban nem sikerült felszaporítanunk. A B73-6-1 transzgénikus vonal fehérjetartalma tendenciáját tekintve nagyobb, mint az L88-6 kontroll vonalé, mind Kjeldahl módszerrel mind NIR módszerrel mérve, ez a különbség azonban nem szignifikáns. Bár a fehérjetartalom nem változott szignifikánsan a transzformáció következtében egyéb technológiai és reológiai tulajdonságok szignifikáns változást mutattak. A B73-6-1 lisztjének vízfelvétele és esésszáma nagyobb, míg Zeleny és SDS szedimentációs értéke kisebb, mint a nem-transzformált kontroll vonalé. A transzgénikus vonal sikértartalma Glutomatic System készülékkel mérve nagyon kicsi volt a tészta és a sikér kohezivitásának hiánya miatt. Megjegyzendő, hogy korábbi tanulmányok szerint (Murray és Békés, személyes közlés) a hozzáadott víz mennyisége és a keverési körülmények megváltoztatása nem befolyásolják a tészta kohezivitását. A szedimentációs tesztek eredményei bár általában közvetlen összefüggésben állnak a tészta erősségével, a transzgénikus vonal esetén nem találtunk összefüggést a paraméterek között. Ez egyértelmű jele a fehérjemátrix szerkezetében bekövetkező szignifikáns változásoknak, melyeket a HMW gluteninek x/y egyensúlyának felborulása okoz (7 táblázat).

3. ábra

1Dx5 HMW glutenin túltermelés vizsgálata SDS-PAGE (2000-2002) és RPHPLC (2002) módszerekkel

Old alsz


7. táblázat

A B73-6-1 transzgénikus vonal és az L88-6 kontroll vonal agronómiai és

technológiai tulajdonságainak vizsgálata magyar, ausztrál és angol kísérletekben Magyar (2000-2002)

Tulajdonságok

Terméshozam (kg/plot) Ezerszemtömeg (g) Hektolitersúly (kg/100 l) Keménység index Fehérje tartalom (%) Sikér tartalom (%) Sikér terülés (mm/h) Gluten index Farinográfos vízfelvétel (%) Farinográfos értékszám (mért/extrapolált) Esésszám SDS szedimentáció (ml)

Angol (2001)

Ausztrál (2002)

B73-6-1

L88-6

B73-6-1

L88-6

B73-6-1

L88-6

1.7 33.2 75.8 23.7 14.2 12.2 0.5 99 51.8

1.7 35.4 76.4 16.7 13.9 23.8 1.7 99 51.3

ND ND ND 45.1* 15.1 21.6 0.0 100 58.4

ND ND ND 34.0* 14.6 30.4 0.5 100 57.6

ND ND ND 55.4* 15.5* 26.4 0.0 100 61.7

ND ND ND 38.4* 13.7* 30.0 0.5 100 60.7

0.2 1.2 0.5 7.6 0.4 6.7 1.0 2.0 1.2

31.2/68.3

78.9

40.2

86.6

27.3

83.9

12.4

295 17.0

261 20.9

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

42 2.5

* NIR (közeli infravörös spektroszkópia) eredmények, ND= nincs detektálva, a nem jelölt adatokat a standard módszerek alapján mértük, SzD5% értékeket csak a magyar adatok alapján határoztuk meg a rendelkezésre álló ismétlésszám miatt

6.1.2.2 A környezet hatása az 1Dx5 HMW glutenin génnel transzformált búzafajta reológiai tulajdonságaira A környezet a sikérfehérjék mennyiségét és minőségét egyaránt befolyásolja. A hároméves szántóföldi

kísérlet

két

évében

komoly

szárazság

volt

áprilistől.

Vizsgáltuk

a

Old alsz


transzformáció/fajta, az évjárat, a gombaölőszer és a termőhely hatását a transzgénikus és a kontroll vonalra. A vizsgálat alapjául a vonalak agronómiai és technológiai tulajdonságai szolgáltak. A kéttényezős variancia analízis eredményei szerint - melyben a transzformáció és az évjárat hatását vizsgáltuk – megállapítottuk, hogy a transzformáció hatására szignifikánsan csökkent a sikértartalom, a sikérterülés, a farinográfos értékszám, az SDS-szedimentáció és az ezerszemtömeg, ugyanakkor nőtt a vízfelvétel értéke. Az évjárat, a farinográfos értékszám és a vízfelvétel kivételével, valamennyi feltüntetett paraméterre szignifikáns hatással volt a hároméves kísérletben (8. táblázat.). A két tényező (év, fajta) kölcsönhatása az esésszámot és az SDS-szedimentációt befolyásolta szignifikánsan. A gombaölőszernek a kisérlet egyik évében sem volt szignifikáns hatása a vonalak technológiai és reológiai tulajdonságaira. A termőhelynek szignifikáns hatása volt mindkét vonal (B73-6-1, L88-6) fehérje tartalmára és farinográfos vízfelvételére, ugyanakkor a transzformáció hatása nem volt szignifikáns ugyanezen paraméterekre (8. táblázat). Ez azt mutatja, hogy a transzformáció a gluteninek mennyiségét és szerkezetét befolyásolják, míg a fehérjék összes mennyiségét csak a környezet befolyásolja. Barro és mtsai. (2002) kimutatták, hogy a transzgénikus vonal és az eredeti genotípus között genetikailag meghatározott különbség van a kalászolási idő és a kalászonkénti kalászkaszám fenotípusos tulajdonságok esetén. Ezzel összefüggésben ebben a tanulmányban

további

fontos

tulajdonságoknak,

mint

a

búzaszem

méretének

és

keménységének transzformáció hatására bekövetkező szignifikáns változását mutattuk ki. Az eredmények a használt módszertől és a környezet hatásától függetlenek voltak. A 2.2 µm-nél kisebb szemek aránya 4.15% volt a nem transzformált kontroll vonalra és 8.4% volt a transzgénikus vonalra. A lisztkihozatal nem csökkent a kisebb szemméret következtében, a búza mechanikai tisztítása/rostálása során azonban a kis szemátmérő komoly veszteségeket okozhat. A szem szerkezetének szokatlan természetét bizonyítja az a megfigyelés is, hogy a várakozással ellentétben a keménységbeli változások hatása nem tükröződik a farinográfos vízfelvétel mért értékeiben, mivel azok közel azonos eredményt adtak a transzformált és a kontroll törzsre mindhárom termőhelyen. A szem méretében és keménységében bekövetkező változások azonban nem valószínű, hogy bármiféle összefüggésben is állnak az 1Dx5 HMW glutenin megnövekedett mennyiségével. 8. táblázat

Genotípus és az évjárat hatása a B73-6-1 és az L88-6 búzavonalak agronómiai és

technológiai tulajdonságaira (Martonvásár, 2000-2002) kéttényezős variancia analízissel Tulajdonságok

Genotípus hatás

Évjárat hatás

Genotípus és évjárat kölcsönhatása

Old alsz

6. Eredmények és értékelésük Terméshozam (kg/parcella) NS *** NS Hektolitersúly (kg/100 l) NS *** NS Ezerszemtömeg (g) * * NS Lisztkihozatal (%) NS * NS Csírázás (%) NS * NS Esésszám (sec) NS * * Sikér tartalom (%) *** ** NS Sikér terülés (mm/h) *** ** NS SDS szedimentáció (ml) * *** * Farinográfos értékszám *** NS NS Farinográfos vízfelvétel (%) * NS NS Fehérje tartalom (%) NS * NS *, **, *** Szignifikancia 0.05, 0.01 és 0.001 valószínűségi szinten, NS= nem szignifikáns, az adatokat a standard módszerek alapján határoztuk meg

A három termőhely eredményeit összehasonlítva (Magyarország, Anglia és Ausztrália) megállapítottuk, hogy a szemkeménység és a farinográfos értékszám kivételével (keverés nélkül meghatározva) egyik paraméter sem mutatott szignifikáns különbséget a transzformáns és a kontroll vonal között. A fehérje és a sikér tartalom két termőhelyen, míg a sikér terülés csak egy termőhelyen különbözött szignifikánsan. Meg kell említeni, hogy szignifikánsan különböző fehérjetartalmat mértünk NIR módszerrel, azonban az SzD5% értéket a Kjeldahl mérések alapján határoztuk meg (7. táblázat). 6.1.2.3 Dagasztási kísérletek az 1Dx5 HMW glutenin génnel transzformált búzafajta lisztjével Vizsgálataink során a reológiai tulajdonságok meghatározására Brabender Farinográfot, 10g Mixográfot és Chopin Alveográfot használtunk. A tészta keverése során (Mixográf, Farinográf) az L88-6 dagasztási ideje a köztermesztésben levő fajtákéhoz hasonló volt (2-3 perc). A B73-6-1 lisztje hidratálódott, de a tésztakialakulás nem volt megfelelő még 20 perces dagasztás során sem (88 rpm fordulatszám Mixográfnál, 63 rpm Farinográfnál). Mivel a keverés mértéke nem volt megfelelő a tészta kialakulásához, az energiabevitel mértékét kellett úgy növelni, hogy a fehérje polimer szerkezet annyira megváltozhasson, hogy kialakuljon a tészta. Ez nagyobb sebességű keverés mellett érhető el. A nagy sebességű keverés alternatívájaként a B73-6-1 lisztjét kereskedelmi forgalomban levő, különböző minőségű búzafajták lisztjeivel kevertük és dagasztottuk (Lona, Mv Marsall és Mv Magdaléna) 0, 10, 20, 30 és 40%-os arányban. A keverési tulajdonságok becslése céljából a paramétereket 100%-os B73-6-1 tartalomra extrapoláltuk. Kísérletünk során, hasonló eredményeket kaptunk Mixográfos paraméterekre bármelyik fajtával történt is a keverés a háromból (Mv Magdaléna, Mv Marsall, Lona) (4. ábra). A B73-6-1 extrapolációval kapott reológiai jellemzői közül a 10g-os Mixográffal mért, tészta keveréssel szembeni maximális ellenállása (PR), az ellágyulás Old alsz


(RBD) valamint a görbeszélesség (BWPR, BWBD, MBW) értékek kisebbek, míg a keverési idő (MT) nagyobb volt a kontrollénál (L88-6). A nagy tésztaellenállás, az ellágyulás és a keverési idő értékei a tészta nagy stabilitását és ellenállását mutatják, míg a transzgénikus vonal kis görbeszélesség értékei a kis nyújthatóságot jelzik. Az MT és RBD adatok alapján a transzgénikus tészta stabilitása közel ugyanolyan mértékben javult kevesebb mennyiségű egyéb búzafajták lisztjének bekeverésekor. A transzgénikus vonal lisztje a nagy nyújthatósággal és jó sütőipari tulajdonságokkal rendelkező, Lona tavaszi búzafajta tésztanyújthatóságát csökkentette a legnagyobb mértékben. Ezt mutatja a keverésből származó BWPR értékekből képzett egyenes meredekségének változása (4. ábra). Keveréseket végeztünk az Mv17 puhaszemű búzafajta lisztjével is, mivel azonban ennek fehérjetartalmát, mely a B73-6-1 fehérje tartalmánál szignifikánsan kisebb, nem vettük figyelembe, teljesen eltérő meredekségű és értékű görbéket kaptunk (az adatot nem közöljük). A B73-6-1 farinográfos vízfelvétele nagyobb, görbe alatti területe és farinográfos értékszáma pedig kisebb értéket adott a kontrollénál. Mivel a farinográf alapvetően egy lassú sebességű keverést biztosító készülék, egyszerűen egy hidratációs görbét ad eredményül, mely az extra erős tésztára egy igen gyenge lisztre jellemző képet mutat. Más fajtákkal keverve és extrapolációval kapott eredmények szerint azonban a farinográf a kontrollhoz hasonló eredményt adott a transzgénikus vonalra is, vagyis mindkettő az A2 farinográf csoportba sorolható. A tészta erősségét és stabilitását Chopin Alveográffal is jellemeztük. Az eredmények szerint a görbék manuális értékelése után, a transzgénikus vonalra kapott maximális túlnyomás érték nagyobb volt, mint a kontrollé. Mivel azonban a tészta nem volt nyújtható és a görbének nem volt töréspontja, a görbehossz (L) értéket nem tudtuk meghatározni. A tészta kialakulatlansága és nyújthatóságának hiánya miatt a transzgénikus búza lisztjét ezesetben is kevertük és dagasztottuk kereskedelmi forgalomban levő búzafajták lisztjével 15, 30 és 45% -os arányban. Az adatok 100% B73-6-1 tartalomra extrapolálásával megbecsültük a keverési paramétereket. Ez alapján a transzgénikus búza lisztje kisebb G, L, W és P értékeket adott a kontrollnál, ugyanakkor a P/L érték egynél nagyobb volt. A transzgénikus vonal kisebb maximális túlnyomás és deformációs értékei az extraerős, nyújthatósággal nem rendelkező tésztának köszönhető, mely a légnyomás hatására nagyon könnyen szakad, de alig nyúlik. Amikor az Mv Magdaléna lisztjét a B73-6-1 egyre növekvő mennyiségű lisztjével kevertük, a maximális túlnyomás értéke (P) és a görbe hossza (L) egyre csökkent. Amikor az Mv Marsallt használtuk keverésre a P érték nem változott, az L érték azonban csökkent. A Lona esetén a Old alsz


transzgénikus búza lisztmennyiségének növekedésével a P érték csökkent, az L érték azonban nőtt. A deformációs munka (W) valamennyi esetben csökkent (5. ábra). Összességében a B736-1 lisztjének már 10%-os aránya is előnyös hatással volt a kereskedelmi forgalomban levő búzafajták tésztaerősségére. 5. ábra

0% (1), 15% (2), 30% (3), 45% (4) és 50% (5) B73-6-1–el kevert búzafajták Alveográf görbéje

Old alsz


4. ábra

A B73-6-1 tésztaerősséget és nyújthatóságot jellemző Mixográfos paraméterei

három különböző kereskedelmi forgalomban levő búzafajta lisztjével dagasztva

Old alsz


6.1.2.4

Értékelés

A különböző tartalékfehérjéket kódoló gének expressziós szintjének szabályozása rendkívül összetett a transzgénikus búzában. Az extra kópiában bevitt 1Dx5 HMW glutenin gének hatására nemcsakhogy négyszeresére nőtt az 1Dx5 fehérje alegységek expressziós szintje a B73-6-1 búzatörzsben, de ezzel egyidőben szignifikánsan nőtt az LMW gluteninek összes mennyisége is, miközben az Ax, By, Dy és a gliadin tartalom csökkent a Bx alegységek mennyisége pedig gyakorlatilag nem változott. Mindezek után tehát mind a glutenin/gliadin arány, mind a HMW/LMW arány nőtt a transzgénikus búzában. A fehérjeösszetétel ilyen irányú változása következtében egyes technológiai és reológiai tulajdonságok is megváltoztak. A tészta stabilitása nőtt, nyújthatósága és kohezivitása pedig csökkent. Az x és y típusú HMW glutenin alegységek arányának nagy mértékű eltolódása eredményezte a fehérjemátrix szerkezetének olyan irányú megváltozását, melynek hatására a sikérfehérjék kohezivitása csökkent. A fehérjemátrix szerkezetében bekövetkező szignifikáns változásokat jelzi, hogy a szedimentációs tesztek eredményei és a tészta erőssége között nem találtunk összefüggést a transzgénikus vonal esetén. Azok a paraméterek, melyek a tészta stabilitását és erősségét jellemzik (a kis ellágyulás és tészta ellenállás, a nagy maximális túlnyomás, kis deformációs munka és nagy keverési idő) mind azt bizonyítják, hogy a B73-6-1 extraerős tésztával és sikérrel rendelkezik. Ugyanakkor nyújthatósága kicsi, amint azt a kis görbeszélesség értékek, a duzzadás és a görbehossz értékek mutatják. Mindennek eredményeként a transzgénikus vonal lisztjéből sütött kenyér kis térfogatú, kenyérbélzete pedig rendkívül tömör szerkezetű volt. Megállapítottuk, hogy a transzformált genotípus önmagában kenyérkészítésre nem, gyengébb minőségű lisztek javítására, a tészta stabilitásának növelésére azonban alkalmas. Ez a megállapítás megerősíti korábbi tanulmányok eredményeit is (Darlington és mtsai. 2003, Popineau és mtsai. 2001, Rooke és mtsai. 1999), melyek szintén transzformáns genotípusokat vizsgálnak. Ezek az eredmények összehasonlíthatók ’in vitro’ tanulmányok eredményeivel (Beasley és mtsai. 2001), melyek szignifikáns összefüggést találtak a polimer mérete, mennyisége, alegység összetétele és a liszt funkcionális tulajdonságai között. A kísérlet szerint a HMW/LMW arány megváltoztatásával megváltozott az ’in vitro’ polimerek molekulatömeg eloszlása is. E módszer ad egy durva megközelítést a fehérjealegység összetétel változásának funkcionális tulajdonságokra kifejtett hatásáról, de egyáltalán nem ad információt a gluteninek természetes szerkezetéről. Ezzel a témával néhány a közelmúltban megjelent tanulmány foglalkozik (Don et al 2003, Weegels et al. 1996).

Old alsz


A HMW/LMW glutenin arány eltolódása szignifikáns változásokat okoz a transzgénikus genotípus funkcionális tulajdonságaiban. A változás olyan mértékű, hogy a hagyományos vizsgálati módszerek nem képesek a minta jellemzésére. Miután a hagyományos módszerek számos egyszerű alternatíváját próbáltuk ki sikertelenül, -például változtattuk a dagasztáshoz használt víz mennyiségét, illetve búzakeményítővel kevertük a lisztet- két sikeresen alkalmazható alternatívát találtunk a meglehetősen szokatlan tészta vizsgálatára. Ezek szerint vagy a szokásosnál szignifikánsan nagyobb sebességű dagasztás alkalmazása szükséges, vagy a transzformáns búza lisztjét keverni kell valamely hagyományos dagasztási tulajdonságokkal rendelkező búzafajta lisztjével. Ez utóbbi esetben a minta eredményeit extrapolációval kaptuk meg. Meg kell említenünk azonban, hogy mindkét módszernek van azonban hátránya. Az intenzív dagasztás a tészta szerkezetét drasztikusabban töri a hagyományos dagasztásnál, míg más búzafajták lisztjének keverése olyan glutenin műtermékek keletkezését eredményezheti, amelyek keverés nélkül nem is léteznének. Ezeknek a módszereknek a használata azonban lehetővé teszi számunkra, hogy legalább megbecsülhessük a rendelkezésünkre álló minta tulajdonságait. A transzformáns és a kontroll vonal tulajdonságait összehasonlítva számos olyan változást állapítottunk meg, melyek nem tulajdoníthatók közvetlenül a transzgén hatásának. Ezek a változások valószínüleg a transzformációs technika illetve a környezet hatásának eredményei lehetnek, sokkal inkább mint magáé a bevitt géné. Igy például a HMW glutenin alegységek mennyiségi arányainak eltolódásán túlmenően az endospermium szerkezetében, olyan egyéb elváltozások történhettek, melynek hatására a szem keménysége és a búzaszem mérete is szignifikánsan megváltozott. A szem keménysége nőtt a szemmérete és ezzel együtt az ezerszemtömeg csökkent. A legvalószínűbb magyarázat erre az lehet, hogy a szokásos fehérje alegység arányok és ennek következtében a glutenin fehérje polimerek szerkezete megváltozott. Ezek a változások befolyásolták a raktározás hatékonyságát, mely kihatással van a teljes szem fejlődésére. A transzformáns genotípust bár szignifikánsan kisebb átlagos szemátmérő jellemzi, terméshozamban ennek ellenére nem találtunk különbséget a transzformált és a kontroll vonal között. Erre magyarázatul szolgálnak Barro és mtsai. (2002)-nak eredményei akik kimutatták, hogy a transzgénikus vonal és az eredeti genotípus között genetikailag meghatározott különbség van a kalászolási idő és a kalászonkénti kalászkaszám fenotípusos tulajdonságok esetén. Genetikai vagy biokémiai alapon nincs magyarázatunk, de elképzelhető, hogy a

Old alsz


szén/nitrogén egyensúlyban van különbség a két törzs között illetve ezek kalászon belüli eloszlásában. A szántóföldi kísérlet két évében komoly szárazság volt áprilistől. Korábbi tanulmányokban kimutatták, hogy a magas hőmérséklet és a szárazság stressz hatására megnő a gluteninek mennyisége, miközben a gliadinok mennyisége relatíve állandó marad. Triboi és mtsai (2000) szerint a környezeti tényezők közül a kijuttatott nitrogéntrágya mennyiségének van a legnagyobb hatása a mag összes fehérjetartalmára és összetételére. Szilágyi és mtsai. (2000) eközben megállapították, hogy nagyobb mennyiségű N forrás esetén a glutenin mennyisége sokkal nagyobb mértékben nőtt, mint a gliadin tartalom. A környezet hatásánál a genetikai tényezők szerepe azonban elsődlegesen meghatározó. 6.1.3 A Bx7 tartalékfehérje alegység mennyiségi vizsgálata 6.1.3.1 Az

1Bx7

tartalékfehérje

túltermelő

genotípusok

és

utódnemzedékeik

fehérjeösszetételének vizsgálata Egyes búzafajták, mint például a kanadai ’extra strong hard red’ csoportba tartozók, alapállapotban is túltermelnek bizonyos fehérje alegységeket. A martonvásári nemesítési programok egyik célja ezen túltermelő genotípusok azonosítása és forrásként való felhasználása. A régi magyar búzafajták és tájfajták fontos génforrásai lehetnek a minőségre történő nemesítésnek. A stabilan jó minőségéről ismert Bánkúti 1201 tartalékfehérje összetételének azonosítása, a fajtában előforduló allélek izolálása lehetővé teszi a fajtában rejlő jó sütőipari technológiai tulajdonságok modern fajtákba történő beépítését. A Bánkúti 1201 törzsek jó minőségének okát keresve, korábbi tartalékfehérje vizsgálatok alapján kiderült, hogy egyes Bánkúti 1201 törzsek túltermelők Bx7 alegységre nézve (Juhász és mtsai 2003). RP-HPLC-vel megvizsgáltuk a Bánkúti 1201 törzsek HMW és LMW glutenin összetételét és a különböző fehérjealegységek relatív mennyiségét. A Bx7 alegység relatív mennyisége alapján a törzsek három csoportját különböztettük meg. A Glu-B1-en 7+8 allélösszetételű törzsek 60 mol%, míg a 7+9 allélösszetételűek 50 vagy 35 mol% körüli mennyiségben tartalmazták a Bx7 fehérjealegységet. Ezek közül három 7+9-es, egyenként 55, 39 és 34 mol% Bx7 tartalmú törzzsel végeztünk keresztezéseket. A keresztezésekhez főként 7+9-es allélösszetételű martonvásári búzafajtákat használtunk szülői partnerként, míg az Ukrainka 7+8-as allélpárt tartalmazott. Az Mv Emma, az Mv Magvas és az Ukrainka megközelítően 36-36%, míg az Mv Magdaléna 49%-t, azaz a többinél jóval nagyobb mennyiségű Bx7 fehérjealegységet tartalmazott (6., 7. ábra).

Old alsz


6. ábra Kontroll fajták és a keresztezésekhez használt egyes genotípusok tartalékfehérje összetétele 70 60

mol%

Ax 50

Bx

40

By Dx

30

Dy

20

Bx/By x/y

10 0 Ch. Spring n 7+8 2+12

Cheyenne

Glenlea

2* 7+9 5+10 2* 7+8 5+10

Red River

Bánkúti1201

N93-3026

1 7+8 5+10 2*B 7+8 2+12 2* 7+8 5+10

60 50

Ax Bx

mol%

40

By 30

Dx Dy

20

Bx/By x/y

10 0 Mv 2

Ukrainka

Magvas

Emma

Magdaléna

2* 7+8 5+10

1 7+8 5+10

1 7+9 5+10

2* 7+9 5+10

2* 7+9 2+12

A Bánkúti 1201-hez hasonló minőségi csoport, amit Kanadában az un. extra strong hard red (extra erős kemény- és pirosszemű) csoportnak neveznek, jó őrlési tulajdonságokkal, nagy fehérjetartalommal, erős, de kiválóan nyújtható tészta tulajdonságokkal rendelkező búzafajtákat foglal magába. A csoportba tartozó kanadai tavaszi búzafajta a Glenlea, minőséget meghatározó jellegzetes allélei közül izolálták és jellemezték az 1Dx5, a túltermelő 1Bx7 HMW glutenin valamint az 50 és 8-as LMW glutenin alegységeket (Cloutier és mtsai 1998). A Bánkúti1201 törzsek mellett további keresztezéseket végeztünk az említett minőségi csoportba tartozó, Glenlea és az N93-3026 genotípusokkal, melyek bizonyítottan túltermelőek Bx7 alegységre nézve. A szelekció során fennmaradt N93-3026/Mv2 törzseket szintén

Old alsz


megvizsgáltuk. A keresztezésnél szülőként használt N93-3026 és Mv2 genotípusok 7+8 allél összetételűek és sorban 63 és 32 mol% Bx7 fehérjealegységet tartalmaztak (7. ábra). A fajták Glu-B1-en kódolt y típusú alegységeinek relatív mennyisége a HMW gluteninek teljes mennyiségére vonatkoztatva, 9, 5 és 8 mol% volt a Bánkúti 1201 (11314), az Mv Magdaléna valamint az N93-3026 törzsekben. A többi fajtáé 14 és 18 mol% között változott. 7. ábra

A keresztezésekhez felhasznált szülői genotípusok és az utódnemzedékek különböző csoportjainak átlagos Bx7 tartalma 60

Bx7 (mol%)

55 50 45 40 35

Bánkúti1201 (11295)

Magdaléna

Emma

Magvas

Ukrainka

/Magdaléna

/Emma

/Magvas

/Ukrainka

7+9

7+9

7+9

7+9

7+9

7+8

7+9

7+9

7+9

7+8 7+9

7+8

7+8

Mv 2

35

N93-3026/MV2 (7217)

7+8

40

N93-3026/MV2 (7218)

45

N93-3026/MV2 (7215)

50

N93-3026/MV2 (7214)

Bx7 (mol%)

55

N93-3026/MV2 (7213)

60

Kiugró v. 7+8 átlag

N93-3026/MV2 (7216)

65

N93-3026/MV2 (7219)

N93-3026

Bx7 átlag

11314/

Bánkúti1201 (11310)

7+9

11310/

Bánkúti1201 (11314)

25

11295/

30

7+8

7+8

30 7+8

7+8

7+8

7+8

A Bx7 normál és túltermelő kontroll genotípusok közül normál termelő a Glu-B1-en 7+8 allélpárt hordozó Chinese Spring és 7+9 allélpárt hordozó Cheyenne. A túltermelő Glenlea, N93-3026 és a Red River 46, 48 és 62 mol% Bx7 alegységet tartalmaztak. A Bánkúti 1201 Old alsz


7+8 allélpárt tartalmazó törzsei közül a 62 mol% átlagos Bx7 tartalommal rendelkezők mind 7+8 allélpárt tartalmaztak, ugyanakkor a 7+9 allélpárt tartalmazók 36 vagy 52 mol% átlagos Bx7 tartalommal rendelkeztek (6. ábra). A keresztezési program során létrehozott F3 utódnemzedék tartalékfehérje összetételének, illetve az alegységek mennyiségének statisztikai elemzése céljából, csoportokat hoztunk létre a szülői partnerek és azok HMW-glutenin tartalmának különbözősége alapján. Az egyes csoportok mintaszáma különböző volt, ezért első lépésben Bartlett próbával ellenőriztük, hogy az adatsorok szórása megközelítőleg egyforma-e (I. táblázat, Függelék). Amennyiben χ2 értéke nagyobb, mint a megfelelő FG-re megadott táblázat χ2

1%

érték, levonhatjuk azt a

következtetést, hogy P=2% szinten az egyedi csoportok adott minőségi tulajdonságának szórásai között szignifikáns a különbség (adott csoport kiegyenlítetlenebb, nagyobb szórású, mint a csoportok átlaga). Másrészt ha χ2 értéke kisebb, mint a P=99% -ra megadott kritikus érték az adott csoport kiegyenlítettebb, kisebb szórású, mint a csoportok átlaga. χ2total értékei alapján az adatsorok kiugró értékeket tartalmaztak. Ezek eltávolításával χ2total értékei a kritikus értékek által körülhatárolt intervallumba esnek, melyből következően a varianciaanalízis a csoportokra elvégezhető. A Bánkúti 1201 keresztezésekhez három különböző Bx7 HMW glutenin tartalmú törzset választottunk valamennyit 7+9 allélösszetétellel. Annak ellenére azonban, hogy a három Bánkúti 1201 törzs Bx7 alegységtartalma között szignifikáns volt a különbség, a keresztezési programban velük létrehozott F3 utódnemzedék törzsei között nem volt szignifikáns a különbség Bx7 alegység tekintetében bármely martonvásári fajtával történt is a keresztezés. Szignifikáns volt azonban a különbség az Mv Magdalénával keresztezett három Bánkúti 1201 törzs By alegységei között valamint az Ukrainkával keresztezett három Bánkúti 1201 törzs By és Dy alegységeinek mennyisége között. Ugyanazon Bánkúti 1201 törzset négy különböző fajtával keresztezve szignifikáns különbséget találtunk szinte valamennyi HMW glutenin alegység relatív mennyiségében (II. táblázat, Függelék). A törzsek közül a legnagyobb Bx7 arányt a minőségjavító Mv Magdaléna búzafajtával keresztezett Bánkúti 1201 törzsek adták, mely nem meglepő, hiszen a fajták közül az Mv Magdaléna 49 mol% Bx7 tartalékfehérje alegységet tartalmazott szemben a többi fajta 36 mol%-ával. Hasonló tendencia figyelhető meg az Mv Emma utódainál is azonban ez esetben jóval kisebb mintaszám vizsgálatát vehetjük alapul. A többi alegység, így a By, Dx, Dy, és Ax mennyisége általában alacsonyabb volt, mint a keményszemű, malmi búzafajtákkal (Mv Magvas, Ukrainka) keresztezett Old alsz


törzseké. Az F4 11310 Bánkúti 1201 keresztezéseiben a By, az F4 11314-ében pedig a By, a Dx és az Ax alegységek mennyiségének átlagai között nem volt szignifikáns a különbség. A Bx7 alegységet legnagyobb mennyiségben termelő F4 11314 Bánkúti 1201 törzs és az Mv Magdaléna keresztezéséből származó vonalak a vártnál jóval alacsonyabb mennyiségű Bx7 alegységgel rendelkeztek (7. ábra). Az ábrán külön feltüntettünk néhány az átlagtól lényegesen nagyobb Bx7 aránnyal rendelkező törzs átlagadatait is. Ezek elsősorban az Mv Magdaléna keresztezéseiből utódnemzedék

kerültek valamennyi

ki.

SDS-PAGE vizsgálatokkal

tagja

az

Ukrainka

megállapítottuk,

keresztezéseinek

hogy az

kivételével

7+9

allélösszetételűek voltak. Az Ukrainka keresztezéseiből származó utódok néhány kivételtől eltekintve 7+8-as allélpárt tartalmaztak. Az N93-3026 és az Mv2 keresztezéséből négy olyan vonal származik, melyekben a Bx7 alegységek relatív mennyiségének aránya magas, 43-45 mol% volt. Ez az érték azonban a Bx7 túltermelő N93-3026 szülő alegység túltermelésének szintjét meg sem közelíti. A keresztezésből származó valamennyi törzsben a Bx7-es alegység a By8-as alegységgel együtt fordul elő (7. ábra). A Bánkúti 1201 és az N93-3026 szülői partnerek tartalékfehérje összetétele és az alegységek mennyiségi arányai nagy változatosságot mutattak, a változatosság azonban a keresztezések során létrehozott utódnemzedékekben az előbbiek alapján vártnál kisebb volt. Néhány törzs, melyek elsősorban az Mv Magdaléna és az Mv Emma keresztezései közül kerültek ki 50 mol%-nál nagyobb arányban tartalmazták a Bx7 tartalékfehérje alegységet. Ugyanakkor a 45 mol% Bx7 tartalmat megközelítő, az N93-3026 keresztezésének utódai között talált törzsek is különös figyelmet igényelnek. Felmerült a kérdés, hogy ezek a törzsek vajon genetikailag meghatározott alapon termelik-e túl a Bx7 alegységet vagy esetleg egyéb tényezők (évjárat hatás, műtrágyázás stb.) befolyásolták a fehérje alegységek expressziójának mértékét. Ennek bizonyítására DNS alapú vizsgálatokat végeztünk. A tartalékfehérje összetétel rutinszerű vizsgálata egy nemesítési program során meglehetősen hosszadalmas a nagy mintaszám miatt. Előnyösebb az allél összetételt DNS alapon PCR technikával meghatározni. A DNS alapú vizsgálatok előnye, hogy nincs szükség érett magokra és már az F2 nemzedékben elkezdhető a szelekció. A Bx7 alegység túltermelésének azonosítására Gárdonyi és mtsai (2004) markert terveztek. Ennek felhasználásával azonosítottuk a túltermelő törzseket. Old alsz


Első lépésben a Bánkúti 1201 és az N93-3026 keresztezéseiből származó törzsekből DNS-t izoláltunk, különös tekintettel azokra, amelyekben nagy (50mol% és 40mol%fölött) volt a Bx7 tartalékfehérje alegység mennyisége a HPLC vizsgálatok alapján. A Bx7 fehérjét kódoló gén promóterében kerestük azt a 43 bp hosszú inszerciót, amely a túltermelést genetikailag is alátámasztja. Az eredmények alapján megállapítottuk, hogy a Bánkúti 1201 törzsek és az Mv Magdaléna keresztezéséből származó utódok még 50mol% Bx7 tartalom felett sem tartalmazták a keresett inszerciót. Az N93-3026 keresztezéseiből származó utódok közül a 45mol% volt az a körülbelüli Bx7 tartalom, amelynél a túltermelést feltételeztük. Bebizonyosodott, hogy az a négy törzs, melynek 43mol% fölött volt a Bx7 fehérje alegység tartalma, mind tartalmazta promóterében az inszerciót (8. ábra). Mindezt annak ellenére, hogy a fehérje alegység expressziós szintje meg sem közelítette az N93-3026 szülőét. Ugyancsak megjelent az inszerció a kontrollként használt túltermelő törzsekben (Glenlea, Red River stb.). Megállapítottuk, hogy a DNS marker felhasználásával kimutatott Bx7 alegység túltermelés valamennyi esetben, azokban a törzsekben és fajtákban jelent meg ill. volt kimutatható, ahol a Bx7-es alegység mellett a By8-as alegység jelent meg. A genetikailag is bizonyítottan 1Bx7 túltermelő és a normál termelő genotípusok minőségi tulajdonságait gyorsvizsgálati módszerrel összehasonlítottuk és megállapítottuk, hogy a vizsgált törzsek esetén nincs szignifikáns különbség a törzsek fehérje-, sikértartalma és Zeleny értéke között. (FOSS Tecator, II.B. táblázat Függelék). 8.ábra

A Bx7 fehérje alegység túltermelésének vizsgálata DNS markerrel a

fehérjevizsgálatok alapján nagy Bx7 alegységtartalmú törzsekben

6.1.3.2

Értékelés

Old alsz


A martonvásári nemesítési programok egyik fő célja olyan kiváló sütőipari tulajdonságokkal rendelkező búzafajták nemesítése, melyek a különböző környezeti feltételekhez kiválóan alkalmazkodnak és jó betegségellenálló képességgel is rendelkeznek. E cél megvalósítása érdekében a világ különböző tájairól származó genotípusokat, mint génforrásokat használja fel a nemesítő. Jelen tanulmányban a jó minőséggel összefüggésbe hozott és a tészta stabilitásnövelő hatásáról ismert 1Bx7 alegységet túltermelő kanadai genotípusokat és régi magyar fajtákat használtuk fel célunk megvalósítása érdekében, elkerülve a transzformált törzs kísérletbe vonását. E genotípusok felhasználásával nemcsak hogy az 1Bx7 alegység mennyiségi arányának és ezzel a tészta stabilitásának növekedését érhetjük el az utódnemzedékben, de a régi magyar tájfajták felhasználásával a genetikai diverzitás növeléséhez is hozzájárulhatunk. A keresztezési programok során kapott eredményeink rámutattak arra, hogy az utódnemzedék HMW glutenin alegység összetétele és az alegységek mennyiségi arányainak alakulása meglehetősen

komplex.

Egyrészt

megállapítottuk,

hogy

a

Bx7

fehérje

alegység

túltermelésének mértéke illetve az alegységek mennyiségi arányai az utódnemzedékben nem feltétlenül azonosak valamely szülői genotípuséval. Ugyanakkor az eredmények azt is mutatják, hogy a magas Bx7 fehérje expressziót mutató genotípusok nem feltétlenül genetikailag meghatározott alapon termelik túl az alegységet illetve általunk eddig ismeretlen genetikai tényezők is lehetnek. A genetikai faktorokon kívül az előző kísérlethez hasonlóan itt is figyelembe kell vennünk, hogy a környezet is befolyásolhatja az eredményeket. Így a N ellátottság vagy a hőstressz is, mely utóbbi jelentős hatással volt az előző évek termésére (Triboi és mtsai. 2000, Szilágyi és mtsai. 2000). Megállapítottuk azt is, hogy a Bx7 alegység túltermelése kísérletünkben minden esetben az 1By8 alegység együttes jelenlétével járt. Az x és az y alegységek aránya kiugróan magas, a többitől szignifikánsan eltérő volt az Mv Magdaléna és az N93-3026 szülői genotípusok esetén. Az utódnemzedékben azonban sem az x/y sem a HMW/LMW arány nem adott számottevő szignifikáns eltérést. Az 1Dx5 HMW-glutenin túltermelésénél tapasztaltakhoz hasonlóan az 1Bx7 alegység túltermelésének hatása is elsősorban az x/y alegységek arányának jelentős mértékű eltolódásában tükröződött. Ez az előző fejezetben már megemlített ’in vitro’ tanulmányok eredményeinek megfelelően utal arra, hogy a funkcionális tulajdonságokban sem várható lényeges különbség a törzsek között. Ezt az F3 generációban végzett gyorsvizsgálati (NIR) eredmények tükrözik is. Old alsz


A fentiekben számbavett egyéb tényezők figyelmen kívül hagyása érdekében, a túltermelés genetikai úton való tesztelése indokolt. A Bx7 tartalékfehérje alegység túltermelésének tesztelésére Gárdonyi és mtsai. (2004) markert terveztek. Ehhez a munkához a Bánkúti 1201 törzseit vették alapul, mivel bebizonyosodott, hogy számos Bánkúti 1201 törzs túltermeli a Bx7 fehérje alegységet (Juhász és mtsai 2003). Funkcionális vizsgálatok szerint a Glu-B1 lókuszon 7+8 allélpárt hordozó Bánkúti 1201 törzsek általában jobb minőségű lisztet adnak, mint a 7*+9 allélpárt hordozók, mivel a Bx7 HMW fehérje általában jóval nagyobb mennyiségben termelődik, mint a Bx7*. Megállapították, hogy a Bx7 alegységet kódoló szekvencia 18 bázispárral hosszabb, mint a Bx7* glutenin géné. Ennek a 18 bp méretű duplikációnak a jelenléte PCR marker segítségével megállapítható és így a 7+8 allél kombinációt hordozó növények egyértelműen azonosíthatók. A 7+8 allélpár jelenléte azonban nem mindig jár együtt a Bx7 HMW glutenin alegység túltermelésével. A Bx7 fehérjét kódoló gén promóterében azonban sikerült azonosítani egy 43 bp hosszú inszerciót, amely csak a túltermelő törzsekben van jelen. Az inszerció jelenlétének kimutatására újabb PCR markert terveztek és megállapították, hogy az inszerció jelenléte korrelál a Bx7 fehérje túltermelésével. Ezt a markert használtuk fel a markerszelekciós vizsgálatokhoz az utódgeneráció F3 nemzedékében. Az eddigi vizsgálatok alapján a marker alkalmas a genetikailag meghatározott módon 1Bx7 túltermelő genotípusok azonosítására. Mindemellet azonban megjegyzendő, hogy még nem ismert, hogy vajon valamennyi illetve csak és kizárólag a Bx7 túltermelő genotípus promótere tartalmazza-e az azonosításra használt inszerciót.

6.2

A szemkeménység és a puroindolin gének hatása a búza minőségére Old alsz


6.2.1 Az endospermium szerkezet és a puroindolin fehérje vizsgálatokban felhasznált törzsek A szem endospermium szerkezetének vizsgálatához a szántóföldi kísérletekben termesztett F3, F4 és F5 generációjú törzseket használtuk fel (1999 és 2001 között) valamint az elmúlt 50 év köztermesztésben levő fajtáit. Ezen felül kontrollként különböző ploidfokú búzával rokon vad fajokat is bevontunk a vizsgálatba. (III. táblázat, Függelék)

6.2.2 Egyes technológiai tulajdonságok és a szem endospermium szerkezetének változása eltérő generációkban a búzánál (Triticum aestivum L.) A korábbi időszakban a búza szelekciója a malom- és sütőipari tulajdonságok alapján történt, és csak közvetett módon törekedtek a nemesítők a kemény-, acélos szemű búzafajták előállítására. A NIR alapon működő készülékek, valamint a szemkeménység vizsgáló SKCS 4100 megjelenésével a nemesítési programban lehetővé vált egyrészt a szemkeménység javítását, másrészt a jelenlegi szemkeménység megtartását célzó kutatási program kialakítása. A szelektált F3 törzsek szemtermésének endospermium szerkezetét vizsgálva megállapítottuk, hogy a törzsek széles variációt mutattak. A puhaszemű csoportba sorolható a vizsgált 869 törzsből 120, mivel szemkeménység (hardness) indexük 40–nél kisebb volt. Az átmeneti csoportba (40 és 50 közti szemkeménység index) 118 törzs sorolható, míg a legnagyobb csoportot az 50 és 70 hardness indexű, keményszemű törzsek alkották. Az előzőhöz 280, míg az utóbbihoz 295 törzs tartozik. Még e két csoportnál is keményebb endospermium szerkezetű, azaz 70-nél nagyobb értékű volt 56 törzs. A felsoroltak alapján látható, hogy a 869 törzsből 631 kemény vagy igen kemény kategóriába tartozik, ami a teljes vizsgálati anyag 72,7 %-át teszi ki. Az F3 törzsek szemtermésből vizsgált különböző szemkeménységű csoportok nedvessikér tartalmának, Zeleny szedimentációs értékének, valamint a farinográfos vízfelvételének változását az IV. táblázatban (Függelék) foglaltuk össze. Az adatokból látható, hogy a szemkeménység növekedésével egyenes mértékben nőtt a törzsek nedvessikér tartalma. A 40 hardness index alatti, azaz puhaszemű törzsekhez képest szignifikánsan nagyobb volt már az átmeneti, 40–50 szemkeménységű csoport nedvessikér tartalma, és mindenegyes, ennél nagyobb szemkeménységű csoportban fokozatosan, és szignifikánsan tovább nőtt a nedvessikér tartalom. A 60–nál nagyobb szemkeménységű törzsek átlagos nedvessikér tartalma meghaladta a 34 %-ot, tehát e tulajdonság alapján a javító minőségű búzák csoportjába sorolhatók.

Old alsz


Érdemes megjegyezni, hogy a minimum és a maximum értékeket összehasonlítva a legnagyobb maximum nedvessikér tartalmat az 50 és 60 közti szemkeménységű csoportban lehetett megtalálni. Ez a Bánkúti 1201 technológiai típusú törzsekre jellemző elsősorban. Az Mv Pálma és hasonló genotípusok ugyanakkor nagyobb szemkeménységűek, de kevésbé lehet szelektálni kiugróan nagy nedvessikér tartalmú törzseket. Mindenesetre az biztató, hogy a 70– nél nagyobb szemkeménységű törzseknél a minimális érték is meghaladta a malmi búza szabvány 28 %-os határát. A Zeleny szedimentációs érték hasonlóan alakult, mint a nedvessikér esetében látható volt. A legkeményebb, 70-es értéknél nagyobb keménységű csoport kivételével a puhaszemű törzsekhez képest mintegy 10–el, lépcsőzetesen nőtt mindenegyes csoport átlaga, ami jóval meghaladja a szignifikáns különbség határát. Mivel a Zeleny szedimentációs érték többek között a kenyértérfogatra ad megbízható előrejelzést. Értékének növekedése a sütőipari tulajdonságok javítását is maga után vonja. A Zeleny szedimentáció szélső értékeit áttekintve megállapíthatjuk, hogy a 60–nál nagyobb szemkeménységű törzsek minimum értéke 35 volt, míg a maximum a 75–öt is elérte, illetve meghaladta. A farinográfos vízfelvevő képesség és a szem endspermium szerkezet közti összefüggések széleskörűen ismertek. Az F3 nemzedékben szelektált törzsek eredményei jól igazolják, hogy a keményebb szemű búzatörzsek nagyobb farinográfos vízfelvevő képességgel rendelkeznek, és az egyes csoportok közti különbségek minden esetben meghaladták a szignifikancia határát. Hasonlóan a Zeleny szedimentációnál tett megállapításunkra, itt is elmondhatjuk, hogy a 60 -nál nagyobb szemkeménységű összes törzs vízfelvevő képessége megbízhatóan jó, vagy kiváló. Ugyanakkor 50 és 60 keménység érték között jelentősen nagyobb lett a szórás értéke. A szemkeménység Pearson-féle korrelációs értékeit vizsgálva az egyes minőségi tulajdonságok és a különböző szemkeménységi csoportok között elmondható, hogy az összes törzs szemkeménysége igen szorosan korrelált a farinográfos vízfelvétellel valamint a Zeleny szedimentációs értékkel, de még a nedvessikér tartalommal is 0,1 %-os szignifikancia szinten volt megbízható összefüggés (V. táblázat, Függelék). Az egyes szemkeménységi csoportokat vizsgálva megállapítható, hogy a nedvessikér tartalommmal a 40 keménységi értéknél puhább szemű törzsek mutattak közepes erősségű összefüggést, ugyanakkor a farinográfos vízfelvétellel minden csoport szorosan korrelált. A szemkeménységi csoportok és a Zeleny szedimentációs értékek összefüggése a szem keménységének növekedésével fokozatosan kisebb lett.

Old alsz


Az F4 generáció törzseinek vizsgálati eredményeit a VI. táblázatban (Függelék) foglaltuk össze. Ebben a szelekciós fázisban összesen 254 törzs vizsgálatát végeztük el. A minőségi tulajdonságokat NIR készülékkel mértük, meghatároztuk az egyes minták szemkeménységét, nedvessikér tartalmát, Zeleny szedimentációs értékét valamint farinográfos vízfelvevő képességét. Az F4 törzsek szemtermésének keménységi adatai 26,7 és 92 között változtak, az átlagos érték meghaladta a 60-t. A törzsek kb. 17%-a tekinthető puhaszeműnek, illetve átmeneti típusúnak (keménység érték 50 alatti), több mint 82% kemény endospermium szerkezetű. A 254 törzsből 14 törzs esetében mértünk 80 feletti keménység értékeket. Igen széles variációt mutat a vizsgált törzsek Zeleny szedimentációs értéke (18,6-78,5), valamint a fehérjetartalom (10,2-16,6%). Az eredmények alapján megállapítható, hogy valamennyi vizsgált minőségi tulajdonság javult a szemkeménység növekedésével. Kisebb mértékű a változás a nedvessikér- és a fehérjetartalomban, ugyanakkor a Zeleny érték és a farinográf vízfelvétel fokozatos növekedése figyelhető meg a nagyobb szemkeménységgel. Különösen érvényes ez a megállapítás a 70-nél nagyobb szemkeménységű törzsek Zeleny értékére és farinográf vízfelvevő képességére. Az F4 törzsek Pearson-féle korrelációs értékeit vizsgálva megállapítható, hogy az összes törzs szemkeménysége – az F3 generációban kapott eredményekhez hasonlóan – szoros összefüggést mutatott a Zeleny szedimentációs értékkel, valamint a farinográfos vízfelvevő képességgel, közepes volt a korreláció a nedvessikér- és fehérjetartalom, valamint a szemkeménység között (VII. táblázat, Függelék). Míg az utóbbi tulajdonságra valamennyi keménységi csoport esetében erősen szignifikáns és szoros összefüggést tapasztaltunk, a többi minőségi paraméter esetében a korreláció mértéke és szorossága a keménységi érték növekedésével nőtt. Az F5 nemzedékben levő törzseket vizsgálva elmondható, hogy összesen 492 törzs szelekcióját és minőségi vizsgálatát végeztük el ugyancsak NIR technikán alapuló készülékkel. A keménység értékek 39,2 és 111,2 között változnak. Összesen 51 törzs esetében mértünk 50 alatti keménységi értéket, ennek megfelelően a törzsek 10,37%-a tekinthető puhának. A 492 törzs 58,3%-ának, 287 törzsnek a keménysége a 70 és 90 közötti tartományba esik és több mint 10% meghaladja a 90 feletti értéket, ami már a durum búza keménységének megfelelő érték. A törzseket keménységük alapján csoportosítottuk és vizsgáltuk az egyes csoportok minőségi tulajdonságait, valamint megállapítottuk az egyes csoportokban a keménység és a minőségi tulajdonságok közötti összefüggéseket (VIII. táblázat, Függelék). A szemkeménység alapján Old alsz


az egyes csoportokba tartozó törzsek valamennyi esetben szignifikánsan különböztek egymástól mind a három vizsgált minőségi tulajdonságra. Egyedül a sikértartalom esetében az 50-60 ill. a 60-70 keménységi csoportokba tartozó törzsek nem különböztek egymástól jelentősen. A tulajdonságok és a keménység közötti Pearson korrelációs értékek a IX. táblázatban (Függelék) találhatóak. A táblázatból megállapítható, hogy a keménységi értékek erősen szignifikáns és szoros összefüggést mutatnak a vízfelvétellel és a szedimentációs értékkel. Az egyes keménységi csoportoknál a keménységi értékek ebben az estben is szignifkáns és szoros összefüggésben állnak a vízfelvétellel mind a három minőségi csoportban és az összefüggések erőssége a keménységi értékek növekedésével nő. Ugyanakkor a 60-70 keménységi csoportba tartozó törzsek esetén a vízfelvétel kivételével nem találtunk szignifikáns összefüggéseket a funkcionális tulajdonságok és a keménységi értékek között. 6.2.3 Értékelés Magyarországon egyrészt a jó malomipari tulajdonságokkal másrészt a jó sütőipari tulajdonságokal rendelkező búzafajtákat kedveli a feldolgozóipar. A két kritérium együttes teljesülése nagy előnyt jelent a malom és sütőipar kapcsolatában. Vizsgálatainkkal megállapítottuk, hogy szoros összefüggés van az endospermium szerkezet és a farinográfos vízfelvétel között. A törzsek fehérjetartalmát, nedvessikér tartalmát és Zeleny értékét vizsgálva elmondhatjuk, hogy a törzsek szemtermése mindenegyes szemkeménységi csoportban különbözött egymástól, és a keménység növekedésével általában javultak a vizsgált technológiai tulajdonságok. Ezek alapján a szemkeménység alapja lehet a sütőipari minőségre történő indirekt szelekciónak, de a korlátozó tényezők meghatározása természetesen még további vizsgálatot igényel. Figyelembe kell például vennünk, hogy a fehérje, a nedvessikér tartalom és a Zeleny szedimentáció keménységgel illetve endospermium szerkezettel való összefüggése egyrészt függ az őrlési technológiától másrészt a vizsgált genotípusok tartalékfehérje összetételének különbségei torzíthatják azt. Jó malom és sütőpari minőségű genotípusok nemesítéséhez tehát alapvetően két egymástól eltérő tulajdonság-csoport együttes figyelembe vétele szükséges, még abban az esetben is ha a törzsek többsége leginkább 2* 7+9 5+10 HMW glutenin allélkombinációval rendelkezik és azonos őrléstechnikát alkalmazunk valamennyi vizsgált mintánál. A kapott eredmények alapján az endospermium szerkezet javítása és keményszemű búza genotípusok szelekciójának keretében keresztezést végzünk kemény x kemény endospermium szerkezetű szülőpartnerekkel, és a szelekció során a meglévőknél keményebb szemű Old alsz


genotípusokat válogatunk ki. A nemesítési program alapvetően az alábbi három fázisra bontható fel: A nemesítés első fázisában, amely F3 generációig tart, kalász- és törzsszelekció történik a növénymagasság, a bokrosodóképesség, a gombabetegségekkel szembeni rezisztencia, a kalászolási idő, és más, a tenyészidőszakban vizuálisan

megítélhető tulajdonság

figyelembevételével. A második fázisban csoportosítjuk a törzseket 50 és 70, valamint 70-nél nagyobb szemkeménység indexű csoportba, megállapítjuk azok nedvessikér tartalmát, Zeleny szedimentációs értékét, valamint a fehérjetartalmát NIR gyorsvizsgáló készülékkel. A harmadik fázisban kerül sor a technológiai minőség széleskörű vizsgálatára (farinográf, sikér mennyisége és minősége, sütéspróba, esésszám, stb.), a minőségi jellegek stabilitásának meghatározására. Ez a periódus kiegészül a több termőhelyen történő teljesítmény vizsgálattal, ami ezen vizsgálatokkal ugyanúgy részletesen tanulmányozza a fejlett törzsek minőségi jellemzőit, mint a termőképességét. A kemény x kemény szemtípusú szülők keresztezése mellett a nemesítési programban puhaszemű szülőpartnereket is felhasználunk azzal a céllal, hogy javítsuk az új keményszemű fajták termőképességét, abiotikus és biotikus rezisztenciáját. Ennek érdekében a puhaszemű forrásokat keresztezzük

kemény endospermium szerkezetű szülőpartnerekkel, majd

megkíséreljük a puhaszemű szülő jó tulajdonságait az új, kemény endospermium szerkezetű genotípusba beépíteni. A nemesítés első fázisában a növénytípusra, rezisztenciára történő kiválogatás, a tenyészkerti vizuális szelekció az elsődleges, hasonló módon, mint az első nemesítési programban. A második szakaszban olyan keményszemű genotípusokra végzünk szelekciót, melyek keménységi indexe meghaladja az 50-et, az elvégzett minőség vizsgálatok egyébiránt azonosak az első programban leírtakkal. A harmadik fázis annyiban tér el az első programtól, hogy nagyobb figyelmet szentelünk a szemkeménység stabilitás ellenőrzésének.

6.2.4 A puroindolin gének jelentősége az endospermium szerkezettel kapcsolatos vizsgálatokban Az elmúlt ötven év köztermesztésben szereplő fajtáinak vizsgálatakor megállapítottuk, hogy a keménységgel összefüggésbe hozható puroindolin-a és b gének megtalálhatók valamennyi Old alsz


fajtában. A fajták szemkeménysége tehát egyetlen esetben sem hozható összefüggésbe a puroindolin-a hiányával. Néhány köztermesztésben szereplő fajta, illetve az előző fejezetekben kísérleti céllal felhasznált genotípusok puroindolin-b génjét megszekvenáltuk az előforduló mutációtípusok beazonosítása érdekében. Az eredmények szerint a puroindolin-b gének nagy része vad típusú, azaz nem tartalmaz mutációt, akad azonban néhány kivétel. A vizsgált hexaploid fajták közül említésre méltó a Bánkúti 1201, mely a puroindolin-b génben egy glicin(46)-szerin (46) mutációt tartalmaz, melyet az egyik szülőtől a Marquis búzafajtától örökölt. A szekvencia csere azáltal befolyásolja a szemkeménységet, hogy a hidrofóbicitás csökkenése következtében csökken a puroindolinek lipidkötő képessége, a lipidkötés erőssége. Az 1Dx5 HMW glutenin génnel transzformált B73-6-1 puroindolin b génje szintén pontmutációt tartalmaz, melynek következtében a Cys (29) aminósavat Arg (29) *

100

*

120

*

140

*

160

gaagttggcggaggaggtggttctcaacaatgtccgcaggagcggccgaagctaagctcttgcaaggattacgtgatggag helyettesíti.:: (9.táblázat, 9.ábra). GAAGTTGGCGGAGGAGGTGGTTCTCAACAATGTCCGCAGGAGCGGCCGAAGCTAAGCTCTTGCAAGGATTACGTGATGGAG purbrovid Bankuti120 Glenlea B73-6-1 L88-6

: : : GAAGTTGGCGGAGGAGGTGGTTCTCAACAATGTCCGCAGGaGCGGCCGAAGCTAAGCTCTTGCAAGGATTACGTGATGGAG : : GAAGTTGGCGGAGGAGGTGGTTCTCAACAATGTCCGCAGGAGCGGCCGAAGCTAAGCTCTTGCAAGGATTACGTGATGGAG : : GAAGTTGGCGGAGGAGGTGGTTCTCAACAATGTCCGCAGGAGCGGCCGAAGCTAAGCTCTTGCAAGGAtTACGTGATGGAG : GAAGTTGGCGGAGGAGGTGGTTCTCAACAATGTCCGCAGGAGCGGCCGAAGCTAAGCTCTTGCAAGGATTACGTGATGGAG sorrend:

162 162 162 162 162

9. ábra Hexaploid búzafajták puroindolin-b génjének és termékének összehasonlítása

Nukleotid

purbrovid Bankuti120 Glenlea B73-6-1 L88-6

: : : : :

* 180 * 200 * 220 * 240 cgatgtttcacaatgaaggattttccagtcacctggcccacaaaatggtggaagggcggctgtgagcatgaggttcgggag CGATGTTTCACAATGAAGGATTTTCCAGTCACCTGGCCCACAAAATGGTGGAAGAGCGGCTGTGAGCATGAGGTTCGGGAG CGATGTTTCACAATGAAGGATTTTCCAGTCACCTGGCCCACAAAATGGTGGAAGGGCGGCTGTGAGCATGAGGTTCGGGAG CGACGTTTCACAATGAAGGAtTTTCCAGTCACCTGGCCCACAAAATGGTGGAAGGGCGGCTGTGAGCATGAGGTTCGGGAG CGATGTTTCACAATGAAGGAtTTTCCAGTCACCTGGCCCACAAAATGGTGGAAGGGCGGCTGTGAGCATGAGGTTCGGGAG CGAtGTTTCACAATGAAGGATTTTCCAGTCACCTGGCCCACAAAATGGTGGAAGgGCGGCTGTGAGCATGAGGTTCGGGAG

: : : : :

243 243 243 243 243


: : : : :

* 260 * 280 * 300 * 320 aagtgctgcaagcagctgagccagatagcaccacaatgtcgctgtgattctatccggcgagtgatccaaggcaggctcggt AAGTGCTGCAAGCAGCTGAGCCAGATAGCACCACAATGTCGCTGTGATTCTATCCGGCGAGTGATCCAAGGCAGGCTCGGT AAGTGCTGCAAGCAGCTGAGCCAGATAGCACCACAATGTCGCTGTGATTCTATCCGGCGAGTGATCCAAGGCAGGCTCGGT AAgTGCTGCAAGCAGCTGAGCCAGATAGCACCACAATGTCGCTGTGATTCTATCCGGCGAGTGATCCAAGGCAGGCTCGGT AAGTGCTGCAAGCAGCTGAGCCAGATAGCACCACAATGTCGCTGTGATTCTATCCGGCGAGTGATCCAAGGCAGGCTCGGT AAGTGCTGCAAGCAGCTGAGCCAGATAGCACCACAATGTCGCTGTGATTCTATCCGGCGAGTGATCCAAGGCAGGCTCGGT

: : : : :

324 324 324 324 324

* 340 * 360 * 380 * 400 purbrovid : ggcttcttgggcatttggcgaggtgaggtattcaaacaacttcagagggcccagagcctcccctcaaagtgcaacatgggc Bankuti120 : GGCTTCTTGGGCATTTGGCGAGGTGAGGTATTCAAACAACTTCAGAGGGCCCAGAGCCTCCCCTCAAAGTGCAACATGGGC Aminósav szekvencia: Glenlea : GGCTTCTTGGGCATTTGGCGAGGTGAGGTATTCAAACAACTTCAGAGGGCCCAGAgCCTCCCCTCAAAgTGCAACATGGGC B73-6-1 : GGCTTCTTGGGCATTTGGCGAGGTGAGGTATTCAAACAACTTCAGAGGGCCCAGAGCCTCCCCTCAAAgTGCAACATGGGC L88-6 : GGCTTCTTGGGCATTTGGCGAGGTGAGGTATTCAAACAACTTCAGAGGGCCCAGAgCCTCCCCTCAAAgTGCGACATGGGC * 20 * 40 * 60 * GGCTTCTTGGGCATTTGGCGAGGTGAGGTATTCAAACAACTTCAGAGGGCCCAGAGCCTCCCCTCAAAGTGCaACATGGGC

: : : : :

405 405 405 405 405


: : : : :


: : : : :

TLFLLALLALVASTTFAQYSEVGGWYNEVGGGGGSQQCPQERPKLSSCKDYVMERCFTMKDFPVTWPTKW TLFLLALLALVASTTFAQYSEVGGWYNEVGGGGGSQQCPQERPKLSSCKDYVMERCFTMKDFPVTWPTKW TLFLLALLALVASTTFAQYSEVGGWYNEVGGGGGSQQCPQERPKLSSCKDYVMERCFTMKDFPVTWPTKW TLFLLALLALVASTTFAQYSEVGGWYNEVGGGGGSQQCPQERPKLSSCKDYVMERRFTMKDFPVTWPTKW TLFLLALLALVASTTFAQYSEVGGWYNEVGGGGGSQQCPQERPKLSSCKDYVMERCFTMKDFPVTWPTKW TLFLLALLALVASTTFAQYSEVGGWYNEVGGGGGSQQCPQERPKLSSCKDYVMERcFTMKDFPVTWPTKW 80 * 100 * 120 * 140 WKGGCEHEVREKCCKQLSQIAPQCRCDSIRRVIQGRLGGFLGIWRGEVFKQLQRAQSLPSKCNMGADCKF WKSGCEHEVREKCCKQLSQIAPQCRCDSIRRVIQGRLGGFLGIWRGEVFKQLQRAQSLPSKCNMGADCKF WKGGCEHEVREKCCKQLSQIAPQCRCDSIRRVIQGRLGGFLGIWRGEVFKQLQRAQSLPSKCNMGADCKF WKGGCEHEVREKCCKQLSQIAPQCRCDSIRRVIQGRLGGFLGIWRGEVFKQLQRAQSLPSKCNMGADCKF WKGGCEHEVREKCCKQLSQIAPQCRCDSIRRVIQGRLGGFLGIWRGEVFKQLQRAQSLPSKCDMGADCKF WKgGCEHEVREKCCKQLSQIAPQCRCDSIRRVIQGRLGGFLGIWRGEVFKQLQRAQSLPSKC1MGADCKF

: : : : :

70 70 70 70 70

: : : : :

140 140 140 140 140

9. táblázat Hexaploid búzafajták puroindolin-b génjeinek azonosított mutációi Fajta

Genom szimbólum

Szekvencia hosszúság

Mutációtípus

Azonosság

Összehasonlítási alap

Old alsz

6. Eredmények és értékelésük Mv2 Bánkúti 1201 Libellula Etoile de Choisy GK Kata Glenlea B73-6-1 L88-6

ABD ABD ABD ABD ABD ABD ABD ABD

ABD ABD ABD ABD ABD ABD ABD ABD

176 bp 437 bp 409 bp 429 bp 383 bp 437 bp 437 bp 437 bp

Vad típus Gly-46→Ser-46 Vad típus Vad típus Vad típus Vad típus Cys-29→Arg-29 Vad típus

82.4% 98,2% 96.9% 85.5% 95.3% 98.4% 98.2% 98.2%

Triricum aestivum pinB gene (AJ302100)

A szemkeménység vizsgálatokhoz kontrollként felhasználtunk néhány diploid, tetraploid és hexaploid fajt, melyek a búzával (Triticum aestivum) rokonságban állnak. A vizsgálatok néhány előremutató eredményt adtak a szemkeménységgel kapcsolatos kutatások terén, ezért a továbbiakban ezen eredmények részletezésére kerül sor. A Triticum aestivumhoz hasonló módon

a

búzával

rokon

diploid

és

teraploid

vad

fajok

csoportján

belül

is

megkülönböztethetünk puha és keményszemű típusokat ellentétben az irodalom által közölt adatokkal, melyek szerint valamennyi diploid faj puhaszemű, míg a tetraploidok keményszeműek. Eredményeink alapján a legnagyobb átlagos szemkeménységgel a tetraploid fajok csoportja rendelkezik, míg a diploidok nagyrészt valóban puhaszeműek. A vizsgált diploid fajok közül azok, amelyek UU vagy SS genommal rendelkeztek, keményszeműek, míg az AA, DD, NN, MM és CC genommal rendelkezők a puhaszeműek csoportjába tartoznak. A tetraploid fajok nagy része kifejezetten keményszemű, vannak azonban kivételek. Puhaszemű az AB genommal rendelkező T. Turgidum ssp. Turgidum, a DC genommal rendelkező Aegilops cylindrica, ugyanakkor puha vagy átmeneti típusba tartozik az UM genommal rendelkező Aegilops biuncialis vagy az AB genommal rendelkező T. petropavlovskyi var Petroferrugineum egyik törzse is. A vizsgált hexaploid fajok közül gyakorlatilag valamennyi minta puhaszemű a kontroll fajták (Mv Magdaléna és Mv Magvas) és a T. zhukovskyi kivételével. Valamennyi minta közül a diploid Aegilops umbellulata (UU) szemkeménysége volt a legnagyobb az Aegilops uniaristata (NN) és az Aegilops cylindrica-é (DCDC) pedig a legkisebb (III.táblázat, Függelék). A diploid és tetraploid fajok között a szemkeménységen túl különbséget találtunk az ezerszemtömeg és a szem átmérője között is. A diploid fajok 1.24 mm átlagos szemátmérővel rendelkeztek szemben a tetra- és hexaploid fajok 2.3-2.5 mm –es átmérőjével. Hasonló a tendencia az ezerszemtömeg esetén is, 20.4 és 38 g a di- és tetraploidok átlagos ezerszemtömege. Ez a 18 g különbség igen jelentős és hűen tükrözi a búzaszemek endospermiumának a méretét és ’telítettségét’. Az SDS szedimentáció értékeiben nem találtunk szignifikáns különbséget a csoportok között a csoportokon belül azonban 20 ml –es eltérések is voltak a különböző minták szedimentációs értékei között (III., 10. táblázat).

Old alsz


Hasonlóképpen a csoportok fehérjetartalma között is szignifikáns volt a különbség. A legkisebb nyersfehérje tartalommal a T. monococcum (AA), a T. turgidum paleocolchicum var. Karamyschevii (AB AB) és a T. aestivum ssp. Compactum (ABD ABD) rendelkezett a különböző csoportokban, míg a legnagyobb fehérje tartalma az Aegilops comosa (MM), az Aegilops triuncialis (UC UC) és a T. kiharae var kiharae (AGD AGD) mintáknak volt. A korreláció analízis eredményei szerint összefüggést találtunk a fehérjetartalom változása és a szemkeménység (r= -0.38, rkrit2%=0.38) valamint az SDS szedimentáció változása között (r= 0.46, r

=0.42). A fehérjetartalom növekedésével a szedimentációs érték nőtt a szem

krit1%

keménysége ugyanakkor csökkent. A legszorosabb összefüggés nem meglepő módon az ezerszemtömeg és a szem átmérője között volt (r= 0.97). 10. táblázat A búza rokon fajainak vizsgált minőségi tulajdonságai Tulajdonságok Szemkeménység Peren SKCS Szemátmérő (mm) Ezerszemtömeg (g) SDS Szedimentáció (ml) Kjeldahl fehérje (%) (F=5.7) Nyersfehérje (%)

ploidfok diploid tetraploid hexaploid diploid tetraploid hexaploid diploid tetraploid hexaploid diploid tetraploid hexaploid diploid tetraploid hexaploid diploid tetraploid hexaploid

minimun 7,24 10,18 22,29 1,39 1,29 2,24 19,15 22,52 32,51 11,00 12,00 13,00 13,97 14,21 12,47 13,41 13,07 10,70

maximum 115,41 94,64 70,94 1,84 3,21 3,23 36,12 56,77 58,06 32,00 33,00 30,00 30,99 31,92 21,80 29,14 29,04 18,97

átlag 28,90 69,00 41,38 1,24 2,34 2,47 20,37 38,34 39,98 22,70 17,50 21,89 21,74 19,28 16,32 20,16 17,84 15,09

szórás 41,29 22,72 18,15 0,68 0,52 0,31 12,20 8,9 8,03 7,59 6,79 5,35 4,80 4,33 2,62 4,39 3,70 2,36

SzD 9,02** 0,17*** 3,1*** 2,13 1,31* 1,15*

*, **, *** Szignifikancia 0.05, 0.01 és 0.001 valószínűségi szinten

PCR reakcióval kimutattuk, hogy a szem keménységét illetve puhaságát meghatározó puroindolin gének megtalálhatók a diploid és hexaploid fajokban. A tetraploidok csoportjában az eddigi irodalmi adatokkal ellentétben találtunk néhány fajt, melyek tartalmazzák a puroindolin géneket és sikerült is PCR technikával kimutatnunk azokat. Nem meglepő, hogy a puhaszemű, DDCC genommal rendelkező Aegilops cylindrica tartalmazza a puroindolin géneket, amennyiben igaz a puroindolin gének és a puhaság szoros kapcsolatsága, azonban a gének ugyancsak jelen vannak az AB genomú T. turgidum ssp. Turgidumban valamint az UM genomú Aegilops biunciálisban. Meglepő, hogy az Aegilops triunciálisban (UUCC) nem találtunk puroindolin géneket, annak ellenére, hogy a diploid UU és CC genommal rendelkező

Old alsz


fajok közül mindkettő tartalmazta azokat. Ugyancsak figyelemre méltó, hogy néhány AB genommal rendelkező fajban megtaláltuk a puroindolin géneket, sőt ugyanazon faj két különböző törzse (T. turgidum ssp. Paleocholchicum var. Karamischevii) is eltérő eredményt adott (10. ábra, III. táblázat). 10. ábra

Puroindolin-b gének jelenléte vad fajokban

Az ellentmondások feloldása érdekében megszekvenáltuk néhány tetraploid és diploid faj puroindolin génjét. Közülük a 80-as keménységi indexel rendelkező T. petropavlovszki (AB) a puroindolin-a és b géneket is tartalmazza annak ellenére, hogy keményszemű. A szekvencia elemzés eredményei (11. ábra) szerint a T. petropavlovszki puroindolin-b génje tartalmaz egy deléciót, melynek következtében a leolvasási keret eltolódik és egy olyan szekvencia jön létre, melyről a teljes fehérje átírása nem történhet meg. Ennek következtében a gén jelenléte ellenére a puroindolin-b fehérje nem expresszálódik. Ugyanakkor a diploid fajok közül a puhaszemű és AA genommal rendelkező a T. sinskajae is tartalmazza a puroindolin géneket. A T. sinskajae puroindolin-b szekvenciája két pontmutációt is tartalmaz (12. ábra) ennek ellenére az aminósav szekvenciája csak egy aminósavban tér el a T. aestivum puroindolin b fehérjétől. Kereteltolódás nincs, a kódoló génről fehérje expresszálódik, mely a T. aestivum puroindolin b –jét felépítő aminósavak közül az egyik prolin helyett threonint tartalmaz. 11. ábra T. petropavlovszki (AB) puroindolin-b génjének és termékének összehasonlítása a T. aestivum –éval Nukleotid sorrend:

Old alsz


160 * 180 * 200 * 220 * purbrovid : atggagcgatgtttcacaatgaaggattttccagtcacctggcccacaaaatggtggaagggcggctgtgagcatgag : 234 PETROPAVLO : ATGGAGCGATGTTTCACAATGAAGGAtTTTCCAGTCACCTGGCCCACAAA-TGGTGGAAGGGCGGCTGTGAGCATGAG : 233 ATGGAGCGATGTTTCACAATGAAGGATTTTCCAGTCACCTGGCCCACAAA TGGTGGAAGGGCGGCTGTGAGCATGAG 240 * 260 * 280 * 300 * purbrovid : gttcgggagaagtgctgcaagcagctgagccagatagcaccacaatgtcgctgtgattctatccggcgagtgatccaa : 312 PETROPAVLO : GTTCGGGAGAAgTGCTGCAAGCAGCTGAGCCAGATAGCACCACAATGTCGCTGTGAtTCTATCCGGCGAGTGATCCAA : 311 GTTCGGGAGAAGTGCTGCAAGCAGCTGAGCCAGATAGCACCACAATGTCGCTGTGATTCTATCCGGCGAGTGATCCAA

Aminósav szekvencia: * 20 * 40 * 60 * 8 purbrovid : TLFLLALLALVASTTFAQYSEVGGWYNEVGGGGGSQQCPQERPKLSSCKDYVMERCFTMKDFPVTWPTKWWKGGCEHEV : PETROPAVLO : TLFLLALLALVASTTFAQYSEVGGWYNEVGGGGGSQQCPQERPKLSSCKDYVMERCFTMKDFPVTWPTNGGRAAVSMRF : TLFLLALLALVASTTFAQYSEVGGWYNEVGGGGGSQQCPQERPKLSSCKDYVMERCFTMKDFPVTWPTKGG4AACEHEF

79 79

0 * 100 * 120 * 140 * 1 purbrovid : REKCCKQLSQIAPQCRCDSIRRVIQGRLGGFLGIWRGEVFKQLQRAQSLPSKCNMGADCKFPSGYYW**YSLYS?---- : 151 PETROPAVLO : GRSAASS*AR*HHNVAVILSGE*SKAGSVASWAFGEVRYSNNFRGPRASPQSATWAPTASSQGRIPAHWRPLLVDPSSV : 155 GEKAAKQLAQIAHNCACDLIGEVIKAGLGAFLAFGEGEVFKNFQGAQALPQKANMAADAKFPGGIPAHWRPLLSDPSSV

12. ábra T. sinskajae (AA) puroindolin-b génjének és termékének összehasonlítása a T. aestivum –éval Nukleotid sorrend: * 20 * 40 * 60 * purbrovid : accttattcctcctagctctccttgctcttgtagcgagcacaaccttcgcgcaatactcagaagttggcg : Sinskajae2 : ACCTTATTCCTCCTAgCTCTCCTTGCTCTCGTAGCGAGCACAACCTTCGCGCAATACTCAGAAGTTGGCG : ACCTTATTCCTCCTAGCTCTCCTTGCTCT GTAGCGAGCACAACCTTCGCGCAATACTCAGAAGTTGGCG

70 70

80 * 100 * 120 * 140 purbrovid : gctggtacaatgaagttggcggaggaggtggttctcaacaatgtccgcaggagcggccgaagctaagctc : 140 Sinskajae2 : GCTGGTACAATGAAGTTGGCGGAGGAGGTGGTTCTCAACAATGTCCGCAGGAGCGGCCGAAGCTAAGCTC : 140 GCTGGTACAATGAAGTTGGCGGAGGAGGTGGTTCTCAACAATGTCCGCAGGAGCGGCCGAAGCTAAGCTC * 160 * 180 * 200 * purbrovid : ttgcaaggattacgtgatggagcgatgtttcacaatgaaggattttccagtcacctggcccacaaaatgg : 210 Sinskajae2 : TTGCAAGGATTACGTGATGGAGCGATGTTTCACAATGAAGGATTTTCCAGTCACCTGGCCCACAAAATGG : 210 TTGCAAGGATTACGTGATGGAGCGATGTTTCACAATGAAGGATTTTCCAGTCACCTGGCCCACAAAATGG 220 * 240 * 260 * 280 purbrovid : tggaagggcggctgtgagcatgaggttcgggagaagtgctgcaagcagctgagccagatagcaccacaat : 280 Sinskajae2 : TGGAAGGGCGGCTGTGAGCATGAGGTTCGGGAGAAgTGCTGCAAGCAGCTGAGCCAGATAGCACCACAAT : 280 TGGAAGGGCGGCTGTGAGCATGAGGTTCGGGAGAAGTGCTGCAAGCAGCTGAGCCAGATAGCACCACAAT * 300 * 320 * 340 * purbrovid : gtcgctgtgattctatccggcgagtgatccaaggcaggctcggtggcttcttgggcatttggcgaggtga : 350 Sinskajae2 : GTCGCTGTGATTCTATCCGGCGAGTGATCCAAGGCAGGCTCGGTGGCTTCTTGGGCATTTGGCGAGGTGA : 350 GTCGCTGTGATTCTATCCGGCGAGTGATCCAAGGCAGGCTCGGTGGCTTCTTGGGCATTTGGCGAGGTGA 360 * 380 * 400 * 420 purbrovid : ggtattcaaacaacttcagagggcccagagcctcccctcaaagtgcaacatgggcgccgactgcaagttc : 420 Sinskajae2 : GGTATTCAAACAACTTCAGAGGGCCCAGAGCCTCACCTCAAAgTGCAACATGGGCGCCGACTGCAAGTTC : 420 GGTATTCAAACAACTTCAGAGGGCCCAGAGCCTC CCTCAAAGTGCAACATGGGCGCCGACTGCAAGTTC

Aminósav szekvencia: * 20 * 40 * 60 * purbrovid : TLFLLALLALVASTTFAQYSEVGGWYNEVGGGGGSQQCPQERPKLSSCKDYVMERCFTMKDFPVTWPTKW : Sinskajae2 : TLFLLALLALVASTTFAQYSEVGGWYNEVGGGGGSQQCPQERPKLSSCKDYVMERCFTMKDFPVTWPTKW : TLFLLALLALVASTTFAQYSEVGGWYNEVGGGGGSQQCPQERPKLSSCKDYVMERCFTMKDFPVTWPTKW

70 70

80 * 100 * 120 * 140 purbrovid : WKGGCEHEVREKCCKQLSQIAPQCRCDSIRRVIQGRLGGFLGIWRGEVFKQLQRAQSLPSKCNMGADCKF : 140 Sinskajae2 : WKGGCEHEVREKCCKQLSQIAPQCRCDSIRRVIQGRLGGFLGIWRGEVFKQLQRAQSLTSKCNMGADCKF : 140 WKGGCEHEVREKCCKQLSQIAPQCRCDSIRRVIQGRLGGFLGIWRGEVFKQLQRAQSL SKCNMGADCKF

Old alsz


Hasonlóképpen az Aegilops biuncialis UM genomú tetraploid faj puha/átmeneti endospermium szerkezettel rendelkezik és expresszál puroindolin típusú gént (13. ábra), annak ellenére, hogy annak szekvenciája a T. aestivumétól jelentős mértékben különbözik. 13. ábra Aegilops biuncialis (UM) puroindolin-b génjének és termékének összehasonlítása a T. aestivum – éval Nukleotid sorrend: * 20 * 40 * 60 * purbrovid : accttattcctcctagctctccttgctcttgtagcgagcacaaccttcgcgcaatactcagaagttggcg : Abiunciali : ACCTTATTCCTCCTAGCTCTGCTTGCTCTTGTAGCTGGCACAACCTTCGCGCAATACTCAGAAGTTGGCG : ACCTTATTCCTCCTAGCTCT CTTGCTCTTGTAGC GCACAACCTTCGCGCAATACTCAGAAGTTGGCG

70 70

80 * 100 * 120 * 140 purbrovid : gctggtacaatgaagttggcggaggaggtggttctcaacaatgtccgcaggagcggccgaagctaagctc : 140 Abiunciali : GCTGGTTTCACAATGAAGTTGGCGCAGGAGGTGCTTCTCAACAATGCCCGCTGGAGCGGCCGAAGCTAAG : 140 GCTGGT A A G G GG G AGG GGT CT CAA C G G GC G G * 160 * 180 * 200 * purbrovid : ttgcaaggattacgtgatggagcgatgtttcacaatgaaggattttccagtcacctggcccacaaaatgg : 210 Abiunciali : CTCTTGCAAGGATTACGTGATGGAGCGGTGTTTCACAATGAGGGAtTTTCCAGTCACTTGGCCCACGAGA : 210 T A A TG G G T A A G T C C A G 220 * 240 * 260 * 280 purbrovid : tggaagggcggctgtgagcatgaggttcgggagaagtgctgcaagcagctgagccagatagcaccacaat : 280 Abiunciali : TGGTGGAAGGGCGGTTGTGAGCACGAGGTCCGGGAGAAGTGCTGCAAGCAGCTGAGCCAGATAGCACCAC : 280 TGG G GGC GT A A G G AG TGC AGC G A CAC A * 300 * 320 * 340 * purbrovid : gtcgctgtgattctatccggcgagtgatccaaggcaggctcggtggcttcttgggcatttggcgaggtga : 350 Abiunciali : AGTGCCGCTGCGATTCTATCCGAGGAATGATGCAAGGCAAGCTCGGTGGCTTCTTCGGCATTTGGCGAGG : 350 GC G T CGAG AT G GG CTT C G G G 360 * 380 * 400 * 420 purbrovid : ggtattcaaacaacttcagagggcccagagcctcccctcaaagtgcaacatgggcgccgactgcaagttc : 420 Abiunciali : TGATGTATTCAAACAAATTCAGAGGGCCCAGAGCCTCCCCTCAAAgTGCAACATGGGCGCCGACTGCAAG : 420 G T AAC G CC C C CA G CG C C

Aminósav szekvencia: * 20 * 40 * 60 * purbrovid : TLFLLALLALVASTTFAQYSEVGGWYNEVGGGGGSQQCPQERPKLSSCKDYVMERCFTMKDFPVTWPTKW : Abiunciali : TLFLLALLALVAGTTFAQYSEVGGWFHNEVGAGGASQQCPLERPKLSSCKDYVMERCFTMRDFPVTWPTR : TLFLLALLALVA TTFAQYSEVGGW5 G GG Q S 6

70 70

80 * 100 * 120 * 140 purbrovid : WKGGCEHEVREKCCKQLSQIAPQCRCDSIRRVIQGRLGGFLGIWRGEVFKQLQRAQSLPSKCNMGADCKF : 140 Abiunciali : WWKGGCEHEVREKCCKQLSQIAPQCRCDSIRGMMQGKLGGFFGIWRGDVFKQIQRAQSLPSKCNMGADCK : 140 W G C R 6 G

6.2.5 Értékelés A Perten SKCS 4100 készülékkel mért szemkeménység (PKEM, III. táblázat), átmérő, és ezerszemtömeg értékek mellett az értékelésnél figyelembe vettük azok szórását is. A szemkeménység szórása a búzával rokon fajoknál mintegy 12 és 20% között változott, ami elsősorban az átmeneti típusba tartozó minták valódi keménységi csoportba tartozását kérdőjelezi meg. A szemátmérő közötti különbségek befolyásolhatják a keménységmérés eredményeit a keménységi csoportba sorolást azonban nem módosíthatják. Jól tükrözi e

Old alsz


megállapítás igazságát, hogy az 1.68 mm, tehát igen kicsi átmérővel rendelkező Aegilops biuncialis szemkeménysége a durumoknál megszokott értékekével vetekszik (HI=115), míg a legnagyobb átmérőjű (3.2 mm) T. zhukovskyi szemkeménysége ennél jóval alulmarad. Az eredmény megbízhatóságát támasztja alá természetesen az a tény is, hogy a készülék 1-4 mm átmérőjű szemre van kalibrálva. A jelenlegi álláspont szerint a szem puhaságát meghatározó puroindolin gének a T. tauschiitől származnak, mely a T. aestivum D genomjának donorja. Mivel a diploid vad fajokban megtalálhatók a puroindolin gének, korábbi feltételezések szerint ezek a fajok a búza A és B genomjának donorjai. Tekintve azonban, hogy az eddigi vizsgálatok alapján a tetraploid (AABB) búzáknak nincs puroindolin génjük, ez a feltételezés hamisnak bizonyult (Gautier és mtsai 2000). A tetraploid búzák A genom donorjának a T. monococcumot tartották korábban, mára azonban bebizonyosodott, hogy sokkal inkább a T. urartu tölti be ezt a szerepet. A B genom donor még nem ismert, de valószínüleg a T. speltioides vagy a T. longissimum. Jelenleg azt sem tudjuk, hogy a tetraploid Triticum fajokban a puroindolin fehérjék hiánya a puroindolin gének deléciójának, rekombinációjának vagy divergenciájának köszönhető-e a diploid búzák A és B genomján. A rekombináció miatt a primerek valószínüleg egymástól túl messze kötődnek a DNS-hez ahhoz hogy PCR termék képződjön. A puroindolin gének tehát valami oknál fogva elvesznek a tetraploid fajokban majd a hexaploidokban újra megjelennek a T. tauschii D genomjával. Ezt bizonyítja szekvenciáik azonossága is. Eredményeink, melyek szerint a tetraploidok között puhaszemű, és puroindolinokat tartalmazó keményszemű törzseket azonosítottunk rámutatnak arra, hogy az öröklődésmenet a leírtaknál összetettebb. Egy tetraploid faj egy törzse esetén deléciót azonosítottunk a puroindolin-b génben, mely magyarázatot ad a fehérje hiányára. Nem találtunk azonban magyarázatot magának a génnek a hiányára tetraploid fajokban. A szem endospermium szerkezetében fellépő különbség eddigi ismereteink szerint gyakorlatilag egy, az 5D kromoszóma rövid karján elhelyezkedő Ha gén expressziójának köszönhető. Egyetlen fő gén jelenléte azonban ellentmond a búza allohexaploid tulajdonságának, mivel a legtöbb gén háromszoros homológ szériában létezik, minden genomban egyszer. Eredményünk igazolni látszik, hogy a Ha gén a búza A és B kromoszómáján is jelen van, csak bizonyos esetekben nem fejeződik ki. Amennyiben a fehérje expresszió ellenére a búzamintánk kemény endospermium szerkezetű azt a puroindolin-a gén hiányával vagy a puroindolin-b gén mutációjával magyarázzák

Old alsz


hexaploid

fajokban.

A

mutáció

következtében

megváltozott

következtében ugyanis az endospermium különböző

aminósav

összetétel

komponensei között

létrejött

kölcsönhatások változnak meg. Csökken a puroindolin lipidkötő képessége a keményítő felületén, miközben a fehérje mátrix és a keményítő kölcsönhatása erősödik. A puroindolinek háromdimenziós szerkezete még nem ismert, azonban nagy arányban tartalmaz hélixes szerkezeti egységeket. Douliez és mtsai (2000) szerint egy hélix egyszerű rotációja miatt a puroindolinekben a ciszteinek hibásan párosodnak az úgynevezett Cys-X-Cys motívumokban. Amennyiben a ciszteinek száma egy mutáció következtében lecsökken, -mint ahogy ez a B73-6-1 törzs esetén történt- vele együtt csökken a cisztein párosodások száma és ezáltal a puroindolinek szerkezete is megváltozik. A szerkezetváltozás maga után vonja a lipidkötőképesség megváltozását, ami egyben a szemkeménység változásához is vezet. Ez a mutációtípus

magyarázatul

szolgálhat

a

B73-6-1

kontrollhoz

képesti

szignifikáns

megváltozásához. A búzával rokon fajok a nemesítésben hasznosak lehetnek forrásként a genetikai diverzitás növelésére elsősorban a betegségekkel szembeni rezisztencia kialakításában. Mindenek előtt azonban a különböző fajok minőségét meghatározó genetikai háttér ismerete szükséges, a nemesítési programok tervezhetősége és a várható eredmények könnyebb megbecsülhetősége érdekében.

Old alsz


6.3

A keményítő szintézisét szabályozó enzim, vagy más néven waxy fehérje

jelentősége és a keményítő tulajdonságainak variabilitása egy régi magyar búzafajta, a Bánkúti 1201 populációban 6.3.1 A GBSS enzimfehérje vizsgálatokba bevont törzsek A MTA Mezőgazdasági Kutatóintézetében 1994 óta folynak a Bánkúti 1201 fajtával kapcsolatos kísérletek. 1995-ben a populációt HMW-glutenin alegység összetétel alapján törzsekre bontották és a homogén törzseket kalászutódsorokba vetették az intézet tenyészkertjében. A vizsgálatokhoz a populáció 1998-ban aratott termését használtuk fel (X. táblázat). 33 szelektált Bánkúti 1201 (Bánkúti 5/Marquis) HMW glutenin összetételében különböző törzs keményítő tulajdonságait vizsgáltuk Rapid Visco Analyser (RVA), Differential Scanning Calorimetry (DSC) és HPLC módszerekkel. Kontrol fajták a Rosella és a Janz voltak. A Rosella egy ausztrál puhaszemű, 4A null GBSS alléllal rendelkező búzafajta, míg a Janz egy keményszemű, normál GBSS tartalomú ausztrál búzafajta. A Bánkúti 1201 törzsek kétismétléses kísérletben kerültek elvetésre. A méréseket két ismétlésben végeztük el. A Bánkúti 1201 populáció harminchárom kiválasztott törzse magas fehérje tartalommal (1620%, Kjeltec 1035, Foss-Tecator, Sweden) rendelkezett és a farinográfos vízfelvétel értéke is széles határok között változott (58.7-62.4 ml, Farinographic). A törzsek keménység indexe (hardness index, HI) 57.7 és 62.4 között változott (Perten SKCS 4100, Perten Instruments AB, Sweden), mely szerint valamennyi vonal a keményszemű típusba sorolható (Vida és mtsai 1998). 6.3.2 A Bánkúti 1201 törzsek keményítő összetételének vizsgálata A Bánkúti 1201 törzsek amilóz tartalma 14.4% és 24.2% között valamint ennek megfelelően az amilopektin tartalom 75.8% és 85.6% között változott. Az amilóz/amilopektin arány szélső értékei 0.16 és 0.32 voltak. A széleskörben publikált amilóz tartalomnál (20-30%) ezek jóval alacsonyabb értékek (Soulaka és mtsai 1985) (11. táblázat). A használt módszer önmagával és más módszerekkel összemérhető (az eredmények jól korrelálnak) így például a jódozásos módszernél arányosan alacsonyabb amilóz tartalom értéket ad (Regina és mtsai 1997). A törzsek többsége 15% és 18% közötti amilóz tartalommal rendelkezett és egy második csúcs is megjelent az amilóz tartalom gyakorisági görbéjén 19.5%-nál (13.a. ábra). A kontrolként használt Rosella és a Bánkúti 5 (a Bánkúti 1201 egyik szülője) 16.5% amilóz tartalommal

Old alsz


rendelkezett, míg a nem-waxy standard-nek, a Janz-nek 18.1% amilóz tartalma volt. A Marquis, a Bánkúti 1201 másik szülője 19% amilóz tartalommal rendelkezett. A törzsek amilóz tartalma leginkább a szülőkére hasonlított, de néhány törzs még a részlegesen waxy Rosella

fajtáénál

is

alacsonyabb

amilóz

tartalommal

rendelkezett.

Az

eredmény

alátámasztására, mely részlegesen waxy törzsek jelenlétét feltételezi, PCR reakciót állítottunk össze. A PCR reakció során kapott termékek elválasztásával megállapítottuk, hogy mind a 33 Bánkúti 1201 törzs tartalmazza mindhárom waxy allélt a domináns fázisban (GBSS-termelő), azonban még nem ismert, hogy vajon mindhárom waxy allél aktív-e a különböző törzsekben, illetve van-e mutáció a waxy allélekben, amelyek befolyásolják a GBSS aktivitását. 11. táblázat HPLC módszerrel meghatározott amilóz és amilopektin tartalom Amilóz [%]

Amilopektin [%]

Amilóz/Amilopektin

14. 4-24. 2

75. 8-85. 6

0. 16-0. 32

Átlag

17. 2

82. 7

0. 21

Szórás

2. 1

2. 1

0. 03

Janz (normál)

18. 1

81. 9

0. 22

Rosella (4A null)

16. 5

83. 5

0. 20

Bánkúti 1201

Liszt és keményítő szuszpenzió hőmérsékletváltozás hatására bekövetkező viszkozitásbeli változását RVA készülékkel mértük. A keményítő csúcsviszkozitása 232 és 372 RVU (Rapid Visco Unit) között változott, míg a görbe csúcs utáni letörésének mértéke (breakdown) 74 és 172 RVU között volt. Hűtéskor a viszkozitásgörbe ismét emelkedni kezd (setback). A törzsek esetén az emelkedés mértéke 114 és 217 RVU között volt (12. táblázat). Valamennyi paraméter és a minimum-maximum értékek közötti különbségek liszt esetén kisebbek voltak, mint keményítő esetén (14. ábra, 12. táblázat). A kisebb viszkozitásbeli különbségeket eredményezheti a lisztben levő fehérjék jelenléte. Batey (2000) megállapította, hogy a különböző glutenin alegységek kölcsönhatásba lépve a keményítővel befolyásolhatják a viszkozitást. Rendszerint növelik, esetenként csökkentik azt. A lisztre és a keményítőre mért eredmények közötti korreláció mértéke kicsi volt (14. ábra). Az ábrán jól látható, hogy azonos mérési körülmények között a Bánkúti 1201 törzseinek viszkozitás értékei között szignifikáns különbség volt. A hőmérséklet tartási szakaszában beállt minimális viszkozitás értékek alapján (viscosity at hold) a Bánkúti 1201 vonalakat három csoportra oszthatjuk (13.b ábra). Boggini és mtsai (2001) megállapították, hogy nem-waxy vagyis normál búzafajták viszkozitás értékei általában alacsonyabbak és szignifikánsan megkülönböztethetők a részlegesen waxy genotípusokétól. A normál búzafajták csoportján belül a viszkozitásbeli Old alsz


variabilitás kisebb, mint a részlegesen waxy genotípusok esetén. A különböző Bánkúti 1201 törzsek viszkozitás értékei (csúcs-, tartási-, és végső-) inkább a részlegesen waxy genotípusokénak megfelelő. Ez megerősíti korábbi feltételezésünket, mely szerint a Bánkúti 1201 törzsek GBSS aktivitása különböző. A viszkozitás függvényében a fehérjetartalom véletlenszerű szóródása azt mutatja, hogy a gyakorisági görbén valamennyi tartományban hasonló a fehérjetartalom eloszlása (15. ábra).

12. táblázat Bánkúti 1201 törzsek keményítő viszkozitásának meghatározása Keményítő

Liszt

Min-Max értékek

Átlag

Szórás

Min-Max értékek

Átlag

Szórás

Viszkozitás (csúcs) [RVU]

232-372

310

41. 3

209-285

249

16. 2

Viszkozitás (maradék) [RVU]

131-277

202

44. 3

126-157

140

8. 0

Viszkozitás (végső) [RVU]

249-478

367

72

235-300

276

14. 4

Görbe letörése [RVU]

74-172

108

23. 2

74-145

109

14. 1

Görbe emelkedése [RVU]

114-217

165

29

110-147

136

7. 7

Csúcs idő [perc]

9. 6-10. 6

10

0. 3

9. 1-9. 6

9. 4

0. 1

83-90

87

1. 9

65-86

83

6. 5

Min. hőmérséklet [ºC]

V is z k o z it á s [ R V U ]

14. ábra A 33 kiválasztott Bánkúti 1201 törzs RVA profilja (a. liszt, b. keményítő) a.

b.

Idő [perc]

Old alsz

6. Eredmények és értékelésük Dendrogram using Ward Method Rescaled Distance Cluster Combine C A S E Label

Num

0 5 10 15 20 25 +---------+---------+---------+---------+---------+

x24/rmf101 8 x90/rmf63 28 x61/rmf93 19 x103/rmf50 32 x41/rmf57 14 x55/rmf104 17 x75/rmf96 22 x18/rmf69 6 x26/rmf90 9 x98/rmf65 29 Bankuti5 1 x57/rmf47 18 x82/rmf98 24 A lisztre és a x22/rmf87 keményítőre vonatkozó 7 x34/rmf75 11 x35/rmf67 12 2 Viszkozitásx1/rmf99Viszkozitás x62/rmf94 (csúcs) [RVU] (maradék) 20 [RVU] x36/rmf56 13 x78/rmf82 23 x102/rmf55 31 0. 28 x89/rmf68 0. 0827 x101/rmf54 30 x84/rmf51 25 x253/rmf43,1 33 x12/rmf74 5 x69/rmf80 21 x5/rmf84 4 x44/rmf102 15 x87/rmf61 26 x2/rmf72 3 x46/rmf71 16 x33/rmf92 10

adatok korrelációja (r 5% =0.42) Viszkozitás (végső) [RVU]

Görbe letörése [RVU]

Görbe emelkedése [RVU]

Csúcs idő [perc]

Min. hőmérséklet [°C]

0. 17

0. 19

0. 24

-0. 06

0. 34

13. ábra a. Az amilóz tartalom, b. a keményítő maradék viszkozitásának és a c. gélesedéshez szükséges entalpia értékek gyakorisági görbéje

05 Apr 01 SPSS for MS WINDOWS Release 6.0

Page 8

Old alsz


A búzakeményítő gélesedési tulajdonságait DSC-vel is tanulmányoztuk. A gélesedéshez 8.3 és 16.3 J/g közötti hőmennyiség (∆H) szükséges a különböző törzsek esetén, mely mintegy 3%-al magasabb az irodalmi adatoknál (Batey és mtsai 1997). A gélesedési csúcs hőmérséklete 59.8 és 62.5 ºC között volt. A Bánkúti 1201 törzsek többségének 9-13 J/g energiára volt szüksége a gélesedéshez (13.c ábra), de néhány törzsnek ennél is többre. A Bánkúti szülők és a kontrol fajták entalpia értékei egymáshoz nagyon közel esnek (11.5-12.5 J/g). Az amilóz-lipid csúcs entalpiája 1.4 és 5.7 J/g között változott, a csúcs hőmérséklete

Old alsz


pedig 93.7 és 108.5 ºC között változott, melyek nagyon széles tartományt jelentenek (22. táblázat). Az amilóz-lipid komplex-el kapcsolatban ismereteink még hiányosak, és DSC-vel nehéz lenne megállapítani, hogy vajon az amilóz-lipid komplexek léteznek-e a természetes keményítő szemcséken vagy csupán gélesedés során képződnek. 13. táblázat DSC-vel mért keményítő tulajdonságok a Bánkúti 1201 populációban Gélesedés

Amilóz-lipid csúcs

Csúcs T [ºC]

ΔH [J/g]

Csúcs T [ºC]

ΔH [J/g]

59. 8-62. 7

8. 3-16. 3

93. 7-108. 5

1. 4-5. 7

Átlag

61. 1

12. 1

100. 9

3. 3

Szórás

1.0

2.0

4. 0

1. 2

Janz

62. 0

12. 5

94. 2

6. 9

Rosella

64. 2

11. 4

94. 2

4. 4

Bánkúti 1201

15. ábra

A fehérjetartalom véletlenszerű eloszlása a maradék viszkozitás függvényében 22

Fehérje [%]

20 18 16 14 12 10 100

150

200

250

300

Maradék viszkozitás [%]

A mért keményítő tulajdonságok alapján (RVA, DSC, HPLC) Hierarchikus Cluster analízist végeztünk a törzsek különbözőségének megállapítására (16. ábra). Az analízis eredményeként a Bánkúti törzsek öt csoportját különböztethettük meg. Az öt csoportot összehasonlítva megállapítottuk, hogy a hármas csoport tartalmazta a legnagyobb viszkozitásértékekkel (csúcs-, tartás-, végső-viszkozitás, viszkozitás emelkedés (setback)) ugyanakkor a legkisebb görbeletöréssel és viszkozitás növekedést elindító hőmérséklet értékekkel jellemezhető törzseket. Az ötös csoportba sorolhatók a legkisebb viszkozitás értékekkel (csúcs-, tartás-, Old alsz


végső-viszkozitás, emelkedés -setback), és a legmagasabb viszkozitás növekedést elindító hőmérséklettel rendelkező törzsek, míg a négyes csoportnak van a legkisebb csúcsideje és a legnagyobb letörése a viszkozitás értékekben. Az öt csoport egyéb technológiai tulajdonságokban így a farinográfos értékszám, SDS szedimentáció, szemkeménység, sikértartalom értékeiben szignifikáns különbséget nem mutatott és hasonlóképpen a fehérje összetételt tekintve (high molecular weight- (HMW), low molecular weight- (LMW) glutenins, glutenin/gliadin ratio, unextractable polymeric protein (UPP%)) sem találtunk szignifikáns különbséget az öt csoport között. 16. ábra

Hierarhikus Klaszter Analízis a keményítő tulajdonságokra

Dendrogram using Ward Method Rescaled Distance Cluster Combine C A S E Label x24/rmf101 x90/rmf63 x61/rmf93 x103/rmf50 x41/rmf57 x55/rmf104 x75/rmf96 x18/rmf69 x26/rmf90 x98/rmf65 Bankuti5 x57/rmf47 x82/rmf98 x22/rmf87 x34/rmf75 x35/rmf67 x1/rmf99 x62/rmf94 x36/rmf56 x78/rmf82 x102/rmf55 x89/rmf68 x101/rmf54 x84/rmf51 x253/rmf43,1 x12/rmf74 x69/rmf80 x5/rmf84 x44/rmf102 x87/rmf61 x2/rmf72 x46/rmf71 x33/rmf92

Num 8 28 19 32 14 17 22 6 9 29 1 18 24 7 11 12 2 20 13 23 31 27 30 25 33 5 21 4 15 26 3 16 10

0 5 10 15 20 25 +---------+---------+---------+---------+---------+

1.

2.

3.

4.

5.

05 Apr 01 SPSS for MS WINDOWS Release 6.0

Page 8

6.3.3 Értékelés Nagy változatosságot állapítottunk meg a különböző Bánkúti 1201 törzsek keményítő tulajdonságaiban mind a törzsek amilóz tartalmát (14.4%-24.2%) mind az RVA viszkozitást (232-372 RVU) és a DSC entalpiát (8.3-16.3 J/g) tekintve. A törzsek közötti különbözőségek megállapítására Hierarhikus Klaszter analízist végeztünk az említett keményítő tulajdonságok

Old alsz


alapján. Ezek szerint a Bánkúti törzsek öt csoportját különböztettük meg. Az eredményeket összegezve megállapítottuk, hogy a HMW glutenin összetétel alapján heterogén Bánkúti 1201 populáció keményítő tulajdonságait tekintve is heterogén. A fehérje valamint a keményítő tulajdonságaiban talált variabilitás között a vártnak megfelelően nem volt kimutatható összefüggés. Az amilóz tartalom meghatározására több különböző módszer létezik. Más módszer ugyanazon minta ugyanazon paraméterére eltérő eredményt adhat. A Bánkúti 1201 számos törzsének HPLC módszerrel meghatározott amilóz tartalma, az irodalmi adatokat és a kontroll fajták eredményeit is figyelembe véve alacsonyabb a normál őszi búza genotípusokénál. Ennek okát egyenlőre nem ismerjük. Megállapítottuk, hogy mindhárom waxy allél jelen van valamennyi törzsben, azonban az még nem ismert, hogy vajon mindhárom allél aktív-e a különböző

törzsekben,

illetve

tartalmaznak-e

mutációt,

amelyek

befolyásolják

az

enzimaktivitást. Más gének, mint például a keményítő szintáz enzimek szintén szerepet játszhatnak-e különbségek kialakulásában ennek kiderítésére azonban további vizsgálatok szükségesek. Az eredmények alapján mód van a régi magyar búzafajták nemesítésben való alkalmazásakor egy kétdimenziós mátrixhatás alapján kiválasztani a legmegfelelőbb tulajdonságpárral rendelkező vonalakat. Igy például a Bánkúti 1201 populációban találhatunk olyan, kiváló tésztaerősséggel rendelkező törzseket, melyek ugyanakkor vagy alacsony vagy magas amilóztartalommal rendelkeznek. Az alacsony amilóztartalmú waxy típusú búza nemesítése elsősorban ázsiában terjedt el. Hazai viszonylatban a nagy amilóztartalmú búza nemesítését tűztük ki célul, táplálkozástani okokból.

Old alsz

7. Eredmények összefoglalása és következtetések

7

EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA ÉS KÖVETKEZTETÉSEK

Vizsgálataink során arra kerestük a választ, hogy egyes fehérjék jelenléte, azok mennyiségi arányai illetve génjeik mutációi milyen összefüggésben állnak a búza minőségével, ezek hogyan öröklődnek a különböző generációkban és lehetőséget kerestünk ezen ismeretek hatékony felhasználására a búza nemesítésében hozzájárulva ily módon a genetikai diverzitás növeléséhez. 7.1

Tartalékfehérje alegységek mennyiségi tulajdonságainak hatásai a búza és a liszt

funkcionális és reológiai tulajdonságaira Az angol kutatók által transzformált B73-6-1 transzgénikus vonal 10-15 extra kópiát tartalmaz az 1Dx5 HMW glutenin génből, mely a kódolt fehérje expressziójának négyszeres kifejeződését eredményezi. A transzformált és az eredeti kontroll vonal technológiai és reológiai tulajdonságait vizsgáltuk kontinentális, száraz éghajlati viszonyok között Martonvásáron (2000-2002). A három éves szántóföldi kísérlet során a transzgén és a transzgén hatására létrejött funkcionális tulajdonságok generációról-generációra stabilan öröklődtek. Nem találtunk különbséget a transzgénikus vonal és az eredeti genotípus termőképességében

és

alkalmazkodóképességében,

de

egyértelmű

genetikailag

meghatározott különbséget találtunk a szem keménységében és a szem átmérőjében. Ezen tulajdonságok megváltozása, nem hozható közvetlen összefüggésbe az 1Dx5 glutenin gén extra génkópiáinak jelenlétével, sokkal inkább tulajdonítható a transzformációs technika mellékhatásának vagy a búzaszem endospermium szerkezetében bekövetkező egyéb változásoknak. Az endospermium szerkeztében olyan elváltozások történhettek, melynek hatására a szem keménysége nőtt a szemmérete és ezzel együtt az ezerszemtömeg csökkent. Eredményeinkből következően további transzformációs kísérletekben is számítanunk kell a búza tulajdonságaiban bekövetkező olyan változásokra, melyeket nem közvetlenül a bevitt gén határoz meg. A kémiai összetételben és a funkcionális tulajdonságokban bekövetkező változások nagy része közvetlen összefüggésbe hozható az 1Dx5 extra génkópiáinak jelenlétével, melynek nagy hatása van a glutenin polimer frakció tulajdonságaira azáltal, hogy megváltoztatja a tartalékfehérjék felhalmozódását a búza érési folyamata során. Ennek következtében a teljes szem fejlődése is alapvetően megváltozik. A B73-6-1 transzgénikus vonal tendenciáját tekintve nagyobb fehérjetartalommal rendelkezik, mint az L88-6 kontroll vonal, de ez a különbség nem szignifikáns. Ezzel szemben szignifikánsan megnőtt az 1Dx5 HMW glutenin alegységek abszolút mennyisége, az LMW glutenin alegység tartalom, és velük együtt a Dx/Dy-, HMW/LMW- és a glutenin/gliadin arány is. Más HMW glutenin Old alsz


alegységek (Ax, By, Dy) mennyisége és a gliadin tartalom ugyanakkor csökkent. Az x és y típusú alegységek arányának eltolódása a fehérjemátrix szerkezetének olyan mértékű megváltozását eredményezte, melynek hatására a sikérfehérjék kohezivitása csökkent. Ennek következtében a reológiai tulajdonságok szignifikánsan megváltoztak és egy rendkívül erős, ellenálló és kis nyújthatósággal rendelkező tésztát kaptunk. A nedvessikér mennyiségének és az SDS szedimentációnak a csökkent értéke valamint azok a paraméterek, melyek a tészta reológiai tulajdonságait jellemzik, mind azt bizonyítják, hogy a B73-6-1 transzgénikus búza nagy tésztaerősséggel és kis nyújthatósággal rendelkezik, melynek eredményeként a transzgénikus vonal lisztjéből sütött kenyér kis térfogatú és tömör kenyérbélzetű. Összességében megállapítottuk, hogy a transzformált genotípust extrém tulajdonságai alkalmassá teszik gyengébb sikér-minőségű lisztek minőségének javítására. A martonvásári nemesítési programok egyik fő célja kiváló sütőipari tulajdonságokkal rendelkező búzafajták nemesítése. E cél megvalósítása érdekében, a nagy tészta erősséget és stabilitást kialakító 1Bx7 alegységet természetes módon túltermelő genotípusokat használtunk fel, elkerülve a hasonló hatású 1Dx5 HMW gluteninnel transzformált genotípus használatát. Az 1Bx7 HMW glutenin alegységet túltermelő kanadai búzafajták és a Bánkúti 1201 keresztezéseiből származó utódnemzedék F3 generációjában (2002) vizsgáltuk a tartalékfehérje összetételt és az egyes alegységek mennyiségi arányait. A HMW glutenin alegységek RP-HPLC-vel történt menniységi elemzése szerint a Bánkúti 1201-nek az Mv Magdalénával keresztezett utódai között találtunk Bx7-re túltermelő törzseket, a túltermelést azonban az általunk használt DNS marker nem támasztotta alá. Ez azt jelenti, hogy a törzsek Bx7 promótere nem tartalmazta a túltermelő törzsekre jellemző 43 bp-os inszerciót. A túltermelés oka itt más tényezőkben keresendő. Az N93-3026/Mv2 keresztezése során létrehozott utódok között azonosítottunk olyan törzseket, amelyek Bx7 túltermelése genetikai markerrel is alátámasztható. Az 1Bx7 túltermelésének kimutatására használt marker az eddigi vizsgálatok alapján alkalmas a ’Bánkúti típusú’, genetikailag meghatározott módon 1Bx7 túltermelő genotípusok azonosítására. Mindemellett azonban megjegyzendő, hogy még nem ismert, hogy vajon valamennyi illetve csak és kizárólag a Bx7 túltermelő genotípus promótere tartalmazza-e az azonosításra használt inszerciót. A keresztezésekkel létrehozott utódnemzedékben sem az x/y sem a HMW/LMW arány nem adott

számottevő

szignifikáns

eltérést.

Az

1Dx5

HMW-glutenin

túltermelésénél

tapasztaltakhoz hasonlóan az 1Bx7 alegység túltermelésének hatása is elsősorban az x/y alegységek arányának jelentős mértékű eltolódásában tükröződött. Ez az előző kísérletben

Old alsz


már megemlített ’in vitro’ tanulmányok eredményeinek megfelelően utal arra, hogy a funkcionális tulajdonságokban sem várható lényeges különbség a törzsek között. A keresztezési programok során kapott eredményeink rámutattak arra, hogy az utódnemzedék HMW glutenin alegység összetétele és az alegységek mennyiségi arányainak alakulása meglehetősen komplex. Egyrészt megállapítottuk, hogy a Bx7 alegység túltermelése, olyan genetikailag meghatározott tulajdonság, mely a By8-as alegység együttes jelenlétével párosul. Az alegység túltermelését azonban egyéb genetikai és környezeti tényezők is befolyásolhatják, tekintve hogy a Bx7 fehérje alegység túltermelésének mértéke illetve az alegységek mennyiségi arányai az utódnemzedékben nem feltétlenül azonosak valamely szülői genotípuséval. A környezeti tényezők közül a N ellátottság és a hőstressz is jelentős hatással lehet a tartalékfehérjék mennyiségi arányaira, hisz a magas hőmérséklet és szárazság jellemző volt az előző évek időjárására (Triboi és mtsai. 2000, Szilágyi és mtsai. 2000). Végezetül megállapítottuk hogy a kísérletben felhasznált genotípusokkal nemcsak hogy az 1Bx7 alegység mennyiségi arányának növekedését érhetjük el az utódnemzedékben, de a régi magyar tájfajták felhasználásával a genetikai diverzitás növeléséhez is hozzájárulhatunk. Keresztezési programunkban tehát olyan 1Bx7 fehérje alegységet túltermelő törzseket hoztunk létre, melyek túltermelését mind fehérje alapon HPLC módszerrel, mind genetikai markerrel bizonyítottunk. 7.2

Az eltérő endospermium szerkezet következményei és a puroindolinok szerepe a

búzafajták tulajdonságainak meghatározásában Magyarországon egyrészt a jó malomipari tulajdonságokkal másrészt a jó sütőipari tulajdonságokal rendelkező búzafajtákat kedveli a feldolgozóipar. A két kritérium együttes teljesülése nagy előnyt jelent a malom és sütőipar kapcsolatában, ehhez azonban két egymástól teljesen független tulajdonság-csoport együttes jelenlétének igénye merül fel. A szemkeménység alapján csoportokba sorolt törzsek egyes technológiai tulajdonságait tanulmányoztuk különböző generációkban (1999-2001). A törzsek nedvessikér tartalmát, Zeleny értékét és farinográfos vízfelvételét vizsgálva elmondhatjuk, hogy az F3 törzsek szemtermése minden egyes szemkeménységi csoportban különbözött egymástól, és a keménység

növekedésével

általában

javultak

a

törzsek

vizsgált

technológiai

tulajdonságai. Az F3 törzsek vizsgálati eredményeihez képest az F5 generációban szelektált törzsek minőségi tulajdonságainak szórása csökkent, ami elsősorban a hatékony szelekció következménye. Ennek a ténynek köszönhetően a minimum értékek is nagyobbak általában, mint az F3 generációban. Ugyanakkor nagyobb gyakorisággal sikerült szelektálni olyan nagy

Old alsz


Zeleny értékű és farinográf vízfelvevő képességű törzseket, melyeknél a nagy szemkeménység érték jó technológiai minőséggel párosultak. Ezek alapján elmondható, hogy a szemkeménység alapja lehet a sütőipari minőségre történő indirekt szelekciónak különösen a farinográf vízfelvevő képesség javítására, de a közepes erősségű összefüggések alapján az 50 és 60 szemkeménységű csoportból is lehetséges kiváló technológiai tulajdonságú búza genotípusok kiválogatása. A korlátozó tényezők meghatározása természetesen még további vizsgálatot igényel. A szemkeménység és a puroindolinok kapcsolatának vizsgálata során megállapítottuk, hogy valamennyi hexaploid faj valamint a kontrollként használt diploid fajok is tartalmazzák a puroindolin-a és puroindolin-b géneket. A fajták szemkeménysége tehát egyetlen esetben sem hozható összefüggésbe a puroindolin-a hiányával. A vizsgált hexaploid fajták közül Gly (46)-Ser (46) mutációt azonosítottunk a Bánkúti 1201 populációban és Cys (29)-Arg (29) mutációt a B73-6-1 transzformált törzsben. A glicin-szerin szekvencia csere azáltal befolyásolja a szemkeménységet, hogy hatására a hidrofóbicitás csökken. Ugyanakkor a ciszteinek számának csökkenése a puroindolinok szerkezetében okoz olyan változásokat melynek hatására a purondolinok lipidkötő képessége csökken. Ennek eredményeként megerősödik a kölcsönhatás a keményítő és a fehérjemátrix között és keményebb endospermium szerkezet alakul ki. A diploid fajok esetén azonosítottunk két olyan genotípust, mely kemény szemtípussal rendelkezett ellentétben az eddig közölt irodalmi adatokkal melyek szerint valamennyi diploid faj puhaszemű. Ezek az Aegilops umbellulata (UU) és az Aegilops speltoides (SS). Ugyancsak említésre méltó a Triticum sinskajae (AA) és az Aegilops uniaristata (NN) melyekről eddig nem jelentek meg adatok az irodalomban. A diploid T. sinskajae (AA) esetén két pontmutációt találtunk a puroindolin-b génjében, melyek közül csak egy okoz aminósavcserét. A génről fehérje expresszálódik és puha szemtípust kapunk. A tetraploid fajok csoportjában három puhaszemű genotípust (Aegilops biuncialis (UM), Triticum turgidum ssp. Turgidum (AB), Aegilops cylindrica (DC)) és több olyan törzset azonosítottunk, amelyek tartalmaztak puroindolin géneket, annak ellenére, hogy hiányzik belőlük a D genom. Ez egy korábbi feltételezést támaszt alá, mely szerint a puroindolin gének nem csak a búza D genomján találhatók meg. A tetraploid fajokban a puroindolin-b szekvenciájában deléciót illetve pontmutációt azonosítottunk, melyek a fehérje expresszió hiányát illetve a puroindolin fehérjék szerkezetének és lipidkötő képességének a megváltozását eredményezik. Ennek hatására pedig kemény endospermium szerkezet jön létre. Vizsgálataink alapján deléciót tartalmaz például a tetraploid T. petropavlovsky (AB) puroindolin-b génje. A deléció következtében fehérje nem expresszálódik, ezért kemény szemtípust kapunk. Az UM genommal rendelkező tetraploid Aegilops biuncialis puroindolin-b szekvenciája és a róla expresszálódó fehérje a T.

Old alsz


aestivumétól jelentős mértékben különbözik, jelenléte puha endospermium szerkezetet eredményez. A kontrollként használt búzával rokon vad fajok a genetikai diverzitás növelésének eszközei lehetnek a búzanemesítésben, endospermium szerkezetükkel a szemek mérete és az ezerszemtömeg adták a legnagyob korrelációt. 7.3

A keményítő tulajdonságainak diverzitás vizsgálata a beltartalmi tulajdonságok

variabilitásának növelésére A régi magyar búzafajták és tájfajták szintén fontos forrásai lehetnek a búza genetikai diverzitásának növelésében. A Bánkúti 1201 régi magyar búzafajta populációt HMW glutenin alegység összetétel alapján törzseire bontottuk és ezen törzsek keményítőjének tulajdonságait tanulmányoztuk. Vizsgálataink alapján nagy variabilitást találtunk a törzsek amilóz tartalmában (14.4%-24.2%), az RVA-vel mért viszkozitás értékekben (232-372 RVU, csúcsviszkozitás), és a gélesedéshez szükséges energia értékében (∆H= 8.3 és 16.3 J/g) is. Néhány Bánkúti 1201 törzs amilóz tartalma alacsonyabb volt a részlegesen waxy genotípusénál, markerszelekcióval azonban megállapítottuk, hogy a Bánkúti 1201 valamennyi törzse tartalmazza mindhárom waxy allélt. Még nem ismert azonban, hogy vajon mindhárom allél aktív-e a különböző törzsekben, illetve tartalmaznak-e mutációt az allélekben, amelyek befolyásolják a GBSS aktivitását. Ezen felül más a keményítő szintézisében szerepet játszó enzim is hatással lehet az amilóz mennyiségére. A törzsek közötti különbözőségek megállapítására Hierarhikus Klaszter analízist végeztünk a HPLC, RVA és DSC-vel mért keményítő tulajdonságok alapján. Az eredmények szerint a Bánkúti törzsek öt csoportját különböztettük meg és megállapítottuk, hogy a HMW glutenin összetétel alapján heterogén Bánkúti 1201 populáció keményítő tulajdonságait tekintve is heterogén. A magas amilóztartalmú törzsek között egyaránt előfordulnak 2*b alegységet tartalmazó és/vagy 1Bx7 túltermelő genotípusok és normál tartalékfehérje öszetételű törzsek. Ennek megfelelően mód van a régi magyar búzafajták nemesítésben való alkalmazásakor egy kétdimenziós mátrixhatás alapján kiválasztani a legmegfelelőbb tulajdonságpárral rendelkező törzseket.

Mind a fogyasztó, mind az ipar igényeit kielégíteni kívánó új búzafajták nemesítésekor a gabonakémia komplex eszközrendszerét szimultán, egymás mellett kell alkalmazni, és egymástól független géncsoportoknak a kémiai összetételre és morfológiai tulajdonságokra gyakorolt hatását kell követni, hogy a megfelelő keresztezésekkel a kívánt tulajdonság kombinációt végül létre tudjuk hozni.

Old alsz

Köszönetnyilvánítás

Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretnék köszönetet mondani szüleimnek és barátaimnak támogatásukért továbbá mindazoknak akik hozzájárultak dolgozatom elkészítéséhez. Köszönet szakmai vezetőimnek, dr Bedő Zoltán és Prof Lásztity Radomir konzulenseimnek hasznos tanácsaikért és támogatásukért. Hálával tartozom dr Bedő Zoltánnak és dr. Láng Lászlónak, mint munkahelyi vezetőimnek, amiért biztosították a lehetőséget a hazai és a külföldi tudományos munkámhoz, illetve a dolgozat elkészítéséhez. Köszönetem fejezem ki a Magyar Oktatási Minisztériumnak valamint dr. Matthew Morellnek a négy hónapos külföldi tanulmányútért a CSIRO Plant Industry (Canberra) laboratóriumában. Külön köszönetem fejezem ki dr. Békés Ferencnek, dr. Tamás Lászlónak, dr Vida Gyulának és dr. Ian Bateynek a gyakorlati munkában, a dolgozat megírásában nyújtott segítségükért, hasznos tanácsaikért. Köszönetem fejezem ki továbbá kollégáimnak, dr. Szalai Gabriellának, dr. Szűcs Péternek, dr Juhász Angélának, Pál Magdának, dr. Barbara Curtin-nek és dr. Andrew Pedler-nek szakmai segítségükért. Köszönöm a lisztlabor dolgozóinak, Szanyó Sándornénak, Szántai Mihálynénak és Szeidl Antalnénak a minőségvizsgálatokban valamint Illés Klárának a DNS izolálásban nyújtott segítségét. Végezetül köszönetem Harasztos Barbarának a munkámmal kapcsolatos angol lektori teendők ellátásáért.

Old alsz

Nyilatkozat

NYILATKOZAT

Alulírott Rakszegi Mariann kijelentem, hogy ezt a doktori értekezést magam készítettem és abban csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, amelyet szó szerint, vagy azonos tartalomban, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelműen, a forrás megadásával megjelöltem.

………………………………………

Martonvásár, 2004. 09. 10.

Old alsz

8. Irodalomjegyzék

8

IRODALOMJEGYZÉK

Ahmad M. 2000. Molecular marker assisted selection of HMW glutenin alleles related to wheat bread quality by PCR-generated DNS markers. Theoretical and Applied Genetics 101: 892-896. Alpeter F.,Vasil V.,Srirastava V.,Vasil I.K.: 1996a. Integration and expression of the highmolecularweight glutenin subunit 1Ax1 gene into wheat. Nature Biotechnology, 14: 11551159. Alpeter F., Diaz I.McAuslane H.Gaddour K.Carbonero P., Vasil I.K: 1999. Increased insect resistance in transgenic wheat stably expressing trypsin inhibitor CMe. Molecular Breeding, 5: 5363. Alpeter F., Vasil V., Srivastava V., Stöger E., Vasil I.K: 1996b. Accelerated production of transgenic wheat (Triticum aestivum L.) plants. Plant Cell Reports, 16: 1217. Altpeter F., Vasil V., Srivastava V., Vasil I.K. 1997. Integration and expression of the highmolecular–weight subunit 1Ax1 gene into wheat. Nature Biotechnology 14: 1155-1159. Alvarez M.L., Guelman S., Halford N.G., Lustig S., Reggiardo M.I., Ryabushkina N., Shewry P., Stein J., Vallejos R.H. 2000. Silencing of HMW glutenins in transgenic wheat expressing extra HMW subunits. Theor. Appl. Genet. 100: 319-327. Alvarez M.L., Guelman S., Halford N.G., Lustig S., Reggiardo M.I., Ryabushkina N., Shewry P., Stein J., Vallejos R.H.: 2000. Silencing of HMW glutenins in transgenic wheat expressing extra HMW subunits. Theoretical Applied Genetics 100: 319327. American Association of Cereal Chemist, 2000. Approved methods of the AACC. Method 54-40A, Physical Dough Tests. Mixograph Method.,10th ed, The Association, St Paul, MN. American Association of Cereal Chemists (1991) Approved Methods of the AACC, 8th ed., St Paul, MN. American Association of Cereal Chemists.: 1983. Approved methods of the AACC. 8th Ed. AACC, St. Paul, MN, USA. Anderson J.M, Larsen R, Laudencia D, Kim W.T, Morrow D, Okita T.W, Preiss J. 1991. Molecular characterisation of the gene encoding a rice endosperm specific ADPglucose pyrophosphorylase subunit and its developmental pattern of transcription. Gene 97: 199-205. Baga M., Chibbar R.N., Kartha K.K.: 1999a. Expression and regulation of transgenes for selection of transformants and modification of traits in cereals. Molecular Improvement of Cereal Crops. In Vasil IK (eds), Advances in Cellular and Molecular Biology of Plants, 5: 83131. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. Ball S, Guan H.P, James M, Myers A, Keeling P, Mouille G, Buléon A, Colonna P, Preiss J. 1996. From glycogen to amylopectin: A model for the biosynthesis of the plant starch granule. Cell 86: 349-352. Barabás Z., Matuz J., Kertész, Z. 1987. A búza nemesítése. In: Barabás Z. (ed.): A búzatermesztés kézikönyve. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest. 117-222. Barlow K.K, Butrose M.S, Simmonds D.H, Vesk M. 1973. The nature of the starch-protein interface in wheat endosperm. Cereal Chemistry 50: 443-454. Barnabás B., Kovács G., Hegedűs A., Erdei S., Horváth G.: 2000. Regeneration of doubled haploid plants from in vitro selected microspores to improve aluminium tolerance in wheat. Journal of Plant Physiology, 156: 217222. Barnabás B., Szakács É, Karsai I., Bedő Z.: 2001. In vitro androgenesis of wheat: from fundamentals to practical application. Euphytica 119: 211-216. Barro F., Barcelo P., Lazzeri P.A., Shewry P.R., Martín A., Ballesteros J.2003. Functional properties and agronomic performance of transgenic Tritordeum expressing high molecular weight glutenin subunit genes 1Ax1 and 1Dx5. Journal of Cereal Science 37: 65-70. Barro F., Barcelo P., Lazzeri P.A., Shewry P.R., Martín A., Ballesteros J. 2002. Field evaluation and agronomic performance of transgenic wheat. Theor. Appl. Genet. 105: 980-984. Barro F., Rooke L., Békés F., Gras P., Tatham A.S., Fido R., Lazzeri P.A., Shewry P.R., Barcelo, P. 1997. Transformation of wheat with high molecular weight subunit genes results in improved functional properties. Nature Biotechnology 15: 1295-1299. Barro F.,Cannell M.E, Lazzeri P., Barcelo P.: 1998. Influence of auxins on transformation of wheat and tritordeum and analysis of transgene integration patterns in transformants. Theoretical Applied Genetics, 97: 684-695.

Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Barro F., Rooke L., Békés F., Gras P., Tatham A.S., Fido R., Lazzeri P.A., Shewry P.R., Barcelo P.: 1997. Transformation of wheat HMW subunit genes results in improved functional properties. Nature Biotechnology, 15: 1295-1299. BaruahWolff J., Harwood W.A., Lonsdale D.A., Harvey A., Hull R., Snape J.W. 1999. Luciferase as a reporter gene for transformation studies in rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Reports, 18: 715720. Batey I.L., Gupta R.B., MacRitchie F. 1991. Use of size-exclusion high-performance liquid chromatography in the study of wheat flour proteins: An improved chromatographic procedure. Cereal Chemistry 68: 207-209. Batey, I.L. Interactions of starch with glutens having different glutenin sub-units. Wheat Gluten (Ed. P.R. Shewry, A.S. Tatham) Proceedings of the 7th International Workshop Gluten 2000, Bristol, UK, 2000, pp. 499-502. Batey I.L., Curtin B.M. 1996. Measurement of amylose/amylopectin ratio by high-performance liquid chromatography. Starch/Starke, 48: 338-344. Batey I.L., Curtin B.M., Moore S.A. 1997. Optimization of rapid-visco analyser test conditions for predicting Asian noodle quality. Cereal Chemistry. 74: 497-501. Beasley H.L., Blanchard C.L, Bekes F. 2001. Preparative method for in vitro production of functional polymers from glutenin subunits of wheat. Cereal Chem. 78: 464-470. Beasley H.L., Uthayakumaran S., Stoppard F.L., Partridge S.J., Daqiq L., Chong P., Békés F. 2002. Synergistic and additive effects of three high molecular weight glutenin subunit loci. II. Effects on wheat dough functionality and end-use quality. Cereal Chem. 79: 301-307. Bechtel D.B, Zayas I, Kaleikau L, Pomeranz Y. 1990. Size-distribution of wheat starch granules during endosperm development. Cereal Chemistry 67: 59-63. Bechtel D.B, Zyasas I, Dempster R, Wilson J.D. 1993. Size-distribution of starch granules isolated from hard red winter and soft red winter wheats. Cereal Chemistry 70: 238-240. Becker D., Brettschneider R., Lörz H. 1994. Fertile transgenic wheat from microprojectile bombardment of scutellar tissue. Plant Journal 5: 299307. Bedő Z., Láng L., Vida Gy., Weszelyné V.H. 1998. The endospermium structure of Martonvásár wheat varieties. Martonvásár, 2: 7-8. Bedő Z., Vida Gy., Láng L., Karsai I. 1998. Breeding for breadmaking quality using old Hungarian wheat varieties. Euphytica, 100: 179-182. Bedő Z., Kárpáti M., Vida Gy., Kramarik-Kissimon J., Láng L. 1995. Good breadmaking quality wheat (Triticum aestivum L.) genotypes with 2+12 subunit composition at the Glu-D1 locus. Cereal Research Communications. 23: 283-289. Beecher B, Smidansky E.D, See D, Balke T.K, Giroux M.J. 2001. Mapping and sequence analysis of barley hordoindolines. Theoretical and Applied Genetics 102: 833-840. Békés F., Anderson O., Gras P.W., Gupta R.B., Tam A., Wrigley C.W., Appels R. 1994c. The contributions to mixing properties of 1D HMW glutenin subunits expressed in a bacterial system. In: Improvement of cereal quality by genetic engineering. Proceedings of the Royal Australian Chemistry Institute, Cereal Chemistry Division Symposium on Improvement of Cereal Quality by Genetic Engineering. R.J. Henry and J.A. Ronalds eds., Sydney, Australia, 12-16 September 1993. 97-103. Békés F., Gras P.W., Gupta R.B. 1994a. Mixing properties as a measure of reversible reduction/oxidation of doughs. Cereal Chem. 71:44-50. Békés F., Gras P.W., Gupta R.B., Hickman D.R., Tatham A.S. 1994b. Effects of a high Mr Glutenin Subunit (1Bx20) on the dough mixing properties of wheat flour. J. Cereal Sci. 19:3-7. Békés F, Smied I. 1981. Assay into the protein-lipid complexes of wheat flour soluble in petroleum ether. Acta Alimentaria 10: 229-253. Bettge A.D, Morris C.F. 2000. Realtionship among grain hardness, pentosan fractions and end-use quality of wheat. Cereal Chemistry 77: 241-247. Bhattacharyya M, Smith A.M, Ellis T.H.N, Hedley C, Martin C. 1990. The wrinkled-seed character of pea described by Mendel is caused by a transposone-like insertion in a gene encoding starchbranching enzyme. Cell 60: 115-122.

Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Bietz J.A. 1987. Genetic and biochemical studies of enzymatic endosperm proteins. In: ’Wheat and Wheat Improvement’ (E.G. Heyne, ed.), American Society of Agronomy Inc. Crop Science Society of America Inc. Soil Science Society of America Inc., Madison, Wisconsin pp. 215-241. Biffen, R.H. 1908. On the inheritance of „strength” in wheat. J. Agric. Sci. 3: 86-101. Blechl A.E., Anderson O.D. 1996. Expression of a novel high-molecular-weight glutenin subunit gene in transgenic wheat. Nature Biotechnology 14: 875-879. Blechl A.E., Anderson O.D. 1996. Expression of a novel highmolecularweight glutenin subunit in transgenic wheat. Nature Biotechnology 14: 875879. Blechl A.E., Le H.Q., Anderson O.D. 1998. Engineering changes in wheat flour by genetic transformation. Journal of Plant Physiology 152: 703707. Blochet J.E, Chevalier C, Forest E, Pebay-Peyroula E, Gautier M.F, Joudrier P, Pezolot M, Marion D. 1993. Complete amino acid sequence of puroindoline, a new basic and cystine-rich protein with a unique tryptophan-rich domain, isolated from wheat endosperm by Triton X-114 phase partitioning. FEBS Letters 329. 336-340. Boggini G., Cattaneo M., Paganoni C., Vaccino P. 2001. Genetic variation for waxy proteins and starch properties in Italian wheat germplasm. In: Wheat in a Global Environment (Ed. Z. Bedő and L. Láng.) Proceedings of the 6th International Wheat Conference, Budapest, Hungary, 2001, pp. 249-253. Bohn M, Utz H.F, Melchinger A.E. 1999. Genetic similarities among winter wheat cultivars determined on the basis of RFLPs, AFLPs, and SSRs and their use for predicting progeny variance. Crop Science 39: 228-237. Bordier C. 1981. Phase separation of integral membrane proteins in Triton X114 solution. J. Biol. Chem. 256: 1604-1607. Boyer C.D., Damewood P.A, Simpson E.K.G. 1980. Effect on gene dosage at high amylose loci on the properties of the amylopectin fractions of the starches. Starch 32: 217-222. Bregitzer, P.Halbert, S.E.Lemaux, P.G. 1998. Somaclonal variation in the progeny of transgenic barley. Theoretical Applied Genetics. 96: 421425. Briarty L.G, Hughes C.E, Evers A.D. 1979. The developing endosperm of wheat-a stereological analysis. Annals of Botany 44: 641-658. Bryan G.J, Collins A.J, Stephenson P, Orry A, Smith J.B, Gale M.D. 1997. Isolation and characterisation of microsatellites from hexaploid bread wheat. Theoretical and Applied Genetics 94: 557-563. Bushuk W. 1998. Interactions in wheat doughs. In: Interactions: The Keys to Cereal Quality (R.J. Hamer and R.C. Hoseney eds.) AACC, St. Paul, Minnesota, USA, pp. 1-15. Butow B.J., Tatham A.S., Savage A.W.J., Gilbert S.M., Shewry P.R., Solomon R.G., Békés F. 2003. Creating a balance-the incorporation of a HMW glutenin subunit into transgenic wheat lines. Journal of Cereal Science 38: 181-187. Caddick M.X., Greenland A.J., Jepson I., Krause, K.P., Qu N., Riddell K.V., Salter M.G., Schuch W., Sonnewald U., Tomsett A.B. 1998. An ethanol inducible gene switch for plants used to manipulate carbon metabolism. Nature Biotechnology, 16: 177-180. Cameron R.E, Durrani C.M, Donald A.M. 1994. Gelation of amylopectin without long range order. Starch 46: 285-287. Campbell K.G, Bergman C.J, Gualberto D.G, Anderson J.A, Giroux M.J, Hareland G, Fulcher R.G, Sorrels M.E, Finney P.L. 1999. Quantitative trait loci associated with kernel traits in a softxhard wheat cross. Crop Science 39: 1184-1195. Cannell M.E., Barcelo P., Lazzeri P.A. 1998. Stability and heritability of marker genes in transgenic wheat and Tritordeum. In Slinkard AE (eds), Proceedings of the 9th International Wheat Genetic Symposium, 3: 9294. University Extension Press, University of Saskatoon, Canada. Chalmers K.J, Campbell A.W, Kretschmer J, Karakousis A, Henschke P, Pierens S, Harker N, Palotta M, Cornish G.B, Shariflou M.R, Rampling L.R, McLauchlan A, Daggard G, Sharp P.J, Holton T.a, Sutherland M.W, Appels R, Landridge P. 2001. Construction of three linkage maps in bread wheat, Triticum aestivum. Australian J. of Agricultural Research 52: 1089-1119. Chao S, Sharp P.J, Worland A.J, Warham E.J, Koebner R.M.D, Gale M.D. 1989. RFLP-based genetic linkage maps of wheat homologous group 7 chromosomes. Theoretical amd Applied Genetics 78: 495-504.

Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Chaure P., Gurr S.J., Spanu P. 2000. Stable transformation of Erysiphe graminis, an obligate biotrophic pathogen of barley. Nature Biotechnology 18: 205-207. Chawla H.S., Cass L.A., Simmonds J.A. 1999. Developmental and environmental regulation of anthocyanin pigmentation in wheat tissues transformed with anthocyanin regulatory genes. In Vitro Cellular and Developmental BiologyPlant 35: 403-408. Chen L., Zhang S., Beachy R.N., Fauquet C.M.:1998. A protocol for consistent, largescale production of fertile transgenic rice plants. Plant Cell Reports, 18: 25-31. Cheng M., Fry J.E., Pang S., Zhou H., Hironaka C.M., Duncan D.R., Conner T.W., Wan, Y. 1997. Genetic transformation of wheat mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Physiology, 115: 971-980. Cheng X., Sardana R., Kaplan H., Altosaar I. 1998. Agrobacteriumtransformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer. Proceedings of the National Academy of Science, 95: 2767-2772. Chibbar R.N., Kartha K.K., Leung N, Qureshi J., Caswell K. 1991. Transient expression of marker genes in immature zygotic embryos of spring wheat (Triticum aestivum) through microprojectile bombardment. Genome 34: 453-460. Cho M.J., Jiang W., Lemaux P.G. 1999. Highfrequency transformation of oat via microprojectile bombardment of seedderived highly regenerative cultures. Plant Science 148: 9-17. Chong K., Bao S., Xu T., Tan K., Liang T., Zeng J, Huang H., Xu J., Xu Z. 1998. Functional analysis of the ver gene using antisense transgenic wheat. Physiologia Plantarum, 102: 87-92. Christensen, A.H.Sherrock, R.A.Quail, P.: 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Molecular Biology, 18: 675689. Cloutier S., Lukow O.M. 1998. Cloning and expression of a rare LMW glutenin. Proceedings of the 9th International Wheat Genetics Symposium. Saskatoon, Sk. Vol. 3:2-4. Cobb N.A.. 1896. The hardness of grain in the principal varieties of wheat. Agric. Gazette N.S.W, 7: 279-299. Craig J, Lloyd J.R, Tomlinson K, Barber L, Edwards A, Wang T.L, Martin C, Hedley C.L, Smith A.M. 1998. Mutations in the gene encoding starch synthase II profoundly alter amylopectin structure in pea embryos. The plant Cell 10: 413-426. Crosbie G.B, Lambe W.J, Tsutsui H, Gilmour R.F. 1992. Further evaluation of the flour swelling volume test for identifying wheats potentially suitable for Japonese noodles. J. of Cereal Science 15: 271-280. Crosbie G.B, Lambe W.J. 1993. The application of the flour swelling volume test for potential noodle quality to wheat breeding lines affected by sprouting. J. of Cereal Science 18: 267-276. Crosbie G.B. 1991. The relationship between starch swelling properties, paste viscosity and boiled noodle quality in wheat flours. J. of Cereal Science 13: 145-150. Cumming DB, Tung M.A. 1975. The ultrastructure of commercial wheat gluten. J. Inst. Can. Technol. Aliment. 8: 67-73. D’Ovidio R, Anderson O.D. 1994. PCR analysis to distinguish between alleles of a member of a multigene family correlated with wheat bread-making quality. Theoretical Applied Genetics 88: 759-763. D’Ovidio R., Masci S., Porceddu E., Kasarda D.D. 1997. Duplication of the Bx7 high-molecularweight glutenin subunit gene in bread wheat (Triticum aestivum L.) cultivar ’Red River 68’. Plant Breeding, 116: 525-531. Darlington H.F, Tesci L, Harris N, Griggs D, Cantrell I, Shewry P.R. 2000. Starch granule associated proteins in barley and wheat. J. of Cereal Science 32: 21-29. Darlington H., Fido R., Tatham A.S., Jones H., Salmon S.E., Shewry P.R. 2003. Milling and baking properties of field grown wheat expressing HMW subunit transgenes. Journal of Cereal Science 38: 301-306. Davis W. H, Middleton G.K, Herbert TT. 1961. Inheritance of protein, texture, and yield in wheat. Crop Sci. 1: 235-238. Day L, Greenwell P, Lock S, Brown H. 1999. Analysis of wheat flour proteins related to grain hardness using capillary electrophoresis. J. of Chromatography 836: 147-152. De Block M.De, Sonville A., Debrouwer, D. 1995. The selection mechanism of phosphinotricin is influenced by the metabolic status of the tissue. Planta 197: 619626. Old alsz

8. Irodalomjegyzék

De Block, M., Debrouwer D., Moens T. 1997. The development of a nuclear male sterility system in wheat. Expression of the barnase gene under the control of tapetum specific promoters. Theoretical Applied Genetics 95: 125131. Denyer K, Dunlap F, Thorbjorsen T, Keeling P, Smith A. 1996. The major form of ADP-glucose pyrophosphorylase in maize endosperm is extra-plastidial. Plant Physiology 112: 779-785. Denyer K., Hylton C.M., Jenner C.F., Smith A.M. 1995. Identification of multiple isoforms of soluble and granule-bound starch synthase in developing wheat endosperm. Planta 196: 256-265. Dexter J.E, Marchylo B.A, MacGregor A.W, Tkachuk R. 1989. The structure and protein composition of vitreous piebald and starchy durum wheat kernels. J. of Cereal Science 10: 19-32.

Digeon J.F, Guiderdoni E, Alary R, Michaux-Ferriere N, Jourdrier P, Gautier M.F. 1999. Cloning of a wheat puroindoline gene promoter by IPCR and analysis of promoter regions required for tissue-specific expression in transgenic rice seed. Plant Molecular Biology 39: 1101-1112. Don, C., Lichtendonk W.J., Plijter J.J., R.J. Hamer. 2003. Understanding the link between GMP and dough: from glutenin particles in flour towards developed dough. Journal of Cereal Science 38: 157-165. Douliez J.P, Michon T, Elmorjani K, Marion D. 2000. Structure, biological and technological functions of lipid transfer proteins and indolins, the major lipid binding proteins from cereal kernels. J. of Cereal Science 32: 1-20. Drenkard E, Richter B.G, Rozen S, Stutius L.M, Angell N.A, Mindrinos M, Cho R.J, Oefner P.J, Davis R.W, Ausubel F.M. 2000. A simple procedure for the analysis of single nucleotid polymorphisms facilitates map-based cloning in arabidopsis. Plant Physiology 124: 1483-1492. Dubcovky J, Luo M.C, Zhong G.Y, Bransteitter R, Desai A, Kilian A, Kleinhofs A, Dvorak J. 1996. Genetic map of diploid wheat, Triticum monococcum L., and its comparison with maps of Hordeum Vulgare L. Genetics 143: 983-999. Dubriel L, Compoint J.P, Marion D. 1997. The interaction of puroindolines with wheat polar lipids determines their foaming properties. J. of Agriculture and Food Chemistry 45: 108-116. Dubriel L, Gaborit t, Bouchet B, Gallant D, Broekaert W.F, Quillien L, Marion D. 1998. Spatial and temporal distribution of puroindolines and non specific lipid transfer protein in vitro antifungal properties. Plant Science 138: 121-135. Ebinuma H., Sugita K., Matsunaga E., Yamakado M. 1997. Selection of markerfree transgenic plants using the isopentenyl transferase gene as a selectable marker. Proceedings of the National Academy of Science, 94: 2117–2121. Eckermann P.J, Verbyla A.P, Cullis B.R, Thompson R. 2001. The analysis of quantitative traits in wheat mapping populations. Australian J. of Agricultural Research 52: 1195-1206. Edwards A, Fulton D.C, Hylton C.M, Jobling S.A, Gidley M, Rossner U, Martin C, Smith A.M. 1999. A combined raduction in the activity of starch synthases II and III of potato has novel effects on the starch of tubers. Plant Journal 17: 251-262. Endo T.R, Gill B.S. 1996. The deletion stock of common wheat. J. of Heredity 87: 295-307. Erpelding J.E, Blake N.k, Blake T.K, Talbert L.E. 1996. Transfer of sequence tagged site PCR markers between wheat and barley. Genome 39: 802-810. Evers A.D 1971. Scanning electron microscopy of wheat starch. III. Granule developement in endosperm. Starch 23: 157-162. Fido R.J., Békés F., Gras P.W., Tatham A.S. 1997. Effects of alpha-, beta-, gamma-, and omegagliadins on the dough mixing properties of wheat flour. Journal of Cereal Science 26: 271-277. Fischer P., Fuller G.G, Lin Z. 1997. Branched viscoelastic surfactant solutions and their response to elongational flow. Rheologica Acta 36: 632-638. Flipse E, Suurs L, Keetels C.J.A.M, Kossmann J, Jacobsen E, Visser R.G.F. 1996. Introduction of sense and antisense cDNA for branching enzyme in the amylose-free potato mutant leads to physico-chemical changes in the starch. Planta 198: 340-347. Forde J., Malpica J.M., Halford N.G., Shewry P.R., Anderson O. D., Green F.C., Miflin B.J. 1985. The nucleotide sequence of a HMW glutenin subunit gene located on the chromosome 1A of wheat. NAR 13: 6817-6832. Gale M.D, Devos K.M. 1997. Homologous group 7. In: (P.E. McGuire and C.O. Qualset, eds.), Progress in genome mapping of wheat and related species. (joint Proc. 5th 6th Public Workshop

Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Int Triticeae Mapping Initiative). Genetic Resources Conservation Program, University of California, Davis, Ca pp. 107-120. Gao M, Fisher D.K, Kim K.N, Shannon J. C, Guiltinan M.J. 1996. Evolutionary conservation and expression patterns of maize starch branching enzyme IIA and IIB genes suggest isoform specialisation. Plant Molecular Biology 30: 1223-1232. Gao M, Wanat J, Stinard P.S, James M.G, Myers A.M. 1998. Characterization of dull, a maize gene coding for a novel starch synthase. The Plant Cell 10: 399-412. Gárdonyi M., Juhász A., Rakszegi M., Tamás L., Bedő Z. 2004. A Bánkúti 1201 búza populáció Bx7 HMW glutenin összetételének vizsgálata PCR alapú markerekkel. X. Növénynemesítési Tudományos Napok, Összefoglalók p 28. Gautier M.F, Aleman A.E, Guirao A, Marion D, Jourdier P. 1994. Triticum aestivum puroindolines, two basic cystine-rich seed proteins? CDNA sequence and developmental gene expression. Plant Molecular Biology 25: 43-57. Gautier M.F, Cosson P, Guiaro A, Alary R, Joudrier P. 2000. Puroindoline genes are highly conserved in diploid ancestor wheat and related species but asent in tetraploid Triticum species. Plant Science 153: 81-91. Gidley M.J. 1989. Molecular mechanisms underlying amylose aggregation and gelation. Macromolecules 22: 351-358. Giroux M.J, Morris C.F. 1997. A glycine to serine change in puroindoline b is associated with wheat grain hardness and low levels of starch-surface friabilin. Theoretical and Applied genetics 95: 857-864. Giroux M.J, Morris C.F. 1998. Wheat grain hardness results from highly conserved mutations in the friabilin components puroindoline a and b. Proceedings of the National Academy of Science, USA 95: 6262-6266. Giroux M.J, Talbert L, Habernicht D.K, Lanning S, Hempill A, Martin J.M. 2000. Association of puroindoline sequence type and grain hardness in hard red spring wheat. Crop Science 40: 370374. Grafius J.E. 1956. Components os yield in oat: a geometrical interpretation. Agronomy Journal 48: 419-423. Greenland, A.J.Bell, P.Hart, C.Jepson, I.Nevshemal, T.Register, III J.Wright, S.: 1997. Reversible male sterility: a novel system for the production of hybrid corn. The Society of Experimental Biology SEB 1044: 141147. Greenwell P, Schofield J.D. 1986. A starch granule protein associated with endosperm softness in wheat. Cereal Chemistry 63: 379-380. Greenwell P. 1992. Biochemical studies of endosperm texture in wheat. Chorleywood Digest 118: 7476. Griffin T.J, Smith L.M. 2000. Single-nucleotide polymorphism analysis by MALDI-TOF mass spectrometry(Review). Trend is Biotechnology 18: 77-84. Gross E, Arnold N, Goette J, Schwarz-Boeger U, Kiechle M. 1999. a comparision of BRCA1 mutation analysis by direct sequencing, SSCP and DHPLC. Human Genetics 105: 72-78. Gupta R.B., MacRitchie F. 1994. Allelic variation at glutenin subunit and gliadin loci, Glu-1, Glu-3 and Gli-1, of common wheats. II. Biochemical basis of the allelic effects on dough properties. J. Cereal Sci. 19:19-29. Gupta R.B., Paul J.G., Cornish G.B., Palmer G.A., Békés F., Rathjen A.J. 1994. Allelic variation at glutenin subunit and gliadin loci, Glu-1, Glu-3 and Gli-1, of common wheats. I. Its additive and interaction effects on dough properties. J. Cereal Sci. 19:9-17. Haldrup A., Petersen SG., Okkels FT. 1998. Positive selection: a plant selection principle based on xylose isomerase, an enzyme used in the food industry. Plant Cell Reports, 18: 76-81. Hamer R.J, Maarten G.van Oort, Garritsen A, Weegels P.L, Prieto J.A 1990. New methods to understand interactions in wheat flour doughs. Interactions between gliadins and flour lipids. In: Gluten Proteins 1990 pp. 296-303. Hamer R.J, Weegels W.P, Marseille J.P. 1992. Prediction of wheat bread-making quality of wheat: the use of HMW glutenin A subunit based quality scoring systems. J. of cereal Science 15: 91102.

Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Hankóczy J. 1914. A búza és búzaliszt minősítése. A magyar mérnök és építészegyesület közleménye, 16-17. Hannah L.C, Shaw J.R. 1998. Genomic nucleotide sequence of a wild type shrunken-2 allele of Zea mays. Plant Phisiology 98: 1214-1216. Harberd N.D., Bartels D., Thompson R.D. 1986. DNA restriction-fragment variation in the gene family encoding high molecular (HMW) glutenin subunits of wheat. Biochem. Genet. 24: 117126. Harn C, Knight M, Ramakrishnan A, Guan H.P, Keeling P.L, Wasserman B.P. 1998. Isolation and characterization of the SSIIa and SSIIb starch synthase cDNA clones from maize endosperm. Plant Molecular biology 37: 639-649. Harwood W.A., Ross S.M., Cilento P., Snape, J.W. 2000. The effect of DNA/gold particle preparation technique, and particle bombardment device, on the transformation of barley (Hordeum vulgare). Euphytica, 111: 67-76. He G.Y., Lazzeri P.A. 1998. Analysis and optimisation of direct DNA delivery into wheat scutellum and Tritordeum inflorescence explants by tissue electroporation (Triticum aestivum L.). Plant Cell Reports 18: 64-70. He G.Y., Rooke L., Steele S., Békés F., Gras P., Tatham A.S, Fido R., Barcelo P.Shewry, P.R., Lazzeri P.A. 1999. Transformation of pasta wheat (Triticum turgidum L. var. durum) with highmolecularweight glutenin subunit genes and modification of dough functionality. Molecular Breeding, 5: 377-386. Helguera M, Khan I.A, Dubcovsky J. 2000. Development of PCR markers for wheat leaf rust resistance gene Lr47. Theoretical and Aplied Genetics 101: 625-631. Hermansson A.M, Svegmark K. 1996. Developments in the understanding of starch functionality. Trends in Food Science and Technology 7: 345-353. Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumashiro T. 1994. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the TDNA. The Plant Journal 6: 271282. Hirschhorn J.N, Sklar P, Lindblad-Toh K, Lim Y.M, Ruiz-Gutierrez M, Bolk S, Langhorst B, Schaffner S, Winchester E, Lander E.S. 2000. SBE-TAGS: an array-based method for efficient single-nucleotide polymorphism genotyping. Proceeding of the National Academy of Sciences, USA 97: 12164-12169. Hoseney C.R., Wade P., Finley J.W. 1988. Soft wheat products . In: Pomeranz, Y. (ed.): Wheat chemistry and technology, part II. AACC, St. Paul, MN, USA, 407-456. Igrejas G, Gaborit t, Oury F.X, Chiron H, Marion D, Branlard G. 2000. Genetic and environmental effects on the contents of puroindolin-a and puroindoline-b, lipid binding proteins from bread wheats. Relathionship with hardness and breadmaking quality. Cereal chemistry 34: 37-47. Inkson N.J, McLeish T.C.B, Harlen O.G, Groves D.J. 1999. Predicting low density polyethylene melt rheology in elongational and shear flow wuth ’pom-pom’ constitutive equations. J. of Rheology 43: 873-896. International Association for Cereal Science and Technology, 1995. ICC 105/2 Determination of Crude Protein in Cereals and Cereal Products for Food and for Feed 1994, Vienna. International Association for Cereal Science and Technology, 1995. ICC 115/1 Method for using Brabender Farinograph 1972, Vienna. International Association for Cereal Science and Technology, 1995. ICC 116/1 Determination of the Sedimentation Value (according to Zeleny) as an Approximate Measure of Baking Quality 1972, Vienna. International Association for Cereal Science and Technology, 1995. ICC 121 Method for using of the Chopin-Alveograph 1972, Vienna. International Association for Cereal Science and Technology, 1995. ICC 137/1 Mechanical Determination of the Wet Gluten Content of Wheat Flour (Glutomatic) 1982, Vienna. International Association for Cereal Science and Technology, 1995. ICC 159 Determination of Protein by Near Infrared Reflectance (NIR) Spectroscopy 1995, Vienna. International Association for Cereal Science and Technology, 1995. ICC 202 Procedure for near infrared (NIR) reflectance analysis of ground wheat and milled wheat products 1986, Vienna. International Organization for standardization, ISO 3093-1982 Cereals. Determination of falling number. Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Iriki N., Yamauchi F., Takada H., Kuwabara T. 1987. Evaluation of flour quality and screening method for Japanese noodles in wheat breeding. Res. Bull. Hokkaido Natl. Agr. Exp. Stn. 148: 85-94. Iser M., Fetting S., Scheyhing F., Viertel K., Hess D. 1999. Genotypedependent stable genetic transformation in German spring wheat varieties selected for high regeneration potential. Journal of Plant Physiology, 154: 509-516. Jach G., Binot E., Frings S, Luxa K, Schell J. 2001. Use of red fluorescent protein from Discosoma sp. (dsRED) as a reporter for plant gene expression. The Plant Journal, 28: 483-491. Jackson E.A., Morel M.H., Strohm T., Branlard G., Metakovsky E.V., Redaelli R. 1996. Proposal for combining the classification systems of alleles of Gli-1 and Glu-3 loci in bread wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Genetics and Breeding 50: 321-336. Jagtap S.S, Beardsley A, Forrest J.M.S, Ellis R.P. 1993. Protein composition and grain quality in barley. Aspects of Applied Biology 36: 51-60. James M.G, Robertson M.G, Myers A.M. 1995. Characterisation of the maize gene sugary 1, a determinant of starch composition in kernels. The Plant Cell 7: 417-429. Jane J.L, Chen J.F. 1992. Effect of amylose molecular size and amylopectin branch chain length on paste properties of starch. Cereal Chemistry 69: 60-65. Jefferies S.P, Pallotta M.A, Paull J.G, Karakousis A, Kretschmer J.M, Manning S, Islam AKMR, Landridge P, Chalmers K.J. 2000. Mapping and validation of chromosome regions conferring boron toxicity tolerance in wheat (Triticum aestivum). Theoretical and Applied Genetics 101: 767-777. Jefferson R. 1987. Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system. Plant Molecular Biology Reporter, 5: 387405. Jelenska J.Tietze, E.Tempe, J.Brevet, J. 2000. Streptothricin resistance as a novel selectable marker for transgenic plant cells. Plant Cell Reports, 19: 298-303. Jolly C.J, Rahman S, Kortt A.A, Higgins T.J.V. 1993. Characterisation of the wheat Mr 15000 ’grain softness protein’ and analysis of the relationship between its accumulation in the while seed and grain softness. Theoretical and Applied Genetics 86: 590-597. Jolly CJ., Glenn GM ,Rahman S. 1996. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93: 2408-2413. Joppa L.P, Du C, Hart G.E, Hareland G.A. 1997. Mapping gene(s) for grain protein in tetraploid wheat (Triticum turgidum L.) using a population of recombinant inbread chromosome lines. Crop Science 37: 1486-1589. Juhász A., O.R. Larroque, L. Tamás, S.L.K. Hsam, F.J. Zeller, F. Békés and Z. Bedő 2003. Bánkúti 1201 - an old Hungarian wheat variety with special storage protein composition. Theor and Appl Genet. 107:697-704. Karsai I., Bedő Z., Balla L. 1993. Effect of donor plant growth environment on in vitro androgenesis in wheat (Triticum aestivum L.). Acta Agronomica Hungarica, 42: 39. Karsai I., Bedő Z., Hayes P.M. 1994a. Effect of induction medium pH and maltose concentration on in vitro androgenesis of hexaploid winter triticale and wheat. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 39: 49-53. Karsai I., Bedő Z., Kovács G., Barnabás B. 1994b. The effect of in vivo and in vitro aluminum treatment on anther culture response of triticale x wheat hybrids. Journal of Genetics and Breeding, 48: 353-357. Karunaratne S., Sohn A.A, Scott J., Steinbiss HH., Scott KJ. 1996. Transformation of wheat with the gene encoding the coat protein of barley yellow mosaic virus. Australian Journal of Plant Physiology, 23: 429-435. Khan A.A, Bergstrom G.C, Nelson J.C, Sorrels M.E. 2000. Identification of RFLP markers for resistance to wheat spindle streak mosaic bymovirus 8WSSMV) disease. Genome 43: 477-482. Kikkert, J.R. 1993. The Biolistic PDS1000/He device. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 33: 221226. Knight M.E, Harn C, Lilley C.E.R, Guan H.P, Singletary G.W, Mu-Forster C.M, Wasserman B.P., Keeling P.L. 1998. Molecular cloning of starch synthase I from maize (w64) endosperm and expression in Escherichia coli. Plant Journal 14: 613-622.

Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Kohli A., Gahakwa D., Vain P., Laurie DA, .Christou P. 1999. Transgene expression in rice engineered through particle bombardment: Molecular factors controlling stable expression and transgene silencing. Planta, 208: 88-97. Komari T, .Hiei Y., Saito Y., Murai N., Kumashiro T. 1996. Vectors carrying two separate TDNAs for cotransformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers. Plant Journal, 10: 165-174. Korzun V, Borner A, Worland A.J, Law C.N, Röder M.S. 1997. Application of microsatellite markers to distinguish inter-varietal chromosome substitution lines of wheat (Triticum aestivum L.). Euphytica 95: 149-155. Kreis M., Forde B.G., Rahman S., Miflin B.J., Shewry, P.R. 1985a. Molecular evolution of the seed storage proteins of barley, rye and wheat. Journal of Molecular Biology 183: 499-502. Kreis M., Shewry P.R., Forde B.G., Forde J, Miflin B.J. 1985b. Structure and evolution of seed storage proteins and their genes, with particular reference to those of wheat, barley and rye. In Oxford Surveys of Plant Cell and Molecular Biology Vol. 2 (ed. B.J. Miflin), Oxford University Press, Oxford, pp. 253-317. Krishnamurthy K, Giroux M.J. 2001. Expression of wheat puroindoline genes in transgenic rice enhances grain softness. Nature Biotechnology 19: 162-166. Kyozuka J., Fujimoto H., Izawa T., Shimamoto K. 1991. Anaerobic induction and tissuespecific expression of maize Adh1 promoter in transgenic rice plants and their progeny. Molecular and General Genetics 228: 40-48. Landridge P, Lagudah E.S, Holton T.A, Appels R, Sharp P.J, Chalmers K.J. 2001. Trends in genetic and genome analysis in wheat: a review. Australian J. of Agricultural Research 52: 1043-1077. Láng L.- Bedő Z.- Juhász A.- Weselyné V.H.: 1999. Investigation of wheat kernel hardness. V. Scientific Research Days of Plantbreeding, Hungarian Academy of Sciences, Budapest, Abstracts p. 21. Larsson H, Eliasson A.C. 1997. Influense of the starch granule surface on the rheological behaviour of wheat flour dough. J. of Texture Studies 28: 487-501. Lásztity, R. The chemistry of cereal proteins. CRC Press, Boca Raton, 19-138, 1996 Lawrence G.J.F., MacRitchie F., Wrigley W. 1988. Dough and baking quality of wheat lines deficient in glutenin subunits controlled by the Glu-A1, Glu-B1, and Glu-D1 loci. J. Cereal Sci. 7: 109112. Lawrence, G.J., Shepherd, K.W. 1980. Variation in glutenin protein subunits of wheat. Aust. J. Biol. 33:221-233. Lazzeri PA., Barcelo P., Barro F., Rooke L., Cannell M.E., RascoGaunt S., Tatham A.S., Fido, R, Shewry P.R.. 1997. Biotechnology of cereals: genetic manipulation techniques and their use for the improvement of quality, resistance and input use efficiency traits. In Optimising cereal inputs: its scientific basis. Part 1. Cirencester, UK. Aspects of Applied Biology, 50: 1-8. Leckband, G.Loerz, H. 1998. Transformation and expression of a stilbene synthase gene of Vitis vinifera L. in barley and wheat for increased fungal resistance. Theoretical Applied Genetics, 96: 1004-1012. Leloup V.M, Colonna P, Ring S.G, Roberts K, Wells B. 1992. Microstructure of amylose gels. Carbohydrate Polymers 18: 189-197. Li Z, Chu X, Mouille G, Yan L, Kosar-Hashemi B, Hey S, Napier J, Shewry P.R, Clarke B.C, Appels R, Morell M.K, Rahman S. 1999. The localization, expression and role of the class II starch synthases of wheat. Plant Physiology 20: 1147-1156. Lillemo M, Morris C.F. 2000. A leucine to proline mutation in puroindoline-b frequently present in hard wheats from Northern Europe. Theoretical and Applied Genetics 100: 1100-1107. Liu Z, Sun Q, Ni Z, Yang T. 1999. Development of SCAR markers linked to the Pm21 gene conferring resistance to powdery mildew in common wheat. Plant Breeding 118: 215-219. Liu Z.W, Biyashev R.M, Saghai Maroof M.A. 1996. Development of simple sequence repeat DNA markers and their integration into a barley linkage map. Theoretical and applied Genetics 93: 869-876. Liu B.H. 1998. Statistical genomics. CRC Press: Boca Raton, FL.

Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Lloyd J.D, Landschutze V, Kossman J. 1999. Simultaneous antisense inhibition of two starch synthase isoforms in potato tubers leads to accumulation of grossly modified amylopectin. Biochemical Journal 338: 515-521. Lookhart G.L., Hagman K., Kasarda D.D. 1993. High-molecular-weight glutenin subunits of the most commonly grown wheat cultivars in the U.S. in 1984. Plant Breeding 110: 48-62. Lui Y.G, Mori N, Tsunewaki K. 1990. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis in wheat. I. Genomic DNA library construction and RFLP analysis in common wheat. Japanese J. of Genetics 65: 367-380. Lukow O.M., Forsyth S.A., Payne P.I. 1992. Over-production of HMW glutenin subunits coded on chromosome 1B in common wheat, Triticum aestivum. J. Genet and Breed. 46: 187-192. Lyznik L.A., Hirayama L., Rao K.V., Abad A., Hodges T.K. 1995. Heatinducible expression of FLP gene in maize cells. The Plant Journal. 8: 177-186. MacRitchie F., Kasarda D.D., Kuzmicky D.D. 1991. Characterization of wheat protein fractions differing in contribution to breadmaking quality. Cereal. Chem. 68: 122-130. Marchylo B.A., Kruger J.E., Hatcher D.W. 1989. Quantitative reversed-phase high-performance liquid chromatographic analysis of wheat storage proteins as a potential quality prediction tool. J. Cereal Sci. 9: 113-130. Marchylo B.A., Lukow O.M., Kruger J.E. 1992. Quantitative variation in high molecular weight glutenin subunit 7 in some Canadian wheat. J. Cereal Sci. 15: 29-37. Mares D.J, Stone B.A. 1973. Studies on wheat endosperm. I. Chemical composition and ultrastructure of cell walls. Australian J. of Biological Science 26: 793-812. Margiotta B., Urbano M., Colaprico G., Johansson E., Buonocore F., D' Ovidio R., Lafiandra D. 1996. Detection of y-type subunit at the Glu-A1 locus in some Swedish bread wheat lines. Journal of Cer. Sci. 23:3, 203-211. Marino C.L, Nelson J.C, Lu Y.H, Sorrels M.E, Leroy P, Tuleen N.A, Lopes C.R, Hart G.E. 1996. Molecular genetic maps of the group 6 chromosomes of hexaploid wheat (Triticum aestivum L. em. Thell.) Genome 39: 359-366. Marion D, Gautier M.F, Joudrier P, Ptak M, Pezolet M, Forest E, Clark D.C, Broekaert W. 1994. Structure and function of wheat lipid binding proteins. In: „Wheat Kernel Proteins, Molecular and Functional Aspects’, Universita delgi studi della Tuscia, Viterbo, Italy. Marion D., Dubreil, L. 1998. Lipids, lipid-protein interactions and the quality of baked cereal products. In: Interactions: The Keys to Cereal Quality (R.J. Hamer and R.C. Hoseney eds.) AACC, St. Paul, Minnesota, USA, pp. 131-167. Martin J.M, Frohberg R.C, Morris C.F, Talbert L.E, Giroux M.J. 2000. Milling and bread baking traits associated with puroindoline sequence type in hard red spring wheat. Crop science 41: 228234. Masci S., Lafiandra,D., Porceddu E., Lew E. J-L., Tao H.P., Kasarda, D.D. 1993. D-glutenin subunits: N-terminal sequences and evidence for the presence of cysteine. Cereal Chemistry 70: 581-585. Mattern P.J, Morris R, Schmidt J.W, Johnson V.A. 1973. Location of genes for kernel properties in the wheat variety ’Cheyenne’ using chromosome substitution lines. In ’Proceedings of the 4th International Wheat Genetics Symposium, Colombia, MO. Mc Elroy D., Blowers A.D., Jenes B., Wu R. 1991. Construction of expression vectors based on the rice actin 1 (Act1) 5’ region for use in monocot transformation. Molecular and General Genetics 231: 150-160. McIntosh R.A, Wellings C.R, Park R.F. 1995. Wheat rust: an atlas of resistance genes. (CSIRO: Melbourne). McIntosh R. A. 1988. Catalogue of gene symbols for wheat. In: Proc. of the Seventh Int. Wheat Genet. Symp. Vol. 2: 1225-1323. McIntosh R.A. 1998. Breeding for resistance to biotic stresses. Euphytica, 100: 19-34. McLeish T.C.B, Larson R.G. 1998. Molecular constitutive equations for a class of branched polymers: the pom-pom polymer. J. of Rheology 42: 81-110. Mesfin A, Frohberg R.C, Khan K, Olson T.C. 2000. Increased grain protein content and its association with agronomic and end-use quality in two hard red spring wheat populations derived from Triticum turgidum L. var. Dicoccoides. Euphytica 116: 237-242.

Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Millard M.M, Wolf W.J, Dintzis F.R, Willett J.L. 1999. The hydrodynamic characterisation of waxy maize amylopectin in 90% dimethyl sulphoxide-water by analytical ultracentrifugationm dynamic and static light scattering. Carbohydrate Polymers 39: 315-320. Mizuno K, Kawasaki T, Shimada H, Satoh H, Kobayashi E, Okumura S, Arai Y, Baba T. 1993. Alteration of the structural properties of starch components by the lack of an isoform of starch branching enzyme in rice seeds. J. of Biological Chemistry 268: 19084-19091. Molina A., Diaz I., Vasil I.K., Carbonero P., GarciaOlmedo F. 1996. Two coldinducible genes encoding lipid transfer protein LTP4 from barley show differential responses to bacterial pathogens. Molecular and General Genetics, 252: 162-168. Morell M.K, Blennow A, Kosar-Hashemi B, Samuel M.S. 1997. Starch branching enzymes in developing wheat endosperm. Plant Physiology 113: 201-208. Morin P.A, Saiz R, Monjazeb A. 1999. High-throughput single nucleotide polymorphism genotyping by fluorescent 5’ exonuclease assay. Biotchniques 27: 538-552. Morris C.F, Garrison E.K, Allan R.E, Simeone M.C. 2001. Identification and characterisation of nearisogenic hard and soft hexaploid wheats. Crop Science 41: 211-217. Morrison W.R, Law C.N, Wylie L.J, Coventry A.M, Seekings J. 1989. The effect of group 5 chromosomes on the free polar lipids and breadmaking quality of wheat. J. of Cereal Science 9: 41-51. Morrison W.R. 1988. Lipids in cereal starches: A review. J. of Cereal Science 8: 1-15. Morrison W.R., Gadan H. 1987. The amylose and lipid contents of starch granules in developing wheat endosperm. J. of Cereal Science 5: 263-275. Morrison W.R., Tester R.F., Snape C.E., Law R., Gidley M.J. 1993. Swelling and gelatinisation of cereal starches. IV. Some effects of lipid-complexed amylose in waxy and normal barley starches. Cereal Chemistry 70: 385-391. Mouille G, Maddelein M.L, Ball S. 1996. Pree-amylopectin Processing: A Mandatory Step for Starch Biosynthesis in Plants. The Plant Cell 8: 1353-1366. MSZ 6367/4-86. Edible, fodder and industrial seeds and husked products. Determination of test weight, thousand kernel weight and classification grade, Hungary. MSZ 6369/5-87 Flour testing methods. Testing of gluten, Hungary. MSZ 6369/6-1988 Flour testing methods. Determination of water absorption capacity and baking quality, Hungary. Munsted H, Laun H.M. 1981. Elongational properties and molecular structure of polyethylene melts. Rheologica Acta 20: 679-721. Murashige, T.Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiology 15: 473497. Nakamura T, Yamamori M, Hirano H, Hidaka S, Nagamine T. 1995 Production of waxy (amylose free) wheats. Molecular and General Genetics 248: 253-259. Nakamura Y, Umemoto T, Ogata N, Kuboki Y, Yano M, sasaki T. 1996a. Starch debranching enzyme (R-enzyme or pollulanase) from developing rice endosperm: purification, cDNA and chromosomal localization of the gene. Planta 199: 209-218. Nakamura Y, Umemoto T, Satoh H. 1996b. Changes in structure of starch and enzyme activities affected by sugary mutations in developing rice endosperm. Possible role of starch debranching enzyme (R-enzyme) in amylopectin biosynthesis. Physiologia Plantarum 97: 491-497. Nakamura Y. 1996c. Some properties of starch debranching enzymes and their possible role in amylopectin biosynthesis. Plant Science 121: 1-18. Nakamura T., Yamamori M., Hidaka S., Hoshino T. 1993b. Decrease of waxy (Wx) protein in two common wheat cultivars with low amylose content. Plant Breed. 111: 99-105. Nakamura, T., Yamamori, M., Hirano, H., Hidaka, S. 1993a. Identification of three Wx protein in wheat (Triticum aestivum L.) cultivars. Biochem. Genet. 31: 75-86. Neff M.M, Neff J.D, Chory J, Pepper A.E. 1998. dCAPs, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant Journal 14: 387-392. Nehra N.S., Chibbar R.N., Leung N., Caswell K., Mallard C., Steinhauer L., Baga M., Kartha K.K. 1994. Selffertile transgenic wheat plants regenerated from isolated scutellar tissues following microprojectile bombardment with two distinct gene constructs. Plant Journal, 5: 285-297.

Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Nelson J.C, Sorrels M.E, Van Deynze A.E, Lu Y.H, Atkinson M, Bernard M, Leroy P, Faris J.D, Anderson J.A. 1995. Molecular mapping of wheat: major genes and rearrangement in homeologous groups 4, 5 and 7. Genetics 141: 721-731. Neuhaus H.E., Stitt M. 1990. Impact of reduced activity of ADP-glucose pyrophosphorylase or plastid phosphoglucomase on the fluxes to starch and sucrose in Arabidobsis thaliana (L.) Heynh. Planta 192: 445-454. Ng K.Y, Duvick S.A, White P.J. 1997. Thermal properties of starch from selected maize (Zea Mays L.) mutants during development. Cereal Chemistry 74: 288-292. Obuchowski W, Bushuk W. 1980. Wheat hardness: Comparison of methods of its evaluation. Cereal Chemistry 57: 421-425. Oda S, Schofield J.D. 1997. Characterisation of friabilin polypeptides. J. of Cereal Science 26: 29-36. Oda M., Yasuda Y., Okazaki S., Yamauchi Y., Yokoyama Y. 1980. A method of flour quality assessment for Japanese noodles. Cereal Chemistry. 57: 253-254. Odell J.T., Nagy F., Chua N. 1985. Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313: 810-812. Okada K, Negishi Y, Nagao S. 1987. Studies on heavily ground flour using roller mills. II. Chemical alteration of proteins, particularly globulin, during dough mixing. Cereal Chemistry 64: 3-8. Osborne B, Turnbull K.M, Anderssen R.S, Rahman S, Sharp P.J, Appels R. 2001. Tha hardness locus in Australian wheat lines. Australian J. of Agricultural Research 52: 1275-1286. Osborne T.B. 1907. The proteins of the wheat kernel. Carnegie Institute, Washington D.C. Osborne T.B. 1924. The vegetable proteins. Longmans, Green and Co., London. Panozzo J.F, Bekes F, Wrigley C.W, Gupta R.B. 1994. The effects of bromate (0-30 ppm) on the protein and lipids of dough. Cereal chemistry 71: 195-199. Panozzo J.F, Hannah M.C, O’Brien L, Békés F. 1993. The relathionship of free polar lipids and flour protein to breadmaking quality. J. of Cereal Science 17: 47-62. Parish J.A, Halse N.J. 1968. Effects of light, temperature and the rate of desiccation on translucency in wheat grain. Australian J. of Agricultural Research 19: 365-372. Parker G.D, Chalmers K.J, rathjen A.J, Landridge P. 1999. Mapping loci associated with milling yield in wheat (Triticum aestivum L.) Molecular Breeding 5: 561-568. Parker G.D, Fox P.N, Langridge P, Whan B, Ganter P. 2002. Genetic diversity within Australian wheat breeding programs based on molecular and pedigree data. Euphytica 124: 293-306. Parker G.D, Landridge P. 2000. Development of a STS marker linked to a major locus controlling flour colour in wheat (Triticum aestivum L.) Molecular Breeding 6: 169-174. Parker M.L. 1985. The relathionship between A-type and B-type starch granules in the developing endosperm of wheat. Journal of Cereal Science 3: 271-278. Pater S.De, Kijne J. 1997. Cloning and characterisation of the wheat biosynthetic enzyme amylogenin. 5th International Congress of Plant Molecular Biology, Syngapore Abstract No. 746. Pauk J., Hänsch R., Schwarz G., Nerlich A., Monostori T., Mészáros A., Jenes B., Kertész Z., Matuz J., Schulze J., Mendel R.R. 1998. Genetic transformation of wheat (Triticum aestivum L.) in Hungary. Növénytermelés 47: 241251. Paull J.G, Chalmers K.J, Karakousis A, Kretschmer J.M, Manning S, Landridge P. 1998. Genetic diversity in Australian wheat varieties and breeding material based on RFLP data. Theoretical and applied Genetics 96: 435-446. Payne P.I, Corfield K.G, Blackman J.A. 1979. Identification of a high molecular weight subunit of glutenin whose presence correlated with breadmaking quality in wheat of related pedegree. Theoretical and applied Genetics 55: 153-159. Payne P.I. 1987. Genetics of wheat storgae proteins and the effect of allelic variation on bread-making quality. Ann. Rev. Plant physiol. 38: 141-153. Payne P.I., Holt L.M., Jackson C.N., Law C.N. 1984. Wheat storage proteins: Their genetics and their potential for manipulation by plant breeding. Philos. Trans. R. Soc. Lond. Ser. B, 304: 356-371. Payne P.I., Holt L.M., Jackson E.A., Law, C.N. 1984a. Wheat storage proteins: their genetics and their potential for manipulation by plant breeding. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 304, 359-371.

Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Payne P.I., Holt L.M., Law C.N. 1981. Structural and genetical studies on the high-molecular-weight subunits of wheat glutenin. Part I. Allelic variation in subunits amongst varieties of wheat (Triticum aestivum). Theor. Appl. Genet. 60: 229-236. Payne P.I., Holt L.M., Lister P.G. 1988. Gli-A3 and Gli-B3, two newly designated loci coding for omega-type gliadins and D subunits of glutenin. In Proceedings of the 7th International Wheat Genetic Symposium (eds. Miller, T.E. and Koebner, R.M.D) Bath Press, Bath, England pp. 9991002. Payne P.I., Lawrence G.J., Nightingale M.A., Krattiger A.F., Holt L.M. 1987. The relationship between HMW subunit composition and bread-making quality of British-grown varieties. J. Sc. Food Agric. 40: 51-60. Payne P.I., G.J. Lawrence. 1983. Catalogue of alleles for the complex gene loci, Glu-A1, Glu-B1, and Glu-D1 which code for high molecular weight subunits of glutenin in hexaploid wheat. Cereal Res. Commun. 11: 29-35. Pellegrineschi A., McLean S., Salgado M., Velazquez L., Hernandez R., Brito R.M., Noguera M., Medhurst A., Hoisington D. 2000. Transgenic wheat plants: A powerful breeding source. In Bedő Z, Láng L (eds), Wheat in a Global Environment, pp. 325-330. Peng J, Korol A.B, Fahima T, Roder M.S, Ronin Y.I, Li Y.C, Nevo E. 2000. Molecular genetic maps in wild emmer wheat, Triticum dicoccoides: genome-wide coverage, massive negative interference, and putative quasi-linkage. Genome Research 10: 1509-1531. Perl A., Kless H., Blumenthal A, .Galili G., Galun E. 1992. Improvement of plant regeneration and GUS expression in scutellar wheat calli by optimisation of culture conditions and DNAmicroprojectile delivery procedures. Molecular and General Genetics, 235: 279-284. Perretant M.R, Cadalen T, Charmet G, Sourdille P, Nicolas P, Boeuf C, Tixier M.H, Branlard G, Bernard S, Bernard M. 2000. QTL analysis of bread-making quality in wheat using a doubled haploid population. Theoretical and Applied Genetics 100: 1167-1175. Pestova E, Ganal M.W, Röder M.S. 2000. Isolation and mapping of microsatellite markers specific for the D genome of bread wheat. Genome 43: 689-697. Plaschke J, Ganal M.W, Röder M.S. 1995. Detection of genetic diversity in closely related bread wheat using microsatellite markers. Theoretical and Applied Genetics 91: 1001-1007. Pomeranz Y. 1988. Composition and functionality of wheat flour components. In: Wheat: Chemistry and Technology (Y. Pomeranz ed.), Vol.II. AACC, St.Paul, Minnesota, USA, pp. 219-370. Pomeranz Y., Williams, P.C. 1990. Wheat hardness: its genetic, structural and biochemical background, measurements and significance. In: Pomeranz, Y. (ed): Advances in Cereal Science and Technology, AACC, St Paul, MN, USA. 10, 471-544. Popineau Y., Deshayes G., Lefebvre J., Fido A.S., Tatham A.S., Shewry P.R. 2001. Prolamin aggregation, gluten viscoelasticity, and mixing properties of transgenic wheat lines expressing 1Ax and 1Dx high molecular weight glutenin subunit transgenes. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49: 395-401. Popineau Y., Pineau F. 1988. Changes of conformation and surface hidrophobicity of gliadins. Lebensmittel Wissenschaft Technologie 21: 113-117. Popineau Y., Deshayes G., Lefebvre J., Fido R., Tatham A.S., Shewry P.R. 2001. Prolamin aggregation, gluten viscoelasticity, and mixing properties of transgenic wheat lines expressing 1Ax and 1Dx high molecular weight glutenin subunit transgenes. Journal of Agricultural Food Chemistry, 49: 395-401. Powell W, Machray G.C, Provan J. 1996. Polimorphism revealed by simple sequence repeats. Trends in plant Science 1: 215-222. Potrykus I. 1991. Gene transfer to plants: Assessment of published approaches and results. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 42: 205-225. Prasad M, Varshney R.K, Kumar A, Balyan H.S, Sharma P.C, Edwards K.J, Singh H, Dhaliwal H.S, Roy J.K, Gupta P.K. 1999. A microsatellite marker associated with a QTL for grain protein content on chromosome arm 2DL of bread wheat. Theoretical Applied Genetics 99: 341-345. Preston L.R., Harker N., Holton T., Morell M.K. 1999. Plant cultivar identification using DNA analysis. Plant Varieties and Seeds 12: 191-205.

Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Puolimatka M., Pauk J. 2000. Effect of incubation duration and medium composition on plant regeneration in wheat (Triticum aestivum L.) anther culture. Journal of Plant Physiology, 156: 197203. Puolimatka M., Pauk, J. 1999. Impact of explant type, duration and initiation time on the coculture effect in isolated microspore culture of wheat (Triticum aestivum L.). Journal of Plant Physiology, 154: 367-373. Rahman S, Abrahams S, Abbott D, Mukai Y, Samuel M, Morell M, Appels R. 1997. A complex arrangement in the D genome of wheat. Genome 40: 465-474. Rahman S, Jolly C.J, Skerritt J.H, Wallosheck A. 1994. Cloning of a wheat 15 kDa grain softness protein (GSP). GSP is a mixture of puroindoline-like polypeptides. European J. of Biochemistry 223: 917-925. Rahman S, Li Z, Abrahams S, Abbott D, Appels R, Morell M.K. 1999. Characterisation of the gene encoding wheat endosperm starch branching enzyme-I. Theoretical and Applied Genetics 98: 156-163. Rahman S., Kosar-Hashemi B., Samuel M.S., Hill A., abbott D., Skerritt J.H., Preiss J., Appels R., Morrell M.K. 1995. The major proteins of wheat endosperm starch granules. Australian J. of Plant Physiology 22: 793-803. Rakszegi M, Békés F.,Láng L., Szűcs P, Tamás L, Shewry P.R., Bedő Z. 2004. Technological quality of transgenic wheat expressing an increased amount of a HMW subunit of glutenin. J. of Cereal Science (submitted). Rakszegi M., Békés F., Juhász A., Szűcs P., Láng L., Tamás L., Shewry P.R., Bedő Z. 2001. Technological quality of a transgenic Australian spring wheat variety under Central European conditions. Cereals 2000, Proceedings of the 11th ICC Cereal and Bread Congress and of the 50th Australian Cereal Chemistry Conference (M. Wootton, I.L. Batey, C.W. Wrigley eds.) Melbourne, Australia pp. 261-264. Rakszegi M., I. Batey, Vida Gy., Juhász A., Bedő Z., M.K. Morell. 2003. Starch properties in different lines of an old Hungarian wheat variety, Bánkúti 1201. Starch/Starke 55: 397-402. Rakszegi, M., Tamás, C., Szűcs, P., Tamás, L., Bedő, Z. 2001. Current status of wheat transformation (review). Journal of Plant Biotechnology 3: 67-81. RascoGaunt, S.Barcelo, P. 1999. Immature inflorescence culture of cereals: a highly responsive system for regeneration and transformation. In Hall RD (eds), Methods in Molecular Biology: Plant Cell Culture Protocols, pp. 7181. Humana Press Inc., Totowa, NJ. RascoGaunt, S.Riley, A.Barcelo, P.Lazzeri, P.A.: 1999a. Analysis of particle bombardment parameters to optimize DNA delivery into wheat tissues. Plant Cell Reports, 19: 118127. RascoGaunt, S.Riley, A.Lazzeri, P.Barcelo, P.De Block, M.Block, M. de. 1999b. A facile method for screening for phosphinothricin (PPT)resistant transgenic wheats. Molecular Breeding, 5: 255262. RascoGaunt, S.Riley, ACannell, M.Barcelo, P.Lazzeri, P.A. 2001. Procedures allowing the transformation of a range of European elite wheat (Triticum aestivum L.) varieties via particle bombardment. Journal of Experimental Botany, 52: 865874. Regina A., Morell M.K., Sharp P.J., Batey I.L., Curtin B.M. Comparison of small scale methods for analysing amylose content in wheat. In: Cereals '97, (Ed. A.Tarr, A.S. Ross, C.W. Wrigley) Proceedings 47th Australian Cereal Chemistry Conference, Perth: September 14-18, 1997, pp.162-166. Repellin, A.Baga, M.Jauhar, P.P.Chibbar, R.N.: 2001. Genetic enrichment of cereal crops via alien gene transfer: new challenges. Plant Cell Tissue and Organ Culture 64: 159183. Rodriguez-Ouijano, M. and Carrillo, J.M.: Relationship between allelic variation of Glu-1 and Gli1/Glu-3 prolamin loci and gluten strength in hexaploid wheat. Euphytica 91:141-148, 1996 Rooke, L., Békés, F., Fido, R., Barro, F., Gras, P., Tatham, A.S., Barceló, P., Lazzeri, P., Shewry P.R. 1999. Overexpression of a gluten protein in transgenic wheat results in greatly increased dough strength. Journal of Cereal Science 30: 115-120. Rooke, L.Békés, F.Fido, R.Barro, F.Gras, P.Tatham, A.S.Barcelo, P.Lazzeri, P.Shewry, P.R.: 1999. Overexpression of a gluten protein in transgenic wheat results in greatly increased dough strength. Journal of Cereal Science 30: 115120. Röder M.S, Korzun V, Gill B.S, Ganal M.W. 1998. The physical mapping of microsatellite markers in wheat. Genome 41: 278-283.

Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Röder M.S, Korzun V, Wendehake K, Plaschke J, Tixier M.H, Leroy P, Ganal M.W. 1998. A microsatellite map of wheat. Genetics 149: 2007-2023. Röder M.S, Plaschke J, Konig S.U, Borner A, Sorrells M.E, Tanksley S.D, Ganal M.W. 1995. Abundance, variability and chromosomal locations of microsatellites in wheat. Molecular and General Genetics 146: 327-333. Russell D.A., Fromm M.E. 1997. Tissuespecific expression in transgenic maize of four endosperm promoters from maize and rice. Transgenic Research, 6: 157-168. Safford R, Jobling S.A, Sidebottom C.M, Westcott R.J, Cooke D, Tober K.J, Strongitharm B.H, Russel A.L, Gidley M.J. 1998. Consequences of antisense RNA inhibition of starch branching enzyme activity on properties of potato starch. Carbohydrate Polymers 35: 155-168. Sanford J.C. 1988. The biolistic process a new concept in gene transfer and biological delivery. Trends Biotechnology, 6: 229302. Seyfarth R, Feuillet C, Schachermayr G, Winzeler M, Keller B. 1999. Development of a molecular marker for the adult plant leaf rust resistance gene Lr35 in wheat. Theoretical and Applied Genetics 99: 554-560. Schropp P., Wieser H. 1996. Effects of high molecular weight subunits of glutenin on the rheological properties of wheat gluten. Cereal Chem. 73: 410-413. Sebecic B, Sebecic B. 1995. Wheat flour starch granule-size distribution and rheological properties of dough. Part 2. Extensographic measurements. Die Nahrung 2: 117-123. Seilmeier W., Belitz H.D., Wieser H. 1991. Separation and quantitative determination of highmolecular-weight subunits of glutenin from different wheat varieties and genetic variants of the variety Sicco. Zeitschrift für Lebensmittel Untersuchung und –Forschung 192: 124-129. Serik O., Ainur I., Murat K., Tetsuo M., Masaki I. 1996. Silicon carbide fibermediated DNA delivery into cells of wheat (Triticum aestivum L.) mature embryos. Plant Cell Reports, 16: 133-136. Shariflou M.R, Sharp P.J. 1999. A polymorphic microsatellite in the 3’ end of waxy genes of wheat, Triticum aestivum. Plant Breeding 118: 275-277. Shewry P.R., Tatham, A.S. 1997. Biotechnology of wheat quality. J. Sci. Food Agric 73: 397-406. Shewry P.R., Tatham, A.S. 1999. The Characteristics, Structures and Evolutionary Relationships of Prolamins. In: Seed Proteins (eds.: P.R. Shewry and R. Casey), Kluwer Academic Publishers, The Netherlands, pp 11-33. Shewry P.R., Bradberry D., Franklin J., White R.D. 1984. The chromosomal locations and linkage relationships of the structural genes for the prolamin storage proteins (secalnis) of rye. Theor. Appl. Genet. 69: 63-69. Shewry P.R., Halford N.G., Tatham A.S. 1992. The high molecular weight subunits of wheat glutenin. J. Cereal Sci. 15: 105-120. Shewry P.R., Halford N.G., Tatham A.S., Popineau Y., Lafiandra D., Belton P. 2003. The high molecular weight subunits of wheat glutenin and their role in determining wheat processing properties. Advances in Food and Nutrition Research 45: 219-302. Shewry P.R., Tatham A.S. 1990. The prolamin storage proteins of cereal seeds: structure and evolution, Biochem. J., 267. 1-12. Shure M, Wessler S, Federoff N. Molecular identification and isolation of the waxy locus in maize. Cell 35: 225-233. Simmonds D.H, Barlow K.K, Wrigley C.W. 1973. The biochemical basis of grain hardness in wheat. Cereal Chemistry 50: 553-562. Singh N.K., Shepherd K.W., Cornish G.B. 1991. A simplified SDS-PAGE procedure for separating LMW subunits of glutenin. J. Cereal Sci. 14: 203-208. Smith J.S.C, Smith O.S, Bowen S.L, Tenborg R.A, Wall S.J. 1991. The description and assessment of distances between inbred lines of maize: III A revised scheme for the testing of distinctiveness between inbred lines utilizing DNA RFLPs. Maydica 36: 213-226. Smith J.S.C. 1984. Genetic variability within US hybrid maize: multivariate analysis of isozyme data. Crop Science 24: 1041-1046. Soulaka A.B., Morrison W.R. 1985. The amylose and lipid contents, dimensions, and gelatinisation characteristics of some wheat starches and their A- and B-granule fractions. J. Sci. Food Agric. 36: 709-718 Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Sourdille P, Perretant M.R, Charmet G, Leroy P, Gautier M.F, Jourdrier P, Nelson J.C, Sorrels M.E, Bernard M. 1996. Linkage between RFLP markers and genes affecting kernel hardness in wheat. Theoretical and Applied Genetics 93: 580-586. Srivastava V., Vasil V., Vasil I.K. 1996. Molecular characterization of the fate of transgenes in transformed wheat (Triticum aestivum L.). Theoretical Applied Genetics, 92: 1031-1037. Stark D. M, Timmerman K.P, Barry G.I, Preiss J.P, Kishore G.M. 1992. Regulation of the amuont of starch in tissue by ADP-glucose pyrophosphorylase. Science 158: 287-292. Stephenson P, Bryan G, Kirby J, Collins A, Devos K, Busso C, Gale M. 1998. Fifty new microsatellite loci for the wheat genetic map. Theoretical and Applied Genetics 97: 946-949. Stewart Jr C.N.: 2001. The utility of green fluorescent protein in transgenic plants. Plant Cell Reports, 20: 376–382. Stoger E., Williams S.,Christou P., Down RE., Gatehouse J.A. 1999. Expression of the insecticidal lectin from snowdrop (Galathus nivalis agglutinin; GNA) in transgenic wheat plants: effect on predation by the grain aphid Sitobion avenae. Molecular Breeding, 5: 65-73. Sugita K., Matsunaga E., Ebinuma H. 1999. Effective selection system for generating markerfree transgenic plants independent of sexual crossing. Plant Cell Reports, 18: 941-947. Sutton H.K. 1991. Qualitative and quantitative variation among high molecular weight subunits of glutenin detected by reversed-phase high-performance liquid chromatography. J. Cereal Sci. 14:2534. Symes K.J. 1965. The inheritance of grain hardness in wheat as measured by the particle size index. Australian J. of Agricultural research 16: 113-123. Szilágyi Sz., Triboi E., Győri Z., Triboi A.M., Branlard G., Borbély M. 2002. Environmental and genetical effects on protein composition measured by SE-HPLC and Mixograph characteristics of the winter wheat grown in France and Hungary. ICC Conference 2002, Novel raw materials, technologies and products - New challenge for the quality control (Salgó A., Tömösközi S., Lásztity R. eds.), Budapest, Hungary pp. 114-127. Takumi S., Shimada T. 1996. Production of transgenic wheat through particle bombardment of scutellar tissues: frequency is influenced by culture duration. Journal of Plant Physiology, 149: 418-423. Tamás C., Rakszegi M, .Szűcs P., Tamás L., Bedő Z. 2000. Temperature, light and medium optimisation for plant regeneration of winter wheat varieties. 6th International Wheat Conference, p. 308. Budapest, Hungary, 59 June 2000. Tamás L., Tamás C., Morell KM., Appels R. 1999. The use of GFP gene as a reporter gene in wheat transformation. 4th Congress of the Hungarian Genetical Society, p. 166. Tanchak M.A, Schernthaner J.P, Giband m, Altosaar 1988. I. Tryptophanins: Isolation and molecular characterisation of oat cDNA clones encoding proteins structurally related to puroindoline and wheat grain softness proteins. Plant Science 137: 173-184. Thorbjorsen T, Villand P, Denyer K, Olsen O.A, Smith A.M. 1996. Distinct forms of ADP glucose pyrophosphorylase occur inside and outside the amyloplasts in barley endosperm. The Plant Journal 10: 243-250. Tingay S., McElroy D., Kalla R., Fieg S., Wang M., Thornton S., Brettell R. 1997. Agrobacterium tumefaciensmediated barley transformation. The Plant Journal, 11: 1369-1376. Toki S. 1997. Rapid and efficient Agrobacteriummediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter, 15: 16-21. Triboi E., abad A., Michelena A., Lloveras J., Ollier J.L., Daniel C. 2000. Environmental effects on the quality of two wheat genotypes: 1. quantitative and qualitative variation of storage proteins. European Journal of Agronomy 13: 47-64. Turnbull K, Gaborit T, Marion D, Rahman S. 2000. Variation in puroindoline polypeptides in Australian wheat cultivars in relationship to grain hardness. Australian J. of Plant Physiology 27: 143-158. Turner M, Mukai Y, Leroy P, Charef B, Appels R, Rahman S. 1999. Tha Ha locus of wheat: identification of a polymorphic region for tracing grain hardness in crosses. Genome 42: 1-9. Urbano M., Margiotta B., Colaprico G., Lafiandra D. Production of hexaploid and tetraploid waxy lines. Wheat Gluten (Ed. P.R. Shewry, A.S. Tatham.) Proceedings of the 7th International Workshop Gluten 2000, Bristol, UK, 2000, pp. 531-534.

Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Uthayakumaran S., Beasley H.L., Stoppard F.L., Keentok M., Phan-Thien N., Tanner R.I., Békés F. 2002. Synergistic and additive effects of three high molecular weight glutenin subunit loci. I. Effects on wheat dough rheology. Cereal Chem. 79: 294-300. Uthayakumaran S., Newberry M., Keentok M., Stoddard F.L., Békés F. 2000a. Basic rheology of bread dough with modified protein content and glutenin-to-gliadin ratios. Cereal Chem. 77: 744749. Uthayakumaran S., Stoddard F.L., Gras P.W., Békés F. 2000b. Effects of incorporated glutenins on functional properties of wheat dough. Cereal Chemistry 77: 737-743. Uthayakumaran, S., Tömösközi, S., Tatham, A.S., Savage, A.W.J., Gianibelli, M.C., Stoppard, F.L., Békés, F. 2001. Effects of gliadin fractions on functional properties of dough depending on molecular size and hydrophobicity. Cereal Chem. 78: 138-141. Vágújfalvi A, Crosatti C, Galiba G, Dubcovsky J, Cattivelli L. 2000. Two loci on chromosome 5A regulate the differential cold-dependent expression of the cor14b gene in frost-tolerant and frostsensitive genotypes. Molecular and General Genetics 263: 194-200. Vain P., Worland A., Kohli A., Snape JW., Christou P. 1998. The green fluorescent protein (GFP) as a vital screenable marker in rice transformation. Theoretical Applied Genetics, 96: 164-169. Vasil, I.K.: 1998. Biotechnology and food security for the 21st century: a realworld perspective. Nature Biotechnology, 16: 399-400. Vasil V., Castillo A.M., Fromm M.E., Vasil I.K. 1992. Herbicide resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus. BioTechnology, 10: 667-674. Vibók I., Nagy T., Bittencourt P., Jenes B., Dallmann G. 1999. Endosperm specific expression of a gliadinactin hybrid promoter in transgenic rice (Oryza sativa L.). Cereal Research Communications, 27: 241-249. Vida Gy., Bedő Z. 1999. Őszi aestivum- és durumbúza-genotípusok szemkeménysége és más sütőipari minőségi tulajdonságai közötti összefüggések elemzése főkomponens-analízissel. Növénytermelés 48: 33-42. Vida Gy., Bedő Z., Láng L., Juhász A. 1998. Analysis of the quality traits of a Bánkúti 1201 population. Cereal Research Communication 26: 313-320.

Walker C.E, Ross A.S, Wrigley C.W, McMaster G. 1988. Accelerated starch paste characterisation with the Rapid Visco-Analyser. Cereal Foods World 33: 491-493. Weegels, P.L., Van de Pijpekamp, A.M., Graveland, A., Hamer R.J., Schofield J.D. 1996. Depolymerisation and re-polymerisation of wheat glutenin dough processing. I. Relathionships between glutenin macropolymer content and quality parameters. Journal of Cereal Science 23: 103-111. Weeks J.T., Anderson O.D., Blechl A.E. 1993. Rapid production of multiple independent lines of fertile transgenic wheat (Triticum aestivum). Plant Physiology. 102: 1077-1084. Weir B., Gu X., Wang M.B., Upadhyaya N., Elliot A.R., Brettell R.I.S. 2001. Agrobacterium tumefaciensmediated transformation of wheat using suspension cells as a model system and green fluorescent protein as a visual marker. Australian Journal of Plant Physiology, 28: 807-818. Wieser H., Seilmeier W., Kieffer R. 1994b. Relationship between the amount of gluten protein types and the reological properties of different wheat cultivars. In: Gluten Proteins 1993, Assoc. Cereal Res.: Detmold, Germany, pp. 141-150. Wieser H., Seilmeier W., Belitz, H.D. 1994a. Use of RP-HPLC for a better understanding of the structure and the functionality of wheat gluten proteins. In: HPLC of Cereal and Legume Proteins. J.E. Kruger and J.A. Bietz eds., AACC, St. Paul, Minnesota, USA, pp.235-272. Worzella W.W, Cutler G.H. 1939. A critical study of techniques for measuring granulation in wheat meal. J. of Agricultural Science 58: 329-341. Wright M., Dawson J., Dunder E., Suttie J., Reed J., Kramer C., Chang Y., Novitzky R., Wang H., ArtimMoore L. 2001. Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.) and wheat (Triticum aestivum L.) using the phosphomannose isomerase gene, pmi, as the selectable marker. Plant Cell Reports, 20: 429–436. Wrigley C.W., Andrews J.L., Békés F., Gras P.W., Gupta R.B., MacRitchie F., Skerritt J.H. 1998. Protein-protein Interactions – Essential to Dough Rheology. In: Interactions: The Keys to Cereal Quality (R.J. Hamer and R.C. Hoseney eds.) AACC, St. Paul, Minnesota, USA, pp. 17-46. Old alsz

8. Irodalomjegyzék

Xia G.M., Li Z.Y., He C.X., Chen H.M., Brettell R. 1999. Transgenic plant regeneration from wheat (Triticum aestivum L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Acta Phytophysiologica Sinica, 25: 22-28. Yamamori M. 1998. Selection of a wheat lacking a putative enzyme for starch synthesis, SGP-1. Proceedings of the 9th International Wheat Genetics Symposium Vol. 4 pp 300-302.

Yamamori M., Nakamura T., Endo T.R., Nagamina T. 1994. Waxy protein deficiency and chromosomal location of coding genes in common wheat. Theor. Appl. Genet. 89: 179184. Yan LL, Bhave M. 2001. Characterization of waxy proteins and waxy genes of Triticum timopheevii and T-zhukovskyi and implications for evolution of wheat. Genome 44: 582588. Zhang S., Cho M.J., Koprek T., Yun R., Bregitzer P., Lemaux P.G. 1999. Genetic transformation of commercial cultivars of oat (Avena sativa L.) and barley (Hordeum vulgare L.) using in vitro shoot meristematic cultures derived from germinated seedlings. Plant Cell Reports, 18: 959966. Amoah, B.K.Wu, H.Sparks, C.Jones, H.D.: 2001. Factors influencing Agrobacteriummediated transient expression of uidA in wheat inflorescence tissue. Journal of Experimental Botany, 52: 1135-1141. Zhao X.C, Batey I.L, Sharp P.J, Crosbie G, Barclay I, Wilson R, Morell M.K, Appels R. 1998. A single genetic locus associated with starch granule properties and noodle quality in wheat. J. of Cereal Science 27: 7-13.

Old alsz

Függelék

FÜGGELÉK I. táblázat

A Bartlett próba különböző minőségi tulajdonságokra meghatározott χ2 értékei

A.

FG Bx (mol%) By (mol%) Dx (mol%) Dy (mol%) Ax (mol%) HMW/LMW Bx/By x/y Fehérje %

/Magdaléna 18 34,52 16,72 17,97 19,09 17,77 23,75 33,99 30,16 23,54


17 17,82 1,50 < 0,72 < 0,78 < 0,79 < 1,64 < 2,20 < 2,06 < 0,68 <


10 0,96 < 0,52 < 2,42 < 0,06 < 1,65 < 0,001 < 0,02 < 0,01 < 0,05 <

Bánkúti 1201 (F4 11295)/ /Magvas /Ukrainka 4 12 0,45 1,92 < 0,47 18,33 1,21 17,53 1,47 14,62 0,82 17,41 2,74 5,64 0,101 < 2,27 < 0,24 < 5,4 2,54 8,66 Bánkúti 1201 (F4 11310)/ 8 13 1,15 < 7,61 0,21 < 0,84 < 0,22 < 0,22 < 0,05 < 0,09 < 0,04 < 0,23 < 0,001 < 0,001 < 0,004 < 0,006 < 0,002 < 0,006 < 0,032 < 0,034 < Bánkúti 1201 (F4 11314)/ 5 13 0,39 < 1,95 < 2,95 0,62 < 4,97 2,92 < 1,17 0,14 < 2,76 0,65 < 0,0005 < 0,0002 < 0,04 < 0,008 < 0,02 < 0,009 < 0,06 < 0,05 <

/Emma

χ2total

2 0,11 1,47 0,29 1,81 0,98 4,86 0,63 1,20 2,25

3,66/25,32 5,53 4,35 1,46 3,79 5,11 6,43/25,79 4,97/13,16 1,85

0 -

7,79 7,79 1,32 1,52 6,54 7,02 1,58/60,82 4,02/30,03 1,63

0 -

0,94 6,97 0,91 17,4 4,35 5,67 6,29 1,38 0,08

B.

Old alsz

Függelék

Bx Dx By Dy Ax HMW/LMW x/y Bx/By Fehérje % Bx Dx By Dy Ax HMW/LMW x/y Bx/By Fehérje % Bx Dx By Dy Ax HMW/LMW x/y Bx/By Fehérje %

Bánkúti 1201 /Magdaléna /Magdaléna /Magdaléna /Magdaléna /Magdaléna /Magdaléna /Magdaléna /Magdaléna /Magdaléna /Ukrainka /Ukrainka /Ukrainka /Ukrainka /Ukrainka /Ukrainka /Ukrainka /Ukrainka /Ukrainka /Magvas /Magvas /Magvas /Magvas /Magvas /Magvas /Magvas /Magvas /Magvas

FG 18,17,10 18,17,10 18,17,10 18,17,10 18,17,10 18,17,10 18,17,10 18,17,10 18,17,10 12,13,13 12,13,13 12,13,13 12,13,13 12,13,13 12,13,13 12,13,13 12,13,13 12,13,13 8,5,4 8,5,4 8,5,4 8,5,4 8,5,4 8,5,4 8,5,4 8,5,4 8,5,4

F4 11295 26,22 18,31 17,13 32,02 22,52 18,15 15,77 7,69 30,35 4,69 10,92 22,07 18,68 21,19 13,46 15,61 20,01 12,62 3,07 1,99 1,22 < 1,99 0,71 < 4,37 3,04 3,19 9,03

F4 11310 17,82 3,96 < 21,78 9,55 4,11 14,90 27,54 36,84 > 8,60 26,53 3,45 < 3,86 < 10,99 7,01 12,37 12,37 10,74 14,25 10,42 14,25 15,35 > 13,93 15,25 > 7,16 12,89 12,89 4,19

F411314 0,96 < 22,72 6,08 3,42 18,36 11,95 1,68 < 0,46 < 6,05 6,78 23,63 12,06 8,32 9,80 12,17 10,03 7,23 11,13 3,50 0,75 0,42 1,06 1,04 5,47 1,07 0,91 3,76

χ2total 2,58/15,40 2,44/15,73 1,59 9,83 13,58 0,30 7,15/11,61 1,39/31,84 6,98 10,10 1,03/10,25 9,11 2,56 4,71 0,12 0,84 3,81 0,21 0,66 5,96/11,55 0,16/16,93 0,13/10,36 1,94/17,68 1,64 7,63 7,85 0,13

χ2total kiugró adatok nélkül/χ2total kiugró adatokkal χ2 krit1%=9.21 (FG=2), χ2 krit1%=11,3 (FG=3), χ2 krit99%=0,12

Old alsz

Függelék II. táblázat

A különböző csoportok minőségi tulajdonságainak variancia analízise

A. átlag n

/Magdaléna 19 Max Átlag 54,37 37,51 A 18,05 13,53 A 24,36 18,26 A 11,27 9,74 A 21,45 19,44 A 6,20 2,56 A 17,90 13,06 A

Bx (mol%) By (mol%) Dx (mol%) Dy (mol%) Ax (mol%) Bx/By Fehérje %

Min 32,72 8,77 14,50 7,09 10,51 1,81 15,10

n Bx (mol%) Dx (mol%) Dy (mol%) Ax (mol%) HMW/LMW Fehérje %

32,77 15,39 7,73 19,04 0,32 14,70

18 50,55 19,43 10,73 23,40 0,60 16,50

n Bx (mol%) Dy (mol%) Fehérje %

33,49 8,59 15,00

11 36,82 10,19 16,50

Szórás 4,43 1,95 2,26 1,23 2,30 0,88 0,78

Min 31,89 14,05 19,30 10,13 17,51 2,01 14,50

37,23 A 17,39 A 9,71 A 21,33 A 0,38 A 15,63 A

3,76 1,08 0,69 1,01 0,06 0,43

32,37 16,87 9,50 18,11 0,31 13,70

35,34 A 9,42 A 15,86 A

1,13 0,54 0,47

32,29 5,06 14,70

Bánkúti 1201 (F4 11295)/ /Magvas 5 Max Átlag Szórás Min 34,40 1,07 30,94 32,82 B 15,83 0,69 12,60 14,64 B 22,51 1,25 12,93 21,36 B 12,11 0,73 4,16 10,99 B 20,13 1,05 19,40 18,65 B 2,37 0,14 1,41 2,87 B 15,80 0,54 13,80 14,96 B Bánkúti 1201 (F4 11310)/ 9 37,26 1,39 26,26 34,30 B 21,87 1,43 17,13 20,43 B 11,54 0,70 7,14 10,58 B 20,24 0,61 20,48 18,86 B 0,39 0,03 0,36 0,34 B 15,60 0,59 14,60 14,72 B Bánkúti 1201 (F4 11314)/ 6 35,00 1,02 30,07 33,44 B 11,31 2,35 9,26 9,42 A 16,00 0,51 14,80 15,22 B

/Ukrainka 13 Max Átlag 35,10 33,12 B 21,95 16,24 C 23,20 20,76 B 9,11 8,12 C 30,02 21,72 C 2,70 2,12 C 15,80 14,89 B 14 35,81 21,66 10,54 25,98 0,49 16,40

Szórás 1,23 2,40 2,62 1,27 2,67 0,34 0,55

Min 36,47 12,75 15,10 8,88 19,40 2,31 16,30

/Emma 3 Max Átlag 37,86 37,31 A 15,80 14,75 B 16,72 15,74 C 11,06 10,16 A 22,35 20,48 D 2,97 2,23 D 17,70 16,90 C

SzD P% Szórás 0,75 1,74 0,86 1,14 1,62 0,36 0,72

1,17** 0,71** 0,79*** 0,42*** 0,81* 0,14* 0,14***

1 32,48 C 19,57 C 9,46 C 22,61 C 0,42 C 15,28 C

2,81 1,42 0,94 1,48 0,03 0,57

-

-

14 35,39 32,27 C 12,34 10,71 B 16,50 15,74 A

1,42 0,81 0,50

-

-

47,75 D 16,52 D 8,65 D 21,68 D 0,52 D 16,90 D

0,82* 0,35*** 0,22** 0,31*** 0,01** 0,14***

-

0,47*** 0,44* 0,18*

0

Old alsz

Függelék

Bánkúti 1201 By (mol%) By (mol%) Dy (mol%) HMW/LMW Bx/By Fehérje %

n 19,18,11 13,14,14 13,14,14 13,14,14 13,14,14 13,14,14

/Magdaléna /Ukrainka /Ukrainka /Ukrainka /Ukrainka /Ukrainka

Min 8,77 12,60 4,16 0,31 1,81 15,10

F4 11295 Max Átlag 18,05 13,53 A 21,95 16,24 A 9,11 8,12 A 0,61 0,36 A 6,20 2,08 A 17,90 14,89 A

Szórás 1,95 2,40 1,27 0,04 0,34 0,55

Min 4,57 12,36 7,14 0,36 2,04 14,60

F4 11310 Max Átlag 14,81 12,93 B 15,51 13,86 B 10,54 9,46 B 0,49 0,42 B 2,85 2,35 B 16,40 15,28 B

Szórás 2,26 0,97 0,94 0,03 0,24 0,57

Min 12,75 13,19 9,26 0,37 1,70 14,80

F411314 Max Átlag 18,24 15,41 C 20,23 14,42 C 12,34 10,71 C 0,49 0,42 B 2,49 2,26 C 16,50 15,74 C

Szórás 1,56 1,71 0,81 0,03 0,19 0,50

SzD P% 0,54** 0,48** 0,27*** 0,01*** 0,07* 0,14***

*, **, *** Szignifikancia 0.05, 0.01 és 0.001 valószínűségi szinten, Fehérje% Inframatic 8611 készülékkel mérve B. Pedigree N93-3026 Mv 2 N93-3026/MV2 (7213) N93-3026/MV2 (7214) N93-3026/MV2 (7215) N93-3026/MV2 (7216) N93-3026/MV2 (7217) N93-3026/MV2 (7218) N93-3026/MV2 (7219)

Glu-B1 7 OE+8 7+8 7 OE +8 7 OE +8 7+8 7 OE +8 7+8 7+8 7 OE +8

Fehérje (%) 15,2 15,2 18,0 18,9 17,8 18,6 17,0 18,0 17,4

Sikér (%) 33,3 33,2 29,3 30,5 29,0 29,9 27,7 29,3 28,2

Zeleny (ml) 45,5 47,4 51,6 53,4 48,9 52,6 44,0 52,8 49,8

Keménység 72,5 62,6 39,2 45,2 36,3 48,9 45,3 59,8 51,7

OE-overexpression/túltermelő

Old alsz

Függelék III. táblázat

A búza rokon fajainak vizsgált minőségi tulajdonságai és a puroindolin allélek jelenléte

Sorsz Faj megnevezése

Genom szimbólum U U

PKEM PinAPinB

PkemS.Dev

Átmérő Átmérő S.Dev

TKW

TKW S.Dev SDSszed Nyersfehérje

1

Aegilops umbellulata

115,405

1

1

20,574

1,686

0,359

22,650

7,538

30

19,15

2

Aegilops speltoides

S

S

91,917

1

1

20,503

1,395

0,294

22,452

5,724

20

20,76

3

Aegilops tauschii Coss.

D

D

32,192

1

1

15,787

1,358

0,251

19,151

4,022

18

16,49

4

T. monococcum

A

A

23,765

1

1

17,627

1,439

0,260

21,981

5,102

26

17,71

5

Aegilops uniaristata

N

N

16,445

1

1

16,367

1,204

0,261

20,053

4,602

32

23,69

6

T. monococcum

A

A

7,246

1

1

17,979

1,661

0,279

26,365

6,055

11

13,41

7

T. sinskajae

A

A

ND

1

1

ND

1,837

0,394

34,952

8,882

12

19,39

8

Aegilops comosa

M

M

ND

1

1

ND

ND

ND

ND

ND

23

29,14

9

Aegilops caudata

C

C

ND

1

1

ND

ND

ND

ND

ND

32

23,41

10 T. turgidum ssp. Paleocolchicum var. Karamyschevii (1)

AB

AB

94,636

0

0

15,462

2,221

0,419

32,332

8,585

13

16,26

11 T. turgidum ssp. Dicoccoides

AB

AB

88,185

0

0

20,285

2,264

0,470

35,008

11,223

14

16,23

12 T. timopheevii ssp. Timopheevii var. Rubiginosum

AG

AS

87,913

0

0

15,446

2,227

0,458

35,464

9,756

13

16,45

13 T. turgidum ssp. Dicoccon var. Arras

AB

AB

81,950

0

0

13,085

2,658

0,423

42,955

7,926

13

16,55

14 T. turgidum ssp. Dicoccon var. Atratum

AB

AB

80,672

0

0

15,347

2,727

0,387

46,672

9,557

12

15,8

15 T. petropavlovskyi (1)

AB

AB

80,348

1

1

19,164

2,977

0,662

50,671

15,780

12

15,81

16 T. turgidum ssp. Dicoccon

AB

AB

78,535

0

0

15,050

2,342

0,424

39,030

9,083

15

19,86

17 T. turgidum ssp. Polonicum

AB

AB

78,496

1

1

16,857

2,492

0,521

41,438

10,210

13

18,99

18 T. turgidum ssp. Ispahanicum var. Spahanorufum

AB

AB

74,682

1

1

13,556

2,352

0,444

41,010

8,744

15

17,15

19 T. turgidum ssp. Paleocolchicum var. Karamyschevi (2)

AB

AB

67,603

1

1

18,076

2,492

0,417

35,558

9,704

17

13,07

20 Aegilops triuncialis

UC

UC

57,891

0

0

15,150

1,672

0,389

29,425

8,338

26

22,63

21 T. petropavlovskyi var. Petroferrugineum (2)

AB

AB

51,518

1

1

14,944

3,212

0,475

56,768

12,589

20

17,17

22 Aegilops biuncialis

UM

UM

44,571

1

1

16,447

1,425

0,354

24,596

6,549

33

29,04

23 T. turgidum ssp. Turgidum

AB

AB

36,018

1

1

19,787

2,634

0,421

39,814

9,082

22

15,69

24 Aegilops cylindrica Host

DC

DC

10,176

1

1

14,851

1,294

0,336

22,517

4,818

30

19,16 14,76

25 T. zhukovskyi

AGA ASAm

70,944

0

0

21,321

3,227

0,738

58,062

16,039

13

26 Magvas

ABD ABD

64,75

1

1

13,1

2,24

0,41

32,87

7,9

26

10,7

27 Magdaléna

ABD ABD

57,84

1

1

11,3

2,29

0,44

34,06

8,3

27

14,94

28 T. aestivum ssp. Spelta var. Neglectum

ABD ABD

38,049

1

1

14,811

2,289

0,353

36,713

10,315

21

16,91

29 T. aestivum ssp. spelta

ABD ABD

33,093

1

1

12,707

2,606

0,412

44,028

9,646

17

15,99

29,769

1

1

16,126

2,453

0,398

43,393

9,620

18

18,97

30 T. kiharae var kiharae

AGD

AGD

31 T. aestivum ssp. Macha

ABD ABD

27,661

1

1

14,571

2,375

0,384

37,158

8,792

23

15,47

32 T. aestivum ssp. Compactum

ABD ABD

22,287

1

1

18,666

2,274

0,477

32,514

9,601

22

12,71

Old alsz

Függelék IV. táblázat A különböző szemkeménységű F3 törzsek minőségi tulajdonságai (1999) Nedvessikér tartalom % Keménység <40 40 < Keménység <50 50 < Keménység < 60 60 < Keménység < 70 Keménység > 70 SzD5% Zeleny szedimentációs érték Keménység < 40 40 < Keménység <50 50 < Keménység < 60 60 < Keménység < 70 Keménység > 70 SzD5% Farinográfos vízfelvétel Keménység < 40 40 < Keménység <50 50 < Keménység < 60 60 < Keménység < 70 Keménység > 70 SzD5%

Minimum-Maximum

Átlag

Szórás

25 - 38 26 - 41 26 - 53 24 - 45 29 - 41

31 A 32 B 34 C 34 D 35 D 0,99

2,7 2,8 3,3 3,2 2,8

11 - 43 16 - 56 23 - 69 35 - 75 48 - 79

26 A 35 B 46 C 55 D 62 E 5,7

6,4 7,1 7,9 7,8 7,6

51,7 - 54,7 51 - 56,7 47,1 - 59,2 56,2 - 60,4 58,9 - 61,7

53,3 A 55,0 B 57,1 C 58,7 D 60,1 E 1,39

0,67 0,75 1,11 0,64 0,57

V. táblázat A keménység Pearson korrelációs értékei (r) az egyes minőségi tulajdonságokkal a különböző keménységi csoportokban a vizsgált F3 törzsekben (p<0,05:*, p<0,01:**, p<0,001:***) Összes törzs (N=869) 0,36*** Nedvessikér % Zeleny szedim. ml 0,84*** 0,95*** Vízfelvétel %

Kem. < 40 N=120 0,27** 0,54*** 0,78***

40
50
60
Kem. > 70 N=55 0,15 0,28** 0,59***

Old alsz

Függelék VI. táblázat

A különböző szemkeménységű F4 törzsek minőségi tulajdonságai (2000)

Fehérje tartalom % Keménység < 40 (4) 40 < Keménység <50 50 < Keménység < 60 60 < Keménység < 70 Keménység > 70 SzD5% Nedvessikér tartalom % Keménység < 40 40 < Keménység <50 50 < Keménység < 60 60 < Keménység < 70 Keménység > 70 SzD5% Zeleny szedimentációs érték ml Keménység < 40 40 < Keménység <50 50 < Keménység < 60 60 < Keménység < 70 Keménység > 70 SzD5% Farinográfos vízfelvétel Keménység < 40 40 < Keménység <50 50 < Keménység < 60 60 < Keménység < 70 Keménység > 70 SzD5%

VII. táblázat

Minimum-Maximum

Átlag

Szórás

9,1 - 14 9,7 - 14,9 9,5 - 16,1 10,2 - 15,3 10,6 - 14,4

11,14 A 11,69 B 11,93 B 12,48 C 12,24 C 0,26

0,96 1,13 1,2 1,09 0,73

24,4 - 40,8 24,3 - 44,1 17,9 - 47,5 25,1 - 44,5 26,6 - 39,3

31,13 A 32,21 AB 32,53 AC 34,28 C 32,84 B 1,17

3,37 4,14 4,4 4,08 2,69

22 - 71 38 - 83 22 - 83 38 - 85 42 - 80

43 A 56 BC 57 B 61 D 60 CD 4

0,67 0,75 1,11 0,64 0,57

52,6 - 59 55,1 - 59,9 55,0 - 61,1 56,7 - 60,6 57,5 - 61,6

54,90 A 57,18 B 57,75 C 58,80 D 59,16 E 0,22

1,15 0,88 0,86 0,82 0,77

A szemkeménység Pearson korrelációs értékei (r) az egyes minőségi tulajdonságokkal a

különböző keménységi csoportokban a vizsgált F4 törzsekben (p<0,05: , p<0,01:**, p<0,001: ***)

Fehérje % Nedvessikér % Zeleny szedim. ml Vízfelvétel ml

Összes törzs (N= 254)

Kem.<40 N=24

40
50< Kem. <60 N=20

60
Kem.>70 N=108

0,39*** 0,35*** 0,80*** 0,97***

-0,05 -0,03 0,54** 0,87***

0,14 0,15 0,35 0,71***

0,42 0,36 0,56** 0,75***

0,20 0,25* 0,38*** 0,62***

0,29** 0,35*** 0,48*** 0,83***

Old alsz

Függelék VIII. táblázat

A különböző szemkeménységű F5 törzsek minőségi tulajdonságai (2001) Minimum – Maximum

Fehérje tartalom % 9,8 – 13,3 Keménység < 50 10,2 – 15,10 50 < Keménység < 60 10,5 – 14,3 60 < Keménység < 70 9,8 – 16,1 Keménység > 70 SzD 5% Nedvessikér tartalom % 22,7 – 36,0 Keménység < 50 24,3 – 41,6 50 < Keménység < 60 23,3 – 36,3 60 < Keménység < 70 20,8 – 44,6 Keménység > 70 SzD 5% Zeleny szedimentációs érték ml 23,6 – 48,0 Keménység < 50 27,4 – 62,9 50 < Keménység < 60 30,4 – 56,3 60 < Keménység < 70 34,0 – 82,5 Keménység > 70 SzD 5% Farinográfos vízfelvétel ml 51,60 – 53,70 Keménység < 50 52,60 – 55,5 50 < Keménység < 60 54,1 – 56,3 60 < Keménység < 70 55,3 – 61,1 Keménység > 70 SzD 5%

IX. táblázat

Átlag

Szórás

11,27 A 11,77 B 12,15 C 12,63 D 0,33

0,84 0,86 0,90 0,98

27,64 A 29,51 B 29,71 B 31,23 C 1,25

3,10 3,08 3,38 3,77

31,27 A 37,82 B 43,66 C 54,43 D 2,92

5,64 5,98 6,35 9,24

52,50 A 53,59 B 55,37 C 57,44 D 0,32

0,50 0,59 0,49 1,03

A keménység Pearson korrelációs értékei (r) az egyes minőségi tulajdonságokkal a különböző

keménységi csoportokban a vizsgált F5 törzsekben (p<0,05: , p<0,01:**, p<0,001:

Fehérje % Nedvessikér % Zeleny szedim. ml Vízfelvétel ml

X. táblázat

Összes törzs (N= 492) 0,51*** 0,40*** 0,83*** 0,98***

Kem. < 50 N=51 0,05 0,09 0,29* 0,69***

50< Kem. <60 N=58 0,46*** 0,43*** 0,58*** 0,77***

60< Kem. < 70 N=43 0,21 0,23 0,01 0,63***

***) Kem. > 70 N=340 0,35*** 0,36*** 0,67*** 0,92***

A GBSS enzimfehérje vizsgálatokba bevont Bánkúti 1201törzsek és a keményítő tulajdonságai

Old alsz

Függelék

Sorszám

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37

Kísérlet 1998

RMF 43 RMF 46 RMF 47 RMF 50 RMF 51 RMF 54 RMF 55 RMF 56 RMF 57 RMF 61 RMF 63 RMF 65 RMF 67 RMF 68 RMF 69 RMF 71 RMF 72 RMF 74 RMF 75 RMF 79 RMF 80 RMF 82 RMF 84 RMF 87 RMF 90 RMF 92 RMF 93 RMF 94 RMF 96 RMF 98 RMF 99 RMF 101 RMF 102 RMF 104 RMF 107 Rosella Janz

Kísérlet 1996

B 27 B 103 B 84 B 101 B 102 B 36 B 41 B 87 B 90 B 98 B 35 B 89 B 18 B 46 B2 B 12 B 34 B 47 B 69 B 78 B5 B 22 B 26 B 33 B 61 B 62 B 75 B 82 B1 B 24 B 44 B 55

∆H (J/g) DSC

Csúcsviszkozitás (RVU) (RVA)

Amilóz %

13,56 12,60 10,89 9,01 15,08 11,28 11,96 13,15 9,28 11,76 10,57 11,02 16,34 13,10 10,94 8,34 11,04 12,45 15,21 12,31 13,42 12,52 13,25 12,77 12,50 14,39 11,79 11,19 9,91 10,13 9,58 12,73 13,23 10,16 17,41 11,39 12,53

260,6 332,7 337,7 307,9 282,3 309,3 332,0 314,4 371,8 266,6 324,8 336,4 326,4 321,7 342,2 238,5 248,3 256,8 365,1 231,0 264,8 319,6 267,1 361,8 338,2 273,2 348,4 340,2 363,7 348,5 327,2 317,5 289,2 353,2 251,0

17,46 15,04 14,41 16,59 16,63 16,24 17,90 17,60 15,34 16,41 15,65 19,74 15,29 15,04 15,47 16,42 17,49 17,07 16,09 15,38 15,89 17,21 14,72 16,66 17,22 21,65 19,60 17,76 19,14 24,20 20,72 16,92 17,64 16,19 16,91 16,52 18,06

Old alsz

Szelekciós lehetőségek a búza minőség-orientált nemesítésében fehérjekémiai és DNS markerekkel

Recommend Documents