UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Geneesmiddelenleer Laboratorium voor Medicinale Chemie Academiejaar 2008-2009
SYNTHESE VAN SUBSTRAAT-GEBASEERDE INHIBITOREN VAN MITOCHONDRIAAL THYMIDINE KINASE (TK-2)
Jolien JANSSENS Eerste master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. dr. apr. S. Van Calenbergh
Commissarissen Prof. dr. apr. F. De Vos Dr. A. Heyerick
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Geneesmiddelenleer Laboratorium voor Medicinale Chemie Academiejaar 2008-2009
SYNTHESE VAN SUBSTRAAT-GEBASEERDE INHIBITOREN VAN MITOCHONDRIAAL THYMIDINE KINASE (TK-2)
Jolien JANSSENS Eerste master in de Farmaceutische Zorg
Promotor Prof. dr. apr. S. Van Calenbergh
Commissarissen Prof. dr. apr. F. De Vos Dr. A. Heyerick
De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef. 25 mei 2009
Promotor Prof. dr. apr. S. Van Calenbergh
Auteur Jolien Janssens
DANKWOORD Alvorens ik mijn dankwoord richt aan enkele mensen in het bijzonder, wil ik toch even zeggen dat het een onmogelijke opdracht is iedereen, die op één of andere manier zijn steentje bijgedragen heeft tot het voltooien van deze thesis, persoonlijk te bedanken. Bij het werken aan een thesis gaat het immers niet alleen om de wetenschappelijke inhoud, ook de stimulerende schouderklopjes van velen deden me deugd. De interesse in ‘hoe ik het stelde in het labo?’ deed me veel plezier en gaf me de steun die ik nodig had! Daarom wil ik een algemeen dankwoord richten aan al de mensen die me op deze manier steunden. In het bijzonder wens ik mijn promotor, Prof. dr. apr. Serge Van Calenbergh, te bedanken voor het zeer interessante onderzoeksonderwerp, het spenderen van zijn kostbare tijd in het begeleiden van mijn onderzoek en het erg snel nalezen van mijn teksten. Sara, jou zou ik graag willen bedanken voor de dagelijkse begeleiding, de fantastische uitleg bij allerlei probleempjes, je grenzeloze geduld en de oppepper die je me gaf telkens ik het even moeilijk had! Ik vond het ook erg lief dat je me tijdens de vele uren aan mijn ‘kolommen’ gezelschap hield en daarvoor zelfs je eigen middagpauze opofferde! Bedankt voor alles! Verder wens ik ook Prof. Jan Balzarini te bedanken voor het snel testen van de gesynthetiseerde verbindingen. Het was erg fijn resultaten te kunnen interpreteren van de moleculen die ik in de loop van het onderzoek gesynthetiseerd heb. Uiteraard dank ik ook Nora, Eline, Thomas, Izet, Matthias en Caroline voor de goede tips, de leuke ‘goeiemorgen’ of ‘tot straks’, een toffe babbel tussendoor… Special English thanks to Kiran, Radim and René for the great tips, the friendly ‘good morning’ or ‘see you later’ and the small talks… Kiran and Radim, I particularly want to thank you for your willingness to extensively answer to all of my detailed chemistry-questions, especially in the last couple of weeks! Bovendien wil ik ook mijn ouders, broer Joppe, zus Jidse en haar vriend Mathieu bedanken voor hun dagelijkse interesse, hulp met de computer of bij het nalezen van mijn werk en vooral voor hun geloof in mij. Mama en papa, jullie wil ik nog eens extra bedanken omdat jullie me de kans geven deze interessante opleiding te volgen en zo te bouwen aan een fijne toekomst! Last but not least wil ik mijn vriend Filip bedanken voor zijn onvoorwaardelijke steun en liefde en zijn fantastische kookkunsten die hij uit zijn mouw toverde terwijl ik ijverig aan het schrijven was. Filip, je toonde steeds interesse in wat ik deed, luisterde als ik het moeilijk had en spoorde me op tijd aan toch even te ontspannen. Bedankt!
1. INLEIDING .......................................................................................................................... 1 1.1. INTRODUCTIE .............................................................................................................. 1 1.2. MITOCHONDRIAAL DNA (mtDNA) .......................................................................... 1 1.3. DNA-POLYMERASE γ (DPγ) ....................................................................................... 1 1.4. DEOXYRIBONUCLEOSIDETRIFOSFATEN (dNTP) ................................................. 2 1.5. DEOXYRIBONUCLEOSIDEKINASEN (dNK‟s) ......................................................... 4 1.6. TRANSFER ..................................................................................................................... 5 1.7. THYMIDINE KINASE (TK) .......................................................................................... 6 1.7.1. Algemeen .................................................................................................................. 6 1.7.2. TK-1 ......................................................................................................................... 6 1.7.3. TK-2 ......................................................................................................................... 6 1.7.4. Problemen met TK-2 .............................................................................................. 7 1.8. NUCLEOSIDEANALOGEN (NA) ................................................................................ 7 1.8.1. Algemeen .................................................................................................................. 7 1.8.2. AZT .......................................................................................................................... 8 1.8.3. Bijwerkingen ........................................................................................................... 8 1.9. DE OXPHOS-THEORIE ................................................................................................ 9 1.10. mtDNA-DEPLETIE SYNDROOM (MDS) .................................................................. 9 1.11. TK-2 INHIBITOREN .................................................................................................. 10 1.11.1. Nut van TK-2 inhibitoren ................................................................................... 10 1.11.2. Historiek van de TK-2 inhibitoren .................................................................... 10
2. DOELSTELLINGEN......................................................................................................... 13
3. METHODEN EN MATERIALEN ................................................................................... 15 3.1. METHODEN ................................................................................................................. 15 3.1.1. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) .......................................................... 15 3.1.1.1. Het principe van NMR ..................................................................................... 15 3.1.1.2. Het NMR-spectrum .......................................................................................... 16 3.1.1.3. Apparatuur ........................................................................................................ 17 3.1.2. Massaspectroscopie (MS) ..................................................................................... 17 3.1.2.1. Het principe van MS ........................................................................................ 17 3.1.2.2. Het MS-spectrum ............................................................................................. 18
3.1.2.3. Apparatuur ........................................................................................................ 18 3.2. MATERIALEN ............................................................................................................. 18
4. BESCHRIJVEND DEEL................................................................................................... 19 4.1. SYNTHESE VAN N-(3‟-DEOXY-β-D-THYMIDIN-3‟-YL)-N‟-(4”-CHLORO-3”TRIFLUOROMETHYLFENYL)-GUANIDINE ANALOGEN (11, 12 EN 13) ................. 19 4.1.1. Algemeen overzicht ............................................................................................... 19 4.1.2. Bespreking van de reactiemechanismen ............................................................. 21 4.1.2.1. Synthese van 2,3‟-anhydro-5‟-O-trifenylmethyl-β-D-thymidine (3)................ 21 4.1.2.2. Synthese van 3‟-amino-3‟-deoxy-5‟-O-trifenylmethyl-β-D-thymidine (5) ...... 21 4.1.2.3. Synthese van analogen met HgCl2 ................................................................... 22 4.2. SYNTHESE VAN 5‟‟‟-(3‟-AMINO-3‟-DEOXY-β-D-THYMIDIN-3‟N-YL)-1‟‟‟-(4”CHLORO-3”-TRIFLUOROMETHYLFENYL)-1‟‟‟,2‟‟‟,3‟‟‟,4‟‟‟-TETRAZOOL (15) ..... 24 4.3. SYNTHESE VAN 3‟-DEOXY-3‟-(1”,2”,3”-TRIAZOL-1”-YL)-β-D-THYMIDINE (18)........................................................................................................................................ 26 4.4. SYNTHESE VAN 3‟-BENZYLAMINO-3‟-DEOXY-β-D-THYMIDINE (20) ........... 27
5. EXPERIMENTEEL DEEL ............................................................................................... 29 5.1. SYNTHESE VAN N-(3‟-DEOXY-β-D-THYMIDIN-3‟-YL)-N‟-(4”-CHLORO-3”TRIFLUOROMETHYLFENYL)-GUANIDINE ANALOGEN .......................................... 29 5.1.1. Synthese van 5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidine (1)......................................... 29 5.1.2. Synthese van 2,3’-anhydro-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidine (3) ................. 29 5.1.3. Synthese van 3’-azido-3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidine (4) ......... 30 5.1.4. Synthese van 3’-amino-3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidine (5) ........ 31 5.1.5. Synthese van N-(3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”chloro-3”-trifluoromethylfenyl)-thiourea (6) ............................................................... 32 5.1.6. Synthese van N-(3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”chloro-3”-trifluoromethylfenyl)-benzylguanidine (7) .................................................. 32 5.1.7. Synthese van N-(3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”chloro-3”-trifluoromethylfenyl)-guanidine (8) ............................................................. 33 5.1.8. Synthese van N-(3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”chloro-3”-trifluoromethylfenyl)-methylguanidine (9) ................................................. 34 5.1.9. Synthese van N-(3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”chloro-3”-trifluoromethylfenyl)-isopropylguanidine (10) ........................................... 34 5.1.10. Synthese van N-(3’-deoxy-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”-chloro-3”trifluoromethylfenyl)-benzylguanidine (11) ................................................................. 35
5.1.11. Synthese van N-(3’-deoxy-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”-chloro-3”trifluoromethylfenyl)-guanidine (12) ............................................................................ 35 5.1.12. Synthese van N-(3’-deoxy-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”-chloro-3”trifluoromethylfenyl)-isopropylguanidine (13) ............................................................ 36 5.2. SYNTHESE VAN 5‟‟‟-(3‟-AMINO-3‟-DEOXY-β-D-THYMIDIN-3‟N-YL)-1‟‟‟-(4”CHLORO-3”-TRIFLUOROMETHYLFENYL)-TETRAZOOL ......................................... 36 5.2.1. Synthese van 5’’’-(3’-amino-3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidin-3’Nyl)-1’’’-(4”-chloro-3”-trifluoromethylfenyl)-tetrazool (14) ......................................... 36 5.2.2. Synthese van 5’’’-(3’-amino-3’-deoxy-β-D-thymidin-3’N-yl)-1’’’-(4”-chloro-3”trifluoromethylfenyl)-tetrazool (15) .............................................................................. 37 5.3. SYNTHESE VAN 3‟-DEOXY-3‟-(1”,2”,3”-TRIAZOL-1”-YL)-β-D-THYMIDINE .. 38 5.3.1. Synthese van 3’-azido-3’-deoxy-β-D-thymidine (16) .......................................... 38 5.3.2. Synthese van 3’-deoxy-3’-(1”,2”,3”-triazol-1”-yl)-β-D-thymidine (18) ............ 38 5.4. SYNTHESE VAN 3‟-BENZYLAMINO-3‟-DEOXY-β-D-THYMIDINE................... 39 5.4.1. Synthese van 3’-benzylamino-3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidine (19) ........................................................................................................................................... 39 5.4.2. Synthese van 3’-benzylamino-3’-deoxy-β-D-thymidine (20) ............................. 40
6. RESULTATEN EN BESPREKING ................................................................................. 41 6.1. BIOLOGISCHE EVALUATIE ..................................................................................... 41 6.1.1. Algemeen ................................................................................................................ 41 6.1.2. Resultaten .............................................................................................................. 41 6.1.3. Bespreking ............................................................................................................. 42 6.2. STRUCTUURANALYSE VAN 1”,4”- EN 1”,5”-DIGESUBSTITUEERDE TRIAZOLEN ........................................................................................................................ 43
7. BESLUIT EN TOEKOMSTPERSPECTIEVEN ............................................................ 45
8. LITERATUURLIJST ........................................................................................................ 46
BIJLAGE 1: 1H-NMR-spectrum van 15 BIJLAGE 2: 1H-NMR-spectrum van 18 BIJLAGE 3: 13C-NMR-spectrum van 18
LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN
δ
chemische shift
µ
magnetisch moment
ν
frequentie
ADP
adenosinedifosfaat
AMP
adenosinemonofosfaat
Arg
arginine (aminozuur)
ATP
adenosinetrifosfaat
AZT
azidothymidine
B0
extern magneetveld
CTP
cytidinetrifosfaat
dAdo
deoxyadenosine
dATP
deoxyadenosinetrifosfaat
DBU
1,8–diazabicyclo[5,4,0]undec-7-een
dCDP
deoxycytidinedifosfaat
dCK
deoxycytidine kinase
dCTP
deoxycytidinetrifosfaat
dCyt
deoxycytidine
dGK
deoxyguanosine kinase
dGTP
deoxyguanosinetrifosfaat
dGuo
deoxyguanosine
dIno
deoxyinosine
DLC
dunnelaagchromatografie
DMAP
4-dimethylaminopyridine
Dm-dNK
dNK van Drosophila melanogaster
DMF
dimethylformamide
DMSO
dimethylsulfoxide
dN
deoxyribonucleosiden
DNA
deoxyribonucleic acid
DNC
deoxynucleotide carrier
dNDP
deoxyribonucleosidedifosfaten
dNK‟s
deoxyribonucleosidekinasen
dNMP
deoxyribonucleosidemonofosfaat
dNTP
deoxyribonucleosidetrifosfaat
DPγ
DNA-polymerase γ
dTDP
deoxythymidinedifosfaat
dThd
deoxythymidine
dTTP
deoxythymidinetrifosfaat
dUDP
deoxyuridinedifosfaat
dUrd
deoxyuridine
dUTP
deoxyuridinetrifosfaat
EMS
elektromagnetische straling
ENT
equilibratieve nucleoside transporter
ESI
elektrospray ionisatie
ETK
elektronentransportketen
FIAU
fialuridine
GDEPT
gene directed enzyme prodrug therapy
Gln
glutamine (aminozuur)
GMP
guanosinemonofosfaat
HAART
highly active antiretrovirale therapie
HIV
Human Immunodeficiency Virus
HPLC
high performance liquid chromatography
HSQC
Heteronuclear Single Quantum Correlation
HSV-TK
TK van het Herpes simplex virus
hTK-2
humaan TK-2
Hz
Hertz
IC50
50% inhiberende concentratie
Ile
isoleucine (aminozuur)
IMP
inosinemonofosfaat
J
koppelingsconstante
kt
kamertemperatuur
Leu
leucine (aminozuur)
MDS
mtDNA-depletie syndroom
MS
massaspectroscopie
mtDNA
mitochondriaal DNA
NA
nucleosideanaloog
NDPK
nucleosidedifosfaatkinase
NMPK‟s
nucleosidemonofosfaatkinasen
NMR
nucleaire magnetische resonantie
NZ
nucleïnezuren
OXPHOS
oxidatieve fosforylatie
ppm
parts per million
RNA
ribonucleic acid
rNr
ribonucleotide reductase
SBS
snelheidsbepalende stap
TBAF
tetrabutylammoniumfluoride
THF
tetrahydrofuran
TK
thymidine kinase
TMPK
thymidine monofosfaatkinase
TMS
tetramethylsilaan
TOF
time-of-flight
Trp
tryptofaan (aminozuur)
UDP
uridinedifosfaat
UMP
uridinemonofosfaat
UTP
uridinetrifosfaat
Val
valine (aminozuur)
VZV
Varicella zoster virus
Inleiding 1. INLEIDING 1.1. INTRODUCTIE DNA (deoxyribonucleïnezuur) is de basis van ons bestaan. Het bestaat uit een aaneenschakeling van nucleotiden, waarbij elk nucleotide is opgebouwd uit een deoxyribosegroep, een fosfaatgroep en een pyrimidine (cytosine en thymine)- of een purine (adenine en guanine)- base. DNA kan voorgesteld worden als een ruggengraat die afwisselend deoxyribose- en fosfaatgroepen bevat. De ribben van de ruggengraat worden gevormd door de basen. Deze basen vormen basenparen die enerzijds zorgen voor de dubbele helixvorm en anderzijds verantwoordelijk zijn voor de erfelijke informatie. 95 % van het humane DNA wordt teruggevonden in de kern; de resterende 5 % komt voor in de mitochondriën. (Mathews et al., 2000; Rampazzo et al., 2004)
1.2. MITOCHONDRIAAL DNA (mtDNA) Het enige extrachromosomale DNA in een cel komt voor in de mitochondriën. Het mitochondriaal DNA is dubbelstrengig, circulair en codeert voor 13 polypeptiden uit de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) nodig voor ATP(adenosinetrifosfaat)-synthese, voor 2 ribosomale RNA‟s (ribonucleïnezuur) en voor 22 transfer-RNA‟s, nodig voor de translatie van het mtDNA. Het mtDNA wordt gerepliceerd door een nucleair-gecodeerd proteïne, het DNA-polymerase γ (DPγ). (Kakuda, 2000)
1.3. DNA-POLYMERASE γ (DPγ) DPγ is het enige DNA-polymerase van de 5 grootste humane cellulaire DNApolymerases dat in de mitochondriën voorkomt. DNA-polymerases α, β, ζ en ε zijn gelokaliseerd in de kern. (Kakuda, 2000) Mitochondriaal DPγ bevat een grote katalytische subeenheid met een DNApolymerase- en exonuclease-activiteit en een kleine subeenheid met bindings- en voortgangsactiviteit. (Lim et al., 1999) De exonuclease-activiteit zorgt voor proofreading van de groeiende DNA-streng, waardoor de betrouwbaarheid van de DNA-replicatie toeneemt, toch verloopt de replicatie niet altijd foutloos. (Lewis, 2007)
1
Inleiding
2
De mtDNA-replicatie door DPγ is onafhankelijk van de nucleaire DNA-synthese en vindt plaats gedurende de hele celcyclus: een continu aanbod van deoxyribonucleosidetrifosfaten (dNTP) is dus onontbeerlijk voor de mtDNA-synthese. (Bogenhagen & Clayton, 1976) 1.4. DEOXYRIBONUCLEOSIDETRIFOSFATEN (dNTP) dNTP‟s zijn essentieel voor DNA-synthese, zowel voor kernDNA als voor mtDNA. Deze bouwstenen kunnen verkregen worden op 2 manieren: via „de novo‟-synthese en een „salvage-pathway‟. In de „salvage-pathway‟ worden dNTP‟s gesynthetiseerd vanuit deoxyribonucleosiden (dN) en basen die beschikbaar zijn in dieet of door enzymatische afbraak van nucleïnezuren (NZ). De splitsing van de NZ start bij de breking van de interne bindingen door endonucleasen, wat resulteert in deoxyoligonucleotiden. Deze worden exonucleolytisch
gekliefd
door
niet-specifieke
fosfodiësterasen.
De
gevormde
deoxymononucleotiden worden vervolgens hydrolytisch gesplitst en de ontstane dN‟s worden door het reversibele nucleoside-fosforylase omgevormd tot de overeenkomstige nucleobasen. Vanuit deze nucleobasen kunnen in de „salvage pathway‟ dN‟s gevormd worden die gefosforyleerd
worden
tot
deoxyribonucleosidekinasen
de
overeenkomstige
(dNK‟s),
dNTP‟s
door
nucleosidemonofosfaatkinasen
respectievelijk (NMPK‟s)
en
nucleosidedifosfaatkinase (NDPK). Een andere mogelijke weg in de „salvage-pathway‟ omvat de directe synthese van het deoxyribonucleosidemonofosfaat (dNMP) vanuit de nucleobase. (FIGUUR 1.1) (Mathews et al., 2000) In de „de novo‟-synthese worden nucleotiden gesynthetiseerd startend van aminozuren en suikers, de synthese van de purine- en de pyrimidine-nucleotiden verloopt echter verschillend.
De
inosinemonofosfaat
synthese (IMP).
van
purine-nucleotiden
Vanuit
deze
start
met
gemeenschappelijke
de
synthese
precursor
van
worden
adenosinemonofosfaat (AMP) en guanosinemonofosfaat (GMP) gevormd. De synthese van pyrimidine-nucleotiden begint bij de opbouw van de vrije base, waaraan pas later een ribosefosfaat wordt gekoppeld tot vorming van een nucleotide: uridinemonofosfaat (UMP). Vanuit UMP wordt -via uridinedi-(UDP) en uridinetrifosfaat (UTP)- cytidinetrifosfaat (CTP) gevormd. (FIGUUR 1.2) (Mathews et al., 2000)
Inleiding
FIGUUR 1.1: RECUPERATIE VAN PURINE EN PYRIMIDINE BASEN. DE FIGUUR TOONT HET VERBAND TUSSEN NZ-KATABOLISME (BLAUW) EN HERSYNTHESE VAN NUCLEOTIDEN DOOR DE „SALVAGE-PATHWAY‟ (ROOD). (Mathews et al., 2000)
De „de novo‟-synthese resulteert in de vorming van ribonucleotiden. Om dienst te doen als bouwsteen voor DNA moeten deze ribonucleotiden nog gereduceerd worden. Deze reductie wordt gekatalyseerd door het ribonucleotide reductase (rNr), waardoor -na eventueel additionele fosforylatie- deoxyadenosinetrifosfaat (dATP), dGTP, dUTP en dCTP ontstaan. (Mathews et al., 2000)
De methylgroep, die deoxythymidine (dThd) in DNA onderscheidt van uridine in RNA, wordt via een aantal stappen (o.a. door inwerking van thymidylaatsynthase) geïntroduceerd uitgaande van deoxycytidinedifosfaat (dCDP) en deoxyuridinedifosfaat (dUDP). Verdere fosforylatie levert uiteindelijk deoxythymidinetrifosfaat (dTTP). (Mathews et al., 2000) In het cytosol worden dNTP‟s zowel via „de novo‟-synthese als via de „salvagepathway‟ gevormd. In de mitochondriën ontbreken echter de nodige enzymen voor „de novo‟synthese, de bouwstenen voor mtDNA worden hier bekomen via de „salvage-pathway‟ enerzijds en via de transfer vanuit het cytosol anderzijds. (Saada, 2004; Mancuso et al.,2002)
3
Inleiding
4
FIGUUR 1.2: OVERZICHT VAN HET NUCLEOTIDE-METABOLISME. „DE NOVO‟PATHWAYS VOOR SYNTHESE EN GEBRUIK VAN RIBONUCLEOTIDEN (ORANJE) EN DEOXYRIBONUCLEOTIDEN (BLAUW). (Mathews et al., 2000)
In tegenstelling tot de synthese van kernDNA gaat deze van mtDNA continu door. In rustende cellen (bv. spieren, lever, hersenen, hart) is de cytosolische dNTP-synthese echter gedownreguleerd: de „de novo‟-synthese en de activiteit van de salvage-dNK‟s, zoals TK-1, zijn
sterk
teruggedrongen,
waardoor
in
niet-delende
weefsels
de
cytosolische
deoxyribonucleotiden onbeschikbaar zijn. Dit heeft tot gevolg dat in rustende cellen de mitochondriën enkel kunnen terugvallen op de „salvage-pathway‟ voor de nodige dNTP‟s en dat wanneer ook deze bron aangetast wordt (door bepaalde geneesmiddelen, ziekten…) er ernstige problemen ontstaan. (Pérez-Pérez et al., 2008)
1.5. DEOXYRIBONUCLEOSIDEKINASEN (dNK‟S) De initiële fosforylatie van dN gebeurt door dNK‟s. Bij de mens worden 4 verschillende types dNK‟s teruggevonden met elk hun specifieke locatie en substraten:
Thymidine kinase 1 (TK-1): gelokaliseerd in het cytosol, fosforyleert dThd en deoxyuridine (dUrd);
Deoxycytidine kinase (dCK): gelokaliseerd in het cytosol of in de kern, fosforyleert
deoxycytidine
(dCyt),
deoxyadenosine
(dAdo)
en
deoxyguanosine (dGuo);
Thymidine kinase 2 (TK-2): gelokaliseerd in de mitochondriën, fosforyleert de pyrimidines: dThd, dCyt en dUrd;
Inleiding
5
Deoxyguanosine kinase (dGK): gelokaliseerd in de mitochondriën, fosforyleert de purines: dGuo, dAdo, en deoxyinosine (dIno). (Reichard, 1988; Arner & Eriksson, 1995; Van Rompay et al., 2000; Jones, 1980; Zhu et al., 1998; Wang et al., 1999; Eriksson et al., 2002; Saada, 2004)
1.6. TRANSFER Een 2e bron van mitochondriale nucleotide bouwstenen, naast de „salvage-pathway‟, is het transport van de bouwstenen vanuit het cytosol naar de mitochondriale matrix. De mitochondriën beschikken over een dubbel membraan, waarvan het binnenste membraan slecht permeabel is voor dN en deoxynucleotiden. Specifieke transporters zijn noodzakelijk om hun transfer mogelijk te maken. De deoxyribonucleosidedifosfaten (dNDP) en dNTP‟s kunnen overgebracht worden met behulp van de deoxynucleotide carrier (DNC) (Dolce et al., 2001). dN kunnen getransfereerd worden met behulp van de ENT (equilibratieve nucleoside transporter) (Lai et al., 2004). Eens de dN in de matrix van de mitochondriën geraakt zijn, is stapsgewijze fosforylatie noodzakelijk. De initiële fosforylatie (SBS) gebeurt door dGK en TK-2 (Eriksson et al., 2002). De tweede fosforylatie gebeurt door 4 verschillende NMPK‟s, waarna NDPK zorgt voor de finale trifosfaatvorm. (FIGUUR 1.3) (Bradshaw & Samuels, 2005)
FIGUUR 1.3: SCHEMATISCH OVERZICHT VAN HET dNTP-METABOLISME IN DE MITOCHONDRIEN EN DE TRANSFER VAN DE BOUWSTENEN VAN HET CYTOSOL NAAR DE MITOCHONDRIEN-MATRIX. (Bradshaw & Samuels, 2005)
Inleiding 1.7. THYMIDINE KINASE (TK) 1.7.1. Algemeen
TK is een dNK en katalyseert de eerste fosfaatoverdracht van een geschikte donor, ATP, naar dN in de „salvage-pathway‟. TK‟s kunnen, naargelang hun structuur, onderverdeeld worden in 2 subfamilies: type 1 en type 2 (Gentry, 1992; Birringer et al., 2005). Tot de type 1-TK‟s behoren het mitochondriale humane TK-2 en het TK van het Herpes simplex virus (HSV-TK). De type 2-TK‟s omvatten het humane cytosolische TK-1 en de TK‟s van andere eukaryoten zoals Dictyostelium discoideum en Entamoeba histolytica. Type 2 TK‟s worden ook aangetroffen in verschillende prokaryoten zoals Staphylococcus aureus, Mycoplasma pneumoniae en Bacillus anthracis alsook in verschillende virussen (Sandrini et al., 2006). Type 1- en type 2-TK‟s vertonen slechts kleine sequentieovereenkomsten en hebben verschillende substraatspecificiteiten. (Thiel et al., 2008)
1.7.2. TK-1
TK-1 is een cytosolisch enzym dat gecodeerd wordt door een gen op chromosoom 17 (Mancuso et al., 2002). TK-1 fosforyleert enkel dThd en dUrd met ATP en dATP als fosfaatdonor (Thiel et al., 2008). De kristalstructuur van TK-1 is volledig opgehelderd. Het expressiepatroon van TK-1 is sterk afhankelijk van de celcyclus, TK-1 is voornamelijk actief tijdens de S-fase en zeer sterk gedownreguleerd bij niet-delende cellen. (Saada, 2004)
1.7.3. TK-2
TK-2 daarentegen bevindt zich in de mitochondriën en het expressiepatroon is onafhankelijk van de celcyclus, het is dus een constitutief enzym (Zhu et al., 1998; Wang et al., 1999; Eriksson et al., 2002; Saada, 2004). Het TK-2 gen is gelokaliseerd op chromosoom 16 en codeert voor een polypeptide van 234 aminozuren (Mancuso et al., 2002). TK-2 is in staat om dThd, dUrd en dCyt te fosforyleren met ATP en cytidinetrifosfaat (CTP) als fosfaatdonoren (Thiel et al., 2008). TK-2 is het enige humane dNK waarvan de 3D-structuur tot op de dag van vandaag onopgehelderd bleef. Het heeft echter sterke overeenkomsten met het multifunctionele dNK van het fruitvliegje Drosophila melanogaster (dM-dNK) (PérezPérez et al., 2008, Al-Madhoun et al., 2004). Op basis van deze overeenkomsten en de
6
Inleiding aminozuursequentie van TK-2 werd een homologiemodel opgesteld, dat bruikbaar is om de bindingswijze van TK-2-liganden te modelleren. (Hernandez et al., 2006) 1.7.4. Problemen met TK-2 In post-mitotische cellen -waar TK-1 en „de novo‟-synthese gedownreguleerd zijn- is er een gebrek aan cytosolische aanvoer van nucleotide-bouwstenen. Als gevolg hiervan is TK-2 verantwoordelijk voor de initiële, noodzakelijke fosforylering van dThd, dat in de mitochondriën bekomen wordt door de mitochondriale „salvage-pathway‟ of via de ENT.
Mutaties in het gen dat codeert voor TK-2 leiden bijgevolg tot een tekort aan dTTP in niet-delende cellen waardoor een verstoring van de balans van dNTP‟s in de mitochondriën ontstaat. Het gevolg is een depletie van mtDNA wat resulteert in een gestoorde aanmaak van de OXPHOS-enzymen en problemen ter hoogte van de elektronentransportketen (ETK). In delende cellen is TK-1 in het cytosol actief, waardoor de TK-2-deficiëntie kan gecompenseerd worden door import van deoxythymidinedifosfaat (dTDP) en dTTP met behulp van de DNC.
Verschillende studies tonen aan dat TK-2, naast fosforylerende eigenschappen, ook een mogelijke rol speelt in de mitochondriale toxiciteit geassocieerd met verlengde therapie met antivirale nucleosideanalogen zoals AZT (azidothymidine) en FIAU (fialuridine). Sluitende bewijzen zijn er echter niet. (Samuels, 2006)
1.8. NUCLEOSIDEANALOGEN (NA) 1.8.1. Algemeen
NA zijn chemische varianten van de endogene nucleosiden en worden gebruikt als antivirale geneesmiddelen. NA zijn prodrugs, die na trifosforylering tot hun actieve vorm kunnen interageren met het virale DNA- of RNA- polymerase of het virale reverse transcriptase en geïncorporeerd worden in een groeiende virale DNA- of RNA- streng. Door de chemische modificaties is bv. verdere verlenging van de DNA-streng onmogelijk, wat leidt tot vroegtijdige ketenterminatie. Dit fenomeen zorgt voor de inhibitie van de replicatie van virussen. Voorbeelden van NA zijn AZT en FIAU.
7
Inleiding
8
1.8.2. AZT AZT (zidovudine) is een antiviraal geneesmiddel dat gebruikt wordt in de behandeling van Human Immunodeficiency Virus (HIV)1. AZT2 is een chemische variant van het natuurlijk nucleoside dThd (additie van een azido-groep) en wordt geïncorporeerd in een groeiende virale DNA-streng, wat tot vroegtijdige ketenterminatie leidt. Hierdoor kan het HIV zich niet meer vermenigvuldigen in de cel. (FIGUUR 1.4) (Samuels, 2006)
FIGUUR 1.4: AZT WORDT, NA TRIFOSFORYLERING TOT DE ACTIEVE VORM, GEÏNCORPOREERD IN EEN GROEIENDE VIRALE DNA-STRENG. DIT LEIDT TOT VROEGTIJDIGE KETENTERMINATIE. (De Clercq, 2002)
1.8.3. Bijwerkingen AZT en andere NA‟s kunnen echter ook interageren met het gastheerpolymerase. De gevoeligheid van de verschillende DNA-polymerasen voor NA is verschillend: γ > β > α=ε. Er
bestaan
2
hypothesen
omtrent
de
bijwerkingen
van
NA‟s.
De DNA-polymerase γ-hypothese stelt:
NA‟s inhiberen het DPγ op een directe manier zonder incorporatie;
NA‟s worden geïncorporeerd in een groeiende mtDNA-streng en induceren zo ketenterminatie;
1
HIV is een retrovirus, beschikt over het reverse transcriptase en is de verwekker van AIDS. Het gebruik van AZT en andere NA vernietigt het HIV niet volledig, waardoor levenslange therapie noodzakelijk is voor deze patiënten. 2 AZT maakt vaak deel uit van de highly active antiretrovirale therapie (HAART).
Inleiding
9
de DPγ-exonuclease-activiteit wordt geïnhibeerd waardoor geïncorporeerde NA‟s niet meer verwijderd zullen worden;
door
de
inhibitie
van
de
DPγ-exonuclease-activiteit
neemt
de
betrouwbaarheid van de DNA-synthese door DPγ af. (Lewis et al., 2003b) Door interacties met het gastheerpolymerase ontstaan mutaties of depleties in het mtDNA, waardoor de productie van een aantal van de OXPHOS-enzymen verstoord wordt en lactaatacidose, intracellulaire lipiden-accumulatie, hepatische stenose en mitochondriale myopathie kunnen ontstaan. (Kakuda, 2000)
De tweede hypothese stelt dat AZT kan optreden als competitieve inhibitor voor TK-2. Aangezien dThd alleen kan gefosforyleerd worden door TK-2 in niet-delende weefsels, zullen de dTTP-pools gedepleteerd raken in aanwezigheid van AZT. Er ontstaat een imbalans van de dNTP-pools in de mitochondriën, waardoor opnieuw stoornissen ontstaan in het mtDNA. (Pérez-Pérez et al., 2008)
1.9. DE OXPHOS-THEORIE De oxidatieve fosforylatie wordt onderhouden door de mitochondriale respiratoire keten of ETK. Deze ETK bestaat uit 5 enzymatische complexen: ter hoogte van complex I tot en met complex IV worden elektronen -afkomstig van reducerende equivalentengetransfereerd over de binnenste mitochondriale membraan, waardoor een protonengradiënt opgebouwd wordt. Deze protonengradiënt is de drijvende kracht voor het 5e enzymcomplex -ATP-synthase- om ATP te genereren uit adenosinedifosfaat (ADP) en anorganisch fosfaat. (Hatefi, 1985)
Het mtDNA codeert o.a. voor 13 polypeptiden uit deze ETK. Door een tekort aan mtDNA zal de ETK en bijgevolg ook de ATP-productie verstoord raken.
1.10. mtDNA-DEPLETIE SYNDROOM (MDS) MDS is een algemene benaming voor een heterogene groep van aandoeningen ten gevolge van mtDNA-depletie (Pérez-Pérez et al., 2008). mtDNA-depletie kan secundair zijn, bv. ten gevolge van een antivirale therapie met nucleosideanalogen, maar bij MDS wordt de
Inleiding
10
mtDNA-depletie als primair proces verondersteld. MDS is een autosomale, recessieve aandoening, die weefselspecifiek of systemisch kan zijn en veroorzaakt wordt door een fout in het gen dat codeert voor TK-2. Kinderen met MDS zijn symptoomloos bij de geboorte, maar op zeer jonge leeftijd manifesteren de symptomen zich. De belangrijkste symptomen van MDS zijn myopathie, lipodystrofie, perifere neuropathie, insulineresistentie en lactaatacidose (Kakuda, 2000; Lewis, 2003a; Nolan & Mallal, 2004; Samuels, 2006). De myopathische vorm van MDS zorgt voor een progressieve spierzwakte, hypotonie en areflexie. Kinderen die leiden aan MDS overlijden op zeer jonge leeftijd, vaak reeds voor het beëindigen van het eerste levensjaar, o.a. door respiratoir falen. (Tritschler et al., 1992; Mancuso et al., 2002; Vila et al., 2003; Saada, 2004)
1.11. TK-2 INHIBITOREN 1.11.1. Nut van TK-2 inhibitoren De functies van TK-2 inhibitoren zijn zeer uiteenlopend. Ze kunnen enerzijds gebruikt worden om de rol van TK-2 in de handhaving en de homeostase van de mitochondriale dNTP-pool en mtDNA te verduidelijken. Anderzijds kunnen ze benut worden om het aandeel van TK-2 activiteit in de mitochondriale toxiciteit van bepaalde antivirale geneesmiddelen en in MDS op te helderen. Bovendien tracht men met behulp van TK-2 inhibitoren -via modelling- een beter inzicht te krijgen in de 3D-structuur van TK-2. (Pérez-Pérez et al., 2008) Een bijkomende mogelijke toepassing van de meeste TK-2 inhibitoren wordt gezocht in de gene directed enzyme prodrug therapy (GDEPT) bij kanker. De meeste TK-2 inhibitoren beschikken over een vrije 5‟-OH groep en komen daardoor in aanmerking als mogelijke suicide substraten. (Portsmouth et al., 2007)
1.11.2. Historiek van de TK-2 inhibitoren
Het onderzoek naar TK-2 inhibitoren startte vrij recent (1999), wanneer verschillende nucleosiden,
gemodificeerd
aan
hun
suikergedeelte,
werden
getest
voor
hun
substraat/inhibitor-eigenschappen ten opzichte van verschillende dNK‟s, waaronder dCK, TK-1 en TK-2. In 2000 werden verschillende ribofuranosylnucleosiden onderzocht voor hun TK-2 inhibitie. Ook arabinofuranosylnucleosiden werden onderzocht als TK-2 inhibitoren. (FIGUUR 1.5)
Inleiding
11 O
O
Br HN
HN O
O
O
N
HO
HN N
HO
O
N
HO
O
O
O O
OH OH
H3C(H2C)4
NH
OH
(CH2)8CH3 O
O
FIGUUR 1.5: RIBO-, 2‟-DEOXYRIBO- EN ARABINOFURANOSYLNUCLEOSIDEANALOGEN ALS TK-2 INHIBITOREN
Interessante activiteit werd ook bekomen met pyrimidine-2‟-deoxynucleosideanalogen met een tritylfunctie op de 5‟-positie van het deoxyribose. In een volgende stap werd de deoxyribose-eenheid van het nucleoside vervangen door een acyclische spacer die de thymine-base en de trityleenheid bevat aan beide uiteinden van de spacer (FIGUUR 1.6).
H N
O O
O
N
O O
H N
O
N (H2C)6
FIGUUR 1.6: ACYCLISCHE NUCLEOSIDEANALOGEN ALS TK-2 INHIBITOREN
Een recente samenwerking tussen het Laboratorium voor Medicinale Chemie en het REGA Instituut in Leuven leidde tot de ontdekking van gesubstitueerde 3‟- en 5‟thioureaderivaten van β- en α-dThd als zeer selectieve TK-2 inhibitoren3 (FIGUUR 1.7). De inhiberende activiteit van 3‟-gesubstitueerde derivaten is sterker dan die van de 5‟-derivaten. (Pérez-Pérez et al., 2008; Balzarini et al.,2009)
3
Het labo Medicinale Chemie levert sinds 1999 onderzoek naar de ontwikkeling van inhibitoren van thymidine monofosfaatkinase (TMPK) van Mycobacterium tuberculosis. Screening van de resulterende bibliotheek van TMPK-inhibitoren op verschillende TK‟s (TK-1, TK-2, Herpes Simplex virus-1 TK, Varicella zoster virus TK en Dm-dNK) bracht een 5-tal zeer potente en selectieve TK-2 inhibitoren aan het licht.
Inleiding
12 O HN O
HO
H R N
N
O H N
R
(
H N
O
S N
OH
)n NH
O
N H
O
S FIGUUR 1.7: 3‟-THIOUREADERIVATEN VAN β-THYMIDINE EN 5‟-THIOUREADERIVATEN VAN α-THYMIDINE
Geïnspireerd door de 3‟-thioureaderivaten werden recent een reeks van 4”- en 5”gesubstitueerde 3‟-deoxy-3‟-(1”,2”,3”-triazol-1”-yl)-nucleosideanalogen gesynthetiseerd en onderzocht als TK-2 inhibitoren (FIGUUR 1.8). Hieruit bleek dat de 4”-positie van de triazoolring de meest gunstige is voor derivatisatie. Combinatie van derivatisatie op de 4”positie met een 5-bromovinyl-substitutie van de base leverde de meest potente TK-2 inhibitor tot dusver gerapporteerd, die daarenboven uitermate selectief bleek versus TK-1. (Van Poecke, 2009)
O
O
HN
HN N
O HO
O
N
N
O HO
O N N N
R
Br
HN
HO O N N N
O
O R
N N N R
FIGUUR 1.8: 4”- EN 5”- GESUBSTITUEERDE 3‟-DEOXY-3‟-(1”,2”,3”-TRIAZOL-1”-YL)NUCLEOSIDEANALOGEN
Doelstellingen
13
2. DOELSTELLINGEN Screening van een aangelegde bibliotheek van thymidine-
O
analogen op verschillende TK‟s (TK-1, TK-2, Herpes simplex
HN
virus-1 TK, Varicella zoster virus TK en Dm-dNK) bracht een 5-tal zeer potente en selectieve TK-2 inhibitoren aan het licht. Modificaties van deze verbindingen leverden een nieuwe reeks TK2 inhibitoren, waaronder verbinding I (IC50= 0.15 ± 0.01µM).
O
N
HO O S
Cl F3C
N H
NH
FIGUUR 2.1: VERBINDING I
(FIGUUR 2.1) (Balzarini et al., 2009)
Startend van het homologiemodel van humaan TK-2 (hTK-2) werd de bindingswijze van inhibitor I aan het enzym in aanwezigheid van ATP gesimuleerd. Daaruit kan geconcludeerd worden dat I in de bindingsplaats gestabiliseerd wordt door verschillende interacties: (i) het thymidine gedeelte van de inhibitor bevindt zich tussen de fenyl ring van F143 aan de ene kant en de zijketens van zowel Trp86 en Val15 aan de andere kant; (ii) de O4 en N3 atomen van thymidine zijn in staat waterstofbruggen te vormen met de carboxamide groep van Gln110; (iii) de O5‟-hydroxyl wordt vastgehouden door de guanidinium-N van Arg134; (iv) de gesubstitueerde fenyl ring zit klem tussen de zijketen van Ile59 en is zodanig geöriënteerd dat de trifluoromethyl groep gericht is naar de Arg196 en dat het Cl-atoom in een hydrofobe opening terechtkomt, gevormd door de zijketens van Leu193, Ile204 en Leu209; (v) beide thioureum stikstoffen zijn in staat waterstofbruggen te vormen met de Oatomen van de γ-fosfaat groep van ATP. (FIGUUR 2.2) (Balzarini et al., 2009)
FIGUUR 2.2: GEMODELLEERDE BINDINGSWIJZE VAN I (C IN HET WIT) IN DE ACTIEVE BINDINGSPLAATS VAN HUMAAN TK-2 (PINK RIBBON). ATP WORDT VOORGESTELD MET DE C-ATOMEN IN OLIJFGROEN, Mg2+ WORDT VOORGESTELD ALS PAARSROZE SFEER. STIPPELLIJNEN STELLEN DE WATERSTOFBRUGGEN VOOR TUSSEN DE THIOUREUM-N‟S EN DE O‟S VAN HET γ-FOSFAAT VAN ATP, EN TUSSEN HET AMIDE VAN Q110 EN THYMIDINE. (Balzarini et al., 2009)
Doelstellingen
14
Geïnspireerd door de bindingswijze van I aan hTK-2, beoogt dit onderzoekswerk om een aantal analogen van I te synthetiseren waarbij de 3‟-thioureum-linker vervangen wordt door een alternatieve linker die een sterkere interactie met de γ-fosfaatgroep kan vormen. Hierbij wordt in de eerste plaats gedacht aan een guanidine groep, die bij fysiologische pH voorkomt in de geprotoneerde vorm en kan zorgen voor ionaire interactie met de γfosfaatgroep van ATP waardoor de affiniteit zou moeten toenemen.
Recent werd een reeks 4”(IVD 915)- en 5”(SVP 023)-gesubstitueerde 3‟-deoxy-3‟(1”,2”,3”-triazol-1”-yl)-β-D-thymidine derivaten gesynthetiseerd en getest als mogelijke TK-2 inhibitoren (FIGUUR 2.3). De biologische resultaten toonden aan dat een triazool een interessant alternatief vormt voor de thioureum-linker. (Van Poecke, 2009)
In een tweede luik zal nagegaan worden of de substituent op de triazoolring wel degelijk een rol speelt in de TK-2 inhiberende werking, of dat de triazoolring op zich verantwoordelijk is voor activiteit. Hiertoe zullen we 3‟-deoxy-3‟-(1”,2”,3”-triazol-1”-yl)-βD-thymidine
(18) synthetiseren (FIGUUR 2.3). Deze verbinding zal ook als referentieproduct
gebruikt worden om de positie van de triazoolsubstituent (4” of 5”) ondubbelzinnig te bepalen m.b.v.13C-NMR. O
O
HN O HO
HN N
O
HN N
HO
18
O
N
HO
O
N N N
O
O
O
N N N
N N N
SVP 023
IVD 915
FIGUUR 2.3: 3‟-DEOXY-3‟-(1”,2”,3”-TRIAZOL-1”-YL)-β-D-THYMIDINE (18), 3‟-DEOXY-3‟((4”-BENZYL)-1”,2”,3”-TRIAZOL-1”-YL)-β-D-THYMIDINE (IVD 915) EN 3‟-DEOXY-3‟-((5”BENZYL)-1”,2”,3”-TRIAZOL-1”-YL)-β-D-THYMIDINE (SVP 023) O
Verder zal 3‟-benzylamino-3‟-deoxy-β-D-thymidine (20) (FIGUUR 2.4) gesynthetiseerd worden als prototype voor een volgende reeks
verbindingen waarin de aminofunctie de thioureumlinker vervangt.
HN HO
O
N
O HN
FIGUUR 2.4: VERBINDING 20
Methoden en materialen
15
3. METHODEN EN MATERIALEN 3.1. METHODEN 3.1.1. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) (Thienpont, 2007; McMurry, 2008) 3.1.1.1. Het principe van NMR Een atoomkern bestaat uit protonen en neutronen. Zowel protonen als neutronen hebben een spin. Afhankelijk van de verhouding van het aantal protonen en neutronen in een nucleus, bezitten de meeste atoomkernen, zoals 1H- en
13
C-atomen een spin, wat inhoudt dat
zij een cirkelvormige beweging maken rond hun as. Aangezien atoomkernen daar bovenop een positieve lading dragen, wekken deze atomen een magneetveld op. In afwezigheid van een extern magneetveld (B0) zullen de ontstane magnetische momenten (µ) zich willekeurig oriënteren. Wordt echter een extern magnetisch veld aangelegd, dan kunnen de µ‟s zich oriënteren volgens 2I+1 standen ten opzichte van het uitwendige veld B0: voor 1H- en
13
C-
atomen is dit parallel of anti-parallel (FIGUUR 3.1). De energie-inhoud van de parallele oriëntatie is lager dan die van de anti-parallele oriëntatie. De parallele oriëntatie heeft dan ook de voorkeur.
FIGUUR 3.1: (a) WILLEKEURIGE ORIËNTATIE VAN NUCLEÏ IN AFWEZIGHEID VAN B0. (b) PARALELLE (ROOD) EN ANTIPARALELLE (BLAUW) ORIËNTATIE VAN NUCLEÏ T.O.V. B0. (McMurry, 2008)
Wanneer een molecule bestraald wordt met elektromagnetische straling (EMS), dan zal deze EMS enkel geabsorbeerd worden als haar energie-inhoud overeenkomt met het energieverschil tussen de parallele en anti-parallele oriëntatie. Bijgevolg zal de spin van de atomen van de molecule omklappen naar de anti-parallele oriëntatie. De exacte frequentie (ν) nodig voor resonantie is afhankelijk van de identiteit van de nucleus, maar ook van de sterkte van B0.
Methoden en materialen In de praktijk komen zelden naakte atomen voor. Een atoom is vrijwel altijd ingebouwd in een omgeving die zijn resonantie beïnvloedt. Alle kernen in een molecule zijn omgeven door e-, die zelf kleine magneetveldjes opwekken en die het opgelegde magnetische veld afzwakken. Hierdoor is het veld ter hoogte van de nucleï vrijwel steeds zwakker dan B0 (afschermingseffect). Daarom zullen -bij een constant B0- verschillende atomen in resonantie gaan bij een verschillende ν. De verschillen in resonantie zijn echter zeer klein, waardoor we met een referentiesubstantie werken: tetramethylsilaan (TMS). Bij het opnemen van een NMR-spectrum wordt het verschil in resonantiefrequentie van de TMS-nucleï en de nucleï van de te onderzoeken substantie bepaald. Dit verschil noemen we de chemische shift (δ) t.o.v. het TMS-signaal en wordt uitgedrukt in parts per million (ppm). δ is een maat voor het afschermingseffect van de nucleï.
Daarnaast ondervinden atomen invloed van nabijgelegen nucleaire spins, waardoor spinkoppeling ontstaat. Nucleï zijn kleine magneetjes die zich parallel of anti-parallel oriënteren t.o.v. B0. Het is echter zo dat de oriëntering van de ene nucleus die van naburige nucleï kan beïnvloeden. Hierdoor wordt het signaal voor een nucleus opgesplitst afhankelijk van het aantal buren. De grootte van de splitsing wordt weergegeven door de koppelingsconstante J en uitgedrukt in Hertz (Hz). 3.1.1.2. Het NMR-spectrum In een NMR-spectrum wordt de absorptieintensiteit van de nucleï uitgezet in functie van de resonantiefrequentie. Aangezien de nucleï in een molecule zich in een verschillende elektronische omgeving bevinden, zal het afschermingseffect verschillend zijn en zal de ν waarbij absorptie optreedt ook verschillend zijn. Op die manier krijgen we heel wat informatie uit het NMR-spectrum:
op basis van de resonantiefrequentie krijgen we informatie over de omgeving van de molecule waarin het atoom zich bevindt;
op basis van de oppervlakte onder een bekomen piek, krijgen we een idee over het aantal nucleï die bij die piek horen;
op basis van de opsplitsing van de piek, krijgen we een beeld van het aantal naburige nucleï;
op basis van het aantal pieken, kunnen we ons een idee vormen over het aantal verschillende soorten nucleï in de molecule.
16
Methoden en materialen 3.1.1.3. Apparatuur Er werd gebruik gemaakt van een Varian Mercury 300 spectrometer (300 MHz). 3.1.2. Massaspectroscopie (MS) (Thienpont, 2007) 3.1.2.1. Het principe van MS MS is een spectroscopische techniek, waarbij ionen gevormd worden in een ionisatieproces. Afhankelijk van het gebruikte ionisatieproces kunnen zowel positieve als negatieve ionen gevormd worden. De analyse van een staal met MS gebeurt in verschillende „stappen‟. In een eerste fase wordt het staal geïoniseerd, waardoor naast moleculaire ionen ook fragmentionen kunnen ontstaan. Vervolgens worden de verkregen ionen gescheiden volgens hun massa-over-lading-verhouding (m/z), om nadien gedetecteerd te worden.
In het Laboratorium voor Medicinale Chemie wordt gebruik gemaakt van high performance liquid chromatography (HPLC) als inlaatsysteem, elektrospray ionisatie (ESI) als ionenbron en een time-of-flight- (TOF) massafilter. Het HPLC-effluent wordt door een naald gestuurd, waarop aan het uiteinde een potentiaal aangelegd is. Het staal kan ook onmiddellijk geïnjecteerd worden door de naald. De uittredende oplossing wordt hierdoor verneveld als een fijne spray van oorspronkelijk vrij grote geladen druppels. De druppels kunnen enerzijds geladen zijn doordat de opgeloste analyten zure of basische functionele groepen bezitten die geladen kunnen zijn afhankelijk van de pH van de mobiele fase in HPLC. Anderzijds kunnen ze een lading krijgen door adductvorming, waarvoor de adductionen, zoals H+ en Na+ gevormd worden door primaire ionisatie van de solventdamp. Vervolgens wordt het solvent verdampt, waardoor de afmeting van de druppels afneemt en de ladingsconcentratie aan de oppervlakte toeneemt. Bovendien wordt de oppervlaktespanning van de druppels overwonnen door de Coulombse repulsiekrachten, waardoor de druppels exploderen tot een serie kleinere, minder geladen druppeltjes. Na dit ionisatieproces worden de ionen via een capillair naar de TOF-massafilter getransfereerd. (FIGUUR 3.2)
De TOF-massafilter gebruikt het verschil in transittijd doorheen een buis met zekere afstand om ionen met een verschillende m/z van elkaar te scheiden. Er wordt een elektrisch veld aangelegd, waardoor de ionen een zekere kinetische energie krijgen. De lichtere ionen zullen een hogere snelheid hebben dan de zwaardere ionen, waardoor ze de afstand tot aan de detector op het einde van de buis sneller zullen afleggen.
17
Methoden en materialen
FIGUUR 3.2: ELEKTROSPRAY IONISATIE (handleiding MS, 2004)
3.1.2.2. Het MS-spectrum In een MS-spectrum worden de relatieve hoeveelheden waarin elk soort ion voorkomt uitgezet. Aangezien de aard en het aantal van de gevormde moleculaire ionen en de fragmentionen zeer karakteristiek zijn voor de samenstelling en de structuur van de organische molecule, is het MS-spectrum de vingerafdruk van de organische molecule. 3.1.2.3. Apparatuur Er werd gebruik gemaakt van een Waters LCT Premier XE TM TOF massaspectrometer met een ZsprayTM source met ESI en modular LockSprayTM interface, gekoppeld aan een Waters Alliance HPLC systeem. 3.2. MATERIALEN Dunnelaagchromatografie (DLC) werd steeds uitgevoerd met Alugram ® SIL G/UV254 aluminiumplaatjes van Machery-Nagel. Anisaldehyde werd aangewend als kleurreagentia voor de visualisatie van de verbindingen.
Voor kolomchromatogafie werd steeds gebruik gemaakt van Silica Gel 60Å 0.032 - 0.063 mm of 0.063 - 0.200 mm, aangekocht bij Biosolve B.V (Nederland).
De gebruikte solventen werden geleverd door Fisher Scientific, Sigma-Aldrich en Acros Organics. De nodige reagentia werden aangekocht bij Sigma-Aldrich en Acros Organics.
18
Beschrijvend deel
19
4. BESCHRIJVEND DEEL 4.1. SYNTHESE VAN N-(3‟-DEOXY-β-D-THYMIDIN-3‟-YL)-N‟-(4”-CHLORO-3”TRIFLUOROMETHYLFENYL)-GUANIDINE ANALOGEN (11, 12 EN 13) 4.1.1. Algemeen overzicht O HN
O
HO
O
b
OH
OH
O
TrO O
a
N N
O
N
TrO
O
O
HN
HN N
O
O
O
N
TrO
c
O
OMs 3
2
1
O O HN
O
HN N
O
d
HN
O
TrO
e
O
N
O
f
TrO
O
HN
O
N3
S HN
NH2 4
CF3
5
6
O HN N
O
TrO
g
h
O HN
X
9: R=Me 10: R=iPr
N
HO O HN
N R 7: R=Bn 8: R=H
Cl
O
HN O
N
TrO
N R
HN
HN CF3 Cl
CF3
11: R=Bn 12: R=H 13: R=iPr
Cl
(a) TrCl, DMAP, droge pyridine, 65 °C, overnacht, 77%; (b) methaansulfonylchloride, droge pyridine, 0 °C, 3u; (c) DBU, acetonitril, reflux, overnacht, 93% over 2 stappen; (d) NaN3, benzoëzuur, DMF, reflux, overnacht, 75%; (e) 10% Pd/C, H2, droge MeOH, kt, 5u, 73%; (f) 4-chloro-3-(trifluoromethyl)fenylisothiocyanaat, DMF, 0 °C -> kt, 3u, 98%; (g) passend amine of 7N NH3, Et3N, HgCl2, DMF, 0 °C -> kt, 20u, 56%-57%; (h) HCOOH/Et2O (7:3), kt, 1u, 64%-71%. FIGUUR 4.1: ALGEMEEN REACTIESCHEMA VOOR DE SYNTHESE VAN N-(3‟-DEOXY-β-DTHYMIDIN-3‟-YL)-N‟-(4”-CHLORO-3”-TRIFLUOROMETHYLFENYL)-GUANIDINE ANALOGEN
Beschrijvend deel
20
Voor de synthese van een reeks N-(3‟-deoxy-β-D-thymidin-3‟-yl)-N‟-(4”-chloro-3”trifluoromethylfenyl)-guanidine analogen (11, 12 en 13) wordt gestart met de synthese van een gemeenschappelijke thioureum precursor 6, die als bouwsteen kan gebruikt worden voor de synthese van 11,
12 en 13. Thioureum-analogen zijn veelzijdig bruikbare
uitgangsproducten voor de synthese van guanidines, omdat ze -met een hoog rendementkunnen gesynthetiseerd worden vanuit vrij eenvoudig beschikbare precursoren. (Cunha et al., 2001) Het algemene reactieschema wordt gegeven in FIGUUR 4.1.
De syntheseweg voor de bereiding van 6 berust op een weg die reeds eerder gevolgd werd in het Laboratorium voor Medicinale Chemie (Van Daele, 2007). Ze begint met de selectieve bescherming van de 5‟-OH functie van het startproduct, thymidine. De alcoholfunctie op de 5‟-positie wordt gesubstitueerd (SN1) met een trifenylmethylgroep (Tr) door reactie van thymidine met tritylchloride en DMAP in pyridine.
Rechtstreekse substitutie van de 3‟-OH functie naar een azide zou zorgen voor verandering van de stereochemie (S → R). Het is echter de bedoeling de oorspronkelijke configuratie (S) te behouden. Daartoe wordt de 3‟-OH functie in een eerste stap gemesyleerd, gevolgd door de vorming van een 2,3‟-anhydrovorm (3) door behandeling met DBU. De 2,3‟anhydrovorm wordt in een volgende stap gemakkelijk geopend via nucleofiele aanval (SN2) van NaN3 waarbij het azide (4) met gewenste configuratie bekomen wordt (dubbele inversie). (Horwitz et al., 1964; Verheyden et al., 1971)
Azide 4 wordt vervolgens gereduceerd tot het overeenkomstige primair amine 5. De reductie kan o.a. uitgevoerd worden via katalytische hydrogenatie of via Staudingerreductie. Omdat de beschermende trifenylmethylfunctie mogelijk gevoelig is voor hydrogenolyse (Pd, H2) (Hanessian & Rancourt, 1977), worden beide reacties eerst op kleine schaal getest. De Staudingerreductie (Barai et al., 2007) heeft een erg laag rendement (27%), de hydrogenolyse tast de beschermfunctie niet aan en heeft een veel hoger rendement (73%). Bijgevolg wordt voor de hydrogenatie gekozen.
Koppeling van amine 5 met 4-chloro-3-(trifluoromethyl)-fenylisothiocyanaat levert precursor 6 via nucleofiele acylsubstitutie (Van Daele, 2007). Via een HgII-gekatalyseerd proces worden vervolgens het benzyl-, het niet gesubstitueerd- en het isopropylguanidine
Beschrijvend deel
21
analoog van 6 gesynthetiseerd (7, 8 en 10). De vorming van het methylguanidine analoog (9) faalde. (Cunha et al., 2001) Finale ontscherming onder zure omstandigheden levert analogen 11, 12 en 13. (Temal-Laib et al., 2002; Bessodes et al., 1986). 4.1.2. Bespreking van de reactiemechanismen 4.1.2.1. Synthese van 2,3‟-anhydro-5‟-O-trifenylmethyl-β-D-thymidine (3) 1,8-diazabicyclo[5,4,0]undec-7-een (DBU) zal het N-2 proton abstraheren met vorming van een intermediair carbanion. In een volgende stap zal het elektronenpaar van het carbanion delokaliseren, waardoor de methaansulfonylgroep uitgestoten wordt door de carbonylgroep. (FIGUUR 4.2) Het resultaat is de anhydrovorm. 2,3‟-Anhydronucleosiden zijn stabiele intermediairen voor de vorming van 3‟-gesubstitueerde nucleosiden.
N TrO
N
HN
N O
O
O
O
N
TrO
N N
O
TrO
O
O
N
O O
OMs
OMs 2
3
FIGUUR 4.2: REACTIEMECHANISME VOOR DE SYNTHESE VAN 2,3‟-ANHYDRO-5‟-OTRIFENYLMETHYL-β-D-THYMIDINE
4.1.2.2. Synthese van 3‟-amino-3‟-deoxy-5‟-O-trifenylmethyl-β-D-thymidine (5) In 1 van de testreacties, waarbij azide 4 omgezet wordt tot het overeenkomstig amine 5, gebeurt de reductie d.m.v. Staudingerreductie. Het reactiemechanisme wordt voorgesteld in FIGUUR 4.3. Het azide reageert eerst met trifenylfosfine met vorming van een iminofosforaan
of fosfine-imine, dat in evenwicht is met het overeenkomstig aza-ylide. In waterig milieu worden
vervolgens
het
overeenkomstig
amine
en
trifenylfosfine-oxide
gevormd.
(http://www.organic-chemistry.org/namedreactions/staudinger-reaction.shtm; Clayden et al., 2001)
Beschrijvend deel
22
N
R
N
Ph Ph Ph
P N
- N2
N
N
N
N
R
PPh3
N
N
N
PPh3
R
PPh3
R
N
PPh3
R
A
N O H
H
R
PPh3
H OH
R N
H
O H H
PPh3 H O
B
R N
NH2 R
O PPh3
H2O
PPh3
FIGUUR 4.3: STAUDINGER REDUCTIE A) REACTIE VAN HET AZIDE MET TRIFENYLFOSFINE MET VORMING VAN EEN IMINOFOSFORAAN B) HET OVEREENKOMSTIG AMINE WORDT GEVORMD NA TOEVOEGING VAN H2O
4.1.2.3. Synthese van analogen met HgCl2
Door gebruik te maken van HgCl2 als katalysator, neemt het elektronegatieve karakter van het S-atoom van de thioureumfunctie toe. Dit resulteert in een sterk elektronendeficiënt C-atoom, waarop het vrij elektronenpaar van het gebruikte amine zal aanvallen. Nadat een base (Et3N) het „eerste‟ proton abstraheert, vindt elektronendelokalisatie plaats, wat resulteert in de uitstoot van het [-S-Hg-Cl]-complex. Abstractie van een „tweede‟ proton resulteert in het gewenste gesubstitueerde guanidine-analoog. (FIGUUR 4.4) (Batey & Powell, 2000)
Beschrijvend deel
23 O
O HN
HN O
O
N
N
O
O
O
O HN HN
Cl
S
HN
Cl
CF3
+
HN
Hg
S
Cl
Cl
Hg CF3
R NH2
Cl
Cl
6
O
O
HN O
HN N
O
O
N
O
O
O +
Et3N
H2 R N
HN
HN S
H R N
HgCl
HN
S
HgCl
HN CF3
CF3
Cl
Cl
O
O
HN O
Et3NH
HN N
O
O
N
O O
O +
HN HN
S Hg
HN
N R H CF3 Cl
+ S Hg + Et3NH Cl
Cl HN
N R CF3
Et3N
Cl 7:R=Bn 8:R=H 9:R=Me X 10:R=iPr
FIGUUR 4.4: REACTIEMECHANISME VOOR DE SYNTHESE VAN DE ALKYLGUANIDINE ANALOGEN VANUIT HET THIOUREA-DERIVAAT
Beschrijvend deel
24
4.2. SYNTHESE VAN 5‟‟‟-(3‟-AMINO-3‟-DEOXY-β-D-THYMIDIN-3‟N-YL)-1‟‟‟-(4”CHLORO-3”-TRIFLUOROMETHYLFENYL)-1‟‟‟,2‟‟‟,3‟‟‟,4‟‟‟-TETRAZOOL (15)
HN
HN
HN O
O
O
O O
N
O
N
O
O
O
O a
b
HN
HN
S
HN
N
CF3 Cl
Cl
HN
N N
N
N
N N N
Cl CF3
6
N
HO
O
14
CF3 15
(a) NaN3, DMF, Et3N, HgCl2, 0 °C -> kt, 6u, 31%; (b) HCOOH/Et2O (7:3), kt, 1u, 45%. FIGUUR 4.5: ALGEMEEN REACTIESCHEMA VOOR DE SYNTHESE VAN 5‟‟‟-(3‟-AMINO-3‟DEOXY-β-D-THYMIDIN-3‟N-YL)-1‟‟‟-(4”-CHLORO-3”-TRIFLUOROMETHYLFENYL)1‟‟‟,2‟‟‟,3‟‟‟,4‟‟‟-TETRAZOOL
De procedure voor de synthese van tetrazool 15 uit de eerder vermelde precursor 6 werd
eerder toevallig gevonden bij het zoeken naar een alternatieve syntheseweg voor het nietgesubstitueerde guanidine analoog (eerst substitutie van de S door een azide, gevolgd door een reductie). Het algemene reactieschema wordt weergegeven in FIGUUR 4.5.
Door reactie van 6 met NaN3, Et3N en HgCl2 in droge DMF, wordt een instabiel guanyl azide intermediair gevormd. Interne cyclisatie resulteert in de vorming van 5‟‟‟-(3‟amino-3‟-deoxy-5‟-O-trifenylmethyl-β-D-thymidin-3‟N-yl)-1‟‟‟-(4”-chloro-3”trifluoromethylfenyl)-1‟‟‟,2‟‟‟,3‟‟‟,4‟‟‟-tetrazool 14. (FIGUUR 4.6) (Batey & Powell, 2000; Powell, 2001; Hadden, 2005)
Beschrijvend deel
25 O
O
O HN
HN O
HN
O
N
N
O
N
O O
O
O
O
O
HN
HN
N
HN
S
N
HN
N
N
N
N CF3
N N
Cl
Cl
Cl
CF3
CF3
6
14
FIGUUR 4.6: REACTIEMECHANISME VOOR DE SYNTHESE VAN 5‟‟‟-(3‟-AMINO-3‟DEOXY-5‟-O-TRIFENYLMETHYL-β-D-THYMIDIN-3‟N-YL)-1‟‟‟-(4”-CHLORO-3”TRIFLUOROMETHYLFENYL)-1‟‟‟,2‟‟‟,3‟‟‟,4‟‟‟-TETRAZOOL
Häbich (1992) rapporteerde reeds de synthese van 3‟-(5”-amino-1”,2”,3”,4”-tetrazol1”-yl)-3‟-deoxythymidines. Bij deze verbindingen staat de tetrazoolring rechtstreeks op de 3‟positie van het deoxythymidine. Dit in tegenstelling tot verbinding 15, waarbij de tetrazoolring via een aminofunctie gebonden is op de 3‟-positie. (FIGUUR 4.7) De connectie via een aminogroep wordt aangetoond met behulp van de 1H-NMR, waar een duidelijke koppeling optreedt tussen de 3‟-NH- en de H-3‟ (J=7.2 Hz).
O HN O HO
5' 4'
N1
N
HN O HO
5' 4'
2'
NHR
O
1'
5''' N
N
6"
1"
5"
6
2'
1'''
4"
N1
2
3'
HN
5"
N N 3"
5
6
1'
3'
4
3
5
O 1"
2" N
2
O
4
3
4'''
N 3''' N
2'''
2"
Cl
4"
3"
15
CF3
FIGUUR 4.7: 3‟-(5”-AMINO-1”,2”,3”,4”-TETRAZOL-1”-YL)-3‟-DEOXYTHYMIDINES EN 5‟‟‟-(3‟-AMINO-3‟-DEOXY-β-D-THYMIDIN-3‟N-YL)-1‟‟‟-(4”-CHLORO-3”TRIFLUOROMETHYLFENYL)-1‟‟‟,2‟‟‟,3‟‟‟,4‟‟‟-TETRAZOOL
In de literatuur wordt gedocumenteerd dat de regioselectivititeit van de uitgevoerde tetrazoolsynthese verklaard kan worden door het geconjugeerde systeem dat hierbij ontstaat tussen de fenyl- en de tetrazoolring. (Batey & Powell, 2000)
Beschrijvend deel
26
4.3. SYNTHESE VAN 3‟-DEOXY-3‟-(1”,2”,3”-TRIAZOL-1”-YL)-β-D-THYMIDINE (18) O HN
O a
HO
O N3
O
O
HN
HN N
O TrO
O
O
N
O b
HN N
HO
O c
O
N3
O
N
N
17
18
N N
N
HO
N N
Me3Si 4
16
(a) ZnBr2, CH2Cl2/iPrOH (85:15), kt, overnacht, 54%; (b) trimethylsilylacetyleen, CuSO4.5H2O, Naascorbaat, t-BuOH/H2O (1:1), 45 °C, 5 dagen; (c) TBAF, kt, overnacht, 40% over 2 stappen. FIGUUR 4.8: ALGEMEEN OVERZICHT VOOR DE SYNTHESE VAN 3‟-DEOXY-3‟-(1”,2”,3”TRIAZOL-1”-YL)-β-D-THYMIDINE
Voor de synthese van het 3‟-deoxy-3‟-(1”,2”,3”-triazol-1”-yl)-β-D-thymidine (18) wordt vertrokken vanuit verbinding 4 (FIGUUR 4.8). Detritylering van azide 4 met behulp van ZnBr2 als Lewiszuur levert 3‟-amino-3‟-deoxy-β-D-thymidine (16) op.
Introductie van de triazoolring wordt gerealiseerd via een Cu I-gekatalyseerde Huisgen 1,3-dipolaire cycloadditie, waarbij enkel het 1”,4”-digesubstitueerde 1”,2”,3”-triazool gevormd wordt. CuI, dat in situ gegenereerd wordt door reductie van CuSO4, zal een coördinatiecomplex vormen met trimethylsilylacetyleen, met uitstoting van 1 van zijn liganden. Dit resulteert in de conversie van het alkyn tot een acetylide (a). In de volgende stap bindt het azide op het Cu-atoom via de N vlakbij het C-atoom. Hierbij wordt opnieuw een ligand uitgestoten (b). Vervolgens valt de terminale N van het azide aan op het C-2-atoom van het acetylide, waardoor een ongewone zesdelige koper (III)-metallo-ring gevormd wordt (c). Na afsplitsing van de koper, wordt het gewenste triazool verkregen (d). (FIGUUR 4.9) (Rostovtsev et al., 2002)
Als laatste stap voor de synthese van 18 wordt de trimethylsilylfunctie verwijderd door behandeling met TBAF. (Wigerinck, 1991; Cosyn, 2008)
Beschrijvend deel
27 R1
CuLn-1 R1 N
R1
CuLn-2 N
N
N
d
R2
N
N N
R2
N N
R2
c R1
CuLn-2 N N
N
LnCu
R2
b
R1 R1
H
CuLn-1
a N N
N
R2
FIGUUR 4.9: REACTIEMECHANISME VOOR DE CuI-GEKATALYSEERDE HUISGEN 1,3DIPOLAIRE CYCLOADDITIE
4.4. SYNTHESE VAN 3‟-BENZYLAMINO-3‟-DEOXY-β-D-THYMIDINE (20)
O
O
HN
HN N
O
O
O
O NH2
5
HN
HN N
N
O
TrO
TrO
O
HO
TrO O
a N
b
N
O
O
c
O NH
NH
19
20
(a) benzaldehyde, droge MeOH, kt, 24u; (b) NaBH4, kt, 30 min, 16% over 2 stappen; (c) ZnBr2, CH2Cl2/iPrOH (85:15), kt, overnacht, 34%. FIGUUR 4.10: ALGEMEEN OVERZICHT VOOR DE SYNTHESE VAN 3‟-BENZYLAMINO-3‟DEOXY-β-D-THYMIDINE
De synthese van 3‟-benzylamino-3‟-deoxy-β-D-thymidine (20) verloopt in 3 stappen -vertrekkende van 5- en start met een reductieve aminering (FIGUUR 4.10). Een reductieve aminering zorgt voor de conversie van een carbonylgroep in een amine, via een intermediair imine. De carbonylgroep is meestal een keton of een aldehyde. Voor de synthese van 20 reageert amine 5 eerst met benzaldehyde (a). Na additie aan de carbonylfunctie vindt een
Beschrijvend deel
28
protontransfer plaats met vorming van een onstabiel hemiaminal (b). Protonatie van de hydroxylgroep in het hemiaminal resulteert in de afsplitsing van H2O, waarbij een stabiel carbokation gevormd wordt, een iminium-ion (c). Protonverlies levert uiteindelijk het imine op. (FIGUUR 4.11 A) (Clayden et al., 2001; De Clercq, 2004)
Het verkregen imine wordt vervolgens gereduceerd met NaBH4 via het hydride-additie principe. In een eerste fase vindt nucleofiele additie van het hydride-anion plaats. In de volgende fase levert protonatie een secundair amine (19). (FIGUUR 4.11 B) (De Clercq, 2004)
In een laatste stap wordt de beschermende tritylfunctie verwijderd door reactie met ZnBr2. Dit resulteert in de vorming van 20.
R1
NH2 H
R2
R1
a O
R1
H2 N
R2
H
O
H
H N
R2
H
OH2
N
c
R1
b
R1
H
H N
R2
H
OH
H+
R1
H+
R1 N
N
+ H2O H
R2
H
R2
H
R2
A H O R1 R2
CH3
R1
R1
N
N H
H-
H
H R2
+ MeOH
H2O
NH H H R2
+
OH-
B
FIGUUR 4.11: REACTIEMECHANISME VOOR DE REDUCTIEVE AMINERING A) REACTIE VAN EEN PRIMAIR AMINE MET EEN CARBONYLGROEP MET VORMING VAN EEN IMINE B) REDUCTIE VAN HET GEVORMDE IMINE TOT EEN SECUNDAIR AMINE
Experimenteel deel
29
5. EXPERIMENTEEL DEEL 5.1. SYNTHESE VAN N-(3‟-DEOXY-β-D-THYMIDIN-3‟-YL)-N‟-(4”-CHLORO-3”TRIFLUOROMETHYLFENYL)-GUANIDINE ANALOGEN 5.1.1. Synthese van 5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidine (1) Aan een oplossing van β-D-thymidine (3,91 g; 16 mmol) in anhydrisch pyridine (40 mL) worden achtereenvolgens DMAP (2,14 g; 18 mmol) en trifenylmethylchloride (5,27 g; 19 mmol) toegevoegd. Na 16 uur roeren bij 65 °C onder N2-atmosfeer wordt met behulp van DLC (CH2Cl2/MeOH 98:2) aangetoond dat het startmateriaal nog niet verdwenen is. Naast een spot voor het verwachte product is ook reeds een spot voor de di-getrityleerde vorm te zien dus wordt de reactie stopgezet. Aan het reactiemengsel wordt CH2Cl2 (40 mL) toegevoegd en de resulterende oplossing wordt gewassen met een verzadigde NaHCO3oplossing (3x150 mL). Na drogen over anhydrisch MgSO4 wordt de organische fase geëvaporeerd bij verlaagde druk. Coëvaporatie met tolueen is noodzakelijk om al het pyridine te verwijderen. Na chromatografische scheiding met behulp van een silicakolom (CH2Cl2/MeOH 98:2) wordt 1 bekomen als wit schuim ( 6,01 g; 12 mmol; 77%). H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.47 (3H, app s, 5-CH3); 2.11 2.30 (2H, m, H-2‟A en H-2‟B); 3.15 - 3.26 (2H, m, H-5‟A en H-5‟B); HN 5 3.89 (1H, app dd, J=4.2 Hz en J=7.5 Hz, H-4‟); 4.33 (1H, app br s, 6 O 2 N1 H-3‟); 5.33 (1H, d, J=1.5 Hz, 3‟-OH); 6.21 (1H, app t, J=6.9 Hz, O 5' H-1‟); 7.25 - 7.41 (15H, m, Tr); 7.49 (1H, d, J=1.5 Hz, H-6); 11.33 O 4' 1' (1H, s, 3-NH) 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 12.45 (5-CH3); 3' 2' 39.38 – 41.04 (C-2‟); 4.67 (C-5‟); 71.12 (C-3‟); 84.40 (C-1‟); 86.05 OH (C-4‟); 87.07 (Tr); 110.25 (C-5); 127.86 (Tr); 128.67 (Tr); 128.94 (Tr); 136.37 (C-6); 144.17 (Tr); 151.06 (C-2); 164.34 (C-4) Exacte massa (ESI-MS): berekend voor C29H28N2NaO5+: [M+Na+]=507.1890; gevonden [M+Na+]=507.1887 O
3
1
4
5.1.2. Synthese van 2,3’-anhydro-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidine (3) Aan een gekoelde oplossing (0 °C) van 1 (5,97 g; 12 mmol) in droge pyridine (41 mL) wordt druppelsgewijs methaansulfonylchloride (1,24 mL; 16 mmol) toegevoegd. Na 3u roeren bij kt onder N2-atmosfeer wordt met behulp van DLC (CH2Cl2/MeOH 96:4) aangetoond dat 1 volledig weggereageerd is. Na toevoegen van een verzadigde NaHCO3oplossing (41 mL) wordt het reactiemengsel geëxtraheerd met CH2Cl2 (3x80 mL) en gedroogd over anhydrisch MgSO4. Het bekomen crèmekleurige schuim wordt opgelost in acetonitrile (52 mL) en vervolgens wordt DBU (2.00 mL; 13 mmol) toegevoegd. Na 16 uur
Experimenteel deel
30
refluxen onder N2-atmosfeer toont DLC (CH2Cl2/MeOH 97:3) aan dat de reactie afgelopen is. Het solvent wordt verwijderd onder verminderde druk en het residu opgezuiverd met behulp van kolomchromatografie (CH2Cl2/MeOH 97:3). 3 wordt bekomen als een wit schuim (5.33 g; 11 mmol; 93%)
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.77 (3H, d, J=0.9 Hz, 5-CH3); 2.42 - 2.60 (2H, m, H-2‟A en H-2‟B); 3.08 - 3.16 (2H, m, H-5‟A en N H-5‟B); 4.40 - 4.45 (1H, m, H-4‟); 5.32 (1H, app br s, H-3‟); 5.89 (1H, O N app d, J=3.6 Hz, H-1‟); 7.21 - 7.39 (15H, m, Tr); 7.62 (1H, d, J=1.2 Hz, O H-6) 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 13.70 (5-CH3); 33.39 (C-2‟); O 63.19 (C-5‟); 77.73 (C-3‟); 84.12 (C-1‟); 87.03 (C-4‟); 87.50 (Tr); 116.81 (C-5); 127.74 (Tr); 128.59 (Tr); 128.86 (Tr); 137.36 (C-6); 143.95 (Tr); 153.95 (C-2); 171.40 (C-4) Exacte massa (ESI-MS): berekend voor C29H27N2O4+: [M+H+]=467.1965; gevonden [M+H+]=467.1966 O
1
5.1.3. Synthese van 3’-azido-3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidine (4) Verbinding 3 (5.33 g; 11 mmol), NaN3 (3.74 g; 57 mmol) en benzoëzuur (1.39 g; 11 mmol) worden opgelost in DMF (69 mL). Na een nacht refluxen bij 150 °C onder N 2atmosfeer toont DLC (CH2Cl2/MeOH 98:2) aan dat de reactie afgelopen is en wordt het solvent verwijderd door evaporatie onder verminderde druk. Het residu wordt opgelost in CH2Cl2 en pekel wordt toegevoegd. De waterige fase wordt 3 keer geëxtraheerd met CH2Cl2. De organische fase wordt gedroogd over anhydrisch MgSO4, gefiltreerd en geëvaporeerd. Chromatografische scheiding op een silicakolom (CH2Cl2/MeOH 98:2) levert 4 op als lichtgeel schuim (4.35 g; 8.5 mmol; 75%). H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.56 (3H, d, J=0.9 Hz, 5-CH3); 2.31 – 2.40 (1H, m, H-2‟A); 2.46 – 2.55 (1H, m, H-2‟B); 3.25 (2H, d, HN J=3.6 Hz, H-5‟A en H-5‟B); 3.85 – 3.90 (1H, m, H-4‟); 4.55 – 4.62 (1H, O N m, H-3‟); 6.13 (1H, dd, J=5.7 Hz en J=7.2 Hz, H-1‟); 7.23 – 7.42 (15H, O m, Tr); 7.52 (1H, d, J=1.2 Hz, H-6); 11.36 (1H, s, 3-NH) 13C NMR O (75 MHz, DMSO-d6): δ 12.57 (5-CH3); 36.66 (C-2‟); 60.41 (C-3‟); N3 63.82 (C-5‟); 82.63 (C-1‟); 83.99 (C-4‟); 87.19 (Tr); 110.42 (C-5); 127.91 (Tr); 128.70 (Tr); 128.94 (Tr); 136.56 (C-6); 144.06 (Tr); 151.05 (C-2); 164.35 (C-4) Exacte massa (ESI-MS): berekend voor C29H27N5NaO4+: [M+Na+]=532.1955; gevonden [M+Na+]=532.1958 O
1
Experimenteel deel
31
5.1.4. Synthese van 3’-amino-3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidine (5) Testreactie 1: Staudingerreductie Aan een oplossing van 4 (20 mg; 0.040 mmol), THF (90 µL) en water (2 µL) wordt, bij 40-50 °C, gedurende 3 uur druppelsgewijs een oplossing van Ph3P (11 mg; 0.043 mmol) in THF (32 µL) toegevoegd. Na 19.5 uur toont DLC (CH2Cl2/MeOH 90:10) aan dat de reactie afgelopen is. 10 mL pekel wordt toegevoegd en de waterige fase wordt vervolgens geëxtraheerd met CH2Cl2 (3x10 mL). De organische fase wordt gedroogd over anhydrisch MgSO4, gefiltreerd en geëvaporeerd. Na chromatografische scheiding (CH2Cl2/MeOH 98:2 → 90:10) wordt 5 bekomen als witte vaste stof (6 mg; 0.011 mmol; 27%).
Testreactie 2: katalytische hydrogenatie Een oplossing van 4 (113 mg; 0.22 mmol) in droge methanol (5.6 mL) wordt katalytisch gehydrogeneerd onder atmosferische druk met 10% Pd/C (9 mg) als katalysator. Na 5 uur wordt met DLC (CH2Cl2/MeOH 95:5) aangetoond dat de reactie afgelopen is en wordt de katalysator verwijderd door filtratie over een celietfilter. Het filtraat wordt geëvaporeerd en het residu wordt opgezuiverd met behulp van kolomchromatografie (CH2Cl2/MeOH 98:2 → 90:10). 5 wordt bekomen als witte vaste stof (79 mg; 0.16 mmol; 73%).
Grote schaal: 2.36 g 5 wordt via katalytische hydrogenatie bekomen uit 3.81 g 4 (65%) (procedure analoog aan testreactie 2). H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.49 (3H, app s, 5-CH3); 1.90 – 2.08 (1H, m, H-2‟A); 2.17 – 2.52 (1H, m, H-2‟B); 3.22 – 3.27 (2H, HN m, H-5‟A en H-5‟B); 3.47 – 3.53 (1H, app dd, J=6.6 Hz en O N J=13.5 Hz, H-3‟); 3.67 – 3.70 (1H, m, H-4‟); 6.14 (1H, dd, J=5.4 Hz O en J=6.8 Hz, H-1‟); 7.25 – 7.42 (15H, m, Tr); 7.49 (1H, d, J=0.9 Hz, O H-6) 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 12.56 (5-CH3); 41.34 (C-2‟); 52.23 (C-3‟); 64.55 (C-5‟); 84.28 (C-1‟); 86.21 (C-4‟); 86.92 NH2 (Tr); 109.97 (C-5); 127.81 (Tr); 128.64 (Tr); 128.97 (Tr); 136.51 (C-6); 144.30 (Tr); 151.05 (C-2); 164.42 (C-4) Exacte massa (ESI-MS): berekend voor C29H29N3NaO4+: [M+Na+]=506.2050; gevonden [M+Na+]=506.2057 O
1
Experimenteel deel
32
5.1.5. Synthese van N-(3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”-chloro3”-trifluoromethylfenyl)-thiourea (6) Aan een suspensie van 5 (2.36 g; 4.9 mmol) in DMF (44 mL) wordt een oplossing van 4-chloro-3-(trifluoromethyl)-fenylisothiocyanaat (1.0 mL; 6.4 mmol) in DMF (58 mL) toegevoegd bij 0 °C en onder N2-atmosfeer. De bekomen heldere oplossing wordt gedurende 3 uur geroerd bij kt. Met DLC (CH2Cl2/MeOH 95:5) wordt aangetoond dat de reactie afgelopen is. Het reactiemengsel wordt geëvaporeerd en het residu wordt opgezuiverd met behulp van kolomchromatografie (CH2Cl2/MeOH 97:3). 6 wordt bekomen als wit schuim (3.44 g; 4.8 mmol; 98%). H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.46 (3H, d, J=0.9 Hz, 5-CH3); 2.26 – 2.34 (1H, m, H-2‟A); 2.48 – 2.58 (1H, m, H-2‟B); 3.18 (2H, HN 5 d, J=4.8 Hz, H-5‟A en H-5‟B); 4.07 – 4.12 (1H, m, H-4‟); 5.21 (1H, 6 O 2 N1 app br s, H-3‟); 6.28 (1H, app t, J=6.6 Hz, H-1‟); 7.24 – 7.44 (15H, O 5' m, Tr); 7.60 – 7.71 (3H, m, arom H gesubst.Ph); 8.03 (1H, m, H-6); O 4' 8.62 (1H, d, J=6.3 Hz, 3‟-NH); 9.84 (1H, s, N‟H); 11.37 (1H, s, 1' 2' 3-NH) 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 12.45 (5-CH3); 37.52 3' HN (C-2‟); 49.28 (C-3‟); 64.69 (C-5‟); 83.67 (C-1‟); 84.31 (C-4‟); S 87.20 (Tr); 110.36 (C-5); 121.57 (CF3); 125.19 (C van gesubst.Ph); HN 2" 3" 1" CF3 126.78 - 128.99 (Tr en C van gesubst.Ph); 132.37 (C van 6" 4" gesubst.Ph); 136.24 (C van gesubst.Ph); 139.71 (C-6); 144.13 (Tr); 5" Cl 151.06 (C-2); 164.35 (C-4); 181.32 (C=S) Exacte massa (ESIMS): berekend voor C37H32ClF3N4NaO4S+: [M+Na+]=743.1677; gevonden [M+Na+]=743.1675 O
3
1
4
5.1.6. Synthese van N-(3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”-chloro3”-trifluoromethylfenyl)-benzylguanidine (7)
Aan een oplossing van 6 (87 mg; 0.12 mmol) in droge DMF (0.6 mL) worden benzylamine (13 µL; 0.12 mmol), Et3N (34 µL; 0.24 mmol) en HgCl2 (33 mg; 0.12 mmol) toegevoegd bij 0 °C en onder N2-atmosfeer. Het reactiemengsel kleurt na een tiental minuten zwart en wordt geroerd bij kt gedurende 17 uur. Nadat met DLC (CH2Cl2/MeOH 95:5) aangetoond wordt dat de reactie afgelopen is, wordt EtOAc (1.2 mL) toegevoegd. Het reactiemengsel wordt afgefiltreerd over een celietfilter en de filter wordt gewassen met CH2Cl2. Het heldere filtraat wordt 3 keer geëxtraheerd met pekel. De organische fase wordt gedroogd over anhydrisch MgSO4, gefiltreerd en geëvaporeerd. Het residu wordt opgezuiverd
Experimenteel deel
33
met behulp van kolomchromatografie (CH2Cl2/MeOH 95:5). 7 wordt bekomen als witte vaste stof (54 mg; 0.068 mmol; 56%). H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.43 (3H, d, J=0.9 Hz, 5-CH3); 2.20 – 2.28 (1H, m, H-2‟A); 2.31 – 2.41 (1H, m, H-2‟B); 3.23 - 3.32 HN (2H, m, H-5‟A en H-5’B); 3.92 – 3.95 (1H, m, H-4‟); 4.26 (2H, d, O N J=5.7 Hz, CH2 op Bn); 4.60 – 4.63 (1H, m, H-3‟); 6.13 - 6.26 (3H, O m, H-1‟ en 2 arom H op Bn); 6.73 (1H, d, J=8.4 Hz, O 3‟-NH); 6.91 (1H, s, N‟H); 7.19 – 7.41 (21H, m, 15 H van Tr, 3H van Bn en 3 arom H gesubst.Ph); 7.54 (1H, d, J=0.9 Hz, H-6) HN 13 N C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 12.50 (5-CH3); 38.01 (C-2‟); HN 45.17 (CH2 op Bn); 55.60 (C-3‟); 64.11 (C-5‟); 84.15 (C-1‟); 86.95 CF3 (C-4‟ en Tr); 110.00 (C-5); 120.50 (CF3); 121.96 (C van Cl gesubst.Ph); 122.02 (C van gesubst.Ph); 122.34 (C van gesubst.Ph); 125.67 (C van Bn); 127.12 (C van gesubst.Ph); 127.32 (C van gesubst.Ph); 127.71 (C van Bn); 127.75 (C van Bn); 128.58 (Tr); 128.80 (C van Bn); 128.95 (C van Bn); 132.31 (C van Bn); 136.43 (C-6); 140.72 (C van gesubst.Ph); 144.25 (Tr); 151.02 (C-2); 153.74 (C=N); 164.40 (C-4) Exacte massa (ESI-MS): berekend voor C44H40ClF3N5O4+: [M+H+]=794.2715; gevonden [M+H+]=794.2727 O
1
5.1.7. Synthese van N-(3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”-chloro3”-trifluoromethylfenyl)-guanidine (8)
Aan 6 (232 mg; 0.32 mmol) en HgCl2 (872 mg; 3.2 mmol) wordt 7N NH3 (10 mL) toegevoegd onder N2-atmosfeer. Na 4u wordt met DLC (CH2Cl2/MeOH 90:10) aangetoond dat de reactie afgelopen is. Het reactiemengsel wordt afgefiltreerd over een celietfilter, die gewassen wordt met MeOH. Aan het filtraat worden pekel, 0.1 M HCl en EtOAc toegevoegd. De waterige fase wordt nog 2 keer geëxtraheerd met EtOAc. De organische fase wordt gedroogd over anhydrisch MgSO4, afgefiltreerd en geëvaporeerd. 8 (128 mg; 0.18 mmol; 57%) wordt verkregen als witte vaste stof na chromatografische scheiding (CH2Cl2/MeOH 90:10).
Experimenteel deel
34
HN O
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.50 (3H, app s, 5-CH3); 2.29 2.34 (1H, m, H-2‟A); 2.49 – 2.52 (1H, m, H-2‟B); 3.26 – 3.39 (2H, m, H-5‟A en H-5‟B); 4.00 – 4.02 (1H, m, H-4‟); 4.64 – 4.66 (1H, m, H-3‟); 6.21 (1H, app t, J=5.7 Hz, H-1‟); 7.23 - 7.61 (19H, m, 15 H van Tr, 3 arom H gesubst.Ph en 1 H-6); 11.34 (1H, s, 3-NH) 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 12.55 (5-CH3); 37.91 (C-2‟); 51.57 (C-3‟); 63.61 (C-5‟); 83.33 (C-1‟); 84.02 (C-4‟); 87.06 (Tr); 110.17 (C-5); 121.64 (CF3); 123.06 – 132.88 (C van gesubst.Ph en Tr); 136.46 (C-6); 144.11 (Tr); 151.06 (C-2); 153.85 (C=N); 164.39 (C-4) Exacte massa (ESI-MS): berekend voor C37H34ClF3N5O4+: [M+H+]=704.2246; gevonden [M+H+]=704.2241 1
O
N
O O HN NH HN CF3 Cl
5.1.8. Synthese van N-(3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”-chloro3”-trifluoromethylfenyl)-methylguanidine (9) Via een analoge procedure als beschreven voor 7 wordt geprobeerd om 9 te synthetiseren, maar bij analyse van het reactiemengsel m.b.v. MS kon het gewenste product niet teruggevonden worden.
5.1.9. Synthese van N-(3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”-chloro3”-trifluoromethylfenyl)-isopropylguanidine (10)
Guanidine 10 (135 mg; 0.18 mmol; 57%) wordt gesynthetiseerd als witte vaste stof volgens een procedure analoog aan de procedure beschreven voor 7. H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 0.97 – 1.06 (6H, m, CH3 van iPr); 1.42 HN (3H, app s, 5-CH3); 2.26 – 2.35 (2H, m, H-2‟A en H-2‟B); 3.24 – 3.35 (2H, m, H-5‟A en H-5‟B); 3.63 – 3.70 (1H, app sex, J=6.9 Hz, CH van iPr); O N O 3.96 (1H, m, H-4‟); 4.64 (1H, app d, J=5.4 Hz, H-3‟); 5.29 (1H, d, O J=5.4 Hz, 3‟-NH); 6.08 (1H, br s, N'H); 6.20 (1H, app t, J=6.3 Hz, H-1‟); 6.76 (1H, d, J=8.7 Hz, arom H gesubst.Ph); 6.94 (1H, s, arom H HN N gesubst.Ph); 7.21 – 7.42 (16H, m, 15 H van Tr en 1 arom H gesubst.Ph); HN 7.56 (1H, d, J=1.2 Hz, H-6); 11.32 (1H, s, 3-NH) 13C NMR (75 MHz, CF3 DMSO-d6): δ 12.43 (5-CH3); 23.34 (CH3 van iPr); 23.43 (CH3 van iPr); Cl 37.89 (C-2‟); 43.42 (CH van iPr); 51.17 (C-3‟); 64.20 (C-5‟); 84.17 (C-1‟); 84.44 (C-4‟); 86.96 (Tr); 110.03 (C-5); 120.04 (CF3); 121.99 (C van gesubst.Ph); 125.61 (C van gesubst.Ph); 128.76 (C van gesubst.Ph); 128.57 (Tr); 128.96 (C van gesubst.Ph); 132.32 (C van gesubst.Ph); 136.41 (C-6); 140.83 (C van gesubst.Ph); 144.23 (Tr); 151.02 (C-2); 152.01 (C=N); 164.37 (C-4) Exacte massa (ESI-MS): berekend voor C40H40ClF3N5O4+: [M+H+]=746.2715; gevonden [M+H+]=746.2717 O
1
Experimenteel deel
35
5.1.10. Synthese van N-(3’-deoxy-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”-chloro-3”trifluoromethylfenyl)-benzylguanidine (11)
7 (33 mg; 0.041 mmol) wordt opgelost in mierenzuur/diëthylether 7:3 (1.00 mL). Het fluo-gele reactiemengsel wordt gedurende 45 min geroerd bij kt. Nadat DLC (CH2Cl2/MeOH 90:10) aantoont dat de reactie afgelopen is, worden een overmaat EtOAc en water toegevoegd. Vervolgens wordt het reactiemengsel geëxtraheerd met NaHCO3. De waterige fase wordt nadien 3 keer geëxtraheerd met EtOAc. De verkregen organische fase wordt gedroogd over anhydrisch MgSO4 en geëvaporeerd. 11 (15 mg; 0.028 mmol; 68%) wordt, na chromatografische scheiding (CH2Cl2/MeOH 90:10), bekomen als geel-bruine olie-achtige stof. Uitzouting m.b.v. een 4N HCl-oplossing in 1,4-dioxaan geeft 15.1 mg beige poeder (0.026 mmol; 92%). H NMR (300 MHz, DMSO-d6) (base-vorm): δ 1.76 (3H, d, J=0.6 Hz, 5-CH3); 2.23 (2H, app t, J=6.9 Hz, H-2‟A en H-2‟B); 3.54 (1H, dd, J=4.2 Hz HN en J=12.3 Hz, H-5‟A); 3.65 (1H, dd, J=3.3 Hz en J=11.7 Hz, H-5‟B); 3.77 – O N 3.81 (1H, m, H-4‟); 4.27 – 4.32 (3H, m, H-3‟ en CH2 op Bn); 6.14 (1H, app t, HO O J=6.3 Hz, H-1‟); 6.35 (1H, br s, 5‟-OH); 6.93 (1H, app dd, J=2.4 Hz en J=8.7 Hz, arom H gesubst.Ph); 7.02 – 7.03 (1H, m, arom H gesubst.Ph); HN 7.20 – 7.35 (5H, m, Bn); 7.41 (1H, d, J=8.7 Hz, arom H gesubst.Ph); 7.73 (1H, N .HCl HN d, J=1.2 Hz, H-6) 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) (base-vorm): δ 12.95 CF3 (5-CH3); 38.00 (C-2‟); 45.26 (CH2 op Bn); 51.68 (C-3‟); 61.66 (C-5‟); 84.00 (C-1‟); 85.85 (C-4‟); 109.86 (C-5); 120.74 (CF3); 121.96 (C van gesubst.Ph); Cl 122.20 (C van gesubst.Ph); 122.27 (C van gesubst.Ph); 125.58 (C van Bn); 127.24 (C van gesubst.Ph); 127.38 (C van gesubst.Ph); 127.64 (C van Bn); 127.80 (C van Bn); 128.53 (C van Bn); 128.85 (C van Bn); 132.50 (C van Bn); 136.85 (C-6); 140.69 (C van gesubst.Ph); 151.02 (C-2); 152.85 (C=N); 164.45 (C-4) Exacte massa (ESI-MS): berekend voor C25H26ClF3N5O4+: [M+H+]=552.1620; gevonden [M+H+]=552.1620 O
1
5.1.11. Synthese van N-(3’-deoxy-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”-chloro-3”trifluoromethylfenyl)-guanidine (12)
12 (50 mg; 0.11 mmol; 71%) wordt gesynthetiseerd volgens een procedure, analoog beschreven voor 11. Het resultaat is een beige olie. Uitzouting levert een beige vaste stof (4.0 mg; 0.0080 mmol; 7%).
Experimenteel deel H NMR (300 MHz, DMSO-d6) (base-vorm): δ 1.78 (3H, d, J=0.9 Hz, 5-CH3); 2.16 – 2.36 (2H, m, H-2‟A en H-2‟B); 3.59 – 3.72 (2H, m, H-5‟A en H-5‟B); 3.81 – 3.84 (1H, m, H-4‟); 4.29 (1H, app dd, J=6.0 Hz en J=12.9 Hz, H-3‟); 5.76 O N (1H, br s, 5‟-OH); 6.16 (1H, app t, J=6.3 Hz, H-1‟); 7.12 (1H, d, J=7.5 Hz, arom HO O H gesubst.Ph); 7.25 (1H, s, arom H gesubst.Ph); 7.50 (1H, d, J=8.4 Hz, arom H gesubst.Ph); 7.75 (1H, d, J=1.2 Hz, H-6) 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) (baseHN NH vorm): δ 12.97 (5-CH3); 38.01 (C-2‟); 51.62 (C-3‟); 61.85 (C-5‟); 84.02 (C-1‟); .HCl HN 86.05 (C-4‟); 109.95 (C-5); 122.77 (CF3); 127.33 – 128.94 (5 C van gesubst.Ph); CF3 132.66 (C van gesubst.Ph); 136.76 (C-6); 148.08 (C-2); 151.10 (C=N); 164.45 Cl (C-4) Exacte massa (ESI-MS): berekend voor C18H20ClF3N5O4+: [M+H+]=462.1150; gevonden [M+H+]=462.1132 O
1
HN
5.1.12. Synthese van N-(3’-deoxy-β-D-thymidin-3’-yl)-N’-(4”-chloro-3”trifluoromethylfenyl)-isopropylguanidine (13)
13 (54 mg; 0.11 mmol; 64%) wordt gesynthetiseerd op analoge wijze als 11. Het resultaat is een opaque vaste stof. Na uitzouting wordt een wit poeder (21.0 mg; 0.039 mmol; 36%) bekomen. H NMR (300 MHz, DMSO-d6) (base-vorm): δ 1.07 – 1.09 (6H, m, CH3 van iPr); 1.77 (3H, d, J=1.2 Hz, 5-CH3); 2.28 (2H, app t, J=7.2 Hz, H-2‟A en H-2‟B); HN 3.56 – 3.84 (4H, m, H-4‟, H-5‟A, H-5‟B en CH van iPr); 4.32 (1H, app dd, O N J=6.6 Hz en J=12.3 Hz, H-3‟); 5.90 (1H, br s, 5‟-OH); 6.18 (1H, app t, J=6.6 Hz, HO O H-1‟); 7.06 (1H, dd, J=2.4 Hz en J=8.7 Hz, arom H gesubst.Ph); 7.19 (1H, d, .HCl J=2.1 Hz, arom H gesubst.Ph); 7.47 (1H, d, J=8.7 Hz, arom H gesubst.Ph); 7.71 HN N (1H, d, J=1.2 Hz, H-6) 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) (base-vorm): δ 12.93 HN (5-CH3); 23.27 (CH3 van iPr); 37.64 (C-2‟); 43.91 (CH van iPr); 52.32 (C-3‟); CF3 61.82 (C-5‟); 83.98 (C-1‟); 85.76 (C-4‟); 110.04 (C-5); 121.54 (CF3); 121.89 (C Cl van gesubst.Ph); 125.51 (C van gesubst.Ph); 127.32 (C van gesubst.Ph); 127.73 (C van gesubst.Ph); 128.25 (C van gesubst.Ph); 132.66 (C van gesubst.Ph); 136.81 (C-6); 151.10 (C-2); 152.78 (C=N); 164.42 (C-4) Exacte massa (ESI-MS): berekend voor C21H26ClF3N5O4+: [M+H+]=504.1620; gevonden [M+H+]=504.1644 O
1
5.2. SYNTHESE VAN 5‟‟‟-(3‟-AMINO-3‟-DEOXY-β-D-THYMIDIN-3‟N-YL)-1‟‟‟-(4”CHLORO-3”-TRIFLUOROMETHYLFENYL)-TETRAZOOL 5.2.1. Synthese van 5’’’-(3’-amino-3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidin-3’N-yl)1’’’-(4”-chloro-3”-trifluoromethylfenyl)-tetrazool (14)
Aan 6 (189 mg; 0.26 mmol), NaN3 (51 mg; 0.79 mmol) en HgCl2 (78 mg; 0.29 mmol) worden droge DMF (1.0 mL) en Et3N (105 µL; 0.76 mmol) toegevoegd. De verkregen suspensie wordt gedurende 6.5 uur geroerd onder N2-atmosfeer en bij kt. De suspensie wordt
36
Experimenteel deel
37
afgefiltreerd over een celietfilter die gewassen wordt met CH2Cl2. Aan het filtraat wordt pekel toegevoegd en de waterige fase wordt nadien 3 keer gewassen met CH2Cl2. De organische fase wordt gedroogd over anhydrisch MgSO4, gefiltreerd en geëvaporeerd bij verlaagde druk. Na chromatografische scheiding op een silicakolom (EtOAc/hexaan 95:5) wordt 14 bekomen als crèmekleurige vaste stof (58 mg; 0.081mmol; 31 %).
O HN O
N
O O HN 5''' 4''' N N 3''' N N 1''' 2''' Cl CF3 +
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.51 (3H, app s, 5-CH3); 2.33 – 2.42 (1H, m, H-2‟A); 2.46 – 2.53 (1H, m, H-2‟B); 3.27 – 3.33 (1H, m, H5‟A); 3.41 – 3.46 (1H, m, H-5‟B); 4.09 – 4.13 (1H, m, H-4‟); 4.55 – 4.60 (1H, m, H-3‟); 6.31 (1H, app t, J=6.6 Hz, H-1‟); 7.23 – 7.42 (15H, m, Tr); 7.50 (1H, d, J=7.2 Hz, 3‟-NH); 7.60 (1H, d, J=1.2 Hz; H-6); 7.90 – 8.05 (3H, m, arom H gesubst.Ph); 11.36 (1H, s, 3-NH) 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 12.51 (5-CH3); 37.37 (C-2‟); 55.15 (C-3‟); 64.78 (C-5‟); 83.29 (C-1‟); 84.39 (C-4‟); 87.13 (Tr); 110.42 (C-5); 121.05 (CF3); 124.68 – 133.90 (C van gesubst.Ph en Tr); 136.52 (C-6); 144.18 (Tr); 151.08 (C-2); 155.23 (C=N); 164.35 (C-4) Exacte massa (ESIMS): berekend voor C37H31ClF3N7NaO4+: [M+Na+]=752.1970; gevonden 1
+
[M Na ]=752.2006
5.2.2. Synthese van 5’’’-(3’-amino-3’-deoxy-β-D-thymidin-3’N-yl)-1’’’-(4”-chloro-3”trifluoromethylfenyl)-tetrazool (15)
Voor de synthese van 15 (kleurloze olie, 10.0 mg; 0.021 mmol; 45%) wordt een analoge procedure gevolgd als beschreven voor 11.
O HN O
N
HO O HN
N N
Cl CF3
N N
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.80 (3H, app s, 5-CH3); 2.29 – 2.34 (2H, m, H-2‟A en H-2‟B); 3.65 – 3.73 (2H, m, H-5‟A en H-5‟B); 3.97 – 4.01 (1H, m, H-4‟); 4.35 – 4.41 (1H, m, H-3‟); 5.19 (1H, br s, 5‟-OH); 6.25 (1H, app t, J=6.9 Hz, H-1‟); 7.81 (1H, d, J=0.9 Hz, H-6); 7.96 – 8.03 (2H, m, arom H gesubst.Ph); 8.17 (1H, s, arom H gesubst.Ph) 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 12.98 (5-CH3); 37.74 (C-2‟); 55.60 (C-3‟); 62.20 (C-5‟); 84.32 (C-1‟); 85.35 (C-4‟); 110.14 (C-5); 121.37 (CF3); 128.30 (C van gesubst.Ph); 128.73 (C van gesubst.Ph); 131.41 (C van gesubst.Ph); 133.17 (C van gesubst.Ph); 133.83 (C van gesubst.Ph(2)); 136.87 (C-6); 151.17 (C-2); 155.53 (C=N); 164.48 (C-4) Exacte massa (ESI-MS): berekend voor C18H18ClF3N7O4+: [M+H+]=488.1055; gevonden [M+H+]=488.1038 1
Experimenteel deel
38
5.3. SYNTHESE VAN 3‟-DEOXY-3‟-(1”,2”,3”-TRIAZOL-1”-YL)-β-D-THYMIDINE 5.3.1. Synthese van 3’-azido-3’-deoxy-β-D-thymidine (16) Een kleurloze oplossing van ZnBr2 (1.78 g; 7.9 mmol) in CH2Cl2/iPrOH (8.0 mL, 85:15) wordt toegevoegd aan 4 (251 mg; 0.49 mmol). De verkregen knalgele oplossing wordt overnacht geroerd bij kt. Nadat DLC (CH2Cl2/MeOH 96:4) aangetoond heeft dat de reactie afgelopen is, wordt de reactie stopgezet door toevoeging van water. Het residu wordt gewassen met pekel en de waterige fase wordt geëxtraheerd met CH2Cl2. De organische fase wordt gedroogd over MgSO4 en geëvaporeerd onder verlaagde druk. Scheiding met behulp van kolomchromatografie (CH2Cl2/MeOH 96:4) levert 16 (71 mg; 0.27 mmol; 54%) op als lichtgele olie. H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.75 – 1.78 (3H, m, 5-CH3); 2.22 - 2.31 (1H, m, H-2‟A); 2.33 – 2.43 (1H, m, H-2‟B); 3.55 – 3.68 (2H, m, H-5‟A en H-5‟B); HN 3.81 (1H, app dd, J=3.6 Hz en J=8.7 Hz, H-4‟); 4.37 – 4.43 (1H, m, H-3‟); 5.21 O N (1H; t, J=5.1 Hz, 5‟-OH); 6.09 (1H, app t, J=6.6 Hz, H-1‟); 7.68 (1H, d, J=1.2 Hz, HO H-6); 11.29 (1H, s, 3-NH) 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 12.85 (5-CH3); O 36.51 (C-2‟); 55.48 (C-3‟); 60.84 (C-5‟); 84.09 (C-1‟); 84.61 (C-4‟); 110.26 N3 (C-5); 136.79 (C-6); 163.17 (C-2); 172.80 (C-4) Exacte massa (ESI-MS): berekend voor C10H14N5O4+: [M+H+]=268.1040; gevonden [M+H+]=268.1043 O
1
5.3.2. Synthese van 3’-deoxy-3’-(1”,2”,3”-triazol-1”-yl)-β-D-thymidine (18)
Aan een oplossing van trimethylsilylacetyleen (85 µL; 0.59 mmol) in t-BuOH/H2O 1:1 (3.0 mL) worden Na-ascorbaat (18 mg; 0.089 mmol) en CuSO4.5H2O (11 mg; 0.044 mmol) toegevoegd. Na 15 minuten roeren bij kt wordt de oplossing toevoegd aan 16 (80 mg; 0.30 mmol). Het bekomen oranje-rode reactiemengsel wordt 96 uur geroerd bij kt. Omdat de reactie
nog
steeds
niet
afgelopen
blijkt,
wordt
een
additionele
hoeveelheid
trimethylsilylacetyleen (1.5 mL; 11 mmol) toegevoegd en laten we de reactie doorgaan bij 45 °C. Na 24 uur wordt het reactiemengsel geëxtraheerd met EtOAc. De gecombineerde organische fase wordt 3 x gewassen met pekel, gedroogd met anhydrisch NaSO4 en geëvaporeerd. Zonder verdere opzuivering wordt aan het residu 1.0 M TBAF in THF (1.2 mL) toegevoegd. De geel-bruine oplossing wordt overnacht geroerd bij kt, onder N2atmosfeer. Nadat met DLC (EtOAc/MeOH 95:5) aangetoond wordt dat alle startmateriaal verdwenen is, wordt het reactiemengsel geëvaporeerd onder verlaagde druk. Het residu wordt
Experimenteel deel
39
opgezuiverd met behulp van kolomchromatografie (EtOAc/MeOH 100:0 → 95:5). 18 (35 mg; 0.12 mmol; 40%) wordt bekomen als wit poeder.
O
H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.79 (3H, d, J=0.9 Hz, 5-CH3); 2.63 - 2.72 (2H, m, H-2‟A en H-2‟B); 3.58 – 3.71 (2H, m, H-5‟A en H-5‟B); 4.17 – 4.21 (1H, m, H-4‟); 5.26 (1H, m, 5‟-OH); 5.37 – 5.39 (1H, m, H-3‟); 6.41 (1H, app t, J=6.3 Hz, H-1‟); 7.78 (1H, d, J=0.9 Hz, H-4”); 7.81 (1H, d, J=1.2 Hz, H-6); 8.30 (1H, d, J=0.9 Hz, H-5”); 11.33 (1H, s, 3-NH) 13C NMR (75 MHz, DMSOd6): δ 12.27 (5-CH3); 37.22 (C-2‟); 58.97 (C-3‟); 60.72 (C-5‟); 83.89 (C-1‟); 84.52 (C-4‟); 109.63 (C-5); 124.49 (C-5”); 133.57 (C-4”); 136.26 (C-6); 150.45 (C2); 163.74 (C-4) Exacte massa (ESI-MS): berekend voor C12H16N5O4+: [M+H+]=294.1197; gevonden [M+H+]=294.1222 1
HN O
N
HO O 1" 5"
4"
N
2"
N N 3"
5.4. SYNTHESE VAN 3‟-BENZYLAMINO-3‟-DEOXY-Β-D-THYMIDINE 5.4.1. Synthese van 3’-benzylamino-3’-deoxy-5’-O-trifenylmethyl-β-D-thymidine (19)
Aan een suspensie van 5 (88 mg; 0.18 mmol) in droge MeOH (0.7 mL) wordt benzaldehyde (17 µL; 0.17 mmol) toegevoegd. De oplossing wordt geroerd bij kt, onder N2atmosfeer. Na 24 uur wordt het gevormde imine behandeld met NaBH4 (10 mg; 0.27 mmol). Na 30 min roeren toont DLC (CH2Cl2/MeOH 95:5) aan dat de reactie afgelopen is en wordt 1 M NaOH (1,00 mL) toegevoegd. Het reactiemengsel wordt geëxtraheerd met CH2Cl2 en pekel. De organische fase wordt gewassen met pekel, gedroogd met anhydrisch MgSO4 en geëvaporeerd onder verlaagde druk. Opzuivering met kolomchromatografie (CH2Cl2/MeOH 96:4) levert 19 (17 mg; 0.029 mmol; 16%) als kleurloze vaste stof.
O HN O O O
HN
[M+H+]=574.2770
N
H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.41 (3H, d, J=1.2 Hz, 5-CH3); 2.23 (2H, app t, J=6.3 Hz, H-2‟A en H-2‟B); 3.27 - 3.41 (2H, m, H-5‟A en H-5‟B); 3.52 (1H, app dd, J=6.6 Hz en J=12.3 Hz, H-3‟); 3.61 – 3.75 (2H; m, CH2 (Bn)); 3.85 – 3.89 (1H, m, H-4‟); 6.21 (1H, app t, J=6.3 Hz, H-1‟); 7.14 – 7.28 (15H, m, Tr); 7.29 – 7.34 (5H, m, Bn); 7.47 (1H, d, J=1.2 Hz, H-6) 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 12.10 (5-CH3); 39.60 (C-2‟); 52.29 (CH2 (Bn)); 57.53 (C-3‟); 63.80 (C-5‟); 84.68 (C-1‟); 85.11 (C-4‟); 87.45 (Tr); 110.96 (C-5); 127.42 – 128.81 (C van Bn en Tr); 135.70 (C-6); 139.60 (Bn); 143.50 (Tr); 150.30 (C-2); 163.77 (C-4) Exacte massa (ESIMS): berekend voor C36H36N3O4+: [M+H+]=574.2700; gevonden 1
Experimenteel deel 5.4.2. Synthese van 3’-benzylamino-3’-deoxy-β-D-thymidine (20)
20 (kleurloze olie, 18 mg; 0.055 mmol, 34%) wordt gesynthetiseerd volgens een analoge procedure als gevolgd voor de synthese van 16. H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 1.77 (3H, m, 5-CH3); 1.99 – 2.14 (2H, m, H-2‟A en H-2‟B); 3.27 – 3.33 (1H, m, H-3‟); 3.53 – 3.71 (4H, m, H-5‟A, H-5‟B en CH2 (Bn)); 3.76 – 3.80 (1H, m, H-4‟); 4.10 (1H, app br s, 3‟-NH); 5.01 (1H, br s, O N HO 5‟-OH); 6.15 (1H, app t, J=6.3 Hz, H-1‟); 7.19 – 7.32 (5H, m, Bn); 7.74 (1H, d, O J=1.2 Hz, H-6); 11.25 (1H, s, 3-NH) 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6): δ 12.95 (5-CH3); 38.23 (C-2‟); 51.78 (CH2 (Bn)); 58.07 (C-3‟); 62.43 (C-5‟); 84.64 (C-1‟); HN 86.00 (C-4‟); 109.82 (C-5); 127.24 – 128.77 (C van Bn); 136.93 (C-6); 141.46 (Bn); 151.10 (C-2); 164.45 (C-4) Exacte massa (ESI-MS): berekend voor C17H22N3O4+: [M+H+]=332.1605; gevonden [M+H+]=332.1613 O
HN
1
40
Resultaten en bespreking
41
6. RESULTATEN EN BESPREKING 6.1. BIOLOGISCHE EVALUATIE 6.1.1. Algemeen De gesynthetiseerde dThd-analogen werden geëvalueerd voor hun inhiberende activiteit tegenover dThd-fosforylering door recombinant humaan TK-1, hTK-2, Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) TK, Varicella zoster virus (VZV) TK en Dm-dNK.
6.1.2. Resultaten
O
O
HN R1O
O O HN HN
O
HN N
HO
O O HN
S
HN R2
HN N
O O
R1O
HO
O O
N
N N N
Cl
Cl
CF3
11, 12, 13
IVD 914, AT 17, 6
N
N N N N
R1
Br
HN
HN N
CF3
Cl
O
Cl SVP 100
14, 15
IC504 (µM) R1
R2
TK-1
TK-2
HSV-1 TK
VZV TK
Dm dNK
IVD 914 AT 17
H CF3 H Cl
316 ± 1.2 334 ± 49
0.15 ± 0.01 0.098 ± 0.004
195 ± 54 318 ± 11
24 ± 3.0 6.0 ± 1.9
3.5 ± 0.3
6 11 12 13 14 15 SVP 100
Tr CF3 Bn H iPr Tr H -
> 500 468 ± 12 355 ± 69 ≥ 500 > 500 382 ± 52 > 500
> 500 1.3 ± 0.5 0.43 ± 0.02 0.58 ± 0.29 > 500 0.035 ± 0.007 0.036 ± 0.003
> 500 372 ± 39 > 500 > 500 > 500 316 ± 39 4.5 ± 0.6
> 500 41 ± 1 41 ± 3 277 ± 35 > 500 63 ± 26 1.7 ± 0.4
> 500 7.7 ± 4.1 11 ± 6 12 ± 4 > 500 1.2 ± 0.0 0.46 ± 0.06
4
IC50 of de 50% inhiberende concentratie is de concentratie van de testcomponent die nodig is om de fosforylering van dThd met 50% te inhiberen.
Resultaten en bespreking 6.1.3. Bespreking Balzarini et al. (2009) suggereerden dat er een mogelijkheid bestaat dat de lipofiele tritylgroep van de 5‟-trityl-analogen van β-dThd en de lipofiele gesubstitueerde fenylgroep op de thioureum-eenheid van de 3‟-thioureum-β-dThd-derivaten interageren met dezelfde bindingsplaats op TK-2. Om dit aan te tonen werd intermediair 6 getest en werden de resultaten vergeleken met deze voor IVD 914. Hieruit is duidelijk af te leiden dat 6 geen inhiberende werking heeft t.o.v. TK-2, waaruit kan geconcludeerd worden dat het enzym niet in staat is beide sterische groepen te binden wanneer gecombineerd in één analoog en dat beide lipofiele eenheden vermoedelijk in competitie treden voor dezelfde bindingsplaats.
Uit de IC50-waarden kan besloten worden dat de guanidine analogen 11, 12 en 13 relatief goede inhibitoren zijn voor TK-2 en dat de guanidinefunctie een goed alternatief is voor de thioureumlinker. De selectiviteit van 11, 12 en 13 voor TK-2 t.o.v. TK-1 is licht verhoogd in vergelijking met IVD 914 en AT 17. De affiniteit voor TK-2 is echter beduidend lager. Ondanks zijn basisch karakter is een guanidinegroep blijkbaar niet beter als interactiepartner voor de γ-fosfaatgroep. Het niet-gesubstitueerde analoog is met een IC50waarde van 0.43 µM de beste TK-2 inhibitor van de 3 guanidine analogen, wat suggereert dat ook sterische factoren een optimale interactie met TK-2 kunnen verhinderen.
Vergelijking van de IC50-waarde van aminotetrazoolderivaat 15 met alle tot dusver gesynthetiseerde TK-2 inhibitoren toont aan dat de inhiberende activiteit van 15 in dezelfde grootteorde ligt als deze van SVP 100. Met een IC50-waarde van 35 µM is 15 de meest potente TK-2 inhibitor tot dusver. De selectiviteit van 15 t.o.v. TK-1 ligt echter beduidend lager dan deze van SVP 100. Een mogelijke verklaring kan gezocht worden in de aanwezigheid van een 5-bromovinylsubstituent op de base van SVP 100. Zowel gegevens uit de literatuur (Johansson et al., 1999) als voorgaande biologische resultaten hebben aangetoond dat de 5-bromovinyl een ideale substituent is voor TK-2 herkenning. De wijze waarop 15 bindt in de actieve bindingsplaats van TK-2 zal via modelling nagegaan worden.
42
Resultaten en bespreking
43
6.2. STRUCTUURANALYSE VAN 1”,4”- EN 1”,5”-DIGESUBSTITUEERDE TRIAZOLEN In de literatuur wordt gerapporteerd dat, bij de synthese van triazolen, het gebruik van Ru als katalysator resulteert in de vorming van 1,5-digesubstitueerde 1,2,3-triazolen. CuIgekatalyseerde synthese geeft aanleiding tot 1,4-digesubstitueerde 1,2,3-triazolen. (Zhang et al., 2005) Om ontegensprekelijk te bewijzen dat deze informatie klopt, worden de NMRspectra van IVD 915 (1”,4”-digesubstitueerd triazool) en van SVP 023 (1”,5”digesubstitueerd triazool) vergeleken met het NMR-spectrum van 18 (ongesubstitueerd triazool). De structuur van deze 3 verbindingen wordt weergegeven in FIGUUR 6.1.
O
O
HN O HO
HN N
O
HN N
HO
18
O
N
HO
O
N N N
O
O
N N N
IVD 915
O
N N N
SVP 023
FIGUUR 6.1: 3‟-DEOXY-3‟-(1”,2”,3”-TRIAZOL-1”-YL)-β-D-THYMIDINE (18), 3‟-DEOXY-3‟((4”-BENZYL)-1”,2”,3”-TRIAZOL-1”-YL)-β-D-THYMIDINE (IVD 915) EN 3‟-DEOXY-3‟-((5”BENZYL)-1”,2”,3”-TRIAZOL-1”-YL)-β-D-THYMIDINE (SVP 023)
De C
triazool
13
C-NMR-spectra van 18, IVD 915 en SVP 023 zijn erg gelijkend, behalve voor
(C-4” en C-5”). De vergelijkende resultaten worden weergegeven in TABEL 6.1. TABEL 6.1: VERGELIJKING VAN DE 13C-NMR RESULTATEN VAN 18, IVD 915 EN SVP 023 C-4" C-5" 133.57 124.49 18 IVD 915 146.57 121.01 SVP 023 138.22 133.16
Resultaten en bespreking De ligging van de C-4”- en de C-5”-nucleï werden bepaald m.b.v. het HSQC5spectrum van 18. Bij substitutie van het C-4”-atoom (IVD 915), is er slechts een beperkte verschuiving van het signaal voor de 5”-C. Terwijl het signaal voor de C-4”-nucleus sterk downfield verschuift. Het tegenovergestelde effect wordt waargenomen wanneer het C-5”atoom gesubstitueerd wordt (SVP 023): hier is de verschuiving van het C-4”-signaal verwaarloosbaar en is de piek voor de C-5”-nucleus downfield verschoven. Beide waarnemingen kunnen verklaard worden door het licht elektronenzuigend karakter van de fenylsubstituent. Uit deze verschuivingen kan besloten worden dat verbindingen IVD 915 en SVP 023 wel degelijk 1”,4”-digesubstitueerde, respectievelijk 1”,5”-digesubstitueerde triazolen zijn.
5
HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) is een 2D-techniek die 1H- en 13C-resonantiefrequenties met elkaar correleert. Hierdoor is het mogelijk om -uit de positie van de H-atomen- de positie van de overeenkomstige C-atomen af te leiden.
44
Besluit en toekomstperspectieven 7. BESLUIT EN TOEKOMSTPERSPECTIEVEN
Eén van de doelstellingen van het onderzoekswerk was op zoek te gaan naar een alternatieve linker voor de 3‟-thioureumlinker in bestaande TK-2 inhibitoren. De eerste groep van alternatieven bestond uit guanidine analogen, die gesynthetiseerd werden volgens een 8stapssynthese met vrij hoge rendementen. De biologische resultaten toonden aan dat de guanidinefunctie een goed alternatief is voor de thioureumlinker. De selectiviteit van de gesynthetiseerde guanidine analogen voor TK-2 t.o.v. TK-1 is zelfs licht verhoogd. Hun affiniteit voor TK-2 is echter beduidend lager.
Per toeval werd een procedure gevonden die kon gebruikt worden voor de synthese van een dThd-analoog waar een aminotetrazool fungeert als linker tussen dThd en de gesubstitueerde fenylgroep. Dit tetrazool blijkt een zeer potente TK-2 inhibitor (IC50=35 nM), maar de selectiviteit t.o.v. TK-1 is niet zo goed. Bijgevolg zal de tetrazool-linker gecombineerd worden met een 5-bromovinyl-substitutie op de base, waarvan reeds aangetoond is dat het de selectiviteit doet toenemen.
In een volgende poging een alternatieve linker te vinden werd 3‟-benzylamino-3‟deoxy-β-D-thymidine gesynthetiseerd. Deze verbinding zal dienen als prototype voor de synthese van andere analogen met een amine-linker.
De synthese van het ongesubstitueerde triazoolderivaat (18) maakte het mogelijk om via 13C-NMR-analyse aan te tonen dat de reeds gesynthetiseerde triazoolanalogen IVD 915 en SVP 023 inderdaad 1”,4”- respectievelijk 1”,5”-digesubstitueerd waren. In de toekomst moet vergelijking van de biologische resultaten van het ongesubstitueerde triazool met die van de gesubstitueerde derivaten aantonen of de substituent op de triazoolring wel degelijk een rol speelt in de TK-2 inhiberende werking, of dat de triazoolring op zich verantwoordelijk is voor activiteit.
45
Literatuurlijst 8. LITERATUURLIJST Al-Madhoun, A. S.; Tjarks, W.; Eriksson, S. (2004). The Role of Thymidine Kinases in the Activation of Pyrimidine Nucleoside Analogues. Mini Rev. Med. Chem., 4, 341-350. Arner E. S. J.; Eriksson, S. (1995). Mammalian deoxyribonucleoside kinases. Pharmacol. Ther., 67, 155-186. Balzarini, J.; Van Daele, I.; Negri, A.; Solaroli, N.; Karlsson, A.; Liekens, S.; Gago, F.; Van Calenbergh, S. (2009). Human Mitochondrial Thymidine Kinase (TK-2) is Selectively Inhibited by 3‟-Thiourea Derivatives of β-Thymidine. Identification of residues crucial for both inhibiton and catalytic activity. Mol. Pharmacol., 75, 1127-1136. Barai, V. N.; Eroshevskaya, L. A.; Mikhailopulo, I. A.; Azhayev, A; V.; Lapinjoki, S. P. (2007). US Patent 0065922 A1. Batey, R. A.; Powell, D. A. (2000). A General Synthetic Method for the Formation of Substituted 5-Aminotetrazoles from Thioureas: A Strategy for Diversity Amplification. Org. Lett., 2, 3237-3240. Bessodes, M.; Komiotis, D.; Antonakis, K. (1986). Rapid and selective detritylation of primary alcohols using formic-acid. Tetrahedron Lett., 27, 579-580. Birringer, M. S.; Claus, M. T.; Folkers, G.; Kloer, D. P.; Schulz, D. E.; Scapozza, L. (2005) Structure of a type II thymidine kinase with bound dTTP. FEBS Lett. , 579, 1376–1382. Bogenhagen, D.; Clayton, D. A. (1976). Thymidylate nucleotide supply for mitochondrial DNA synthesis in mouse L-cells. Effect of 5-fluorodeoxyuridine and methotrexate in thymidine kinase plus and thymidine kinase minus cells. J. Biol. Chem., 251, 2938-2944. Bradshaw, P. C.; Samuels, D. C. (2005). A computational model of mitochondrial deoxynucleotide metabolism and DNA replication. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 288, C989C1002. Clayden, J.; Greeves, N.; Warren, S.; Wothers, P. (2001). Organic Chemistry. Oxford University Press Inc., New York, United States of America, 1512 pp.
46
Literatuurlijst Cosyn, L. (2008). Synthesis and Biological Evaluation of Purine and Pyrimidine Based Ligands for the A3 and P2Y2 Purinergic Receptors, Universiteit Gent, Doctoraatsthesis. Cunha, S.; Costa, M. B.; Napolitano, H. B.; Lariucci, C.; Vencato, I. (2001). Study of Nbenzoyl-activation in the HgCl2-promoted guanylation reaction of thioureas. Synthesis and structural analysis of N-benzoyl-guanidines. Tetrahedron, 57, 1671-1675. De Clercq, E. (2002). Strategies in the design of antiviral drugs. Nat. Rev. Drug Discov., 1, 13-25. De Clercq, P. (2004). Syllabus Organische Chemie 1e bachelor in de Farmaceutische Wetenschappen, pp. 17.22-17.23 en 20.10-20.14. Dolce, V.; Fiermonte, G.; Runswick, M. J.; Palmieri, F.; Walker, J. E. (2001). The human mitochondrial deoxynucleotide carrier and its role in the toxicity of nucleoside antivirals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 98, 2284–2288. Eriksson, S.; Munch-Petersen, B.; Johansson, K.; Eklund, H. (2002). Structure and function of cellular deoxyribonucleoside kinases. Cell. Mol. Life Sci., 59, 1327-1346. Gentry, G. A. (1992). Viral thymidine kinases and their relatives. Pharmacol. Ther., 54, 319– 355. Häbich, D. (1992). Synthesis of 3‟-(5-amino-1,2,3,4-tetrazol-1-yl)-3‟-deoxythymidines. Synthesis, 4, 358-360. Hadden, M. (2005). Advanced Library Design and Organic Synthesis. Albany Molecular Research, 10, 9-10. Handleiding MS, (2004). Waters LCT PremierTM Operation and Maintenance Training. Hanessian, S.; Rancourt, G. (1977). Approaches to total synthesis of natural-products from carbohydrates. Pure Appl. Chem., 49, 1201-1214. Hatefi, Y. (1985). The mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation system. Annu. Rev. Biochem., 54, 1015-1069.
47
Literatuurlijst Hernandez, A. I.; Familiar, O.; Negri, A.; Rodriguez-Barrios, F.; Gago, F.; Karlsson, A.; Camarasa, M.-J.; Balzarini, J.; Pérez-Pérez, M.-J. (2006). N-Substituted Thymine Derivatives as Mitochondrial Thymidine Kinase (TK-2) Inhibitors. J. Med. Chem, 49, 7766-7773. Horwitz J. P.; Chua, J.; Noel, M. (1964). Nucleosides. V. The Monomesylates of 1-(2‟Deoxy-β-D-lyxofuranosyl)thymine. J. Org. Chem., 29, 2076-2078. http://www.organic-chemistry.org/namedreactions/staudinger-reaction.shtm (15/04/2009). Johansson, M.; Van Rompay, A. R.; Degreve, B.; Balzarini, J.; Karlsson, A. (1999). Cloning and characterization of the multisubstratedeoxyribonucleoside kinase of Drosophila melanogaster. J. Biol. Chem., 274, 23814-23819. Jones, M. E. (1980). Pyrimidine nucleotide biosynthesis in animals: Genes, enzymes, and regulation of UMP biosynthesis. Annu. Rev. Biochem., 49, 253-279. Kakuda, T. N. (2000). Pharmacology of Nucleoside and Nucleotide Reverse Transcriptase Inhibitor-Induced Mitochondrial Toxicity. Clin. Ther., 22, 685-708. Lai, Y.; Tse, C. M.; Unadkat, J. D. (2004). Mitochondrial expression of the human equilibrative nucleoside transporter 1 (hENT1) results in enhanced mitochondrial toxicity of antiviral drugs. J. Biol. Chem., 279, 4490–4497. Lewis, W. (2003a). Defective mitochondrial DNA replication and NRTIs: pathophysiological implications in AIDS cardiomyopathy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 284, H1-H9. Lewis, W. (2007). Pharmacogenomics, Toxicogenomics, and DNA Polymerase γ. J. Infect. Dis., 195, 1399-1401. Lewis, W.; Brian, J.D.; Copeland, W.C. (2003b). Mitochondrial toxicity of NRTI antiviral drugs: an integrated cellular perspective. Nat. Rev. Drug Discov., 2, 812-822. Lim, S. E.; Longley, M. J.; Copeland, W. C. (1999). The mitochondrial p55 accessory subunit of human DNA polymerase gamma enhances DNA binding, promotes processive DNA synthesis, and confers N-ethylmaleimide resistance. J. Biol. Chem., 274, 38197-38203.
48
Literatuurlijst Mancuso, M.; Salviati, L.; Sacconi, S.; Otaegui, D.; Camaño, P.; Marina, A.; Bacman, S.; Moraes, C. T.; Carlo, J. R.; Garcia, M.; Garcia-Alvarez, M.; Monzon, L.; Naini, A. B.; Hirano, M.; Bonilla, E.; Taratuto, A. L.; DiMauro, S.; Vu, T. H. (2002). Mitochondrial DNA depletion: Mutations in thymidine kinase gene with myopathy and SMA. Neurology, 59, 1197-1202. Mathews, C. K.; van Holde, K. E.; Ahern, K. G. (2000). Biochemistry. Addison Wesley Longman, San Francisco, Chapter 4 & 22. McMurry, J. (2008). Organic Chemistry. Brooks/Cole, New York, United States of America, 1224 pp. Nolan, D.; Mallal, S. (2004). Complications associated with NRTI therapy: update on clinical features, and possible pathogenic mechanisms. Antivir. Ther., 9, 849-863. Pérez-Pérez, M.-J.; Priego, E.-M.; Hernández, A.-I.; Familiar, O.; Camarasa, M.-J.; Negri, A.; Gago, F.; Balzarini, J. (2008). Structure, Physiological Role, and Specific Inhibitors of Human Thymidine Kinase 2 (TK2): Present and Future. Med. Res. Rev., 28, 797-820. Portsmouth, D.; Hlavaty, J.; Renner, M. (2007). Suicide genes for cancer therapy. Mol. Aspects Med., 28, 4-41. Powell, D. A. (2001). Mercury promoted synthesis of substituted 5-aminotetrazoles and studies toward the synthesis of the Martinelline alkaloids. Thesis. Rampazzo, C.; Ferraro, P.; Pontarin, G.; Fabris, S.; Reichard, P.; Bianchi, V. (2004). Mitochondrial Deoxyribonucleotides, Pool Sizes, Synthesis, and Regulation. J. Biol. Chem., 279, 17019-17026. Reichard, P. (1988). Interactions between deoxyribonucleotide and DNA synthesis. Annu. Rev. Biochem., 57, 349-374. Rostovtsev, V. V.; Green, L. G.; Fokin, V. V.; Sharpless, K. B. (2002). A stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed., 41, 2596-2599. Saada, A. (2004). Deoxyribonucleotides and Disorders of Mitochondrial DNA Integrity. DNA Cell Biol., 23, 797-806.
49
Literatuurlijst Samuels, D. C. (2006). Mitochondrial AZT Metabolism. IUBMB Life, 58, 403-408. Sandrini, M. P.; Clausen, A. R.; Munch-Petersen, B.; Piskur, J. (2006). Thymidine kinase diversity in bacteria. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 25, 1153–1158. Temal-Laib, T.; Chastanet, J.; Zhu, J. P. (2002). A convergent approach to cyclopeptide alkaloids: Total synthesis of Sanjoinine G1. J. Am. Chem. Soc., 124, 583-590. Thiel, M.; Harder, S.; Wiese, M.; Kroemer, M.; Bruchhaus, I. (2008). Involvement of a Leishmania thymidine kinase in flagellum formation, promastigote shape and growth as well as virulence. Mol. Biochem. Parasitol., 158, 152-162. Thienpont, L. (2007). Syllabus Instrumentele Analytische Chemie 3e bachelor in de Farmaceutische Wetenschappen, pp. 100-147. Tritschler, H. J.; Andreetta, F.; Moraes, C. T.; Bonilla, E.; Arnaudo, E.; Danon, M. J.; Glass, S.; Zelaya, B. M.; Vamos, E.; Telerman-Toppet, N.; Shanske, S.; Kadenbach, B.; Dimauro, S.; Schon, E. A. (1992). Mitochondrial myopathy of childhood associated with depletion of mitochondrial DNA. Neurology, 42, 209-217. Van Daele, I. (2007). Design of Thymidine-based Inhibitors of Mycobacterium tuberculosis Thymidylate Kinase, Universiteit Gent, Doctoraatsthesis. Van Poecke, S. (2009). Ongepubliceerde resultaten. Van Rompay, A. R.; Johansson, M.; Karlsson, A. (2000). Phosphorylation of nucleosides and nucleoside analogs by mammalian nucleoside monophosphate kinases. Pharmacol. Ther., 87, 189-198. Verheyden, J. P. H.; Wagner, D.; Moffatt, J. G. (1971). Synthesis of Some Pyrimidine 2‟Amino-2‟-deoxynucleosides. J. Org. Chem., 36, 250-254. Vila, M. R.; Segovia-Silvestre, T.; Gamez, J.; Marina, A.; Naini, A. B.; Meseguer, A.; Lombes, A.; Bonilla, E. ; DiMauro, S. ; Hirano, M. ; Andreu, A. L. (2003). Reversion of mtDNA depletion in a patient with TK2 deficiency. Neurology, 60, 1203-1205.
50
Literatuurlijst Wang, L.; Munch-Petersen, B.; Herrstrom Sjoberg, A.; Hellman, U.; Bergman, T.; Jornvall, H.; Eriksson, S. (1999). Human thymidine kinase 2: Molecular cloning and characterisation of the enzyme activity with antiviral and cytostatic nucleoside substrates. FEBS Lett., 443, 170174. Wigerinck, P. (1991). Synthesis and antiviral activity of nucleosides with heterocyclic substituents. Universiteit Leuven, Doctoraatsthesis. Zhang, L.; Chen, X.; Xue, P.; Sun, H. H. Y.; Williams, I. D.; Sharpless, K. B.; Fokin, V. V.; Jia, G. (2005). Ruthenium-Catalyzed Cycloaddition of Alkynes and Organic Azides. J. Am. Chem. Soc., 127, 15998-15999. Zhu, C.; Johansson, M.; Permert, J.; Karlsson, A. (1998). Enhanced cytotoxicity of nucleoside analogs by overexpression of mitochondrial deoxyguanosine kinase in cancer cell lines. J. Biol. Chem., 273, 14707-14711.
51
BIJLAGE 1: 1H-NMR-spectrum van 15 O HN O
N
HO O HN
N N
Cl CF3
N N
BIJLAGE 2: 1H-NMR-spectrum van 18
O HN O
N
HO O N N N
BIJLAGE 3: 13C-NMR-spectrum van 18
O HN O
N
HO O N N N
