Studium charakteristik salmonel izolovaných od lidí, zvířat a z potravin

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

Studium charakteristik salmonel izolovaných od lidí, zvířat a z potravin Diplomová práce

Petra Pospíšilová

Vedoucí diplomové práce: doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D.

BRNO 2011

Bibliografický záznam Autor:

Bc. Petra Pospíšilová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce:

Studium charakteristik salmonel izolovaných od lidí, zvířat a z potravin

Studijní program:

Biologie

Studijní obor:

Obecná biologie

Vedoucí práce:

doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D.

Rok obhajoby:

2011

Klíčová slova:

Salmonella, salmonelóza, typizační metody, genotypové metody, fenotypové metody, fágová typizace, PCR

Bibliographic entry Author:

Bc. Petra Pospíšilová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of thesis:

Study of salmonellae characteristics isolated from humans, animals and food-stuffs

Degree programme:

Biology

Field of study:

General Biology

Supervisor:

doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D.

Year of defence:

2011

Keywords:

Salmonella, salmonelosis, typing methods, genotypic methods, phenotypic methods, phage typing, PCR

Na tomto místě bych velmi ráda poděkovala vedoucí diplomové práce doc. MVDr. Renátě Karpíškové, Ph.D., za odborné vedení práce, cenné rady a poskytnutí veškerého materiálu pro její vypracování. Velký dík patří laborantce Lei Jakubcové za ochotu a trpělivou asistenci a všem zaměstnancům mikrobiologické laboratoře SZÚ v Brně za vytvoření příjemných pracovních podmínek. Poděkování patří taktéž rodině a příteli Matějovi za podporu během celého studia.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci napsala samostatně a výhradně s použitím citovaných pramenů. V Brně dne:

Podpis:

Abstrakt Salmonelózy jsou i přes svůj klesající počet stále velkým problémem. Rod Salmonella je tudíž i nadále aktuálním tématem epidemiologických studií. Vzhledem k průniku nových sérotypů a fágových typů na naše území je nutné provádět detailní typizace kmenů. Cílem této práce bylo sledovat epidemické souvislosti kmenů salmonel v období od listopadu 2009 do února 2011, zjistit charakteristiky těchto kmenů a vyhodnotit rozlišovací schopnost použitých metod. K typizaci byly použity metody fenotypové i genotypové. Mezi fenotypovými to byla sérotypizace sklíčkovou aglutinací, fágová typizace a u vybraných kmenů zjišťování rezistence k antimikrobiálním látkám. Z genotypových pak aplikace PCR včetně profágové multiplex PCR a makrorestrikční analýza s následnou pulzní gelovou elektroforézou. Výsledky studie ukázaly, že početně nejsilnějšími jsou na našem území stále S. Enteritidis PT8 a S. Typhimurium DT104. Studie také odhalila průnik nových sérotypů nebo jejich variant na území České republiky. Jedná se o v poslední době diskutovaný monofazický sérotyp S. 4,[5],12:i:- a defektní variantu sérotypu Infantis. Testování antimikrobiální rezistence ukázalo stále zvyšující se multirezistence především u kmenů S. Typhimurium DT104 a S. 4,[5],12:i:-. Profágová multiplex PCR ukázala příbuznost mezi monofazickými kmeny; další korelaci mezi fenotypovými projevy kmene a jeho kódem získaným pomocí této metody jsme nepozorovali. Pulzní gelová elektroforéza se v práci stala účinným nástrojem potvrzení epidemií, v některých případech byla ovšem průkaznější metodou fágová typizace.

Abstract Salmonella spp. represent one of the most common food-borne zoonosis in developed countries. Regarding the detection of new serotypes and phage types it is necessary to implement a detailed strain typing. The aim of this thesis was to monitor epidemic connections of sallmonelae strains collected from November 2009 to February 2011, to identify their characteristics and to interpret the discrimination ability of the methods used in this thesis. Phenotypic as well as genotypic methods were used for the strain typization. The phenotypic methods included slide agglutiantion, phage typing and antimicrobial resistance test. The genotypic methods included PCR applications inclusive of prophage multiplex PCR and macrorestriction analysis followed by pulsed field electrophoresis. The study results showed the most common strains in the Czech Republic are still S. Enteritidis PT8 and S. Typhimurium DT104. The study has also revealed penetration of new serotypes or their variants to the Czech Republic. Those are the recently discussed monophasic S. 4,[5],12:i:- and a defective variant od S. Infantis. Antimicrobial resistance testing showed increasing multidrug resistance typical for S. Typhimurium and S. 4,[5],12:i:-. Prophage multiplex PCR disclosed certain relation among the strains, however, further correlation between the phenotype a obtained codes wasn´t observed. Pulsed field gel electrophoresis became an effective tool for outbreaks confirmation, however, in some cases

phage

typing

provided

better

discrimination

ability.

Obsah Úvod ............................................................................................................... 4

1 1.1

Charakteristika rodu Salmonella .................................................................. 4

1.2

Antigenní struktura....................................................................................... 5

1.2.1

Somatický antigen – O antigen ............................................................. 5

1.2.2

Flagelární antigeny – H antigeny .......................................................... 6

1.2.3

Kapsulární antigen – Vi antigen ............................................................ 6

1.3

Salmonelóza u zvířat ................................................................................... 6

1.4

Salmonelóza u lidí ....................................................................................... 7

1.5

Výskyt salmonel ........................................................................................... 7

1.5.1

Výskyt salmonel u hospodářských zvířat .............................................. 8

1.5.2

Výskyt salmonel v potravinách ............................................................. 8

1.5.3

Výskyt salmonel u lidí ........................................................................... 9

1.6

Epidemie salmonelóz................................................................................. 11

1.6.1

Epidemie ve světě .............................................................................. 11

1.6.2

Epidemie v České republice ............................................................... 12

1.7

Typizační metody ...................................................................................... 13

1.7.1

Fenotypové metody ............................................................................ 13

1.7.1.1

Sérotypizace – sklíčková aglutinace ...................................................................... 13

1.7.1.2

Fágová typizace ..................................................................................................... 15

1.7.1.3

Rezistence k antimikrobiálním látkám .................................................................... 16

1.7.2

Genotypové metody ........................................................................... 17

1.7.2.1

Plazmidová analýza ............................................................................................... 17

1.7.2.2

Aplikace PCR ......................................................................................................... 17

1.7.2.3

Makrorestrikční analýza ......................................................................................... 18

1.7.2.4

Sekvencování DNA ................................................................................................ 19

Cíl práce .............................................................................................................. 20 Materiál a metody ........................................................................................ 21

2 2.1

Materiál ...................................................................................................... 21

2.1.1

Použité mikroorganizmy ..................................................................... 21

2.1.2

Pomůcky ............................................................................................. 23

2.1.3

Kultivační média ................................................................................. 23

2.1.4

Chemikálie a roztoky .......................................................................... 24

2.1.5

Komponenty pro PCR a gelovou elektroforézu .................................. 25 1

2.1.6

Ostatní substance............................................................................... 25

2.1.7

Identifikační sady ................................................................................ 25

2.1.8

Přístroje .............................................................................................. 25

2.2

Metody ....................................................................................................... 27

2.2.1

Fenotypové metody ............................................................................ 27

2.2.1.1

Kultivace kmenů na jednotlivých médiích .............................................................. 27

2.2.1.2

Sérotypizace ........................................................................................................... 28

2.2.1.3

Fágová typizace ..................................................................................................... 28

2.2.1.4

Rezistence k antimikrobiálním látkám – disková difúzní metoda ........................... 29

2.2.2 2.2.2.1

Genotypové metody ........................................................................... 30 Aplikace PCR ......................................................................................................... 30

2.2.2.1.1

Sérotypizace pomocí PCR – detekce genu fljB a fliC ....................................... 32

2.2.2.1.2

Subtypizace sérotypu Typhimurium pomocí profágové multiplex PCR ............ 33

2.2.2.2

Makrorestrikční analýza a pulzní gelová elektroforéza (PFGE) ............................. 35

Výsledky....................................................................................................... 38

3 3.1

Kultivace .................................................................................................... 38

3.2

Typizace kmenů S. enterica subsp. enterica sérotyp Enteritidis ................ 38

3.2.1

Fágová typizace ................................................................................. 38

3.2.2

Rezistence k antimikrobiálním látkám ................................................ 41

3.3

Typizace kmenů S. enterica subsp. enterica sérotyp Typhimurium ........... 42

3.3.1

Fágová typizace ................................................................................. 42

3.3.2

Rezistence k antimikrobiálním látkám ................................................ 44

3.3.3

PCR pro detekci genu fljB .................................................................. 46

3.3.4

Subtypizace sérotypu Typhimurium pomocí PCR – multiplex PCR .... 48

3.4

Typizace kmenů s neurčeným sérotypem ................................................. 48

3.4.1

Latexová aglutinace – Wellcolex ........................................................ 48

3.4.2

Sérotypizace sklíčkovou aglutinací ..................................................... 49

3.4.3

PCR pro detekci genu fliC .................................................................. 50

3.5 4

Epidemie.................................................................................................... 51 Diskuze......................................................................................................... 58

4.1

Sérotypizace .............................................................................................. 58

4.2

Fágová typizace ........................................................................................ 59

4.3

Test rezistence k antimikrobiálním látkám ................................................. 60

4.4

Metody na principu PCR ............................................................................ 60

4.5

Makrorestrikční analýza a elektroforéza v pulzním poli (PFGE) ................ 62 2

4.6

Epidemie.................................................................................................... 62

5

Závěr............................................................................................................. 65

6

Seznam literatury ........................................................................................ 67

7

Seznam zkratek ........................................................................................... 75

3

1 Úvod Počet průjmových onemocnění způsobených baktériemi rodu Salmonella, zvaných salmonelóza, v posledních letech v České republice klesá (Epidat SZÚ, dostupný z http://www.szu.cz/publikace/data/infekce-v-cr). Přesto jsou salmonelózy stále problémem, který má velké socioekonomické dopady. Jako typické alimentární onemocnění souvisí salmonelóza úzce s požitím kontaminované potravy, a má tudíž potenciál ke způsobování hromadných onemocnění. Pro správné určení epidemiologických souvislostí je nezbytně nutná detailní typizace kmenů. Vzhledem k tomu, že rutinní laboratoře nemohou kvůli náročnosti technik takto detailní studie provádět, probíhá pak řada epidemií bez povšimnutí. U nových sérotypů a nových fágových typů vyskytujících se na území České republiky je zapotřebí sledovat, jak se tyto nové kmeny chovají a jakou rychlostí se šíří v populaci zvířecí i humánní. Je také třeba sledovat zdroje a cesty přenosu infekce a výskyt původců v potravinovém řetězci. Pokud jsou prováděny systematické a detailní studie charakteristik suspektních kmenů, je dále možné tyto informace použít pro zkvalitnění epidemiologických studií týkajících se onemocnění salmonelózou. Tyto údaje mohou často dopomoci k propojení zdánlivě nesouvisejících případů onemocnění z různých krajů České republiky, potvrzení vehikula a dosledování zdrojů infekce.

1.1 Charakteristika rodu Salmonella Baktérie rodu Salmonella jsou gramnegativní tyčinky čeledi Enterobacteriaceae (Kmen:

Proteobacteria,

Třída:

Gammaproteobacteria,

Řád:

Enterobacteriales)

s vlastnostmi charakteristickými pro tuto čeleď – přítomnost peritrichálních bičíků (s výjimkou sérotypu Gallinarum), kultivace při 37 °C, pozitivní kataláza a negativní oxidáza, metabolizmus je fakultativně anaerobní a chemoorganotrofní (Sedláček, 2007). Rod Salmonella zahrnuje dva druhy S. enterica (Le Minor a Popoff, 1987) a S. bongori (Reeves a kol., 1989). První druh se dělí do šesti poddruhů, kde každý z poddruhů zahrnuje více sérotypů (Grimont a Weill, 2007). Zavedená nomenklatura je v souladu se současným taxonomickým poznáním (Tindall a kol., 2005). Co se týče biochemických vlastností, pak salmonely tvoří sirovodík (jeden z identifikačních znaků), redukují nitráty, zkvašují glukózu za vzniku plynu a kyselin. Jednotlivé poddruhy Salmonella enterica se ovšem v některých biochemických 4

charakteristikách liší – např. využívání malonátu, sorbitolu a jiné (Grimont a Weill, 2007). Zajímavostí rodu Salmonella je především bohaté zastoupení sérotypů, jak zobrazuje tabulka níže (Tab. 1). Ty jsou určovány na základě kombinace somatických, bičíkových a kapsulárních antigenů, více v kapitole Antigenní struktura. Tab. 1: Zastoupení druhů, poddruhů a sérotypů baktérií rodu Salmonella (Grimont a Weill, 2007)

Název druhu

Název poddruhu

S. enterica S. enterica S. enterica S. enterica S. enterica S. enterica

enterica salamae arizonae diarizonae houtenae indica

Počet sérotypů

S. bongori Celkem

1531 505 99 336 73 13 22 2579

1.2 Antigenní struktura Buňky baktérií rodu Salmonella vykazují na svém povrchu tři typy antigenů. Těmi jsou somatický, bičíkový a kapsulární antigen (typický především pro sérotyp Typhi a Paratyphi). Možnost detekce antigenní struktury je tedy závislá na fenotypovém projevu buňky, a pokud například buňka v některé životní fázi netvoří bičíky, pak není možné bičíkový antigen pomocí fenotypové sérotypizace prokázat. Existují ovšem sérotypy, které přirozeně postrádají geny kódující některé antigeny. Pak je nutné odlišit kmen, který je přirozeně bez antigenu, a kmen, který je v daném antigenu defektní. Tato vlastnost se často týká jednoho ze dvou bičíkových antigenů (tzv. bičíkových fází) a způsobuje problémy při sérotypizaci.

1.2.1 Somatický antigen – O antigen Somatický antigen, zvaný též O antigen, je představován polysacharidy přítomnými na povrchu gramnegativních buněk, je typický pro zástupce čeledi Enterobacteriaceae. Je součástí vnější lipopolysacharidové vrstvy. Tyto antigeny se chovají jako endotoxiny a jsou schopny v hostiteli vyvolat imunitní reakci (Šilhánková, 2008). U rodu Salmonella se vyskytuje 46 různých somatických antigenů, na jejichž základě jsou sérotypy rozděleny do několika skupin. Tyto skupiny byly dříve značeny 5

písmeny, dnes jsou obvykle označovány antigenem nebo kombinací antigenů, které skupina na svém povrchu vykazuje, přičemž je v závorce ponecháno staré označení písmenem – např. skupina dříve označovaná jako O: B je dnes značena jako O: 4 (B) (Grimont a Weill, 2007).

1.2.2 Flagelární antigeny – H antigeny Flagelární neboli bičíkové antigeny se u rodu Salmonella vyskytují ve dvou takzvaných fázích (jsou kódovány geny fliC a fljB), z nichž jedna nebo druhá nemusí být exprimována. Jak již bylo řečeno, některé sérotypy přirozeně postrádají gen pro jednu nebo druhou fázi (například nejčastější sérotyp v České republice S. Enteritidis ve svém genomu nenese gen fljB, nekóduje tudíž protein druhé bičíkové fáze). Jiné sérotypy mohou být v těchto genech defektní a není zatím zcela jisté, jestli takto činí záměrně a tento defekt jim přináší nějakou výhodu (typickým příkladem je nově prevalující monofazická varianta S. Typhimurium defektní v druhé bičíkové fázi). Podle McQuistona a kolektivu je druhá bičíková fáze (fljB) exprimována méně často než první fáze (fliC), tudíž je pro rod Salmonella něco jako „náhradní pneumatika“, jak uvádí McQuiston. Propůjčuje například buňce další antigenní rozmanitost (McQuiston a kol., 2008).

1.2.3 Kapsulární antigen – Vi antigen Kapsulární antigen Vi je přítomný pouze u sérotypů Typhi, Paratyphi C a Dublin (Grimont a Weill, 2007). Tento antigen je základem vakcíny používané jako prevence proti onemocnění břišním tyfem. Její aplikace je doporučována především při cestování do zemí jihovýchodní Asie, účinnost očkování je udávána v rozmezí 35 % – 96 % v závislosti na dodržení doporučených postupů (Whitaker a kol., 2009).

1.3 Salmonelóza u zvířat Manifestující se případy salmonelóz jsou typické pouze pro mláďata. Projevují se u nich jako akutní průjmová onemocnění s vysokou úmrtností (Sedlák a Tomšíčková, 2006). Například u kuřat může infekce dosahovat úmrtnosti až 80 % zvířat v chovu. V prvních 3 až 5 dnech si ovšem mláďata vybudují proti salmonelám imunitu a poté k akutním průběhům nemoci již obvykle nedochází (Hui a kol., 2001). Dospělí jedinci většinou vykazují bezpříznakové nosičství, což pak může způsobit problém u potravinových zvířat, kdy může docházet ke kontaminaci produktů (masa, mléka a vajec) (Torrence a Isaacson, 2003). 6

1.4 Salmonelóza u lidí Rod Salmonella je zodpovědný za dva typy onemocnění – tyfoidní a non-tyfoidní. První formu onemocnění způsobují dva sérotypy (Typhi a Paratyphi). Vyvolávají břišní tyfus, horečnaté onemocnění typické zejména pro jihovýchodní Asii. Ostatní sérotypy poddruhu enterica způsobují onemocnění (zoonózy) manifestující se průjmy, horečkami, nevolností, případně zvracením. Onemocnění se vyznačuje jistou sezónností, kdy vrchol výskytu spadá do období s vyššími průměrnými teplotami, zejména do měsíce srpna (ECDC, 2009). Nejvíce případů je zaznamenáváno ve věkové skupině dětí 0–4 let (EFSA, 2006). Průnik baktérií rodu Salmonella do zažívacího traktu člověka se může projevit více způsoby. Nejčastěji se jedná o průjmové onemocnění, které je označováno jako salmonelóza v užším slova smyslu. Infekce se projeví v rozmezí 6–72 hodin po požití kontaminované potravy a vyznačuje se průjmy, křečemi v břiše, teplotou. Může se objevit nausea a zvracení. Onemocnění obvykle do týdne odeznívá bez následků (Nester a kol., 1998). Pokud se následky přece jen objeví, manifestují se jako extraintestinální formy onemocnění, například ve formě artritidy (Votava a kol., 2003). V současné době je jedinou léčbou dietní režim, antibiotika jsou indikována jen u hospitalizovaných pacientů s vážným klinickým průběhem onemocnění. Udává se, že infekční dávka se pohybuje okolo 105 buněk. Tato dávka je silně závislá na stavu infikovaného (Kothary a Babu, 2001). Poměrně častým jevem je, že se onemocnění neprojeví typickými klinickými příznaky, přestože pacient je pozitivní na nález salmonel ve stolici. Tyto tzv. asymptomatické formy často unikají pozornosti, právě proto, že jedinec netrpí žádnými zdravotními obtížemi. S výjimkou původce S. Typhi je však nosičství jen krátkodobé. Vzácně mohou salmonely při průniku do krevního řečiště vyvolat bakteriémii a následně i sepsi. Tato forma onemocnění je u člověka nejzávažnější. Salmonelová sepse nebývá častá (asi 5 % případů), vyskytuje se především u imunodeficientních pacientů (Hohmann, 2001).

1.5 Výskyt salmonel Baktérie rodu Salmonella jsou svázány se širokým spektrem prostředí a hostitelů. Vyskytují se v prostředí (povrchová voda, rostliny, půda), ze kterých mohou být infikována volně žijící i hospodářská zvířata a následně i člověk (Rosický a kol., 1994). 7

V poslední době nabývá na významu výskyt salmonel v rostlinných produktech a nákazy spojené s konzumací těchto produktů. Zde se může jednat o kontaminaci půdy organickým hnojivem nebo závlahovou vodou (Buck a kol., 2003).

1.5.1 Výskyt salmonel u hospodářských zvířat Salmonely se vyskytují prakticky u všech druhů hospodářských zvířat včetně potravinových. Hlavním rezervoárem salmonel v České republice je hrabavá drůbež, proto jsou postupně Státní veterinární správou ČR zaváděny národní programy pro tlumení výskytu salmonel v chovech nosnic produkujících konzumní vejce (v letech 2008–2010), kuřat chovaných na maso (od roku 2009 do roku 2011), v reprodukčních chovech drůbeže (v letech 2010–2014) a nakonec v chovech krocanů a krůt (v letech 2010–2012). Ozdravné programy jsou založeny zejména na zvýšení hygieny v chovech a v omezené míře i na používání vakcín (výhradně v chovech nosnic). Nedílnou součástí těchto opatření je i průběžný monitoring výskytu salmonel v uvedených chovech (SVS ČR, 2010, dostupné z http://www.svscr.cz/index.php?art=1783). Podobná opatření byla uplatněna i v dalších zemích EU s vysokou prevalencí salmonel v chovech drůbeže. Přes tato opatření však podle výroční zprávy EFSA zatím nedošlo ke snížení záchytu pozitivních nálezů salmonel v mase brojlerů – v roce 2008 – 4,2 %, v roce 2007 – 1,8 % (EFSA, 2010a). Procentuální vyjádření pozitivních nálezů salmonel ve vzorcích konzumních vajec v České republice bylo v roce 2008 nižší než záchyt v celé EU (Česká republika – 0,4 %, EU – 0,5 %) (EFSA, 2010a). V posledních letech monitoring jak v České republice, tak v jiných zemích Evropské unie prokázal vyšší výskyt salmonel v chovech nosnic než v chovech kuřat chovaných na maso (Karpíšková a kol., 2010, EFSA, 2010b). Také chovy prasat a skotu jsou možným zdrojem salmonel, procentuální záchyt pozitivních nálezů vzorků vepřového masa je však v EU výrazně nižší než záchyt z drůbežího masa a vajec. U vepřů byl celkový pozitivní záchyt v EU v roce 2008 0,7 % (Česká republika 0,6 %). U skotu jsou pro rok 2008 tato čísla ještě nižší, průměr ze všech členských států činí 0,2 % pozitivních vzorků, v České republice ve stejném roce pouze 0,2 % (EFSA, 2010a).

1.5.2 Výskyt salmonel v potravinách Baktérie rodu Salmonella jsou příležitostně zachytávány v nejrůznějších typech potravin od živočišných produktů přes ovoce a zeleninu až po koření. V Evropské unii byl počet pozitivních nálezů v hotových výrobcích určených k přímé spotřebě velmi nízký, 8

pohybující se v desetinách procenta. Vyšší počty pozitivních nálezů jsou zjišťovány u lahůdkářských výrobků a obecně u potravin obsahujících nedostatečně tepelně opracovaná vejce, například domácí majonézy, zákusky s krémy a náplněmi a hotové pokrmy obsahující vejce. Vzácně se objevují i případy pozitivních nálezů salmonel v sýrech, většinou se jedná o sýry vyrobené z nepasterizovaného mléka nebo mléka zahřívaného pouze na nízkou teplotu. Podle EFSA nebyl takový případ v roce 2008 v České republice zaznamenán (EFSA, 2010a). Výjimkou není ani zjištění salmonel v koření, zelenině, zeleninových a ovocných salátech určených k přímé spotřebě. Celkový záchyt v EU se pohybuje v desetinách procenta, v roce 2008 0,7 % (EFSA, 2010a). Ojedinělé případy se pak vztahují na nálezy salmonel v pekařských výrobcích, čokoládě, rybách a výrobcích z nich, nepasterizovaných ovocných a zeleninových šťávách, instantních polévkách a chipsech (EFSA, 2010a, Lehmacher a kol., 1995).

1.5.3 Výskyt salmonel u lidí Salmonelóza spadá do kategorie povinně hlášených onemocnění a počty případů jsou v České republice týdně vykazovány do systému Epidat (Epidat SZÚ, dostupný z http://www.szu.cz/publikace/data/infekce-v-cr). Hlášení je povinné i v dalších státech Evropské unie, ale systémy sběru a vykazování dat se liší, a proto je porovnávání počtu hlášených případů na jednotlivé diagnózy možné jen částečně a s dobrou znalostí systému (ECDC, 2009). Hlášená nemocnost na salmonelózu je v ČR v porovnání s členskými státy EU vysoká (Obr. 1). Onemocnění zaznamenává v posledních letech klesající trend. V roce 2009 bylo hlášeno jen 10 805, zatímco v roce 2000 bylo hlášeno 40 233 případů. Jednou z možných příčin tohoto poklesu může být i méně důsledné hlášení případů. Ve studii, kterou provedly Karpíšková a Dědičová v roce 2008, nebylo ve sledovaných lokalitách nahlášeno více než 40 % případů (Karpíšková a Dědičová, 2009). Otázkou pak zůstává, jestli klesající trend výskytu salmonelóz odpovídá realitě nebo zda se na něm podílejí i změny v primární lékařské péči. Jak bylo popsáno výše, od roku 2008 probíhají v ČR ozdravné programy v chovech drůbeže, která je považována za hlavní rezervoár salmonel. Paradoxně však v letech 2008 a 2009 k výraznému poklesu tohoto průjmového onemocnění nedošlo (Epidat, SZÚ).

9

Ve většině zemí Evropské unie dochází také k mírnému poklesu počtu hlášených případů, v některých však počty zůstávají nezměněny a v některých dochází naopak k mírnému nárůstu (EFSA, 2010a).

Obr. 1: Počet případů onemocnění salmonelózou v evropských zemích v roce 2008 (EFSA, 2010a)

Přes sestupný trend výskytu salmonelóz a mnohem vyšší počet hlášených onemocnění kampylobakterózou, zůstávají salmonelózy nejvýznamnějším původcem hromadných onemocnění s epidemickou souvislostí. Jak ukazují případy epidemií po celém světě (Tab. 2), vehiklem salmonelóz může být široké spektrum potravin a toto onemocnění nelze považovat za minoritní problém.

10

Tab. 2: Epidemie ve světě v letech 2000–2006 podle vehikul a sérotypů (zdroj: Doyle a kol., 2007)

Země

Rok

USA

2000

USA Kanada Velká Británie

2000 2000 2004

hlávkový salát

USA

2004

rajčata

Velká Británie Kanada Velká Británie USA

2005 2005 2006 2006

Vehikulum

Sérotyp

pomerančový džus výhonky mungo pekařské výrobky

Enteritidis Enteritidis Enteritidis Newport Braenderup, Javiana

vejce hovězí maso

Enteritidis Salmonella spp.

čokoláda arašídové máslo

Montevideo Tennessee

Počet případů >74 >45 15 >350 515 68 155 >46 >288

1.6 Epidemie salmonelóz Tabulka 2 dokumentuje, že salmonelózy mají díky variabilitě zdrojů velký epidemický potenciál. Většina onemocnění je vyvolána pouze dvěma sérotypy (S. Enteritidis a S. Typhimurium), a proto je nesnadné odhalovat zdroje a cesty šíření onemocnění bez použití vhodných typizačních metod. Často jsou také přehlíženy epidemické výskyty, které nemají zjevný zdroj infekce a jeví se jako případy sporadické. Tyto případy mohou například nastat, pokud je vehikulem potravina s delší dobou údržnosti než týden a je distribuována v tržní síti několika regionů. Proto je důležité průběžné sledování počtu hlášených onemocnění. Důležitým nástrojem je také detailní typizace kmenů, jak bude dále popsáno v kapitole Typizační metody. Zajímavostí také je, že podle tabulky č. 2 způsobily tyto velké epidemie potraviny, které nejsou pro kontaminaci rodem Salmonella příliš typické.

1.6.1 Epidemie ve světě Velké epidemie ve světě do roku 2006 včetně zachycuje tabulka 2. V pozdějších letech stojí za zmínku především epidemie způsobené nově se šířícím monofazickým sérotypem S. 4, [5], 12:i:-. V roce 2006 způsobil tento původce 133 potvrzených případů v Lucembursku, kdy 24 osob muselo být hospitalizováno, jedna osoba zemřela. Za pravděpodobný zdroj nákazy bylo označeno vepřové maso, což odpovídá dosavadním poznatkům o tomto monofazickém kmeni (Mossong a kol., 2007).

11

Stejný původce v roce 2007 způsobil 272 případů na území 35 států USA, hospitalizovaných pacientů bylo 65 a nebylo hlášeno žádné úmrtí. Za zdroj nákazy byly označeny „pot pies“, tedy druh masového koláče (CDC, 2007). Také ve Francii v období března až května roku 2010 vypukla epidemie salmonelózy způsobená monofazickou variantou S. Typhimurium. Po celé zemi bylo identifikováno 110 případů, hospitalizováno bylo 20 pacientů a nebylo hlášeno žádné úmrtí. I v tomto případě bylo vehikulem vepřové maso, konkrétně vepřové klobásy (Bone a kol., 2010).

1.6.2 Epidemie v České republice V České republice byly v posledních letech hlášeny především epidemie svázané s konkrétní lokalitou, většinou se však nepodařilo potvrdit zdroj onemocnění. Epidemiologové

pak

na

základě

pohovoru

s postiženými

osobami

určují

tzv. pravděpodobné (suspektní) vehikulum. Podle kritérií ECDC je však u potvrzené epidemie nutné identifikovat shodné etiologické agens v potravině i u pacientů. Stravovací zařízení v současnosti nemají povinnost uchovávat vzorky potravin, a proto převážná většina epidemií v ČR zůstává dle kritérií ECDC nepotvrzena. Významné epidemie z posledních let v České republice jsou shrnuty v Tab. 3. Detailní popis vybraných epidemií je dále uveden v experimentální části práce, kapitola Epidemie. Tab. 3: Významné epidemie v České republice v posledních letech Rok

Lokalita

2008

Liberecký kraj

2009

Turnov

2009

Jablonec nad Nisou

2010

Turnov

2010

Karlovy Vary

Místo

mateřská škola

domov důchodců

Pravděpodobné vehikulum

Počet nemocných/hospitalizace

Zdroj informací

cukrářské výrobky

31/4

KHS Libereckého kraje, nepublikováno

sekundární kontaminace jídla

32/0

Prattingerová a kol., 2010

šunkové chlebíčky

15/2

závěrečná zpráva, nepublikováno

nezjištěno

51/1

Harman a kol., 2010

75/3

KHS Karlovarského kraje, 2011, nepublikováno

tatarský biftek

12

1.7 Typizační metody Rozlišení rodu Salmonella se neomezuje pouze na rozdělení do již zmíněných 2579 sérotypů. Jednotlivé sérotypy disponují dalšími charakteristikami, významnými především z hlediska epidemiologického. Pokud je jeden sérotyp natolik dominantní, jako v České republice S. Enteritidis, pak je pro epidemiologické účely nutné použít další, podrobnější typizační metody (Karpíšková a Dědičová, 2009). Charakterizaci salmonel lze provádět na úrovni fenotypové, kdy jsou zkoumány vlastnosti, které se projevují fenotypově, nebo na úrovni genotypové, kdy je pro rozlišení použito DNA nebo RNA, ať už pomocí technik PCR, nebo makrorestrikční analýzy. Genotypové metody se sice v poslední době stávají zlatým standardem, ovšem u bakteriálních rodů, které mají dobře rozvinuté techniky fenotypové typizace, zůstávají tyto metody nadále aktuálními (Dijkshoorn a kol., 2001). Pokud se jedná o klinické laboratoře, provádí se převážně identifikace kmene fenotypovými metodami (kultivace na diagnostických půdách, biochemické vlastnosti – ENTEROtest). Dále je prováděna sérotypizace a v některých případech i rezistence k antimikrobiálním látkám. Metody genotypové jsou spíše záležitostí specializovaných pracovišť a epidemiologických studií.

1.7.1 Fenotypové metody 1.7.1.1

Sérotypizace – sklíčková aglutinace

Sérotypizace je nedílnou součástí charakterizace salmonel. Je založena na reakci kmene s antiséry a vyhodnocení dle Kauffmann-White-Le Minor schématu. Vzhledem k tomu, že rod Salmonella zahrnuje 2579 sérotypů, může být někdy jejich typizace obtížná. Pokud je sérotypizováno velké množství kmenů, pak je metoda poměrně zdlouhavá a nevýhodou může být i subjektivní hodnocení výsledku reakce (Dijkshoorn a kol., 2001). V České republice se stabilně objevuje zhruba stovka sérotypů, například v roce 2008 zaznamenala Národní referenční laboratoř pro salmonely záchyt 96 různých sérotypů (Dědičová a kol., 2009). Dominantním sérotypem je již po mnoho let S. Enteritidis (89,7 %) následována S. Typhimurium (5,4 %), S. Infantis (0,8 %), S. Hadar (0,3 %) a S. Newport (0,2 %). Pořadí na prvních dvou místech se po dlouhá léta nemění, ale přesto se začíná trend ubírat v podobném směru jako v jiných zemích, kde je vedoucím sérotypem S. Typhimurium. Ještě v roce 2003 vykazoval sérotyp Enteritidis četnost 96 % a Typhimurium jen asi 1,7 % (Karpíšková a Dědičová, 2009). 13

Ostatní sérotypy vykazují četnost v desetinách až setinách procent. Studie také ukazuje prevalenci nově se objevujícího sérotypu Salmonella enterica subsp. enterica 4,[5],12:i:-, která bývá často klinickými laboratořemi zaměňována za S. Typhimurium, právě proto, že samotná sérotypizace nemusí tyto velmi podobné sérotypy spolehlivě rozlišit. NRL pro salmonely udává, že salmonel s tímto sérotypem bylo do systému Epidat v roce 2008 nahlášeno 7, kdežto NRL jich detekovala v tomto roce 34 (Dědičová a kol., 2009). Pokud se jedná o méně obvyklý sérotyp, pak již samotná sérotypizace může odhalit potenciální epidemii. Tak tomu bylo v případě sérotypu Urbana, který se objevil ve stejném období v České republice, Finsku a Lotyšsku na počátku roku 2010 (RimhanenFinne a kol., 2010). Vehikulum infekce se však nepodařilo dohledat.  Salmonella enterica subsp. enterica 4,[5],12:i:Jak již bylo řečeno, velká většina sérotypů je pohyblivých pomocí peritrichálních bičíků. Jejich tvorba je kódována dvěma různými geny – fliC (známý jako gen první bičíkové fáze) a fljB (známý jako gen druhé bičíkové fáze). Monofazické salmonely se vyznačují absencí druhé bičíkové fáze, což znamená, že v jejich genomu tento gen chybí (Moreno Switt a kol., 2009). Některé sérotypy tento gen postrádají přirozeně (např. i S. Enteritidis). Na základě detailních genetických studií bylo u S. 4,[5],12:i:- bylo prokázáno, že je úzce příbuzná se S. Typhimurium, a je tudíž s největší pravděpodobností její monofazickou variantou (Echeita a kol., 2001). Ke ztrátě fljB genu tedy došlo druhotně. Tento sérotyp je poměrně významný z klinického i epidemiologického hlediska, rychle proniká do chovů zvířat, tudíž i do potravinového řetězce. Na rozdíl od nejčastějšího sérotypu Enteritidis není S. 4,[5],12:i:- spojována s drůbeží, ale s chovy prasat (de la Torre a kol., 2003, Mossong a kol., 2007). Otázkou je, zda se opravdu šíří tak rychle nebo se začíná projevovat kvalitnější diagnostika sérotypů. Přestože se objevují v literatuře zmínky o tomto sérotypu již před rokem 1990, jedná se o ojedinělé případy (Moreno Switt a kol., 2009). Až kolem roku 2000 dochází k celosvětovému „objevu“ tohoto nového sérotypu S. 4,[5],12:i:- , a to ve Španělsku (Echeita a kol., 1999), Thajsku (Amavisit a kol., 2005) a USA (Agasan a kol., 2002). V následujících letech byly postupně z různých zemí hlášeny epidemické výskyty způsobené tímto monofazickým sérotypem. Nejnověji v USA v roce 2007, kdy se epidemie týkala 272 případů v 35 státech (CDC, 2007). 14

V Evropě byla zatím zřejmě nejvýznamnější epidemie (ve dvou vlnách) v Lucembursku v roce 2006, kdy bylo potvrzeno 133 případů, z čehož jeden byl smrtelný (Mossong a kol., 2007), a nejnověji epidemie na jaře 2010 ve Francii způsobená klobásami z vepřového masa (Bone a kol., 2010). Charakteristickými

vlastnostmi

tohoto

sérotypu

je

multirezistence

k antimikrobiálním látkám – kmeny jsou rezistentní k ampicilinu, streptomycinu, sulfonamidům a tetracyklinu. Pokud je proveden diskový difúzní test a je diagnostikována tato multirezistence, pak to může být jistým vodítkem, že se může jednat o S. 4,[5],12:i:(v případě lucemburské epidemie byl test citlivosti k antimikrobiálním látkám proveden a byla prokázána právě tato typická rezistence). Dalším typickým rysem tohoto sérotypu je reakce s přídatnými fágy pro S. Typhimurium, konkrétně fágové typy DT193 (potvrzen v Lucembursku), DT208 a U302 (de la Torre a kol., 2003). Definitivní potvrzení může poskytnout pouze PCR pro detekci genu fljB a následná absence produktu po vizualizaci na gelu. Gen fljB je tedy zodpovědný za tvorbu proteinu druhé bičíkové fáze, a pokud sérotypizace odhalí reakci antisér se somatickými antigeny 4,[5],12 a bičíkovým antigenem první fáze a následná PCR pak absenci genu fljB, jedná se s určitostí o tento nově prevalující sérotyp. 1.7.1.2

Fágová typizace

Detekce fágových typů je založena na reakci testovaného kmene s temperovanými fágy. Dle schématu poskytovaného Colindale HPA v Londýně jsou posléze odečteny reakce a je stanoven tzv. fagotyp. Metoda je využitelná především v epidemiologii, kde souhlasné fágové typy mohou odhalit epidemii. Nevýhodou metody je, že na určitém území často dominuje jeden fágový typ, tudíž by fágová typizace na možnou epidemii nepoukázala. V České republice je pouze jediná laboratoř, kde se tato metoda provádí, a tou je OLHVBP Brno. Metoda je v České republice prováděna pouze u sérotypů Enteritidis, Typhimurium a 4,[5],12:i:-. Podle některých autorů může časem dojít k nahrazení fágové typizace, jakožto fenotypové metody, molekulárními metodami, které dávají objektivnější výsledek (je eliminován subjektivní faktor při hodnocení výsledku), zatím je ale metoda považována za vysoce důležitou v typizaci rodu Salmonella (Baggesen a kol., 2010). Nespornou výhodou fágové typizace je, že určité fágové typy mohou již předem poukázat na další vlastnosti kmene – pro fágový typ S. Typhimurium DT 104 je například typická multirezistence – rezistence k ampicilinu, chloramfenikolu, streptomycinu, sulfonamidům, 15

tetracyklinu a někdy i trimetoprimu a ciprofloxacinu (Karpíšková a kol., 1999). Fágové typy DT193, DT208, U302 jsou zase typické pro monofazickou S. 4,[5],12:i:-, jak bylo popsáno výše. Pokud se jedná o méně obvyklý fágový typ pro danou oblast, je metoda poměrně rychlým vodítkem pro podezření na epidemii – například v případě epidemie v mateřské škole v Turnově na podzim roku 2009, kde etiologickým agens byla S. Typhimurium fágový typ 120 (Prattingerová a kol., 2010). I v takových případech je ovšem nutné jako konfirmaci provést makrorestrikční analýzu a následnou pulzní gelovou elektroforézu. 1.7.1.3

Rezistence k antimikrobiálním látkám

Sledování antibiotické rezistence je častou metodou charakterizace kmenů rodu Salmonella. Přestože u střevních forem salmonelóz nejsou antibiotika k terapii indikována, může antibiogram napomoci epidemiologickému šetření a upozornit na určitý sérotyp nebo fágový typ (již dříve zmíněné multirezistence).  Multirezistentní Salmonella Typhimurium DT104 Typickým příkladem multirezistentních salmonel je S. Typhimurium fágového typu 104, který se začal v Evropě objevovat na počátku 90. let. V České republice se datuje první záchyt u zvířat od roku 1994, u člověka pak od roku 1996. První epidemie vyvolaná tímto multirezistentním kmenem byla zaznamenána v roce 1998, kdy onemocněla převážná část účastníků rodinné oslavy po konzumaci bramborového salátu připraveného z domácí majonézy (Karpíšková a kol., 1999). Od doby prvních záchytů se každým rokem výrazně zvyšuje procento multirezistentních kmenů fágového typu DT104 vůči jejich citlivé formě. Ve Velké Británii bylo v roce 1990 zachyceno 259 těchto rezistentních izolátů, kdežto v roce 1996 jich bylo již 4006 (Threlfall a kol., 1997). Španělská studie z roku 1998 uvádí, že celkové procento kmenů S. Typhimurium, které vykazuje nějakou multirezistenci, je u zvířat 86 % a u lidí dokonce 92 % (Cruchaga a kol., 2001). Šišák a kolektiv zase ve své studii z roku 2006 poukazují na to, že více než polovina testovaných kmenů S. Typhimurium DT104 byla rezistentních vůči pěti a více antimikrobiálním látkám (Šišák a kol., 2006).

16

1.7.2 Genotypové metody 1.7.2.1

Plazmidová analýza

Plazmidová analýza se skládá z dílčích metod, kterými jsou plazmidové profily, plazmidový fingerprinting a detekce konkrétních genů nesených plazmidy (Lukinmaa a kol., 2004). Plazmidy u enterobaktérií, a tedy i rodu Salmonella, často představují významný faktor virulence. Schopnost plazmidů přinášet svým hostitelským buňkám výhody, často rezistenci k antimikrobiálním látkám, je nezpochybnitelná (Holmberg a kol., 1984, Chu a kol., 2008). Zjišťování počtu a velikosti plazmidů u rodu Salmonella jako jeden z vhodných nástrojů epidemiologického šetření již uvádějí ve svých studiích mnozí autoři (Brunner a kol., 1983, Holmberg a kol., 1984, Threlfall a kol., 1990). Ve všech studiích šlo o detailnější rozlišení epidemických kmenů sérotypu Typhimurium. V České republice je metoda plazmidových profilů také úspěšně využívána k subtypizaci významných sérotypů, jak popisují například Karpíšková a kol. ve studii zaměřené na sérotyp Typhimurium (Karpíšková a kol., 2003) a Rychlík a kol. na sérotyp Enteritidis (Rychlík a kol., 2000). Metoda plazmidových profilů umožňuje vizualizovat na gelu počet a velikost plazmidů pomocí porovnání s plazmidem o známé velikosti (standard), čímž můžeme potvrdit nebo vyvrátit klonální shodu u nositelských kmenů. Nejčastější metodou pro extrakci plazmidové DNA je metoda alkalické lýze dle Kado a Liu (Kado a Liu, 1981), pro kterou již existují komerční sady (Qiaprep Spin Miniprep Kit, Qiagen, Německo). Extrahovaná plazmidová DNA je pak využitelná i pro další typizační techniky, například restrikční štěpení plazmidové DNA. 1.7.2.2

Aplikace PCR

Metoda polymerázové řetězové reakce, zavedená v roce 1985, přinesla obrovské výhody vyplývající ze základní charakteristiky metody – amplifikace požadovaného úseku DNA in vitro, tedy bez nutnosti použití klonovacích vektorů. PCR technika tedy využívá cyklicky se opakující enzymovou syntézu nových řetězců požadovaného úseku dsDNA ve směru 5´-3´za účasti DNA-polymerázy (Šmarda a kol., 2008). Metoda je výhodná, pokud se potřebujeme zaměřit na konkrétní oblast genomu (Lukinmaa a kol., 2004). Aplikací vycházejících z této techniky se využívá i při identifikaci a typizaci rodu Salmonella. Pro identifikaci slouží PCR prováděná s rodově

17

specifickými primery, které nám ověří přítomnost nebo nepřítomnost salmonel ve zkoumaném vzorku (Malorny a kol., 2004). Pro typizaci je možné využít metodu PCR například pro sledování genů bičíkových antigenů první i druhé fáze fliC a fljB (McQuiston a kol., 2004). Po provedení PCR můžeme s jistotou říci, jestli se jedná o monofazický kmen. Je to tedy metoda paralelně využitelná pro určení sérotypu, pro určení některých sérotypů je dokonce možné využít pouze metodu PCR – genosérotypizace (Cardona-Castro a kol, 2009). Pro detailnější typizaci se využívá tzv. multiplex PCR, kdy se v jedné reakční směsi nachází více párů primerů, je tedy v jedné reakci detekován větší počet genů (Šmarda a kol., 2008). Pomocí multiplex PCR se dá například u testovaného kmene ve dvou PCR postupně zjistit somatická skupina (variabilní genové regiony rfbJ a wzx) a následně pak sérotyp (variabilní genové regiony fliC, fljB, wcdB a sdf-I sekvence) (Cardona-Castro a kol., 2009). Této aplikace se také například využívá při subtypizaci S. Typhimurium za použití sad primerů mířených na mobilní sekvence genomu, především pak profágovou DNA. Tato metoda by mohla nahradit časově náročnou makrorestrikční analýzu s následnou PFGE (Rychlík a kol., 2008). Uvedená metoda byla použita pro detailní analýzu vybraných kmenů v této práci a je popsána v kapitole Materiál a metody. 1.7.2.3

Makrorestrikční analýza

Makrorestrikční analýza je metoda založená na analýze restrikčních fragmentů o velikosti desítek kilobází až několika megabází (Šmarda a kol., 2008). Pomocí této metody je tedy možné zobrazit najednou celý bakteriální genom v několika fragmentech. Aby se předešlo

poškození

chromozomální

DNA, jsou

buňky imobilizovány

v agarózových bločcích ještě před lýzou (Lukinmaa a kol., 2004). Získané fragmenty je pak nutné rozdělit, k čemuž se využívá speciální elektroforézy v pulzním poli. Gel je vystaven elektrickému poli s měnícím se směrem. V závislosti na této změně přizpůsobují putující molekuly DNA svoji orientaci. Čím větší molekula DNA je, tím pomaleji je schopná se reorientovat, proto je pak její přímočarý pohyb v gelu pomalejší. Nakonec tedy dostáváme tzv. makrorestrikční profil (Šmarda a kol., 2008). Takový profil je pak u epidemií způsobených salmonelami často využívaným

parametrem. V některých

případech, kdy není možné sérotyp zcela jednoznačně určit pomocí sklíčkové aglutinace, lze na základě těchto profilů přiřadit kmen k pravděpodobnému sérotypu (Zou a kol., 2010). Makrorestrikční analýza se využívá zejména pro potvrzení klonální shody (identity) kmenů, získaných v pravděpodobné epidemické souvislosti (Ridley a kol., 1998). Tato 18

metoda je dnes v různých obměnách v restrikčních enzymech považována za zlatý standard při subtypizaci baktérií (Lukinmaa a kol., 2004). Makrorestrikční analýza je určena k detailním studiím kmenů salmonel, nepatří mezi rutinně prováděné metody. 1.7.2.4

Sekvencování DNA

Při stanovení sekvence DNA získáváme znalost primární struktury, tedy pořadí nukleotidů v DNA. Tato metoda dokáže podat zprávu o aminokyselinové sekvenci proteinů, regulaci tvorby a také odhalit mutace (Šmarda a kol., 2008). V dnešní době se pro stanovení sekvence DNA využívají dvě různé metody objevené přibližně ve stejnou dobu, a to metoda chemická (Maxam a Gilbert, 1977) a metoda enzymová (Sanger a kol., 1977). Sekvencování velmi urychlují dnes používané automatické sekvenátory (Šmarda a kol., 2008). Sekvencování genomu pak umožňuje studium tandemových repetic (VNTR) a sekvencování tzv. „housekeeping“ genů pak zpřístupňuje studium multilokusových sekvencí (MLST) (Lukinmaa a kol., 2004). U rodu Salmonella se tato metoda používá buď k sekvencování celého genomu (Parkhill a kol., 2001), plazmidů (Sherburne a kol., 2000, Chu a kol., 2008), nebo kratších úseků DNA, které jsou důležité pro rozlišení kmenů se specifickými vlastnostmi.

19

Cíl práce Cílem práce bylo sledovat pomocí typizačních metod epidemické souvislosti u souboru kmenů salmonel získaných v období od listopadu 2009 do února 2011. Dílčí cíle byly následující: Typizace izolátů získaných z humánních, zvířecích a potravinových zdrojů pomocí fenotypových a genotypových metod. Zhodnocení charakteristik kmenů rodu Salmonella na území České republiky a doporučení vhodného typizačního schématu pro různé kmeny rodu Salmonella. Využití vybraných metod a vyhodnocení jejich rozlišovací schopnosti při šetření epidemií salmonelóz.

20

2 Materiál a metody 2.1 Materiál 2.1.1 Použité mikroorganizmy  Sbírkové kmeny Kontroly pro fágovou typizaci – S. enterica subsp. enterica Enteritidis PT1, PT8, S. enterica subsp. enterica Typhimurium DT1, DT27, Laboratory of enteric pathognes, HPA Colindale, Velká Británie Kontrola pro rezistenci k antimikrobiálním látkám – Escherichia coli CCM 3954, CLSI Makrorestrikční analýza – Salmonella enterica subsp. enterica Braenderup H9812 (CCM 7769), Česká sbírka mikroorganismů  Analyzované kmeny v této práci Kmeny použité v této práci pocházely z archivu SZÚ Brno nebo byly zaslány k identifikaci a typizaci z klinických laboratoří (OOVZ), veterinárních laboratoří a laboratoří vyšetřujících potraviny v období listopad 2009 – únor 2011. Soubor analyzovaných kmenů činil 970 salmonel, jejich přehled uvádí Tab. 4, detaily původu zvířecích a potravinových kmenů pak tabulka Tab. 5a-f Tab. 4: Počty analyzovaných kmenů podle původu a sérotypu

Původ kmenů

Sérotyp

Počet kmenů

Humánní

Enteritidis Typhimurium jiný

347 181 42

Zvířecí

Enteritidis Typhimurium jiný

279 51 29

Potraviny

Enteritidis Typhimurium jiný

18 6 17

Celkem

970

21

Tab. 5a: Původ a počty analyzovaných zvířecích izolátů S. Enteritidis

Původ zvířecích izolátů

Počet kmenů

drůbež hygiena neznámé prase ostatní

256 9 2 12

Celkem

279

Tab. 5b: Původ a počty analyzovaných potravinových izolátů S. Enteritidis

Původ izolátů z potravin

Počet kmenů

drůbeží maso palačinkové těsto

10 2

lahůdkový salát vejce bageta salám trvanlivý mléko z automatu

2 1 1 1 1

Celkem

18

Tab. 5c: Původ a počty analyzovaných zvířecích izolátů S. Typhimurium

Původ zvířecích izolátů

Počet kmenů

prase drůbež holub tele gepard ostatní

15 10 7 3 2 14

celkem

51

Tab. 5d: Původ a počty analyzovaných potravinových izolátů S. Typhimurium

Zdroj izolátů z potravin

Počet kmenů

mléko z automatu zákusek

5 1

celkem

6

Tab. 5e: Původ a počty analyzovaných zvířecích izolátů ostatních sérotypů

Původ zvířecích izolátů

Počet kmenů

drůbež prase kočka

15 13 1

celkem

29

22

Tab. 5f: Původ a počty analyzovaných potravinových izolátů ostatních sérotypů

Původ izolátů z potravin

Počet kmenů

drůbeží maso vinná klobása mléko z automatu zákusek proteinová tyčinka

10 3 2 1 1

celkem

17

2.1.2 Pomůcky Jednorázové plastové pomůcky Petriho misky o průměru 90 mm (P-lab, Česká republika) kultivační kličky (P-lab, Česká republika) špičky na pipety (Thermo, Finsko) zkumavky typu Eppendorf o objemu 1,5 ml a 0,2 ml (Kartell, Španělsko) zkumavky typu Falcon (Kartell, Španělsko) Běžné laboratorní sklo (zkumavky, kádinky, skleněné tyčinky, odměrné válce a baňky, lahve na roztoky a média, podložní sklíčka) Další laboratorní pomůcky (pinzety, nůžky, skalpely, vatové tampony)

2.1.3 Kultivační média BGA – Brillant green agar (Oxoid, Velká Británie) XLD agar – xylóza lyzin deoxycholát agar (Oxoid, Velká Británie) Rambach agar (Merck, Německo) Mueller-Hinton agar (Oxoid, Velká Británie) Nutrient bujón – 10 g Nutrient bujónu (Becton, Dickinson and company, USA), 4,25 g NaCl, 500 ml destilované vody Nutrient agar – 10 g Nutrient bujónu, 6,5 g Nutrient agaru (Becton, Dickinson and company, USA), 4,25 g NaCl, 500 ml destilované vody

23

Nutrient agar zvlhčený nutrient bujónem SS bujón – Nutrient bujón a destilovaná voda v poměru 1:1

2.1.4 Chemikálie a roztoky 1M Tris (pH 8) – 121,14 g Tris rozpustit v 800 ml destilované vody, pomocí neředěné HCl docílit požadovaného pH a doplnit vodou do objemu 1000ml 0,5 M EDTA (pH 8) – 186,12 g EDTA rozpustíme v 800 ml destilované vody, přidáváme pevný NaOH na požadované pH a doplníme vodou do 1000 ml 20% SDS (sodium dodecyl sulfát) – 5 g SDS rozpustit ve 20 ml destilované vody Proteináza K (20 mg/ml) – 100 mg proteinázy K rozpustit v 5 ml sterilní deionizované vody Ethidium bromid (10 mg/ml) – 1 g EtBr rozpustit do 100 ml vody TE pufr (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8) – 10 ml 1M Tris smíchat s 2 ml 0,5 M EDTA a doplnit do 1000 ml sterilní neionizovanou vodou CSB – cell suspension buffer (100 mM Tris, 100 mM EDTA, pH 8) – 10 ml 1 M Tris, 20 ml 0,5 EDTA a doplnit do 100 ml sterilní deionizovanou vodou CLB – cell lysis buffer (50 mM Tris, 50 mM EDTA, pH 8 + 1 % Sarcosylu) – 50 ml 10% Sarcosylu, 25 ml 1 M Tris, 50 ml 0,5 M EDTA, doplnit do 500 ml sterilní neionizovanou vodou 2% agaróza pro přípravu PFGE bločků – 0,2 g agarózy pro PFGE, 9,5 ml 10x TE pufr, 0,5 ml 20% SDS Destilovaná voda – připravovaná v laboratoři SZÚ Brno Fyziologický roztok – připravovaný v laboratoři SZÚ Brno Chlorid sodný (Penta, Česká republika)

24

2.1.5 Komponenty pro PCR a gelovou elektroforézu Sterilní PCR voda – připravovaná v laboratoři SZÚ Brno Qiagen multiplex PCR master mix 1000 (Qiagen, Německo) - HotStarTaq DNA polymeráza, Qiagen Multiplex PCR pufr (6 mM MgCl2 ), dNTP Mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Q-Solution, voda Primery (Generi Bitech, Česká republika) DNA marker (Top-Bio, Česká republika) Agaróza pro elektroforézu (Top-Bio, Česká republika) Agaróza pro PFGE (Lonza, USA) Nanášecí pufr Ethidium bromid – 1 g do 100 ml vody

2.1.6 Ostatní substance Antibiotické disky (Oxoid, Velká Británie) Temperované bakteriofágy v ředění 10-2 až 10-3 (Laboratory of enteric pathogens, HPA Colindale, Velká Británie) Antiséra (Denka Seiken, Japonsko, BioRad, Francie)

2.1.7 Identifikační sady Wellcolex (Oxoid, Velká Británie) – součástí sady jsou 2 typy reagens, kartičky pro provedení reakce a vyhodnocovací schéma

2.1.8 Přístroje Termostat (Laboratorní přístroje Praha, Česká republika) Nastavitelné mikropipety (Finnpipette, Labsystems Thermo Fisher Science, USA) Multikanálová mikropipeta (Biohit, Finsko) Laminární box (Jouan, USA) 25

Termocykler PTC200 (MJ Research, USA) Spektrofotometr (Implen, Německo) Vortex (Biosan, USA) Centrifuga s třepáním (Hermle, Německo) Pikocentrifuga (Qualitron, Jižní Korea) Kahan (Gasprofi, WLD-TEC, Německo) Transiluminátor (Ultra-Lum, USA) Dispenzor antibiotických disků (Oxoid, Velká Británie) Elektroforetická vana pro provedení PFGE (Bio-Rad, USA) Stomacher (Vezola, Česká republika) Vodní lázeň Vodní lázeň s třepáním (N-Biotek, Jižní Korea) Suchá lázeň (Major science, USA) Mikrovlnná trouba (Trendline, Kanada) Autokláv (Sanyo, Japonsko) Digitální váha (Sartorius, Německo) Digitální fotoaparát (Canon, Japonsko) Lednice (Electrolux, Česká republika) Hlubokomrazící box (Dairei, Dánsko) Zařízení pro elektroforézu (Schoeller, Česká republika)

26

2.2 Metody 2.2.1 Fenotypové metody 2.2.1.1

Kultivace kmenů na jednotlivých médiích

Kmeny byly vyočkovávány z transportního média, v případě monitoringu přímo ze vzorků potravin. Základním médiem pro manipulaci s kmeny bylo BGA médium, při potřebě přečištění vzorku bylo nutné použít XLD agar nebo chromogenní Rambach agar.  Kultivace na BGA médiu Agar s briliantovou zelení slouží k rozlišení salmonel od koliformních baktérií, které se na neutrálních médiích mohou jevit podobně. Rozlišení je umožněno na základě využití laktózy, která je v médiu obsažena. Rod Salmonella laktózu nevyužívá, médium je tedy růžové s průhlednými koloniemi. Naopak většina koliformních baktérií laktózu využívá a médium se barví do žlutozelena. BGA bylo používáno jako základní médium pro další zpracování kmenů. Podmínky kultivace: 24 hodin při 37 °C  Kultivace na XLD médiu Vyočkování na XLD médium bylo prováděno souběžně s očkováním na BGA médium. XLD agar je selektivní díky detekci produkce sirovodíku. Suspektní kolonie jsou průsvitné s černým středem. Vyočkování na XLD bylo použito pouze u vybraných kmenů. Podmínky kultivace: 24 hodin při 37 °C  Kultivace na Rambach agaru Vyočkování na Rambach agar jsme používali při nutnosti přečištění kmenů. Rambach agar je chromogenní půda, rod Salmonella na něm roste v pivoňkově růžových koloniích. Koliformní baktérie na tomto médiu vykazují růst v modrých nebo vínových koloniích. Podmínky kultivace: 24 hodin při 37 °C

27

2.2.1.2

Sérotypizace

 Latexová aglutinace – Wellcolex Identifikační sada Wellcolex (latexová aglutinace) je používána pro potvrzení kultivace na selektivních médiích a pro zařazení kmenů rodu Salmonella do určité séroskupiny (pouze A, B, C, D, E, G a Vi antigen) (Oxoid, 2007). Urychluje zařazení kmenů do skupin, a tím usnadňuje sérotypizaci. Metoda byla používána pouze v případě, že přijatý kmen byl zařazen pouze jako Salmonella enterica subsp. enterica, u netypicky se chovajících kmenů a při dourčování kmenů z monitoringu. Metoda byla prováděna podle pokynů výrobce. Metoda je založena na postupném smíchání kultury s dvěma reagens a fyziologickým roztokem a určení zabarvení aglutinace pomocí vyhodnocovací tabulky.  Sklíčková aglutinace Sklíčková aglutinace byla prováděna po předběžném určení do séroskupiny pomocí identifikační sady Wellcolex. Metoda byla provedena u kmenů, které byly určené pouze do poddruhu. Aglutinace byla prováděna na podložním skle smícháním kultury a antiséra. Antiséra jsou somatická a bičíková. Pro prvotní určení se provede aglutinace pomocí polyvalentního antiséra a pak se pokračuje dle schématu Grimont a Weill (dříve Kauffmann-White-Le Minor schéma) v rámci dané séroskupiny. U některých kmenů bylo třeba provést test motility na NA médiu zvlhčeném NB médiem. V takových podmínkách dojde k „rozhýbání“ bičíků, které pak mohou lépe reagovat s bičíkovými antiséry. Pokud některá antiséra nebyla v naší laboratoři dostupná, a kmen tudíž nebylo možno určit, byl daný kmen zaslán na určení do Národní referenční laboratoře pro salmonely na SZÚ v Praze. 2.2.1.3

Fágová typizace

Fágová typizace byla prováděna dle metodiky HPA (Colindale, UK), (Anderson a kol., 1977, Ward a kol., 1987) Fágová typizace je metoda, při které se využívá testovací sady fágů a jejich interakcí s testovaným kmenem rodu Salmonella. Metoda byla prováděna pouze u kmenů určených jako sérotypy Enteritidis, Typhimurium a 4,[5],12:i. Zásobní fágy v uvedeném ředění byly vytitrovány do pracovních roztoků. Kultura vypěstovaná na BGA médiu se naočkovala do zkumavky se 4 ml živného bujónu (NB) a třepala se v termostatu při 37 °C. V případě sérotypu Enteritidis probíhá třepání 105 minut, v případě sérotypu Typhimurium a 4,[5],12:i je to jen 90 minut. Po této době byla bakteriální suspenze nalita na misku 28

s živným agarem (NA), přebytečné množství bylo odsáto a po vstřebání byly na misku multikanálovou pipetou naneseny testovací fágy v pracovním ředění. Ke každé sadě vzorků byly zařazeny kontrolní kmeny, pro S. Enteritidis kmeny s fágovým typem PT1 a PT8, pro S. Typhimurium fágové typy DT1 a DT27 a pro S. 4,[5],12:i DT193, DT208 a U302. Ředění bakteriofágů od výrobce – 10-2-10-3 , pracovní ředění pak RTD – routine test dilution (10 µl do 900 µl SS bujónu). Misky byly uloženy na 24 hodin do 37 °C a druhý den byl proveden odečet reakcí a určení fágového typu podle příslušného schématu. Počet testovaných fágů v sadě pro S. Enteritidis byl 17 Počet testovaných fágů v základní sadě pro S. Typhimurium byl 30 a v přídatné sadě 7 Reakce – confluent lysis (CL), semi-confluent lysis (SCL), opaque lysis (OL), +++ 81-100 plak, ++ 21-80 plak, + 1-20 plak, – bez reakce 2.2.1.4

Rezistence k antimikrobiálním látkám – disková difúzní metoda

Metoda byla prováděna podle metodiky Clinical and laboratory standards institute (CLSI, 2006). U vybraných kmenů bylo prováděno testování antibiotické rezistence metodou diskové difúze. Každý z testovaných kmenů byl očkován do fyziologického roztoku a byla vytvořena suspenze o denzitě cca 0,5 stupně McFarlanda. Tato suspenze byla inokulována přelivem na povrch předsušených misek s Mueller-Hinton agarem. Přebytek suspenze byl odsát a na misky byly pomocí automatických dispenzorů rozmístěny antibiotické disky. Misky byly uloženy do termostatu a při teplotě 37 °C inkubovány po dobu 24 hodin. Druhy testovaných antimikrobiálních látek jsou uvedeny v tabulce 6. Po inkubaci byly změřeny průměry zón kolem disků a dle interpretačních kritérií pro baktérie čeledi Enterobacteriaceae byla určena citlivost nebo rezistence kmenů k daným látkám.

29

Tab. 6: Testované antimikrobní látky (Zdroj: Clinical and laboratory standards institute, 2006)

Antibiotikum

Zkratka Koncentrace R (mm)

I (mm)

S (mm)

Ampicilin Amoxycilin/klavulanová kys. Cefotaxim Chloramfenikol Streptomycin

AMP AMC CTX C S

10 µg 30 µg 30 µg 30 µg 10 µg

≤ 13 ≤ 13 ≤ 14 ≤ 12 ≤ 11

14-16 14-17 15-22 13-17 12-14

≥ 17 ≥ 18 ≥ 23 ≥ 18 ≥ 15

Kanamycin Gentamycin Neomycin Apramycin Sulfonamidy Sulfomethoxazol/trimetoprim

K CN N APR SU SXT

30 µg 10 µg 30 µg 15 µg 300 µg 25 µg

≤ 13 ≤ 12 ≤ 12 ≤ 11 ≤ 12 ≤ 10

14-17 13-14 13-16 12-14 13-16 11-15

≥ 18 ≥ 15 ≥ 17 ≥ 15 ≥ 17 ≥ 18

Trimetoprim Tetracyklin Nalidixová kyselina Ciprofloxacin Enrofloxacin Colistin

W TE NA CIP ENR CT

5 µg 30 µg 30 µg 5 µg 5 µg 10 µg

≤ 10 ≤ 14 ≤ 13 ≤ 15 ≤ 16 ≤8

11-15 15-18 14-18 16-20 17-19 9-10

≥ 16 ≥ 19 ≥ 19 ≥ 21 ≥ 20 ≥ 11

Pozn.: R – zóna rezistence, I – intermediární zóna, S – zóna citlivosti

2.2.2 Genotypové metody 2.2.2.1

Aplikace PCR

Primery použité pro všechny reakce PCR shrnuje tabulka 7, reakční směsi pro všechny aplikace PCR pak tabulka 8 a reakční podmínky tabulka 9.

30

Tab. 7: Primery použité pro všechny aplikace PCR Detekovaný gen fljB

fliC

allB

SGI1

rrtT

gipA

spvB

bim2

gp36

sopE

artA

STM2697

hldD

gtrA

Primery

Sekvence

Reakce

Sense 56

TGTCGATAACCTGGATGACACAGG

Flj4

GGCATCCAGTGTAGTACCATTATC

fliC-i F

TACGCCAAAGTTACCGTTACGG

fliC-i R

AATCATCGCCTACCTTAACTGCTAA

allB F

TTTCGCGACGTTAATGACT

multiplex PCR

allB R

TCAAACATGACGTCCATGC

(triplex 1)

SGI1 F

TTACCGGCGAGTTTACCTC

SGI1 R

TCTGCTTGTGTCTTTGGGT

rrtT F

CAACGCTCAAGTTCATCTTC

rrtT R

AAAGGTGAGCTTGGTGCTC

gipA F

CCTTTGCTAACTTCTTCGC

multiplex PCR

gipA R

GGAGTCGGGCTACCTTTAAG

(triplex 2)

spvB F

CGGTTATAGAAGAGCTCCTGT

spvB R

CCGGTATACGACTCTGTGATC

bim2 F

CCGGTAATGGACTCATTCAG

bim2 R

ATCACCATCGAACTGGTTG

gp36 F

GACTAAAGCGGGATACCGTA

multiplex PCR

gp36 R

GGGCTGTCTCTTTCAGCAG

(triplex 3)

sopE F

CCCGTGAAGCTATACTATCG

sopE R

GTTGGAATTGCTGTGGAGT

artA F

TCTGGTTATGCAAGTGCTGT

artA R

TCTGCACGGATTCTGTATCTA

STM2697 F ACGAAAAAGCTCAGTAGTGC STM2697 R TAGTCTATAGCGCCGTTCTC hldD F

CGCAGTAGAGACATGGATGTA

hldD R

CTGGCGGTACAGCTTTATG

gtrA F

GCGCGTTTCACCTTTAATG

gtrA R

TGGAATAGATAAAGCCGCA

detekce fljB

Velikost produktu (bp)

Literatura

595-750

McQuiston a kol., 2004

304

Cardona-Castro a kol., 2009

560

Rychlík a kol., 2008

detekce fliC

438

216

450

349

206

425

348

263

multiplex PCR

394

(triplex 4) 280

175

Tab. 8: Reakční směsi pro použité aplikace PCR

Komponenta PCR voda Qiagen master mix Primery (50µM) DNA

fljB (μl)

fliC (μl)

multiplex PCR (μl)

7,3

7,3

7

10

10

10

0,35 2

0,35 2

1 2

Pozn. Složení master mixu je uvedeno v kapitole Materiál a metody

31

Tab. 9: Reakční podmínky pro použité aplikace PCR

Krok 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

fljB

fliC

95 ˚C/15 min 94 °C/30 s 60 °C/90 s 72 °C/60 s 28x kroky 2-4 72 °C/10 min 10 °C

95 ˚C/15 min 94 °C/30 s 60 °C/90 s 72 °C/60 s 28x kroky 2-4 72 °C/10 min 10 °C

multiplex PCR 95 ˚C/15 min 94 °C/30 s 60 °C/90 s 72 °C/60 s 28x kroky 2-4 72 °C/10 min 10 °C

2.2.2.1.1 Sérotypizace pomocí PCR – detekce genu fljB a fliC Detekce genů fljB a fliC byla prováděna v případě podezření na výskyt monofazických a jinak defektních salmonel, kdy je nepřítomnost PCR produktu hlavním důkazem chybějící druhé, respektive první bičíkové fáze.  Izolace bakteriální DNA Z bakteriálních kultur byla izolována DNA metodou lýzy varem, hrubý lyzát sloužil jako templátová DNA pro PCR. Do zkumavky typu Eppendorf o objemu 200 µl bylo pipetováno 50 µl PCR vody a byla suspendována jedna kolonie testovaného kmene. Izolace DNA probíhala v suché lázni při teplotě 100 °C po dobu 20 minut. Poté byly zkumavky stočeny na pikocentrifuze po dobu 5 minut. K provedení PCR byl použit supernatant.  Polymerázová řetězová reakce – detekce genu fljB nebo fliC Pro provedení PCR byl připraven master mix (Tab. 8), reakční objem činil 18 µl master mixu a 2 µl templátové DNA. Po smíchání reakčních komponent se mikrozkumavky vložily do termocykleru, kde proběhl reakční cyklus (Tab. 9). Po proběhnutí PCR byly produkty rozděleny pomocí elektroforézy v 1,5% agarózovém gelu, 45 minut při napětí 120 V a 120 mA. Pro určení velikosti produktu byl použit hmotnostní standard 155-970 bp. Vizualizace produktů byla provedena UV světlem po obarvení v roztoku Et bromidu.

32

2.2.2.1.2 Subtypizace sérotypu Typhimurium pomocí profágové multiplex PCR Typizace byla prováděna podle protokolu Výzkumného ústavu veterinárního lékařství v Brně (Rychlík a kol., 2008).  Izolace DNA Stejně jako u detekce genu fljB byla používána nepřečištěná DNA připravená podle postupu uvedeného výše. Pro provedení PCR byl připraven master mix (Tab. 8) v objemu 18 µl+2 µl DNA na jeden vzorek. Vzhledem k tomu, že se jedná o multiplex PCR, na každý vzorek je třeba sada 4 primerů (Tab. 7) a to v jednotlivých mixech. Po smíchání reakčních komponent se mikrozkumavky vloží do cykleru a nechá se proběhnout PCR za definovaných podmínek (Tab. 9). Produkty se rozdělí opět pomocí gelové elektroforézy, stejně jako u předchozích aplikací PCR.  Výpočet kódu V multiplex PCR typizaci dle Rychlíka je výsledek odečítán pomocí binárního kódu, kdy pozitivní reakce má hodnotu 1 a negativní reakce hodnotu 0. Každý kmen je testován ve čtyřech různých reakčních směsích, každá z nich může dát maximálně tři pozitivní reakce. Každý kmen je tedy charakterizován dvanáctimístným kódem složeným z číslic 1 a 0. Pro jednodušší manipulaci s kódy jsou pak tyto převedeny do čtyřmístného kódu, kdy první pozici v tripletu je přiřazena hodnota 1, druhé 2 a třetí 4. Těmito hodnotami jsou původní triplety násobeny a dostáváme požadovaný čtyřmístný kód (příklad – původní binární kód je 101 101 000 000, po převedení dostáváme 1x1 + 0x2 + 1x4=5, násobení provedeme u zbylých tří tripletů a dostáváme konečný kód 5500 (Rychlík a kol., 2008). Postup pro získání čtyřmístného kódu je patrný z Obr. 2 a-b.

33

Obr. 2a: Produkty multiplex PCR, jejich rozdělení pomocí gelové elektroforézy a vzor postupu pro získání kódu (první dva triplexy)

Obr. 2b: Produkty multiplex PCR, jejich rozdělení pomocí gelové elektroforézy a vzor postupu pro získání kódu (druhé dva triplexy)

34

2.2.2.2

Makrorestrikční analýza a pulzní gelová elektroforéza (PFGE)

Pulzní gelová elektroforéza byla prováděna dle protokolu Pulsenet Europe a byla prováděna pro konfirmaci suspektních epidemických kmenů.  Příprava pracovních roztoků Roztoky byly připraveny dle popisu v kapitole Kultivační média a roztoky.  Příprava PFGE bločků z bakteriální kultury Ve 2 ml CSB jsme připravili suspenzi testovaných kmenů z neselektivního Mueller-Hinton agaru, kultury kultivované 14-18 h, suspenze by měla mít zákal McF=2, což jsme ověřili měřením optické denzity při 595 nm, A=1,3-1,4. Do mikrozkumavek typu Eppendorf jsme pipetovali 20 µl proteinázy K (20 mg/ml) a přidali jsme 400 µl připravené buněčné suspenze a opatrně promíchali pipetou, k suspenzi jsme přidali 400 µl 20% SDS agarózy udržované při 55 °C a opakovaným nasátím promíchali. Směs jsme rychle nanesli do tvořítek. Bločky jsme nechali tuhnout 5 minut v ledničce.  Lýza buněk v agarózových bločcích Připravili jsme příslušné množství lyzačního pufru, skládajícího se z CLB a proteinázy K (20 mg/ml), na jeden vzorek je třeba 5 ml CLB a 25 µl proteinázy K. Připravený pufr jsme rozplnili po 5 ml do zkumavek a ztuhlé bločky do těchto zkumavek vložili, inkubovali jsme 2 hodiny při 55 °C v třepané vodní lázni při 120 rpm.  Promývání agarózových bločků Sterilní destilovanou vodu a TE pufr jsme předehřáli na 50 °C, po ukončení lýzy jsme vyměnili lyzační pufr za destilovanou vodu a vzorky inkubovali při pokojové teplotě po dobu 10 minut za stálého třepání při 400 rpm. Krok jsme zopakovali. Destilovanou vodu jsme vyměnili za TE pufr, vzorky nechali třepat opět při pokojové teplotě 15 minut. Krok jsme zopakovali čtyřikrát.  Restrikční štěpení DNA Připravili jsme roztok pro restrikční štěpení, na jeden vzorek jsme smíchali 79,5 µl sterilní destilované vody, 10 µl reakčního pufru, 10 µl BSA a 0,5 µl 50U/ µl enzymu XbaI. Ke každé sadě vzorků bylo nutno připočítat kontrolní kmen S. Braenderup H9812, který se vkládá do gelu do každé 5. jamky. Z bločku jsme odřízli řez široký 1–2 mm a ten umístili 35

do mixu restrikčního enzymu, inkubovali jsme 3 hodiny při 38,5 °C. Po skončení štěpení jsme vyměnili reakční směs za 100 µl 0,5x TBE a inkubovali 10 minut při pokojové teplotě. Bločky jsme osušili, umístili na hřebínek a nechali 30 minut zaschnout. Pak jsme hřebínek vložili do formy a opatrně zalili agarózu (1% gel, 1 g agarózy do 100 ml 0,5xTBE).  PFGE Vanu jsme naplnili 2,5 litry 0,5x TBE pufru, chlazení nastavili na 14 °C a rychlost proudění pufru na 70.  Nastavení podmínek elektroforézy: Initial time 2,2 s Final time 54,2 s Start ratio 1 Napětí 200 V (6 V/cm) Čas 22 h  Barvení gelu a vizualizace produktů Barvící roztok – 40 µl EtBr (10 mg/ml) a 400 ml chlazené destilované vody. Gel barvíme po dobu 30 minut v chladničce a posléze 2 minuty odbarvujeme v chlazené destilované vodě.  Vyhodnocení výsledků Pulzní profily byly stanoveny vizuálním porovnáním (pokud se jednalo o obvyklé pulzotypy) nebo pomocí software BioNumerics (koeficient Dice, typ dendrogramu UPGMA, optimalizace 0,2 %, tolerance pozic bandů 1,2 %). Typizace byla prováděna podle předem navrženého schématu (Obr. 3).

36

Obr. 3: Navržený postup analýzy kmenů dle sérotypu. Pozn. ATB rezistence, PCR pro fljB a fliC a PFGE byly provedeny jen u vybraných kmenů

37

3 Výsledky 3.1 Kultivace Všechny vyšetřované kmeny rostly na základním médiu BGA a XLD, kontaminované kmeny byly přečištěny na médiu Rambach. Všechny kmeny vykazovaly charakteristické rysy pro růst rodu Salmonella na daném médiu.

3.2 Typizace kmenů S. enterica subsp. enterica sérotyp Enteritidis 3.2.1 Fágová typizace Následující tabulky a grafy uvádějí počty jednotlivých zjištěných fágových typů zvlášť pro humánní kmeny (Tab. 10 a Obr. 3), zvířecí kmeny (Tab. 11 a Obr. 4) a kmeny z potravin (Tab. 12 a Obr. 5). Obrázky 4–6 ukazují zastoupení fágových typů u obou sérotypů rozdělených podle původu izolátů.

38

Tab. 10: Počet a procentuální zastoupení zjištěných fágových typů u humánních kmenů S. Enteritidis (n=347)

Fágový typ

Počet

Procentuální zastoupení (%)

8 4b 13a 56 6c 1b 21c 13 2 1 4 22 RDNC 1d 3 6b 9b 11 15 23 24a 35 37

220 34 26 24 7 6 5 4 3 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

63,4 9,8 7,5 6,9 2 1,8 1,4 1,2 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1 <1

Pozn. RDNC – reacts but does not conform (nezařaditelná reakce)

Obr. 4: Zastoupení jednotlivých fágových typů humánních kmenů S. Enteritidis

39

Tab. 11: Počet a procentuální zastoupení zjištěných fágových typů u zvířecích kmenů S. Enteritidis (n=279)

Fágový typ

Počet

Procentuální zastoupení (%)

8

121

43,4

6c

78

28

4b

24

8,6

21c

17

6,1

1b

8

2,9

23

8

2,9

6

4

1,4

U

3

1,1

3

2

<1

20a

2

<1

2

1

<1

4

1

<1

5

1

<1

6a

1

<1

7

1

<1

8a

1

<1

14b

1

<1

20

1

<1

21

1

<1

21a

1

<1

29

1

<1

46

1

<1

Pozn. U – untypable

Obr. 5: Zastoupení jednotlivých fágových typů zvířecích kmenů S. Enteritidis

40

Tab. 12: Počet a procentuální zastoupení zjištěných fágových typů u kmenů z potravin S. Enteritidis (n=18)

Fágový typ

Počet

Procentuální zastoupení (%)

3

5

27,8

1b

2

11,1

4b

2

11,1

6

2

11,1

8

2

11,1

23

2

11,1

7

1

<6

13a

1

<6

U

1

<6

Pozn. U – untypable

Obr. 6: Zastoupení jednotlivých fágových typů kmenů z potravin S. Enteritidis

3.2.2 Rezistence k antimikrobiálním látkám Rezistence u sérotypu Enteritidis byla prováděna pouze u suspektních epidemických kmenů, což bude dále ve výsledcích uvedeno v kapitole Epidemie.

41

3.3 Typizace kmenů S. enterica subsp. enterica sérotyp Typhimurium 3.3.1 Fágová typizace Následující tabulky a grafy uvádějí počty jednotlivých fágových typů zvlášť pro humánní kmeny (Tab. 13 a Obr. 7), zvířecí kmeny (Tab. 14 a Obr. 8) a kmeny z potravin (Tab. 15). Tab. 13: Počet a procentuální zastoupení zjištěných fágových typů u humánních kmenů S. Typhimurium (n=181)

Fágový typ

Počet

Procentuální zastoupení (%)

104 193 120 8 193/10+ U302 U 9 141 195 2 206 RDNC 1 36 7 38 72 110 111 131 208

47 40 24 13 9 8 7 5 4 4 3 3 3 2 2 1 1 1 1 1 1 1

26 22,1 13,3 7,2 5 4,4 3,9 2,8 2,2 2,2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2

Pozn. RDNC – reacts but does not conform (nezařaditelná reakce)

42

Obr. 7: Zastoupení jednotlivých fágových typů humánních kmenů S. Typhimurium Tab. 14: Počet a procentuální zastoupení zjištěných fágových typů u zvířecích kmenů S. Typhimurium (n=51)

Fágový typ

Počet

Procentuální zastoupení (%)

104 2 120 206 1 193 9 U302 RDNC 8 10 36 38 43 51 121 161

18 5 4 4 3 3 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1

35,3 9,8 7,8 7,8 5,9 5,9 3,9 3,9 3,9 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2

Pozn. RDNC - reacts but does not conform (nezařaditelná reakce)

43

Obr. 8: Zastoupení jednotlivých fágových typů zvířecích kmenů S. Typhimurium Tab. 15: Počet a procentuální zastoupení zjištěných fágových typů u kmenů z potravin S. Typhimurium (n=6)

Fágový typ

Počet

Procentuální zastoupení (%)

104 193

3 3

50 50

3.3.2 Rezistence k antimikrobiálním látkám Rezistence k antimikrobiálním látkám byla provedena u všech kmenů s fágovým typem DT193, DT193/10+, DT208, U302, U a DT104. Tabulka 16 zobrazuje zjištěné rezistence u humánních kmenů zkoumaných fágových typů, červeně jsou označeny multirezistentní kmeny (rezistence ke čtyřem a více antimikrobiálním látkám).

44

Tab. 16: Zjištěné rezistence u humánních kmenů vybraných fágových typů Fágový typ DT

Počet analyzovaných kmenů

Typ rezistence (počet rezistencí)

Počet kmenů s danou rezistencí

193

40

193/10+

9

208 U302

1 8

citlivý S (1R) AmpSSu (3R) AmpSTe (3R) AmpSSuTe (4R) AmpSuWTe (4R) AmpSNSuTe (5R) AmpSSuSxtW (5R) AmpAmcSSuTe (5R) AmpSSuSxtWTe (6R) AmpSCNSuTeNA (6R) AmpCNNSuSxtWTe (7N) citlivý AmpSTe (3R) AmpSSuTe (4R) AmpSNSuTe (5R) SSuSxtWTe (5R) CSSuSxtWTe (6R) AmpCSSuSxtWTe (7R) N (1R) citlivý AmpS (2R) AmpSSuTe (4R) SNSuSxtW (5R) AmpCSSuTeNA(6R) AmpSCNAprSuSxtWTeNA (9R) AmpCSKCNNAprSuTeNA (10R) citlivý AmpSSuTe (4R) AmpSNSuTe (5R) AmpAmcSSuTe (5R) AmpSSuTeNA (5R) citlivý S (1R) SN (2R) Ssu (2R) SNSu (3R) AmpNSuTe (4R) AmpSSuTe (4R) AmpCSSuTe (5R) SNSuSxtW (5R) AmpCNSSuTe (6R) AmpCSSuTeNA (6R) AmpAmcCSSuTe (6R) AmpCSSuSxtTe (6R) AmpAmcCSSuTeNA (7R) AmpCNSSuTeNA (7R) AmpAmcSNAprSuTe (7R) AmpCSKNSuTeNA (8R) AmpCSAprSuSxtWTe (8R) AmpCSNSuSxtWTeNA (9R) nevyšetřeno

4 2 5 1 19 1 2 1 1 2 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1

U

7

104

47

1 1 1 3 1 1 1 2 1 3 1 1 1 1 8 1 11 3 2 1 2 2 1 1 1 1 3

45

Tabulka 17 zobrazuje zjištěné rezistence u zvířecích kmenů sledovaných fágových typů, červeně jsou označeny multirezistentní kmeny (rezistence ke čtyřem a více antimikrobiálním látkám). Tab. 17: Rezistence k antimikrobiálním látkám u zvířecích kmenů a vybraných fágových typů Fágový typ DT

Počet analyzovaných kmenů

Typ rezistence (počet rezistencí)

Počet kmenů s danou rezistencí

193

3

U302

2

104

18

S (1R) AmpSKNSuTe (6R) AmpSKCNNSuTe (7R) citlivý CS (2R) SN (2R) SKN (3R) SKNApr (4R) AmpCSSuTe (5R) SKCNNApr (5R) AmpCSNSuTe (6R) SKNAprSuTe (6R) AmpAmcCSSuTe (6R) AmpCSAprSuTe (6R) AmpAmcCSNSuTe (7R) AmpAmcCSKNAprSuTe (9R) nevyšetřeno

1 1 1 1 1 1 1 1 4 1 3 1 1 1 2 1 1

Tabulka 18 zobrazuje zjištěné rezistence u kmenů z potravin sledovaných fágových typů, červeně jsou označeny multirezistentní kmeny (rezistence ke čtyřem a více antimikrobiálním látkám). Tab. 18: Rezistence k antimikrobiálním látkám u kmenů z potravin a vybraných fágových typů Fágový typ DT

Počet analyzovaných kmenů

Typ rezistence (počet rezistencí)

Počet kmenů s danou rezistencí

193

3

104

3

citlivý AmpSSuTe (4R) S (1R) AmpS (2R)

1 2 2 1

3.3.3 PCR pro detekci genu fljB Vzhledem k tomu, že monofazické salmonely (Typhimurium-like) se vyznačují fágovými typy DT193, DT193/10+, DT208 a U302, byla PCR provedena u kmenů s těmito fágovými typy. Dále bylo PCR provedeno u kmenů, které nereagovaly s žádným z testovacích fágů (U – nedefinovatelné). Tabulky 19, 20 a 21 uvádějí výsledky provedení PCR pro detekci genu fljB. Červeně jsou vyznačeny kmeny, které se projevily jako fljB-, tedy monofazické kmeny.

46

Tab. 19: Výsledky PCR pro detekci genu fljB u humánních kmenů vybraných fágových typů S. Typhimurium

Fágový typ DT

Počet analyzovaných kmenů

193

40

193/10+

9

208

1

U302

8

U

7

PCR výsledek

Počet kmenů s daným výsledkem

fljB+ fljBfljB+ fljBfljB+ fljBfljB+ fljBfljB+ fljB-

8 32 3 6 0 1 6 2 2 5

Tab. 20: Výsledky PCR pro detekci genu fljB u zvířecích kmenů vybraných fágových typů S. Typhimurium

Fágový typ DT

Počet analyzovaných kmenů

193

3

U302

2

PCR výsledek

Počet kmenů s daným výsledkem

fljB+ fljBfljB+ fljB-

2 1 2 0

Tab. 21: Výsledky PCR pro detekci genu fljB u kmenů z potravin vybraných fágových typů S. Typhimurium

Fágový typ DT

Počet analyzovaných kmenů

193

3

PCR výsledek

Počet kmenů s daným výsledkem

fljB+ fljB-

0 3

Tabulka 22 uvádí celkový počet testovaných kmenů na fljB, celkový počet fljB negativních kmenů a jejich procentuální podíl z celku testovaných. Tab. 22: Celkový počet testovaných kmenů na fljB a podíl negativních reakcí

Testovaných kmenů celkem

fljB negativní

Podíl negativních z celku testovaných (%)

82

50

61

47

3.3.4 Subtypizace sérotypu Typhimurium pomocí PCR – multiplex PCR Zjištěných 50 kmenů negativní na fljB bylo dále subtypizováno pomocí multiplex PCR. Tabulky 23–25 ukazují vypočítané kódy. Tabulky jsou opět rozděleny jednotlivě pro kmeny humánní (Tab. 23), zvířecí (Tab. 24) a potravinové (Tab. 25). Tab. 23: Kódy získané multiplex PCR (profágovou typizací) – humánní kmeny

Fágový typ DT 193

Počet analyzovaných kmenů 32

Kód zjištěný na základě PCR 5500 5701

Počet kmenů s daným kódem 31 1

193/10+

6

5500 5300 5501 5520

3 1 1 1

208

1

5700

1

U302

2

5500 1313

1 1

U

5

5500 4000

4 1

Tab. 24: Kódy získané multiplex PCR (profágovou typizací) – zvířecí kmeny

Fágový typ DT 193

Počet analyzovaných kmenů 1

Kód zjištěný na základě PCR 5500

Počet kmenů s daným kódem 1

Tab. 25: Kódy získané multiplex PCR (profágovou typizací) – potravinové kmeny

Fágový typ DT 193

Počet analyzovaných kmenů 3

Kód zjištěný na základě PCR 5500 5701

Počet kmenů s daným kódem 2 1

3.4 Typizace kmenů s neurčeným sérotypem 3.4.1 Latexová aglutinace – Wellcolex Výsledky latexové aglutinace pomocí sady Wellcolex uvádějí tabulky níže v textu. Opět byla typizace rozdělena na určování humánních kmenů (Tab. 26), zvířecích kmenů (Tab. 27) a kmenů z potravin (Tab. 28).

48

Tab. 26: Výsledky aglutinace pomocí sady Wellcolex u humánních kmenů

Séroskupina určená pomocí Wellcolex B C E Nezařazeno

Počet kmenů určených do dané skupiny 8 23 3 8

Tab. 27: Výsledky aglutinace pomocí sady Wellcolex u zvířecích kmenů

Séroskupina určená pomocí Wellcolex B C E G

Počet kmenů určených do dané skupiny 5 12 4 8

Tab. 28: Výsledky aglutinace pomocí sady Wellcolex u kmenů z potravin

Séroskupina určená pomocí Wellcolex B C

Počet kmenů určených do dané skupiny 2 15

3.4.2 Sérotypizace sklíčkovou aglutinací Všechny kmeny byly dále podrobeny sérotypizaci pomocí antisér a sklíčkové aglutinace. Výsledky sérotypizace uvádějí tabulky dále. Výsledky jsou členěny na humánní kmeny (Tab. 29), zvířecí kmeny (Tab. 30) a kmeny z potravin (Tab. 31). Tab. 29: Výsledky sklíčkové aglutinace u humánních kmenů

Séroskupina B

Zjištěný sérotyp Agona Gloucester Heidelberg Stanley 4,5,12:-:1,2

Počet kmenů s daným sérotypem 4 1 1 1 1

C

Infantis 6,7:-:1,2 Kentucky Mbandaka Manchester Hadar Muenchen Rissen Thompson Virchow

7 5 2 2 2 1 1 1 1 1

E

Senftenberg Orion

2 1

Nezařazeno

Urbana

8

49

Tab. 30: Výsledky sklíčkové aglutinace u zvířecích kmenů

Séroskupina B

Zjištěný sérotyp Derby Agona

Počet kmenů s daným sérotypem 4 1

C

Infantis Goldcoast Newport Montevideo Ohio Tennessee

4 3 2 1 1 1

E

London Senftenberg

3 1

G

Havana

8

Tab. 31: Výsledky sklíčkové aglutinace u kmenů z potravin

Séroskupina B

Zjištěný sérotyp Derby Saintpaul

Počet kmenů s daným sérotypem 1 1

C

Kentucky Virchow Infantis Newport Bovismorbificans Mbandaka

6 3 2 2 1 1

3.4.3 PCR pro detekci genu fliC Detekce genu fliC byla provedena u defektních variant sérotypu Infantis, které při sérotypizaci nereagovaly s antisérem pro první bičíkovou fázi (5 kmenů). Výsledky jsou shrnuty v tabulce 32. Tab. 32: Celkový počet testovaných kmenů na fliC a podíl negativních a pozitivních reakcí

Testovaných kmenů celkem fliC negativní 5 2

fliC pozitivní 3

50

3.5 Epidemie Vzhledem k faktu, že některé skupiny kmenů se po provedení výše zmíněných reakcí ukázaly jako kmeny potenciálně epidemické, byly u nich použity některé další metody. Epidemie 1 Období: listopad – prosinec 2009 Lokalita: Jablonec nad Nisou (Obr. 9) Suspektní vehikulum: šunkové chlebíčky Počet analyzovaných suspektních kmenů: 10 Sérotyp/fágový typ/pulzotyp: Enteritidis/PT13a/SEXba-3 (Obr. 10) Zjištěné antimikrobiální rezistence – N

Obr. 9: Lokalizace místa hlášených epidemických případů S. Enteritidis PT13a (zdroj použité mapy: http://graphicworld.blog.cz/0811/slepa-mapa-cr)

917.0 614.9

487.4 314.6 251.5 230.6 185.1 174.0 123.8 102.7 78.5 65.7 45.1 35.8

Obr. 10: Pulzotyp epidemie 1 (SEXba-3) a marker

51

Epidemie 2 Období: únor – březen 2010 Lokalita: Praha (Obr. 11) Suspektní vehikulum: nezjištěno Počet analyzovaných suspektních kmenů: 8 Sérotyp/fágový typ/pulzotyp: Enteritidis/PT8/SEXba-1 (Obr. 12) Zjištěné antimikrobiální rezistence – N

Obr. 11: Lokalizace místa hlášených epidemických případů S. Enteritidis PT8 (zdroj použité mapy: http://graphicworld.blog.cz/0811/slepa-mapa-cr)

917.0 614.9

487.4 314.6 251.5 230.6 185.1 174.0 123.8 102.7 78.5 65.7 45.1 35.8

Obr. 12: Pulzotyp epidemie 2 (SEXba-1) a marker

52

Epidemie 3 Období: leden – únor 2010 Lokalita: Česká republika, Finsko, Lotyšsko (Obr. 13) Suspektní vehikulum: nezjištěno Počet analyzovaných suspektních kmenů: 8 Sérotyp/pulzotyp: Urbana/SUXba-1(Obr. 14) Zjištěné antimikrobiální rezistence – SN

Obr. 13: Lokalizace míst hlášených epidemických případů S. Urbana (zdroj použité mapy: http:/ /eu.geograf.cz/eu_s/images/img_mapy/eu_sl.gif)

917.0 614.9

487.4 314.6 251.5 230.6 185.1 174.0 123.8 102.7 78.5 65.7 45.1 35.8

Obr. 14: Pulzotyp epidemie 3 (SUXba-1) a marker

53

Epidemie 4 Období: únor – březen 2010 Lokalita: Turnov (Obr. 15) Suspektní vehikulum: nezjištěno Počet analyzovaných suspektních kmenů: 7 Sérotyp/fágový typ/pulzotyp: Enteritidis/PT8/SEXba-1 (Obr. 16) Zjištěné antimikrobiální rezistence – SKNAprSu

Obr. 15: Lokalizace místa hlášených epidemických případů S. Enteritidis PT8 (zdroj použité mapy: http: //graphicworld.blog.cz/0811/slepa-mapa-cr)

917.0 614.9

487.4 314.6 251.5 230.6 185.1 174.0 123.8 102.7 78.5 65.7 45.1 35.8

Obr. 16: Pulzotyp epidemie 4 (SEXba-1) a marker

54

Epidemie 5 Období: červenec 2010 Lokalita: Zlín (Obr. 17) Suspektní vehikulum: chlebíčky Počet analyzovaných suspektních kmenů: 8 Sérotyp/fágový typ/pulzotyp: Enteritidis/PT8/ SEXba-1 (Obr. 18) Zjištěné antimikrobiální rezistence – Su

Obr. 17: Lokalizace místa hlášených epidemických případů S. Enteritidis PT8 (zdroj použité mapy: http://graphicworld.blog.cz/0811/slepa-mapa-cr)

917.0 614.9

487.4 314.6 251.5 230.6 185.1 174.0 123.8 102.7 78.5 65.7 45.1 35.8

Obr. 18: Pulzotyp epidemie 5 (SEXba-1) a marker

55

Epidemie 6 Období: srpen 2010 Lokalita: Zlínský kraj (Obr. 19) Suspektní vehikulum: vejce Počet analyzovaných suspektních kmenů: 8 Sérotyp/fágový typ/ pulzotyp: Enteritidis/PT4b/SEXba-7 (Obr. 20) Zjištěné antimikrobiální rezistence – citlivé

Obr. 19: Lokalizace místa hlášených epidemických případů S. Enteritidis PT4b (zdroj použité mapy: http://graphicworld.blog.cz/0811/slepa-mapa-cr)

917.0 614.9

487.4 314.6 251.5 230.6 185.1 174.0 123.8 102.7 78.5 65.7 45.1 35.8

Obr. 20: Pulzotyp epidemie 6 (SEXba-7) a marker

56

Epidemie 7 Období: listopad 2010 Lokalita: Františkovy Lázně (Obr. 21) Suspektní vehikulum: tatarský biftek Počet analyzovaných suspektních kmenů: 24 Sérotyp/fágový typ/pulzotyp: Enteritidis/PT56/SEXba-1 (Obr. 22) Zjištěné antimikrobiální rezistence – citlivé

Obr. 21: Lokalizace místa hlášených epidemických případů S. Enteritidis PT56 (zdroj použité mapy: http://graphicworld.blog.cz/0811/slepa-mapa-cr)

917.0 614.9

487.4 314.6 251.5 230.6 185.1 174.0 123.8 102.7 78.5 65.7 45.1 35.8

Obr. 22: Pulzotyp epidemie 7 (SEXba-1) a marker

57

4 Diskuze 4.1 Sérotypizace Sérotypizace založená na sklíčkové aglutinaci s antiséry je běžnou metodou v rutinních i specializovaných laboratořích. Přestože rod Salmonella zahrnuje 2579 sérotypů (Grimont a Weill, 2007), v České republice se jich běžně objevuje kolem stovky ročně (Dědičová a kol., 2009). Na prvních deseti místech se pravidelně s malými obměnami objevují stále tytéž sérotypy. Standardně první místo zaujímá sérotyp Enteritidis, který v roce 2003 tvořil 96 % všech zjištěných sérotypů. Na druhém místě bývá sérotyp Typhimurium. V první desítce se pak většinou objevují sérotypy Infantis, Virchow, Saintpaul, Hadar, Montevideo, Agona, Kentucky a Newport. Tabulka 33 ukazuje pořadí a četnost sérotypů analyzovaných v této studii (již bez rozdělení na humánní, zvířecí a potravinové izoláty). Tab. 33: Deset nejčastěji detekovaných sérotypů salmonel v období listopad 2009 – únor 2011

Sérotyp Enteritidis Typhimurium 4,[5],12:i:Infantis Kentucky Havana Urbana Agona 6,7:-:1,5 Derby

Počet kmenů 644 188 50 13 8 8 8 5 5 5

S. Enteritidis představuje 66,5 % všech námi detekovaných kmenů, což je procentuálně méně, než tomu bývalo v předchozích letech, kdy sérotyp Enteritidis zaujímal téměř 96 % (Dědičová a Karpíšková, 2009). Naproti tomu výskyt sérotypu Typhimurium zaznamenává nárůst. Námi zjištěných 19,4 % je více než v předchozích letech. Zajímavý je obrovský nárůst výskytu nově prevalujícího monofazického sérotypu 4,[5],12:i:-, který byl pravděpodobně delší dobu mylně určován jako sérotyp Typhimurium. Po dohledání záznamů v laboratorním deníku bylo zjištěno, že 18 (36 %) kmenů z námi určených 50 s antigenní strukturou 4,[5],12:i:byly zaslány již jako chybně určené Typhimurium. Chybná sérotypizace je tedy stále 58

problémem a u suspektních kmenů, které vykazují další charakteristiky nového sérotypu (absence reakce s antiséry druhé bičíkové fáze, multirezistence), je potřeba tyto zasílat do NRL k detailní analýze. Do první desítky se také dostaly méně obvyklé sérotypy Havana a Urbana, které se později ukázaly jako epidemické, a tudíž je vyšší počet najednou zaslaný do laboratoře zařadil do nejčetnějších sérotypů. Při větším objemu dat, než které byly k dispozici v této práci, by počty těchto dvou sérotypů nebyly tak významné. Na devátém místě se objevuje taktéž nově prevalující sérotyp, defektní varianta sérotypu Infantis. Zdá se, že po průniku monofazické S. Typhimurium na území České republiky bude tato varianta sérotypu Infantis dalším problémem, jak epidemickým, tak laboratorním.

4.2 Fágová typizace Fágová typizace provedená u sérotypů Enteritidis a Typhimurium ukázala, že v České republice dlouhodobě kolují stejné fágové typy, u S. Enteritidis jsou to dominující PT8, PT4b a u zvířecí PT6c. Vysoký počet PT56 v humánních vzorcích byl posléze vyhodnocen jako ohraničená epidemie, jedná se tedy o mimořádný výskyt daného a na území ČR poprvé detekovaného fágového typu. Poměrně široké zastoupení fágových typů u potravinových izolátů je dáno tím, že potravinové izoláty do laboratoře SZÚ přicházejí, jen pokud jsou nějakým způsobem hůře typovatelné nebo pokud se jedná o podezření na epidemický kmen. Zastoupení fágových typů tedy přesně neodráží realitu. Přesto lze na základě získaných výsledků pozorovat zajímavé souvislosti ve výskytu některých fágových typů. Například PT6c je poměrně často detekován u drůbeže chované v České republice na maso (brojleři). Ve sledovaném souboru izolátů se objevil jak ve skupině humánních kmenů (7/2 %), tak u izolátů ze zvířat (78/28 %); jednalo se výhradně o chovy brojlerů. Dalším zajímavým fagotypem je PT3, který byl v ČR detekován poprvé v roce 2008 (1 izolát z kůže jatečně opracovaného kuřete, země původu nebyla dosledována) (databáze SZÚ, nepublikováno). V roce 2010 byl tento vzácný fágový typ detekován u kuřecích dílů importovaných z Polska a v jednom případě i ze Slovenska (5/27,8 %). Ve stejném roce byl PT 3 detekován i z humánního materiálu. U S. Typhimurium se setkáváme nejčastěji s DT104, DT193, DT120. DT104 je obecně považován za nejhojnější fágový typ u sérotypu Typhimurium. DT193 je takzvaný přídatný fágový typ, objevující se v menší míře u sérotypu Typhimurium. Typický je ovšem pro sérotyp 4,[5], 12:i:-. Z těchto důvodů byly všechny kmeny s tímto fagotypem 59

(a některými dalšími) podrobeny sérotypizaci pomocí PCR pro jasnou identifikaci sérotypu. Z méně často se vyskytujících fágových typů je zajímavý DT2, který je celosvětově vázán na populaci holubů (Andrews-Polymenis a kol., 2004). V průběhu studie byl tento fágový typ detekován třikrát v humánní populaci (<2 %) a pětkrát v populaci zvířat. Jednalo se o izoláty z holubů a po jednom případě i od selete a nosnice. Shoda fágových typů v izolátech humánních a zvířecích potvrzuje, že salmonelóza je zoonóza s cestou přenosu mezi zvířaty a lidmi, a je tedy spolu s dalšími detailními metodami velmi cenným nástrojem epidemiologického šetření.

4.3 Test rezistence k antimikrobiálním látkám Test antibiotické rezistence byl prováděn pouze u vybraných kmenů, pro jejichž fágové typy je typická multirezistence. Pro monofazickou variantu S. 4,[5],12:i:- (DT193, DT193/10+, DT208, U302) je nejčastěji v literatuře popisovaná rezistence ke čtyřem antimikrobiálním látkám (AmpSSuTe). Tuto rezistenci vykazovalo podle naší analýzy pouze 48 % kmenů (24 kmenů). Některou z vyšších rezistencí (tj. 5–9 R) vykazovalo 24 % (12 kmenů). Zbylých 28 % kmenů nevykazovalo multirezistenci (tj. 0–3 R). Míra rezistence se mezi jednotlivými fágovými typy monofazických kmenů zásadně nelišila. Přestože jsme v této práci nepotvrdili svázanost monofazického kmenu s udávanou tetrarezistencí, je jasné, že multirezistence jako taková je pro tento sérotyp velmi příznačným rysem. Zvláště vysoké rezistence až k devíti antimikrobiálním látkám by mohly znamenat velký problém, pokud by se tyto klony začaly mezi kmeny salmonel šířit. Test byl také prováděn u DT104 sérotypu Typhimurium. U tohoto fágového typu bývá často popisována rezistence k pěti látkám (AmpCSSuTe). Tuto kombinaci rezistencí jsme zjistili u 22 % izolátů (14 kmenů). Nicméně kmenů rezistentních k pěti a více antimikrobiálním látkám jsme celkově zaznamenali 80 %. Pouhých 20 % kmenů tudíž vykazovalo rezistenci k 0–3 látkám. Tyto výsledky se shodují se studiemi uvedenými v úvodu práce. Multirezistence se může týkat i sérotypu Enteritidis, jak dokazují pentarezistentní kmeny PT8 z epidemie v penzionu Pohoda (epidemie 4).

4.4 Metody na principu PCR U kmenů určených jako sérotyp S. 6,7:-:1,5, tedy Infantis defektní v první bičíkové fázi, bylo provedeno PCR pro detekci genu fliC. Metoda je pro určení nové varianty 60

sérotypu Infantis dostatečně průkazná a ukazuje, že v poslední době dochází k průniku nového sérotypu (nebo varianty původního sérotypu) na území České republiky. Pomocí PCR jsme chtěli zjistit, zda se jedná o defektní varianty (gen je přítomen, ale není exprimován) nebo o monofazické varianty (gen není v genomu přítomen). PCR prokázalo, že 3 kmeny byly varianty defektní a 2 kmeny varianty monofazické. Zdá se tedy, že po průniku monofazické varianty sérotypu Typhimurium se začínají do chovů, a tudíž i do potravinového řetězce dostávat nové varianty běžných sérotypů. Vzhledem k tomu, že literatura se zatím o podobných případech nezmiňuje, jedná se zřejmě o varianty zcela nové. První případy defektních variant eviduje databáze SZÚ na konci roku 2008. Stejně jako sérotyp Infantis je i defektní varianta typická pro drůbež. Pro detailní rozlišení monofazické a defektní varianty S. Infantis by bylo potřeba provést makrorestrikční analýzu s následnou PFGE, což bude dalším nutným krokem v subtypizaci defektních variant, pokud dojde k jejich rozšíření ve stejné míře, v jaké došlo k rozšíření monofazického sérotypu 4,[5],12:i:-. Pokud byl kmen fágovou typizací určen jako DT193, DT193/10+, DT208, U302 nebo U, byl považován za potenciální monofazickou variantu a byl podroben PCR pro detekci genu fljB, což je spolehlivá metoda odhalující přítomnost nebo absenci genu pro druhou bičíkovou fázi v genomu kmene. Přezkoumaných kmenů bylo celkem 82, u 61 % (50 kmenů) byla potvrzena monofazicita, tedy absence genu fljB. Tato metoda je velmi přínosná pro rozlišení sérotypu Typhimurium a 4,[5],12:i:- v případě, že fenotypové metody nejsou dostatečně průkazné. Jak již bylo zmíněno výše, 36 % kmenů ve zkoumaném období přišlo do laboratoře SZÚ určeno chybně. Nedůsledné

určování

kmenů

salmonel

v rutinních

laboratořích

vede

k podhodnocování počtu a současného stavu monofazických salmonel na území České republiky. Jak vyplývá z testování antimikrobiální rezistence, neplatí vždy, že by se monofazické varianty vyznačovaly tetrarezistencí, proto ani tento krok není zárukou jejich přesného odhalení. Průkaznou metodou tedy zůstává provedení PCR pro detekci genu fljB. Kmeny, které byly vyhodnoceny jako fljB negativní, byly dále podrobeny subtypizaci pomocí multiplex PCR, jež odhaluje profágovou DNA v jejich genomu. Z vypočítaných kódů je jasné, že dominující kód je 5500 (84 %), což odpovídá údajům z jiných studií (Rychlík a kol., 2008). Zdá se, že tento kód je tedy pro monofazické salmonely typický. Zbylých 16 % kmenů se v kódech liší, některé jen v jedné pozici, jiné ve všech čtyřech. U jednoho kmenu se objevil i kód (1313), který je podle Rychlíka a kol. typický pro S. Typhimurium DT104. Tuto metodu můžeme využít například k potvrzení, 61

že se jedná o monofazickou variantu 4,[5],12:i:-, shodný kód nám také potvrdí, zda se jedná o klonální shodu (zde tedy dříve zmiňovaná možnost náhrady makrorestrikční analýzy a PFGE touto metodou). Detailním porovnáním antimikrobiální rezistence, fágového typu a kódu ovšem nevyplynula žádná vzájemná korelace. To znamená, že kód kmenu, potažmo tedy jeho profágová DNA nijak neovlivňuje fenotypové projevy daného kmene. Kód 5500 vykazovaly kmeny s rozdílnými fágovými typy. Detekce genu fljB je tedy zřejmě sama o sobě dostatečným důkazem monofazického sérotypu 4,[5],12:i:-.

4.5 Makrorestrikční analýza a elektroforéza v pulzním poli (PFGE) Zajímavým zjištěním bylo, že tato metoda, považovaná za zlatý standard v typizačních metodách, nemá v některých případech dostatečnou rozlišovací schopnost. Problém je patrný u typizace kmenů sérotypu Enteritidis, a to zejména v ČR nejčastěji se vyskytujících fágových typů PT8, PT13a, ale také vzácného fágového typu PT56. Všechny epidemické kmeny, které jsou detailněji popsány v kapitole Epidemie, patřily k identickému pulznímu profilu SEXba-1. V tomto případě můžeme konstatovat, že metoda fágové typizace umožňuje detailnější odlišení původu kmenů než časově i materiálně náročnější metoda makrorestrikční analýzy.

4.6 Epidemie Všechny uvedené metody byly aplikovány pro potřeby potvrzení klonální shody u salmonel s možnou epidemickou souvislostí. V průběhu studie byly typizovány kmeny ze sedmi epidemií a v závislosti na sérotypu se osvědčila vhodná kombinace výše popsaných metod. Epidemie 1 byla způsobená S. Enteritidis PT13a. PFGE potvrdila klonální shodu kmenů, tudíž i jejich epidemickou souvislost. Fágový typ PT13a způsobil v Libereckém kraji od roku 2008 již dvě potvrzené epidemie. Nejedná se v ČR o zcela neobvyklý fágový typ. Podle databáze SZÚ bývají kmeny fágového typu 13a izolovány především z nosnic a u potravin pak z cukrářských výrobků. Jako suspektní vehikulum epidemie byly určeny šunkové chlebíčky. Vzhledem k výše uvedenému se mohlo jednat o sekundární kontaminaci při výrobě lahůdkářského zboží a nedodržování zásad správné výrobní a hygienické praxe.

62

Epidemie 2 byla způsobená S. Enteritidis PT 8, což je nejčastější fágový typ na našem území. Odhalit epidemické souvislosti je v těchto případech obtížné. Epidemie propukla v nemocničním zařízení, detekce vehikula tím byla značně usnadněna. Přesto se však vehikulum nepodařilo určit. Epidemie 3 způsobená S. Urbana byla velmi zajímavá svým evropským výskytem. Spolu s Českou republikou hlásily výskyt také Finsko a Lotyšsko. V rámci naší republiky se jednalo o separované případy z různých krajů, což zhoršuje pátrání po vehikulu, které nebylo nakonec prokázáno. PFGE prokázala klonální shodu kmenů ve všech třech zemích. Dle závěrečné zprávy mělo onemocnění agresivní průběh, výskyt onemocnění byl vázán zejména na děti do 15 let. Kmeny byly citlivé ke všem antimikrobiálním látkám (Rimhanen-Finne a kol., 2010). Naše analýza prokázala hraniční hodnoty všech kmenů u streptomycinu a neomycinu. Epidemie 4 byla opět způsobena nejčastějším fágovým typem PT8. Její detekci umožnila lokální ohraničenost probíhající epidemie, kdy se jednalo o propuknutí onemocnění v domově důchodců. Většina postižených uváděla, že se stravovala v místním kiosku, konkrétní vehikulum se však nepodařilo zajistit. Výrazným rysem epidemických kmenů byla rezistence k pěti antimikrobiálním látkám, což pro sérotyp Enteritidis není typické. V databázi SZÚ se další kmeny tohoto fágového typu s obdobně vysokou rezistencí nevyskytují. Zřejmě se tedy jednalo o ohraničenou epidemii. Epidemie 5 byla také způsobena nejčastějším fágovým typem PT8. Díky ohraničenosti epidemie bylo dohledáno i suspektní vehikulum, kterým byly v tomto případě chlebíčky. Epidemie 6 způsobená fágovým typem PT4b proběhla stejně jako epidemie 5 ve Zlínském kraji. Prvotním vodítkem byl v daném období méně obvyklý fágový typ. Za suspektní vehikulum bylo považováno palačinkové těsto v jedné z restaurací. Někteří nemocní hlásili konzumaci jiných jídel než palačinkového těsta, proto byla jako suspektní vehikulum označena vejce použitá na přípravu těsta i dalších pokrmů. Případy onemocnění byly hlášeny z celého kraje a PFGE pak potvrdila klonální shodu těchto případů. Databáze SZÚ obsahuje údaje o zvýšeném výskytu fágového typu PT4b v Jihomoravském kraji v polovině roku 2009, u těchto kmenů nebyla provedena makrorestrikční analýza a PFGE, není tedy možné zjistit, jedná-li se o klonální shodu s kmeny ze Zlínského kraje. Epidemie 7 byla způsobena vzácným fágovým typem PT56, který v posledních letech nebyl hlášen z žádné evropské země (Epis ECDC, nepublikováno). Poslední hlášená epidemie způsobená tímto fágovým typem je z roku 2003, kdy ve Velké Británii 63

onemocnělo 138 lidí, většina z nich hlásila konzumaci v čínské restauraci. Vehikulum se však nepodařilo prokázat (KHS Karlovarského kraje, 2011, nepublikováno). V epidemii 7 byl za suspektní vehikulum považován tatarský biftek, není ovšem jasné, zda se vehikulem stalo maso nebo syrová vejce používaná pro přípravu tohoto pokrmu. Šetření na místě nebylo provedeno, protože ihned po inkriminované oslavě bylo restaurační zařízení uzavřeno a probíhala rekonstrukce objektu.

64

5 Závěr Přestože salmonelóz na území České republiky v posledních letech výrazně ubývá, stále se jedná o zoonózu s velkým socioekonomickým dopadem. Vzhledem k možným cestám přenosu je u tohoto onemocnění velká pravděpodobnost vzniku epidemických stavů. Množství epidemií popsaných v této práci ukazuje, že hromadná onemocnění způsobená tímto rodem nejsou na území České republiky ojedinělým jevem. V těchto situacích je nutné pečlivě došetřovat jednotlivé případy a hledat klonální shody jak mezi jednotlivými případy onemocnění, tak i mezi možnými vehikuly infekce. K těmto detailním studiím napomáhají fenotypové a genotypové metody, které jsme použili v této práci. Sérotypizace, běžná laboratorní metoda používaná pro rozlišení v rámci rodu Salmonella, není pro epidemické šetření dostatečně průkazná. Vzhledem k vysokému podílu sérotypů Enteritidis a Typhimurium na našem území nemůže samotná sérotypizace poskytnout požadované rozlišení. Přesto má tato metoda velký smysl u ostatních, méně častých sérotypů, u nichž sklíčková aglutinace poskytuje dostatečně relevantní data. K epidemickým studiím je tedy nutno provádět detailnější fenotypové a genotypové metody. Přestože někteří autoři polemizují, zda má fágová typizace, jakožto fenotypová metoda, stále opodstatnění, bývá často cenným vodítkem, a to především u kmenů s méně častými fágovými typy. Pokud je tato metoda prováděna důsledně podle návodu výrobce, poskytuje velmi dobrý nástroj epidemického šetření. Testy antimikrobiální rezistence jsou dobrým nástrojem sledování nárůstu rezistence u určitých fágových typů, u nichž se zvýšená rezistence očekává (S. Typhimurium DT104, monofazické kmeny). V předkládané práci jsme prokázali, že multirezistence těchto kmenů se neustále zvyšuje, proto je pomocí popsané metody vhodné monitorovat situaci těchto kmenů. Genotypové metody pak patří k nejprůkaznějším. Pomocí PCR lze jednoznačně potvrdit, nebo vyvrátit přítomnost hledaných genů, v případě rodu Salmonella se jedná o geny bičíkových fází fljB a fliC, fljB pro rozlišení sérotypu Typhimurium a jeho monofazické varianty a fliC např. pro odlišení defektní varianty sérotypu Infantis. Vzhledem k velké míře prevalence monofazických kmenů by bylo vhodné tuto metodu provádět u všech suspektních kmenů, což pro rutinní laboratoře znamená odesílání takových kmenů do NRL k detailní analýze. Multiplex PCR se hodí jako doplňková metoda při detailní charakteristice salmonel sérotypu Typhimurium nebo monofazických 65

kmenů. Díky časové nenáročnosti je pak dobrou alternativou makrorestrikční analýzy a PFGE. V dalších studiích by bylo zajímavé srovnání výsledků multiplex PCR a PFGE u velkého souboru kmenů uvedených sérotypů. PFGE jako zlatý standard v epidemiologických studiích by měl podávat detailní informace o klonální shodě, nebo rozdílu mezi analyzovanými kmeny. Pro optimální výsledek je nutné precizní provedení metody, v ideálním případě zakončené analýzou pomocí speciálního počítačového softwaru (BioNumerics). Přesto je v některých případech průkaznější metodou fágová typizace. Analýza epidemií ukázala, že je nadále třeba pečlivě došetřovat případy, kdy jsou hlášeny méně obvyklé sérotypy a fágové typy. V prvé řadě musí být řádně provedeny metody fenotypové, které mohou na suspektní kmeny poukázat. PFGE pak může v těchto případech potvrdit klonální shodu, a tím i epidemickou souvislost. V České republice neexistuje povinnost uchovávat vzorky potravin; dohledat tedy zpětně vehikulum je vzhledem k inkubační době salmonelózy téměř nemožné. Velkou pomocí je pak systém ECDC Epis, do něhož vkládají všechny země EU aktuální informace o probíhajících epidemiích, a je tudíž možné sledovat prevalující sérotypy a fágové typy a posléze identifikovat cesty šíření daného kmene. Vzhledem k obrovskému množství variant v rámci rodu Salmonella je nutné všechny metody provádět důsledně a při jakékoliv abnormalitě kmeny posílat k detailnější typizaci do NRL. Postup při určování sérotypů Enteritidis, Typhimurium, 4,[5],12:i:i ostatních sérotypů navržený v experimentální části práce se osvědčil jako vhodný pro typizaci izolátů rodu Salmonella z různých zdrojů i pro účely epidemiologických šetření.

66

6 Seznam literatury Agasan A., Kornblum J., Williams G., Prat C.-C., Fleckenstein P., Wong M., Ramon A. (2002): Profile of Salmonella enterica subsp. enterica (subspecies I) serotype 4,5,12:i:strains causing food-borne infections in New York City. J. Clin. Microbiol. 40: 1924– 1929. Amavisit P., Boonyawiwat W., Bangtraktulnont A. (2005): Characterization of Salmonella enterica serovar Typhimurium and monophasic Salmonella serovar 1,4,[5],12:i:- isolates in Thailand. J. Clin. Microbiol. 43: 2736–3740. Anderson E. S., Ward L. R., de Saxe M. J., de Sa J. D. H. (1977): Bacteriophage-typing designations of Salmonella typhimurium. J. Hyg. 78: 297–300. Andrews-Polymenis H. L., Rabsch W., Porwollik S., McCelland M., Rosetti C., Adams L. G., Bäumler A. J. (2004): Host restriction of Salmonella enterica serotype Typhimurium pigeon isolates does not correlate with loss of discrete genes. J. Bacteriol. 186: 2619–2628. Baggesen D. L., Sørensen G., Nielsen E. M., Wegener H. C. (2010): Phage typing of Salmonella Typhimurium – is it still a useful tool for surveillance and outbreak investigation? Euro Surveill. 15: 19471. Bone A., Noel H., Le Hello S., Pihier N., Danan C., Raguenaud M. E., Salah S., Bellali H., Vaillant V., Weill F. X., Jourdan-da Silva N. (2010): Nationwide outbreak of Salmonella enterica serotype 4,12:i:- infections in France, linked to dried pork sausage, March-May 2010. Euro Surveill. 15: 19592. Brunner F., Margadant A., Peduzzi R., Piffaretti J.-C. (1983): The plasmid pattern as an epidemiologic tool for Salmonella typhimurium epidemics: comparison with the lysotype. J. Infec. Dis. 148: 7–11. Buck J. W., Walcott R. R., Beuchat L. R. (2003): Recent trends in microbiological safety of fruits and vegetables. Plant Health. Progress doi:10.1094/PHP-2003-0121-01-RV. Cardona-Castro N., Sánchez-Jiménez M., Lavalett L., Múñoz N., Moreno J. (2009): Development and evaluation of a multiplex polymerase chain reaction assay to identify Salmonella serogroups and serotypes. Diagn. Micr. Infec. Dis. 65: 327–330.

67

Cruchaga S., Echeita A., Aladueña A., García-Peña J., Frias N., Usera M. A. (2001): Antimicrobial resistance in salmonellae from humans, food and animals in Spain in 1998. J. Antimicrob. Chemoth. 47: 315–321. De la Torre E., Zapata D., Tello M., Mejía W., Frías N., García Peña F. J., Mateu E. M., Torre E. (2003): Several Salmonella enterica subsp. enterica serotype 4,5,12:i:- phage types isolated from swine samples originate from serotype Typhimurium DT U302. J. Clin. Microbiol. 41: 2395–2400. Dědičová D., Karpíšková R. (2009): Nová revize Kauffmannova-Whiteova schématu pro identifikaci salmonel. Zprávy epidemiologie a mikrobiologie 18: 99–100. Dědičová D., Pihávková H., Mašková J. (2009): Humánní kmeny salmonel identifikovaných v NRL pro salmonely v průběhu roku 2008. Zprávy epidemiologie a mikrobiologie 18: 164–167. Dijkshoorn L., Towner K. J., Struelens M. (2001): New approaches for the generation and analysis of microbial typing data. Elsevier science, Amsterdam. 5, 8, 11–14, 159–162 p. Doyle M. P., Beuchat L. R. (2007): Food microbiology: fundamentals and frontiers (Third edition). ASM Press, Washington 2007. 197–199 p. Echeita M. A., Aladueña A., Cruchaga S., Usera M. A. (1999): Emergence and spread of an atypical Salmonella enterica subsp. enterica serotype 4,5,12:i:- strain in Spain. J. Clin. Microbiol. 37: 3425. Echeita M. A., Herrera S., Usera M. A. (2001): Atypical, fljB-negative Salmonella enterica subsp. enterica strain of serovar 4,5,12:i:- appears to be a monophasic variant of serovar Typhimurium. J. Clin. Microbiol. 39: 2981–2983. Grimont P. A. D., Weill F.-X. (2007): Antigenic formulae of the Salmonella serovars. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Institut Pasteur, Paris. 7–8, 13, 17–107 p. Harman J., Matoušková F., Prattingerová J. (2010): Epidemie salmonelózy způsobená salmonelou Enteritidis v Domově důchodců Pohoda v Turnově. Zprávy epidemiologie a mikrobiologie 19: 137–139.

68

Hohmann E. L. (2001): Nontyphoidal salmonellosis. Clin. Infect. Dis. 32: 263–269. Holmberg S. D., Wachsmuth I. K., Hickman-Brenner F. W., Cohen M. L. (1984): Comparison of plasmid profile analysis, phage typing, and antimicrobial susceptibility testing in characterizing Salmonella typhimurium isolates from outbreaks. J. Clin. Microbiol. 19: 100–104. Hui Y. H., Pierson M. D., Gorham J. K. (2001): Foodborne disease handbook, volume 1: Bacterial pathogens (Second edition). Dekker/CRC Press, New York 2001. 269 p. Chu Ch., Feng Y., Chien A.-Ch., Hu S., Chu Ch.-H., Chiu Ch.-H. (2008): Evolution of genes on the Salmonella virulence plasmid phylogeny revealed from sequencing of the virulence plasmid of S. enterica serotype Dublin and comparative analysis. Genomics 92: 339–343. Kado C. I., Liu S.-T. (1981): Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J. Bacteriol. 145: 1365–1373. Karpíšková R., Beneš D., Dědičová D. (1999): Emergence of multidrug resistant Salmonella Typhimurium DT 104 in the Czech Republic. Euro Surveill. 4: 71. Karpíšková R., Dědičová D. (2009): Výskyt a charakteristika salmonel ve vybraných lokalitách České republiky – porovnání epidemiologických a laboratorních dat. Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 58: 31–35. Karpíšková R., Koláčková I., Dědičová D., Šrámková H. (2003): Characterization of Salmonella enterica serotype Typhimurium in the Czech Republic: phage types, antimicrobial and plasmid profiles. Cent. Eur. J. Publ. Health 11: 160–162. Karpíšková R., Pospíšilová P., Jakubcová L. (2010): Nálezy salmonel u drůbeže v tržní síti: výsledky studie MIKROMON v letech 1999–2009. Zprávy epidemiologie a mikrobiologie 19: 332–334. Kothary M. H., Babu U. S. (2007): Infective dose of foodborne pathogens in volunteers: a review. J. Food. Safety 21: 49–68. Le Minor L., Popoff M. (1987): Designation of Salmonella enterica sp. nov., nom. rev., as the type and only species of the genus Salmonella. Int. J. Syst. Bacteriol. 37: 465–468.

69

Lehmacher A., Bockemühl J., Aleksic S. (1995): Nationwide outbreak of human salmonellosis in Germany due to contamined paprika and paprika-powdered potato chips. Epidemiol. Infect. 115: 501–511. Lukinmaa S., Nakari U., Eklund M., Siitonen A. (2004): Application of molecular genetic methods in diagnostics and epidemiology of food-borne bacterial pathogens. APMIS 112: 908–929. Malorny B., Cook N., D´Agostino M., De Medici D., Croci L., Abdulmawjood A., Fach P., Karpiskova R., Aymerich T., Kwaitek K., Kuchta T., Hoorfar J. (2004): Multicenter validation of PCR-based method for detection of Salmonella in chicken and pig samples. J. Aoac. Int. 87: 861–866. Maxam A. M., Gilbert W. (1977): A new method for sequencing DNA. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74: 560–564. McQuiston J. R., Fields P. I., Tauxe R. V., Logsdon J. M. (2008): Do Salmonella carry spare tyres? Trends Microbiol. 16: 142–148. McQuiston J. R., Parrenas R., Ortiz-Rivera M., Gheesling L., Brenner F., Fields P. I. (2004): Sequencing and comparative analysis of flagellin genes fliC, fljB, and flpA from Salmonella. J. Clin. Microbiol. 42: 1923–1932. Moreno Switt A. I., Soyer Y., Warnick L. D., Wiedmann M. (2009): Emergence, distribution, and molecular and phenotypic characteristics of Salmonella enterica serotype 4,5,12:i:-. Foodborne Pathog. Dis. 6: 407–415. Mossong J., Marques P., Ragimbeau C., Huberty-Krau P., Losch S., Meyer G., Moris G., Strottner C., Rabscg W., Schneider F. (2007): Outbreaks of monophasic Salmonella enterica serovar 4,[5],12:i:- in Luxembourg, 2006. Euro. Surveill. 12: 156–158. Nester E. W., Roberts C. E., Pearsall N. N., Anderson D. G., Nester M. T. (1998): Microbiology: A human perspective (Second edition). WCB McGraw-Hill 1998. 773–774 p. Parkhill J., Dougan G., James K. D., Thomson N. R., Pickard D., Wain J., Churcher C., Mungall K. L., Bentley S. D., Holden M. T. G., Sebaihia M., Baker S., Basham D., Brooks K., Chillingworth T., Connerton P., Cronin A., Davis P., Davles R. M., Dowd L., White 70

N., Farrar J., Feltwell T., Hamlin N., Haque A., Hien T. T., Holroyd S., Jagels K., Krogh A., Larsen T. S., Leather S., Moule S., O´Gaora P., Parry C., Quail M., Rutherford K., Simmonds M., Skelton J., Stevens K., Whitehead S., Barrell B. G. (2001): Complete genom sequence of a multiple drug resistant Salmonella enterica serovar Typhi CT18. Nature 413: 848–852. Prattingerová J., Harman J., Karpíšková R. (2010): Epidemie salmonelózy způsobená sérotypem Salmonella Typhimurium – fagotypu DT120 v mateřské škole v Turnově. Zprávy epidemiologie a mikrobiologie 19: 19–22. Reeves M. W., Evins G. M., Heiba A. A., Plikaytis B. D., Farmer J. J. (1989): Clonal nature of Salmonella typhi and its genetic relatedness to other salmonellae as shown by multilocus enzyme electrophoresis, and proposal of Salmonella bongori comb. nov. J. Clin. Microbiol. 27: 313–320. Ridley A. M., Threlfall E. J., Rowe B. (1998): Genotypic characterization of Salmonella enteritidis phage types by plasmid analysis, ribotyping, and pulse-field gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol. 36: 2314–2321. Rimhanen-Finne R., Lukinmaa S., Martelius T., Rossow H., Karpiskova R., Dedicova D., Galajeva J., Bormane A., Siitonen A., Kuusi M. (2010): Cases of Salmonella Urbana in Finland, the Czech Republic and Latvia, January-February 2010. Euro. Surveill. 15: 19511. Rosický B., Sixl W., Beneš Č., Havlík J., Hubálek Z., Lát J., Matyáš Z., Mikulášková M., Sixl-Voigt B., Thiel W., Wolf A. (1994): Salmonelózy: Aktuální informace pro lékaře, veterinární lékaře a potravinářskou praxi. Scientia Medica, Praha. 59, 98–104, 160 s. Rychlík I., Hradecká H., Malcová M. (2008): Salmonella enterica serovar Typhimurium typing by prophage-specific PCR. Microbiology+ 154: 1384-1389. Rychlík I., Švestková A., Karpíšková R. (2000): Subdivision of Salmonella enterica serovar Enteritidis phage types PT14b and PT21 by plasmid profilig. Vet. Microbiol. 74: 217–225. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. (1977): DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467. Sedláček I. (2007): Taxonomie prokaryot. Masarykova univerzita, Brno. 132 s. 71

Sedlák K., Tomšíčková M. (2006): Nebezpečné infekce zvířat a člověka. Scientia, Praha. 17, 20–27 s. Sherburne C. K., Lawley T. D., Gilmour M. W., Blattner F. R., Burland V., Grotbeck E., Rose D. J., Taylor D. E. (2000): The complete DNA sequence and analysis of R27, a large IncHI plasmid from Salmonella typhi that is temperature sensitive for transfer. Nucleic Acids Res. 28: 2177–2186. Šilhánková L. (2008): Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Academia, Praha. 34–36 s. Šišák F., Havlíčková H., Hradecká H., Rychlík I., Koláčková I., Karpíšková R. (2006): Antibiotic resistance of Salmonella spp. isolates from pigs in the Czech Republic. Vet. Med. Czech. 51: 303–310. Šmarda J., Doškař J., Pantůček R., Růžičková V., Koptíková J. (2008): Metody molekulární biologie. Masarykova univerzita, Brno. 73, 85 s. Threlfall E. J., Frost J. A., Ward L. R., Rowe B. (1990): Plasmid profile typing can be used to subdivide phage-type 49 of Salmonella typhimurium in outbreak investigations. Epidemiol. Infect. 104: 243–251. Threlfall E. J., Ward L. R., Rowe B. (1997): Increasing incidence of resistence to trimethoprim and ciprofloxacin in epidemic Salmonella typhimurium DT104 in England and Wales. Euro. Surveill. 1997, 2:pii=187. Tindall B. J., Grimont P. A. D., Garrity G. M., Euzéby J. P. (2005): Nomenclature and taxonomy of the genus Salmonella. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55: 521–524. Torrence M. E., Isaacson R. E. (2003): Microbial food safety in animal agriculture: Current topics. Iowa state press, Iowa 2003. 75–79 p. Votava M., Černohorská L., Heroldová M., Holá V., Mejzlíková L., Ondrovčík P., Růžička F., Dvořáčková M., Woznicová V., Zahradníček O. (2003): Lékařská mikrobiologie speciální. Neptun, Brno. 55–56, 60–62 s. Ward L. R., de Sa J. D. H., Rowe B. (1987): A phage-typing scheme for Salmonella enteritidis. Epidemiol. Infect. 99: 291–294.

72

Whitaker J. A., Franco-Paredes E., del Rio C., Edupuganti S. (2009): Rethinking typhoid fever vaccines: implications for travelers and people living in highly endemic areas. J. Travel. Med. 16: 46–52. Zou W., Lin W.-J., Foley S. L., Chen C.-H., Nayak R., Chen J. J. (2010): Evaluation of pulse-field electrophoresis profiles for identification of Salmonella serotypes. J. Clin. Microbiol. 48: 3122–3126. Zprávy: Clinical and laboratory standards institute (2006): Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, 16th informational suplement. ECDC: Annual epidemiological report on communicable diseases: Surveillance report. European Centre for Disease Prevention and Control, 2009: 108–111. EFSA (2006): The community summary report on trends and sources of zoonozes, zoonotic agents, antimicrobial resistence and foodborne outbreaks in the European Union in 2005, The EFSA journal 2006, 94: 27–81. EFSA: Community summary report (2010a): Trends and sources of zoonozes and zoonotic agents and food-borne outbreaks in European Union in 2008. EFSA Journal 8(1): 25–29. EFSA: Summary (2010b): Scientific opinion on a quantitative estimation of the public health impact of setting a new target for the reduction of Salmonella in laying hens. EFSA Journal 8(4): 1546. Internet: CDC – Centre for disease control and prevention. Investigation of outbreak of human infections

causes

by

Salmonella

serotype

I

4,5,12:i:-,

2007.

Dostupné

z:

http://www.cdc.gov/salmonella/4512eyeminus.html Epidat SZÚ, dostupné z: http://www.szu.cz/publikace/data/infekce-v-cr Oxoid News Archive June 2007, dostupné z: http://www.oxoid.com/UK/blue/press/press.asp?art=Y&arch=Y&pRef=PR0296&c=UK&l ang=EN&yr=2007

73

SVS ČR – Program tlumení výskytu salmonel, dostupné z: http://www.svscr.cz/index.php?art=1783

74

7 Seznam zkratek BSA – Bovinní sérový albumin CCM – Czech Collection of Microorganisms CDC – Centers for Disease Control and Prevention DT – Definitive type – používané pro fágové typy S. Typhimurium ECDC – European Center for Disease Prevention and Control EFSA – European Food Safety Authority HPA – Health Protection Agency MLST – Multilocus sequence typing NRL – Národní referenční laboratoř OLHVBP – Odbor laboratoří hygieny výživy a bezpečnosti potravin OOVZ – Orgán ochrany veřejného zdraví PCR – Polymerase chain reaction – polymerázová řetězová reakce PFGE – Pulsed field gel electrophoresis – pulzní gelová elektroforéza PT – Phage type – používané pro fágové typy S. Enteritidis SVS ČR – Státní veterinární správa České republiky SZÚ – Státní zdravotní ústav VNTR – Variable number tandem repeat

75