STUDI PENDAHULUAN UNTUK MENDAPATKAN INFORMASI GEN PENGKODE α-AMILASE DARI BAKTERI LAUT GALUR LOKAL Vibrio sp. SFNB3
TESIS
Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung
Oleh:
TINA DEWI ROSAHDI NIM : 20506001 PROGRAM STUDI KIMIA
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2008
ABSTRAK STUDI PENDAHULUAN UNTUK MENDAPATKAN INFORMASI GEN PENGKODE α-AMILASE DARI BAKTERI LAUT GALUR LOKAL Vibrio sp. SFNB3
Oleh: Tina Dewi Rosahdi 20506001
α-Amilase (1,4-α-D-glukan glukanohidrolase, E.C. 3.2.1.1) adalah endoenzim yang mengkatalisis hidrolisis ikatan α-1,4-glikosidik pada amilosa atau amilopektin menghasilkan α-limit dekstrin, oligosakarida linier, dan sedikit maltosa serta glukosa. α-Amilase yang berasal dari bakteri mendominasi aplikasi dalam sektor industri. Bakteri laut merupakan sumber penghasil α-amilase yang sangat potensial dan belum banyak diteliti. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan informasi mengenai keberadaan gen pengkode α-amilase pada bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3. Fragmen DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 yang telah dipotong oleh enzim restriksi EcoRI dengan ukuran 4,5-6 kb diligasikan dengan vektor pUC19 yang telah dipotong dengan enzim restriksi EcoRI. Penapisan sel transforman yang membawa gen pengkode α-amilase diidentifikasi berdasarkan pada pembentukan daerah bening pada media agar yang mengandung pati setelah diberi penambahan iodin. Hasil analisis restriksi plasmid rekombinan dari transforman E. Coli yang menunjukkan daerah bening (Vsp.7) menunjukkan adanya fragmen DNA kromosom sisipan dengan ukuran sekitar 4,7 kb. Hasil analisis urutan nukleotida fragmen DNA sisipan Vsp.7 menunjukkan kesamaan dengan Hypothetical protein dari Vibrio harveyi ATCC BAA-1116 (nomor akses CP000789.1) dan flavodoxin 2 serta single-stranded-DNA-specific exonuclease RecJ dari Vibrio parahaemolyticus RIMD (nomor akses BA000031.2). Pada fragmen DNA sisipan Vsp.7 tidak diperoleh gen pengkode α-amilase. Meskipun demikian, diperoleh informasi penting bahwa V. parahaemolyticus RIMD mempunyai gen pengkode α-amilase (nomor akses BA000031) dengan panjang basa 2,085 kb dan terdiri dari 695 residu asam amino. Besarnya ukuran gen α-amilase V. parahaemolyticus RIMD ini memunculkan dugaan bahwa αamilase dari V. parahaemolyticus RIMD mempunyai sifat yang berbeda dengan α-amilase pada umumnya. Untuk penelitian selanjutnya, dari urutan nukleotida gen pengkode α-amilase V. parahaemolyticus dapat dibuat rancangan primer dan gen pengkode α-amilase dari bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3 dapat diamplifikasi melalui proses Polymerase Chain Reaction. Kata kunci : α-amilase, kloning, Vibrio sp. i
ABSTRACT PRELIMINARY STUDY ON THE ATTAINMENT OF INFORMATION OF AN α-AMYLASE GENE FROM A LOCAL MARINE Vibrio sp. SFNB3
By: Tina Dewi Rosahdi 20506001 α-Amylases (1,4-α-D-glucan glucanohydrolase, E.C. 3.2.1.1) are endo-acting enzymes that catalyze the hydrolysis of α-1,4-glycosidic linkages of amylose and amylopectin to produce α-limit dextrins, linier olygosaccharides, and a small amount of maltose and glucose. Industrial applications of α-amylases are dominated by α-amylases from bacterial sources. Marine bacteria are one of the potential sources of α-amylases yet to be further explored. The purpose of this research is to gain information about the presence of the local marine Vibrio sp. SFNB3 α-amylase gene. EcoRI digested Vibrio sp. SFNB3 chromosomal DNA fragments with a size of 4.5 to 6 kb were ligated to a pUC19 vector which had been digested by a restriction enzyme EcoRI. Screening of the transformant carrying the α-amylase gene was done based on the presence of a halo area in agar media containing starch after iodine addition. Restriction analysis of the recombinant plasmid from E. coli transformant showing halo area (Vsp.7) showed the present of chromosomal DNA fragment with the size of 4.7 kb. Nucleotide sequence analysis of the Vsp.7 insert DNA showed a similarity with a hypothetical protein from Vibrio harveyi ATCC BAA-1116 (accession number CP000789.1), a flavodoxin 2, and a single-stranded-DNA-specific exonuclease RecJ from Vibrio parahaemolyticus RIMD (accession number BA000031.2). The α-amylase gene was not present on the Vsp.7 insert DNA fragments. However, valuable information was obtained in which V. parahaemolyticus RIMD has a putative gene encoding α-amylase (accession number BA000031) with a size of 2.085 kb and consist of 695 amino acids residues. The size of this V. parahaemolyticus RIMD α-amylase gene is not common for a gene encoding α-amylase, thus indicates that the α-amylase may possess a unique property. For further study, a primer can be designed from the nucleotide sequence of the V. parahaemolyticus RIMD α-amylase gene and the local marine Vibrio sp. SFNB3 α-amylase gene can be amplified by Polymerase Chain Reaction. Key word: α-amylase, cloning, Vibrio sp.
ii
PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS Tesis Magister yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya. Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin Dekan Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung.
iii
Pertama-tama, katakan pada dirimu apa yang akan kau raih; lalu lakukan apa yang perlu kau lakukan (Epictus). Karena sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan (Q.S. Alam Nasyrah:5) Sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan (Q.S. Alam Nasyrah:6) Maka apabila kamu telah selesai (dari sesuatu urusan), kerjakanlah dengan sungguh-sungguh (urusan) yang lain (Q.S. Alam Nasyrah:7)
Kupersembahkan untuk Mama, Bapa, adik-adikku Dan seluruh keluargaku . . . Terima kasih yang tak terhingga atas semuanya
iv
UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur, Alhamdulillahirobbil ‘alamin, penulis panjatkan kehadirat Allah SWT karena atas izin dan karunianya penulis dapat menyelesaikan penyusunan Tesis ini. Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada : 1. Ibu Dr. Dessy Natalia yang telah membimbing dengan penuh kesabaran dan pengertian serta telah memberikan banyak ilmu dan pengetahuannya kepada penulis. 2. Staf pengajar Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung, khususnya bidang Biokimia, Kepala Laboratorium Penelitian Biokimia dan staf program studi Kimia ITB, khususnya staf Laboratorium Penelitian Biokimia, Pak Yayat, Pak Edi, dan Pak Dadan. 3. Ibu Fernita Puspasari, M. Si yang telah banyak memberikan masukan, dukungan dan ilmunya selama penelitian berlangsung; Tunjung Mahatmanto, Iman Prawira, Anastasia Riany, Anna Sanawati, Keni Vidilaseris, Septin Aldila, Edu Ibrahim, Ozy Jumadila, dan Rian yang telah membantu penulis selama penelitian. Teman-teman angkatan 2006, terutama Neneng Yusri Parikesit dan Rina Budi Satiyarti, terima kasih untuk kecerian dan dukungannya, dan teman-teman lainnya yang tidak dapat disebutkan satu persatu. 4. Kedua orang tua, Bapa Dedy Sahdi, S. Pd dan Mama Heni Rohaeni, yang setiap saat selalu memberikan doa, semangat, dan dukungan kepada penulis. Adik-adikku, Wida Sari Rosahdi dan Widi Hernawan Rosahdi yang selalu siap membantu; seluruh keluarga yang selalu mendoakan dan memberikan semangat kepada penulis serta Ade Rusmana yang selalu memberikan inspirasi, motivasi, doa, dan selalu siap membantu penulis. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan tesis ini masih banyak terdapat kekurangan, karenanya dengan segala kerendahan hati, penulis mengharapkan kritik dan saran untuk perbaikan selanjutnya. Semoga karya ini dapat memberikan manfaat. v
Bandung, Juni 2008 Penulis DAFTAR ISI ABSTRAK ......................................................................................................... i ABSTRACT ......................................................................................................
ii
PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS .............................................................. iii UCAPAN TERIMAKASIH .............................................................................
v
DAFTAR ISI .....................................................................................................
vi
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................
ix
DAFTAR TABEL .............................................................................................
xii
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xiii DAFTAR SINGKATAN ..................................................................................
xiv
Bab I
Pendahuluan ................................................................................. 1
Bab II
Tinjauan Pustaka
4
II.1
α-amilase .......................................................................................
4
II.2
Pati .................................................................................................
10
II.3
α-Amilase bakteri laut.................................................................... 13
II.4
Bakteri genus Vibrio ...................................................................... 14
II.5
Kloning gen....................................................................................
16
Metodologi Penelitian
21
III.1
Alat.................................................................................................
21
III.2
Bahan .............................................................................................
22
III.3
Metode............................................................................................
23
III.3.1
Peremajaan kultur dan pertumbuhan bakteri laut galur lokal
Bab III
SFNB3............................................................................................ III.3.2
Isolasi DNA kromosom bakteri laut galur lokal SFNB3 dengan metode Wizard® Genomic DNA Purification Kit..........................
III.3.3
23
Identifikasi bakteri laut galur lokal SFNB3 dengan sekuensing gen 16S rRNA ...............................................................................
III.3.4
23
24
Pemotongan DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 secara parsial dengan enzim restriksi EcoRI ........................................................ 25 vi
III.3.5
Pemurnian DNA dengan GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit .............................................................................
26
III.3.6
Elektroforesis gel agarosa .............................................................. 26
III.3.7
Isolasi DNA plasmid pUC19 dengan metode QIAprep Spin Miniprep Kit...................................................................................
III.3.8
27
Pemotongan DNA plasmid pUC19 dengan enzim restriksi EcoRI dan defosforilasi.............................................................................
27
III.3.9
Ligasi..............................................................................................
28
III.3.10
Pembuatan sel E. coli Top10F’ kompeten.....................................
28
III.3.11
Transformasi E. coli Top10F’ dengan DNA plasmid rekombinan
29
III.3.12
Penapisan (Screening)....................................................................
30
III.3.13
Isolasi plasmid rekombinan yang membawa gen α-amilase dengan metode QIAprep Spin Miniprep Kit...................................
III.3.14
30
Pemotongan plasmid rekombinan yang membawa gen α-amilase dengan enzim restriksi EcoRI......................................................... 31
III.3.15
Analisis urutan nukleotida..............................................................
31
Bab IV
Hasil dan Pembahasan ................................................................
32
IV.1
Pertumbuhan dan penapisan bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3............................................................................................
32
IV.2
Penyiapan DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3..............................
33
IV.3
Identifikasi bakteri laut galur lokal SFNB3 dengan sekuensing gen 16S rRNA................................................................................
IV.4
34
Pemotongan DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 secara parsial dengan enzim restriksi EcoRI......................................................... 35
IV.4.1
Pemotongan DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 secara parsial dengan variasi aktivitas unit enzim restriksi EcoRI.......................
IV.4.2
36
Pemotongan DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 secara parsial oleh enzim restriksi EcoRI dengan variasi waktu inkubasi............ 37
IV.4.3
Pemotongan dan pemurnian fragmen DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 ...........................................................................................
IV.5
Isolasi DNA plasmid pUC19 dengan QIAprep Spin Miniprep Kit...................................................................................................
IV.6
38 40
Pemotongan, defosforilasi dan pemurnian DNA plasmid 41 vii
pUC19............................................................................................ IV.7
Transformasi E. coli TOP10F’ dengan plasmid rekombinan.........
42
IV.8
Penapisan sel transforman .............................................................
44
IV.9
Isolasi plasmid rekombinan Vsp.7 dengan metode QIAprep Spin Miniprep Kit dan pemotongan dengan enzim restriksi EcoRI ......
IV.10
45
Analisis urutan nukleotida Vsp.7 ................................................... 46
Bab V
Kesimpulan dan Saran ................................................................ 54
V.1
Kesimpulan .................................................................................... 54
V.2
Saran ..............................................................................................
54
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................
55
LAMPIRAN ......................................................................................................
58
viii
DAFTAR GAMBAR
Gambar II.1
Proses hidrolisis ikatan α-1,4-glikosidik pada amilopektin...
4
Gambar II.2
Struktur tiga dimensi α-amilase.............................................
5
Gambar II.3
Struktur (A) dan topologi (B) (β/α)8 atau TIM barrel............
6
Gambar II.4
Diagram topologi α-amilase (Nielsen et al., 2000)...............
7
Gambar II.5
Mekanisme
double
intermediet
kovalen
displacement dengan
dan
pembentukan
mempertahankan
aksi
glikosilhidrolase..................................................................... Gambar II.6
8
Skema susunan subsite dengan penempatan oligosakarida pada subsite –5 sampai +3.....................................................
9
Gambar II.7
Susunan domain dan letak asam amino pada α-amilase........ 9
Gambar II.8
Komponen pati jagung (G adalah unit anhidroglukosa)........
Gambar II.9
Struktur granula pati dengan bagian amorf dan semikristalin yang membentuk cincin...........................................
Gambar II.10
11 12
Iodin setelah ditambahkan pada media agar mengandung pati.......................................................................................... 13
Gambar II.11
Vibrio cholerae......................................................................
Gambar III.1
Peta restriksi plasmid pUC19................................................. 22
Gambar IV.1
Pertumbuhan dan penapisan bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3..............................................................................
Gambar IV.2
15
32
Elektroforegram hasil isolasi DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3
dengan
metode
Wizard®
Genomic
DNA
Purification Kit......................................................................
34
Gambar IV.3
Elektroforegram hasil PCR 16S rRNA..................................
34
Gambar IV.4
Urutan Nukleotida gen 16S rRNA bakteri laut galur lokal SFNB3.................................................................................... 35
Gambar IV.5
Elektroforegram
pemotongan
secara
parsial
DNA
kromosom Vibrio sp. SFNB3 oleh enzim restriksi EcoRI ix
dengan variasi aktivitas unit enzim restriksi..........................
Gambar IV.6
Elektroforegram
pemotongan
secara
parsial
36
DNA
kromosom Vibrio sp. SFNB3 oleh enzim restriksi EcoRI dengan variasi waktu inkubasi............................................... Gambar IV.7
Elektroforegram
pemotongan
secara
parsial
37
DNA
kromosom Vibrio sp. SFNB3 oleh enzim restriksi EcoRI dengan perbandingan waktu inkubasi.................................... Gambar IV.8
Elektroforegram pemotongan fragmen DNA kromosom dengan enzim restriksi EcoRI................................................
Gambar IV.9
38 39
Elektroforegram pemurnian DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 dengan GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit......................................................................
40
Gambar IV.10
Elektroforegram hasil isolasi DNA pUC19...........................
41
Gambar IV.11
Elektroforegram hasil pemotongan, defosforilasi, dan pemurnian pUC19..................................................................
Gambar IV.12
Hasil transformasi E. coli TOP10F’ dengan plasmid rekombinan............................................................................
Gambar IV.13
46
Strategi penentuan urutan nukleotida fragmen DNA sisipan Vsp.7 dengan metode dideoxy Sanger...................................
Gambar IV.17
45
Elektroforegram hasil pemotongan plasmid rekombinan Vsp.7 dengan enzim restriksi EcoRI......................................
Gambar IV.16
44
Elektroforegram hasil isolasi plasmid rekombinan Vsp.7 dengan metode QIAprep Spin Miniprep Kit..........................
Gambar IV.15
43
Penapisan sel transforman dengan menggunakan Dsikloserin dan KI/I2................................................................
Gambar IV.14
42
47
Hasil pensejajaran urutan nukleotida Vsp.7-M13F-pUC dari Vibrio sp. SFNB3 dengan urutan nukleotida flavodoxin 2 dari V. parahaemolyticus........................................................ 48
Gambar IV.18
Hasil pensejajaran urutan nukleotida Vsp.7-M13R-pUC dari Vibrio sp. SFNB3 dengan urutan nukleotida singlestranded-DNA-specific
x
exonuclease
RecJ
dari
V.
parahaemolyticus...................................................................
Gambar IV.19
49
Skema gen-gen pengkode yang diduga terdapat pada fragmen DNA sisipan Vsp.7 dari bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3...................................................................
Gambar IV.20
Pensejajaran urutan asam amino α-amilase dari beberapa spesies dengan genus Vibrio.................................................
Gambar IV.21
50 51
Domain yang terdapat pada α-amilase V. parahaemolyticus RIMD (program Conserved Domains, situs NCBI) .............
xi
52
DAFTAR TABEL
Tabel II.1
Empat daerah lestari dan berhubungan dengan β-sheets yang ditemukan dalam urutan asam amino enzim keluarga αamilase ..................................................................................... 6
Tabel II.2
Jenis-jenis vektor dan ukuran insert yang dibawa...................
xii
17
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran A
Elektroforegram hasil sekuensing Gen 16S rRNA bakteri laut galur lokal SFNB3 ............................................................ 59
Lampiran B
Elektroforegram hasil sekuensing fragmen DNA sisipan pada plasmid rekombinan (Vsp.7) ..........................................
Lampiran C
Analisis urutan asam amino pengkode α-amilase pada genus Vibrio
dengan
program
Conserved
Domain
dari
NCBI ....................................................................................... Lampiran D
61
63
Analisis urutan asam amino pengkode α-amilase pada beberapa spesies dengan program Conserved Domain dari NCBI .......................................................................................
xiii
65
DAFTAR SINGKATAN
DNA
: Deoxyribo Nucleic Acid
dNTP
: deoxy Nucleotide Tri Phosphate
EDTA
: Etilen Diamin Tetra Asetat
kb
: Kilo basa
kDa
: Kilo Dalton
LB
: Luria-Bertani
LBA
: Luria-Bertani + ampisilin
NCBI
: National Center for Biotechnology Information
OD
: Optical Density
pb
: pasang basa
PCR
: Polymerase Chain Reaction
xiv
