J Kedokter Trisakti
Vol.23 No.3
Studi in vitro : hambatan zink sulfat terhadap pertumbuhan kuman Salmonella Julius E. Suryawidjaja*, Elly Herwana**, Adi Hidayat***, dan Murad Lesmana* *
Bagian Mikrobiologi, **Bagian Farmakologi, dan ***Bagian Kesehatan Masyarakat, Fakultas Kedokteran Universitas Trisakti
ABSTRAK Suplementasi zink dilaporkan dapat mengurangi lama dan beratnya diare dengan cara mempercepat terjadinya penyembuhan dan regenerasi sel-sel epitel intestinal yang mengalami kerusakan. Di antara kuman-kuman yang menyebabkan diare, Salmonella masih tetap menjadi masalah kesehatan yang utama. Mekanisme kerja efek langsung zink terhadap kuman penyebab diare Salmonella belum pernah dilaporkan. Penelitian ini bertujuan menilai efek hambatan zink sulfat terhadap pertumbuhan galur klinis Salmonella enterica ser. Typhi dan Salmonellae non-tifoid. Hasil penelitian menunjukkan, sebanyak 15% isolat Salmonella ser. Typhi mengalami hambatan oleh zink sulfat pada konsentrasi 1,0 mg/mL dan hambatan terhadap seluruh isolat ditunjukkan pada konsentrasi zink sulfat sebesar 1,8 mg/mL. Setelah galur Salmonella ser. Typhi, Salmonella ser. Typhimurium, dalam jumlah 7%, juga telah dihambat oleh zink sulfat pada konsentrasi 1,0 mg/mL. Salmonellae lainnya menunjukkan hambatan pertumbuhan oleh zink sulfat antara konsentrasi 1,2 mg/mL dan 2,0 mg/mL. Salmonella ser. Paratyphi A adalah satu-satunya spesies Salmonella yang memperlihatkan rentangan konsentrasi hambatan zink yang sempit yaitu antara 1,2 – 1,6 mg/mL. Studi invitro ini menunjukkan bahwa zink menghambat pertumbuhan serotipe Salmonella yang seringkali merupakan penyebab diare. Kata kunci : Zink sulfat, hambatan, pertumbuhan, Salmonella, diare
An in vitro study : inhibition effect of zinc sulfate on growth of Salmonella species ABSTRACT Zinc supplementation has been reported effective in reducing the duration and severity of diarrhea by enhancing the recovery and regeneration of impaired intestinal epithelial cells. Among enteropathogens that cause diarrhea, Salmonella species are one of the major pathogens causing diarrheal diseases. Effect of zinc on growth of Salmonella species had never been reported. This study was undertaken to evaluate the inhibition effect of zinc sulfate on growth of Salmonella species. A number (15%) of Salmonella ser. Typhi strains tested were inhibited by zinc sulfate of 1.0 mg/mL and were completely inhibited at the concentration of zinc sulfate of 1.8 mg/mL. Following Salmonella ser. Typhi was Salmonella ser. Typhimurium, of which 7% were also beginning to be inhibited by zinc sulfate at 1.0 mg/mL. Other Salmonellae were inhibited by zinc sulfate at concentrations between 1.2 mg/mL and 2.0 mg/mL. However, Salmonella ser. Paratyphi A was the only Salmonella species which showed a narrow range of zinc inhibition concentrations, between 1.2 – 1.6 mg/mL. This in vitro study indicate that zinc has an inhibition effect on growth of Salmonella serotypes which was found as the causative agents of diarrheal diseases. Key words : Zinc sulfate, inhibition, growth, Salmonella, diarrhea
81
Surjawidjaja, Herwana, Hidayat, Lesmana
PENDAHULUAN Penyakit infeksi diare merupakan kausa utama dari morbiditas dan mortalitas pada anak-anak di seluruh dunia. Pada anak-anak di bawah usia 5 tahun dilaporkan setiap tahun sekitar 1,5 miliar episode dan 1,5 - 2,5 juta kematian akibat diare.(1,2) Diare terjadi umumnya di daerah dengan kondisi sanitasi dan hygiene lingkungan buruk, penyediaan air yang tidak memadai, kemiskinan, serta pendidikan yang masih terbatas, seperti yang banyak dijumpai di negara-negara berkembang.(2) Survei Kesehatan Nasional yang diselenggarakan oleh Departemen Kesehatan Republik Indonesia pada tahun 2001 menunjukkan sekitar 9,4% kematian pada bayi-bayi dan 13,2% pada anakanak yang berumur antara 1-4 tahun, disebabkan oleh karena diare.(3) Meskipun penggunaan larutan rehidrasi oral telah berhasil secara substansial menurunkan mortalitas diare di seluruh dunia, namun morbiditas infeksi diare masih tetap tinggi dan merupakan masalah kesehatan masyarakat.(1,4) Di antara kuman-kuman yang menyebabkan diare, Salmonella masih tetap menjadi masalah kesehatan yang utama. Salmonellosis nontifoid dan tifoid jelas merupakan penyakit yang terjadi diakibatkan oleh makanan (foodborne disease). Walaupun dilaporkan bahwa insidens penyakit tifoid selama beberapa tahun ini stabil, kasus-kasus salmonellosis nontifoid meningkat di mana-mana di dunia.(4) Sejak lebih dari dua dekade terakhir, insidens infeksi Salmonella nontifoid di beberapa negara naik dengan pesat sehingga mencapai tingkat epidemik. (5,6) Infeksi oleh nontifoid Salmonella biasanya merupakan suatu gastroenteritis yang sembuh sendiri (self-limiting) dan tidak membutuhkan pengobatan antibiotika, namun sekuele yang serius meliputi infeksi sistemik dan kematian seringkali terjadi.(6) Pada keadaan ini sering kali antibiotika sangat dibutuhkan. Namun, akhir-akhir ini banyak galur Salmonella yang telah berkembang menjadi resisten terhadap satu atau lebih (multi-resisten) antibiotika yang lazim digunakan pada pengobatan diare. Penggunaan zink untuk pengobatan beberapa penyakit serta efek dari suplementasi zink terhadap penyakit diare telah banyak dilaporkan. (7-9) 82
Hambatan zink terhadap Salmonella
Suplementasi zink terbukti secara efektif mengurangi lamanya serta beratnya penyakit diare pada anak di bawah usia 3 tahun. (7) Efek ini dilaporkan konsisten pada semua penelitian suplementasi zink terhadap infeksi diare. Meskipun mekanisme kerja zink pada kasus-kasus diare belum secara keseluruhan dimengerti, namun hasil dari beberapa penelitian menunjang observasi tentang efek positif zink untuk mencegah terjadinya diare berkelanjutan atau diare kronik dengan cara mempercepat penyembuhan dan regenerasi sel-sel epitel usus yang rusak yang disebabkan oleh diare.(8,9) Sejauh ini, laporan-laporan mengenai suplementasi zink dalam kaitan dengan penyakit infeksi diare hanya sampai pada kesimpulan bahwa zink mempunyai efek di dalam memperbaiki kerusakan usus serta mengembalikan fungsinya yang meliputi absorpsi cairan dan elektrolit, serta meningkatkan respons imunitas setempat. (9) Sedangkan efek langsung zink terhadap kuman penyebab diare belum pernah dilaporkan. Penelitian ini bertujuan menilai efek hambatan zink sulfat terhadap pertumbuhan spesies kuman Salmonella, khususnya serotipe yang sering dijumpai sebagai penyebab diare. METODE Medium agar zink sulfat (ZSA) Larutan zink sulfat dibuat dengan cara melarutkan 0,2 g ZnSO4.7H2O ke dalam 10 mL air suling (distilled water) untuk mendapatkan konsentrasi zink sulfat sebesar 20 mg/mL (larutan induk). Larutan disterilkan dengan cara filtrasi, menggunakan filter Millipore (Millipore Co., Bedford, MA). Dari larutan induk ini (20 mg/mL), diambil berbagai volume untuk ditambahkan kepada agar Mueller Hinton cair (500C) sampai volumenya menjadi 20 mL sehingga didapatkan konsentrasi zink sulfat tertentu dalam agar Mueller Hinton. Agar yang mengandung zink sulfat ini kemudian dituang ke dalam lempeng petri dan dibiarkan dingin dan membeku pada suhu kamar. Dengan cara ini diperoleh medium agar zink sulfat (ZSA) dengan kandungan zink sulfat pada masingmasing medium sebesar 0,2 mg/mL, 0,4 mg/mL,
J Kedokter Trisakti
0,6 mg/mL, 0,8 mg/mL, 1,0 mg/mL, 1,2 mg/mL, 1,4 mg/mL, 1,6 mg/mL, 1,8 mg/mL, dan 2,0 mg/mL. Isolat kuman Isolat kuman patogen enterik yang digunakan pada studi ini adalah isolat klinik Salmonella yang berasal dari penderita diare dan merupakan kumpulan isolat (stock cultures) di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Trisakti. Masing-masing isolat tersebut adalah Salmonella enterica ser. Typhi, Salmonella enterica ser. Paratyphi A, Salmonella enterica ser. Typhimurium, Salmonella enterica ser. Virchow, Salmonella enterica ser. Hadar, Salmonella enterica ser. Enteritidis, dan Salmonella enterica ser. Weltevreden. Jumlah masing-masing serotipe Salmonella yang diuji dicantumkan pada Tabel 1. Jumlah keseluruhan isolat Salmonella yang digunakan di dalam pengujian ini adalah 310. Di Laboratorium, isolat-isolat disimpan sebagai biakan kuman di dalam tryptic soy broth (TSB) yang ditambah gliserol dengan kadar 20%, dibekukan dan diletakkan di dalam lemari pendingin bersuhu –70 0C. Sebelum pengujian, biakan dikeluarkan dan dibiarkan mencair (thawed) pada suhu kamar. Selanjutnya biakan ditanamkan pada medium agar darah, diinkubasikan pada suhu 370C untuk waktu 18-24 jam. Koloni-koloni yang tumbuh diseleksi, diambil dan diuji secara biokimiawi untuk menentukan identitas dan kemurniannya. Biakan murni dari kuman patogen enterik ini kemudian dipindahkan ke dalam tabung yang berisi 5 mL kaldu brain heart infusion (BHI), dan diinkubasi 18-24 jam pada suhu 370C. Tabel 1. Jenis-jenis Salmonella yang digunakan pada pengujian zink
Vol.23 No.3
Inokulasi zink sulfat agar Biakan kuman Salmonella dalam BHI yang berumur 18-24 jam tersebut kepekatannya disesuaikan dengan standar McFarland 0,5 dengan cara menambahkan larutan garam faal ke dalam biakan kaldu sampai diperoleh kekeruhan sesuai yang dikehendaki. Biakan kaldu berisi kuman yang telah ditipiskan sesuai dengan standar McFarland 0,5 ini dipindahkan ke dalam sumur-sumur microtiter plate. Ke dalam masing-masing sumur ini dimasukkan 10 ml biakan kaldu. Inokulasi ZSA dilakukan dengan menggunakan suatu aparatus replikasi inokulum berupa lempeng logam dengan sengkelit jarum yang jumlahnya 32 buah sehingga dapat memindahkan biakan dalam jumlah yang sekaligus banyak (32 buah) ke atas lempeng agar. Dengan menggunakan aparatus replikasi inokulum, diambil 1 ml biakan kaldu dan dipindahkan ke atas lempeng agar ZSA. Semua biakan kaldu juga dipindah tanamkan ke atas lempeng agar Mueller Hinton yang tidak mengandung zink sebagai pembanding (kontrol). Lempeng-lempeng agar kemudian diinkubasi selama 18-24 jam secara aerobik pada suhu 370C. Interpretasi hasil pengujian Konsentrasi hambatan minimal dari zink sulfat dibaca dan dicatat sebagai konsentrasi terendah dari zink sulfat yang menyebabkan hambatan lengkap terhadap biakan pada lempeng agar ZSA dan Mueller Hinton (sebagai pembanding), dengan mengabaikan adanya satu koloni tunggal atau pertumbuhan tipis yang disebabkan inokulum. HASIL Hasil pengujian efek hambatan zink sulfat terhadap berbagai serotipe Salmonella disajikan pada Tabel 2. Efek hambatan dari zink sulfat mulai tampak pada konsentrasi 0,8 mg/mL. Pada konsentrasi ini, 15% dari Salmonella enterica ser. Typhi yang diuji dan 7% dari Salmonella ser. Typhimurium, sudah mengalami hambatan, sedangkan galur Salmonella lainnya baru mulai mengalami hambatan oleh zink sulfat pada konsentrasi >1,0 mg/mL atau lebih tinggi. 83
Surjawidjaja, Herwana, Hidayat, Lesmana
Hambatan zink terhadap Salmonella
Tabel 2. Konsentrasi hambatan zink sulfat terhadap Salmonella enterica ser. Typhi dan Salmonella non-typhoid
Meskipun demikian, sebanyak ≥ 50% dari isolat yang diuji mengalami hambatan pada kadar zink sulfat antara 1,2 - 1,4 mg/mL. Salmonella enterica ser. Virchow (20%) dan ser. Hadar (33%), keduanya termasuk di dalam Salmonella serogrup C, tampak mulai mengalami hambatan pada konsentrasi zink sulfat lebih tinggi yaitu 1,2 mg/mL, sedangkan inhibisi oleh zink sulfat sebesar 50% tampak pada Salmonella ser. Virchow pada konsentrasi zink sulfat antara 1,4 to 1,5 mg/ mL dan pada Salmonella ser. Hadar pada konsentrasi 1,4 mg/mL. Meskipun hampir semua Salmonella ser. Typhimurium (91%) dan Salmonella ser. Typhi (96%) serta Salmonella ser. Enteritidis (98%) telah mengalami hambatan pertumbuhan pada konsentrasi zink sulfat 1,4 mg/mL; tetapi baru pada konsentrasi 1,6 mg/mL mereka secara keseluruhan mengalami hambatan. Hambatan terhadap seluruh (100%) isolat Salmonella ser. Paratyphi A yang diuji diperlihatkan oleh zink sulfat dengan konsentrasi 1,4 mg/mL. Sekitar 2-4% Salmonella ser. Hadar, ser. Virchow dan ser. Weltevreden masih bertahan pada konsentrasi zink sulfat 1,6 mg/mL, tetapi seluruhnya tidak tumbuh lagi pada zink sulfat dengan konsentrasi 1,8 mg/mL. Pada konsentrasi zink sulfat 2,0 mg/mL tidak ada lagi isolat Salmonella yang masih menunjukkan pertumbuhan. PEMBAHASAN Defisiensi zink yang ringan dan sedang kerap kali dijumpai terutama pada anak-anak di negara 84
berkembang. Defisiensi zink dianggap menjadi salah satu penyebab meningkatnya insidens diare dan keadaan ini memperburuk episode penyakit.(10) Baqui dkk.(9) melaporkan bahwa anak-anak yang mendapat suplementasi zink pada saat mengalami dan sesudah menderita diare, menunjukkan penurunan durasi diare sebesar 24% dan penurunan insidens diare sebesar 15%, serta kecenderungan berkurangnya risiko untuk mengalami diare kembali. Hasil yang dilaporkan oleh Baqui dkk.(9) ini sesuai dan konsisten dengan laporan-laporan lain sebelumnya yang menyatakan bahwa pemberian zink pada bayi dan anak-anak penderita diare, secara klinis menunjukkan reduksi dari durasi episode diare, berkurangnya berat penyakit serta menurunnya risiko diare yang berkepanjangan. Dengan demikian zink mengurangi frekuensi terjadinya diare kronis dan durasi penderita yang mengalami tinja berair. (6,7,9) Mekanisme dari suplementasi zink terhadap penyakit diare belum seluruhnya diketahui. Ada kemungkinan efek zink di dalam menghentikan proses diare berhubungan dengan terjadinya perbaikan dari absorpsi air dan elektrolit oleh usus, (11) regenerasi epitel usus, meningkatnya kadar enzim enterosit dan ekskresi kuman-kuman patogen dari usus yang terjadi lebih cepat.(9,12) Studi in vitro ini menunjukkan bahwa zink sulfat pada konsentrasi antara 1,2 dan 1,8 mg/ mL mampu menghambat pertumbuhan Salmonella. Penelitian efek antimikrobial dari zink secara in vitro ini dilakukan terhadap Salmonella karena kuman ini di Indonesia merupakan mikro-organisme yang dominan sebagai kausa diare bersama-sama
J Kedokter Trisakti
dengan Vibrio cholerae dan Shigella.(13) Bentuk zink yang digunakan pada penelitian ini adalah zink sulfat (ZnSO4.7H20) karena bahan atau senyawa ini yang paling banyak dipakai sebagai suplementasi pada penyakit diare. Dari hasil penelitian ini tampak bahwa mayoritas (≥96%) dari kuman Salmonella yang diuji mengalami hambatan oleh zink sulfat pada nilai konsentrasi minimal zink sulfat antara 1,4 - 1,6 mg/mL dan seluruh isolat Salmonella tidak tumbuh lagi pada medium yang mengandung zink sulfat dengan konsentrasi 2,0 mg/ mL. Dosis suplementasi zink yang digunakan untuk penderita diare anak-anak seperti dilaporkan(12,14,15) adalah antara 20 mg/hari sampai 25 mg/hari atau setara dengan 88 mg - 110 mg zink sulfat (ZnSO4.7H2O). Mengingat bahwa zink sulfat yang akan diabsorpsi di usus hanya sekitar 5% sampai 26% saja(16) maka 74-95% atau 65,1 mg – 104,5 mg dari dosis inisial (88 mg - 110 mg) yang diberikan ke penderita, yang sebenarnya tertinggal di usus, tidak diabsorpsi. Jumlah ini akan terdistribusi ke seluruh usus dan beberapa faktor seperti misalnya gerakan usus, asupan dan retensi air, dapat mengubah konsentrasi relatif dari zink sulfat yang tidak terabsorpsi sehingga menyebabkan konsentrasi zink sulfat di tempat-tempat tersebut menjadi jauh lebih rendah. Namun, dosis yang digunakan dalam berbagai penelitian diare pada anak-anak (7-9,12) terbukti cukup efektif untuk menyembuhkan diare. Konsentrasi zink sulfat yang tidak terabsorpsi dan tertinggal di usus ini masih lebih tinggi bila dibandingkan dengan konsentrasi hambatan minimal zink sulfat terhadap Salmonella (2,0 mg/mL).
Vol.23 No.3
UCAPAN TERIMA KASIH Peneliti mengucapkan terima kasih kepada Pimpinan Fakultas Kedokteran Universitas Trisakti yang telah memberikan bantuan dana bagi kegiatan penelitian ini. Tidak lupa ucapan terima kasih disampaikan kepada para petugas Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Trisakti atas bantuannya mempersiapkan kumpulan isolat. Daftar Pustaka 1.
2.
3.
4.
5.
6. 7.
KESIMPULAN Zink tidak hanya mempunyai efek terapeutis yang sifatnya faali seperti yang ditujukkan oleh khasiatnya pada penyembuhan penyakit diare, tetapi zink juga mempunyai efek menghambat pertumbuhan kuman Salmonella. Dengan demikian penyembuhan penyakit, berkurangnya gejala-gejala penyakit yang berat dan menurunnya risiko terjadinya diare yang berkepanjangan adalah karena efek dual dari zink.
8.
9.
Black RE, Morrin SS, Bryce J. Where and why are 10 million children dying every year. Lancet 2003; 361: 2226-34. Kosek M, Bern C, Guerrant RI. The global burden of diarrheal disease, as estimated from studies published between 1992-2000. Bull WHO 2003; 81: 197-204. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Survei kesehatan nasional 2001. Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Departemen Kesehatan Republik Indonesia; 2002. Victoria CG, Bryce J, Fantaine O, Mcmasch R. Reducing deaths from through oral rehydration therapy. Bull World Health Organ 2000; 78: 124655. Olsen SJ, Bishop R, Brenner FW, Roels TH, Bean N, Tauxe RV, et al. The changing epidemiology of Salmonella: Trends in serotypes isolated from humans in the United States, 1987-1997. J Infect Dis 2001; 183: 753-61. Fierer J, Swancutt M. Non-typhoid Salmonella: a review. Curr Clin Trop Infect Dis 2000;20:134-57. Hidayat A, Achadi A, Sunoto, Soemarmo PS. The effect of zinc sulfate supplementation in children under three years of age with acute diarrhea in Indonesia. Med J Indones 1998; 7: 237-41. Gupta DN, Mondal SK, Ghosh S, Rajendran K, Sur D, Manna B. Impact of zinc supplementation on diarrhoeal morbidity in rural children of West Bengal, India. Acta Paediatr 2003; 92: 531-6. Baqui A, Black RE, Arifeen SE, Yunus M, Chakraborty J, Ahmend S, et al. Effect of zinc supplementation started during diarrhoea on morbidity and mortality in Bangladeshi children: community randomized trial. BMJ 2002; 325: 1059-63.
85
Surjawidjaja, Herwana, Hidayat, Lesmana
10.
11.
12.
13.
86
Bahl R, Bhandari N, Hambidge KM, Bhan MK. Plasma zinc as a predictor of diarrheal and respiratory morbidity in children in an urban slum setting. Am J Clin Nutr 1998; 68 (suppl): 414S7S. Gishan F. Transport of electrolytes, water and glucose in Zn deficiency. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1984; 3: 608-12. Sazawal S, Black RE, Bhan MK, Bhandari N, Sinha A, Jalla S. Zinc supplementation in young children with acute diarrhea in India. N Engl J Med 1995; 333:839-44. Oyofo BA, Subekti D, Tjaniadi P, Machpud N, Komalarini S, Setiawan B, et al. Enteropathogens associated with acute diarrhea in community and
Hambatan zink terhadap Salmonella
14.
15.
16.
hospital patients in Jakarta, Indonesia. FEMS Immunol Med Microbiol 2002; 34: 139-46. Strand TA, Chandyo RK, Bahl R, Sharma PR, Adhikara RK, Bhandari N, et al. Effectiveness and efficacy of zinc for the treatment of acute diarrhea in young children. Pediatrics 2002; 109: 898-903. Bhandari N, Bahl R, Taneja S, Strand TA, Molbak K, Ulvik RJ, et al. Substantial reduction in severe diarrheal morbidity by daily zinc supplementation in young North Indian children. Pediatrics 2002; 109: 86-92. Bettger WJ, O’Dell BL. A critical physiological role of zinc sulfate in the structure and function of biomembranes. Life Sci 1981; 28: 1425-38.
