Efek hambatan zink sulfat terhadap pertumbuhan Shigella spp

Universa Medicina

Januari-Maret 2006, Vol.25 No.1

Efek hambatan zink sulfat terhadap pertumbuhan Shigella spp. Elly Herwana*a, Julius E. Surjawidjaja **, Murad Lesmana **, dan Adi Hidayat *** *

Bagian Farmakologi, ** Bagian Mikrobiologi, *** Bagian Ilmu Kedokteran Komunitas Fakultas Kedokteran Universitas Trisakti

ABSTRAK Shigella adalah bakteri enterik patogen yang penting sebagai penyebab diare. Insidens shigellosis yang tinggi didapatkan di negara berkembang di mana standar hidup rendah dan kondisi sanitasi yang buruk. Sementara itu bakteri Shigella menunjukkan perluasan resistensinya terhadap antimikroba yang digunakan untuk mengatasi diare. Saat ini telah dilaporkan bahwa zink sulfat menunjukkan efek hambatan terhadap beberapa bakteri enterik patogen. Pada penelitian ini dilakukan studi in vitro tentang efek hambatan zink sulfat terhadap pertumbuhan Shigella spp. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa dari 135 isolat Shigella spp. yang diuji, 60-80% dapat dihambat pertumbuhannya oleh zink sulfat pada konsentrasi 1,4 mg/mL. Pada konsentrasi zink sulfat ini terjadi hambatan terhadap 80% dari S. dysenteriae, 77,5% dari S. flexneri, 83,8% dari S. sonnei, dan 66,7% dari S. boydii. Pada kadar zink sulfat 1,6 mg/mL, bakteri S. dysenteriae dan S. boydii dihambat secara lengkap, sementara untuk S. flexneri dan S. sonnei dibutuhkan kadar yang lebih tinggi yaitu 2 mg/mL. Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa di antara spesies Shigella, S. dysenteriae adalah yang paling sensitif, sebanyak 70% dapat dihambat pada kadar zink sulfat sebesar 1,2 mg/mL. Diperlukan studi lebih lanjut untuk mengetahui manfaat zink sulfat sebagai ajuvan dari antibiotika untuk mengatasi pasien diare sejak diketahui bahwa Shigella spp. menunjukkan multiresistensi terhadap antibiotika. Kata kunci : Shigella, diare, zink sulfat, hambatan

Inhibition effect of zinc sulfate on growth of Shigella spp. ABSTRACT Shigella is increasingly recognized as an important enteric pathogen causing diarrhea. The incidence of shigellosis is highest in developing countries where standard of living and sanitary conditions are usually poor. Over the years, Shigella spp. have developed resistance to most antimicrobial agents used for treatment of diarrhea. We conducted an in vitro study to evaluate the inhibition effect of zinc sulfate on Shigella spp. The study shows that of 135 Shigella isolates tested, 60-80% were inhibited by zinc sulfate at concentration of 1.4 mg/ml. At this concentration of zinc sulfate, 80% of S. dysenteriae, 77.5% of S. flexneri, 83.4% of S. sonnei and 66.7% of S. boydii, were inhibited. While S. dysenteriae and S. boydii were completely inhibited at the concentration of zinc sulfate 1.6 mg/ml, S. flexneri and S. sonnei required a higher concentration of zinc sulfate for a complete inhibition, which was 2 mg/ml. However, the majority of S. flexneri (88.8%) and S. sonnei (93.7%) have been inhibited by zinc sulfate at concentration of 1.6 mg/ml. This study also shows that among the Shigella species, S. dysenteriae was the most sensitive to zinc sulfate with 70% inhibition at zinc sulfate concentration of 1.2 mg/ml. Therefore further study needed to evaluate the effect of zinc sulfate as an adjuvant of antibiotic therapy in diarrhea patients since many Shigella spp. have shown multi-resistance to antibiotics. Keywords : Shigella, diarrhea, zinc sulfate, inhibition

Korespondensi : aElly Herwana Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran, Universitas Trisakti Jl. Kyai Tapa No.260, Grogol Jakarta 11440 Tel. 021-5672731 eks. 2801, Fax. 021-5660706 E-Mail : [email protected]

1

Herwana, Surjawidjaja, Lesmana, dkk

PENDAHULUAN Penyakit infeksi diare masih menjadi masalah kesehatan sebagai penyebab utama dari morbiditas dan mortalitas pada anak-anak di negara berkembang. Kasus infeksi diare lebih sering terjadi di lingkungan dengan kondisi sanitasi dan hygiene yang buruk, ketersediaan sumber air bersih yang kurang, kemiskinan, d a n p e n d i d i k a n y a n g r e n d a h . (1) S u r v e i Kesehatan Nasional yang dilakukan oleh Departemen Kesehatan Republik Indonesia pada tahun 2001 menunjukkan bahwa sekitar 9,4% kematian pada bayi dan 13,2% kematian pada anak usia 1-4 tahun adalah akibat infeksi diare. (2) Shigella spp. merupakan penyebab infeksi diare yang dominan untuk negara berkembang. Setiap tahun, diperkirakan ada sekitar 164,7 juta kasus infeksi diare yang disebabkan oleh kuman Shigella, dan 163,2 juta di antaranya t e r j a d i d i n e g a r a b e r k e m b a n g . ( 3 ) Te r a p i rehidrasi oral secara bermakna terbukti menurunkan angka kematian diare akibat dehidrasi. (4) Namun ternyata intervensi ini hanya sedikit memberikan manfaat bagi pasien dengan diare yang disebabkan oleh infeksi bakteri enteropatogen yang invasif seperti Shigella. Akibatnya diare tetap saja menempati peringkat utama dalam masalah kesehatan di negara berkembang. (5) Diare pada anak-anak dapat memberikan dampak yang merugikan terhadap status gizi anak. ( 6 - 9 ) Malnutrisi dapat terjadi akibat kurangnya asupan nutrisi, anoreksia, kerusakan dan kematian sel mukosa usus yang disebabkan oleh diare. (8-9) Masalah ini menjadi lebih buruk sebab Shigella menunjukkan resistensi terhadap antibiotika yang digunakan sebagai obat pilihan utama (first line therapy) untuk mengatasi infeksi diare seperti ampisilin, tetrasiklin, dan trimetoprimsulfametotoksazol. (10) 2

Zink sulfat dan Shigella spp.

Penelitian terhadap suplementasi zink pada anak-anak dengan diare akut telah dilakukan di berbagai negara menunjukkan efek yang bermakna dalam mengurangi durasi diare dan mencegah terjadinya diare persisten. (11-15) Efektivitas suplementasi zink terhadap diare dikaitkan dengan mempercepat penyembuhan dan regenerasi sel-sel epitel usus yang rusak akibat infeksi diare sehingga dapat mengembalikan fungsinya yang meliputi absorbsi cairan dan elektrolit. Peningkatan respons imunitas seluler juga diperkirakan dapat terjadi pada suplementasi zink. Meskipun demikian, penelitian mengenai efek langsung zink terhadap bakteri enteropatogen penyebab diare belum banyak dilaporkan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek hambatan zink sulfat secara in vitro terhadap pertumbuhan Shigella, terutama terhadap spesies yang paling sering dijumpai sebagai bakteri penyebab diare. METODE Medium agar zink sulfat (ZSA) Dibuat larutan zink sulfat dengan konsentrasi 40 mg/mL sebagai larutan induk dengan cara melarutkan 0,4 g ZnSO 4.7H 20 ke dalam 10 mL air suling (destilated water). Untuk mensterilkan larutan dilakukan filtrasi dengan menggunakan filter Millipore (Millipore Co., Bedford, MA). Dari larutan induk yang mengandung zink sulfat 40 mg/mL ditambahkan pada agar Muller Hinton cair (50 0C) untuk membuat medium agar zink sulfat (ZSA) dengan konsentrasi zink sulfat sebagaimana tertera dalam Tabel 1. Isolat kuman Isolat kuman patogen enterik yang digunakan pada studi ini adalah isolat klinik Shigella yang berasal dari penderita diare dan merupakan kumpulan isolat (stock cultures)

Universa Medicina

di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas K e d o k t e r a n U n i v e r s i t a s Tr i s a k t i . I s o l a t Shigella yang diuji meliputi S. disenteriae (10 isolat), S. flexneri (71 isolat), S. sonnei (42 isolat), dan S. boydii (12 isolat). Masingmasing isolat disimpan di dalam tryptic soy broth (TSB) yang ditambah gliserol dengan kadar 20%, dibekukan dan disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu -700C hingga saat pengujian. Pada saat dilakukan pengujian, biakan dikeluarkan dari lemari pendingin dan d i b i a r k a n m e n c a i r p a d a s u h u k a m a r. Selanjutnya biakan ditanam pada medium agar darah, lalu diinkubasi pada suhu 37 0C selama 18-24 jam. Koloni-koloni yang tumbuh pada medium agar darah tersebut dilakukan seleksi, diambil dan diuji kemurniannya secara biokimiawi. Biakan murni dari kuman enterik ini kemudian dipindahkan ke dalam tabung yang berisi 5 mL kaldu brain heart infusion (BHI) kemudian diinkubasikan lagi pada suhu 37 0C selama 18-24 jam. Inokulasi biakan pada zink sulfat agar Biakan kuman di dalam brain heart infusion yang telah diinkubasi selama 18-24 jam tersebut kemudian ditipiskan dengan larutan garam faal dan disesuaikan kepekatannya

Vol.25 No.1

menurut standar larutan MacFarland 0,5. Biakan kaldu kemudian dipindahkan sebanyak 0,5 ml ke dalam sumur-sumur dari microtiter plate. Selanjutnya dengan menggunakan inoculum re p l i c a t i n g a p p a r a t u s , b i a k a n t e r s e b u t diinokulasikan ke agar zink (ZSA). Inoculum replicating apparatus dapat memindahkan sekaligus 48 biakan kaldu, masing-masing sebanyak 1¼ µL dari sumur-sumur microtiter plate untuk ditanamkan pada lempeng agar Mueller Hinton yang mengandung berbagai kadar zink sulfat sebagaimana tertera pada Tabel 1. Biakan juga ditanam pada lempeng agar Mueller Hinton yang tidak mengandung zink sebagai pembanding (control). Semua lempeng agar yang telah diinokulasi dengan biakan kuman, diinkubasikan secara aerobik pada suhu 37 0 C selama 18-24 jam. Interpretasi hambatan Konsentrasi hambatan minimal dari zink sulfat dibaca dan dicatat sebagai konsentrasi terendah dari zink sulfat yang menyebabkan hambatan lengkap terhadap biakan pada lempeng agar ZSA dan Mueller Hinton (sebagai pembanding), dengan mengabaikan koloni tunggal atau pertumbuhan tipis yang disebabkan oleh inokulum.

Tabel 1. Penambahan zink sulfat (Zn SO 4.7H 2O, 40 mg/mL) pada agar Mueller Hinton untuk membuat zink sulfat agar (ZSA)

3

Herwana, Surjawidjaja, Lesmana, dkk

Zink sulfat dan Shigella spp.

Tabel 2. Persentasi kumulatif dari hambatan zink sulfat terhadap Shigella spp.

HASIL Hasil penelitian ini memperlihatkan bahwa sekitar 60–80% dari isolat Shigella dapat dihambat oleh zink sulfat pada konsentrasi 1,4 mg/mL. Shigella dysenteriae mulai dihambat oleh zink sulfat pada konsentrasi 1,2 mg/mL dan dihambat secara lengkap (100%) pada konsentrasi 1,6 mg/mL. Shigella flexneri mulai dihambat pada konsentrasi zink sulfat terendah (0,2 mg/mL) tetapi dihambat lengkap pada konsentrasi tertinggi (2mg/mL). (Tabel 2) Sebanyak 61,8% dari S. sonnei mulai dihambat pada konsentrasi zink sulfat 1,4 mg/mL dan lengkap dihambat pada konsentrasi 2 mg/mL. Shigella boydii mulai dihambat pada konsentrasi zink sulfat yang sama dengan Shigella sonnei (0,8 mg/mL), tetapi dihambat sempurna pada konsentrasi yang lebih rendah (1,6 mg/ml). PEMBAHASAN Meskipun terapi rehidrasi cairan dapat menurunkan mortalitas penderita infeksi diare secara bermakna, angka kesakitan diare tetap tinggi di negara berkembang. Masalah infeksi diare memberikan dampak yang besar terhadap nutrisi, terutama pada anak-anak. Interaksi antara diare dan malnutrisi dapat merupakan hubungan dua arah. Infeksi diare memberikan efek negatif terhadap status gizi akibat penurunan asupan nutrisi dan absorpsi usus, 4

peningkatan katabolisme dan pemecahan nutrient yang digunakan untuk sintesis jaringan dan pertumbuhan. (8-9) Sementara malnutrisi dapat menjadi predisposisi terhadap terjadinya infeksi akibat penurunan kemampuan barier proteksi kulit dan mukosa, serta perubahan fungsi respon imun. Keadaan ini seringkali mengakibatkan penururunan energi disertai defisiensi mikronutrien. (6-9) Meskipun banyak studi telah membuktikan bahwa suplementasi zink pada anak dengan diare akut dapat memperpendek durasinya dan mencegah terjadinya diare persisten, namun efek zink secara langsung terhadap bakteri enteropatogen penyebab diare belum banyak dilaporkan. Kemungkinan mekanisme efek antidiare dari suplementasi zink sulfat sejauh ini dikaitkan dengan perbaikan absorbsi air dan elektrolit di usus, regenerasi sel epitel usus dan pengembalian fungsinya, serta peningkatan mekanisme imunologi untuk mengatasi infeksi. (4) Shigella merupakan bakteri enterik patogen yang dominan sebagai kausa diare bersama-sama dengan Salmonella dan Vibrio cholerae. (5) Studi in vitro ini menunjukkan bahwa pada konsentrasi antara 0,2 hingga 2 mg/mL, zink sulfat dapat menghambat pertumbuhan bakteri enterik Shigella. Pada spesies yang paling sering dijumpai yaitu S. flexneri, kadar hambat minimal dari zink sulfat telah terjadi pada kadar yang paling rendah yaitu 0,2 mg/mL. Pada kadar zink sulfat 1,6

Universa Medicina

mg/ml, pertumbuhan S. flexneri dapat dihambat sebesar 100%. Hasil ini konsisten dengan penelitian yang dilakukan Surjawidjaja et al. yang menyatakan S. flexneri sebanyak 100% dapat dihambat pada konsentrasi zink sulfat 1,2 mg/mL. (16) Dosis suplementasi zink yang digunakan pada anak-anak adalah antara 20 mg/hari hingga 25 mg/hari atau setara d e n g a n 8 8 m g - - 11 0 m g z i n k s u l f a t (ZnSO 4 .7H 2 O). Pada suplementasi zink per oral, absorbsi di usus hanya sekitar 5% hingga 26% saja. Ini berarti bahwa 74-95% atau 65,1104,5 mg dari dosis pemberian, tidak mengalami absorbsi dan akan tertinggal di dalam usus. Jumlah ini akan terdistribusi di dalam lumen usus. Namun agak sulit untuk menentukan besarnya kadar zink sulfat yang mencapai segmen usus karena dapat dipengaruhi oleh gerakan usus, asupan dan retensi air, yang dapat mengubah konsentrasi relatif dari zink sulfat yang tidak diabsorbsi. Bukan tidak mungkin bahwa konsentrasi zink sulfat yang tidak diabsorpsi dan tertinggal di dalam usus ini masih cukup efektif untuk menghambat pertumbuhan Shigella spp. sehingga dapat memberikan perbaikan gejala klinis penderita diare.

Vol.25 No.1

Trisakti yang telah memberikan bantuan dana untuk penelitian ini. Ucapan terima kasih juga kami sampaikan kepada petugas Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Trisakti atas bantuannya dalam mempersiapkan kumpulan isolat. Daftar Pustaka 1.

2.

3.

4.

5.

6.

KESIMPULAN Zink sulfat memberikan efek hambatan terhadap pertumbuhan spesies Shigella yang merupakan bakteri yang paling sering menjadi penyebab infeksi diare. Studi lebih lanjut diperlukan untuk menilai manfaat zink sulfat sebagai ajuvan terhadap terapi antibiotika untuk pasien dengan diare yang disebabkan oleh bakteri enterik patogen.

7.

8. 9.

UCAPAN TERIMA KASIH

10.

Peneliti mengucapkan terima kasih kepada Pimpinan Fakultas Kedokteran Universitas

11.

Kotloff KL, Winickoff JP, Ivanoff B. Global burden of Shigella infections: implications for vaccine development and implementation of control strategies. Bull World Health Organ 1999; 77: 65166. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Survei kesehatan nasional 2001. Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Departemen Kesehatan Republik Indonesia; 2002. Kosek M, Bern C, Guerrant RI. The global burden of diarrheal disease, as estimated from studies published between 1992-2000. Bull World Health Organ 2003; 81: 197-204. Victoria CG, Bryce J, Fantaine O, Memasch R. Reducing deaths from through oral rehidration therapy. Bull World Health Organ 2000; 78: 1246-55. Oyofo BA, Subekti D, Tjaniadi P. Machpud N, Komalarini S, Setiawan W et al. Enteropathogens associated with acute diarrhea in community and hospital patients in Jakarta, Indonesia. FEMS Immunol Med Microbiol 2002; 34: 139-46. Guerrant RL, Schorling JB, McAuliffe JF, de Souza MA. Diarrhea as a cause and effect of malnutrition: diarrhea prevents catch-up growth and malnutrition increases diarrhea frequency and duration. Am J Trop Med Hyg 1992; 47: 28-35. Guerrant RL, Lima AA, Davidson F. Micronutrients and infections: interactions and implications with enteric and other infection and future priorities. J Infect Dis 2000; 182 (Supp l): S134-8. Brown KH. Diarrhea and malnutrition. J Nutr 2003;133: 328S-32. Black RE. Diarrheal disease. In: Nelson KE, William CM, Graham NMH, editors. Infectious disease epidemiology, theory and practice. Aspen Publication, Maryland. 2001: 497-517. Sack RB, Rachman M, Yunus M. Antimicrobial resistance in organism causing diarrheal disease. Clin Infect Dis 1997; 24 (Suppl 1): S 102-5. Hidayat A, Achadi A, Sunoto, Soedarmo SP: The effect of zinc sulfate supplementation in children

5

Herwana, Surjawidjaja, Lesmana, dkk

12.

13.

6

under three years of age with acute diarrhea in Indonesia. Med J Indones 1998; 7: 237-41. Bhutta ZA, Bird SM, Black RE, Brown KH, Gardner JM, Hidayat A, et al. Therapeutic effects of oral zinc in acute and persistent diarrhea in children in developing countries: pooled analyses of randomized controlled trials. Am J Clin Nutr 2000; 72: 1516-22. Strand TA, Chandyo RK, Bahl R, Sharma PR, Adhikari RK, Bhandari N, et al. Effectiveness and efficacy of zinc for treatment of acute diarrhea in young children. Pediatrics 2002; 109: 898-903.

Zink sulfat dan Shigella spp. 14.

15.

16.

Gupta DN, Mondal SK, Ghosh S, Rajendran K, Sur D, Manna B. Impact of zinc supplementation on diarrheal morbidity in rural children of West Bengal, India. Acta Paediatr 2003; 92: 531-6. Baqui A, Black RE, Arifeen SE, Yunus M, Chakraborty J, Ahmend S, et al. Effect of zinc supplementation started during diarrhea on morbidity and mortality in Bangladeshi children: community randomized trial. BMJ 2002; 325: 1059-63. Surjawidjaja JE, Hidayat A, Lesmana M. Growth inhibition of enteric patogens by zinc sulfate: an in vitro study. Med Princ Pract 2004; 13: 286-9.