STUDI EMBRIOGENESIS SOMATIK TIGA GENOTIPE KEDELAI TOLERAN DAN SATU GENOTIPE PEKA NAUNGAN SECARA IN VITRO
AHMAD RIYADI
SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Studi Embriogenesis Somatik Tiga Genotipe Kedelai Toleran dan Satu Genotipe Peka Naungan adalah karya saya dengan arahan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Agustus 2009
Ahmad Riyadi NIM A151060151
ABSTRACT AHMAD RIYADI. Study on Somatic Embryogenesis of Three Shade Tolerant and a Shade Sensitive Genotypes of Soybean In Vitro. Under direction of Nurul Khumaida and Didy Sopandie. Soybean (Glycine max (L.) Merrill) has become one of the world’s most important crops due to the high content of oil and protein in its seed. It can be consumed directly or utilized as raw material in agroindustry. Most by-products of soybean oil extraction are used in animal nutrition. Furthermore, the chemical composition of soybean seed recommends it as one of the main solution for global food deficits. As a consequence of the continuously growing national demand for soybean, new commercial cultivars, with greater capacity to withstand environmental stresses and genetically improved to increase yield quantity and quality are desirable. Tissue culture and plant transformation techniques open new possibilities for improving soybeans, and among them methods of in vitro regeneration and somatic embryogenesis stand out. The aim of this study was to get an established protocol of somatic embryogenesis required in engineering soybean variety being tolerant to low light intensity. Three shade tolerant (Ceneng, CG30-10, CG76-10) and a shade sensitive (Godek) genotypes of soybean have been used as explant sources. The present study revealed that genotype, NAA and 2,4-D had significant effect on embryogenic callus and globular stage embryo induction. Frequency of embryogenic callus varied in response to different treatment used. Triple interaction of CG76-10 x 53,71 µM NAA x 22,62 µM 2,4-D as well as Ceneng x 26,85 µM NAA x 00,00 µM 2,4-D showed the highest embryogenic capacity with respectively 0,44 and 0,4 globular stage embryos per responding explant. Globular stage embryo formation was positively correlated to friable and intermediate structure of callus and light green color of callus. Genotype and origin induction medium have very significant effect on somatic embryo development. The both designated interaction in promoting cotiledonary embryos. Double interaction of Ceneng x IK-12 (NAA 53,71 µM + 2,4-D 67,87 µM) resulted the highest efficiency in total cotiledonary embryo formation and normal embryo as well. Histodifferentiation medium independently influenced somatic embryo development. The highest average number of cotiledonary stage embryo was reached by combination of 2,69 µM NAA + 13,32 µM BA (MH1). Whereas no factor was observed which associated with abnormal embryo. each genotype indicated various viability. Ceneng with the highest percent of germination and index of vigor described that this genotype more viable and vigorous than three others. CG76-10 had fastest germination rate, suggested this genotype had better vigor potency. Conversion efficiency was poor in all treatments. Keywords: soybean, somatic embryogenesis, genotipe, auxin, cytokinin, regeneration
RINGKASAN AHMAD RIYADI. Studi Embriogenesis Somatik Tiga Genotipe Kedelai Toleran dan Satu Genotipe Peka Naungan Secara In Vitro. Dibimbing oleh Nurul Khumaida dan Didy Sopandie. Kedelai (Glycine max L. Merrill) merupakan tanaman pangan yang sangat penting karena kadungan minyak dan protein dalam bijinya. Biji kedelai merupakan komoditas multiguna yang dapat dikonsumsi langsung atau digunakan sebagai bahan baku kegiatan agroindustri. Produk sampingan yang merupakan ampas hasil ekstraksi minyak banyak digunakan dalam industri pakan ternak. Kebutuhan kedelai nasional yang terus meningkat menuntut adanya varietas kedelai yang toleran terhadap cekaman lingkungan dan secara genetik telah ditingkatkan kuantitas dan kualitas produksinya. Diantara sifat unggul kedelai yang potensial untuk ditingkatkan adalah kemampuannya beradaptasi pada lingkungan dengan intensitas cahaya rendah. Kedelai dengan karakter seperti itu diperlukan untuk perluasan areal tanam di bawah tegakan tanaman perkebunan atau pada sistem wana tani. Perakitan varietas kedelai unggul yang toleran naungan dengan produktivitas yang tinggi dapat dilakukan melalui pemuliaan konvensional dan rekayasa genetika. Kultur jaringan dan transformasi gen membuka peluang perbaikan tanaman secara in vitro. Di antara teknik yang paling efisien untuk meregerasikan tanaman hasil transformasi genetika adalah embryogenesis somatk. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan protokol embriogenesis somatik beberapa genotipe kedelai yang dibutuhkan bagi perakitan varietas yang adaptif terhadap intensitas cahaya rendah. Penelitian ini terdiri atas tiga tahap percobaan yaitu: 1) Induksi kalus embriogenik pada tiga genotipe kedelai toleran dan satu genotipe peka naungan, 2) Histodifferensiasi embrio somatik dan 3) Germinasi embrio somatik. Selain itu juga dilakukan studi histologi embrio somatik. Penelitian pertama merupakan percobaan faktorial dengan tiga faktor yang disusun secara acak lengkap. Faktor pertama yaitu genotipe kedelai: Ceneng (G1), Godek (G2), CG 30-10 (G3) dan CG 76-10 (G4). Faktor kedua adalah NAA dengan 4 taraf yaitu 0,0 µM (N1), 26,85 µM (N2), 53,71 µM (N3) dan 80,56 µM (N4). Faktor ketiga adalah 2,4-D dengan 4 taraf yaitu 0,0 µM (D1), 22,62 µM (D2), 42,25 µM (D3) dan 67,87 µM (D4). Sumber eksplan kultur embriogenesis adalah kotiledon muda berukuran 3-6 mm yang diisolasi dari polong berumur 14 hari setelah antesis. Media dasar yang digunakan mengandung garam-garam mineral MS, vitamin B5, dan sukrosa. Sebagai pemadat media digunakan gelrite (0,2%) dan pH diatur pada skala 7. Pada histodifferensiasi embrio somatik rancangan percobaan merupakan acak lengkap faktorial. Empat genotipe kedelai dikombinasikan dengan sembilan media asal induksi dan empat taraf zat pengatur tumbuh yaitu: 2,69 µM NAA +13,32 µM BA (MH1); 2,69 µM NAA + 13,94 µM Kinetin (MH2); 2,69 µM NAA + 6,81 µM Thidiazuron (MH3): and 2,69 µM NAA + 13,70 µM Zeatin (MH4). Media dasar yang digunakan sama dengan media induksi kalus embriogenik. Eksplan yang digunakan berupa gumpalan kalus embriogenik yang mengandung embrio fase globular. Percobaan germinasi embrio somatik menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan 3 ulangan (cawan petri) dan masing-masing ulangan berisi 5 satuan evaluasi. Percobaannya berfaktor tunggal yaitu genotipe kedelai dengan empat taraf kualitatif: Ceneng (G1), Godek (G2), CG 30-10 (G3) dan CG 76-10 (G4). Pasca maturasi embrio yang matang ditanam pada media perkecambahan tanpa zat pengatur tumbuh berupa media dasar MS yang mengandung vitamin B5 dan sukrosa.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat pengaruh interaksi antara NAA, 2,4-D dan genotipe terhadap jumlah eksplan berkalus pada umur 5 minggu setelah tanam. Frekuensi pembentukan kalus embriogenik bervariasi untuk setiap perlakuan. Genotipe toleran naungan cenderung memiliki kapasitas embriogenik lebih baik dibandingkan genotipe peka naungan dan karakter tersebut diwariskan pada progeni hasil silangan dengan genotipe peka naungan interaksi NAA, 2,4-D dan genotipe juga berpengaruh sangat nyata terhadap diameter dan berat kalus. Hal ini menunjukan bahwa diameter dan berat kalus sangat ditentukan oleh faktor-faktor NAA, 2,4-D dan genotipe. Diameter dan berat kalus tertinggi dihasilkan pada kombinasi NAA 26,85 µM, 2,4-D 22,62 µM dan genotipe Ceneng. Hasil tersebut tidak berbeda nyata dengan nilai-nilai tertinggi pada kombinasi NAA 53,71 µM, 2,4-D 00,00 µM dan genotipe CG76-10; NAA 80,56 µM, 2,4-D 00,00 µM dan genotipe Godek serta kombinasi NAA 26,85 µM, 2,4-D 00,00 µM dan genotipe CG30-10. Selain itu ketiga faktor juga sangat berpengaruh nyata pada pembentukan embrio fase globular. Kombinasi antara NAA 53,71 µM, 2,4-D 22,62 µM dan genotipe CG76-10 serta antara NAA 26,85 µM, 2,4-D 00,00 µM dan genotipe Ceneng, menghasilkan rataan embrio fase globular tertinggi yaitu berturut-turut 0,44 dan 0,4 embrio per eksplan. Terdapat korelasi positif antara terbentuknya embrio fase globular dengan struktur kalus yang remah dan intermediate serta warna kalus hijau muda. Genotipe dan media yang digunakan pada saat induksi kalus embriogenik sangat berpengaruh pada perkembangan embrio somatik. Keduanya menunjukkan interaksi sangat nyata dalam menghasilkan embrio fase kotiledon. Genotipe Ceneng dalam interasinya dengan media IK-12 (NAA 53,71 µM + 2,4-D 67,87 µM) menunjukkan tingkat efisiensi tertinggi baik pada induksi total embrio maupun embrio normal fase kotiledon. Media histodlifferensiasi secara bebas mempengaruhi perkembangan embrio somatik kedelai. Rataan jumlah embrio fase kotiledon tertinggi diperoleh dari hasil kombinasi 2,69 µM NAA + 13,32 µM BA (MH1), yang menghasilkan rataan sebesar 0,245 embrio per eksplan. Kemudian disusul oleh MH2 (2,69 µM NAA + 13,94 µM kinetin) yang menghasilkan 0,15 embrio, MH3 (2,69 µM NAA + 6,81 µM Thidiazuron) dengan 0,078 embrio dan MH (42,69 µM NAA + 13,70 µM Zeatin) dengan 0,038 embrio fase kotiledon. Nilai tertinggi untuk rataan embrio fase kotiledon yang normal diperoleh dari kombinasi antara genotipe Ceneng dan IK-12 (NAA 53,71 µM + 2,4-D 67,87 µM) dengan rataan sebesar 0,9 embrio Sedangkan pada embrio abnormal tidak ditemukan adanya faktor-faktor yang berpengaruh nyata. Pada proses germinasi genotipe memiliki viabilitas embrio yang berbedabeda. Embrio somatik kedelai dari genotipe toleran naungan memiliki daya hidup dan kekuatan tumbuh lebih baik saat proses perkecambahan. Genotipe Ceneng dengan daya germinasi dan indeks vigor tertinggi menunjukan bahwa genotipe ini memiliki embrio yang lebih viabel dan lebih vigor dibandingkan tiga genotipe lainnya. Dengan laju perkecambahan tercepat yang dicapai oleh genotipe CG7610 menunjukkan genotipe ini punya potensi vigor yang baik. Tingkat konversi kecambah menjadi tanaman secara umum masih sangat rendah. Kata kunci: kedelai, embriogenesis somatik, genotipe, auksin, sitokinin, regenerasi
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
STUDI EMBRIOGENESIS SOMATIK TIGA GENOTIPE KEDELAI TOLERAN DAN SATU GENOTIPE PEKA NAUNGAN SECARA IN VITRO
AHMAD RIYADI
Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Departemen Agronomi dan Hortikultura
SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Ir. Agus Purwito, M.Sc.
Judul Tesis Nama NIM
: Studi Embriogenesis Somatik Tiga Genotipe Kedelai Toleran dan Satu Genotipe Peka Naungan Secara In Vitro : Ahmad Riyadi : A151060151
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Didy Sopandie, M.Agr. Anggota
Dr. Ir. Nurul Khumaida, M.Si. Ketua
Diketahui
Ketua Program Studi Agronomi
Dr. Ir. Munif Ghulamahdi, M.S.
Tanggal Ujian: 14 Agustus 2009
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.
Tanggal Lulus:
PRAKATA Alhamdulillah, puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga penyusunan tesis ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2008 ini adalah embriogenesis somatik, dengan judul Studi Embriogenesis Somatik Tiga Genotipe Kedelai Toleran dan Satu Genotipe Peka Naungan. Terimakasih penulis sampaikan kepada Ibu Dr. Ir. Nurul Khumaida atas sarana penelitian yang disediakan, beserta Bapak Prof. Dr. Ir. Didy Sopandie, M. Agr. selaku pembimbing. Kepada Teh Iip dan Teh Juju, penulis menghargai segala bantuannya selama pelaksanaan penelitian. Disamping itu, penulis juga patut berterimakasih kepada Ibu Lukita Devi, SP, M.Si. atas bantuan analisa data, juga kepada teman-teman di Program Studi Agronomi angkatan 2006 atas kerjasamanya selama ini. Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, isteri dan anak-anak tercinta, serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor,
Agustus 2009
Ahmad Riyadi
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Tangerang pada tanggal 7 Agustus 1968 dari ayah Bapak Abdul Hamid dan Ibu Unah. Penulis merupakan putera sulung dari tujuh bersaudara. Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran, Bandung, lulus tahun 1995. Sejak tahun 1998 penulis tercatat sebagai staff peneliti Balai Pengkajian Bioteknologi, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknolgi (BPPT). Saat ini penulis memegang jabatan fungsional sebagai Peneliti Muda dan bertempat di Seksi Bioteknologi Pertanian, Balai Pengkajian Bioteknologi, BPPT, Serpong. Bidang penelitian yang menjadi tanggung jawab peneliti adalah fisiologi tumbuhan. Pada tahun 2006 penulis diterima sebagai mahasiswa pada Program Studi Agronomi dan Hortikultura, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Program Peningkatan Kompetensi Pegawai (PPKP) BPPT.
x
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ………………………………………………………………….
xii
DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………………….
xiii
DAFTAR LAMPIRAN ……………………………………………………………..
xiv
1 PENDAHULUAN ……………………………………………………………... Latar Belakang ……………………………………………………………….. Rumusan Masalah …………………………………………………………… Kerangka Pemikiran …………………………………………………………. Tujuan Penelitian …………………………………………………………….. Manfaat Penelitian …………………………………………………………… Ruang Lingkup Penelitian ……………………………………………………
1 1 4 4 5 5 6
2 TINJAUAN PUSTAKA ………………………………………………………. Klasifikasi dan Morfologi Kedelai …………………………………………… Kultur Jaringan ……………………………………………………………….. Embriogenesis Somatik ……………………………………………………... Embriogenesis Somatik Kedelai ………………………………………….... Transformasi Genetik Kedelai ……………………………………………....
8 8 9 11 13 16
3 INDUKSI KALUS EMBRIOGENIK PADA TIGA GENOTIPE KEDELAI TOLERAN DAN SATU GENOTIPE PEKA NAUNGAN Abstrak ……………………………………………………………………….. Abstract ……………………………………………………………………….. PENDAHULUAN …………………………………………………………….. Latar Belakang ………………………………………………………….. Tujuan Penelitian ……………………………………………………….. BAHAN DAN METODE ……………………………………………………… Waktu dan Tempat …………………………………………………….... Persiapan Bahan Tanaman ……………………………………………. Bahan dan Alat …………………………………………………………... Bahan Tanaman …………………………………………………………. Media Tanam …………………………………………………………….. Rancangan Percobaan …………………………………………………. Analisa Histologi …………………………………………………………. Pengamatan ……………………………………………………………… Klasifikasi Warna Kalus …………………………………………………. HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………………………... Jumlah dan Persentase Eksplan Berkalus …………………………… Diameter dan Berat Kalus ……………………………………………... Warna dan struktur kalus ……………………………………………..... Embrio fase globular…………………………………………………….. Histologi …………………………………………………………………... KESIMPULAN ………………………………………………………………...
18 18 19 20 20 21 21 21 21 22 22 22 23 23 23 24 25 25 28 29 32 36 38
4 HISTODIFFERENSIASI DAN PERKECAMBAHAN EMBRIO SOMATIK
xi
TIGA GENOTIPE KEDELAI TOLERAN DAN SATU GENOTIPE PEKA NAUNGAN …………………………………………………………………….. Abstrak ……………………………………………………………………….. Abstract ……………………………………………………………………….. PENDAHULUAN …………………………………………………………….. Latar Belakang …………………………………………………………... Tujuan Penelitian ………………………………………………………... BAHAN DAN METODE ……………………………………………………… Histodifferensiasi Embrio Somatik …………………………………………. Bahan Tanaman …………………………………………………………. Media Tanam …………………………………………………………….. Rancangan Percobaan …………………………………………………. Pengamatan ……………………………………………………………… Perkecambahan Embrio Somatik ………………………………………….. Bahan Tanaman dan Media ……………………………………………. Rancangan Percobaan …………………………………………………. Pengamatan ……………………………………………………………… HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………………………... Embrio Fase Kotiledon ………………………………………………….. Bobot Embrio ……………………………………………………………... Warna Embrio ……………………………………………………………. Perkecambahan Embrio Somatik ………………………………………. KESIMPULAN ………………………………………………………………...
39 39 40 41 41 42 43 43 43 43 43 43 44 44 44 44 45 45 50 51 52 56
6 PEMBAHASAN UMUM ………………………………………………………
57
7 KESIMPULAN DAN SARAN ………………………………………………...
62
DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………………….
64
LAMPIRAN ………………………………………………………………………….
69
xii
DAFTAR TABEL Halaman 1 Interaksi NAA, 2,4-D dan Genotipe terhadap jumlah dan prosentase eksplan berkalus pada 4 MST ……………………………………………...
26
2 Interaksi NAA, 2,4-D dan genotipe terhadap diameter dan berat kalus pada 4 MST …………………………………………………………………
29
3 Interaksi NAA, 2,4-D dan genotipe terhadap jumlah embrio fase globular pada 4 MST ..…………………………………………………….
33
4 Nilai koefisien korelasi antar peubah ………………………………………
34
5 Interaksi antara media asal dengan genotipe terhadap rataan jumlah embrio fase kotiledon ………………………………………………………..
46
6 Interaksi antara media asal dengan genotipe terhadap rataan jumlah embrio fase kotiledon normal ………………………………………………
48
7 Interaksi antara media asal dan media histodifferensiasi pada persentase pembentukan warna embrio kekuningan ……………………
51
8 Pengaruh media perkecambahan pada empat genotipe kedelai ………
54
xiii
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Diagram alur penelitian …………………………………………………….....
7
2 Perbandingan embriogenesis somatik dan embriogenesis zigotik ……… 11 3 Skema alur ontogeni embrio somatik kedelai ……………………………… 14 4 Klasifikasi warna kalus yang terbentuk pada induksi kalus dari empat genotipe kedelai ………………………………………………………………. 24 5 Hubungan antara konsentrasi NAA dengan rataan jumlah eksplan yang membentuk kalus ……………………………………………………………... 27 6 Hubungan antara konsentrasi 2,4-D dengan rataan jumlah eksplan yang membentuk kalus ……………………………………………………………... 28 7 Pengaruh zat pengatur tumbuh, NAA dan 2,4-D, terhadap warna kalus dari empat genotipe kedelai …………………………………………………. 30 8 Pengaruh zat pengatuh tumbuh, NAA dan 2,4-D, terhadap struktur kalus dari empat genotipe kedelai …………………………………………... 31 9 Embrio somatik fase kotiledon ………………………………………………. 34 10 Skema embriogenesis somatik ……………………………………………… 36 11 Irisan longitudinal embrio somatik fase globular pada empat genotipe kedelai ………………………………………………………………………….. 37 12 Pengaruh media histodifferensiasi terhadap rataan jumlah embrio fase kotiledon ……………………………………………………………………….. 46 13 Embrio fase kotiledon yang tumbuh normal………………………………… 47 14 Morfologi embrio abnormal …………………………………………………... 49 15 Pengaruh genotipe terhadap frekuensi pembentukan embrio fase kotiledon ……………………………………………………………………….. 49 16 Rataan bobot embrio fase kotiledon pada setiap genotipe dari seluruh perlakuan ………………………………………………………………………. 50 17 Perkecambahan embrio fase globular 4 minggu setelah tanam ………… 53
xiv
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Tanaman dan benih genotipe kedelai yang diteliti ……………………..
70
2. Komposisi media dasar penelitian ……………………………………….
71
3. Tahapan pembuatan preparat histologis metoda parafin ……………..
72
4. Tabel hasil sidik ragam ……………………………………………………
74
