Možnosti a změny při zpracování vzorků kostní dřeně po aktivaci přístrojů umožňujících selekci MM buněk ve vysoké čistotě i při minimální vstupní infiltraci
Mgr. Silvie Dudová, RNDr. Iva Burešová, Drahomíra Kyjovská Centrum základního výzkumu pro monoklonální gamapatie a mnohočetný myelom, ILBIT LF MU Brno Laboratoř experimentální hematologie a buněčné imunoterapie, OKH FN Brno GROUP
CZECH
CMG OMA MYEL
ČESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA
MACS separace • CD138 mikrokuličky – superparamagnetické částice, 50 nm • biodegradovatelná matrix, odpadá nutnost odstraňovat je z buněk po separaci • nemění strukturu, funkci nebo aktivitu značených buněk • pozitivní selekce: v separátoru silné magnetické pole – zadržuje pouze značené buňky, ty jsou vymyty po odstranění kolony z magnetického pole
GROUP
CZECH
CMG OMA MYEL
ČESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA
MACS separace VarioMACS • nízká účinnost separace při infiltraci KD < 10% • pracná metoda
Nové přístroje • AUTOMACS • FACS-ARIA
GROUP
CZECH
CMG OMA MYEL
ČESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA
VarioMACS 40 - 60ml KD gradientová centrifugace MB > 10%
MB ≤ 10%
MACS selekce CD 138+
kryokonzervace
CD 138-
kryokonzervace kryokonzervace
GROUP
CZECH
CMG OMA MYEL
ČESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA
AutoMACS 40 - 60ml KD gradientová centrifugace MB > 0% infiltrace vysoká buněčnost
nízká buněčnost
lyzační pufr pro odstranění ery MACS selekce CD 138+
CD 138-
kryokonzervace kryokonzervace
GROUP
CZECH
CMG OMA MYEL
ČESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA
kryokonzervace
Dosavadní výsledky Srovnání čistoty frakce CD138+ buněk 120
infiltrace čistota A utoMA CS
100
60 40 20 0 2
3
4
Zisk CD138+ buněk
C D 138+ b u ň ky v m ilio n ech
3
AutoMACS VarioMACS
2,5 2 1,5 1 0,5 0 1
CMG OMA MYEL
GROUP
1
CZECH
čistota v % buněk
čistota V arioMACS 80
ČESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA
2
3
4
FACS Aria • vysokorychlostní sorter • sortovat až 4 různé populace buněk z jednoho vzorku • podle potřeby - maximální čistota nebo maximální výtěžek • 2 postupy přípravy buněk – lýza erytrocytů lyzačním roztokem s NH4CL a separaci gradientovou centrifugací • buňky obarveny protilátkou proti CD138 značenou phycoerytrinem (PE)
GROUP
CZECH
CMG OMA MYEL
ČESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA
FACS Aria Srovnání čis toty vys ortované CD138+ populace po přípravě lýzou a gradie ntovou ce ntrifugací 100 90 70 60
% inf iltrace
50
lýza
40
grad. centr.
30 20
Srovnání výtěžku vysortované CD138+ populace po přípravě lýzou a gradientovou centrifugací
10 0 3
4
5
6
7 absolutní počet CD138+ buněk v tis. Na 1ml KD
2
30 25 20 % inf iltrace lýza
15
grad. Centr.
10 5 0 1
CMG OMA MYEL
GROUP
1
CZECH
% CD138+ buněk
80
ČESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA
2
3
4
5
6
7
FACS Aria - první poznatky • postačuje 1 znak (CD138) pro sortování myelomových bb • výsledná čistota není jednoduše závislá na iniciálním procentuálním zastoupení této populace v KD • čistota vyšší po gradientové centrifugaci • absolutní počet získaných CD138+ buněk je vyšší po lyzaci KD
• čistota a výtěžek myelomových buněk „jdou proti sobě“, takže nebude snadné rozhodnout se pro určitý způsob zpracování KD před sortem
GROUP
CZECH
CMG OMA MYEL
ČESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA
Využití buněk KD doposud: • 2 ml KD → cytogenetika • 3 ml KD v EDTA → izolace RNA a DNA → Bank on a cure (IFM), cytogenetika (CGH) • 1 ml flowcytometrie • 60 ml KD → separace bb → epigenetika: 1,5x106 → proteomika: 3x106
GROUP
CZECH
CMG OMA MYEL
ČESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA
Využití CD138+ buněk nově: • 1.5 ml KD v EDTA → izolace DNA → Bank of cure (IFM) • 0.5 ml KD → flowcytometrie Využití separovaných buněk: – FISH 200 tis – CGH 500 tis. (50 buněk) – real-time PCR 500 tis – proteomika 1,5x106 – epigenetika 1,5x106 – GEP 1x106 Celkem: 5x106 buněk GROUP
CZECH
CMG OMA MYEL
ČESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA
Materiál pro jednotlivé metody: MACS
buňky: FISH (200 tis) proteomika: 1,5x106 epigenetika: 1,5x106
RNA: real time PCR (500 tis) GEP (1x106)
DNA: CGH (50 tis)
GROUP
CZECH
CMG OMA MYEL
ČESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA
Otázky: •
Co upřednostnit? Vyšší čistota nebo více buněk?
•
Jaké jsou priority využití CD138+ buněk?
GROUP
CZECH
CMG OMA MYEL
ČESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA
PODĚKOVÁNÍ Centrum základního výzkumu pro monoklonální gamapatie a mnohočetný myelom, ILBIT LF MU Brno Laboratoř experimentální hematologie a buněčné imunoterapie FN Brno
Oddělení klinické hematologie FN Brno
Interní hematoonkologická klinika FN Brno
GROUP
CZECH
CMG OMA MYEL
ČESKÁ MYELOMOVÁ SKUPINA
