Strategie pro strukturní analýzu receptorů lidských NK buněk alias 293. pokus jak zvýšit výtěžek a dosíci se struktury

Strategie pro strukturní analýzu receptorů lidských NK buněk alias 293. pokus jak zvýšit výtěžek a dosíci se struktury

Ondřej Vaněk Katedra biochemie Přírodovědecká fakulta UK Praha

Laboratoř strukturní biochemie imunitní odpovědi ...aneb od genu k proteinu, od proteinu k jeho struktuře a funkci!

rozpustných forem receptorů NK buněk a jejich ligandů pro : Využití přípravu nových protinádorových imunoterapeutik (2015-2017)

[email protected]

Obsah přednášky • NK buňky a jejich receptory • Kultivace a transfekce HEK293S GnTI- suspenzní buněčné linie • Produkce a struktura LLT1

• 293. pokus – příběh NKRP1 • Strategie… • Aplikace v imunoterapii rakoviny

NK buňky Natural-killer cells = vrození zabijáci Velké granulární lymfocyty (CD16+, CD56+, CD3-), 15% cirkulujících lymf. Rychlá likvidace nádorových a virově infikovaných buněk Stimulační x inhibiční receptory Výsledný signál může aktivovat cytotoxickou odpověď • Missing-self hypotéza: ztráta inhibice snížením exprese MHC gp I. vede k aktivaci cytotoxické odpovědi

• • • • •

NK(T) buňky tvoří most mezi vrozenou (A) a adaptivní (B) imunitou, mají důležité regulační funkce (sekrece IFNγ, dozrávání DC), vlastní imunologickou paměť a významnou roli v protinádorové a protivirové imunitní odpovědi vs. autoimunitní onemocnění, transplantace

NK(T) buňky tvoří most mezi vrozenou (A) a adaptivní (B) imunitou, mají důležité regulační funkce (sekrece IFNγ, dozrávání DC), vlastní imunologickou paměť a významnou roli v protinádorové a protivirové imunitní odpovědi vs. autoimunitní onemocnění, transplantace

Receptory NK buněk

(Vivier E. et al., Science, 2011)

Receptory NK buněk • Imunoglobulinům podobné

– NKp30, NKp44 a NKp46 aktivační receptory – Ligandy nádorového a virového původu

• C-lektinům podobné

– CD69, NKG2D, CD94/NKG2A, NKRP1, LLT1, NKp80, KACL, AICL – Inhibiční i aktivační funkce – Tvoří evolučně spřažené receptor – ligandové páry

Iizuka K. et al., Nat Immunol 4, 801-807 (2003); Bartel Y. et al., Front Immunol 4, 362 (2013); Li Y. et al., J Exp Med 208, 703-714 (2011)











Receptory NK buněk • NKRP1 (CD161, klrb1) – NK a NK-T buňky, hemi-ITAM signální motiv, inhibiční funkce

• LLT1 (OCIL, clec2d) – Lidské NK buňky, T a B lymfocyty, antigen prezentující buňky – Přirozený funkční ligand NKRP1, kostimulační funkce – Zvýšená exprese na glioblastomech – únik před NK buňkami

NK buňka NKRP1

LLT1

T lymfocyt

Potlačení cytotoxické reakce

Receptory NK buněk • NKRP1 (CD161, klrb1) – NK a NK-T buňky, hemi-ITAM signální motiv, inhibiční funkce

• LLT1 (OCIL, clec2d) – Lidské NK buňky, T a B lymfocyty, antigen prezentující buňky – Přirozený funkční ligand NKRP1, kostimulační funkce – Zvýšená exprese na glioblastomech – únik před NK buňkami

NK buňka NKRP1

LLT1

Glioblastom

Potlačení cytotoxické reakce

Rekombinantní exprese proteinů - proč: izolace z přirozeného materiálu zpravidla obtížná až nemožná vs. snadná purifikace a hlavně možnost zavedení nových vlastností (od bodových mutací, přes fúzní proteiny až po např. „structure-based design“) - jak: - „cell free“ systémy – buněčné extrakty z čehokoli - bakterie – No. 1 forevermore - kvasinky – S. cerevisiae nebo P. pastoris & MeOH - rostliny – magnICON – tranzientní infekce tabáku - prvoci – LEXSY – Leishmania tarentolae - hmyzí buňky – Sf9 & MultiBac; S2 & stabilní & Cu2+ - savčí buňky – CHO & RMCE; HEK293 – viz dále…

Buňky HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) • HEK293E nebo 293-6E – nejvyšší produktivita díky epizomální replikaci, ale také nejvíce citlivé na zacházení… • HEK293T – velmi robustní linie, adherentní i suspenzní kultivace • HEK293S GnTI- – homogenní glykosylace, jasná volba pro strukturní biologii

MALDI-MS of N-linked glycans from s19A from HEK 293T cells. David J. Harvey, Max Crispin University of Oxford

Manipulace N-glykosylace v HEK293 linii Kifunensine 293T

Glycan Biosynthesis Pathway

a-M I 293S

GnT1-/-

oligomannose glycans


GnT1 Swainsonine or Lec36

High expression Hybrid sugars Endo H cleavable

paucimannose glycans

Low expression Uniform sugars Endo H+D cleavable

Sf9

Golgi

complex glycans 293T

Moderate expression Uniform sugars Endo H cleavable

hybrid glycans

293T

a-M II

High expression Uniform (large) sugars Endo H cleavable

High Expression Complex sugars NOT cleavable

Veronica T. Chang, Solving the glycosylation problem, Structure, 2007.

Manipulace N-glykosylace v HEK293 linii Kifunensine 293T

Glycan Biosynthesis Pathway

a-M I 293S

GnT1-/-



GnT1 Swainsonine or Lec36

High expression Hybrid sugars Endo H cleavable

paucimannose glycans

Low expression LLT1 Uniform sugars Endo H+D cleavable

Sf9

Golgi

complex glycans 293T

Moderate expression Uniform sugars Endo H cleavable

hybrid glycans

293T

a-M II

High expression Uniform (large) sugars Endo H cleavable

High Expression Complex sugars NOT cleavable

Bláha et al., Expression and purification of soluble and stable ectodomain of natural killer cell receptor LLT1 through highdensity transfection of suspension adapted HEK293S GnTI- cells. Protein Expr. Purif. 109, 7-13, 2015.

HEK293 suspenzní kultivace Buňky v suspenzi na třepačce (135 rpm / 19 mm či 180 rpm / 50 mm orbit) v 5% CO2 ve skleněných Schott-Duran láhvích s víčky s 0,22 μm prodyšnou membránou (lze autoklávovat) v ExCELL293 / F17 bezsérových médiích od 1 ml – po litry (standardní kultivační objem produkce 0.4 l).

293S: transfekce za vysoké buněčné hustoty Standardní transfeckce v HEK293S GnTI- linii nefunguje, ale za vysoké buněčné hustoty ano, bez ohledu na médium a inkubaci DNA:PEI směsi A)

B)

C)

(A) DNA:PEI optimization (B) Secreted protein production (measured as SEAP activity) and (C) transfection efficiency (GFP+ viable cells) of suspension adapted HEK293T cells (yellow) and HEK293S GnTI- cells (cyan) transfected at density of 2.0×106 cells/ml and HEK293S GnTI- cells transfected at density of 20×106 cells/ml with transfection complex formed a priori (gray) or in situ (magenta) was monitored 3 days post-transfection. Bláha et al., Expression and purification of soluble and stable ectodomain of natural killer cell receptor LLT1 through highdensity transfection of suspension adapted HEK293S GnTI- cells. Protein Expr. Purif. 109, 7-13, 2015.

Produkce LLT1 v 293S linii

A280

Finální produkční protokol: - 20·106 b/ml transfekce v ExCELL293 - 2 µg DNA na 1·106 buněk - DNA:PEI 1:2 - Transfekční směs: - 10% pTW5-p27 - 2% pTW5-aFGF - 88% pTW5sec_LLT1 - 3-4 hod po transfekci 2·106 b/ml produkce - valproová kyselina do 2 mM konc.

• Vysoká hustota • p27+aFGF+VPA = 150-200% více!!!

V, ml

Strategie 1 • Optimalizujte svůj expresní systém!

Exprese rozpustné formy LLT1 • Transmembránový protein II. typu, C-lektinům podobná rodina • Glykoprotein, kovalentní homodimer MHDSNNVEKDITPSELPANPGCLHSKEHSIKATLIWRLFFLIMFLTIIVCGMVAALSA IRANCHQEPSVCLQAACPESWIGFQRKCFYFSDDTKNWTSSQRFCDSQDADLAQVESF QELNFLLRYKGPSDHWIGLSREQGQPWKWINGTEWTRQFPILGAGECAYLNDKGASSAR HYTERKWICSKSDIHV

COOH

Lectin-like domain 5 Cys

5 Cys

--S—S--

Stalk (dimerization)

--S—S--

Transmembrane region Intracellular region NH2

Exprese rozpustné formy LLT1 1

2

3

LLT1 His 176

4

5

6

Exprese rozpustné formy LLT1

C75

C75

C75

C86

C103 C163 C176 C184

C86 C103 C163 H176 C184

C86 C103 S163 H176 C184

Strategie 2 • Optimalizujte svůj expresní systém! • Spárujte cysteiny, zbavte se jedináčků!

CD

SPR

Krystalizace LLT1  LLT1(Q72-V191) H176C – jednoduchá glykosylace (HEK293S GnTI-), 13,8 mg/ml  PEG 300 40%, 0,1M citrát-fosfát pufr; pH 4,2

•

4 různé kryst. struktury, rozlišení: 1,7 – 2,7 Å, asym. jednotka: monomer / nekovalentní dimer

•

konfigurace disulfidických můstků v souladu s MS daty a teorií Skálová et al., Four crystal structures of human LLT1, a ligand for human NKR-P1, in varied glycosylation and oligomerization state. Acta Cryst D71, 578-591, 2015.

Skálová et al., Four crystal structures of human LLT1, a ligand for human NKR-P1, in varied glycosylation and oligomerization state. Acta Cryst D71, 578-591, 2015.

Vybráno jako jeden ze čtyř Instruct „success stories“ na jeho dvouročním kongresu;-)

293 pokusů o expresi lidského NKRP1 • receptor lidských NK a NK-T lymfocytů, přirozený vazebný partner LLT1

• exprese v E. coli – inkluzní tělíska – refolding selhal… • exprese v HEK293T – výtěžek pouze cca 0,1 mg/l a z HEK293S GnTIlinie ještě méně…   • Instruct @ OPPF v Oxfordu – knihovna 46 konstruktů (různé délky expresního konstruktu, různé afinitní kotvy) – expresní test v E. coli opět selhal    • následně doma expresní test knihovny v HEK293T linii – exprese tu je, ale není to o nic lepší, než co už jsme měli sami předtím     • později v OPPF expresní test knihovny v Sf9 hmyzích buňkách s bakuloviry – zase nic      • Co tedy dělat? Expresní konstrukt máme správný, expresní systém taky, jen ten výtěžek…???


• exprese v E. coli – inkluzní tělíska – refolding selhal… purification of E. coli expression • expreseNiNTA v HEK293T – výtěžek pouze cca 0,1 screen mg/l a–zsoluble: HEK293S GnTIlinie ještě méně…  E. coli B834 E. coli Rosetta GFP control • Instruct @ OPPF v Oxfordu – knihovna 46 konstruktů (různé délky expresního konstruktu, různé afinitní kotvy) – expresní test v E. coli 45 36 opět selhal    MW 66

29

• následně doma expresní test knihovny v HEK293T linii – exprese tu je, 20 ale není to o nic lepší, než co už jsme měli sami předtím     24

• později v OPPF expresní test knihovny v Sf9 hmyzích buňkách s 6.5 bakuloviry – zase nic     

14.2

= expected product • Co tedy dělat? Expresní konstrukt máme správný, expresní systém taky, jen ten výtěžek…???


• exprese v E. coli – inkluzní tělíska – refolding selhal… • exprese v HEK293T – výtěžek pouze cca 0,1 mg/l a z HEK293S GnTIlinie ještě méně…  Stalk-region construct library • Instruct @ OPPF v Oxfordu – knihovna 46 konstruktů (různé délky expresního konstruktu, různé afinitní kotvy) – expresní test v E. coli opět selhal    • následně doma expresní test knihovny v HEK293T linii – exprese tu je, Expected product ale není to o nic lepší, než co už jsme měli sami předtím     • později v OPPF expresní test knihovny v Sf9 hmyzích buňkách s bakuloviry – zase nic    ↑  S75-S225

• Co tedy dělat? Expresní konstrukt máme správný, expresní systém taky, jen ten výtěžek…??? Anti-His Western Blot 72h post infection of Sf9 cells


• exprese v E. coli – inkluzní tělíska – refolding selhal… • exprese v HEK293T – výtěžek pouze cca 0,1 mg/l a z HEK293S GnTIlinie ještě méně…   • Instruct @ OPPF v Oxfordu – knihovna 46 konstruktů (různé délky Stalk-region construct library expresního konstruktu, různé afinitní kotvy) – expresní test v E. coli opět selhal    • následně doma expresní test knihovny v HEK293T linii – exprese tu je, Control ale není to o nic lepší, než co už jsme měli sami předtím     • později v OPPF expresní test knihovny v Sf9 hmyzích buňkách s bakuloviry – zase nic post  transfection    of HEK293T cells Anti-His Western Blot 72h • Co tedy dělat? Expresní konstrukt máme správný, expresní systém taky, jen ten výtěžek…???


• Spárujte cysteiny, zbavte se jedináčků! • Nevzdávejte se! Když jsou dveře zamčené, vlezte oknem…

Řešení: HEK293S GnTI- stabilně! • Instruct @ OPPF – přesun knihovny do pOPINTTGneo plazmidu • Pro nejlepší konstrukt selekce na 0,1 mg/ml G418: stabilní polyklonální linie sekretující NKR-P1 až 6 mg/l!!! CMV promoter 129..756 Tripartite leader 756..980 Adenoviral ML enhancer 1056..1167 Splice acceptor site 1251..1280

Neo 6797..7591 SV40 NeoR cassette 6392..7904

pOPINTTGneo 8008 bp

Ampicillin 4345..5191

MW kDa 205

67 29 24 20 14,2

polyA site 1846..1956

oriP replicon 2358..4066

4-12% SDS PAGE

SEC elution fractions ENDO Hf ►

Souhvězdí Malý vůz 

piggyBac indukovatelné stabilní linie


• Spárujte cysteiny, zbavte se jedináčků! • Nevzdávejte se! Když jsou dveře zamčené, vlezte oknem… • Tranzientní vztahy mohou být krásné, ale když jde do tuhého, je třeba navázat více stabilní partnerství;)

Fúzní imunoaktivní konstrukty

(A) Design of B7-H6:7D8 genetic construct. CMV, CMV immediate early promotor; S, secretion leader; IgV and IgC, B7-H6 Ig V-like and Ig C-like subdomains, respectively; VL and VH, cDNA sequences coding for the variable regions of Ig L and H chains of scFv 7D8, respectively; L, sequences coding for a (G4S)4 linker; M and H, sequences coding for cmyc and hexa-histidine tags, respectively. (B) Ribbon drawing according to homology models of B7-H6:7D8. Kellner C. et al., J. Immunol., 2012 Arnon T.I. et al., PLoS ONE, 2008 – NKp30 Fc IgG fusion therapy of prostate cancer cell line

Imunoaktivní polymerní konjugáty Peptide K Polymer

Recombinant protein

Peptide E

Coiled-coil heterodimers

• Pechar M. et al., Biomacromolecules, 2011; Pechar M. et al., Biomacromolecules, 2014

Shrnutí • Optimalizujte svůj expresní systém!

• Spárujte cysteiny, zbavte se jedináčků! • Nevzdávejte se! Když jsou dveře zamčené, vlezte oknem… • Tranzientní vztahy mohou být krásné, ale když jde do tuhého, je třeba navázat více stabilní partnerství;) • Nebojte se používat HEK293S GnTI- linii pro strukturní biologii! 

Díkuvzdání… • studenti: Jan Bláha, Petra Celadová, Edita Poláchová, Anna Dvorská, Helena Pucholtová, Romana Čuperková, Jiří Nový, Barbora Kalousková, Samuel Pažický, Ondřej Skořepa

• spolupracovníci: Tereza Skálová, Jan Dohnálek, Petr Novák • Univerzita Karlova (UNCE 204025/2012, SVV 260079/2014, GA UK 161216 a 927916)

• GA ČR (15-15181S), FRVŠ (669/2013) • COST (CA15126) • SPINE2:Complexes, P-CUBE, BioStruct-X, Instruct • E-mail: [email protected]

Díkuvzdání… • studenti: Jan Bláha, Petra Celadová, Edita Poláchová, Anna Dvorská, Helena Pucholtová, Romana Čuperková, Jiří Nový, Barbora Kalousková, Samuel Pažický, Ondřej Skořepa

• spolupracovníci: Tereza Skálová, Jan Dohnálek, Petr Novák • Univerzita Karlova (UNCE 204025/2012, SVV 260079/2014, GA UK 161216 a 927916)

• GA ČR (15-15181S), FRVŠ (669/2013) • COST (CA15126) • SPINE2:Complexes, P-CUBE, BioStruct-X, Instruct • E-mail: [email protected]

Strategie pro strukturní analýzu receptorů lidských NK buněk alias 293. pokus jak zvýšit výtěžek a dosíci se struktury

Recommend Documents