STŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST Obor SOČ: 04 - Biologie
Ekotoxicita běžných léčiv
Nam Ha Nguyen
Kraj: Jihočeský kraj
České Budějovice 2016
ŠTŘEDOŠKOLSKÁ ODBORNÁ ČINNOST Obor SOČ: 04 - Biologie
Ekotoxicita běžných léčiv Ecotoxicity of common pharmaceuticals
Autor: Nam Ha Nguyen Škola: Česko-anglické gymnázium, Třebízského 1010, 370 06 České Budějovice 5 Kraj: Jihočeský kraj Konzultant: Mgr. Pavel Soukup České Budějovice 2016
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou práci SOČ vypracoval(a) samostatně a použil (a) jsem pouze podklady (literaturu, projekty, SW atd.) uvedené v seznamu vloženém v práci SOČ. Prohlašuji, že tištěná verze a elektronická verze soutěžní práce SOČ jsou shodné. Nemám závažný důvod proti zpřístupňování této práce v souladu se zákonem č. 121/2000 Sb., o právu autorském, o právech souvisejících s právem autorským a o změně některých zákonů (autorský zákon) v platném znění. V ………. dne ………………… podpis: …………………
Poděkování Chtěl bych poděkovat Mgr. Pavlovi Soukupovi za jeho vedení při vypracování této středoškolské odborné činnosti. Především za jeho trpělivost a shovívavost. Dále děkuji RNDr. Michalovi Šorfovi, Ph.D a jeho kolegům za cenné rady a zabezpečení testů akutní toxicity.
ANOTACE Tato středoškolská odborná činnost je zaměřena na studium ekotoxicity běžných léčiv na životní prostředí a sestává se ze dvou částí. V první (teoretické) části shrnuji vybrané důležité informace o pokusném organizmu, jeho využití v testech akutní toxicity a vlivu farmak na vodní organizmy. V druhé (praktické) části práce provádím akutních test toxicity ke zhodnocení účinků vybraných farmak (kofex, ibalgin) na hrotnatku velkou. Všechny koncentrace testovaných léčiv měly vliv na mortalitu hrotnatky velké. Výsledky srovnávám s soudobou literaturou. Klíčová slova: akutní toxicita; kofein; ibuprofen, Daphnia magna, farmaka
ANNOTATION This thesis is focused on the study of the ecotoxicity of common pharmaceuticals in the environment and consists of two parts. In the first (theoretical) part I summarize selected relevant information on the experimental organisms, its utilization in the acute toxicity tests and the effect of pharmaceuticals on aquatic organisms. In the second (practical) part of the work I perform acute toxicity tests to assess the effects of selected pharmaceuticals (kofex, ibalgin) on Daphnia magna survival. All concentrations of the tested pharmaceuticals had an impact on the mortality of Daphnia magna. The results are compared with contemporary literature. Key words: acute toxicity; caffeine, ibuprofen; Daphnia magna; pharmaceuticals
Obsah 1 Úvod............................................................................................................................... 2 2 Teoretická část ............................................................................................................... 3 2.1 Pokusný organizmus ............................................................................................... 3 2.2 Farmaka našich vod................................................................................................. 6 2.3 Vybraná farmaka a jejich vliv na lidský organizmus a životní prostředí ................ 7 2.4 Shrnutí ..................................................................................................................... 8 3 Praktická část ............................................................................................................... 10 3.1 Materiál a metody ................................................................................................. 10 Testovaná látka ........................................................................................................ 10 Design a průběh experimentu .................................................................................. 10 Zpracování dat ......................................................................................................... 11 3.2 Výsledky ............................................................................................................... 11 3.3 Diskuze.................................................................................................................. 12 3.4 Závěr ..................................................................................................................... 14 4 Seznam citované literatury........................................................................................... 15 5 Přílohy.......................................................................................................................... 19
1
1 Úvod Akutní toxicita některých polutantů ve vodních společenstvech je hojně využívaný parametrem sloužícím k popisu míry nebezpečnosti různých látek. Díky pokrokům v medicíně jsou vyráběny stovky farmak. Po požití ale velká část účinných látek nebo jejich metabolitů proniká do životního prostředí. Mezi hojná farmaka patří například kofein a ibuprofen. Vzrůstající dostupnost vysoce kofeinových nápojů, včetně energetických nápojů, na celém světě má za následek zvýšení spotřeby u dětí i dospělých (Shearer, & Graham, 2014). Ibuprofen je v medicíně často používán k utlumení bolestí. Tyhle spotřební výrobky jsou dostupné i bez lékařského předpisu. Spotřebitelé často berou léky s ibuprofenem v nadmíře, už při lehkém pocitu bolesti. Tyto látky a jejich metabolity se do prostředí dostávají splaškovou vodou, kde se akumulují a mohou negativně ovlivnit necílové organizmy. Při hodnocení nebezpečnosti těchto látek můžeme mimo jiné použít testy akutní a chronické toxicity. V těchto testech pro vodní prostředí se využívá pokusného organizmu hrotnatky velké. Ve své práci se proto zaměřím na vliv různých koncentrací kofeinu a ibuprofenu na hrotnatku velkou (Daphnia magna Straus, 1820), literární rešerši rozšířím vlastním testem akutní toxicity.
2
2 Teoretická část 2.1 Pokusný organizmus Daphnia (hrotnatka) je sladkovodní korýš. Vyskytuje se prakticky po celém světě. Využívá se jako krmivo pro ryby, nejčastěji v sušené podobě (Klein, 2008). Jejich těla jsou průhledná a je možné pod stereomikroskopem pozorovat jejich srdce. Dorůstají až 5 mm (Bímová, 2013). Většina druhů hrotnatek má životní cyklus založený na cyklické partenogenezi (rodozměně). Konkrétně u rodu Daphnia, se z přezimujícího vajíčka líhne samice, a ta při dosažení dospělosti vytvoří řadu dalších generací partenogenetických diploidních vajíček. Vajíčka schová do zárodečného prostoru (viz Obr. 1), kde se embrya stále vyvíjejí. Nosí je, až do své příští ekdyse (svlékání). Embrya vypustí, při odhození starého karapaxu (exoskelete). Z toho vyplívá, že výsledek jsou identické klony samiček. Ve špatných životních podmínkách, jako jsou nedostatek potravin, anomální teploty a u vysychajících biotop, se mezi embryi začnou objevovat diploidní samci. Cyklická rodozměně u perlooček je střídáním dvou způsobů rozmnožování – partenogenetického
(nepohlavního)
a
gamogenetického
(pohlavního).
Při
partenogenetickém rozmnožování samice i několik generací v kuse tvoří své (diploidní) klony. Tento způsob rozmnožování nastává v dobrých životních podmínkách (od jara do pozdního léta) a je velmi rychlý. Po zhoršení podmínek (pokles teploty, nedostatek potravy, vysychání prostředí) se v partenogenetických snůškách začnou objevovat diploidní samci a začíná gamogenetické rozmnožování. Další následující snůška už bude obsahovat haploidní vajíčka (1n), která samci oplodní a vzniknou trvalá vajíčka (2n). Trvalá vajíčka přečkají chladné období nebo dokonce vyschnutí prostředí. Konkrétně rod Daphnia tvoří vždy dvě trvalá vajíčka, uložená v ochranném obalu, tzv. ephippiu (sedélku). Z trvalých vajíček se po zlepšení podmínek prostředí opět líhnou partenogenetické samice. Zajímavost cyklické rodozměny perlooček je, že obě pohlaví jsou diploidní, mají obě sady chromozomů (Brandl, 2006). Podle podmínek (zejm. teploty vody) se dožívají jen 5 – 14 měsíců. Jedinci rodu Daphnia jsou běžně používáni k testování toxicity různých látek. Jednodenní juvenilové (partenogenetické samice) jsou vystaveni přítomnosti zkoumané 3
chemikálie v určité koncentraci po dobu 48 hodin. Zaznamenává se mortalita po 24 a 48 hodinách, od pozorovaných hodnot odečteme mortalitu v kontrolních opakováních, kde jsou vystaveni jen vodě. Výsledky jsou analyzovány, aby se vypočítala EC 50 při 48 hodinové expozici. Této metody se užívá také při testování toxicity určitých prostředí (řek, jezer, tůní) a dokonce k neustálému sledování kvality pitné vody jako prevence teroristických útoků. Hrotnatky se umístí do průtokové nádoby s pitnou vodou, při náhlém úmrtí vinou toxických látek se pitná voda zavře, aby nedošlo k otravě lidí. Daphnia magna tedy představuje důležitý pokusný organizmus a bioindikátor. Anomálie růstu spiny "ocasu" je taky náznakem znečištěné vody. Díky transparentnímu tělu je také možné hodnotit vliv látek, jako jsou etanol (Kaas&Krishnarao 2009) nebo nikotin (Pearl, 2013) na projevy metabolizmu (Kaas, & Krishnarao, 2009).
4
Obr. 1: Anatomie Daphnia magna. Na obrázku je samice s partenogenetickými vajíčky (1). Dále jsou patrné následující struktury: spina (2), abdomen (3), řitní otvor (4), drápek – furka (5), krunýř – exoskelet, ochranná funkce (6), obrvené končetiny – filtrace potravy, výměna plynů (7), čelist – mechanické zpracování potravy (8), ústa a jícen (9), první pár tykadel (antenuly) – smyslový orgán (10), zobák – rostrum (11), naupliové oko (12), druhý pár tykadel (antény) – větvený, pohyb (13), složené oko (14), oční sval – 3 páry svalů pro oční pohyb (15), oční nervová uzlina (16), střevo (17), anténní svaly (18), srdce (19), spárované vaječníky (20), vyvíjející se vajíčka (21), vejcovod (22). Přeloženo dle weebly.com (http://bvsheart.weebly.com/uploads/1/5/6/7/15671936/694214045.jpg, 28. 1. 2016)
5
2.2 Farmaka našich vod Léčiva (farmaka) jsou námi většinou pozitivně vnímaná jako prostředky sloužící k léčbě chorob, ulevení od bolesti a posílení našeho zdraví. Obecná definice farmak "léčivá látka, směs léčivých látek nebo léčivý přípravek, který je určen k příznivému ovlivňování zdraví lidí nebo zvířat." https://cs.wikipedia.org/wiki/Léčivo toto vnímání podporuje. Léčiva v dnešní době jsou velmi běžná, a to zejména ta, která lze vydávat bez lékařského předpisu. Mezi nejčastější patří například paralen (paracetamol), xyzal nebo účinná látka v kávě – kofein. Tyto látky ale často projdou lidským organizmem nedotčené nebo jen částečně pozměněné a zachovávají si některé původní účinky (Vlivy působící na organoleptické vlastnosti masných výrobků 2011). Mohou se následně hromadit ve vodách, stojatých i tekoucích. Jejich účinky v malých koncentracích nemusí být na první pohled patrné a navíc není známo, jakým způsobem ovlivňují necílové organizmy, natož celé ekosystémy (Jančula, 2006) Proto se ve vyspělých evropských zemích dbá na správné užívání a předepisování léčiv. Lékaři předepisují pouze nezbytné množství léčiv pacientům, kteří je potřebují. Pacienti případná nepoužitá léčiva vracejí do lékáren (Liška, et al., 2015). Nejsou ale dostupná žádná data o celkové spotřebě léčiv. V České Republice šíření léčiv monitoruje distribuci všech léčiv Státní ústav pro kontrolu léčiv. Uvádí se množství léčiv podle balení a ne konkrétní množství léčivé látky (Michelová, 2011). Nevyužité léky mohou nezodpovědností koncových uživatelů skončit v odpadních vodách. Konzumace léčiv se může lišit stát od státu (Michelová, 2011). Proto se vynakládá velké množství veřejných financí na odstranění léčiv z odpadních vod. Pokročilé farmaceutické technologie a diagnostika nám dávají stále větší a širší výhled na počet široce užívaných léčiv. Využívá se například granulovaného aktivního uhlí (Šrejber, & Barták, 2016). Čistí se zejména odpadní voda vytékající z největších zdrojů znečištění jako jsou nemocnice, rehabilitační ústavy a jiná zdravotnická zařízení. Navzdory tomu se léčiva ve vodách nadále hromadí, neboť k úplnému vyčištění neexistují efektivní prostředky. Analytické metody jsou časově náročné a finančně nákladné (Kuchyňková, & Šibor, 1987). Ve většině případů se sledují v povrchových a odpadních vodách zjišťují následující látky: estrogenní hormony (estron,17beta-estradiol - E2 a 17alpha-etinylestradiol - EE2, tj. základní látky obsažené v současné orální antikoncepci), také látky ze skupiny 6
NSAID, například nesteroidní protizánětlivá léčiva (ibuprophen, diclophenac, kyselina acetylsalicylová a její metabolit kyselina salicylová), antiepileptikum karbamazepin, kyselina klofibrová a kyselina o-hippurová (K. Fuksa, 2008). Výše uvedené látky figurují na seznamu deseti v České Republice nejužívanějších látek, které se jsou sledovány ve vodách ovlivněných vypouštěním odpadních vod (K. Fuksa, 2008). Tyto látky jsou chemicky značně různorodé, na prostředí působí odlišně a zpracování vzorků proto vyžaduje odpovídající přístup (Masmer, 2011).
2.3 Vybraná farmaka a jejich vliv na lidský organizmus a životní prostředí Kofein (viz Obr 2.) je typ stimulantu, který urychluje metabolizmus a má vliv na nervovou soustavu (Shearer, & Graham, 2014). Je to droga přírodního původu, kterou mnoho kultur denně užívá, aniž by přemýšlela o jeho vlivu na životní prostředí. Ve své čisté formě je velmi hořký a pro lidský organizmus návykový. Možná proto je nejpopulárnějším užívaným stimulantem na světě (Whalen, et al., 2008). Lidé navyklí kofeinu při jeho nedostatku prožívají abstinenční příznaky, které mohou zahrnovat zmatenost, bolesti hlavy, nevolnost, zácpu a desorientaci. Jako u většiny návykových látek, si náruživí uživatelé často vyvinou toleranci a potřebují stále vyšší dávky k dosažení požadovaných účinků (Clunies, et al., 1999). Kvůli masivnímu rozšíření pití kávy se od roku 1970 začalo s masivní deforestací, která měla zajistit prostor pro vznik nových kávových plantáží (Mrázková, Ruferová, & Chmelař, 2014). Na ostatní organizmy může mít kofein podobný vliv jako na lidi. Je toxický pro ptáky, psy a kočky a má výrazný negativní vliv na měkkýše, pavouky a na různý hmyz. Oproti tomu včelám zlepšuje paměť (Wikimedia Foundation, Inc., 2016). Hrotnatkám zrychluje tep srdce. Reakce je přímo úměrná množství kofeinu, čím větší koncentrace kofeinu, tím rychlejší pulz (Whalen, et al., 2008). V rostlinách působí jako přírodní pesticid. Může ochromit a zabít hmyzího dravce, který rostlinu napadá. Vysoké koncentrace kofeinu se nacházejí v okolní půdě sazenic kávy, které tím inhibují klíčení semen jim blízkých – jejich potenciálních konkurentů o světlo a živiny.
7
Obr. 2: Strukturní vzorek molekuly kofeinu.
Ibuprofen (viz Obr 3.) je široce užívána nesteroidní protizánětlivá droga. Používá se k tlumení bolesti (hlavy, zubů, zad, kloubů, apod.) a k snižování horečky. Ibuprofen blokuje tvorbu prostaglandinů, což jsou látky, které naše tělo uvolňuje v reakci na nemoci a zranění. Prostaglandiny způsobují bolesti a otoky, jsou uvolňovány v mozku a mají pyretické účinky. Vedlejšími účinky ibuprofenu mohou být průjem, nevolnost, zvracení, dyspepsie (bolest v horní části břicha, nadýmání, poruchy trávení) a neurčitá bolest žaludku nebo střev. Už nízké koncentrace ibuprofenu v řekách mohou mít vliv na počet jiker ryb (Bay, 2002).
Obr. 3: Strukturní vzorec molekuly Ibuprofenu.
2.4 Shrnutí V čistírnách odpadních vod (ČOV) se odstraňují pro prostředí škodlivé látky. Hlavní pozornost je věnována tzv. prioritním škodlivinám, mezi něž patří i farmaka (Hájčíková, 2006). Kvantita a rozmanitost farmak, které se do odpadních vod dostávají, je značná. Což činí identifikaci jednotlivých konkrétních škodlivin ekonomicky nemožnou. Přítomnost škodlivin je v ČOV sledována pomocí jejich charakteristických parametrů jako je pH (6,5 - 9,5), bakterie (kolimorfní, enterokoky) a látky. Například přítomnost 8
biochemicky odbouratelných organických látek, zejména forem fosforu a dusíku. Cílem je zlepšení místní kvality vody na tzv. „dobrý stav“ vody. Ne všechny polutanty (látky škodlivé prostředí) lze zcela odstranit, například hormonální látky prochází procesem čištění, a jejich koncentrace směrem po proudu narůstá, kde může způsobovat změnu pohlaví některých ryb, jako je například zákonem chráněna ouklejka pruhovaná (Alburnoides bipunktatus) (Jánišová, 2013). K hodnocení míry škodlivosti rozmanitých farmak na vodní ekosystémy lze využít hrotnatku druhu Daphnia magna, které lze levně a snadno chovat ve velkých počtech. Jejich reakce na přítomnost škodlivin je rychlá a dobře viditelná, proto se jich užívá i k akutním testům toxicity (Edita, 2014) Jelikož mají relativně krátký reprodukční cyklus, jsou dobře použitelné pro chronické testování (Šplíchal, 2007). Farmaceutické látky mohou na hrotnatky působit podobně jako na člověka, nicméně důsledky přítomnosti jejich malých koncentrací na celé společenstvo nejsou zatím známé.
9
3 Praktická část 3.1 Materiál a metody Testovaná látka V lékárně jsem opatřil běžně dostupné léky bez receptu: Ibalgin 400® (Zentiva, l. s.,Praha, Česká Republika) a Kofex (NATURVITA A.S. , Česká Republika). Detail složení viz Tabulka 1.
Ibalgin 400® Kukuřičný škrob, předželatinovaný kukuřičný škrob, sodná sůl karboxymetylškrobu, kyselina stearová, mastek, koloidní bezvodý oxid křemičitý, hypromelóza 2910/3, makrogol 6000, oxid titaničitý, erythrosin, simetikonová emulze SE 4.
Kofex Kofein čistý 40 mg, kofein z guaranového etxraktu 10 mg. Guaranový extrakt s 12% obsahem kofeinu, kofein, mikrokrystalická celulóza, sorbitol, stearan hořečnatý
Tabulka 1: Složení Ibalginu a Kofexu deklarované v příbalových letácích. Design a průběh experimentu Pomocí třecí misky s tloučkem jsem rozmělnil studovaná léčiva a připravil zásobní vodní roztoky. Některé látky v těchto lécích obsažené nebyly ve vodě rozpustné, pracoval jsem proto s jejich suspenzí. Pracoval jsem s ekvivalentními koncentracemi účinných látek, přídavek podpůrných látek jsem zanedbal. Pro test akutní toxicity jsem vždy používal 4 koncentrace účinných látek (ibuprofen: 50, 100, 200 a 400 mg.l-1, kofein: 200, 400, 600 a 800 mg.l-1) a kontrolu. Každé z těchto koncentrací byly vystaveni jedinci Daphnia magna mladší 24 hodin a to 4 kusy v 4 opakováních (N=16). Na začátku pokusu jsem do každého opakování přidal 2,5 ml roztoku řas. Experiment probíhal v temnotě ve 20°C, teplotu jsem průběžně kontroloval datalogerem. Použil jsem probublávanou odstátou vodovodní vodu (pH: 7,68, vodivost: 240 µS.cm-1). V nádobách byl jednou změřen rozpuštěný kyslík sondou WTW Multi 350I. Test probíhal v 100 ml skleněných kádinkách v celkovém objemu 75 ml (voda + roztok řas + suspense testovaných léčiv). Experiment jsem zahájil vložením juvenilních hrotnatek do kádinek 24.2.2016 v 12:00. Mortalitu jsem kontroloval visuálně po 24 hodin 25.2.2016 v 12:00 a 26.2.2016 v 12:00, kdy byl experiment ukončen.
10
Zpracování dat Pomocí linearizace na probit (kofein) nebo empiricky z dat (ibuprofen) jsem stanovil hodnoty LC50/48h. Pro výpočty LC50/48h pro kofein jsem použil korekci vzhledem k zvýšené mortalitě v kontrole (Finney, D. J., 1952). Výsledky jsem podrobil jednocestné analýze variance (ANOVA) a rozdíly prověřil TukeyHSD post-hoc testem. Data byla zpracována v program R-CRAN (Team, 2015)
3.2 Výsledky Teplota v experimentu se pohybovala v rozmezí 19,3 – 22,4 °C (průměr = 19,53 °C). V experimentálních nádobách bylo 8,4 mg.l-1 kyslíku (tj. 96,7% nasycení). Mortalita v kontrolách byla 12,5%. Mortalitu ve všech koncentracích zobrazuje Obr. 4. Všechny koncentrace jsou statisticky odlišné od kontrol, výstup TukeyHSD testu shrnuje Tabulka 2. LC50/48h pro kofein byla vypočtena jako 198 mg.l-1 (zaokrouhleno na celá čísla). LC50/48h pro ibuprofen byla odhadnuta z dat na 50 mg.l-1.
11
Obr. 4: Mortalita Daphnia magna v různých koncentracích ibuprofenu (levý panel, černé body) a kofeinu (pravý panel, šedé body) po 24 (nahoře) a 48 hodinách (dole). Body reprezentují průměr ze 4 opakování. Chybové úsečky zobrazují ± směrodatnou odchylku.
ibuprofen dvojice koncentrací rozdíl kontrola – 50 0,375 kontrola – 100 0,875 kontrola – 200 0,875 kontrola – 400 0,875 50 – 100 0,500 50 – 200 0,500 50 – 400 0,500 100 – 200 ~0 100 – 400 ~0 400 – 800 ~0
signifikance 0,002** 10-7*** 10-7*** 10-7*** 0,0001*** 0,0001*** 0,0001*** 1 1 1
dvojice koncentrací kontrola – 200 kontrola – 400 kontrola – 600 kontrola – 800 200 – 400 200 – 600 200 – 800 400 – 600 400 – 800 600 – 800
kofein rozdíl 0,500 0,563 0,625 0,813 0,063 0,125 0,313 0,063 0,250 0,188
signifikance 0,0003*** 7×10-6*** 2×10-6*** 8×10-8*** 0,945 0,599 0,017* 0,945 0,067# 0,233
Tabulka 2: Výstupy TukeyHSD testu. Srovnání všech dvojic koncentrací a kontroly ibuprofenu respektive kofeinu. Signifikance zobrazuje „adjusted P“ hodnoty a korespondující úroveň signifikance: ***, P < 0,001; **, P < 0,01; *, P < 0,05; #, P < 0,1.
3.3 Diskuze I přes procentuelně vyšší mortalitu kontrol (12,5%, hranice validity dle OECD 10%) považujeme test za validní. Mé hodnoty LC50/48h pro ibuprofen i kofein se shodují s výsledky Bang, et al. (2015). K určení toxicity kofeinu se také využívá pokusný organismus Brachionus calyciflorus (Rotifera) (Zarrelli, et al., 2014) nebo bakterií Vibrio fischeri (Aguirre-Martínez, et al., 2015). Tyto testy naznačují řádově odlišnou toxicitu kofeinu (LC50/48h – B. calyciflorus =104 mg.l-1, IC50/15min – V. fischeri = 19600 mg.l-1). To může být způsobeno zejména odlišnou fyziologií testovaných organizmů, což podtrhuje složitost hodnocení nebezpečnosti farmak pro cílové organizmy.
12
V přírodní podmínkách se ovšem zdaleka nevyskytují takto vysoké koncentrace kofeinu. Střední koncentrace kofeinu je 5 mg.l-1, maxima obvykle dosahuje v zimním období (Papageorgiou,, Kosma, & Lambropoulou, 2016). To je pravděpodobně způsobeno zvýšenou konzumací nápojů obsahujících kofein v zimním období a menší průtok vody v tocích (Papageorgiou, Kosma, & Lambropoulou, 2016). Jelikož ale nejsou dostupná data o spotřebě léčiv a soustavný monitoring neprobíhá, může docházek k nám neznámým krátkodobým výkyvům koncentrací, zejména lokálního charakteru. V takovém případě se mohou projevit zjištěné negativní vlivy. Náš odhad LC50/48h pro ibuprofen je ve srovnání s obdobnými pracemi podhodnocený (Cleuvers, 2004: LC50/48h = 132,6 mg.l-1; Han, Hur, & Kim, 2006: LC50/48h = 108mg.l-1; Heckmann, et al., 2007: LC50/48h = 101,2 mg.l-1). Jelikož letální koncentraci uvádíme jako ekvivalent množství ibuprofenu v suspensi rozdrcených tablet Ibalginu 400®, je možné, že výsledek je zkreslený efektem některé z podpůrných látek. Akutní toxicita pro korýše Thamnocephalus platyurus je naopak ještě vyšší (LC50/24h -
T. platyurus=19,59
mg.l-1) než pro D. magna (Kim, et al., 2009) a účinek ibuprofenu je tedy specifický i v rámci korýšů. Ibuprofen je nejprodávanějším léčivem v České republice (Michelová, 2011). Na necílové organizmy může působit mnoha způsoby, mimo jiné i hormonálně (Halden, 2009). Náš odhad LC50/48h je striktní, ale i tak řádově (~5000×) převyšuje koncentrace, které je možné naměřit v kohoutkové vodě (1-11 ng.l-1, (Olejníčková, 2009) Toto množství se nepovažuje za nebezpečné pro zdraví (Michelová, 2011). K vlivům na necílové organizmy by mohlo docházet v rizikových oblastech, jako jsou malé toky těsně za ústím z ČOV, po proudu od nemocnic a jiných zdravotnických zařízeních, kde lze očekávat řádově vyšší koncentrace.
13
3.4 Závěr V teoretické části této práce jsem vypracoval rešerši zaměřenou na výskyt, chov, charakteristiku a rozmnožování Daphnia magna. Poté jsem se zaměřil na základní popis farmak našich vod a potenciálního vlivu na životní prostředí, zejména na vodní ekosystémy. Zvýšenou pozornost jsem věnoval dvěma běžně užívaným léčivům, kofeinu a ibuprofenu. Tyto farmaceutické látky jsou běžně dostupné bez receptu a při testovaných koncentracích působí toxicky na hrotnatky, které mají klíčové postavení v potravním řetězci velkého množství vodního hmyzu a obratlovců. V experimentální části jsem vyhodnocoval účinek vybraných farmaceutických výrobků na pokusný organizmus Daphnia magna (Crustacea) pomocí testu akutní toxicity. Výsledné hodnoty LC50/48h pro kofein = 198 mg.l-1, pro ibuprofen = 50 mg.l-1. I když, testované koncentrace řádově převyšují přirozeně měřené hodnoty, naše výsledky dávají podnět k dalšímu sledování výskytu farmaceutických léčiv v životním prostředí. Riziko jejich dlouhodobých účinků na necílové organizmy nemělo být podceňováno. Míru rizika by mohly pomoci odhalit testy chronické toxicity.
14
4 Seznam citované literatury Aguirre-Martínez G. V., Owuor M.A., Garrido-Pérez C., Salamanca M.J., Del Valls T.A. & Martín-Díaz M.L. (2015) Are standard tests sensitive enough to evaluate effects of human pharmaceuticals in aquatic biota? Facing changes in research approaches when performing risk assessment of drugs. Chemosphere 120, 75–85. Bang S.H., Ahn J.-Y., Hong N.-H., Sekhon S.S., Kim Y.-H. & Min J. (2015) Acute and chronic toxicity assessment and the gene expression of Dhb, Vtg, Arnt, CYP4, and CYP314 in Daphnia magna exposed to pharmaceuticals. Molecular & Cellular Toxicology 11, 153–160. Bay O. (2002) CRD sewage treatment FAQs. https://georgiastrait.org/wpcontent/uploads/share/12__11_Update_Sewage_FAQs_pt1.pdf Bímová T. (2013) Struktura zooplanktonu v nádržích Jizerských hor v období vrcholící antropogenní acidifikace a zotavování z acidifikace (1992-2012). Praha. https://is.cuni.cz/webapps/zzp/download/120139661 Cleuvers M. (2004) Mixture toxicity of the anti-inflammatory drugs diclofenac, ibuprofen, naproxen, and acetylsalicylic acid. Ecotoxicology and Environmental Safety 59, 309–315. Clunies S., M Urban R., Smith C., Raquel I., A Meschter M., Smolenski M., et al. (1999) Treatment for stimulant use disorders. 270-95-0013 with The CDM Group, Inc. (CDM). Edita K. (2014) Studium účinků veterinárních farmak ve vodním prostředí. 67. http://is.muni.cz/th/364831/prif_m/Edita_Kolarova_-_DP.pdf Finney, D. J. E. (1952) Probit Analysis. Cambridge University Press, Cambridge. Hájčíková P. (2006) Vlivy na životní prostředí jako vstup do CBA. Masarykova univerzita, Brno. is.muni.cz/th/62742/esf_m/diplomova_prace.doc Halden R.U. (2009) Pharma-Ecology – The Occurrence and Fate of Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment. Environmental health perspectives 117, A172. Han G.H., Hur H.G. & Kim S.D. (2006) Ecotoxicological risk of pharmaceuticals from 15
wastewater treatment plants in Korea: occurrence and toxicity to Daphnia magna. Environmental toxicology and chemistry / SETAC 25, 265–271. Heckmann L.-H., Callaghan A., Hooper H.L., Connon R., Hutchinson T.H., Maund S.J., et al. (2007) Chronic toxicity of ibuprofen to Daphnia magna: Effects on life history traits and population dynamics. Toxicology letters 172, 137–145. Jančula D. (2006) Ekotoxikologické hodnocení metod používání pro omezení masového rozvoje řas. 1–32. https://is.muni.cz/th/63649/prif_m/diplomova_prace.pdf Jánišová M. (2013) Hormonální látky ve vodách. www.lipka.cz/soubory/hormony-f3501.pdf K. Fuksa J. (2008) Limnological news farmaka ve vodách. 1–11. http://docplayer.cz/13176302-Limnologicke-noviny-limnolo Kaas B. & Krishnarao K. (2009) Effects of melatonin and ethanol on the heart rate of Daphnia magna. Impulse: an …, 1–8. https://www.researchgate.net/publication/41100506_Effects_of_melatonin_and_ethanol _on_the_heart_rate_of_Daphnia_magna Kim J.-W., Ishibashi H., Yamauchi R., Ichikawa N., Takao Y., Hirano M., et al. (2009) Acute toxicity of pharmaceutical and personal care products on freshwater crustacean (Thamnocephalus platyurus) and fish (Oryzias latipes). The Journal of toxicological sciences 34, 227–232. Klein V. (2008) Výskyt korýšu (Crustacea) v CHKO Moravský kras a jejich bioindikační využití. Brno. is.mendelu.cz/zp/portal_zp.pl?prehled=vyhledavani;podrobnosti=21324;download_prac e=1+&cd=1&hl=cs&ct=clnk&gl=cz Kuchyňková K. & Šibor J. (1987) Zelená chemie. educoland.muni.cz/down-245/ Liška M., Soukupová K., Kule L., Metelková A. & Koželuh M. (2015) Farmaka našich vod. In: Vodohospdářská konference Vodní nádrže. pp. 125–128. Masmer P. (2011) Ekotoxikologie, kontaminace a bioindikace v malých vodních tocích. 1–80. is.muni.cz/th/223044/prif_m/
16
Michelová M. (2011) Výskyt farmak v prostředí a jejich interakce s organismy. Masarykova Univerzita. file:///C:/Users/Oem/Desktop/Výskyt farmak v prostředí a jejich interakce s organismy.pdf Mrázková B., Ruferová Z. & Chmelař A. (2014) Komu chutná prales. Fair Trade in Brno. www.nazemi.cz/sites/default/files/prales_2014.pdf Olejníčková Z. (2009) Odstraňování reziduí specifického antropogenního znečištění vody organickými látkami při úpravě na vodu pitnou. Vysoké učení technické v Brně. https://dspace.vutbr.cz/xmlui/handle/11012/11773 Papageorgiou M., Kosma C. & Lambropoulou D. (2016) Seasonal occurrence, removal, mass loading and environmental risk assessment of 55 pharmaceuticals and personal care products in a municipal wastewater treatment plant in Central Greece. Science of the Total Environment 543, 547–569. Pearl S. (2013) The Effects of Nicotine and Caffeine on the Heart Rate of Daphnia. https://prezi.com/6giqd9gglxt8/the-effect-of-nicotine-and-caffeine-on-the-heart-rate-ofdaphnia Shearer J. & Graham T.E. (2014) Performance effects and metabolic consequences of caffeine and caffeinated energy drink consumption on glucose disposal. Nutrition Reviews 72, 121–136. Šplíchal Z. (2007) Kontaktní testy ekotoxicity sedimentů. Masarykova Univerzita, Brno. https://is.muni.cz/th/151051/prif_b/bakalarska_prace.pdf Šrejber J. & Barták P. (2016) ionexy, aktivní uhlí, chemikálie pro úpravu vody. 1. http://www.erspol.cz/index.php%3Fsite%3Dactivni_uhli Team R.C. (2015) R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Australia. Bažantová E. (2011) Vlivy působící na organoleptické vlastnosti masných výrobků. https://theses.cz/id/0an6u4/?furl=/id/0an6u4/;lang=en
17
Whalen D.J., Silk J.S., Semel M., Forbes E.E., Ryan N.D., Axelson D.A., et al. (2008) Caffeine consumption, sleep, and affect in the natural environments of depressed youth and healthy controls. Journal of Pediatric Psychology 33, 358–367. Wikimedia Foundation, Inc. (2016) Caffeine. Wikipedia, 1. Zarrelli A., DellaGreca M., Iesce M.R., Lavorgna M., Temussi F., Schiavone L., et al. (2014) Ecotoxicological evaluation of caffeine and its derivatives from a simulated chlorination step. Science of the Total Environment 470-471, 453–458.
18
5 Přílohy Příloha 1: Průběh teploty v testu akutní toxicity Příloha 2: Tabulka pozorované mortality v testech akutní tocitity Příloha 3: Foto-ukázka ředících roztoků a experimentálního designu
19
Příloha 1: Průběh teploty v testu akutní toxicity. Zvýšení teploty uprostřed experimentu zapříčinila kontrola mortality po 24 hodinách.
Průběh teploty v testu akutní toxicity 25 24 23
21 20 19 18 17 16
Čas
I
26.2.16 12:00
26.2.16 6:00
26.2.16 0:00
25.2.16 18:00
25.2.16 12:00
25.2.16 6:00
25.2.16 0:00
24.2.16 18:00
15 24.2.16 12:00
Teplota [°C]
22
Příloha 2: Tabulka pozorované mortality v testu akutní toxicity ve všech koncentracích ibuprofenu i kofeinu. ibuprofen kontrola 50 mg.l-1 100 mg.l-1 200 mg.l-1 400 mg.l-1 kofein kontrola 200 mg.l-1 400 mg.l-1 600 mg.l-1 800 mg.l-1
0 1 4 4 4 0 1 2 2 3
mortalita po 24h (číselně, %) 1 0 1 =12,5% 1 2 1 =31,2% 4 4 4 =100% 4 4 4 =100% 4 4 4 =100% mortalita po 24h (číselně, %) 1 0 1 =12,5% 1 1 1 =25% 1 3 2 =50% 2 3 2 =56,3% 4 2 2 =68,8%
ibuprofen kontrola 50 mg.l-1 100 mg.l-1 200 mg.l-1 400 mg.l-1 kofein kontrola 200 mg.l-1 400 mg.l-1 600 mg.l-1 800 mg.l-1
II
mortalita po 0 1 2 1 4 4 4 4 4 4 mortalita po 0 1 2 3 3 3 3 3 3 4
48h (číselně, %) 0 1 =12,5% 2 3 =50% 4 4 =100% 4 4 =100% 4 4 =100% 48h (číselně, %) 0 1 =12,5% 2 3 =62,5% 3 2 =68,8% 3 3 =75% 4 4 =93,8%
Příloha 3: Ukázka ředících roztoků (vlevo) testovaných léčiv (ibalgin – nahoře, kofex – dole) a experimentální design s 4 koncentracemi a jednou kontrolou vše po čtyřech opakováních (vpravo).
.
III
