STATUS ANTIOKSIDAN TIKUS SPRAGUE-DAWLEY BETINA DENGAN PEMBERIAN NANOPARTIKEL KURKUMINOID TEMULAWAK BALITTRO
RISKA FEBRIANTI
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
PERNYATAAN SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Status Antioksidan Tikus Sprague-Dawley Betina dengan Pemberian Nanopartikel Kurkuminoid Temulawak Balittro adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini merupakan bagian dari proyek penelitian Hibah Kompetitif Penelitian Strategis Unggulan Nasional tahun 2011 atas nama Dr. Laksmi Ambarsari MS dkk dengan judul Produksi Nanopartikel kurkuminoid Berbasis Bahan Baku Terstandar Secara Genetik dan Metabolik untuk Meningkatkan Nilai Tambah Biodiversitas Lokal Demi Kemajuan Bangsa. Proyek penelitian ini didanai oleh DIKTI dengan nomor kontrak 476/SP2H/PL/Dit.Litabmas/V/2011. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Februari 2014 Riska Febrianti NIM G84090050
ABSTRAK RISKA FEBRIANTI. Status Antioksidan Tikus Sprague-Dawley Betina dengan Pemberian Nanopartikel Kurkuminoid Temulawak Balittro. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan EDY DJAUHARI PURWAKUSUMAH. Temulawak (Curcuma xanthorrhiza) merupakan tumbuhan herbal Indonesia yang memiliki aktivitas antioksidan. Penelitian ini bertujuan mengukur peningkatan bioavabilitas kurkuminoid melalui efektivitas nanopartikel kurkuminoid sebagai antioksidan pada tikus yang diinduksi karbon tetraklorida (CCl4). Nanopartikel kurkuminoid temulawak dihasilkan dengan metode ultrasonikasi-homogenisasi memiliki rata-rata ukuran partikel 141.85+38.82 nm dengan nilai indeks polidispersitas sebesar 0.233 serta efisiensi penjerapan mencapai 71%. Selama perlakuan, bobot badan tikus mengalami kenaikan. Gejala klinis tikus (tingkah laku dan feses) tidak menunjukkan adanya ketidaknormalan. Efek nanopartikel kurkuminoid tersalut lemak padat dapat menurunkan kadar malondialdehida dan meningkatkan aktivitas enzim peroksidase, glutation peroksidase serta superoksida dismutase. Kata kunci: antioksidan, kurkuminoid, nanopartikel lemak padat, temulawak.
ABSTRACT RISKA FEBRIANTI. Antioxidant Status of Sprague-Dawley Female Rat with Curcuminoids Nanoparticles of Balittro Curcuma. Supervised by LAKSMI AMBARSARI and EDY DJAUHARI PURWAKUSUMAH. Curcuma (Curcuma xanthorrhiza) is an Indonesian herbs plant with antioxidant activity. This research aimed to measure the increasing of curcuminoids bioavaibility through the efectivity of nanoparticle curcuminoids as antioxidant for carbon tetrachloride (CCl4) induced rats. Nanoparticle curcuminoids was produced by homogenization-ultrasonication method showed results particle size of curcuminoids nanoparticle was 141.85±38.82 nm with polidispersity index was 0.233 and entrapment efficiency was 71%. During the treatment, rat’s body weight was increased. Clinical symptoms of rats (behavior and feces) was normal. Nanoparticle curcuminoids can decrease malondialdehide concentrations and increase peroxide, glutation peroxide, and superoxide dismutase activity. Keywords: antioxidant, curcuminoid, solid lipid nanoparticle, curcuma.
STATUS ANTIOKSIDAN TIKUS SPRAGUE-DAWLEY BETINA DENGAN PEMBERIAN NANOPARTIKEL KURKUMINOID TEMULAWAK BALITTRO
RISKA FEBRIANTI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
Judul Skripsi : Status Antioksidan Tikus Sprague-Dawley Betina dengan Pemberian Nanopartikel Kurkuminoid Temulawak Balittro Nama : Riska Febrianti NIM : G84090050
Disetujui oleh
Dr Laksmi Ambarsari, MS Pembimbing I
Drs Edy Djauhari P, MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, MAppSc Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
JuduJ Skripsi: Status Antioksidan Tikus Spraglie-Dcl\I'/ev Betina denga n Pemberian Nanopa11ikeJ Kurkuminoid Temulawak Balittro Nama : Riska Febrianti NIM : G84090050
Disetujui oJeh
~
Dr Laksmi Ambarsari, MS Pembimbing I
Tanggal Lulus:
1 2 FEB 201 4
Pembimbing II
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Illahi Rabbi, Allah subhanahu wa ta’ala atas segala nikmat dan karunia-Nya sehingga penyusunan karya ilmiah yang berjudul Status Antioksidan Tikus Sprague-Dawley Betina dengan Pemberian Nanopartikel Kurkuminoid Temulawak Balittro ini dapat diselesaikan. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Laksmi Ambarsari MS dan Drs. Edy Djauhari P, MSi, selaku pembimbing skripsi serta Muslih Abdul Mujib, MSi yang telah banyak membantu dalam hal teknis pembuatan nanopartikel. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Nabilla, Edwin, Suryadi, Budi selaku rekan satu tim kerja, drh. Devi beserta staff Pusat Studi Satwa Primata yang telah membantu selama pengumpulan data. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, A andri, A ai, Apri, dan teman-teman biokimia 46 atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Februari 2014 Riska Febrianti
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Percobaan
3
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Pembahasan SIMPULAN DAN SARAN
6 6 10 17
Simpulan
17
Saran
17
DAFTAR PUSTAKA
17
LAMPIRAN
20
RIWAYAT HIDUP
32
DAFTAR TABEL 1 Distribusi ukuran partikel dan efisiensi penjerapan 2 Pengamatan bobot badan tikus
6 7
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5 6 7 8
Emulsi nanopartikel kurkuminoid tersalut lemak padat Hati tikus Sprague dawley betina Keadaan feses setelah diberi perlakuan Kadar malondialdehida hati tikus Sprague-Dawley Betina Aktivitas enzim superoksida dismutase hati tikus Sprague-Dawley Betina Aktivitas enzim glutation peroksidase hati tikus Sprague-Dawley Betina Aktivitas peroksidase hati tikus Sprague-Dawley Betina Mekanisme enzim antioksidan
6 7 7 9 9 10 10 16
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 8
Diagram alir penelitian Efisiensi penjerapan Hasil analisis ukuran partikel Pengukuran kadar MDA Pengukuran aktivitas enzim superoksida dismutase Pengukuran aktivitas enzim glutation peroksidase Pengukuran aktivitas enzim peroksidase Hasil analisis SPSS
20 21 22 23 25 26 28 30
PENDAHULUAN Penggunaan bahan alam, baik sebagai obat maupun tujuan lain cenderung meningkat, terlebih dengan adanya isu back to nature. Seiring dengan perkembangan yang terjadi saat ini, obat tradisional mendapat perhatian lebih bagi alternatif pelayanan kesehatan. Selain itu banyak orang beranggapan bahwa penggunaan tanaman obat atau obat tradisional relatif lebih aman dibandingkan obat sintesis. Menurut BPOM RI (2005), obat tradisional adalah bahan atau ramuan yang berupa bahan tumbuhan, bahan hewan, bahan mineral, sediaan galenik atau campuran dari bahan-bahan tersebut, yang secara tradisional telah digunakan untuk pengobatan berdasarkan pengalaman. WHO merekomendasikan penggunaan obat tradisional termasuk herbal dalam pemeliharaan kesehatan masyarakat, pencegahan dan pengobatan penyakit, terutama untuk penyakit kronis, penyakit degeneratif dan kanker. WHO juga mendukung upaya-upaya dalam peningkatan keamanan dan khasiat dari obat tradisional (WHO 2003). Salah satu tanaman obat yang sering digunakan sebagai obat tradisional adalah temulawak. Temulawak (Curcuma xanthorriza Roxb.) merupakan salah satu tumbuhan obat suku Zingiberaceae yang banyak tumbuh di Indonesia (Sidik et al. 1995). Rimpang merupakan bagian yang paling berguna dari tanaman ini terutama untuk tujuan pengobatan tradisional yang dikenal dengan jamu. Manfaat temulawak terutama diperoleh dari kurkuminoid yang merupakan senyawa aktif dalam rimpang tanaman temulawak. Hasil penelitian Liang et al. (1985) menyatakan bahwa kurkumin rimpang temulawak berkhasiat menetralkan racun, menghilangkan rasa nyeri sendi, menurunkan kadar kolesterol darah, dan sebagai antioksidan. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa senyawa kurkuminoid memiliki bioavabilitas yang rendah baik pada berbagai hewan model (Wahlstrom dan Blennow 1978; Ravindranath et al. 1980 dan 1981; Pan et al. 1999) dan manusia (Shoba et al. 1998). Penyebab rendahnya bioavailabilitas kurkumin dikarenakan senyawa tersebut hampir tidak larut dalam air pada pH asam dan netral sehingga sulit sekali terabsorpsi. Salah satu cara untuk mengatasi masalah tersebut antara lain dengan penyatuan kurkuminoid ke dalam sistem koloid pembawa (colloidal carrier system) membentuk sediaan nanopartikel kurkuminoid. Nanopartikel lemak padat memiliki sifat yang unik, yaitu ukurannya kecil, luas permukaan besar, dan kapasitas pemuatan obat yang tinggi (Kamble et al. 2010). Selain itu, beberapa penelitian menunjukkan bahwa penggunaan obatobatan dalam skala nano dapat mengurangi dosis obat yang dapat mengakibatkan efek samping pada beberapa pasien (Malsch 2005). Nanopartikel lemak padat, Solid Lipid Nanoparticle (SLN) dikembangkan sebagai suatu alternatif untuk nanopartikel polimer, liposom, dan emulsi. SLN merupakan koloid pembawa submikron yang terdiri dari lemak fisiologis, terdispersi dalam air atau dalam suatu larutan surfaktan berair (Kamble et al. 2010). Diantara pembawa pengantaran obat modern, SLN telah menjadi sistem koloid pembawa yang menjanjikan. Dibandingkan dengan partikel pembawa yang lain, SLN memiliki sejumlah keuntungan sebagai sistem pengantaran obat, seperti tolerabilitas dan biodegradasi yang baik, bioavailabilitas yang tinggi, efisien mengenai sasaran, dan mudah dipersiapkan dan disterilisasi dalam skala besar (Pang et al. 2009).
2 Mujib (2011) telah berhasil melakukan karakterisasi nanopartikel kurkuminoid tersalut lemak padat dengan metode homogenisasi dan ultrasonikasi dengan komposisi asam palmitat : kurkuminoid terbaik adalah 1 : 0.1 dengan volume 100 mL, diperoleh ukuran partikel sebesar 252.3±69.4 nm dengan efisiensi penjerapan 77.65%. Formulasi nanopartikel kurkuminoid lemak padat telah diketahui, namun efek nanopartikel kurkuminoid terhadap status antioksidan secara in vivo belum diketahui. Penelitian ini bertujuan melakukan karakterisasi nanopartikel lemak padat dan mengukur efek nanopartikel kurkuminoid temulawak terhadap aktivitas enzim antioksidan yang meliputi enzim peroksidase, superoksida dismutase, dan glutation peroksidase, serta kadar malondialdehida. Selain itu, penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai efektivitas nanopartikel kurkuminoid temulawak tersalut lemak padat terhadap status antioksidan pada tikus Sprague-Dawley betina dengan perlakuan stres oksidatif yang diinduksi CCl4 serta dapat menjadi langkah awal penggunaan nanopartikel kurkuminoid temulawak asal Balittro sebagai obat tradisional yang bermanfaat sebagai antioksidan. Hipotesis penelitian ini adalah nanopartikel kurkuminoid temulawak tersalut lemak padat dapat meningkatkan bioavabilitas di dalam tubuh. Hal tersebut ditunjukkan dengan penurunan kadar malondialdehida serta peningkatan aktivitas enzim superoksida dismutase, peroksidase, dan glutation peroksidase.
METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan mulai bulan Januari hingga Agustus 2013 di Laboratorium Kimia Fisik, Departemen Kimia FMIPA IPB; Laboratorium Biofisika Material, Departemen Fisika FMIPA IPB; Laboratorium Pusat Studi Satwa Primata, Bogor; dan Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, Bogor. Bahan Penelitian ini menggunakan tikus putih (Rattus sp.) betina galur SpragueDawley berasal dari Pusat Studi Satwa Primata berumur 4-8 minggu dengan bobot 140-170 g. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain kurkuminoid dari rimpang temulawak Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO), kurkuminoid (Merck), asam palmitat (Merck), poloksamer 188 (BASF), air reverse osmosis (RO), vitamin C, larutan pengukuran superoksida dismutase, peroksidase, glutation peroksidase, dan malondialdehida (MDA), etanol, n-heksana, standar kurkuminoid, metanol, dan CCl4. Alat Alat yang digunakan adalah pengaduk magnet, homogenizer (Ultra Turrax T18), ultrasonic processor (130 Watt 20 kHz, Cole-Parmer), mikrosentrifusa (MIKRO 200R, Hettich Zentrifugen), spektrofotometer UV-Vis (UV-1700 Pharmaspec), particle size analyzer (Delsa NanoC), dan microplate reader.
3 ProsedurPercobaan Karakterisasi Nanopartikel Kurkuminoid Tersalut Lemak Padat Pembuatan Nanopartikel Kurkuminoid Tersalut Asam Palmitat (Mujib 2011). Fase lemak terdiri atas 1 g asam palmitat dan 0.1 g kurkuminoid dipanaskan pada suhu 75°C sambil diaduk. Fase air terdiri atas 0.5 g poloksamer 188 dan 100 mL air reverse osmosis yang dipanaskan pada suhu (75°C). Fase lemak didispersikan ke dalam fase air sambil diaduk. Emulsi yang dihasilkan kemudian dihomogenisasi dengan kecepatan 13500 rpm selama 5 menit, selanjutnya diultrasonikasi dengan amplitudo 20 % selama 60 menit. Nanopartikel kurkuminoid yang diperoleh didinginkan pada suhu 00C sehingga dihasilkan nanopartikel kurkuminoid dalam bentuk emulsi. Efisiensi Penjerapan (Yadav et al. 2008). Nanopartikel kurkuminoid yang dihasilkan disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm (18626×G) pada suhu 4°C selama 40 menit dan supernatannya didekantasi. Residunya diekstraksi dengan metanol 89%, kemudian disentrifugasi pada kecepatan yang sama. Serapan supernatan metanol diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 425 nm. Efisiensi penjerapan dihitung dengan persamaan: Konsentrasi kurkumin terjerap Efisiensi penjerapan = Konsentrasi kurkumin yang ditambahkan ×100% Konsentrasi kurkuminoid terjerap diperoleh melalui perhitungan dengan menggunakan persamaan regresi linear dari deret standar kurkuminoid. Analisis Ukuran Partikel (Pang et al. 2007). Emulsi kurkuminoid-SLN yang dihasilkan selanjutnya dianalisis ukuran partikelnya ditentukan dengan menggunakan particle size analyzer berdasarkan distribusi jumlah. Rancangan Percobaan dan Hewan Uji (Konatham et al. 2010 modifikasi) Penelitian ini menggunakan 27 ekor tikus betina galur Sprague-Dawley yang berasal dari laboratorium Pusat Studi Satwa Primata, berusia sekitar 4-8 minggu dengan berat badan sekitar 140-170 g. Tikus dibagi menjadi 9 kelompok masing-masing terdiri dari 3 ekor tikus. Hewan coba diaklimatisasi selama minimal 1 minggu dan dimasukkan dalam kandang kelompok. Sebelum percobaan, hewan coba ditimbang berat badannya. Selanjutnya tikus dibuat rusak hatinya sehingga mengalami oksidasi dengan 0.7 mL/kgBB CCL4 33% (dalam olive oil) pada hari ke 3, 6, dan 9 secara intraperitoneal kecuali kelompok normal. Kelompok 1 adalah kelompok normal tanpa induksi CCl4 yang diberikan. Kelompok 2 kontrol negatif diberi CCl4 tanpa pemberian sediaan apapun. Kelompok 3 diberi nanopartikel kurkuminoid temulawak Balitro dengan dosis 50 mg/kg BB. Kelompok 4 diberi nanopartikel kurkuminoid temulawak Balitro dengan dosis 100 mg/kg BB. Kelompok 5 diberi nanopartikel kurkuminoid temulawak Balitro dengan dosis 1500 mg/kgBB. Kelompok 6 diberi ekstrak kurkuminoid temulawak Balittro dengan dosis 100 mg/kgBB. Kelompok 7 kontrol positif vitamin C dengan dosis 36 mg/kgBB. Kelompok 8 kontrol positif standar kurkuminoid dengan dosis 20 mg/kgBB. Kelompok 9 kontrol nanopartikel placebo. Semua sediaan diberikan secara oral dalam bentuk larutan dalam air dengan sonde lambung. Hari ke-10 dilakukan euthanasia untuk diambil hatinya dan selanjutnya aktivitas enzim enzim superoksida dismutase (SOD), peroksidase (POX), glutation peroksidase (Gpx), dan kadar malondialdehida (MDA) diukur untuk menentukan efek antioksidan sediaan yang diuji.
4 Pengukuran kadar MDA (Biovision 2013) Preparasi sampel dengan cara 10 mg jaringan hati dihomogenisasi dengan penambahan 300 μL lisis bufer MDA (3 μL BHT 100x). Homogenat yang dihasilkan selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 13000 G selama 10 menit. Sedangkan untuk standar dilakukan dengan sebanyak 10 μL standar MDA diencerkan dengan 407 μL ddH2O untuk mempersiapkan 0.1 M MDA. Kemudian 20 μL 0.1 M MDA diencerkan dengan penambahan 980 μL ddH 2O untuk menyiapkan 2 mM MDA, selanjutnya ditambahkan 0, 2, 4, 6, 8, dan 10 μL dari 2 mM MDA ke tabung microcentrifuge terpisah dan disesuaikan volume akhir 200 μL dengan ddH2O. Sebanyak 600 μL larutan TBA ditambahkan dalam setiap botol berisi standar dan sampel. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu 95°C selama 60 menit. Campuran reaksi didinginkan sampai suhu kamar dalam penangas es selama 10 menit. Campuran reaksi sebanyak 200 μL (dari 800 μL reaksi campuran) dipipet ke dalam setiap sumur pada microplate untuk analisis dan dibaca absorbansi pada 532 nm. Pengukuran aktivitas superoksida dismutase (Biovison 2013) Jaringan hati sebanyak 10 mg dibilas dengan PBS-KCl dan dihomogenkan dalam 0.1 M Tris-HCl. Kemudian homogenat disentrifus pada kecepatan 14000 G selama 5 menit suhu 4°C dan supernatan dikumpulkan. Sebanyak 20 μL larutan sampel ditambahkan untuk setiap sumur sampel dan blanko 2 dan 20 μL ddH 2O pada blanko 1 dan blanko 3. Selanjutnya ditambahkan 200 μL larutan kerja WST pada setiap sumur. Selanjutnya 20 μL larutan bufer pengencer pada blanko 2 dan blanko 3 sedangkan 20 μL larutan enzim untuk setiap sampel dan blanko 1. Sampel diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 450 nm. Pengukuran aktivitas glutation peroksidase (Biovision 2013) Jaringan hati sebanyak 0.1 g dihomogenkan dalam 0.2 mL larutan bufer dingin. Selanjutnya homogenat disentrifugasi pada 10000 G selama 15 menit pada 4°C dan supernatan dikumpulkan. Reaksi campuran sebanyak 40 μL ditambahkan ke masing-masing sampel uji, kontrol positif lalu aduk. Selanjutnya campuran tersebut diinkubasi selama 15 menit. Sebanyak 10 μL cumene hydroperoxide ditambahkan dan diaduk rata. Selanjutnya diukur absorbansi pada 340 nm pada T1 untuk membaca A1, dan diakhiri dengan pengukuran absorbansi pada 340 nm lagi di T2 setelah inkubasi reaksi pada 25°C selama 5 menit untuk membaca A2 dengan melindungi sampel dari cahaya. NADPH (nikotinamida adenin dinukleotida fosfat) 40 mM sebanyak 25 μL diencerkan dengan 975 μL ddH2O untuk menghasilkan NADPH 1 mM. Selanjutnya ditambahkan 0, 20, 40, 60, 80, 100 μL dari 1 mM NADPH ke microplate menghasilkan 0, 20, 40, 60, 80, 100 nmol/sumur. Ke dalam masing-masing sumur ditepatkan volume akhir 100 μL dengan buffer, selanjutnya dilakukan pengukuran absorbansi pada 340 nm untuk penentuan kurva standar NADPH. Pengukuran aktivitas peroksidase(Biovison 2013) Homogenat hati disentrifugasi selama 15 menit pada 1000 g dalam waktu 30 menit untuk menghilangkan partikulat pelet. Sampel sebanyak 20 μL ditambahkan ke dalam setiap sumur dan disesuaikan volume akhir 50 μL dengan
5 bufer. Sebanyak 50 μL reaksi campuran ditambahkan pada masing-masing sampel uji dan kontrol positif hidrogen peroksida (HRP). Selanjutnya diaduk dan diinkubasi selama 3 menit pada 37°C dan dilakukan pengukuran absorbansi pada 570 nm utuk pengukuran A0. Selanjutnya diinkubasi selama 90 menit pada suhu 37°C untuk pengukuran absorbansi pada 570 nm untuk A1. Sedangkan untuk standar, sebanyak 10 μL subtrat H2O2 12.5 mM diencerkan dengan bufer 1240 μL untuk mendapatkan H2O2 substrat 0.1 mM. Substrat hasil pengenceran ditambahkan 0, 10, 20, 30, 40, 50 μL menjadi pada sumur dan ditepatkan volume akhir 50 μL dengan bufer pengujian untuk menghasilkan 0, 1, 2, 3, 4, 5 nmol/sumur standar H2O2. Untuk setiap sumur, dipersiapkan total 50 μL reaksi campuran mengandung 2 μL Probe OxiRed dan 48 μL HRP kontrol positif. Campuran diinkubasi selama 5 menit dan mengukur absorbansi pada 570 nm dalam microplate reader. Analisis Data (Mattjik dan Sumertajaya 2000) Rancangan acak lengkap digunakan pada rancangan penelitian ini. Data yang diperoleh dianalisis dengan metode ANOVA (analysis of variance) pada tingkat kepercayaan 95% dan taraf α = 0.05. Model rancangan tersebut adalah sebagai berikut. Yij = µ + τ + εi Keterangan: Yij = pengamatan perlakuan ke-i dan ulangan ke-j µ = Pengaruh rataan umum τ = Pengaruh rataan ke-i εi = Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j Uji lanjut yang digunakan adalah uji Duncan pada selang kepercayaan 90%, taraf α = 0.05. Semua data dianalisis dengan program SPSS 11.5.
6
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Karakterisasi Nanopartikel Kurkuminoid tersalut Lemak Padat Karakterisasi nanopartikel kurkuminoid memiliki tiga parameter dalam pengukurannya yang meliputi rata-rata ukuran partikel, indeks polidispersitas, dan efisiensi penjerapan. Hasil pengukuran partikel nanopartikel kurkuminoid dianalisis menggunakan alat particle size analyzer Delsa NanoC (Beckman Coulter). Ukuran partikel yang dihasilkan adalah 141.85+38.82 nm dengan indeks polidispersitas sebesar 0.233+0.06 (Tabel 1). Efisiensi penjerapan emulsi nanopartikel kurkuminoid 70.96%. Gambar 1 menunjukkan formulasi emulsi nanopartikel kurkuminoid yang baik yang ditandai dengan warna kuning cerah yang larut sempurna tanpa ada gumpalan didalamnya (homogen). Tabel 1 Distribusi ukuran partikel dan efisiensi penjerapan Jenis Sampel
Nanopartikel kurkuminoid
Rata-Rata Ukuran Partikel (nm)*
Indeks Polidispersitas (IP)*
[kurkuminoi d] terjerap (mg/mL)
[kurkuminoid] ditambahkan (mg/mL)
Efisiensi Penjerapan (%)*
141.85+38.82
0.233+0.06
0.7096
1
70.96+9.3 0
keterangan (*): n= 3 kali ulangan
Gambar 1 Emulsi nanopartikel kurkuminoid tersalut lemak padat Bobot Badan dan Kondisi hewan coba Pengamatan kondisi hewan coba dilakukan selama 10 hari yang meliputi pola tingkah laku, bobot badan, dan keadaan fisik hewan coba. Selama perlakuan, tidak terjadi keabnormalan perilaku dan feses pada tikus. Feses tikus tidak mengalami perubahan warna (feses tetap berwarna hitam). Parameter yang diamati selanjutnya adalah perubahan bobot badan selama perlakuan. Tabel 2 menunjukkan bahwa secara umum bobot badan semua kelompok cenderung meningkat selama pemberian perlakuan. Tetapi, di hari ke-4 pada kelompok CCl4 mengalami penurunan berat badan pada kelompok perlakuan CCl4, ekstrak kurkuminoid 100 mg/kgBB, dan vitamin C 36 mg/kgBB, jika dibandingkan dengan kelompok perlakuan lain yang cenderung mengalami kenaikan bobot badan. Secara statistik, bobot badan kelompok normal berbeda nyata (p<0.05) dengan kelompok nanopartikel kurkuminoid 1500 mg/kgBB, ekstrak kurkuminoid 100 mg/kgBB, dan kelompok perlakuan vitamin C 36 mg/kgBB. Parameter terakhir yang dapat diamati setelah perlakuan adalah pengamatan fisik hati tikus yang dilakukan setelah euthanasia. Hati tikus yang diinduksi CCl4 terlihat mengalami abnormalitas berupa pustula (Gambar 2b), sedangkan tikus
7 yang tidak diinduksi CCl4 (kelompok normal) tidak ditemukan adanya pustula di hatinya (Gambar 2a). Tabel 2 Pengamatan bobot badan tikus Kelompok Normal
Hari ke0
2
4
6
8
% perubahan
149.76
156.40
157.63
159.30
158.77
6.02ab
CCl4 178.23 187.60 186.37 189.13 189.07 6.08ab Nanopartikel kurkuminoid 50 160.03 170.27 170.27 169.13 165.83 3.62a mg/kgBB Nanopartikel kurkuminoid 100 146.03 150.63 152.87 153.40 156.87 7.42ab mg/kgBB Nanopartikel kurkuminoid 1500 152.83 164.30 165.60 166.37 171.70 12.35b mg/kgBB Ekstrak kurkuminoid 100 143.53 163.40 160.93 162.83 161.60 12.59b mg/kgBB Vitamin C 36 141.97 155.37 153.10 159.57 160.93 13.35b mg/kgBB Standar kurkuminoid 100 147.87 149.83 151.93 155.60 158.87 7.44ab mg/kgBB Nanopartikel 158.23 163.50 169.83 169.83 168.00 6.17ab kosong a Angka-angka pada kolom yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji selang berganda Duncan).
Pustula
Gambar 2 Hati tikus Sprague dawley Betina setelah euthanasia dengan perlakuan A= normal, B= induksi CCl4
Feses
Gambar 3 Keadaan feses tikus setelah diberi perlakuan
8 Status Antioksidan Tikus Percobaan Status antioksidan suatu bahan secara in vivo dapat dilakukan dengan pengukuran terhadap kadar MDA, aktivitas superoksida dismutase (SOD), aktivitas glutation peroksidase (GPx) dan aktivitas peroksidase hati tikus. Berdasarkan pengukuran kadar MDA menunjukkan bahwa pemberian CCl4 dapat meningkatkan kadar MDA jika dibandingkan dengan kelompok pemberian nanopartikel (Gambar 4). Kadar MDA yang terukur dari kelompok pemberian nanopartikel dosis 50 mg/kgBB, nanopartikel dosis 100 mg/kgBB, dan nanopartikel dosis 1500 mg/kgBB dapat menurunkan kadar MDA hati tikus dibandingkan dengan kelompok normal dan CCl4 . Hasil pengukuran pemberian nanopartikel ini menunjukkan hasil yang hampir sama dengan kelompok ekstrak kurkuminoid. Kadar MDA terendah ditunjukkan pada kelompok nanopartikel kosong. Sedangkan kadar MDA tertinggi ditunjukkan pada kelompok vitamin C. Tetapi, secara statistik pengukuran kadar MDA dari keseluruhan kelompok tidak berbeda nyata. Hasil pengukuran aktivitas superoksida dismutase (SOD) menunjukkan semua kelompok perlakuan memiliki aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok normal (Gambar 5). Pemberian CCl4 dapat menurunkan aktivitas SOD. Ketiga kelompok perlakuan dengan nanopartikel kurkuminoid diketahui meningkatkan aktivitas superoksida dismutase dibandingkan kelompok normal dan CCl4. Hasil pengukuran dengan pemberian ekstrak kurkuminoid menunjukkan hasil yang hampir sama dengan pemberian naopartikel kurkuminoid dosis 1500 mg/kgBB. Aktivitas tertinggi terdapat pada kelompok 5. Secara statistik, aktivitas enzim menunjukkan hasil yang berbeda nyata. Artinya, pemberian nanopartikel kurkuminoid dosis 1500 mg/kgBB memiliki efek meningkatkan aktivitas SOD. Hasil yang sama juga ditunjukkan pada pengukuran aktivitas glutation peroksidase (Gambar 7). Kelompok dengan perlakuan pemberian CCl4 sebagai agen radikal eksogen menunjukkan aktivitas yang lebih rendah jika dibandingkan kelompok pemberian nanopartikel kurkuminoid. Ketiga perlakuan dengan pemberian nanopartikel kurkuminoid dapat meningkatkan aktivitas glutation peroksidase. Aktivitas GPx pada pemberian ekstrak kurkuminoid lebih rendah jika dibandingkan dengan kelompok CCl4 dan pemberian nanopartikel kurkuminoid, tetapi masih jauh lebih tinggi aktivitasnya jika dibandingkan dengan kelompok normal. Dosis nanopartikel kurkuminoid sebesar 100 mg/kgBB memberikan hasil yang berbeda nyata dibandingkan dengan normal dalam meningkatkan aktivitas glutation peroksidase. Berdasarkan pengukuran aktivitas peroksidase, diketahui bahwa pemberian nanopartikel kurkuminoid dosis 50 mg/kgBB dan 1500 mg/kgBB pada tikus meningkatkan aktivitas peroksidase dibandingkan kelompok normal walaupun secara statistik hasil keduanya tidak berbeda nyata. Aktivitas enzim peroksidase tertinggi terdapat pada kelompok 8 dengan aktivitas sebesar 3.2532 mU/mL. Sedangkan, aktivitas enzim peroksidase terendah ditunjukkan oleh kelompok 2 dengan perlakuan pemberian CCl4. Kelompok perlakuan lainnya menunjukkan hasil yang tidak berbeda jauh dengan kelompok normal. Secara statistik, secara keseluruhan aktivitasnya tidak menunjukan perbedaan yang nyata antar kelompoknya (p<0.05).
9 7 5.98+3.02a Kadar MDA (nmol/mg)
6
5.31 + 0.24a
4.46+0.20a 4.56+3.52a 4.32+1.12a4.24+0.36a 4.26+0.14a
5
4.59+3.02
4
3.50+1.61a
3 2 1 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Kelompok
Gambar 4 Kadar MDA tikus Sprague-Dawley Betina 1) Normal; 2) CCl4; 3) Nanopartikel kurkuminoid 50 mg/kgBB; 4) Nanopartikel kurkuminoid 100 mg/kgBB; 5) Nanopartikel kurkuminoid 1500 mg/kgBB; 6) Ekstrak kurkuminoid 100 mg/kgBB; 7) Vitamin C 36 mg/kgBB; 8) Standar kurkuminoid 20 mg/kgBB; 9) Nanopartikel placebo. Keterangan: Angka-angka pada grafik yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji Duncan).
100
% Inhibisi Superoksida dismutase
90
81.43+9.98b
80
71.52+15.13ab
70
66.75+11.58ab
62.79+4.96ab
60 50
75.25+25.88ab
49.72+1.56ab 45.85+43.58ab
45.08+23.38ab
41.07+7.63a
40 30 20 10 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
Kelompok
Gambar 5 Aktivitas enzim superoksida dismutase hati tikus Sprague-Dawley Betina 1) Normal; 2) CCl4; 3) Nanopartikel kurkuminoid 50 mg/kgBB; 4) Nanopartikel kurkuminoid 100 mg/kgBB; 5) Nanopartikel kurkuminoid 1500 mg/kgBB; 6) Ekstrak kurkuminoid 100 mg/kgBB; 7) Vitamin C 36 mg/kgBB; 8) Standar kurkuminoid 20 mg/kgBB; 9) Nanopartikel placebo. Keterangan: Angka-angka pada grafik yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji Duncan).
10
Aktivitas glutation peroksidase (mU/mL)
7000
6000
5523.08+1693.41c
5000
3733.33+1203.55bc
3838.56+1845.50bc
3657.05+2725.77bc
4000
4141.03+2683.31bc
2619.23+1607.02abc
3000
1713.46+2065.81ab 2000 973.72+729.97ab 1000 89.74+11.75a 0 -1000
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Kelompok
Gambar 6 Aktivitas enzim glutation peroksidase hati tikus Sprague-Dawley Betina 1) Normal; 2) CCl4; 3) Nanopartikel kurkuminoid 50 mg/kgBB; 4) Nanopartikel kurkuminoid 100 mg/kgBB; 5) Nanopartikel kurkuminoid 1500 mg/kgBB; 6) Ekstrak kurkuminoid 100 mg/kgBB; 7) Vitamin C 36 mg/kgBB; 8) Standar kurkuminoid 20 mg/kgBB; 9) Nanopartikel placebo. Keterangan: Angka-angka pada grafik yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji Duncan).
4
Aktivitas peroksidase (mU/mL)
3.5
3.25+0.35a
3
2.5
2.44+0.05a 2.42+0.46a 2.18+0.35a 1.95+1.12a
2.55+0.58a
2.33+1.33a
2
2.22+0.34a 2.02+0.68a
1.5 1 0.5 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9
Kelompok
Gambar 7 Aktivitas enzim peroksidase hati tikus Sprague-Dawley Betina 1) Normal; 2) CCl4; 3) Nanopartikel kurkuminoid 50 mg/kgBB; 4) Nanopartikel kurkuminoid 100 mg/kgBB; 5) Nanopartikel kurkuminoid 1500 mg/kgBB; 6) Ekstrak kurkuminoid 100 mg/kgBB; 7) Vitamin C 36 mg/kgBB; 8) Standar kurkuminoid 20 mg/kgBB; 9) Nanopartikel placebo. Keterangan: Angka-angka pada grafik yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji Duncan).
11 Pembahasan Karakterisasi Nanopartikel Kurkuminoid tersalut Lemak Padat Penyalut yang digunakan dalam pembuatan nanopartikel kurkuminoid adalah asam palmitat. Penggunaan asam palmitat ini mengacu pada pembuatan nanopartikel kurkuminoid yang telah dilakukan oleh Mujib (2011). Selain itu, asam palmitat merupakan asam lemak yang meningkat bioavailabilitasnya pada mencit (Xie 2011). Perbandingan penggunaan antara kurkuminoid dengan asam palmitat adalah 1 : 0.1 dengan volume 100 mL. Formula yang dihasilkan berupa emulsi dengan warna kuning cerah dan homogen (Gambar 1). Emulsi nanopartikel kurkuminoid yang telah dihasilkan selanjutnya diultrasonikasi pada amplitudo 20% selama 1 jam. Metode ultrasonikasi ini bertujuan memecah partikel dalam emulsi menjadi partikel yang lebih kecil sehingga menghasilkan ukuran partikel yang seragam (Mujib 2011). Keseragaman ukuran partikel berkaitan erat dengan dengan penyerapan nanopartikel di dalam tubuh. Kecilnya ukuran partikel akan meningkatkan luas permukaaan yang menyebabkan kelarutan tinggi. Tingginya kelarutan memudahkan partikel tersebut untuk diserap ke dalam tubuh (Awad et al. 2008). Ukuran partikel nanopartikel kurkuminoid ditentukan dari alat Particle Size Analyzer dengan metode photon correlation spectroscopy (PCS). Tabel 1 memperlihatkan ukuran partikel nanopartikel kurkuminoid yang kecil yaitu 141.85+38.82 nm, ukuran tersebut masuk dalam rentang ukuran partikel nanopartikel lemak padat yang baik yaitu 50-1000 nm (Ristanti 2008). Nilai indeks polidipersitas (IP) nanopartikel kurkuminoid adalah 0.233+0.06. Indeks polidipersitas adalah parameter yang menyatakan distribusi ukuran partikel dari sistem nanopartikel, bila nilai IP kurang dari 0.3 maka ukuran partikel memiliki distribusi yang sempit (Mujib 2011). IP nanopartikel kurkuminoid memiliki nilai yang kurang dari 0.3 (Tabel 1), hal tersebut menunjukkan distribusi ukuran partikel yang sempit dan mengindikasikan proses pembuatan nanopartikel telah berhasil. Efisiensi penjerapan merupakan parameter penting dalam karakterisasi nanopartikel tersalut lemak padat. Metode efisiensi penjerapan yang digunakan adalah metode langsung, yaitu dengan mengekstraksi kurkuminoid yang terjerap dalam matriks lemak menggunakan metanol setelah lemak padat dipisahkan dari medium pendispersi dengan sentrifugasi. Kemudian konsentrasinya ditetapkan dengan spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang maksimum 425 nm menggunakan persamaan regresi linear dari kurva kalibrasi kurkuminoid standar (Lampiran 2). Efisiensi terjerap didefinisikan sebagai persentase kurkuminoid yang terjerap ke dalam lemak padat dibandingkan dengan total kurkuminoid yang ditambahkan. Presentase efisiensi penjerapan kurkuminoid pada nanopartikel lemak padat diperoleh sebesar 70.96+9.30% (Tabel 2). Hal tersebut sesuai dengan harapan bagi sistem penghantaran obat yang baik yaitu diatas 60% (Konatham et al. 2010). Nilai efisiensi penjerapan bergantung pada seberapa besar zat aktif yang ditambahkan pada saat pembuatan nanopartikel lemak padat, karena merupakan perbandingan jumlah zat aktif yang terjerap dengan yang ditambahkan (Mujib 2011). EP juga dipengaruhi oleh kelarutan zat aktif dalam lemak cair (Parhi dan Suresh 2010).
12 Bobot Badan dan Kondisi Hewan Coba Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus varietas Rattus norvegicus galur Sprague Dawley betina sebanyak 27 ekor berumur delapan minggu dengan bobot badan 153.1644+11.23 g. Tikus dikandangkan pada kandang Rodentia Laboratorium Pusat Studi Satwa Primata. Penggunaan tikus Sprague Dawley sebagai hewan coba dalam penelitian ini, karena tikus ini banyak digunakan dalam penelitian mengenai imunitas. Selain itu, tikus ini tidak dapat muntah sehingga lebih mudah dalam melakukan pencekokan. Pengandangan tikus dibagi secara berkelompok. Hewan coba dikandangkan dengan kandang khusus yang terbuat dari plastik yang beralaskan beeding. Penerangan kandang diatur secara otomatis pada kondisi 12 jam terang dan 12 jam gelap dengan suhu ruangan 230C. Sebelum memulai perlakuan, tikus diadaptasi selama satu minggu. Adaptasi bertujuan menghindari resiko timbulnya stres selama proses transportasi serta menyeragamkan pola makan ataupun pola hidup dengan lingkungan baru. Selama adaptasi hewan coba diberikan pakan standar sebanyak + 20 g. Pemberian pakan ini sudah sesuai dengan angka kebutuhan konsumsi pakan tikus per hari (Puspawati 2009). Penentuan banyaknya sisa pakan dilakukan dengan cara scoring. Berdasarkan data pengamatan bobot badan hewan coba, keseluruhan hewan coba pada setiap perlakuan mengalami kenaikan bobot badan sebesar 8.21% (Tabel 3). Hal tersebut menunjukkan bahwa pemberian sediaan nanopartikel kurkuminoid tidak mengakibatkan penurunan bobot badan hewan coba, sebaliknya meningkatkan bobot badan. Hal ini sesuai dengan penelitian Puspawati (2009) yang menyatakan bahwa pemberiaan sediaan antioksidan pada hewan coba tidak memberikan efek negatif maupun penurunan bobot badan hewan coba, tetapi memberikan efek kenaikan bobot badan hewan coba. Selain itu, kenaikan bobot badan ini dipengaruhi oleh tingkat konsumsi pakan dan umur tikus yang berada dalam masa pertumbuhan (mature point), yaitu kurang dari 6 bulan. Umur tikus yang digunakan pada awal adaptasi adalah ±2 bulan. Kondisi ini menunjukkan tikus dalam keadaan sehat, tidak ada gangguan pertumbuhan, dan kalorinya tercukupi (Lu 2006). Perlakuan hewan coba kemudian dilanjutkan dengan induksi atau cekok karbon tetraklorida. Karbon tetraklorida (CCl4) merupakan sumber radikal bebas eksogen yang dapat menyebabkan stres oksidatif (Simanjuntak 2007). Simanjuntak (2007) menyatakan bahwa, apabila tubuh terpapar CCl4 dapat menyebabkan kerusakan hati. Penelitian lain menyebutkan bahwa CCl4 merupakan penyebab kerusakan hati yang ditandai dengan peradangan akut pada sel-sel hati, yakni terjadinya nekrosis yang ditandai pustula pada hati (Shanmugasundaram dan Venkataraman 2006). Pernyataan ini sesuai dengan pengamatan kondisi hati tikus yang diinduksi dengan CCl4 yang menunjukan abnormalitas berupa pustula, sedangkan hati tikus kelompok normal (tidak diinduksi CCl4) tidak menunjukkan ketidaknormalan (Gambar 2). Induksi CCl4 dilakukan pada hari ke-3. Kelompok tikus yang diinduksi dengan CCl4 mengalamai penurunan bobot badan pada penimbangan bobot badan di hari ke-4 dari 187.60 g menjadi 186.37 g (Tabel 2). Jeon et al (2003) menyatakan bahwa pemberian CCl4 mengacaukan proses oksidasi dan
13 menurunkan bobot badan. Hal ini menunjukkan adanya pengaruh pemberian CCl4 terhadap bobot badan tikus. Secara fisik semua tikus tetap memiliki mata merah yang jernih, bulu putih, tidak rontok, serta feses padat dan hitam (Gambar 3). Warna feses normal mengindikasikan nanopartikel kurkuminoid dapat terserap dengan baik oleh tikus karena warna feses tidak berubah menjadi kuning (warna kurkumin). Selain pengamatan feses, pada tingkah laku tikus tidak ditemukan adanya kelainan, selama pengamatan tidak ditemukan adanya tikus yang gelisah dan hiperaktif. Kadar MDA pada Hati Tikus Keadaan stres oksidatif terjadi bila jumlah radikal bebas dalam tubuh lebih tinggi dari jumlah sistem antioksidan. Stres oksidatif yang ditimbulkan oleh radikal bebas tersebut dapat ditentukan dengan mengukur salah satu parameter berupa kadar malondialdehida (MDA). Bila kadar MDA tinggi, maka dapat dipastikan sel mengalami stres oksidatif (Valko 2006). Sehingga kadar MDA merupakan indeks parameter tidak langsung terjadinya stres oksidatif. Sumber radikal bebas yang dihasilkan dari luar yang dapat menimbulkan stres oksidatif adalah karbon tetraklorida (CCl4). Pengukuran kadar MDA pada penelitian ini menggunakan metode tiobarbiturat (TBA). Prinsip pengukuran MDA adalah reaksi satu molekul dengan dua molekul TBA yang membentuk kompleks MDA-TBA yang berwarna merah muda sehingga dapat dikuantifikasi melalui spektrofotometri pada panjang gelombang 532 nm (Yagi 1998). Alasan penggunaan metode ini adalah metode TBA mempunyai tingkat kepekaan yang tinggi pada radikal bebas dan mudah diaplikasikan. MDA adalah produk peroksidasi lipid dan kadarnya dapat ditekan oleh keberadaan senyawa-senyawa antioksidan (Prangdimurti et al. 2006). Dengan kata lain, kadar MDA yang rendah menunjukkan adanya penghambatan terhadap oksidasi lipid oleh antioksidan (Simanjuntak 2007). Gambar 4 menunjukkan bahwa pemberian CCl4 sebagai agen radikal eksogen dapat meningkatkan kadar MDA jika dibandingkan dengan perlakuan pemberian nanopartikel kurkuminoid, walaupun masih lebih tinggi jika dibandingkan dengan kelompok normal. Hal ini sesuai dengan teori yang menyatakan bahwa CCl4 dapat meningkatkan peroksidasi hati yang mengakibatkan kenaikan kadar MDA (Simanjuntak 2007). Pemberian nanopartikel dosis 50 mg/kgBB, 100 mg/kgBB, dan 1500 mg/kgBB serta ekstrak kurkuminoid 100 mg/kgBB menurunkan kadar MDA dengan kadar MDA yang hampir sama. Sehingga dapat diketahui bahwa pemberian nanopartikel kurkuminoid memiliki efek yang sama dengan pemberian ekstrak kurkuminoid. Menurunnya kadar MDA pada tikus dikarenakan karena kurkuminoid merupakan senyawa fenolik yang akan mendonorkan elektron kepada senyawa radikal yang dihasilkan oleh senyawa CCl4, sehingga akan menurunkan oksidasi lipid yang secara langsung akan menurunkan kadar MDA sebagai produk akhir proses tersebut (Puspawati 2009). Pemberian nanopartikel placebo yang terdiri dari asam palmitat dan air reverse osmosis pada tikus menunjukkan kadar MDA yang lebih rendah jika dibandingkan dengan kelompok normal, tetapi masih lebih tinggi jika dibandingkan pemberian nanopartikel dan ekstrak kurkuminoid. Hal ini membuktikan pemberian nanopartikel placebo tidak toksik, karena asam palmitat
14 yang merupakan bahan pokok pembuatan nanopartikel placebo merupakan produk normal dari sistem asam lemak dalam sel hewan dan berfungsi sebagai prekursor asam lemak rantai panjang lainnya dan dua asam lemak tidak jenuh (, yaitu asam palmitoleat dan asam oleat (Lehninger 1982). Berdasarkan pengukuran diketahui bahwa pemberian vitamin C yang diketahui sebagai antioksidan eksogen tidak dapat menghambat peroksidasi lipid, hal itu dapat terlihat dari meningkatnya kadar MDA pada perlakuan tersebut. Sehingga dapat dikatakan vitamin C 36 mg/kgBB tidak lebih baik sebagai antioksidan jika dibandingkan kelompok pemberian nanopartikel kurkuminoid, padahal dosis vitamin C yang digunakan berdasarkan dosis toleransi perut manusia dalam keadaan normal sebesar 400 mg (Pauling dalam Fonorow 2008) yang dikonversikan pada dosis tikus yaitu sebesar 36 mg/KgBB. Peristiwa ini diduga disebabkan penyerapan senyawa vitamin C dalam tubuh tikus tidak optimal karena sifat senyawanya mudah larut dalam air sehingga mudah dikeluarkan dari dalam tubuh melalui urin (Almatsier 2004). Secara statistik baik kelompok CCl4 maupun kelompok perlakuan pemberian nanopartikel tidak memiliki perbedaan yang nyata (p<0.05). Sehingga dapat dikatakan, pemberian nanopartikel kurkuminoid belum maksimal sebagai antioksidan. Aktivitas Superoksida Dismutase pada Hati Tikus Pengukuran status antioksidan secara in vivo selanjutnya adalah aktivitas superoksida dismutase. Enzim SOD merupakan enzim antioksidan endogen yang mempunyai peranan penting secara langsung melindungi sel dari gangguan radikal bebas, dan secara tidak langsung memelihara keseimbangan oksigen yang bersifat toksik (Wresdiyati et al. 2002). Pengukuran kandungan enzim antioksidan SOD merupakan cara untuk mengetahui kondisi pertahanan sel terhadap radikal bebas. Prinsip dasar pengukuran superoksida dismutase (SOD) adalah reaksi antara O2*-(radikal superoksida dengan Blue tetrazolium (NBT) sehingga membentuk formazan biru ungu. SOD yang berada dalam plasma berlomba dengan NBT untuk bereaksi dengan O2 *- sehingga menghambat pembentukan warna. Aktivitas SOD ini diukur melalui derajat penghambatan (inhibisi) pembentukan warna (Widowati et al. 2005). Semakin banyak jumlah enzim SOD dalam sampel maka warna yang terbentuk pun semakin tidak pekat. Kelompok perlakuan CCl4 memperlihatkan aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan kelompok normal, tetapi masih lebih rendah jika aktivitasnya dibandingkan kelompok nanopartikel kurkuminoid 100 mg/kgBB dan nanopartikel kurkuminoid 1500 mg/kgBB. Hal ini sesuai dengan karena induksi CCl4 akan menurunkan aktivitas enzim antioksidan (Jeon 2003). Hasil pengukuran menunjukkan bahwa nanopartikel kurkuminoid dosis 50 mg/kgBB, 100 mg/kgBB, dan 1500 mg/kg BB, ekstrak kurkuminoid, vitamin C, dan standar kurkuminoid dapat meningkatkan aktivitas enzim superoksida dismutase dibandingkan dengan kelompok normal (Gambar 5). Dengan kata lain, dapat dinyatakan bahwa pemberian perlakuan sudah efektif sebagai antioksidan. Hal ini sesuai dengan pernyataan Yuan et al. (2009), bahwa senyawa antioksidan bekerja secara sinergis dengan enzim SOD dalam menetralkan radikal bebas, sehingga aktivitas enzim SOD menjadi tinggi. Secara statistik, hanya kelompok pemberian nanopartikel kurkuminoid dosis 1500 mg/kgBB yang menunjukkan
15 hasil berbeda nyata dengan kelompok normal. Artinya, pemberian nanopartikel kurkuminoid dosis 1500 mg/kgBB dapat meningkatkan aktivitas SOD. Aktivitas Glutation Peroksidase pada Hati Tikus Selanjutnya, penelitian ini menganalisis aktivitas antioksidan glutation peroksidase (GPx) yang terdapat di dalam hati tikus sebagai gambaran pengaruh pemberian nanopartikel kurkuminoid temulawak terhadap aktivitas antioksidan GPx. Enzim glutation peroksidase merupakan enzim yang mengatalisis reduksi H2O2 dan lemak peroksida (LOOH) dengan menggunakan glutation tereduksi (GSH) sebagai kofaktor (Nabet 1996). Prinsip pengukuran enzim ini adalah glutation peroksidase mengatalisis glutation tereduksi (GSH) menjadi glutation teroksidasi (GSSG). GSSG yang dihasilkan direduksi menjadi GSH dengan bantuan NADPH oleh glutation reduktase. Hasil analisis menunjukkan aktivitas GPx perlakuan CCl4 lebih tinggi dibandingkan kelompok normal, tetapi masih lebih rendah jika dibandingkan dengan ketiga perlakuan pemberian nanopartikel kurkuminoid. Glutation peroksidase yang rendah berkorelasi dengan gangguan yang berhubungan dengan radikal bebas (Judge et al. 2005). Kelompok normal memiliki aktivitas GPx yang terendah sebesar 89.7436 mU/mL, sedangkan aktivitas tertinggi ditunjukkan oleh perlakuan pemberian nanopartikel kurkuminoid dosis 100 mg/kgBB. Pemberian nanopartikel kurkuminoid dosis bertingkat dapat meningkatkan aktivitas glutation peroksidase secara berbeda nyata (p<0.05). Peningkatan aktivitas glutation peroksidase disebabkan terjadinya peroksidasi lipid membran mitokondria (Meister 1995). Peningkatan aktivitas glutation peroksidase ini dimungkinkan karena kurkuminoid menetralkan radikal bebas. Secara statistik, pemberian nanopartikel kurkuminoid dosis 50 mg/kgBB dan 1500 mg/kgBB sebanding dengan kelompok CCl4, sehingga mengindikasikan bahwa pemberian naopartikel dosis 50 mg dan 1500 mg belum efektif sebagai antioksidan. Sedangkan pemberian nanopartikel dosis 100 mg menunjukkan hasil meningkatkan aktivitas glutation peroksidase yang berbeda nyata dengan kelompok kontrol dan CCl4. Hal tersebut karena pemberian senyawa antioksidan akan menurunkan peroksidasi lipid yang secara tidak langsung akan meningkatkan aktivitas GPx sebagai enzim penetralisirnya. Aktivitas Peroksidase pada Hati Tikus Pengukuran status antioksidan yang terakhir adalah aktivitas enzim peroksidase. Peroksidase adalah kelas enzim golongan oksireduktase yang mengkatalisis H2O2 yang bersifat toksik menjadi H2O yang netral dengan adanya substrat yang bertindak sebagai donor hidrogen sehingga sel hidup tidak mengalami kerusakan (Hiner et al. 2002). Enzim peroksidase merupakan kelompok enzim mengaitkan hubungan dengan aktivitas katalase sebagai enzim yang secara endogen yang diproduksi tubuh. Pemberian CCl4 dapat menurunkan aktivitas peroksidase dibandingkan kelompok normal (Gambar 7). Menurut Jeon (2003), pemberian CCl4 dapat menurunkan aktivitas antioksidan. Pemberian nanopartikel dosis 50 mg/kgBB dan 1500 mg/kgBB dapat meningkatkan aktivitas peroksidase dibanadingkan kelompok normal. Hal yang dapat terlihat adalah bahwa pemberian nanopartikel kurkuminoid dapat meningkatkan aktivitas peroksidase, walaupun secara statistik tidak berbeda
16 nyata. Pengamatan aktivitas antioksidan dengan parameter enzim peroksidase masih belum bisa dilakukan observasi lebih lanjut karena mekanisme kelompok enzim tersebut dalam penangkalan radikal bebas masih belum diketahui secara pasti Aktivitas antioksidatif Nanopartikel Kurkuminoid Berdasarkan keseluruhan pengukuran dapat teramati bahwa pemberian CCl4 dapat meningkatkan kadar MDA dan menurunkan aktivitas peroksidase, superoksida dismutase serta glutation peroksidase. Pemberian nanopartikel kurkuminoid dapat meningkatkan aktivitas enzim antioksidan dan menurunkan kadar MDA. Hal ini dikarenakan CCl4 dapat meningkatkan kadar MDA yang keberadaannya dapat dinetralisir oleh enzim antioksidan. Hal tersebut sesuai dengan hipotesis yang sebelumnya dikemukakan bahwa pembentukan nanopartikel kurkuminoid dapat meningkatkan bioavabilitas dibandingkan dengan ekstrak kurkuminoid. Selain itu, diketahui bahwa perlakuan terbaik dalam menekan keadaan stres oksidatif adalah pemberian nanopartikel pada aktivitas superoksida dismutase, karena nanopartikel memberikan aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan kelompok normal dan hampir sama dengan pemberian ekstrak kurkuminoid. Penggunaan nanopartikel dosis 100 mg/kgBB dan 1500 mg/kgBB memberikan efek yang relatif sama atau lebih tinggi dengan standar kurkuminoid. Nanopartikel kurkuminoid mengandung bahan aktif lebih kecil yaitu 0.3 mg dan 0.02 mg, sedangkan standar kurkumin mengandung bahan aktif sebesar 1.6 mg (pada dosis 20 mg), sehingga pembuatan kurkuminoid lemak padat lebih ekonomis dibandingkan dengan penggunaan standar kurkumin karena mengandung bahan aktif yang lebih sedikit, tetapi memberikan efek yang sama atau lebih tinggi.
Gambar 8 Mekanisme kerja enzim antikosidan
17
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Karakterisasi nanopartikel kurkuminoid tersalut lemak padat diperoleh hasil rata-rata ukuran partikel 141.85+38.82 nm, distribusi ukuran partikel yang sempit sebesar 0.233 serta efisiensi penjerapan mencapai 70.96%. Nanopartikel kurkuminoid temulawak asal Balittro baik sebagai antioksidan. Saran Perlu dilakukan tahapan lebih lanjut penentuan dosis efektif nanopartikel kurkuminoid tersalut lemak padat khususnya pada enzim superoksida dismutase.
DAFTAR PUSTAKA Almatsier S. 2004. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Awad T, Helgason T, Kristbergsson K, Decker EA, Weiss J, McClements DJ. 2008. Solid lipid nanoparticles as delivery systems for bioactive food components. Food Biophysic.(3):146–154. BPOM RI. 2005. Lampiran Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan RI Nomor :HK.00.05.4.1380 [internet]. [diacu 2013 Desember 12]. Tersedia dari: http: // www2. pom. go. id/ public/ hukum_ perundangan/ pdf/ SK%20CPOTB(1). pdf Biovision. 2013. Glutathione peroxidase activity colorimetric assay kit [internet]. [diacu 2013 Desember 11]. Tersedia dari: http: //www. biovision. com/ manuals/K762.pdf Biovision. 2013. Lipid peroxidation (mda) colorimetric/fluorometric assay kit [internet]. [diacu 2013 Desember 11]. Tersedia dari: http: //www. biovision.com/manuals/K739.pdf?osCsid=p3pondekgluik5i0v2d05ufb74. Biovision. 2013. Peroxidase activity colorimetric/fluorometric assay kit [internet]. [diacu 2013 Desember 11]. Tersedia dari: http: //www. biovision.com/manuals/K772.pdf?osCsid=h1ece063787ju120g3scfvfc05. Biovision. 2011. Superoxide Dismutase (SOD) Activity Assay Kit [internet]. [diacu 2013 Desember 11]. Tersedia dari: http: //www. biovision.com/manuals/K335.pdf?osCsid=rpvapthbcklvf08m7p152jhsv0. Fonorow O. 2008. Pauling Therapy Handbook. Boston: Lulu Press. 256 hlm. Hiner et al. 2002. Mechanism of compound information in heme peroxidases. J Inorgan Biochem. (91): 27-33. Jeon TI, Hwang SG, Park NG, Shin SI, Choi SD, Park DK. 2003. Antioxidative effect of chitosan on chronic carbon tetrachloride induced hepatic injury in rats. Toxicol. (1): 67-73. Judge S, Mok Jang Y, Smith A, Hagen T, dan Leeuwenburg C. 2005. Ageassociated increases in oxidative stress and antioxidant enzyme activities
18 in cardiac interfibrillar mitochondria: implication for the mitochondrial theory of aging. University of Florida. Faseb J. (3):419-421. Kamble VA, Jagdale DM, Kadan VJ. 2010. Solid lipid nanoparticles as drug delivery system. Int J Pharm BioSci. (1) :1–9. Konatham S. 2010. Liposomal delivery of curcumin to liver. Turk J. Pharm Sci. 7(2): 89-98. Lehninger. 1982. Dasar-dasar Biokimia: Jilid 2. Jakarta: Erlangga. 386 hlm. Liang OB, Widjaya Y, Asparton Y, Puspa S. 1985. Beberapa aspek isolasi, identifikasi, dan penggunaan komponen-komponen Curcuma xanthorriza Roxb. dan Curcuma domestika Val. Prosiding Symposium Nasional Temulawak. Bandung: Lembaga Penelitian Universitas Padjajaran. Lu F. 2002. Toksikologi Dasar: Asas, Organ sasaran, dan Penilaian Risiko. Nugroho, penerjemah. Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Toxicology, fundamentals, target organs, and risk assesment. 392 hlm. Malsch N. 2005. Biomedical Nanotechnology. USA: T&F Group. 161 hlm. Mattjik AA, Sumertajaya IM. 2002. Perancangan percobaan jilid 1 edisi ke-2 dengan aplikasi SAS dan MINITAB. Bogor: IPB Press. 276 hlm. Meister A. 1995. Mitochondrial changes associated with glutathione deficiency. Biochem Biophys Acta. (1): 35-42. Mujib MA. 2011. Pencirian nanopartikel kurkuminoid tersalut lemak padat [tesis]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Nabet F B. 1996. Zat gizi antioksidan penangkal senyawa radikal pangan dalam sistem biologis. Dalam Zakaria F R, R Dewanti, S Yasni (eds.). Prosiding Seminar Senyawa Radikal dan Sistem pangan: Reaksi Biomolekuler, Dampak terhadap Kesehatan dan Penangkalan, hal. 8-15. Kerjasama PAU IPB dengan Kedutaan Perancis, Jakarta. Pan M H, Huang T M, Lin JK. 1999. Biotransformation of curcumin through reduction and glucuronidation in mice. Drug Metab.Dispos. 27(4): 486– 94. Pang X, Cui F, Tian J, Chen J, Zhou J, Zhou W. 2009. Preparation and characterization of magnetic solid lipid nanoparticles loaded with ibuprofen. Asian J Pharm Sci. (4): 132–137. Parhi R, Suresh P. 2010. Production of solid lipid nanoparticles-drug loading and release mechanism. J Chem Pharm. 2 (1): 211-227. Puspawati G. 2009. Kajian aktivitas proliferasi limfosit dan kapasitas antioksidan Sorgum (Sorghum bicolor L Moench) dan Jewawut (Pennisetum sp) pada Tikus Sprague Dawley [tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Prangdimurti E, Muchtadi D, Astawan M, Zakaria FR. 2006. Aktivitas antioksidan ekstrak daun suji. J Teknol Indust Pangan. 17(2) : 79-88. Ravindranath V, Chandrasekhara N. 1980. Absorption and tissue distribution of curcumin in rats. Toxicol. (16): 59– 65. Ravindranath V, Chandrasekhara N. 1981. Metabolism of curcumin––studies with [3H] curcumin. Toxicol. (22): 37–44. Ristanti E. 2008. Potensi lemak dan minyak dari tanaman perkebunan sebagai bahan baku material pembawa dalam sistem penghantaran obat. J Indust Hasil Perkebunan. (3): 63-64.
19 Shoba G, Joy D, Joseph T, Majeed M, Rajendran R, Srinivas PS. 1998. Influence of piperine on the pharmacokinetics of curcumin in animals and human volunteers. Planta Med. 64(4): 353–6. Sidik, Mulyono MW, Mutadi A. 1995. Temulawak (Curcuma xanthorriza Roxb). Jakarta: Phyto Medika. 105 hlm. Simanjuntak K. 2007. Radikal bebas dari senyawa toksik karbon tetraklorida (CCl4). Bina Widya. 8(1): 25-31. Shanmugasundaram P, Venkataraman S. J. 2006. Hepatoprotective and antioxidant effects of Hygrophila auriculata (K. Schum) heine acanthaceae root extract. J Ethnopharmacol. (1): 124-128. Valko M. 2006. Free radical, metal, and antioxidant in oxidative stress induced cancer. J Chem Biol.(160): 1-40. Wahlstrom B, Blennow G. 1978. A study on the fate of curcumin in the rat. Acta Pharmacol Toxicol.(2): 86–92. [WHO] World Health Organization. 2003. Traditional medicine [internet]. [diacu 2012 Desember 27]. Tersedia dari: http: //www. who. int/ mediacentre/ factsheets/fs134/en/. Widowati W, Ratu S, Rymond R, Marlinda S. 2005. Penapisan aktivitas superoksida dismutase pada berbagai tanaman. JKM. (5): 33-48. Wresdiyati T, K Mamba, IKM Adnyane, US Aisyah. 2002. The effect of stress condition on the intracellular antioxidant copper,zinc-superoxide dismutase in the rat kidney: an immunohistochemical study. Hayati. (3):85-88. Xie S Y. 2011. Preparation, characterization and pharmacokinetics of enrofloxacin-loaded solid lipid nanoparticles: Influences of fattyacids. Colloid Surfaces Biointerf. 83(2): 382-387. Yadav V, Vinay P, Sarasija S, Yadav S. 2008. Curcumin Loaded Palmitic Acid Microparticles. InPharm Communique. (1) : 15–18. Yagi K. 1998.Simple assay for the level of total lipid peroxides in serum or plasma. Methods Mol Biol. (108): 101-106. Yuan C, Huang L, Cheng Y. Bu, Liu F, Yi Z, Yang, & Song. 2009. Evaluation of antioxidant and immune activity of Phellinus ribis glucan in mice. Food Chem. (115) : 581– 584.
20 Lampiran 1 Diagram Alir Penelitian Ekstrak kurkuminoid
Nanopartikel kurkuminoid tersalut lemak padat
Pengukuran ukuran partikel dengan PSA
Pengukuran Efesiensi Penjerapan
Rancangan percobaan pengukuran status antioksidan in vivo
Perlakuan stress oksidatif
Pengambilan sampel hati tikus tiap kelompok
Pengukuran kadar malondialdehida dan enzim antioksidan
Kadar Malondialdehida
Aktivitas Peroksidase
Aktivitas Superoksida Dismutase
Analisis Data
Aktivitas glutation peroksidase
21 Lampiran 2 Penentuan efisiensi penjerapan
Absorbansi
a) Kurva penentuan panjang gelombang maksimum (λmaks) 1.63 1.625 1.62 1.615 1.61 1.605 1.6 1.595 1.59 1.585 1.58 418
420
422
424
426
428
430
432
Panjang gelombang (nm)
Absorbansi
b) Kurva Kalibrasi Kurkuminoid 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
y = 6.000x + 0.011 R² = 0.995
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
Konsentrasi Kurkuminoid Terjerap (mg/mL)
c) Cara perhitungan efisiensi penjerapan Konsentrasi kurkuminoid terjerap (Pengenceran 10x) =
Absorbansi Kurkumin Terjerap-0.011
0.502 −0.011
6
×Faktor pengenceran
= × 10 6 =0.0818 mgmL-1 Konsentrasi kurkuminoid yang ditambahkan = 10 mg dalam 10 mL emulsi 10 mg = 10 ml =1 mgmL-1 Efisiensi penjerapan (%) Konsentrasi Kurkuminoid Terjerap = Konsentrasi Kurkuminoid yang Ditambahkan × 100% =
0.0818 mgmL −1 1 mgmL −1
= 81.8%
× 100%
22 Lampiran 3 Hasil analisis ukuran partikel sampel 1 a) Ukuran partikel berdasarkan distribusi jumlah
23 Lampiran 4 Pengukuran kadar MDA a) Kurva standar MDA 1.6 1.4 Absorbansi
1.2 y = 0.068x + 0.080 R² = 0.994
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
5
10
15
20
25
Ratarata
Standar Deviasi
5.3072
0.2397
4.5556
3.5204
4.3233
1.1235
4.2374
0.3635
4.4580
0.2014
4.2608
0.1353
5.9768
3.0173
4.5927
1.6135
3.5034
0.7133
MDA (nmol)
b) Data pengukuran kadar MDA Kelompok Normal
Kontrol (-) CCl4
Nanopartikel kurkuminoid 50 mg/kgBB Nanopartikel kurkuminoid 100 mg/kgBB Nanopartikel kurkuminoid 1500 mg/kgBB Ekstrak kurkuminoid temulawak Kontrol (+) Vitamin C 36 mg/kgBB Standar kurkuminoid 100 mg/kgBB Nanopartikel kosong
0.977 1.032 0.952 0.617 1.543
13.1215 13.9268 12.7555 7.8507 21.4085
[MDA] sebenernya (nmol/mg) 5.2486 5.5707 5.1022 3.1403 8.5634
0.416 1.017
4.9078 13.7072
1.9631 5.4829
0.806 0.634
10.6179 8.0996
4.2471 3.2398
0.733 0.834 0.846 0.871 0.851 0.804 0.795 0.795 0.835 1.655 1.013 0.636 0.984 1.061 0.550 0.575 0.813 0.649
9.5490 11.0278 11.2035 11.5695 11.2767 10.5886 10.4568 10.4568 11.0425 23.0483 13.6486 8.1288 13.2240 14.3514 6.8697 7.2357 10.7204 8.3192
3.8196 4.4111 4.4814 4.6278 4.5107 4.2354 4.1827 4.1827 4.4170 9.2193 5.4594 3.2515 5.2896 5.7406 2.7479 2.8943 4.2881 3.3277
A
[MDA]
24 c) Perhitungan kadar MDA Persamaan garis linear kadar MDA adalah y = 0.068x + 0.080 [MDA] =
Absorbansi-0.080 0.068 0.977-0.080
= 0.068 = 13.1215 nmol Kadar MDA A C(nmol/mg)=( mg ×4) 0.977
= ( 10 ×4) = 5.2486 nmol/mg
25 Lampiran 5 Pengukuran inhibisi superoksida dismutase a) Data pengukuran aktivitas superoksida dismutase Kelompok Normal
Kontrol (-) CCl4 Nanopartikel kurkuminoid 50 mg/kgBB Nanopartikel kurkuminoid 100 mg/kgBB Nanopartikel kurkuminoid 1500 mg/kgBB Ekstrak kurkuminoid temulawak Kontrol (+) Vitamin C 36 mg/kgBB Standar kurkuminoid 100 mg/kgBB Nanopartikel kosong
A
A blanko
A terkoreksi
Inhibisi
% inhibisi
1.424 1.489 1.429 0.656 1.171 0.642 0.546 0.753
1.168 1.168 1.168 0.412 0.930 0.412 0.412 0.412
0.256 0.321 0.261 0.244 0.241 0.230 0.134 0.341
0.4599 0.3228 0.4494 0.4852 0.4916 0.5148 0.7173 0.2806
45.9916 32.2785 44.9367 48.5232 49.1561 51.4768 71.7300 28.0591
0.718
0.412
0.306
0.3544
35.4430
0.565 0.612
0.412 0.412
0.153 0.200
0.6772 0.5781
67.7215 57.8059
0.588
0.412
0.176
0.6287
62.8692
0.494 0.456
0.412 0.412
0.082 0.044
0.8270 0.9072
82.7004 90.7173
0.550
0.412
0.138
0.7089
70.8861
0.797 0.529
0.723 0.412
0.074 0.117
0.8439 0.7532
84.3882 75.3165
0.937 1.215
0.723 1.168
0.214 0.047
0.5485 0.9008
54.8523 90.0844
1.214
1.168
0.046
0.9030
90.2954
0.671
0.412
0.259
0.4536
45.3586
0.859 0.698
0.412 0.412
0.447 0.286
0.0570 0.3966
5.6962 39.6624
0.449
0.412
0.037
0.9219
92.1941
0.618
0.412
0.206
0.5654
56.5401
0.510
0.412
0.098
0.7932
79.3249
0.581
0.412
0.169
0.6435
64.3460
b) Perhitungan aktivitas enzim superoksida dismutase Aterkoreksi = A - Ablanko = 1.424 – 1.168 = 0.256 Akontrol = Ablanko1 – Ablanko2 = 0.534-0.06 = 0.474 % Inhibisi =
Akontrol-Aterkoreksi Akontrol 0.474-0.256
×100%
= ×100%= 0.474 = 45.9916%
Ratarata % inhibisi
Standar Deviasi
41.0689
7.6310
49.7187
1.5551
45.0774
23.3752
62.7989
4.9582
81.4346
9.9760
71.5190
15.1297
75.2461
25.8835
45.8509
43.5797
66.7370
11.5791
26
Absorbansi
Lampiran 6 Pengukuran aktivitas enzim glutation peroksidase a) Kurva standar enzim glutation peroksidase 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
y = 0.013x + 0.203 R² = 0.985
0
20
40
60 80 NADPH (nmol)
100
120
b) Data pengukuran aktivitas enzim glutation peroksidase Kelompok Normal
Kontrol (-) CCl4 Nanopartikel kurkuminoid 50 mg/kgBB Nanopartikel kurkuminoid 100 mg/kgBB Nanopartikel kurkuminoid 1500 mg/kgBB Ekstrak kurkuminoid temulawak Kontrol (+) Vitamin C 36 mg/kgBB Standar kurkuminoid 100 mg/kgBB Nanopartikel kosong
4.0000 0.7692 0.9231 20.3846 52.3846
Aktivitas (mU/mL) 100.0000 76.9231 92.3077 509.6154 5238.4615
89.7436
11.7502
3657.0513
2725.7703
0.882 0.508 0.769
52.2308 23.4615 43.5385
5223.0769 2346.1538 4353.8462
3733.3333
1203.5533
0.798
0.788
45.0000
4500.0000
1.188 1.593
0.697 0.962
0.687 0.952
37.2308 57.6154
3723.0769 5761.5385
5523.0769
1693.4087
2.408
1.274
1.134
1.124
70.8462
7084.6154
1.808
0.707
1.101
1.091
68.3077
1707.6923
2.511
1.657
0.854
0.844
49.3077
4930.7692
3838.4615
1845.4967
2.302
1.455
0.847
0.837
48.7692
4876.9231
1.989 2.174
1.23 1.407
0.759 0.767
0.749 0.757
42.0000 42.6154
1050.0000 4261.5385
2619.2308
1607.0159
2.505 2.408 3.179
1.961 1.267 2.501
0.544 1.141 0.678
0.534 1.131 0.668
25.4615 71.3846 35.7692
2546.1538 1784.6154 3576.9231
4141.0256
2683.3073
2.564
1.433
1.131
1.121
70.6154
7061.5385
3.416 2.478
3.01 1.733
0.406 0.745
0.396 0.735
14.8462 40.9231
371.1538 4092.3077
1713.4615
2065.8063
1.273
0.972
0.301
0.291
6.7692
676.9231
3.562
3.146
0.416
0.406
15.6154
390.3846
1.710
1.264
0.446
0.436
17.9231
1792.3077
973.7179
729.9700
1.403
1.094
0.309
0.299
7.3846
738.4615
A1
A2
∆A
A340
B
3.220 1.539 1.927 2.058 2.695
2.955 1.316 1.702 1.580 1.801
0.265 0.223 0.225 0.478 0.894
0.255 0.213 0.215 0.468 0.884
2.607 2.138 2.162
1.715 1.620 1.383
0.892 0.518 0.779
2.137
1.339
1.885 2.555
Rata-rata Aktivitas
Standar Deviasi
27 c) Perhitungan aktivitas enzim glutation peroksidase ∆A= (A1_sampel – A2_sampel)− (A1_RC – A2_RC) = (3.220-2.955) - (0.180-0.170) = 0.265 A340 = ∆A- (A1_RC – A2_RC) = 0.265-0.01 = 0.255 Persamaan garis linear pengukuran enzim glutation peroksidase adalah y = 0.013x + 0.203; A340 sebagai y. sedangkan x sebagai B. 0.255 = 0.013x + 0.203 0.013x = 0.255 – 0.203 x=4 Aktivitas GPx =
B (T2-T1) 4
×Faktor pengenceran
= 5 ×2.5 = 100 mU/mL
28
Absorbansi
Lampiran 7 Pengukuran aktivitas enzim peroksidase a) Kurva standar enzim peroksidase 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
y = 0.229x + 0.024 R² = 0.993
0
1
2
3
4
5
6
H2O2(nmol)
b) Data pengukuran aktivitas enzim peroksidase Kelompok Normal
Kontrol (-) CCl4 Nanopartikel kurkuminoid 50 mg/kgBB
A0
A1
∆A
B
0.310 0.477 0.411 0.336 0.112
0.644 1.130 0.644 0.858 0.266
0.334 0.653 0.233 0.522 0.154
1.3503 2.7403 0.9102 2.1695 0.5660
Aktivitas (mU/mL) 1.8755 3.8060 1.2642 3.0132 0.7861
0.393
0.757
0.364
1.4810
2.0570
0.311 0.214
0.729 0.640
0.418 0.426
1.7163 1.7512
2.3838 2.4322
0.400
0.836
0.436
1.7948
2.4927
Nanopartikel kurkuminoid 100 mg/kgBB
0.205
0.644
0.439
1.8078
2.5109
0.330 0.292
0.719 0.615
0.389 0.323
1.5900 1.3024
2.2083 1.8089
Nanopartikel kurkuminoid 1500 mg/kgBB
0.239 0.202
0.689 0.541
0.450 0.339
1.8558 1.3721
2.5775 1.9057
0.683
1.168
0.485
2.0083
2.7893
0.404
0.749
0.345
1.3983
1.9420
0.270 0.535 0.481 0.251
0.727 1.072 0.918 0.661
0.457 0.537 0.437 0.410
1.8863 2.2349 1.7991 1.6815
2.6198 3.1040 2.4988 2.3354
0.248
0.576
0.328
1.3242
1.8391
0.320 0.450
0.822 1.067
0.502 0.617
2.0824 2.5834
2.8922 3.5881
0.561
1.127
0.566
2.3612
3.2795
0.488 0.243
0.744 0.582
0.256 0.339
1.0105 1.3721
1.4034 1.9057
0.298
0.776
0.478
1.9778
2.7469
Ekstrak kurkuminoid temulawak Kontrol (+) Vitamin C 36 mg/kgBB Standar kurkuminoid 100 mg/kgBB Nanopartikel kosong
Rata-rata Aktivitas
Standar Deviasi
2.3152
1.3267
1.9521
1.1172
2.4363
0.0546
2.1760
0.3521
2.4242
0.4613
2.5553
0.5837
2.2244
0.3435
3.2532
0.3487
2.0187
0.6788
29 c) Perhitungan aktivitas enzim peroksidase ∆A = A1-A0 = 0.644-0.310 = 0.334 Persamaan garis linear kurva standar aktivitas enzim peroksidase adalah y= 0.229x + 0.024 ;∆A sebagai y, sedangkan x sebagai B. 0.334 = 0.229x + 0.024 0.334-0.024 = 0.229x 0.031 x = 0.229 =1.3503 Aktivitas enzim peroksidase B =T×V ×Faktor pengenceran 1.3503
= ×2.5 90×0.02 = 1.8755 mU/mL
30 Lampiran 4 Hasil analisis SPSS Anova Peroksidase
Between Groups Within Groups Total Superoksida Between Groups dismutase Within Groups Total Malondialdehi Between Groups da Within Groups Total Glutation Between Groups peroksidase Within Groups Total
Sum of Squares 2.265 12.418 14.682 5294.202 7326.588 12620.790 11.819 52.241 64.060 5.043E7 6.566E7 1.161E8
df 8 18 26 8 18 26 8 18 26 8 18 26
Mean Square .283 .690
F .410
Sig. .900
661.775 407.033
1.626
.186
1.477 2.902
.509
.834
6303825.343 3647759.983
1.728
.159
Peroksidase Duncana Perlakuan
N
CCl4 Nanopartikel kosong Nanopartikel 100mg/kgBB Vitamin C Normal Nanopartikel 1500 mg/kgBB Nanopartikel 50 mg/kgBB Ekstrak kurkuminoid Standar kurkuminoid Sig.
3 3 3 3 3 3 3 3 3
Subset for alpha = 0.05 1 1.9521 2.0187 2.1760 2.2244 2.3152 2.4242 2.4362 2.5553 3.2532 .062
Superoksida Dismutase Duncana Perlakuan Normal Nanopartikel 50 mg/kgBB Standar kurkuminoid CCl4 Nanopartikel 100 mg/kgBB Nanopartikel kosong Ekstrak kurkuminoid Vitamin C Nanopartikel 1500 mg/kgBB Sig.
N 3 3 3 3 3 3 3 3 3
Subset for alpha = 0.05 1 2 41.0689 45.0774 45.0774 45.8509 45.8509 49.7187 49.7187 62.7989 62.7989 66.7370 66.7370 71.5190 71.5190 75.2461 75.2461 81.4346 .085 .069
31 Malondialdehida (MDA) Duncan
a
Perlakuan
N
Nanopartikel kosong Nanopartikel 100 mg/kgBB Ekstrak kurkuminoid Nanopartikel 50 mg/kgBB Nanopartikel 1500 mg/kgBB CCl4 Standar kurkuminoid Normal Vitamin C Sig.
3 3 3 3 3 3 3 3 3
Subset for alpha = 0.05 1 3.5034 4.2374 4.2608 4.3233 4.4580 4.5556 4.5927 5.3072 5.9767 .138
Glutation Peroksidase Duncana Subset for alpha = 0.05 1 2 3 Normal 3 89.7436 Nanopartikel kosong 3 973.7179 973.7179 Standar kurkuminoid 3 1713.4615 1713.4615 Ekstrak kurkuminoid 3 2619.2308 2619.2308 2619.2308 CCl4 3 3657.0513 3657.0513 Nanopartikel 50 mg/kgBB 3 3733.3333 3733.3333 Nanopartikel 1500 mg/kgBB 3 3838.4615 3838.4615 Vitamin C 3 4141.0257 4141.0257 Nanopartikel 100 mg/kgBB 3 5523.0769 Sig. .134 .075 .098 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000. Perlakuan
N
32
RIWAYAT HIDUP Penulis lahir di Bekasi pada tanggal 26 Februari 1992 sebagai anak ketiga dari empat bersaudara. Putri pasangan Nurdin dan Sarimanah. Penulis menjalani pendidikan dasar di SD Negeri Jatirahayu II pada tahun 1997-2003. Pendidikan menengah dilanjutkan pada tahun 2003-2006 di SMP Negeri 259 Jakarta. Penulis menyelesaikan pendidikan jenjang menengah atas di SMA Negeri 62 Jakarta pada tahun 2009. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan pendidikan di Departemen Biokimia. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA). Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Ujian Saringan Masuk IPB (USMI). Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah tergabung dalam organisasi Community Research and Education In Biochemistry (CREBs) sebagai anggota divisi Human Resource and Development (HRD) pada tahun 2011-2012. Pada tahun 2012 penulis melaksanakan kegiatan praktik lapang di Laboratorium Biologi Molekuler Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) dengan karya ilmiah yang berjudul Analisis Prolin pada Tebu (Saccharum officinarum L.) di Bawah Kondisi Cekaman Kekeringan. Penulis aktif mengikuti kegiatan organisasi internal kampus dan kegiatan kepanitiaan kampus. Selain itu penulis pernah menjadi asisten praktikum Biokimia Umum pada tahun ajaran 2013/2014 dan pengajar di Homeschooling Primagama.
