AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN ANTIINFLAMASI IN VITRO SERTA KANDUNGAN KURKUMINOID DARI TEMULAWAK DAN KUNYIT ASAL WONOGIRI
REZA WISNU KUSUMA
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
ABSTRAK REZA WISNU KUSUMA. Aktivitas Antioksidan dan Antiinflamasi In Vitro Serta Kandungan Kurkuminoid dari Temulawak dan Kunyit Asal Wonogiri. Dibimbing oleh SYAMSUL FALAH dan WARAS NURCHOLIS. Penelitian ini menguji aktivitas antioksidan dan antiinflamasi dari kunyit dan temulawak asal Wonogiri. Senyawa bioaktif yang berperan utama dalam antioksidan dan antiinflamasi adalah kurkuminoid. Hasil penelitian sebelumnya menyebutkan senyawa kurkuminoid terdapat pada temulawak dan kunyit. Pengujian aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH (2,2-difenil-1pikrilhidrazil). Dari hasil pengujian didapatkan potensi antioksidan temulawak Wonogiri lebih tinggi dibandingkan kunyit Wonogiri. Nilai IC50 yang didapatkan sebesar 53.13 ppm untuk temulawak Wonogiri dan sebesar 61.72 ppm untuk kunyit Wonogiri. Aktivitas antiinflamasi dianalisis dengan metode inhibisi enzim COX-2 secara in vitro. Hasil yang diperoleh menunjukkan daya inhibisi terbaik terhadap COX-2 ialah sampel kunyit Wonogiri sebesar 47.45% sedangkan temulawak Wonogiri sebesar 87.19%. Kandungan kurkuminoid pada kunyit dan temulawak diukur menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Dari hasil pengukuran didapatkan kandungan kurkuminoid pada kunyit sebesar 74.57 mg/g dan temulawak sebesar 20.04 mg/g. Kata kunci: kurkuminoid, antioksidan, antiinflamasi, temulawak, kunyit
ABSTRACT REZA WISNU KUSUMA. In Vitro Antioxidant and Anti-inflamantory Activity and Curcuminoid Contents of Curcuma xanthorrhiza RoxB. and Curcuma domestica Val. From Wonogiri. Supervised by SYAMSUL FALAH and WARAS NURCHOLIS. This research examined antioxidant and anti-inflamantory activities of Curcuma xanthorrhiza RoxB. and Curcuma domestica Val. from Wonogiri. The main bioactive compounds functioning as antioxidant and anti-inflamantory are curcuminoid. The previous research reported that curcuminoid compound is present in C. xanthorrhiza RoxB. and C. domestica Val. The antioxidant potency of the sample was detected by DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) method. Results showed that the antioxidant potency of C. xanthorrhiza RoxB. is higher than that of C. domestica Val. from Wonogiri. IC50 value of C. xanthorrhiza RoxB. was 53.13 ppm and C. domestica Val. Was 61.72 ppm. Anti-inflamantory activity was analyzed by in vitro cyclooxygenase 2 (COX2) inhibition method. The best inhibition activity against of COX2 is showed by C. domestica Val. in amount of 47.45% and value of C. xanthorrhiza RoxB is 87.19%. Curcuminoid Content of C. xanthorrhiza RoxB. and C. domestica Val. was measured by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Results showed that curcuminoid content of C. domestica Val. was 74.57 mg/g and C. xanthorrhiza RoxB. was 20.04 mg/g. Key word : Curcuminoid, antioxidant, anti-inflamantory, Curcuma xanthorrhiza RoxB, Curcuma domestica Val.
AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN ANTIINFLAMASI IN VITRO SERTA KANDUNGAN KURKUMINOID DARI TEMULAWAK DAN KUNYIT ASAL WONOGIRI
REZA WISNU KUSUMA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012
Judul Skripsi
:
Nama NRP
: :
Aktivitas Antioksidan dan Antiinflamasi In Vitro serta Kandungan Kurkuminoid dari Temulawak dan Kunyit Asal Wonogiri Reza Wisnu Kusuma G84080060
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si Ketua
Waras Nurcholis, S.Si, M.Si Anggota
Diketahui
Dr. Ir. I Made Artika, M.App. Sc. Ketua Departemen Biokimia
Tanggal lulus :
PRAKATA Puji dan syukur kita panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan rahmat dan kemudahan dalam penyusunan karya ilmiah hasil penelitian ini yang berjudul Aktivitas Antioksidan dan Antiinflamasi Secara In Vitro Serta Kandungan Kurkuminoid Dari Temulawak dan Kunyit Asal Wonogiri. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November 2011 hingga Februari 2012 di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini merupakan bagian dari Kegiatan Penelitian Hibah Kompetitif tingkat Nasional. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si dan Waras Nurcholis, M.Si selaku komisi pembimbing atas segala kesabarannya dalam memberikan bimbingan, arahan serta masukan kepada penulis dalam penyusunan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga dipersembahkan kepada kedua orang tua penulis yaitu Bapak U. Dahlan dan Ibu Yanti Suriaatmadja beserta kakak Vika Dahlianti yang tidak pernah berhenti memberikan dukungan moril maupun materiil sehingga karya ilmiah hasil penelitian ini dapat diselesaikan dengan baik. Penulis juga menyampaikan ucapan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman selaku Kepala Pusat Studi Biofarmaka IPB yang telah mengijinkan penulis melaksanakan kegiatan penelitian di laboratorium PSB, serta seluruh staf laboratorium PSB, khususnya Ibu Nunu, Mbak Wiwik, Mas Endi, dan Pak Zaim. Atas bantuan teknis dan saran yang diberikan selama penelitian. Penulis menyampaikan terima kasih kepada seluruh dosen dan staf Departemen Biokimia IPB atas bantuan dan saran yang telah diberikan. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Nurul Syifa, Ni Luh Putu Eka Kartika Sari, David Akbar, Rizka Arusima, Mas Anggara, Mas Harry dan Mas Anjar atas doa, semangat, dukungan moril ataupun materiil serta segala motivasi untuk selalu berusaha menjadi lebih baik. Semoga karya ilmiah ini dapat memberikan manfaat bagi seluruh pembaca serta dapat menjadi langkah awal penulis untuk berjalan mencapai impiannya.
Bogor, Agustus 2012
Reza Wisnu Kusuma
RIWAYAT HIDUP Reza Wisnu Kusuma merupakan anak kedua dari ayah Ujang Dahlan dan Ibu Yanti Suriaatmadja yang lahir pada 11 Januari 1990. Penulis menyelesaikan pendidikan jenjang menengah atas di SMA Negeri 3 Bogor, Jawa Barat pada tahun 2008. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan pendidikan di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Ujian Saringan Masuk IPB (USMI) Selama mengikuti kegiatan perkuliahan, penulis pada tahun 2010 mendapat kesempatan untuk mengikuti kegiatan PKM-P (Program Kreatifitas Mahasiswa bidang Penelitian) yang didanai oleh Dikti. Pada tahun 2011 penulis melaksanakan kegiatan praktik lapang di Laboratorium Sistematika Molekuler LIPI dengan karya ilmiah yang berjudul Isolasi dan Amplifikasi DNA Untuk Mengkaji Keragaman Populasi Tumbuhan Taka. Penulis aktif mengikuti kegiatan organisai internal kampus dan eksternal kampus. Atas kemampuan organisasi yang baik, penulis pernah menjabat sebagai Ketua Entrepeneur Himpunan Profesi Biokimia IPB CREBs pada tahun 2010. Kegiatan organisasi di luar kampus, penulis aktif di organisasi Pandu Wirausaha dan yayasan Sekolah Bersama Yuk hingga sekarang.
DAFTAR ISI Halaman
DAFTAR TABEL .................................................................................................. ix DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. ix DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................... x PENDAHULUAN .................................................................................................. 1 TINJAUAN PUSTAKA Kunyit (Curcuma domestica Val.) ...................................................................... 1 Temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb) ........................................................ 2 Kurkuminoid ....................................................................................................... 2 Radikal Bebas ...................................................................................................... 3 Senyawa Antioksidan .......................................................................................... 3 Metode 2,2 diphenyl-1-picryl-hydrazil (DPPH) .................................................. 4 Inflamasi .............................................................................................................. 4 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat .................................................................................................... 5 Metode Penelitian ................................................................................................ 5 HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi Sampel ................................................................................................. 7 Kadar Kurkuminoid Ekstrak Rimpang Temulawak dan Kunyit Wonogiri ......... 7 Aktivitas Antioksidan Ekstrak Rimpang Temulawak dan Kunyit Wonogiri ...... 8 Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Rimpang Temulawak dan Kunyit Wonogiri ... 9 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 10 LAMPIRAN .......................................................................................................... 12 SIMPULAN DAN SARAN ………………………………………………........... 9
DAFTAR GAMBAR Halaman
1 Rimpang Kunyit ................................................................................................ 2 2 Rimpang Temulawak ......................................................................................... 2 3 Struktur Kimia Kurkuminoid ............................................................................. 3 4 Format Micro plate Inhibisi COX-2 ................................................................. 6 5 Kadar Kurkuminoid Ekstrak Etanol Temulawak dan Kunyit Wonogiri ............ 8 6 Nilai Absorbansi DPPH oleh sampel Temulawak dan Kunyit .......................... 8 7 Aktivitas Penghambatan Radikal Bebas DPPH pada Temulawak dan Kunyit .. 9 8 Aktivitas Penghambatan COX-2 oleh Temulawak dan Kunyit Wonogiri .......... 9
DAFTAR LAMPIRAN Halaman
1 Diagram alir penelitian..................................................................................... 12 2 Prosedur ekstraksi (BPOM 2005) .................................................................... 13 3 Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH .............................................. 14 4 Preparasi larutan untuk uji inhibisi COX-2...................................................... 15 5 Kadar air ekstrak kunyit dan temulawak Wonogiri ......................................... 16 6 Rendemen hasil ekstraksi ................................................................................. 17 7 Hasil pengukuran kadar kurkuminoid temulawak dengan HPLC.................... 18 8 Hasil pengukuran kadar kurkuminoid kunyit dengan HPLC ........................... 19 9 Data absorban ekstrak temulawak wonogiri .................................................... 21 10 Data absorban ekstrak kunyit wonogiri.......................................................... 22 11 Grafik hubungan % inhibisi dengan konsentrasi sampel ................................. 23 12 Nilai IC50 masing-masing sampel ................................................................... 24 13 Kurva standar uji inhibisi COX-2 .................................................................... 25 14 Data uji daya inhibisi ekstrak rimpang temulawak dan kunyit Wonogiri…….26
PENDAHULUAN Indonesia merupakan Negara agraris terbesar di dunia.Hal ini tentu membuat Indonesia memiliki berbagai tanam-tanaman yang memiliki berbagai potensi, salah satunya sebagai obat.Indonesia yang dikenal sebagai negara dengan megabiodiversitas, memiliki keanekaragaman hayati flora dan fauna yang sangat melimpah.Dari 28.000 jenis tumbuhan yang ditemukan di Indonesia, kurang lebih 7.000 jenis di antaranya adalah tumbuhan obat (Kassahara & Hemmi 1986). Penggunaan tanam-tanaman sebagai obat tradisional ternyata telah lama dikenal oleh masyarakat Indonesia jauh sebelum pelayanan kesehatan menggunakan obat-obatan sintetik.Peningkatan penggunaan obat-obatan tersebut seiring dengan peningkatan kesadaran masyarakat terhadap dampak negatif dari penggunaannya.Masyarakat kembali memilih tanaman obat sebagai alternatif terhadap penyembuhan berbagai penyakit.Selain itu, efek samping yang ditimbulkan juga lebih kecil.Hal tersebut memicu peneliti untuk melakukan penelitian di bidang biofarmaka, yaitu mengenai obat-obatan alami yang berasal dari tumbuhan. Tumbuhan obat adalah kelompok tumbuhan yang umumnya digunakan sebagai obat dan sumber bahan baku obat. Pemanfaatan lain dari tumbuhan obat adalah sebagai bumbu masak, makanan, minuman, kosmetik, dan parfum (Wahid & Sudarno 1993). Tumbuhan obat yang digunakan biasanya dalam bentuk simplisia yang berupa akar, daun, buah, dan biji. Temulawak (Curcuma xanthorriza Roxb.) merupakan salah satu tumbuhan obat suku Zingiberaceae yang banyak tumbuh di Indonesia (Sidik et al 1995). Temulawak diketahui memiliki banyak manfaat antara lain sebagai antihepatitis, antikarsinogenik, antimikroba, antioksidan, antihiperlipidemia, antiviral, antiinflamasi, dan detoksifikasi (WHO 1999). Selain itu, temulawak merupakan sumber bahan pangan, pewarna, bahan baku industri seperti kosmetika, maupun dibuat makanan atau minumansegar (Dalimartha 2000). Kunyit merupakan salah satu tanaman herbal yang dapat menangkal radikal bebas.Kunyit mengandung komponen aktif yang berfungsi sebagai antioksidan.Komponen aktif dalam kunyit yang berperan adalah kurkuminoid.Komponen ini juga terdapat pada beberapa jenis temu-temuan lain seperti temulawak. Kurkuminoid adalah komponen yang memberikan warna kuning yang bersifat
sebagai antioksidan dan berkhasiat antara lain sebagai hipokolesterolemik, kolagogum, koleretik, bakteriostatik dan spasmolitik. Berbagai penelitian telah membuktikan khasiat kurkuminoid dalam pengobatan terutama sebagai antihepatoksik dan antikolesterol, serta obat tumor dan kanker (Nagabhushan & Bhide 1992).Kunyit dan temulawak memiliki potensi sebagai antioksidan dan antiinflamasi.Antioksidan ini berfungsi untuk menghambat terjadinya penyakit degeneratif karena radikal bebas.Potensi antiinflamasi dari kedua sampel tersebut dapat menghambat terjadinya peradangan. Sampel pada penelitian ini berasal dari Wonogiri.Wonogiri merupakan salah satu daerah budidaya kunyit dan temulawak yang berada di Jawa Tengah.Tujuan penelitian ini adalah mendapatkan nilai aktivitas antioksidan dan antiinflamasi terbaik yang ditandai dengan %inhibisi terbesar dan nilai konsentrasi ppm terkecil serta kandungan kurkuminoid dari kedua sampel. Hipotesis penelitian ini adalah kunyit dan temulawak memiliki nilai aktivitas antioksidan dan antiinflamasi yang berbeda walaupun berasal dari daerah yang sama. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi potensi aktivitas antioksidan dan antiinflamasi dari kunyit dan temulawak yang berasal dari Wonogiri. TINJAUAN PUSTAKA Kunyit Indonesia sebagai negara tropis yang dikenal dengan biodiversitas terbesar kedua di dunia, memiliki banyak tanaman yang diketahui secara empiris berkhasiat sebagai obat.Kunyit merupakan salah satu jenis tumbuhan yang secara umum banyak digunakan sebagai obat, baik dalam bentuk tunggal maupun kombinasi campuran. Penggunaan kunyit tidak hanya sebatas sebagai bumbu untuk menambah rasa dan memberi warna, tetapi juga sebagai bahan baku minuman sehat seperti kunyit asam atau kunyit instan. Secara empiris kunyit banyak digunakan sebagai obat mag, penurun kolesterol, diare, nyeri haid, sakit kuning, dan obat luka. Kunyit termasuk tanaman tahunan yang tumbuh merumpun. Susunan tubuh tanaman terdiri atas akar, rimpang, batang semu, pelepah daun, daun, tangkai bunga dan kuntum bunga.Sistem perakaran tanaman kunyit termasuk akar serabut berbentuk benang yang menempel pada
2 rimpang.Kedalaman rim mpang dalam m tanah c panjang akar 22,5 cm m, tebal sekitar 16 cm, rimpang muuda 1,61 cm daan rimpang tuua 4 cm. Tiap rumpuun tanaman kunyit k dapat tumbuh rimpang anttara 7-10 buahh, dan anakann antara 11-15 tanam man(Gambar 1). 1 Tumbuhann kunyit tergolong dalam d kingddom Plantae,, divisi Spermatophhyta, sub diivisi Angiosppermae, kelas Monoocotyledonae, ordo Zingibberales, suku Zingiiberaceae, geenus Curcum ma dan spesies Currcuma xanthorrrhiza Val. Tanaman T kunyit dapaat hidup denggan baik padda suhu yang berkissar antara 200-300C dengann curah hujan 1500-2000 mm/tahuun (Rukmana 2008) m k komponen akktif yang Kunyit mengandung berperan sebbagai antioksiidan. Komponnen aktif dalam kuunyit yang berperan adalah kurkuminoidd.Komponen ini juga terdapat t pada beberaapa jenis temuu-temuan lainn seperti temu lawakk. Kurkuminoid adalah kom mponen yang memberikan warna kuning yang bersifat b anttara lain sebagai antiioksidan dan berkhasiat sebagai hipokolesteroomik, kolaagogum, b spasmolitik,, Kadar koleretik, bakteriostatik, zat antioksiidan dalam reempah- rempah juga diketahui cuukup tinggi. Berbagai peenelitian telah mem mbuktikan khhasiat kurkuuminoid dalam peengobatan terutama sebagai antihepatokssik dan antikkolesterol, serrta obat tumor dan kanker (Naggabhushan & Bhide 1992).Kompponen fenolikk dalam kunyyit dapat menghambaat pertumbuuhan kanker dan mempunyai aktivitas antiimutagenik.Seelain itu mbuhan kunyit jugaa dapat menekan pertum kanker usus, payudara, paaru-paru, dan kulit. k
K Gambar 1 Rimpang Kunyit Temullawak Temulaawak merupaakan tanamann obat berupa tumbbuhan rumpunn berbatang seemu. Di Indonesia teemulawak dikenal dengan berbagai b nama daerahh, misalnya teemulawak (Suumatra), koneng gedde, temu rayaa, temu besar, aci koneng, kooneng tegel, temulawak (Jawa), temulobak (Madura), ( tom mmo (Bali), tommon t (Sulawesi Selatan) S atau Ternate T dengaan nama
karbaga (Dallimartha 20000). Curcuma berasal b dari bahasa arab a kurkum yyang berarti kuning, k sedangkan xanthorriza x berasal dari bahasa b Yunani xantoos yang berarrti kuning dan n rhiza yang berarti akar. Sesuai dengan klassifikasi botani, temullawak termassuk dalam kin ngdom Plantae, divvisi Spermatoophyta, sub divisi Angiospemaee, kelas Monnocotyledonaee, ordo Zingiberales, famili Zinngiberaceae, genus d nama spesies Cu urcuma Curcuma dan xanthorrhiza Roxb. (Rukkmana 2006).Secara alami temulaawak tumbuhh dengan baaik di lahan - lahann yang teduh dan terlindun ng dari sinar matahhari.Di habitaat alami, ru umpun tanaman ini tumbuh t suburr di bawah naaungan pohon bambbu dan jati.M Meskipun dem mikian temulawak juuga dapat tum mbuh di tempaat yang terik, seperti di d tanah tegalaan. Tanaman ini memiliki daya adaptassi yang tinggi terhaddap berbagaii cuaca di daerah beriklim troppis.Suhu udarra yang baik untuk budidaya tanaaman ini antarra 19-30° (Affifah & Tim Lentera 2003).Tanam man ini memeerlukan 0-4.000 curah hujann tahunan aantara 1.500 mm/tahun. Temulawak T dapat tumbu uh di dataran rendaah dan tinggi,, sampai ketin nggian 750 meter di d atas permuukaan laut, bahkan b Sudarman daan Harsono ((1980) meny yatakan bahwa temuulawak dapaat tumbuh hingga h ketinggian 1800 meter ddi atas perm mukaan laut. Denggan perakaraan yang daangkal, temulawak cepat menguruuskan lapisan n tanah atas. Walaaupun temulaawak tidak terlalu memilih jenis tanah untukk tempat hidu upnya, namun temullawak akan ttumbuh sangaat baik pada tanah yang y subur ddan gembur (W Wahid 1985). Temulawaakmerupakan tumbuhan taahunan yang tumbuh tegak dengann tinggi hinggaa lebih dari 1 m tettapi kurang ddari 2 m, berrwarna hijau atau coklat gelap.Akar rim mpang terbentuk deengan sempurrna dan berccabang kuat, berwarrna hijau gelap. Tiap batang b mempunyai daun d 2 -9 heelai dengan bentuk b bundar mem manjang samppai bangun lanset, warna daun hijau h atau cokklat keunguan terang sampai gelapp, panjang daaun 31-84 cm m dan lebar 10-18 cm, panjaang tangkai daun m(Gambar 2). Daun termasuk helaaian 43 -80 cm termasuk tipee daun sempurrna, artinya tersusun dari pelepah daun, tangkkai daun, dan n helai ng dan daun. Perbungaan lateral, ttangkai rampin sisik berbentuuk garis, pannjang tangkai 9 -23 cm dan lebaar 4-6 cm, berdaun peliindung banyak yanng panjangnyya melebihi atau sebanding deengan mahkoota bunga. Kelopak bunga berwaarna putih berrbulu, panjang g 8-13 mm, mahkotaa bunga berbeentuk tabung dengan d
3 panjang kesseluruhan 4.55 cm, helaiann bunga berbentuk bundar b memannjang berwarnna putih dengan ujunng yang berwaarna merah daadu atau merah, panjjang 1.25-2 cm dan lebaar 1 cm (Sidik et al 1995).
bisdemetoksi kurkumin (Afifah 2003). m Kurkumin mempunyai rumus molekul d boboot molekul 368 C21H20O6 dengan g/mol,sedanggkan demetoksikurrkumin mempunyai rumus r molekuul C20H18O5 dengan d bobot molekkul sebesar 3338 g/mol. Rumus R molekul untuuk bisdemetokksikurkumin adalah C19H16O4 denngan bobot m molekul 308 g/mol (Gambar 3).
R1 R2
Gambar 2 Rimpang Temulawak Kurk kuminoid Kurkumiinoid rimpangg kunyit adalaah suatu zat yang terdiri atas campuran c kom mponen d kuurkumin. senyawa kurrkumin dan desmetoksi Kurkuminoiid mempunyaai warna kuniing atau kuning jinggga, berbentukk serbuk denggan rasa sedikit pahhit, larut dalaam aseton, alkohol, a asam asetatt glasial, dann alkali hidrroksida. Kurkumin tiidak larut dalam air dan diietileter. Kurkuminoiid mempunyaai aroma khas, dan tidak bersifaat toksik (Kisoo 1985). Sifat kim mia kurkuminooid (Gambar 3) yang menarik adaalah sifat peruubahan warnaa akibat perubahan pH lingkunggan. Dalam susana asam, kurkkuminoid berrwarna kuninng atau kuning jinggga, sedangkann dalam suasaana basa berwarna merah. m Keunikkan lain terjaadi pada sifat kurkum min dalam suuasana basa, karena selain terjaddi proses disosiasi, pada suasana basa kurkum min dapat mengalami m deegradasi membentuk asa ferulat dan ferulloiilmetan. i terjadi biila kurkumin berada Degradasi ini dalam lingkkungan pH 8,55 – 10,0 dalam m waktu yang relatiff lama, walaaupun hal inni tidak berarti bahhwa dalam waktu yang relatif singkat tidak terjadi degradasi d kuurkumin, karena prosses degradasii sangat dipeengaruhi juga oleh suhu lingkunggan. Salah saatu hasil mpunyai degradasi, yaitu feruloilmetan mem cokklat yang akan warna kuuning mempengaruuhi warna meerah yang sehharusnya terjadi. Sifaat kurkuminoiid lain yang penting adalah aktiivitasnya terhhadap cahayya. Bila kurkumin terkena cahhaya, akan terjadi struktur s siklisasi dekomposisi berupa kurkumin atau terjadi degradasi struktur (Tonnesen & Karsen 19855). Kurkumiinoid memiliki 3 senyawaa, yaitu kurkumin, kurkuminn dan desmetoksii
Keterangan: R1 R2 -OCH3 -OCH3 = kurkum min = demetooksikurkumin -OCH3 -H = bisdem metoksikurkum min -H -H noid Gambarr 3 Struktur kiimia kurkumin (Basnet 20011) Radikal B Bebas Radikal bebas b adalah m molekul yang sangat reaktif karenna memiliki eelektron yang g tidak berpasangan pada orbitall luarnya seh hingga molekul sel tubuh dapat bereakksi dengan m dengan cara mengikat eleektron sel terrsebut, dan menyebbabkan reakksi berantai yang menghasilkann radikal beebas baru. Radikal R bebas dapat bereaksi denngan kompon nen sel baik komponnen struktural (molekul pen nyusun membran) maupun m kom mponen fung gsional yaitu enzim dan d DNA (Widdjaja 1997). Radikal bebas meruupakan atom m atau molekul yanng sifatnya ssangat tidak stabil sehingga untuk u mempperoleh passangan elektron sennyawa ini ssangat reaktif dan merusak jarinngan. Sebenaarnya, radikal bebas mekenisme biokimia b tubuuh normal. Namun, N bila radikal bebas sempaat bertemu dengan d enzim atau lemak tak jjenuh, makaa akan menyebabkann kerusakan awal pada tubuh (Anies 2009). b dapat diibentuk melallui dua Radikal bebas cara, yaitu secara eksoggen dan end dogen. Secara eksoggen radikal bbebas didapaat dari polusi luar melalui m jalan ppernafasan, diigesti / makanan, dan d penyerappan kulit. Secara endogen radikkal bebas diprroduksi secaraa terus menerus paada tubuh manusia sebagai konsekuensi dari d metabolissme normal melalui m sistem transport normal, daan aktivitas ok ksidasi seperti sikllooksigenase. Radikal bebas
4 diproduksi di dalam sel oleh mitokondria, membran plasma, lisosom, peroksisom, retikulum endoplasma, dan inti sel. Beberapa kerusakan yang dapat timbul oleh serangan radikal bebas antara lain kerusakan protein, DNA, peroksidasi lipid, kerusakan membran sel terutama penyusun membran yang berupa asam lemak tidak jenuh yang merupakan bagian dari fosfolipid dan mungkin juga protein, menimbulkan autoimun, dan proses penuaan. Akan tetapi, radikal bebas tidak selalu merugikan. Misalnya, radikal bebas berperan dalam pencegahan penyakit yang disebabkan mikrobia melalui sel-sel khusus yang disebut fagosit (Tuminah& Sulistiyowati 2000). Salah satu target dari serangan radikal bebas dalam sel makhluk hidup adalah lipid dari membran sel, terutama asam-asam lemak tidak jenuh. Reaksi oksidasi lipid terbagi menjadi tiga tahap yaitu inisiasi, propagasi, dan terminasi. Senyawa Antioksidan Secara alamiah tubuh manusia mempunyai pertahanan endogen untuk meredam dampak negatif radikal bebas yaitu berupa senyawa antioksidan. Antioksidan adalah suatu senyawa yang dapat menetralkan dan melawan zat toksik (radikal bebas) dan menghambat terjadinya oksidasi pada sel sehingga mengurangi terjadinya kerusakan sel. Berdasarkan sumbernya antioksidan dapat digolongkan menjadi dua golongan, yaitu antioksidan sintetik dan alami. Antioksidan sintetik diperoleh dari hasil sintesa reaksi kimia, seperti butylated hydroxyanisole (BHA) dan butylated hidroxytoluene (BHT) sangat efektif dalam menghambat reaksi oksidasi lemak. Akan tetapi, penggunaan antioksidan sintetik telah diketahui memiliki efek samping yang berbahaya antara lain menyebabkan kerusakan hati. Antioksidan alami diperoleh dari hasil ekstraksi bahan alami. Senyawa antioksidan alami antara lain seperti flavonoid, vitamin E, C, dan betakaroten dapat diperoleh dari sumber-sumber alami seperti pada rempah, herbal, sayuran, dan buah. Senyawa alami memiliki kelebihan karena kemungkinan lebih aman untuk dikonsumsi (Kikuzaki & Nakatani 1993). Antioksidan dapat berupa enzim atau zat bukan enzim. Antioksidan berupa enzim (yang terdapat dalam tubuh) adalah katalase, superoksida dismutase, dan glutation peroksidase. Zat scavenger (pembersih) nonenzim adalah vitamin E, vitamin A, vitamin C, beta-karoten, metionin, selenium,
dan tirosin. Berdasarkan mekanisme pencegahan dampak negatif radikal bebas, antioksidan dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu, antioksidan pencegah yang mengurangi kecepatan inisiasi (permulaan) rantai reaksi, dan antioksidan pemecah rantai yang akan memotong perbanyakan reaksi berantai (Murrayet al 2003). Proses penghambatan oksidasi lipid oleh antioksidan terjadi melalui berbagai mekanisme yaitu pemberian elektron, pemberian hidrogen, penambahan lipid pada cincin aromatik antioksidan dan pembentukan komplek antara lipid dan cincin aromatik antioksidan (Ketaren 1986). Vitamin E (α- tokoferol) adalah senyawa antioksidan yang bersifat lipofilik, dapat bekerja pada membran sel dan lipoprotein sebagai donor ion hidrogen sehingga radikal bebas menjadi molekul yang stabil. D-alfatokoferol mempunyai distribusi alami yang paling luas dan aktifitas biologik terbesar (Widjaja 1997). Sumber vitamin E yang terbanyak adalah minyak biji-bijian terutama minyak biji gandum, minyak kedelai, minyak jagung, beras merah, oatmeal, dan sereal (Kartawiguna 1998). Inflamasi Inflamasi adalah respon terhadap cedera jaringan dan infeksi. Ketika proses inflamasi berlangsung, terjadi reaksi vaskular dimana cairan, elemen-elemen darah, sel darah putih (leukosit), dan mediator kimia berkumpul pada tempat cedera jaringan atau infeksi. Proses inflamasi merupakan suatu mekanisme perlindungan dimana tubuh berusaha untuk menetralisir dan membasmi agen-agen yang berbahaya pada tempat cedera dan untuk mempersiapkan keadaan untuk perbaikan jaringan (Mitchell 2006). Inflamasi bertujuan untuk menghancurkan mikroorganisme, menghilangkan aktivitas toksinnya, dan mempersiapkan jaringan bagi kesembuhan serta perbaikan. Meskipun pada dasarnya merupakan respon yang bersifat protektif, namun inflamasi dapat pula berbahaya, respon ini dapat menyebabkan reaksi hipersensitivitas yang bisa membawa kematian atau kerusakan organ (Hayes & Kee 1996). Inflamasi umumnya ditandai oleh dua komponen utama yaitu respon dinding vaskular dan respon sel radang, efek yang dimediasi oleh protein plasma yang beredar dan faktor-faktor yang diproduksi setempat oleh dinding pembuluh darah atau sel-sel radang. Penanda inflamasi lainnya yaitu terminasi yakni tahap berakhirnya proses
5 inflamasi yang terjadi ketika agen penyebabnya sudah dieliminasi dan mediator yang disekresikan dihilangkan, mekanisme anti-inflamasi yang aktif juga turut terlibat. Inflamasi memiliki pola yang akut dan kronik yaitu inflamasi akut dan inflamasi kronik. Inflamasi akut adalah onset yang dini, durasi yang pendek dengan melibatkan proses eksudasi cairan (edema) dan emigrasi sel polimorfonuklear (neutrofil). Inflamasi kronik adalah onset yang terjadi kemudian dan durasi yang lebih lama dengan melibatkan limfosit serta makrofag dan menimbulkan proliferasi pembuluh darah serta pembentukan jaringan baru. Terdapat empat tanda klinis yang klasik pada inflamasi (yang paling menonjol pada inflamasi akut) yaitu; panas, merah, edema (tumor), nyeri. Gangguan fungsi dapat pula dianggap sebagai tanda klinis inflamasi (Hayes & Kee 1996). Adanya pencederaan jaringan akan membebaskan berbagai jenis mediator inflamasi, seperti prostaglandin, bradikinin, histamin dan sebagainya. Mediator inflamasi dapat mengaktivasi nosiseptor yang menyebabkan munculnya nyeri. Tahapan inflamasi berawal dari perubahan fosfolipid menjadi asam arakidonat yang merupakan substrat bagi enzim prostaglandin endoperoxide synthase (PGHS; COX, cyclooxygenase) menjadi PGG2, dan reduksi peroksidatif PGG2 menjadi PGH2. Selanjutnya sebagai bahan baku prostaglandin, endoperoksidan PGH2 diubah menjadi berbagai prostaglandin. Saat ini dikenal dua iso-enzim COX, yaitu COX-1 dan COX-2. COX-1 sebagai enzim constitutive yaitu mengubah PGH2 menjadi berbagai jenis prostaglandin (PGI2, PGE2) dan tromboxan (TXA2) yang dibutuhkan dalam fungsi homeostatis. COX-2 yang terdapat di dalam sel-sel imun (makrofag dan lainnya), sel endotel pembuluh darah dan fibroblast sinovial sangat mudah diinduksi oleh berbagai mekanisme, akan merubah PGH2 menjadi PGE2 yang berperan dalam kejadian inflamasi, nyeri dan demam. Oleh karena itu COX-2 dikenal sebagai enzim inducible. Pada kenyataannya, baik COX-1 dan COX-2 adalah isoenzim yang dapat diinduksi (Lelo 2001). BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini, diantaranya rimpang temulawak asal Wonogiri, kunyit asal Wonogiri, etanol 70 % (E.Merck), metanol, DPPH (2,2 difenil1-pikril hidrazil), kit clorimetric COX (ovine)
inhibitor screeningassay No. 560131 (Cayman Chem Com 2011), akua tridestillata, DMSO (E.Merck), aluminium foil. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini, diantaranya gelas piala, gelas ukur, tabung reaksi, gelas arloji, labu takar, cawan petri, sudip, spatula, pipet mikro, tip, vortex, micro plate, oven, rotavapor, penggiling 100 mesh,freezer, neraca digital, dan ELISAreader EPOCH. Metode Penelitian Persiapan Sampel Sampel basah terdiri dari 20 kg rimpang temulawak dan 20 kg rimpang kunyit. Masing-masing sampel dibersihkan dan dicuci menggunakan air mengalir sampai semua tanah dan kotoran yang menempel pada simplisia hilang. Selanjutnya sampel dipotong-potong kecil sehingga cepat kering. Selanjutnya semua simplisia dikeringkan di bawah sinar matahari selama 5 hari. Kemudian setiap simplisia kasar dari masingmasing sampel digiling dengan ukuran 100 mesh. Ukuran serbuk simplisia masingmasing sampel yang digunakan adalah 100 mesh (telah menjadi simplisia kering dengan kadar air ≤ 10%). Penentuan Kadar Air (AOAC 2006) Cawan porselen kosong dikeringkan pada suhu 1050C selama 30 menit di dalam oven. Cawan porselen tersebut selanjutnya didinginkan di dalam eksikator dan ditimbang sebagai bobot kosong cawan. Sebanyak 2 gram simplisia dimasukkan ke dalam cawan dan dikeringkan pada suhu 1050C selama 3 jam. Setelah itu, cawan yang berisi simplisia didinginkan dalam eksikator, dan ditimbang kembali sebagai bobot kering sampel. Perlakuan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Ekstraksi Sampel (BPOM 2005) Pada teknik maserasi menggunakan pelarut etanol 70% dengan perbandingan simplisia dengan pelarut (b/v) adalah 1:10. Sebanyak 1 kg simplisia dan 10 L etanol 70% dimasukkan ke dalam maserator dan direndam selama 6 jam sambil sesekali diaduk, kemudian sampel didiamkan sampai 24 jam. Selanjutnya maserat dipisahkan dengan menyaring filtrat dengan menggunakan kertas saring Whatman nomor 4. Semua maserat dikumpulkan dan diuapkan dengan rotavapor penguap vakum (BUCHI, R-250, Switzerland) pada suhu 500C hingga diperoleh ekstrak
6 kental. Ekstrak simpilisia yang telah pekat siap digunakan untuk penelitian selanjutnya. Analisis Kadar Komponen Bioaktif Temulawak Menggunakan HPLC (Jayaprakasha et al. 2002) Dua puluh lima mg sampel ditimbang dan dilarutkan ke dalam 5 ml metanol. Larutan disaring dengan kertas saring 0.45 μm dan ditempatkan pada vial HPLC. Sebanyak 10 μL dari larutan ekstrak sampel temulawak dan kunyit asal Wonogiri diinjeksikan ke dalam HPLC. Senyawa standar kurkuminoid dibuat dengan konsentrasi 0.1%. Kondisi HPLC untuk analisis ini digunakan jenis kolom C18 detektor UV-Vis dengan volume injeksi 10 μl, elusi gradien dan suhu kolom yang digunakan yaitu 480 C. Analisis kadar kurkuminoid dengan HPLC ini menggunakan fase gerak non polar yaitu metanol. Uji Antioksidan dengan Metode DPPH (Blois 1958, diacu dalam Hanani et al. 2005 dengan Modifikasi) Ekstrak kental dari sampel temulawak dan kunyit Wonogiri dari hasil maserasi dilarutkan dengan metanol dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Modifikasi metode dilakukan dengan mengubah konsentrasi ekstrak yang digunakan untuk analisis yaitu 12.5, 25, 50, 100 dan 200 ppm. Larutan induk untuk masing-masing sampel temulawak dan kunyit Wonogiri yaitu 200 ppm dibuat dengan menimbang 1 gram sampel dan ditambahkan 5 ml metanol. Sebanyak 1.23 mg DPPH yang diencerkan dengan metanol hingga 25 ml menggunakan labu takar (Juniarti 2009). Kemudian untuk membuat larutan sampel dengan konsentrasi 12.5 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm dan 200 ppm. Sebanyak 40 μL setiap sampel dengan masing-masing konsentrasi dimasukkan ke dalam masingmasing sumur (well plate) dan dilakukan masing-masing tiga kali ulangan. Pada masing-masing sumur ditambahkan 160 μL larutan DPPH 0.1 M hingga volume akhir yang terdapat pada sumur yaitu 200 μL. Selanjutnya, diinkubasi pada suhu 370C selama 30 menit dan diukur serapannya menggunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 517 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh selanjutnya digunakan untuk mendapatkan persen penangkapan radikal bebas oleh sampel dan digunakan untuk mendapatkan persamaan regresi linier dengan rumus: Y= a + b ln x. Nilai IC50 dihitung dengan menggunakan rumus persamaan regresi tersebut. Nilai IC50 yang paling rendah menunjukkan aktivitas sampel sebagai
senyawa antioksidan yang paling tinggi dibandingkan yang lainnya. Uji Daya Inhibisi Ekstrak Etanol Rimpang Temulawak dan Kunyit Wonogiri terhadap Enzim COX-2 Secara In Vitro (Cayman Chemical Catalog No. 560131) Ekstrak diuji daya inhibisinya terhadap enzim COX-2. Uji daya inhibisi dilakukan dengan metode ELISA, dengan menggunakan COX Inhibitor Screening Assay Kit (Cayman Chemical Catalog No. 560131) ) (Lampiran 4). Uji daya ekstrak etanol rimpangtemulawak dan kunyit dilakukan pada plat yang telah disiapkan (Gambar 4). A B C D E F G H
1 Blk Blk NSB NSB B0 B0 B0 TA
2 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
3 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8
4 BC2 % % H H H H H
5 BC2 % % H H H H H
6 H H H H H H H H
7 H H H H H H H H
Gambar 4 Format plat inhibisi COX-2 Keterangan gambar: Blk : blanko TA : aktivitas total NSB : non specific binding : maksimum binding B0 S1-S8 : standar 1-8 BC2 : background COX-2 % :100% initial activity samples H : COX inhibitor samples Preparasi larutan-larutan yang digunakan pada uji aktivitas enzim COX-2 dapat dilihat pada Lampiran 4. Sebanyak 100 μl buffer EIA dimasukkan pada sumurNSB. Kemudian 50 μl buffer EIA pada sumurB0. Larutan standar prostaglandin diisi ke dalam sumur S8-S1. Sumur BC diisi dengan 50 μl larutan background, sebanyak 50 μl larutan aktivitas awal COX-2 dengan pengenceran 2000 kali pada sumur (%), selanjutnya pada sumur inhibitor COX-2 diisi dengan larutan ekstrak etanol rimpang temulawak dan kunyit yang telah diencerkan 2000 kali. Tahap berikutnya, setiap sumur ditambahkan prostaglandin asetilkolinesterase (PG AchE tracer) kecuali pada sumur TA dan Blk, setiap sumur ditambahkan 50 μl antiserum prostaglandin kecuali sumur TA dan NSB kemudian plat ditutup dan diinkubasi selama 18 jam pada suhu ruang. Setelah plate diinkubasi, plate dicuci dengan larutan penyangga pencuci, kemudian setiap sumur ditambahkan dengan pereaksi
7 Ellman sebanyak 0,2 ml dan sumur TA diisi dengan prostaglandin asetilkolinesterase (tracer) 5 μl. Plate ditutup dengan plastik film dan diikubasi pada ruang gelap selama 60-90 menit lalu diukur menggunakan Elisa reader dengan panjang gelombang 412 nm. Persiapan larutan untuk uji dapat dilihat pada lampiran 5 yang sesuai dengan Cayman Chemical Catalog No. 560131). Penentuan IC50. Inhibition concentration 50 atau IC50 merupakan nilai konsentrasi minimal ekstrak yang dapat menginhibisi sampai 50%. Nilai IC50 diperoleh dari masing-masing kurva ekstrak sampel dengan memasukkan nilai Y=50. Y = a + bX (fungsi linier) Y = aX2 + bX +c (fungsi kuadratik) Y = a+ b ln (X) (fungsi ln) Keterangan: a dan b = konstanta X = IC50 Persamaan dipilih satu yang paling sesuai untuk masing-masing sampel dengan melihat nilai R2 tertinggi yang diperoleh. HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstrak sampel Penelitian ini menggunakan rimpang temulawak dan kunyit yang berumur sekitar 9 bulan.Mutu rimpang sangat ditentukan oleh umur, tempat tumbuh dan jenis tanah. Menurut Rahmat (1995), Panen rimpang dapat dilakukan pada saat kandungan karbohidrat tinggi, yaitu pada umur 9-10 bulan, ukuran rimpang sudah optimal dengan warna kuning kecoklatan.Ekstraksi serbuk rimpang temulawak dan kunyit dilakukan dengan cara maserasi dengan menggunakan pelarut etanol 70%. Metode maserasi dilakukan selama 3 x 24 jam. Rendemen yang dihasilkan dari suatu proses ekstraksi akan meningkat seiring dengan peningkatan waktu ektraksi (Basalmah 2006). Semakin lama waktu ekstraksi, maka semakin lama waktu kontak antara sampel dan pelarut yang menghasilkan semakin banyak senyawa yang berdifusi keluar sel.Penelitian ini melakukan ekstraksi dengan ukuran butir serbuk 100 mesh, suhu 50 oC, dan pengadukan yang hanya dilakukan sesekali. Pemilihan suhu penguapan sebesar 50 °C pada proses ekstraksi ini didasarkan pada pertimbangan bahwa etanol memiliki titik didih sekitar 78 °C dan bersifat volatil meskipun pada suhu ruang sehingga perlakuan suhu yang terlalu tinggi dapat mengakibatkan penguapan
pelarut yang lebih besar dan dapat merusak senyawa yang tidak tahan panas. Hasil maserasi (Tabel 1) dari rimpang temulawak dan kunyitWonogiri masingmasing dihasilkan maserat atau ekstrak. Berdasarkan hasil tersebut didapatkan rendemen masing-masing ekstrak sebesar 9.68% untuk temulawak dan 15.28% untuk kunyit.Hasil rendemen kunyit lebih besar dibandingkan temulawak karena mengandung senyawa yang lebih banyak dibandingkan temulawak. Kunyit mengandung senyawa kurkumin, demetoksi kurkumin dan bisdemetoksi kurkumin, sedangkan temulawak sedikit mengandung bisdemetoksi kurkumin(Afifah 2003). Berdasarkan hasil tersebut kunyit memiliki nilai rendemen lebih tinggi dibandingkan temulawak. Senyawa bioaktif yang terlarut dalam etanol 70% tersebut diharapkan memiliki potensi aktivitas antioksidan dan antiinflamasi yang akan diuji pada tahap selanjutnya. Perbedaan jumlah rendemen pada ekstrak dikarenakan ekstrak dengan rendemen tertinggi mengandung lebih banyak senyawa yang mudah larut dalam etanol 70%. Tabel 1 Persentase rendemen ekstrak temulawak dan kunyit Wonogiri Rendemen Jenis sampel (%) Temulawak 9.68 Kunyit 15.28 Kadar Kurkuminoid Ekstrak Rimpang Temulawak dan Kunyit Wonogiri Penentuan kadar kurkuminoid menggunakan dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Dari penentuan tersebut didapatkan kadar kurkuminoid (Gambar 5) pada kunyit Wonogiri sebesar 74.57 mg/g dan temulawak Wonogiri sebesar 20.04 mg/g. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa kandungan kurukuminoid pada kunyit lebih banyak dibandingkan dengan temulawak yang berasal dari Wonogiri. Kadar kurkuminoid yang lebih tinggi pada rimpang kunyit karena kunyit memiliki lebih banyak turunan senyawa dibandingkan temulawak. Rimpang kunyit mengandung senyawa turunan kurkuminoid berupa senyawa kurkumin, senyawa demetoksikurkumin, dan senyawa bisdemetoksikurkumin sedangkan pada rimpang temulawak Wonogiri hanya mengandung duasenyawa, yaitu kurkumin
8
80
74.557
60 40
sehingga mam mpu menghaambat radikal bebas lebih banyakk.Peghambatann radikal beb bas ini ditandai denngan peluruhhan warna warna ungu.Penurunnan nilai abssorban karenaa yang diukur oleh ELISA E reader adalah warnaa ungu DPPH yang semakin puddar seiring dengan d meningkatnyaa konsentrasi sampel. Setelah mendapatkan m nilai absorbaan dari semua konsenntrasi, dihitunnglah nilai IC50. 5 Nilai IC50 didapatkkan dari perhiitungan berdaasarkan absorban yang diperroleh.Hasil yang ( 7) pada kunyit yang didapatkan (Gambar berasal dari Wonogiri meemiliki nilai 61.472 6 ppm, sedanggkan nilai akktivitas antioksidan dari temulaw wak Wonogiiri sebesar 53.133 5 ppm. Hasil teersebut menuunjukkan temu ulawak memiliki nilaai aktivitas anttioksidan yang g lebih tinggi dibanddingkan kunyiit yang berasaal dari Wonogiri.Bloois (1958) m mengatakan bahwa suatu bahaan memilikii nilai ak ktivitas antioksidan yang y baik apaabila memilik ki nilai IC50 kurang dari d 200 ppm m. Berdasarkan n hasil penelitian yaang diperoleh, kunyit maupun m temulawak yang berasaal dari Wo onogiri g baik. memiliki nilaai aktivitas anttioksidan yang
0 C. domeestica
C. xanthorrhiiza
Gambar 5Kaadar kurkuminnoidpada ekkstraketanoltem mulawakdankkunyit assal Wonogiri Aktivitaas Antioksidaan Ekstrak Riimpang Temullawak dan Ku unyit Wonoggiri Pengujiaan aktivitas antioksidann pada ekstrak rim mpang temuulawak dan kunyit ditentukan menggunakan m n metode 1,1 difenil2-pikrilhidraazil (DPPH). Konsentrassi yang diukur padaa pengujian antioksidan a inni yaitu 200 ppm, 1000 ppm, 50 pppm, 25 ppm, dan d 12.5 ppm yang nantinya n akann diperoleh niilai IC50 untuk tiap sampel. s Penguukuran ini dilakukan dengan 3 kali ulanngan pada setiap sampel.Penggukuran awall pada penguujian ini yaitu menggukur absorbban sampel dengan menggunakaan ELISA reaader. Berdasarrkan hasil peengukuran diiperoleh data absorbban, semakinn tinggi konnsentrasi sampel yaituu dimulai darri 12.5 ppm, 25 2 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm m akan s menghasilkaan nilai absoorban yang semakin rendah (Gaambar 6). Artinya, A konnsentrasi sampel yaang semakinn tinggi memiliki m aktivitas anttioksidan yangg semakin tingggi pula
Pengukuran absorban pada 517 nm
20.044 20
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 12.5 25
50
100 200 2
Konsentrasi sampel (ppm) Gambar 6Pennghambatan raadikal bebas DP PPHoleh samppel temulawak k dan kuunyit Wonogirri 61.47 7 Aktivitas antioksidan, nilai IC50 (ppm)
Kandungan kurkuminoid (mg/g)
dan seenyawa demetoksikuurkumin (Lechtenberrg et al. 2004). Hasil peenelitian ini juuga disebabkkan oleh berbagai fakktor lingkungaan.Faktor linggkungan sangat mempengaruhi m hasil metabolit m sekunder rimpangg.Faktor pada suattu y berperann, diantaranyaa cahaya lingkungan yang matahari, suuhu udara, keetersediaan aiir, jenis tanah dan mikroorganiisme patogenn.Faktor c lingkungan lainnya adallah berupa cekaman s dari tanamaan rimpang teersebut. Jika semakin tinggi cekam man yang diraasakan oleh taanaman, maka metaabolit sekunnder dari tanaman t tersebut akkan meningkkat. Hal ini terjadi karena tanaman tersebut mempertaahankan man dengann cara dirinya daari cengkam meningkatkaan jumlah meetabolit sekunndernya. Menurut Nuurhidayah (20005), responm metabolit sekunder dihhasilkan ketikka kondisi linggkungan tanaman meengalami cekaman.
62 60 58 56
53.13
54 52 50 48 C. xanthorriz za C. domestica C. domestica a C. xanthorrh hiza
9 a memiiliki beberapaa nilai didapatkan apabila konsentrasi yang variattif sehingga bisa dihitung nilaii IC50.
Inhibisi COX‐2 (%)
Gambar 7Haasil uji antioksidan ekstrak temulawak daan kunyit Dayya Inhibisi Ek kstrak Rimpaang Temulawaak (C. xanthoorrhiza) dan Kunyit K (C. dom mestica) Won nogiri Terhad dap Aktivitas COX-2 C Pengujiaan antiinflamaasi pada penellitian ini langsung meenghambat ennzim COX-2 berbeda b dengan obbat sintetik antiinflamasii yang ada.Obat siintetik antiinfflamasi mengghambat enzim sikloooksigenase seehingga menim mbulkan efek sam mping beerupa pendarahan lambung.Penndarahan lam mbung ini diakkibatkan tidak adanyya protasikliin yang dihhasilkan enzim C COX-1.Keung ggulan peenelitian antiinflamassi ini adalah laangsung mengghambat pada enzim m COX-2 sehiingga enzim COX-1 tidak terhaambat dan tetap menghhasilkan protasiklin yang berfunggsi sebagai proteksi p lambung. Pengujiaan daya innhibisi samppel ini terhadap CO OX-2 mengguunakan metodde COX Inhibitor Screening S Asssay Kit (C Cayman Chemical Catalog No. N 56013 dengan Hasil reaksi dari d uji konsentrasi 100 ppm.H s sampel ini diukur dengan inhibisi menggunakaan ELISA Reader R pada panjang p gelombang 517 nm. Niilai absorbanssi yang a diolah sehingga s diddapatkan diperoleh akan persen inhibbisi COX-2. Adanya penghambattan aktivitas enzim Siklooksigennase-2 (COX--2) yang cukuup tinggi pada konsenntrasi inhibitoor (sampel) yaaitu 100 ppm menunnjukkan bahw wa ekstrak tem mulawak dan kunyitt memiliki bioaktivitas sebagai antiinflamassi.Hal ini dibbuktikan denganpenggujian yang mendapatkaan hasil sebesar 47.445% untuk temulawak t W Wonogiri dan 87.19% % untuk kunyiit Wonogiri (G Gambar 8). Perbeddaan % inhibisi dari aktivitas a antiinflamassi pada tem mulawak dan kunyit Wonogiridikkarenakan kadar k kurkuuminoid yang berbedda pada setiap sampel. Perbedaaan % inhibiisi yang dihhasilkan kunyit dann temulawaak asal Wonogiri W dikarenakann kadar kurkuminoid k yang dikandung kunyit k lebih banyak b dibanddingkan temulawak. Hal inilah yang membbedakan y menjadii faktor hasil inhibiisi karena yang antiinflamassi adaalah s senyawa kurkuminoidd.Timmermann(1995) melaaporkan kurkuminoidd memiliki aktivitas a yangg tinggi terhadap penghambatan p n aktivitas enzim siklooksigennase.Pada peengujian inii tidak didapatkan nilai IC50.Hal H ini dikarenakan konsentrasi yang digunaakan pada peengujian I 50bisa ini hanya satu konsenntrasi.Nilai IC
100 80 60 40 20 0
87.19 47.45
C. domestica
C. xanthorrhiza x
Gambar 8Akktivitas pengghambatan COX-2 C o olehtemulawak k (C. xanthorrrhiza) d dan kunyit(C C. Domestica a)pada k konsentrasi 1000 ppm
MPULAN DAN N SARAN SIM Simpu ulan Hasil pennelitian ini m menunjukan kunyit Wonogiri meemiliki nilai IIC50 sebesar 61.472 6 ppm dan tem mulawak Wonoogiri sebesar 53.133 5 ppm sebaagai antiokksidan. Ak ktivitas antiinflamasi kunyit padda konsentrassi 100 8 ppm memilikki persen inhibbisi sebesar 87.19% dan temulaw wak sebesar 47.45%.Kand dungan kurkuminoid pada kunyit sebesar 74.57 7 mg/g dan temulawaak sebesar 20..04 mg/g. Saraan Diperlukaan adanya pennelitian lebih lanjut mengenai aktivitas aantiinflamasi dari dengan temulawak dan kunyitt Wonogirid beberapa konsentrasi sehingga bisa mendapatkann nilai IC50. Hal ini dilaakukan untuk mengeetahui besarnyya konsentrasi yang bisa mengham mbat inflamassi . DAFTAR PU USTAKA [AOAC] The T Associaation of Official O Analyttical Chemisst. 2006. Official O Methoods of Anaalysis. Ed ke-18. Washiington DC: Associatio on of Officiaal Analytical C Chemist. [BPOM RI] Badan Penngawas Obaat dan Makannan Republikk Indonesia. 2005. Gerakkan Nasional M Minum Temulawak. Jakartaa : BPOM RI.. Afifah E. 2003. Khassiat dan Manfaat M Temullawak: Rimppang Penyembuh Aneka Penyakit. Agromedia Pusstaka : Jakartaa.
10 Anies.
2009. Judul Cepat Tua akibat Radiasi?. Jakarta: Penerbit Elex Media Komputindo. Hal 127-128
Basnet P, Natasa SB. 2011. Curcumin: An anti-inflammatory molecule from a curry spiceon the path to cancer treatment. Molecules 16: 4567-4598. Blois MS. 1958.Antioxidant determination by the use of stable free radical.Nature 181: 1191-1200. Dalimartha S. 2000. Atlas Tumbuhan Obat Jilid ke-2. Jakarta: Trubus Agriwidya. Hanani E, Munim A, Sekarini R. 2005. Identifikasi senyawa antioksidan dalam spons Callyspongia sp dari Kepulauan Seribu.Majalah Ilmu Kefarmasian 3: 127-133. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Bandung: ITB Press. Hayes
E.R, Kee J.L. 1996. Farmakologi.Pendekatan Proses Keperawatan.Anugerah P, penerjemah; Asih Y, editor. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Pharmacology. A nursing process approach.
Heldt HW. 1997. Plant Biochemistry & Molecular Biology. New York: OxfordUniversity Press Jayaprakasha GK, Rao LJ, Sakariah KK. 2002. Improved HPLC method for determination of curcumin, demethoxycurcumin, and bisdemethoxycurcumin. Agric. Food. Chem. 50: 3668-3672. Kassahara S, Hemmi S. 1986. Medical HerbIndex in Indonesia. Ed. ke-2. Jakarta:PT. Eisai Indonesia, dalam Makiyyah2003 Ketaren, S. 1986. Pengantar Teknologi Minyak dan Lemak Pangan. Cetakan Pertama. Jakarta : UI-Press. Kilkuzaki H, Nakatani. 1993. Antioxidant effects of some ginger constituents. J. Food. Sci: 58 (6): 1407-1410 Kiso.1985.Antihepatotonic Principles of Curcuma Longa Rhizome.Simposium Nasional Temulawak.Bandung : UNPAD. Lechtenberg M, Quandt B, Nahrstedt A. 2004. Quantitative determination of
curcuminoids in Curcuma rhizomes and rapid differentiation of Curcuma domestica Val. and Curcuma xanthorrhiza Roxb.by capillary electrophoresis. Phytochem.Anal. 15: 152–158. Lelo A. 2001. Pertimbangan yang muncul dari OAINS yang digunakan. Naskah Lengkap Temu Ilmiah Rematologi 2001. (eds. Setyohadi B, Kasjmir YI). Jakarta: Ikatan Reumatologi Indonesia. Mitchell R.N. 2006. Buku Saku Dasar Patologis Penyakit Robbins & Cotran, Ed. 7. Hartono A, penerjemah; Handayani S et al, editor. New York: Elsevier Inc. Terjemahan dari: Pocket Companion To Robbins & Cotran Pathologic Basis of Disease, 7th edition. Molyneux P. 2004. The use of stable free radical dyphenilpicryl-hydrazil (DPPH) for estimating antioxidant activity. J. Sci. Technol: 211-219. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwel VW. 2003. Biokimia Harper. Jakarta: Buku Kedokteran EGC. Nagabhushan M, Bhide SV. 1992. Curcumin as an inhibitor of cancer. J. Am. Clin. Nutr. 11: 192-198 Rukmana R. 2006. Temulawak, Tanaman Rempah dan Obat. Yogyakarta: Kanisius. Rukmana R. 2008. Temu-temuan, Apotik Hidup di Pekarangan.Ed ke-5. Yogyakarta: Kanisius. Sidik, Mulyono MW, Mutadi A. 1995. Temulawak (Curcuma xanthorriza Roxb). Jakarta: Phyto Medika Tonnesen HH, Karlsen J. 1985. Studies On Curcumin and Curcuminoids Alkaline Degradation of Curcuming Z.Lebens, Unters, Forsch.180 : 132-134 Tuminah, Sulistyowati. 1999. Pencegahan Kanker dengan Antioksidan.Jurnal Cermin Dunia Kedokteran. 122 Wahid P, Sudiarto. 1985. Pembudidayaan tanaman temulawak. Prosiding symposium nasional temulawak.Bandung: Lembaga Penelitian Universitas Padjajaran.
11 WHO.1999. WHO Monograph on selected medicinal plants. Vol I.ISBN 92125178. Widjaja E. 1997. Konservasi jenis-jenis bambu di Indonesia.Prosiding Seminar Nasional Konservasi Flora Nusantara.Bogor: UPT Balai Pengembangan Kebun Raya Bogor.
11
LAMPIRAN
12
Lampiran1 Diagram alir penelitian Rimpang kunyit dan temulawak Wonogiri -
Dicuci Dipotong Dikeringkan Digiling
Simplisia 100 mesh -
Ekstrak dengan etanol 70 % (maserasi) Evaporator
Ekstrak kunyit dan temulawak Wonogiri -
% rendemenen
Uji bioaktifitas potensi hayati ekstrak temulawak Uji kandungan kurkuminoid dengan HPLC
Uji aktivitas antioksidan DPPH
Nilai IC50
Uji antiinflamasi dengan inhibisi COX-2
Nilai % inhibisi
13
Lampiran 2 Prosedur ekstraksi (BPOM 2005)
Serbuk simplisia temulawak dan kunyit 100 mesh dengan kadar air < 10%
1 kg sampel dilarutkan dalam 10 L etanol 70 % (1:10)
Direndam dan diaduk dalam maserator
Diamkan selama 24 jam
Maserat dipisahkan dan ekstrak diuapkan hingga kental dengan evaporator pada suhu 500C
Ekstrak disimpan di dalam freezer
14
Lampiran 3 Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
Timbang 1 mg sampel dan dilarutkan dengan 5 ml metanol sehingga konsentrasi stok 200 ppm
Timbang 1.23 mg DPPH diencerkan hingga 25 ml dengan metanol
Sampel dimasukkan ke dalam microo plate dengan konsentrasi 200, 100, 50, 25, 12.5 ppm
100 μLlarutan DPPH ditambahkan pada setiap sampel
Sampel diinkubasi selama 30 menit pada suhu 370C
Sampel dibaca dengan Elisa reader pada panjang gelombang 517 nm
15
Lampiran 4 Preparasi larutan untuk uji inhibisi COX-2
Penyiapan sampel uji
Penyiapan pelarut
Penyiapan reagen
Pembuatan standar prostaglandin
Tahap pengenceran pada reaksi COX
16
Lampiran 5 Kadar air ekstrak kunyit dan temulawak
Jenis sampel
Ulangan
Bobot cawan kosong (gr)
Temulawak
1
20.7403
2.0783
Bobot cawan & contoh kering (gr) 22.6032
2
26.6249
2.3243
28.7149
10.08
3
17.4521
2.1193
19.3632
9.82
1
27.6655
2.1436
29.5905
10.19
2
27.8575
2.0375
29.6994
9.6
3
27.7882
2.0820
29.6599
10.10
Kunyit
Bobot contoh (gr)
Kadar air (%)
Kadar air rata-rata (%)
10.36 10.09
9.96
Contoh perhitungan: &
Kadar air temulawak = .
=
. .
= 10.36% Kadar air rata-rata =
=
.
= 10.09 %
.
.
.
x 100%
x 100%
17
Lampiran 6 Rendemen hasil ekstraksi Bobot ekstrak (gr) 4.5101
Rendemen (%) 8.92
Rendemen rata-rata (%)
1
Bobot sampel (gr) 50.5406
2
50.0232
4.5227
9.04
9.68
3
50.1195
5.5622
11.09
1
50.0604
8.6680
17.32
2
50.1831
6.842
13.64
3
50.1008
7.3528
14.89
Jenis sampel
Ulangan
Temulawak
Kunyit
Contoh perhitungan: Rendemen temulawak (%) =
x 100% .
=
.
x 100%
= 8.92 %
Rendemen rata-rata temulawak (%) = =
.
.
= 9.68 %
.
15.28
18
Lampiran 7 Hasil pengukuran kadar kurkuminoid temulawak dengan HPLC
Tabel 2 Kadar kurkuminoid kunyit Volume Pengencera n (mL)
FP
0,0518
50
50
382131
0,5
301700
0,39476
19,0521
0,0518
50
50
320634
0,5
270600
0,421976
20,3656
0,0518
50
50
331801
0,5
483380
0,728419
35,15533
Berat sampel (mg)
Senyawa Bisdesmetoksi kurkumin Desmetoksi kurkumin Kurkumin
Luas Area Standar
Contoh perhitungan : [inject] = 0.5
= = 0.39476 [sampel] = =
. .
= 19.05211931
Keterangan : FP : Faktor pengenceran
[Standar]
Luas Area Sampel
[Inject]
[Sampel] mg/g Bahan
74,57
19
Lampiran 8 Hasil pengukuran kadar kurkuminoid kunyit dengan HPLC
Tabel 3 kadar kurkuminoid temulawak
Senyawa Bisdesmetoksi kurkumin Desmetoksi kurkumin Kurkumin
Berat sampel (mg)
Volume Pengenceran (mL)
FP
Luas Area Standar
[Standar]
Luas Area Sampel
[Inject]
[SampelL] mg/g Bahan
0,0519
50
50
382131
0,5
27453
0,035921
0,34605
0,0519
50
50
320634
0,5
301393
0,469995
4,52789
0,0519
50
50
331801
0,5
1044842
1,574501
15,16860
Contoh perhitungan : [inject] = 0.5
= = 0.03592 [sampel] = =
. .
= 0,346059033
Keterangan : FP : Faktor pengenceran
20,04
20
Lampiran 9 Data absorbansi aktivitas antioksidan ekstrak temulawak Wonogiri pada panjang gelombang 517 nm Sampel
Konsentrasi (ppm) 200 100 50 25 12.5 200 100 50 25 12.5 200 100 50 25 12.5
Ulangan
1
2
Temulawak
3
Absorban sampel 0,155 0,174 0,252 0,324 0,349 0,118 0,152 0,261 0,323 0,371 0,128 0,137 0,281 0,322 0,394
Absorban blanko
% Inhibisi 78,14 65,27 38,62 19,46 10,18 90,11 74,18 41,21 26,37 11,54 89,59 82,13 47,06 39,59 21,95
0,334
0,364
0,442
Contoh perhitungan : 100 %
% Inhibisi = =
.
. .
100 %
= 81.4516129 %
IC50 (ppm)
IC50 rata-rata (ppm)
67,06395
52,3198
40,01598
53,1332
21
Lampiran 10 Data absorban aktivitas antioksidan ekstrak kunyit Wonogiri pada panjang gelombang 517 nm Sampel
Konsentrasi (ppm) 200 100 50 25 12.5 200 100 50 25 12.5 200 100 50 25 12.5
Ulangan
1
Kunyit
2
3
Absorban sampel 0,115 0,22 0,301 0,364 0,413 0,114 0,216 0,342 0,356 0,332 0,109 0,211 0,317 0,368 0,38
Absorban blanko
% Inhibisi 93,36609 61,17936 36,60934 21,13022 9,090909 93,43434 61,11111 24,49495 20,9596 27,0202 94,55959 61,39896 29,01554 15,80311 12,6943
0,407
0,396
0,386
Contoh perhitungan : 100 %
% Inhibisi = =
.
. .
= 93.36609 %
100 %
IC50 (ppm)
IC50 rata-rata (ppm)
60,50294
60,15918
63,75313
61,47175
22
Lampiran 11 Grafik aktivitas antioksidan hubungan % inhibisi dengan konsentrasi sampel 100.00 100.00
80.00
80.00
60.00
% Inhibisi
40.00 % Inhibisi
y = 26.21ln(x) ‐ 60.23 R² = 0.977
20.00
100
200
y = 29.56ln(x) ‐ 66.98 R² = 0.976
40.00 20.00
0.00 0
60.00
0.00
300
0
Konsentrasi (ppm)
100
200
300
Konsentrasi (ppm)
Grafik 1 Temulawak ulangan 1
Grafik 2 Temulawak ulangan 2 100
100.00
80
80.00 60 60.00 % Inhibisi
% Inhibisi
y = 25.65ln(x) ‐ 44.3 R² = 0.952
40.00
y = 30.09ln(x) ‐ 73.45 R² = 0.961
40 20
20.00
0
0.00 0
100
200
0
300
Grafik 3 Temulawak ulangan 3
% Inhibisi
y = 24.95ln(x) ‐ 52.22 R² = 0.762
100 200 Konsentrasi (ppm)
Grafik 5 Kunyit ulangan 2
300
Grafik 4 Kunyit ulangan 1
% Inhibisi
0
200
Konsentrasi (ppm)
Konsentrasi (ppm)
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
100
300
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
y = 30.19ln(x) ‐ 75.44 R² = 0.903
0
100
200
300
Konsentrasi (ppm)
Grafik 6 Kunyit ulangan 3
23
Lampiran 12 Nilai IC50 aktivitas antioksidan masing-masing sampel
Sampel
Ulangan
Temulawak
Persamaan garis
1 2 3 1 2 3
Kunyit
y = 26,21ln(x) - 60,23 y = 29,56ln(x) - 66,98 y = 25,65ln(x) - 44,3 y = 30,09ln(x) - 73,45 y = 24,95ln(x) - 52,22 y = 30,19ln(x) - 75,44
Contoh perhitungan: y
= a + b ln x
50
= 26.21 ln x – 60.23
ln x =
. .
x = 67.06395 ppm
Rataan IC50 =
.
= 53.13 ppm
.
.
Nilai IC50 (ppm) 67.06395 52.3198 40.01598 60.50294 60.15918 63.75313
Rataan IC50 (ppm) 53.13 61.47
Lampiran 13 Kurva standar uji inhibisi COX-2
160 y = ‐25.9ln(x) + 216.0 R² = 0.988
140
% B/B0
120 100 80 60 40 20 0 0
500
1000
1500
2000
2500
Konsentrasi (pg/ml) 25
Lampiran 14 Data uji daya inhibisi ekstrak rimpang temulawak dan kunyit Wonogiri
26
Contoh perhitungan: (B0)
(S1)
Absorban terkoreksi = Absorbans rerata – NSB
% B/B0 =
Absorban terkoreksi = 0.304166667 – (- 0.0005) = 0.304666667 Temulawak (100) % Inhibisi = 100 % =
.
. .
100 % = 47.45 %
(IA2) S A .
100 %
[PG] terkoreksi = ([PG] x FP) – ([PG]BC-2 x FP
B
% B/B0 = 100 % . = 0.259299781 FP = BC IA2
= 1084942 – 37369.36 = 1047573.101 = 100 = 2000
Sampel = 2000
Keterangan : PG : Prostaglandin FP : Faktor pengenceran %B/B0 : % Maksimum binding BC : Background COX-2 IA2 : Total activity tracer
27
