Stanovení vitaminů ve vybraných potravinách technikou HPLC

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin

Stanovení vitaminů ve vybraných potravinách technikou HPLC Diplomová práce

Brno 2006

Vedoucí diplomové práce:

Vypracovala:

Ing. Tomáš Gregor, Ph.D.

Petra Šotnerová

3

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Stanovení vitaminů ve vybraných potravinách technikou HPLC vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.

V Brně, dne………………………….. Podpis diplomanta…………………..

4

Annotation

This final diploma thesis deals of the problems of vitamins; both hydrophilic (of these was choosen ascorbic acid) and lipophilic (the main accent was put on vitamins A and D). The chemical and physical characteristics of these vitamins are described in this work with a view to a behaviour in solutions and to posibilities of isolation and detection in the foodstuff. The convenient method for vitamin determination is high performance liquid chromatography (HPLC) with UV detection. The work is aimed to an isolation of vitamins from the foodstuff and to a determination of components by the method HPLC, in a practical section. This method is applied for the real samples of food (milk, eggs, fruits etc.).

OBSAH 1

ÚVOD...............................................................................................................8

2

TEORETICKÁ ČÁST .......................................................................................9

2.1 Vitaminy ......................................................................................................9 2.2.1 Vitaminy rozpustné v tucích ................................................................10 2.1.1.1 Vitamin A (Retinol) .......................................................................10 2.1.1.2 Vitamin D (Kalciferol) ...................................................................12 2.1.1.3 Vitamin E (Tokoferoly)..................................................................14 2.1.1.4 Vitamin K......................................................................................15 2.2.1 Vitaminy rozpustné ve vodě ................................................................16 2.1.2.1 Vitamin B1 (Thiamin) ....................................................................16 2.1.2.2 Vitamin B2 (Riboflavin) .................................................................17 2.1.2.3 Niacin ...........................................................................................19 2.1.2.4 Vitamin B6 (Pyridoxin) ..................................................................20 2.1.2.5 Pantothenová kyselina .................................................................21 2.1.2.6 Biotin ............................................................................................22 2.1.2.7 Folacin .........................................................................................23 2.1.2.8 Vitamin B12 (Kobalamin)...............................................................24 2.1.2.9 Vitamin C (Kyselina askorbová) ...................................................25 2.2 Chromatografie.........................................................................................28 2.2.1 Hlediska dělení chromatografie ...........................................................28 2.2.2 Přehled chromatografických technik....................................................29 2.2.3 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie – HPLC .............................29 2.2.4 Stanovení kyseliny askorbové pomocí HPLC......................................32 2.3 Další metody stanovení kyseliny askorbové .........................................34 2.3.1 Příprava vzorku ke stanovení a eliminace rušivých vlivů.....................34 2.3.2 Titrace 2,6-dichlorfenolindofenolem nebo jodem.................................34 2.3.3 Coulometrická titrace...........................................................................35 2.3.4 Polarografické stanovení.....................................................................36 2.4

Stanovení vitaminů A a D pomocí HPLC ................................................36

3

CÍL PRÁCE....................................................................................................38

4

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST.............................................................................39

4.1 Použité chemikálie a přístroje .................................................................39 4.1.1 Seznam použitých chemikálií ..............................................................39 4.1.2 Seznam použitých vzorků ...................................................................39 4.1.3 Seznam použitých přístrojů a pomůcek...............................................39 4.2

Kyselina askorbová..................................................................................40

6

4.2.1 Příprava mobilní fáze ..........................................................................40 4.2.2 Příprava extrakčního činidla ................................................................40 4.2.3 Příprava standardu..............................................................................40 4.2.4 Příprava jednotlivých vzorků ...............................................................41 4.2.5 Statistické vyhodnocení.......................................................................41 4.2.6 HPLC – podmínky stanovení L-askorbové kyseliny ............................41 4.2.7 Jodometrické stanovení ......................................................................42 4.2.7.1 Stanovení faktoru odměrného roztoku .........................................42 4.2.7.2 Stanovení kyseliny askorbové v reálném vzorku..........................42 4.3 Vitamin A...................................................................................................42 4.3.1 Příprava mobilní fáze ..........................................................................42 4.3.2 Příprava standardu..............................................................................42 4.3.3 Příprava jednotlivých vzorků ...............................................................43 4.3.4 HPLC – podmínky stanovení vitaminu A .............................................43 4.3.5 Statistické vyhodnocení.......................................................................43 4.4 Vitamin D...................................................................................................44 4.4.1 Příprava mobilní fáze ..........................................................................44 4.4.2 Příprava standardu..............................................................................44 4.4.3 Příprava jednotlivých vzorků ...............................................................44 4.4.4 HPLC – podmínky stanovení vitaminu D.............................................44 4.4.5 Statistické vyhodnocení.......................................................................45 5

VÝSLEDKY A DISKUZE ...............................................................................46

5.1 Kyselina askorbová..................................................................................46 5.1.1 Kalibrace .............................................................................................46 5.1.2 Vzorky .................................................................................................49 5.2

Vitamin A...................................................................................................53

5.3

Vitamin D...................................................................................................57

6

ZÁVĚR...........................................................................................................61

7

LITERATURA ................................................................................................62

8

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ................................................................64

7

Seznam obrázků Obr. č. 1: Retinol Obr. č. 2 : β-karoten Obr. č. 3: Cholekalciferol Obr. č. 4: Tokoferol Obr. č. 5: Fyllochinon Obr. č. 6: Menachinon Obr. č. 7: Thiamin Obr. č. 8: Riboflavin Obr. č. 9: Kyselina nikotinová a nikotinamid Obr. č. 10: Pyridoxin Obr. č. 11: Kyselina pantothenová Obr. č. 12: Biotin Obr. č. 13: Kyselina listová Obr. č. 14: Struktura korinoidů Obr. č. 15: Kyselina L-askorbová Obr. č. 16: Oxidace kyseliny Obr. č. 17: Schéma kapalinového chromatografu Obr. č. 18: Dávkovací ventil se smyčkou Obr. č. 19: Kolony Obr. č. 20: Píky chromatogramu Obr. č. 21: Absorpční spektrum kyseliny askorbové v UV oblasti Obr. č. 22: Oxidace kyseliny askorbové jódem Seznam tabulek Tab. č. 1: Přehled chromatografických technik Tab. č. 2: Obsah vitaminu C ve vzorcích naměřený chromatograficky, jodometricky a porovnání s literaturou Tab. č. 3: Obsah vitaminu A ve vzorcích a porovnání s literaturou [2] Tab. č. 4: Obsah vitaminu D ve vzorcích a porovnání s literaturou [2]

1 ÚVOD Lidská výživa je jedním z nejvýznamnějších činitelů lidského zdraví. Zajišťuje příjem potřebných živin pro zachování a udržení aktivity, zdraví, růstu a reprodukčních funkcí člověka. Četné poruchy zdraví v životě jedinců jsou zaviněny nesprávnou nebo nedostatečnou výživou těhotné ženy, kojící matky, dětí v raném věku nebo v dospívání. Lidé se živí potravou připravenou různým způsobem z potravin živočišného a rostlinného původu. I u lidí je patrné, i když jen málo vyznačené, instinktivní vyhledávání určité potravy. Správně složená strava má obsahovat bílkoviny, tuky, sacharidy, minerální soli, vitaminy, pochutiny a vodu. Výživa lidí ve světovém měřítku je rozdílná. Lidé v rozvojových zemích trpí hladem a podvýživou, kdežto většina populace v rozvinutých státech přijímá více potravin než organismus potřebuje. Avšak i při nadměrné spotřebě potravin může docházet k nedostatečnému přijmu některých nutričně významných látek, např. vitaminů. Pro správnou výživu člověka a sestavení výživových doporučení je nezbytně nutné znát přesné složení jednotlivých potravin. Jedním ze základních kamenů zdravého stravování jsou nepochybně vitaminy. Metodami a technikami jejich extrakce a stanovením se zabývá tato diplomová práce. Pro stanovení byla použita technika HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie), což je rychlá a přesná laboratorní metoda. Cílem práce byla optimalizace extrakce vitaminů z matrice a metody HPLC pro jejich stanovení. Práce by měla přispět k vyjádření skutečné výživové hodnoty potravin a jejich významu pro spotřebitele.

9

2 TEORETICKÁ ČÁST 2.1 Vitaminy Vitaminy byly objeveny ruským lékařem Lininem roku 1880 při pokusech na zvířatech [1]. Jsou to organické nízkomolekulární sloučeniny syntetizované autotrofními organismy. Heterotrofní organismy je syntetizují jen v omezené míře a získávají je jako exogenní látky především potravou a některé z nich prostřednictvím střevní mikroflóry. V určitém minimálním množství jsou nezbytné pro látkovou přeměnu a regulaci metabolismu člověka. Nejsou zdrojem energie ani stavebním materiálem, ale vesměs mají funkci jako součást katalyzátorů biochemických reakcí, a proto bývají často označovány jako exogenní esenciální biokatalyzátory. Nejběžnější hledisko třídění vitaminů je dosud podle společných fyzikálních vlastností – rozpustnosti ve vodě (v polárním prostředí) a v tucích (v nepolárním prostředí). Vitaminy se takto dělí na dvě velké skupiny:


Vitaminy rozpustné ve vodě (hydrofilní) – 9 vitaminů




Vitaminy rozpustné v tucích (lipofilní) – 4 vitaminy

Některé látky, které samy nevykazují fyziologické účinky, mohou sloužit jako prekurzory vitaminů, tzv. provitaminy, z nichž organismus dokáže vitaminy syntetizovat působením enzymových systémů nebo ultrafialového záření. Při nedostatku (deficienci) některého vitaminu dochází k hypovitaminose (je-li vitamin dodáván v nedostatečném množství) nebo až k avitaminose (přechodný úplný nedostatek vitaminu projevující se poruchou některých biochemických procesů). Opakem je hypervitaminosa způsobená nadměrným příjmem lipofilních vitaminů, která rovněž vyvolává poruchy biochemických procesů a může vést k těžkým onemocněním. Antivitaminy (antagonisté vitaminů) jsou látky, které eliminují určitým způsobem biologické účinky vitaminů, což může vést až k projevům deficience. Aktivita antivitaminů hlavně spočívá na následujících základních principech:


Strukturní analogy vitaminů reagují s příslušnými apoenzymy nebo s bílkovinami, které vitaminy transportují




Některé enzymy přeměňují vitaminy na neúčinné látky

10




Některé látky (většinou bílkoviny, ale i látky nízkomolekulární) tvoří s vitaminy nevyužitelné komplexy

Antivitaminy první skupiny (tzv. pravé antivitaminy) nelze obvykle běžnými technologickými zákroky odstranit. Zbývající dvě skupiny antivitaminů však lze do značné míry eliminovat vhodnými technologickými nebo kulinárními postupy, např. tepelnou inaktivací enzymů nebo denaturací bílkovinné části vitaminu vázaného v nevyužitelném komplexu s bílkovinou [2]. Vitaminy vznikají převážně v rostlinách nebo mikroorganismech. Jejich obsah tam ovšem kolísá, neboť závisí na četných vlivech – odrůda, klimatické podmínky, roční období, složení půdy. Vitaminy jsou v těchto zdrojích také rozkládány příslušnými enzymy – kyselina L-askorbová askorbázou, thiamin thiaminázou apod. [1]. K větším či menším ztrátám dochází u většiny vitaminů během technologického zpracování i kulinární úpravy.

Z tohoto důvodu se vitaminy

považují za indikátory použití správných a šetrných technologických a kulinárních postupů. U vitaminů rozpustných ve vodě takto dochází k největším ztrátám výluhem, u vitaminů rozpustných v tucích jsou největší ztráty způsobeny oxidací. Významnými zdroji vitaminů jsou především základní potraviny – maso a masné výrobky, mléko a mléčné výrobky, vejce (zvláště žloutek), chléb a cereální výrobky, ovoce a zelenina. Vitaminy se zde vyskytují v proměnném množství zpravidla od µg.kg-1 po stovky až tisíce mg.kg-1 podle druhu vitaminu, potraviny a způsobu jejího zpracování [2].

2.2.1 Vitaminy rozpustné v tucích 2.1.1.1 Vitamin A (Retinol) Vitamin A neboli all-trans-retinol je polyisoprenová sloučenina obsahující cyklohexanové jádro. Pod názvem vitamin A jsou zahrnovány všechny látky živočišného původu, mající biologickou aktivitu vitaminu A. Většinu aktivity vitaminu A představuje retinol (obr. č. 1) a jeho dva deriváty, retinal a kyselina retinová. Název retinoidy se obvykle užívá k označení přírodních forem i syntetických analogů.

11

Obr. č. 1: Retinol

Obr. č. 2 : β-karoten

V zelenině je vitamin A přítomen ve formě provitaminu – žlutého pigmentu βkarotenu (obr. č. 2), který je tvořen dvěma molekulami retinolu spojenými na aldehydových koncích svých uhlíkových řetězců. Ovšem protože β-karoten není dostatečně účinně metabolizován na vitamin A, má jako zdroj vitaminu menší účinnost než samotný retinol [3]. Množství β-karotenu potřebné pro vznik 1 µg retinou je 4 µg (je-li provitamin přítomen v mléce, margarínu, rostlinných olejích nebo živočišných tucích), 8 µg (nachází-li se ve vařených listových zeleninách nebo v karotce připravené na tuku) nebo dokonce 12 µg (je-li přítomen v karotce vařené na vodě). Provitamin ze syrové karotky je téměř nevyužitelný [2]. V játrech

je

(perisinusoidálních

vitamin

A

ukládán

hvězdicových

do

zásoby

buňkách),

jako

ester

v lipocytech

pravděpodobně

jako

lipoglykoproteinový komplex. Mimo jaterní buňky je retinol vázán na buněčný retinol-vázající protein (retinol binding protein – CRBP). Retinol působí jako steroidní hormon, navázaný na bílkoviny jádra se pravděpodobně zapojuje do kontroly exprese některých genů. Retinal je složkou zrakového pigmentu rhodopsinu. 11-cis-retinal (isomer alltrans-retinalu) se specificky váže na zrakový protein opsin, čímž dojde k vytvoření rhodopsinu. Ten při svém štěpení otvírá kanál pro Ca-ionty, které umožňují vnímání světla mozkem.

12

Kyselina retinová se podílí na syntéze glykoproteidů. Tomu lze přičítat její účinky při podpoře růstu a diferenciaci tkání [3]. Přirozené retinoidy jsou látky poměrně stabilní v nepřítomnosti vzduchu. Za vyšších teplot a na světle mohou isomerovat na tzv. neokaroteny, které vykazují aktivitu vitaminu A, pokud mají zachovaný alespoň jeden β-jononový cyklus, ale jsou méně intenzivně zbarvené [2].

Oxidaci retinolu urychluje též přítomnost

některých kovů (Fe) nebo organických peroxidů (nenasycené mastné kyseliny). Při stabilizaci retinolu je důležitá funkce antioxidantů (např. tokoferoly) [1]. Jedním z prvotních příznaků nedostatku vitaminu A je špatné noční vidění (šeroslepost), které se projeví, když jaterní zásoby vitaminu jsou blízko vyčerpání. Další pokles vyvolá keratinisaci epiteliálních tkání očí, plic, trávicího a urogenitálního traktu spojenou se snížením sekrece mukosy. Poškození tkání oka – xerofthalmie, může vést až k oslepnutí [3]. Doporučená denní dávka je u dětí 0,4-0,6 mg, u dospělých 0,8-1,0 mg. Dobrými zdroji vitaminu je hlavně zelenina (špenát, petržel kadeřavá, rajčata), játra a jaterní rybí tuky.

2.1.1.2 Vitamin D (Kalciferol) Vitamin D je společný název pro skupinu blízce příbuzných lipofilních 9,10sekosteroidů, z nichž nejvýznamnější jsou vitamin D3 neboli cholekalciferol (obr. č. 3) a vitamin D2 neboli ergokalciferol [2].

13

Obr. č. 3: Cholekalciferol

Provitaminem D3 je 7-dehydrocholesterol, který se vyskytuje u živočichů a provitaminem D2 je ergosterol, který se vyskytuje v rostlinách. Oba se liší pouze postranním řetězcem. Ultrafialová složka slunečního záření štěpí B jádro obou sloučenin. Ergokalciferol vzniká v rostlinách, u živočichů se v kůži vystavené slunečnímu záření tvoří cholekalciferol. Cholekalciferol je zachycován játry, kde je hydroxylován na 25-hydroxycholekalciferol [3]. V ledvinových kanálcích je tento metabolizován na řadu dihydroxysubstituovaných vitaminů D3. Nejúčinnějším z nich je 1α, 25-dihydroxycholekalciferol (kalcitriol), jeho biologická účinnost je asi desetkrát vyšší než účinnost cholekalciferolu [2]. Je považován za vlastní aktivní formu vitaminu a jeho produkce je regulována jeho vlastní koncentrací, hormonem příštítných tělísek a hladinou fosfátů v séru [3]. Vitaminy D jsou jako všechny lipofilní vitaminy oxylabilní látky, a lze proto předpokládat vznik autooxidačních produktů. Termickou transformací (teploty kolem 200 °C) vznikají pyroisomery a isopyroisomery obou vitaminů [2]. Nedostatek vitaminu D působí u malých dětí křivici a u dospělých osteomalácii. Denní potřeba vitaminu D je 2,5-10 µg a je kryta převážně cholekalciferolem získávaným biosyntézou z provitaminu. Dobrými zdroji vitaminu jsou rybí tuk, vaječný žloutek a játra.

14

2.1.1.3 Vitamin E (Tokoferoly) Aktivitu vitaminu E vykazuje osm základních, strukturně příbuzných derivátů, jejichž strukturním základem jsou tokol a tokotrienol. Čtyři formy vitaminu E s nasyceným terpenoidním postranním řetězcem odvozeným od tokolu se nazývají tokoferoly (obr. č. 4), čtyři formy s nenasyceným postranním řetězcem odvozené od tokotrienolu se nazývají tokotrienoly [2].

Obr. č. 4: Tokoferol

Vitamin E, zvláště α-tokoferol, je nejvýznamnějším lipofilním antioxidantem uplatňujícím se u eukaryotických buněk jako ochrana nenasycených lipidů před poškozením volnými radikály. Spolu s β-karotenem a koenzymy Q chrání strukturu a integritu biomembrán. V krevním řečišti je transportován asociovaný s lipidovou fází lipoproteinových částic LDL. Každá částice LDL obsahuje 6 molekul vitaminu E [2]. Tokoferoly působí jako antioxidanty tím, že přerušují řetězové reakce volných radikálů díky své schopnosti přenášet vodík z fenolové skupiny na volný peroxylradikál peroxidované polyenolové kyseliny. Antioxidační účinky tokoferolu působí při vysoké koncentraci kyslíku, proto se hromadí v takových lipidových strukturách, které jsou vystaveny vyššímu parciálnímu tlaku kyslíku, např. v membránách erytrocytů a v membránách dýchacího ústrojí [3]. Adekvátní příjem vitaminu E se považuje za prevenci oxidace lipidů biomembrán. Vitamin E je proto faktorem zpomalujícím proces stárnutí organismu a uplatňujícím se v prevenci kardiovaskulárních chorob a vzniku rakoviny. Nedostatek vitaminu může vyvolat anemii u novorozenců, degenerativní nervové a svalové změny označované jako myopatie a encefalomalacie. Potřeba vitaminu značně závisí na příjmu polyenových mastných kyselin potravou. Pro osoby s průměrným denním příjmem mastných kyselin 14-19 g se

15

doporučuje denní příjem vitaminu 15 mg. Biologická aktivita jednotlivých tokoferolů a tokotrienolů je různá. Nejúčinnějším z nich je α-tokoferol. β-tokoferol vykazuje asi 50 % aktivity α-tokoferolu, γ-tokoferol asi 10 % a δ-tokoferol jen 3 %. Přítomnost dvojných vazeb v molekule tokotrienolů snižuje biologickou aktivitu asi o třetinu ve srovnání s tokoferoly [2]. Dobrými zdroji vitaminu jsou obilné klíčky, slunečnicový olej, olej ze semen kukuřice a sojových bobů, dále taky maso, ovoce a zelenina [3].

2.1.1.4 Vitamin K Všechny přirozeně se vyskytující látky, které vykazují aktivitu vitaminu K jsou deriváty menadionu s nenasyceným isoprenoidním postranním řetězcem [2]. Menadion se přirozeně nevyskytuje, ale in vivo je přeměněn alkylací na jeden z menachinonů (K2, obr. č. 5). V rostlinách se vitamin K nalézá většinou ve formě fyllochinonu (K1, obr. č. 6) [3]. Vitamin K2 je produkován mnoha bakteriemi a aktinomycetami (Escherichia coli, Staphylococcus aureus) [2].

Obr. č. 5: Fyllochinon

Obr. č. 6: Menachinon

16

Vitamin K je esenciální kofaktor pro karboxylaci některých bílkovin, resp. vázané glutamové kyseliny na γ-karboxyglutamovou. Tím získávají proteiny důležité vlastnosti, jako je schopnost vázat vápenaté ionty a fosfolipidy nezbytné pro funkci při srážení krve. Nejznámější reakcí je přeměna neaktivního prothrombinu na aktivní proteolytický enzym thrombin. Antagonisty vitaminu K je většina kumarinů, např. warfarin. Denní potřeba vitaminu se odhaduje na 0,14 mg, ale jen asi 30-70 % přijatého vitaminu je absorbováno ve střevech [2]. Příčinou nedostatku vitaminu je nejčastěji špatné vstřebávání tuků. Deriváty vitaminu K se vstřebávají pouze v přítomnosti žlučových kyselin, ale ve vodě rozpustný menadion se vstřebává i v jejich nepřítomnosti a přechází přímo do krevního oběhu v játrech. Deficience vitaminu se může projevit poruchami srážlivosti krve [3]. Zdroji vitaminu K jsou játra, zelené listové zeleniny, rostlinné oleje. Během skladování a tepelného zpracování potravin jsou vitaminy K relativně stabilní, působením světla dochází k fotodegradaci. Ke ztrátě aktivity dochází při reakci s redukčními činidly a v alkalickém prostředí [2].

2.2.1 Vitaminy rozpustné ve vodě 2.1.2.1 Vitamin B1 (Thiamin) Thiamin se skládá ze substituovaných jader thiazolu a pyrimidinu, spojených methylenovým můstkem. Aktivní formou thiaminu (obr. č. 7) je thiamindifosfát. Vzniká z thiaminu pomoci enzymu thiamindifosfotransferáza v mozku nebo v játrech. K této přeměně je potřeba ATP [3].

Obr. č. 7: Thiamin

17

Thiamindifosfát se účastní jako koenzym enzymové reakce, kterou je přemísťován aktivovaný aldehydový zbytek. Takovou reakcí je např. oxidativní dekarboxylace α-ketokyselin [3]. Antagonistou thiaminu je oxythiamin vznikající z thiaminu v silně kyselém prostředí. Množství potřebného vitaminu souvisí s množstvím sacharidů přijímaných potravou. Na každých 4200 KJ energie získané z cukrů se doporučuje příjem 0,40,6 mg thiaminu. Doporučená denní dávka je tedy 1,2 mg. Deficience způsobuje neurochirurgické onemocnění beri-beri, jejíž rané příznaky se projevují svalovou únavou, nechutenstvím, hubnutím a podrážděností. Beri-beri je běžná v zemích, kde hlavní složkou potravy je loupaná rýže. Příčinou nedostatku často bývá také alkoholismus [2]. Ke zjištění nedostatku thiaminu slouží měření aktivity transketolasy z červených krvinek [3]. Volný thiamin a jeho estery se vyskytují ve všech potravinách, obecně ve vyšších koncentracích v potravinách bohatých na sacharidy (obiloviny, luštěniny, vepřové maso a játra). Obsah vitaminu v mouce závisí na stupni vymletí, neboť thiamin je ve zvýšené míře obsažen v obalových vrstvách. Thiamin náleží k nejméně stálým vitaminům. Relativně stabilní je v kyselém prostředí (pH<5). V neutrálním a alkalickém prostředí, kdy existuje jako volná báze, je značně nestálý. Velké množství produktů vzniká také za varu. Bylo identifikováno až 70 degradačních produktů. Řada z nich je vonnými látkami potravin, např. masa. Thiamin je proto často používán jako složka směsí pro simulaci masového aromatu. Během technologického a kulinárního zpracování dochází ke ztrátám, které činí při smažení 10-50 %, při vaření a dušení 50-70 %. Zmrazování stabilitu vitaminu podstatným způsobem neovlivňuje [2].

2.1.2.2 Vitamin B2 (Riboflavin) Základem struktury riboflavinu (obr. č. 8) je isoalloxazinové jádro. Je barevný a fluoreskuje.

Vyskytuje

se

i

jako

volná

látka,

ale

převážně

ve

formě

flavinmononukleotidu (FMN), dále flavinadenindinukleotidu (FAD) a kovalentně

18

vázaného riboflavinu. Tyto látky jsou kofaktory oxidoredukčních enzymů známých jako flavoproteiny [2].

Obr. č. 8: Riboflavin

Flavinoproteinové enzymy jsou velmi rozšířeny a v savčím metabolismu jsou zastoupeny několika důležitými oxidoreduktasami. Uplatňují se při deaminaci aminokyselin, odbourávání purinů, oxidaci mastných kyselin, účastní se transportu redukujících jednotek z cytosolu do mitochondrií a jsou zde jednou z hlavních složek dýchacího řetězce. Riboflavin je poměrně odolný vůči vysokým teplotám, ale rozkládá se světlem [3]. Denní potřeba vitaminu je do 1,7 mg. 60 % vitaminu získávaného potravou zajišťuje mléko, mléčné výrobky, maso a masné výrobky. Riboflavin z živočišných potravin je snáze absorbován v trávicím traktu než vitamin u potravin rostlinného původu, kde převládají kovalentně vázané formy, obtížně štěpitelné proteasami [2]. S ohledem na široké zapojení riboflavinu do různých metabolických funkcí je překvapující, že jeho nedostatek nevede k větším potížím. Deficience se projevuje zánětem ústních koutků, rtů, jazyka, seborheaou a fotofobií. Riboflavin je syntetizován rostlinami i mikroorganismy, ale nikoliv savci. Jeho dobrým zdrojem jsou kvasnice, játra a ledviny [3].

19

2.1.2.3 Niacin Niacin, dříve nazývaný také PP faktor nebo vitamin PP, je společným označením pro kyselinu nikotinovou a nikotinamid (obr. č. 9). Obě sloučeniny mají stejnou biologickou účinnost.

Obr. č. 9: Kyselina nikotinová a nikotinamid

Nikotinamid fosforečného

je esteru

součástí

nikotinamidadenindinukleotidu

nikotinamidadenindinukleotidfosfátu

NAD

NADP,

a

jeho

které

jsou

kofaktory několika set různých enzymů [2]. Jsou klíčovými složkami mnoha metabolických drah důležitých pro metabolismus sacharidů, lipidů a aminokyselin. Dehydrogenázy spojené s NAD katalyzují reakce v oxidačních drahách (např. v citrátovém cyklu) a dehydrogenázy nebo reduktázy spojené s NADP se uplatňují v drahách souvisejících s redukčními syntézami [3]. Člověk má významnou, ale omezenou možnost syntetizovat niacin složitým způsobem z tryptofanu. Na syntézu 1 mg niacinu je zapotřebí 34-86 mg tryptofanu. Potřeba vitaminu není přesně známa, neboť závisí na mnoha faktorech. Odhaduje se, že člověk potřebuje denně mininálně asi 10 mg [2]. Nedostatek vitaminu působí pelagru, která se projevuje zažívacími poruchami, dermatitidami, depresemi a demencí. Aby se projevily příznaky nedostatku niacinu, musí být strava chudá na dostupný niacin i tryptofan [3]. Nikotinová kyselina je stabilní při zahřívání ve vodných roztocích a velmi stabilní je také v kyselém a alkalickém prostředí. Nikotinamid byl v kombinaci s kyselinou askorbovou použit jako stabilizátor barvy masa. V potravinách živočišného původu se vyskytuje hlavně nikotinamid. Nejbohatší zdroj jsou vnitřnosti, maso a masné výrobky, vejce a zejména žloutek. V potravinách rostlinného původu se vyskytuje hlavně kyselina nikotinová.

20

Obiloviny mají často značný obsah niacinu, obsah v mouce však závisí na stupni vymletí, neboť niacin je z velké části lokalizován v klíčku a v otrubách. Bohatým zdrojem niacinu je i pražená káva [2].

2.1.2.4 Vitamin B6 (Pyridoxin) Názvem pyridoxin (obr. č. 10) nebo také vitamin B6 se označují tři strukturně příbuzné, biologicky aktivní deriváty 3-hydroxy-5-hydroxymetyl-2-methylpyridinu. Jsou to pyridoxol, pyridoxal a pyridoxamin [2]. V jejich účinnosti jako vitaminů není rozdíl [3].

Obr. č. 10: Pyridoxin

Metabolicky aktivní formou je pyridoxalfosfát, který je kofaktorem dekarboxyláz, aminotransferáz a jiných enzymů [2]. Tento koenzym je i nedílnou součástí mechanismu působení fosforylázy, enzymu odpovídajícímu za štěpení glykogenu [3].

Rozšířeny

v živočišných

tkáních

a

rostlinných

pletivech

jsou

také

pyridoxaminfostát a pyridoxolfosfát. Antagonisty vitaminu jsou látky reagující s karbonylovou skupinou pyridoxalu či látky strukturně příbuzné. Mohou to být metabolity tryptofanu, hydraziny a hydroxylaminy, aminokyseliny a linatin. Vitamin je relativně stálý v kyselých roztocích, méně stálý je v neutrálním a alkalickém prostředí, zvláště na světle. Pyridoxol (v potravinách rostlinného původu) je stálejší než pyridoxal a pyridoxamin (v potravinách živočišného původu). Hlavní příčinou ztrát bývá vyluhování vitaminu. Doporučený denní příjem vitaminu je 2,6 mg [2].

21

Projevy nedostatku samotného vitaminu jsou vzácné, obvykle se projeví jako součást celkového nedostatku vitaminů komplexu B. Nedostatek vitaminu může nastat během laktace, u alkoholiků a při léčbě tuberkulózy lékem isoniazidem [3]. Bohatým zdrojem vitaminu je maso, masné výrobky, vnitřnosti, vaječný žloutek, celozrnné cereální výrobky, obilné klíčky, brambory a luštěniny [2].

2.1.2.5 Pantothenová kyselina Kyselina pantothenová (obr. č. 11) je vytvořena spojením β-alaninu a kyseliny pantoové.

Obr. č. 11: Kyselina pantothenová

Aktivní formou kyseliny je koenzym A a protein přenášející acyl (ACP) [3]. Koenzym A je účinnou složkou enzymů přenášejících zbytky karboxylových kyselin.

ACP

pantothenovou

je

koenzymem

kyselinu

syntetáz

nesyntetizují,

mastných

pouze

kyselin.

konvertují

Živočichové

exogenní

vitamin

získávaný potravou na koenzym A a ACP. Stabilita kyseliny ve vodných roztocích značně závisí na pH. Nejstabilnější je v slabě kyselém prostředí (pH 4-5). V kyselém i alkalickém prostředí dochází k hydrolýze amidové vazby, kdy vzniká pantoová kyselina a β-alanin. Vitamin je poměrně labilní při skladování a především při termickém zpracování potravin. Denní příjem vitaminu by měl být u dospělých 6-8 mg [2]. Nedostatek kyseliny pantothenové je vzácný. Je totiž přítomna v mnoha druzích různých potravin, především je v nadbytku v živočišných tkáních, celozrnných obilných klíčcích a luštěninách [3].

22

2.1.2.6 Biotin Biotin je derivát imidazolu. Obsahuje v molekule tři asymetrické atomy uhlíku. Pouze jeden z možných osmi isomerů, a to (+)-biotin, vykazuje biologickou aktivitu. Dříve se nazýval vitamin H (obr. č. 12).

Obr. č. 12: Biotin

Biotin se vyskytuje jako prostetická skupina mnoha enzymů katalyzujících přenos oxidu uhličitého. Rozeznávají se tři skupiny enzymů s biotinem jako kofaktorem: karboxylázy, transkarboxylázy a dekarboxylázy.

Z potravy je

absorbován pouze volný biotin. Biotin vázaný na bílkoviny musí být předem hydrolyzován biotinidázou. Biotin je stálý při zahřívání, na světle, v neutrálních i dokonce silně kyselých roztocích a nestálý v alkalickém prostředí. Snadno se oxiduje. Při zpracování potravin je velmi stabilní. Ztráty jsou způsobeny hlavně výluhem [2]. Nedostatek vitaminu není vyvolán jeho nedostatkem v potravě, ale poruchami jeho využívání, neboť větší část lidské potřeby biotinu syntetizují střevní bakterie [3]. Denní příjem potravou se odhaduje na 50-100 µg. Avitaminosa se projevuje kožními příznaky, dermatitidami apod. Projevy nedostatku může vyvolat syrový vaječný bílek, který obsahuje glykoprotein avidin, tvořící s biotinem velmi pevný komplex. Avšak při tepelném zpracování avidin denaturuje a již s biotinem nereaguje. Dobrým zdrojem biotinu je vaječný žloutek, vnitřnosti (hlavně játra a ledviny), obiloviny, cereální výrobky, luštěniny, květák, hrášek, droždí a houby [2].

23

2.1.2.7 Folacin Folacin je název pro biologicky aktivní deriváty folové (listové neboli pteroylglutamové) kyseliny (dříve také vitamin BC nebo M) [2]. Kyselina listová (obr. č. 13), nebo od ní odvozené foláty, se skládá z pteridinu s připojenými molekulami kyseliny p-aminobenzoové a kyseliny glutamové [3].

Obr. č. 13: Kyselina listová

Aktivní formou kyseliny listové je tetrahydrofolát. Vzniká ve střevě pomocí enzymu

folátreduktáza.

Tetrahydrofolát

je

aktivovaných

přenašečem

jednouhlíkových zbytků (methyl, methylen, formyl atd.), jejichž donorem je hlavně cholin, glyosylová kyselina, serin a další. Vitamin je kofaktorem enzymů uplatňujících

se

především

v metabolismu

aminokyselin,

purinových

a

pyrimidinových nukleotidů [2,3]. Folacin je nestálý v kyselém, neutrálním i alkalickém prostředí, za vyšších teplot a zvláště na světle, v přítomnosti kyslíku, kovů s přechodnou valencí a riboflavinu. Stabilita se liší v závislosti na počtu vázaných glutamových kyselin i jednouhlíkových zbytků. K oxidaci a jiným reakcím dochází běžně při zpracování potravin. Doporučený denní příjem je asi 0,2-0,9 mg. Folacin je ve výživě většinou nedostatkovým vitaminem. Deficience se projevuje megaloblasticku anémií. Hlavními zdroji jsou vejce, vnitřnosti, kvasnice a listová zelenina.

24

2.1.2.8 Vitamin B12 (Kobalamin) Vitaminy B12 mají nejsložitější strukturu ze všech vitaminů. Základem je korinový kruh (obr. č. 14) v němž je v centru napojen kobaltový ion. Kobalt může tvořit až šest koordinačních vazeb s ligandy. Je koordinován na všechny čtyři atomy dusíku pyrrolových jader, pátou vazbou je vázán druhý atom dusíku 5,6dimethylbenzimidazolu v tzv. α-poloze. Šestou vazbou v β-poloze mohou být vázány různé skupiny nebo nemusí být obsazena vůbec [2].

Obr. č. 14: Struktura korinoidů

Aktivní B12 koenzymy jsou methylkobalamin (vzniká přeměnou v cytosolu) a deoxyadenosylkabalamin

(vzniká

v mitochondriích).

Methylkobalamin

hraje

důležitou roli v citrátovém cyklu při přeměně methylmalonyl-CoA na sukcinyl-CoA. Deoxyadenosylkabalamin je koenzym v kombinované přeměně homocysteinu na methionin. Pro vstřebávání vitaminu B12 je nezbytný velmi specifický glykoprotein - vnitřní faktor (IF, z angl. Intrinsic factor), vylučovaný sliznicí žaludeční stěny. Vitamin je skladován v játrech, což je výjimečné pro vitaminy rozpustné ve vodě [3]. Při zpracování potravin je vitamin velmi stabilní. Hlavní příčinou ztrát je opět vyluhování.

25

Denní potřeba vitaminu je asi 1 µg. Vzhledem k nízké potřebě a relativně vysokému obsahu v potravinách je deficience velmi vzácná. Dochází k ní při snížené produkci vnitřního faktoru a tím schopnosti absorbovat vitamin. Projevuje se zhoubnou chudokrevností. Korinoidy jsou přítomny výhradně v potravinách živočišného původu. Dobrými zdroji jsou játra, kvasnice, maso a mléko [2].

2.1.2.9 Vitamin C (Kyselina askorbová) Základní biologicky aktivní sloučeninou je askorbová kyselina (obr. č. 15). Ze čtyř možných stereoisomerů (asymetrický uhlík C-4 a C-5) vykazuje aktivitu vitaminu C pouze L-askorbová kyselina (γ-lakton L-threo-hex-2-enonové kyseliny). Názvem vitamin C se označuje nejen L-askorbová kyselina, ale také celý reversibilní

redoxní

systém.

Ten

zahrnuje

L-askorbovou

kyselinu,

L-

askorbylradikál (produkt její jednoelektronové oxidace) a L-dehydroaskorbovou kyselinu (produkt její dvouelektronové oxidace) [2].

OH O

O CH

CH2OH

OH

OH

Obr. č. 15: Kyselina L-askorbová

Kyselina askorbová je biosyntetizována u většiny savců z glukosy. U primátů, včetně člověka, a některých dalších savců, např. morčat, některých netopýrů (kaloňů), ptáků, ryb a bezobratlých brání této syntéze nepřítomnost enzymu Lgulonolaktonoxidasy [4]. Vitamin C se podílí na významných hydroxylačních reakcích v organismu, účastní biosyntézy mukopolysacharidů, prostaglandinů, absorpce iontových forem železa, jeho transportu, stimuluje transport sodných, chloridových

a

zřejmě

i

vápenatých

cholesterolu, drog a v řadě dalších reakcí.

iontů,

uplatňuje

se

v metabolismu

26

Askorbová kyselina má díky svým vlastnostem (vitamin, antioxidant a chelatační

činidlo) široké

použití

jako

potravinářské

aditivum

především

v konzervárenské a kvasné technologii a v technologii masa, tuků a v cereální technologii. Jako antioxidant se používá také ve vodě rozpustná sůl askorbové kyseliny, natrium-askorbát (v praxi nazývaný askorbát sodný) a lipofilní L-askorbyl6-palmitát, který současně inhibuje tvorbu nitrosaminů v mase a masných výrobcích. Doporučená denní dávka je 60-200 mg. Deficience vitaminu či hypovitaminosa se projevuje řadou nespecifických příznaků, nejčastěji tzv. jarní únavou. Nejznámějším syndromem akutní avitaminosy jsou kurděje (skorbut). Veškerá potřeba vitaminu C je kryta vitaminem z potravy. Nejbohatším zdrojem je ovoce a zelenina. Absolutně nejvyšší koncentrace askorbové kyseliny (17-46 g/kg jedlého podílu) obsahuje ovoce acerola (Malpighia marginata). Bohaté zdroje však zpravidla nebývají významné pro krytí potřeby vitaminu (např. šípky, černý rybíz, kadeřavá petržel), neboť se konzumují jen příležitostně a v malém množství. Průměrný obsah vitaminu mají brambory, paprika, citrusové plody, klíčící semena.

Reakce Obě enolové hydroxylové skupiny askorbové kyseliny mohou disociovat a askorbovou kyselinu lze proto považovat za dvojsytnou kyselinu. V roztocích o fyziologických hodnotách pH se vyskytuje jako anion. Nejvýznamnější reakcí askorbové kyseliny je oxidace vzdušným kyslíkem (autooxidace), která způsobuje většinu ztrát v potravinách při jejich zpracování. Kyselina askorbová se oxiduje na kyselinu dehydroaskorbovou (obr. č. 16). Reakce probíhá v přítomnosti i v nepřítomnosti iontů přechodných (tranzitních) kovů. Aktivní jsou hlavně ionty trojmocného železa a dvojmocné mědi. Reakce závisí na pH prostředí. V kyselém prostředí je pomalá, rychlejší je v neutrálním a nejrychlejší v alkalickém prostředí.

Stabilita Askorbová kyselina je jedním z nejméně stálých vitaminů. Ke ztrátám dochází různými způsoby. Nejvýznamnější jsou ztráty výluhem a oxidací. V nepřítomnosti vzdušného kyslíku jsou způsobeny hlavně kyselinami katalyzovanou degradací.

27

Celkové ztráty se pohybují zpravidla mezi 20 až 80 %. Nejstabilnější je vitamin C při zmrazování a mrazírenském skladování ovoce a zeleniny. Během zpracování je stabilita vyšší u ovoce, které má nižší pH než zelenina [2].

OH

OH O

O

O CH OH

O

CH2OH

CH

OH

O

C

OH

CH

O

CH2OH

CH2OH

OH

CH2OH

HC

OH

OH

OH

CH

C

O

C

O

C

O

C

O

COOH

COOH

Obr. č. 16: Oxidace kyseliny askorbové: v prvním kroku vratná oxidace (odštěpení dvou vodíků) na kyselinu dehydroaskorbovou, a dále nevratná reakce přes kyselinu 2,3-diketogulonovou, až na kyselinu 4,5,5,6- tetrahydroxy-2,3-diketohexanovou. Při extrakci se kyselina askorbová stabilizuje zajištěním nízkého pH, přítomností komplexotvorných látek a redukujících látek. Těmto podmínkám vyhovuje kyselina šťavelová, která v extraktu udržuje nízké pH a má i slabé komplexotvorné

vlastnosti.

Přítomnost

vzdušného

kyslíku

se

eliminuje

probubláváním extraktu dusíkem a krátkým extrakčním časem. K omezení vlivu přítomných těžkých kovů se používá EDTA (ethylendiamintetraoctová kyselina) nebo se extrahuje kyselina askorbová do organických rozpouštědel. V žádném případě se nedoporučuje používat vyšších teplot při extrakci kyseliny askorbové, neboť za těchto podmínek dochází k rychlému rozkladu. Z dalších extrakčních roztoků a stabilizátorů je možné jmenovat zředěnou kyselinou chloristou, kyselinu fosforečnou za přítomnosti EDTA a siřičitanu sodného [15].

28

2.2 Chromatografie Chromatografické metody využívají k dělení směsí mnohonásobné opakované vytváření stavů složek mezi dvěma fázemi, stacionární a mobilní. Rovnovážné stavy se vytvářejí na základě chemicko-fyzikálních interakcí mezi složkou a mobilní fází a mezi složkou a stacionární fází. Stacionární fáze může být tuhá částice, tenká vrstvička kapaliny nanesená na tuhých částicích nebo tenký film kapaliny nanesený na vnitřní straně kapiláry. Fáze mobilní může být plyn, kapalina nebo nadkritická kapalina. Dělení směsi se dosáhne tím, že jednotlivé složky se pohybují médiem různou rychlostí, která je závislá na distribuční konstantě příslušné složky v použité soustavě stacionární a mobilní fáze [9].

2.2.1 Hlediska dělení chromatografie 1) Dle povahy mobilní fáze :

plynová (GC) kapalinová (LC)

2) Dle způsobu provedení :

kolonová (sloupcová) plošná (planární)

3) Dle principu separace :

rozdělovací adsorpční iontově výměnná gelová afinitní

4) Dle pracovního způsobu :

eluční frontální vytěsňovací

5) Dle účelu:

analytická preparativní (preparační)

29

2.2.2 Přehled chromatografických technik Přehled chromatografických technik je obsažen v tabulce 1.

Tab. č. 1: Přehled chromatografických technik [10] Mobilní Uspořádání Stacionární Typ chromatografie fáze

fáze

plyn

kapalina

plynová rozdělovací chromatografie GLC

tuhá látka

plynová adsorpční chromatografie GSC

kapalina

kapalinová rozdělovací chromatografie LLC

kapalina kolonová

gelová permeační chromatografie GPC tuhá látka

kapalinová adsorpční chromatografie LSC iontově výměnná chromatografie IEC

planární

kapalina

papírová rozdělovací chromatografie PC tenkovrstvá rozdělovací chromatografie TLC

tuhá látka

tenkovrstvá adsorpční chromatografie TLC

2.2.3 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie – HPLC Základem HPLC (High Performance Liquid Chromatography) se stalo klasické uspořádáni kolonové kapalinové chromatografie. K účinné separaci se používají mikropartikulární sorbenty (5-10 µm), které kladou prostupující kapalině značný odpor, a proto je třeba pracovat při vysokém tlaku. Za těchto podmínek dochází na koloně k výraznému chromatografickému rozlišení látek v širokých oblastech molekulových hmotností [11,12]. Obecné schéma kapalinového chromatografu (obr. č. 17) lze popsat asi takto: Mobilní fáze je vedena ze zásobníku přes odplyňovač do vysokotlakého čerpadla, odtud postupuje po případném utlumení pulsů do chromatografické kolony, které může být předřazena předkolona. Kolona i předkolona bývá obvykle zhotovena ze skla nebo z nerezové oceli, je možná také kombinace skleněné kolony vložené do nerezového pouzdra, které brání roztržení skla. Za kolonou bývá ve většině případů detektor nebo jímač frakcí či sběrač mobilní fáze. K detektoru je připojen počítač, který vyhodnocuje data (obr. č. 17).

30

Obr. č. 17: Schéma kapalinového chromatografu Tlaky používané v kapalinových chromatografech se pohybují od 1 MPa až do 60 MPa, což je dáno pouze technickým vybavením. Při takových tlacích je dosažen poměrně velký průtok mobilní fáze (až 30 ml/min). Kromě nároků na kolonu (vlastní pracovní část) jsou kladeny obrovské nároky na použité čerpadlo. Dnes nejpoužívanější čerpadla jsou pulsní a bezpulsní. Pulsní mají poměrně malý objem pracovní komory a aby se dosáhlo potřebného průtoku, musí dojít k mnohokrát opakovanému stlačení a vypuzení mobilní fáze z pracovní komory. Bezpulsní čerpadla pracují s velkým objemem pracovní komory (100–500 ml). To umožní provést realizaci mnoha analýz bez obnovy náplně, mají však horší reprodukovatelnost při tvorbě gradientu mobilní fáze. Dávkování vzorku se provádí dávkovacím ventilem (obr. č. 18). Je to třícestný ventil se stálým objemem (v µl) a umožňuje překonat tlaky i 60 MPa. Nevýhodou je neproměnlivý objem, jenž je řešen výměnou dávkovacího ventilu.

Obr. č. 18: Dávkovací ventil se smyčkou

31

Vlastní kolona (obr. č. 19) je naplněna sorbentem určité zrnitosti. Čím je velikost zrn sorbentu menší, tím kratší kolona se použije. Při průměrné velikosti zrn 15 µm bývá délka kolony v rozmezí 15 až 30 cm. Vnitřní průměr nepřesahuje 3-6 mm. Průměr použité kolony má vliv i na celkovou kapacitu kolony vztaženou na množství dávkovaného vzorku [13]. Základem většiny náplní, které obsahují chemicky vázanou stacionární fázi, je silikagel ve formě plně porézních částic nepravidelného tvaru nebo plně porézních kulovitých částic. Chemicky vázaná stacionární fáze na těchto nosičích se získává vytvořením vrstvičky chemicky vázaného silikonového polymeru. Součástí silikonového polymeru je vždy určitá koncová funkční skupina, která ovlivňuje vlastnosti chemicky vázané fáze. Používají se buď uhlovodíkové (hydrofobní) skupiny (např. oktyl-, oktadecyl-), těmto fázím se říká obrácené, jsou označovány RP (reverse phase), nebo polární funkční skupiny (např. nitrilové, aminové), jež jsou zatím méně běžné. V chromatografii s reversními fázemi se pracuje s polárními mobilními fázemi. Používají se alkoholy (methanol), nitrily (acotonitril), ethery (tetrahydrofuran, dioxan) a voda. Pokud je použita pouze jediná mobilní fáze s konstantním složením, proces se nazývá izokratická eluce. Pokud se použije více rozpouštědel o stoupající eluční síle (při analýzách složitých směsí), proces se nazývá gradientová eluce [14].

Obr. č. 19: Kolony. Rovné skleněné trubice naplněné sorbentem, který je držen v koloně pomocí frit. V HPLC

se

používá

množství

detektorů,

mezi

nejpoužívanější

patří

fotometrický UV detektor, dále fluorimetrický, refraktometrický, polarografický, transportní FID, vodivostní, kapacitní, permitivní [13]. Výsledkem chromatografické separace je chromatogram zobrazený na monitoru počítače. Na ose x je retenční čas, což je celkový čas, který příslušný analyt stráví v separační koloně. Na ose y je odezva detektoru. Zóně analytu v

32

chromatogramu

odpovídá

pík

neboli

eluční

křivka,

která

charakterizuje

koncentrační profil analytu v zóně (obr. č. 20).

Obr. č. 20: Píky chromatogramu Nositelem kvalitativní informace jsou eluční parametry eluční čas tR (doba od nástřiku vzorku na kolonu po maximum eluční křivky) a eluční objem VR (celkový objem mobilní fáze, proteklý od nástřiku vzorku na kolonu až po maximum eluční křivky). Je však nemožné opírat se o absolutní hodnoty, neboť jsou závislé na všech experimentálních podmínkách chromatografické analýzy. Kvalitativní analýza je proto založena na porovnání elučního času nebo objemu neznámé složky s elučním časem nebo objemem standardu za stejných podmínek. Kvantitativní analýza vychází z toho, že plocha vymezená píkem nad základní linií je úměrná množství (koncentraci) látky. Kvantitativní analýze musí předcházet měření plochy píků, které se v současnosti provádí výhradně digitálními integrátory [14].

2.2.4 Stanovení kyseliny askorbové pomocí HPLC Stanovením kyseliny askorbové pomocí HPLC se zabývá mnoho vědeckých prací. Každá však používá jiné přístroje, uplatňuje jinou metodiku a jiné podmínky pro stanovení. Proto je nutné každé stanovení na konkrétním přístroji

33

standardizovat a vhodně upravit podmínky, aby výsledky byly srovnatelné s ostatními. Pro stanovení kyseliny askorbové většina metod používá jako extrakční činidlo kyselinu hydrogenfosforečnou ve směsi s kyselinou octovou, kyselinu šťavelovou, citrónovou, chloristou nebo siřičitan sodný. Pro omezení vlivu těžkých kovů lze použít EDTA. Lze použít různé typy kolon, se sorbenty od různých výrobců, např. Nucleosil 100-5 C18, Zorbax SB-C8, Hypersil BDS RP-18 a další. Jako mobilní fáze se nejčastěji používají H2O, CH3OH, KH2PO4, H2SO4 o různých koncentracích. Nejčastěji používanými detektory jsou UV detektory. Jedná se o spektrometry pracující v rozsahu vlnových délek 180-380 nm. Pro detekci kyseliny askorbové je nejvhodnější vlnová délka mezi 240-265 nm. Používá se buď 245 nm, 254 nm nebo 265 nm (obr. č. 21). Při těchto vlnových délkách vykazuje absorpční maximum skupina -C=C–COOH. Kyselinu askorbovou je však možno měřit i při vlnové délce 210 nm, při níž má absorpční maximum skupina –C–COOH (organické kyseliny).

Obr. č. 21: Absorpční spektrum kyseliny askorbové v UV oblasti

34

Při stanovení kyseliny askorbové není vhodné používat vysoké teploty, protože ty zvyšují rychlost rozkladu kyseliny. Optimální je měřit při laboratorní teplotě, tedy kolem 22 °C. Dávkovací smyčky se používají většinou o objemu 10-20 µl, průtok mobilní fáze bývá od 0,3 do 1 ml/min [7, 16].

2.3 Další metody stanovení kyseliny askorbové 2.3.1 Příprava vzorku ke stanovení a eliminace rušivých vlivů Přípravu extraktu vzorku je nutno provést rychle a za podmínek, které by zajistily stabilitu kyseliny askorbové vzhledem k její značné citlivosti vůči vzdušnému kyslíku a jiným oxidačním činidlům. Hlavními zásadami při přípravě vzorku je, aby extrakce byla prováděna v kyselém prostředí a aby bylo zabráněno styku s těžkými kovy zvláště s mědí, stříbrem a železem, které katalyzují oxidaci kyseliny. A. Fujita a D. Iwatake zavedli extrakci 6% kyselinou metafosforečnou, v které je kyselina askorbová velmi stálá. Jiní pracovníci doporučují používat 8% kyselinu octovou [5].

2.3.2 Titrace 2,6-dichlorfenolindofenolem nebo jodem Kyselina L-askorbová se titruje 0,5 mM roztokem 2,6-dichlorfenolindofenolu, přičemž se oxiduje na kyselinu dehydroaskorbovou a 2,6-dichlorfenolindofenol přechází v bezbarvou leukobazi. Příprava vzorku i samotné stanovení kyseliny se provádí v prostředí 2 % kyseliny metafosforečné nebo směsi kyselin metafosforečná + octová, které zabraňují oxidaci nestabilní kyseliny askorbové vzdušným kyslíkem na kyselinu dehydroaskorbovou. Vzorek se ihned titruje do prvního růžového zbarvení, trvajícího nejméně 15 s. Touto metodou lze stanovit pouze kyselinu askorbovou, ne dehydroaskorbovou [6,7]. Jako titrační činidlo je také možno použít roztok jodu, jako indikátor slouží škrobový maz a vzorek se titruje do modrého zbarvení [8]. Extrakční

postup

dichlorfenolindofenolem)

dle

ČSN

používá

56 jako

0050

(titrační

extrakční

činidlo

stanovení 3%

2,6-

kyselinu

35

hydrogenfosforečnou s přídavkem 8% kyseliny octové. Titruje se do slabě růžového zbarvení stálého alespoň 30 sekund [16].

2.3.3 Coulometrická titrace Podstatou coulometrických metod je úplná přeměna stanovované látky na jinou formu v jiném oxidačním stupni. Coulometrické stanovení je založena na měření náboje, potřebného k úplnému průběhu příslušné elektrodové reakce. Elektrodová reakce musí na pracovní elektrodě probíhat vždy se 100% proudovým výtěžkem. Vedle ní nesmějí probíhat žádné další elektrodové děje, rušivou vedlejší reakcí může být i rozpad rozpouštědla (vody). Elektrodový systém se skládá z generačního a indikačního článku. Generační článek tvoří dvě velkoploché platinové elektrody: pracovní elektroda (kde se vytváří titrační činidlo) a pomocná elektroda. Ta je od titrovaného roztoku oddělena trubicí opatřenou skleněnou fritou, aby nedocházelo k mísení produktů elektrolýzy a tím k nežádoucím vedlejším reakcím. Coulometrická titrace je založena na oxidaci kyseliny askorbové jódem (obr. č. 22).

Obr. č. 22: Oxidace kyseliny askorbové jódem

Elektrolýzou roztoku NaI (jodid sodný, základní elektrolyt) se na pracovní elektrodě (anodě) generuje titrační činidlo. Jeho koncentrace je až do dosažení bodu ekvivalence prakticky nulová, a proto biamperomatrickým indikačním systémem neprochází proud. Za bodem ekvivalence s rostoucí koncentrací jódu proud vzrůstá. Během stanovení se kyselina askorbová stabilizuje kyselinou šťavelovou a přídavkem EDTA. Přítomnost vzdušného kyslíku se eliminuje probubláváním extraktu dusíkem [17].

36

2.3.4 Polarografické stanovení Kondenzací kyseliny dehydroaskorbové s o-fenylendiaminem vzniká produkt, který

dává

redukcí

na

rtuťové

kapkové

elektrodě

dobře

vyvinutou

dvouelektrodovou vlnu. Přímo se tak stanoví kyselina dehydroaskorbová. Kyselinu askorbovou je nutno nejprve zoxidovat na kyselinu dehydroaskorbovou [18].

2.4 Stanovení vitaminů A a D pomocí HPLC Stanovení lipofilních vitaminů v potravinách zahrnuje několik následných kroků - přípravu vzorku, alkalickou hydrolýzu vzorku, extrakci vitaminů z hydrolyzátu a vlastní analytickou koncovku. Při alkalické hydrolýze jsou estery všech forem vitaminu A přeměněny na alkoholickou formu příslušného vitaminu a tuky (glyceridy a fosfolipidy) jsou hydrolyzovány na volné mastné kyseliny a glycerol, které mohou být separovány od vitaminů extrakcí organickými rozpouštědly. Vlastní hydrolýza

se provádí

ethanolickým roztokem hydroxidu draselného za přítomnosti antioxidantů pod zpětným chladičem po dobu nejméně 30 minut ve speciální zmýdelňovací aparatuře. Po celou dobu saponifikace se doporučuje probublávat celou aparaturu mírným proudem dusíku, který saturuje dané prostředí a preventivně chrání přítomné vitaminy před vzdušnou oxidací. Množství NaOH použitého k hydrolýze je závislé na množství tuku ve vzorku. Uvádí se, že na každý 1 g tuku je nutné použít 5 ml 60% roztoku NaOH a 15 ml ethanolu. Lipofilní vitaminy jsou extrahovány ze zmýdelněných vzorků potravin různými rozpouštědly a samotná extrakce vitaminů je vůbec jeden z nejdražších, nejpracnějších kroků a zdrojem největších chyb při analýzách lipofilních vitaminů. Jako organická rozpouštědla se používají diethylether, petrolether, hexan, diisopropylether-petrolether nebo 10% ethylacetát v hexanu. Účinnost extrakce hexanem vitaminu D z hydrolyzační směsi je ovlivněna koncentrací ethanolu v hydrolyzátu před vlastní extrakcí. Vitamin A je snadno extrahován do hexanu z vodno-ethanolického roztoku s přídavky vody, ale v případě vysokého obsahu tuku dochází k hydrolýze na soli mastných kyselin (mýdla) a poté se směs vodaethanol-mýdlo chová jako uhlovodíkové rozpouštědlo, konkuruje tak vlastnímu

37

organickému rozpouštědlu a snižování obsahu ethanolu (přídavkem vody) není již tak účinné. Aby se dosáhlo vysokých výtěžků vitaminu A ze zmýdelněné matrice do organického rozpouštědla, je nutné dodržet přesně koncentraci ethanolu ve vodné fázi mezi 30 a 40 %. Při spektrofotometrické detekci je absorpční maximum vitaminu A a jeho esterů 325 nm. Většina lipidů mám maximum absorpce pod 220 nm, konjugované mastné kyseliny mají maximum absorpce 230-235 nm (dieny) a 260-280 nm (trieny) a při stanovení neruší. Absorpční maximum vitaminu D je 264 nm [15].

38

3 CÍL PRÁCE Cílem předložené diplomové práce je optimalizovat metody extrakce a HPLC stanovení vitaminu C a vybraných lipofilních vitaminů na modelových soustavách a aplikovat optimalizované metody na reálných vzorcích potravin. Součástí toho je i zavedení optimalizovaných metod pro rutinní stanovení těchto vitaminů v laboratořích Ústavu technologie potravin (pracoviště N).

39

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Použité chemikálie a přístroje 4.1.1 Seznam použitých chemikálií Kyselina sírová p. a. (Fluka, Milano) Kyselina metafosforečná p.a. (Lachema, Brno) Acetonitril R chromasol pro HPLC (Sigma-Aldrich) Methanol HPLC (Lachema, Brno) Diethylether nestabilizovaný p. a. (Lachema, Brno) Kyselina L-askorbová p. a. (Fluka, Milano) Vitamin D (Sigma-Aldrich) Vitamin A-acetát (Sigma-Aldrich) EDTA (Lachema, Brno) Carrezův roztok I Carrezův roztok II Jód (Lachema, Brno)

4.1.2 Seznam použitých vzorků Kiwi Jahoda Paprika zelená Hrozen zelený Brokolice Mléko Vejce

4.1.3 Seznam použitých přístrojů a pomůcek HPLC chromatograf LCP 4100, ECOM s.r.o. s programátorem gradientu Detektor UV – VIS LCD 2083, ECOM s.r.o. Předkolona Watrex, Nucleosil 120-5 C18, velikost 10 x 4 mm

40

Kolona Watrex, Nucleosil 120-5 C18, velikost 250 x 4 mm Kolona Watrex, Ostion LG KS 0800 H+ 250 x 8 mm Dávkovací ventil typ D Termostat kolony typ LCO 101 Software Data Apex CSW 1.7 Ultrazvuk Notus Powersonic, typ PS 10000 Vakuová rotační odparka Kika-Werke RV 05-ST Vodní lázeň EL-20 (Merci, ČR) Váhy KERN ABJ 220 – 4M Kahan Běžné laboratorní sklo

4.2 Kyselina askorbová 4.2.1 Příprava mobilní fáze Jako mobilní fáze byla používána 0,01M H2SO4. Připravena byla z 96 % H2SO4 ředěním. 0,558 ml 96% H2SO4 bylo smícháno s 1 l destilované vody. Byla uchovávána při laboratorní teplotě, avšak bez přístupu světla z důvodu množení mikroorganismů.

4.2.2 Příprava extrakčního činidla Jako extrakční činidlo byla používána 3% HPO3. Byla připravena rozpuštěním krystalické HPO3 v destilované vodě. 15 g pevné HPO3 bylo smícháno s 0,5 l destilované vody, rozpuštěno pomocí ultrazvuku a přefiltrováno.

4.2.3 Příprava standardu Standard krystalické kyseliny L-askorbové byl uchováván v chladničce při teplotě 5 °C bez p řístupu světla. Pro kalibraci byly použity koncentrace kyseliny Laskorbové 5 mg, 10 mg a 20 mg/100ml v 3% HPO3. Roztoky byly měřeny ihned po přípravě.

41

4.2.4 Příprava jednotlivých vzorků 10 g vzorku bylo rozetřeno v třecí misce v prostředí 3% HPO3 a poté kvantitativně převedeno do odměrné baňky na 100 ml a doplněno 3% HPO3 po rysku. Obsah baňky byl přefiltrován skládaným filtrem a poté zfiltrován mikrofiltry s póry o velikosti 4 µm a následně 0,6 µm. Roztoky byly měřeny ihned po přípravě. Při přípravě vzorků nebyly použity žádné kovové nástroje z důvodu katalytické schopnosti kovů oxidovat kyselinu askorbovou.

4.2.5 Statistické vyhodnocení Každé měření bylo opakováno 3x. Statistické vyhodnocení provedl přímo program CSW.

4.2.6 HPLC – podmínky stanovení L-askorbové kyseliny kolona:

Ostion LG KS 0800 H+ 8x250 mm

mob. fáze:

0,01M H2SO4

průtok:

1 ml/min

teplota:

22 °C

prac. tlak:

6,5 MPa

nástřik:

20 µl

detekce:

UV, 254 nm

software:

Chromatography station for Windows ver. 1.7, Data Apex

hardware:

pumpa HPLC LCP 4100, Ecom s.r.o.

detektor:

UV LCD 2083, Ecom s.r.o.

standard:

k. L-askorbová

kalibrace:

5, 10 a 20 mg/100 ml

42

4.2.7 Jodometrické stanovení

4.2.7.1

Stanovení faktoru odměrného roztoku

K 1 ml standardního roztoku kyseliny askorbové (100 mg/100 ml) bylo přidáno 20 ml 2% roztoku HPO3, asi 0,5 ml škrobového mazu, a titrovalo se v titrační baňce 0,002M odměrným roztokem jódu do modrého zbarvení, které se nemění během 15 s. Výpočtem byl zjištěn faktor, který udává počet mg vitaminu C odpovídající 1 ml titračního činidla.

4.2.7.2

Stanovení kyseliny askorbové v reálném vzorku

10 g vzorku bylo rozetřeno v třecí misce v prostředí 2% HPO3 a převedeno do 100 ml odměrné baňky, přidáno 5 ml roztoku Carrez I, po promíchání 5 ml roztoku Carrez II a doplněno po rysku 2% HPO3. Roztok byl zfiltrován přes skládaný filtr do kádinky, filtrát pipetován 3x po 10 ml do titračních baněk. Ke vzorku bylo přidáno 20 ml 2% HPO3 a asi 0,5 ml škrobového mazu, titrováno 0,002M odměrným roztokem jódu do modrého zbarvení, které se nemění během 15 s. Ze tří stanovení se určila průměrná spotřeba titračního činidla a spočítán obsah vitaminu C ve vzorku.

4.3 Vitamin A 4.3.1 Příprava mobilní fáze Mobilní fáze je směsí acetonitrilu a methanolu v poměru 90:1. Míchání podle poměru provádí sám chromatograf.

4.3.2 Příprava standardu Standard vitaminu A byl uchováván v chladničce při teplotě 5 °C bez p řístupu světla. Pro kalibraci byly použity koncentrace vitaminu A 5 mg, 20 mg a 50 mg/l v diethyletheru. Roztoky byly měřeny ihned po přípravě.

43

4.3.3 Příprava jednotlivých vzorků 10 g vzorku bylo naváženo a vpraveno do destilační baňky s kulatým dnem, bylo přidáno 100 ml ethanolického roztoku KOH. Ve zmýdelňovací aparatuře pod zpětným chladičem probíhala alkalická hydrolýza po dobu 30 min. Poté se z vodno-ethanolického roztoku, kde koncentrace ethanolu byla 30 %, extrahoval vitamin A do diethyletheru v dělící nálevce. Takto získaný extrakt byl zakoncentrován destilací za sníženého tlaku ve vakuové rotační odparce. Zakoncentrovaný extrakt byl pak použit k analýze na HPLC.

4.3.4 HPLC – podmínky stanovení vitaminu A kolona:

Watrex, Nucleosil 120-5 C18, velikost 250 x 4 mm

předkolona:

Watrex, Nucleosil 120-5 C18, velikost 10 x 4 mm

eluce:

izokratická

mob. fáze:

acetonitril/methanol v poměru 90:1

průtok:

0,5 ml/min

teplota:

23 °C

prac. tlak:

6,1 MPa

nástřik:

3 µl

detekce:

UV, 325 nm

software:

Chromatography station for Windows ver. 1.7, Data Apex

hardware:

pumpa HPLC LCP 4100, Ecom s.r.o.

detektor:

UV LCD 2083, Ecom s.r.o.

standard:

vitamin A-acetát

kalibrace:

5, 20 a 50 mg/l

4.3.5 Statistické vyhodnocení Každé měření bylo opakováno 3x. Statistické vyhodnocení provedl přímo program CSW.

44

4.4 Vitamin D 4.4.1 Příprava mobilní fáze Mobilní fáze je směsí acetonitrilu a methanolu v poměru 90:1. Míchání podle poměru provádí sám chromatograf.

4.4.2 Příprava standardu Standard vitaminu D byl uchováván v chladničce při teplotě 5 °C bez p řístupu světla. Pro kalibraci byly použity koncentrace vitaminu D 10 mg a 20 mg/l v diethyletheru. Roztoky byly měřeny ihned po přípravě.

4.4.3 Příprava jednotlivých vzorků 10 g vzorku bylo naváženo a vpraveno do destilační baňky s kulatým dnem, bylo přidáno 100 ml ethanolického roztoku KOH. Ve zmýdelňovací aparatuře pod zpětným chladičem probíhala alkalická hydrolýza po dobu 30 min. Poté se z vodno-ethanolického roztoku, kde koncentrace ethanolu byla 30 %, extrahoval vitamin D do diethyletheru v dělící nálevce. Takto získaný extrakt byl zakoncentrován destilací za sníženého tlaku ve vakuové rotační odparce. Zakoncentrovaný extrakt byl pak použit k analýze na HPLC.

4.4.4 HPLC – podmínky stanovení vitaminu D kolona:

Watrex, Nucleosil 120-5 C18, velikost 250 x 4 mm

předkolona:

Watrex, Nucleosil 120-5 C18, velikost 10 x 4 mm

eluce:

izokratická

mob. fáze:

acetonitril/methanol v poměru 90:1

průtok:

0,5 ml/min

teplota:

23 °C

prac. tlak:

4,2 MPa

nástřik:

3 µl

detekce:

UV, 280 nm

45

software:

Chromatography station for Windows ver. 1.7, Data Apex

hardware:

pumpa HPLC LCP 4100, Ecom s.r.o.

detektor:

UV LCD 2083, Ecom s.r.o.

standard:

vitamin D2

kalibrace:

10 a 20 mg/100 ml

4.4.5 Statistické vyhodnocení Každé měření bylo opakováno 3x. Statistické vyhodnocení provedl přímo program CSW.

5 VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 Kyselina askorbová 5.1.1 Kalibrace Kalibrace chromatografu byla provedena na tři koncentrace L–askorbové, a to 5, 10 a 20 mg/100 ml v prostředí 3% HPO3 (graf č. 2). Eluční čas kyseliny Laskorbové byl za daných podmínek 6,15 min. U každého měření se eluční čas může lišit o desetiny minuty z důvodu manuálního ovládání nástřiku vzorku. Regresní přímku zobrazuje graf č. 3. Přesnost stanovení L-askorbové kyseliny závisí na podmínkách analýzy, především na použité mobilní fázi a teplotě. Mobilní fáze musí mít pH kolem 2, z důvodu rozkladu L-askorbové v prostředí s vyšším pH, teplota na koloně by se měla pohybovat kolem 22 °C (laboratorní teplota), p ři vyšších teplotách (od 30 °C výše) dochází k rozkladu již v koloně a vymyté píky absorbují při jiných vlnových délkách (graf č. 1). Dochází k vratnému rozkladu (pík v 5,7. minutě – kyselina dehydroaskorbová) a částečně i k nevratnému rozkladu (4. minuta – kyselina 4,5,5,6-tetrahydroxy-2,3-diketo-hexanová). Kyselina 2,3-diketogulonová (obr. č. 16) je ve vodném roztoku velmi málo stabilní, mění se velmi rychle na kyselinu 4,5,5,6-tetrahydroxy-2,3-diketo-hexanovou, proto se v roztoku, a tím i v chromatogramu nevyskytuje.

k. askorbová - 24 hod, 0,5% HPO3, 0,02M EDTA 0

mV

-5 -10 -15 -20 -25 0

2

4

6 min

Graf č. 1: Rozklad kyseliny L-askorbové

8

10

47

Graf č. 2: Kalibrace chromatografu na kyselinu L-askorbovou

Graf č. 3: Regresní přímka

48

Rovnice regresní přímky y = 615,382 x Korelační koeficient R = 0,9948

Pro stanovení kyseliny L-askorbové byla jako extrakční činidlo zkoušena také EDTA (graf č. 4), která omezuje vliv těžkých kovů na oxidaci kyseliny L-askorbové. Nakonec ale pro stanovení vzorků použita nebyla, protože při dané vlnové délce 254 nm vykazuje pík v podobném čase jako kyselina dehydroaskorbová.

Graf č. 4: EDTA

49

5.1.2 Vzorky Obsah vitaminu C byl měřen ve vybraných rostlinných vzorcích v době jejich konzumní zralosti (jahoda – graf č. 5, brokolice – graf č. 6, hrozen – graf č. 7, kiwi – graf č. 8, paprika – graf. č. 9). Naměřené hodnoty vitaminu C jsou srovnatelné s množstvím uváděným v literatuře [2] a jsou uvedeny v tabulce č. 2. Pík kyseliny L-askorbové se eluuje v 6. minutě, kolem 5. minuty je vidět pík kyseliny dehydroaskorbové, která je buď přítomna již v samotném vzorku nebo vzniká velmi rychlou oxidací z kyseliny L-askorbové při manipulaci se vzorkem. Kolem 3,5. minuty se eluuje již biologicky neúčinná kyselina 4,5,5,6- tetrahydroxy2,3-diketo-hexanová, která je patrná zejména na chromatogramu brokolice (graf č. 6). Kyselina dehydroaskorbová je dobře viditelná na chromatogramu hroznu (graf č. 7) v 4,99. minutě.

Graf č. 5: Jahoda

50

Graf č. 6: Brokolice (červeně brokolice čerstvá, modře převařená, zeleně vařená 10 min)

Graf č. 7: Hrozen

51

Graf č. 8: Kiwi

Graf č. 9: Paprika

52

Tab. č. 2: Obsah vitaminu C ve vzorcích naměřený chromatograficky, jodometricky a porovnání s literaturou ovoce/zelenina

Naměřený obsah

Jodometricky

Obsah vitaminu C v

vitaminu C v g/100g

g/100 g

HPLC

dle Velíška [2]

kiwi

64,7 ± 0,9

71,7 ± 4,4

70-127

jahoda

55,8 ± 0,9

61,4 ± 4,6

40-70

paprika

145,85 ± 1,8

152 ± 3,9

62-300

hrozen

1,7 ± 0,03

3,7 ± 1,4

2-5

148,02 ± 1,7

158 ± 4,0

110-113

65,9 ± 0,9

73 ± 3,8

42,5 ± 0,7

49 ± 4,1

brokolice čerstvá brokolice prošlá varem brokolice vařená 10 min

Velký rozsah hodnot vitaminu C obsaženého v konkrétní rostlině je dán odrůdou, stupněm zralosti a také způsobem skladování, protože vitamin C se během skladování oxiduje. Z toho důvodu bylo také nutné se vzorky pracovat rychle a co nejvíce zabránit přístupu vzduchu. Příprava vzorku je proto velice náročná a může být zdrojem mnoha chyb. Některé výsledky mohou být z tohoto důvodu nižší, protože nebylo k dispozici vybavení, které by dokonale zabránilo oxidaci (např. anaerobní prostředí, probublávání N2 apod.). Z měřených vzorků se jako nejlepší zdroj vitaminu C jeví brokolice, avšak už jen po převaření se obsah vitaminu sníží na méně než 50 % a po deseti minutách vaření v brokolici zůstane jen něco kolem 30 % původního množství. Na tomto příkladu je labilita vitaminu C jasně patrná. Při měření vitaminu C jodometricky byly výsledky o něco málo vyšší. Možným vysvětlením je to, že jodem se ztitrují veškeré redukující látky (např. polyfenoly), kdežto HPLC stanovíme jen L-askorbovou kyselinu. Dalším vysvětlením vyšších výsledků může být také vizuální indikace bodu ekvivalence, kdy oko není schopno rozeznat první změnu zbarvení.

53

5.2 Vitamin A Měření obsahu lipofilních vitaminů je složitější než hydrofilních, pro jejich charakter rozpustnosti v tucích, jejich polaritu a extrakční distribuční rovnováhy. Důležitý je i aspekt, že se lipofilní vitaminy nevyextrahují z matrice vždy ve 100 % množství, což záleží na metodě extrakce a použitých rozpouštědlech. Pro další měření byla použita technika, při níž se z matrice vyextrahuje co nejvíce lipofilního vitaminu. Souvisí to jak s obsahem tuku v matrici, tak i s koncentrací ethanolického roztoku KOH, který slouží k hydrolýze tuků. Ethanolický roztok KOH byl vždy připravován čerstvý, kvůli riziku vzniku K2CO3 reakcí KOH se vzdušným CO2, a také riziku vzniku ethanolátu draselného. Největší výtěžky vitaminů poskytovaly roztoky s koncentrací 35% ethanolického KOH při obsahu tuku do 4%, a s obsahem 48% ethanolického KOH při matrici s obsahem tuku nad 4%. Kalibrační křivka (graf č. 10) byla stanovena v rozsahu 5; 20 a 50 mg/l v rozpouštědle diethyletheru.

Graf č. 10: Regresní přímka

54

Rovnice regresní přímky y = 1,4286 x Korelační koeficient R = 0,9967

Chromatogram standardu vitaminu A o koncentraci 50 mg/l použitý ke kalibraci je v grafu č. 11.

Graf č. 11: Vitamin A - standard

Standard vitaminu A poskytuje dobrou odezvu, jen v 5. minutě je nepatrný rušivý pík, který zřejmě souvisí s čistotou standardu. Eluce v 10. minutě je ideální pro rychlost stanovení, i když předchozí extrakce a příprava vzorku dobu stanovení rapidně prodlužuje. Pokud máme vzorky vyextrahovány dopředu, můžeme za hodinu bez problémů změřit i pět vzorků. Regresní přímka, jejíž korelační faktor je 0,9967 je ideální, a to i pro tři použité body kalibrace.

55

Graf č. 12: Vitamin A - mléko

V grafu č. 12 je vidět pík vitaminu A v 9,48. min, odpovídá koncentraci 0,043 mg/100 g. Kromě toho jsou patrné i balastní látky, vyextrahované společně s měřeným vitaminem. V 30. minutě by se eluoval i vitamin D, ale ten je měřen při jiné vlnové délce (280 nm), takže ho v tomto chromatogramu i při prodloužení doby eluce na 30 min nedetekujeme (pouze jako nepatrný pík). Stanovit oba vitaminy zároveň by bylo možné při použití detektoru s diodovým polem, který by po detekci vitaminu A v 10. minutě automaticky přeprogramoval vlnovou délku z 325 nm na 280 nm.

56

Graf č. 13: Vitamin A vejce

Na chromatogramu (graf č. 13) je patrný dominantní pík vitaminu A, a také zvýšený obsah lipofilních balastních látek, které vnikají do extraktu. Z důvodu podobných velikostí molekul a podobným fyzikálně-chemickým chováním je nelze od vitaminu A dále oddělit (ani gelovou permeační chromatografií), ale protože nezatěžují pík vitaminu A rozmýváním, stanovení nevadí. Jeden z píků před desátou minutou by měl být β-karoten, ale protože nebyl k dispozici standard βkarotenu, nelze přesně určit který.

Tab. č. 3: Obsah vitaminu A ve vzorcích a porovnání s literaturou [2] Vzorek Naměřený obsah Obsah vit. A vitaminu A v

uváděný v literatuře

mg/100 g

v mg/100 g

Mléko

0,043 ± 0,0009

0,03-0,1

Vejce

0,067 ± 0,001

0,05-0,15

57

5.3 Vitamin D Kalibrace chromatografu pro vitamin D (graf č. 14) byla provedena na dvě koncentrace - 10 a 20 mg/100 ml.

Graf č. 14: Regresní přímka

Rovnice regresní přímky y = 0,59 x Korelační koeficient R = 0,9974

58

Graf č. 13: Vitamin D standard

Standard vitaminu D poskytuje poměrně čistou odezvu, bez rušivých píků, a pík samotného vitaminu D je ostrý a nerozmytý. Doba analýzy v 30. minutě je sice trochu delší oproti vitaminu C nebo A, ale tento nedostatek lze snížit zvýšením průtoku mobilní fáze za cenu většího opotřebení kolony a zhoršení detekčních limitů a ostrosti píku. Regresní přímka, jejíž korelační faktor je 0,9974, je vyhovující pro stanovení tohoto vitaminu v běžných druzích potravin. Kalibrační křivka je lineární i v případě vyšších koncentrací standardu, což ale není nutné použít, protože např. u vajec se extrakt ředí 10x. To znamená, že odezva detektoru se vejde do kalibrační křivky, což je jedna ze zásad správného analytického měření.

59

Graf č.14: Vitamin D mléko

V mléce (graf č. 14) je vitamin D také velmi dobře patrný a po extrakci poskytuje relativně vysoký signál. Ostatní píky jsou lipofilní látky, které se vyextrahovaly společně s vitaminem D a neruší stanovení, protože nezasahují do píku vitaminu D. Signál UV detektoru se v případě měření extraktu u mléka vejde do kalibrační křivky, takže není nutné extrakt nijak ředit.

60

Graf č. 15: Vitamin D vejce

Pro relativně vysoký obsah vitaminu D ve vejcích (graf č. 15) byl analyzovaný extrakt 10x ředěn, vyšší je i obsah balastních látek, což je patrné i na chromatogramu (píky před 30 minutou). Pík v 10. minutě je vitamin A, který se eluuje v jednom běhu. Z důvodu odlišné vlnové délky (325 nm), při které má několikasetnásobně menší absorbci, je z něj vidět jen nepatrný pík.

Tab. č. 4: Obsah vitaminu D ve vzorcích a porovnání s literaturou [2] Vzorky Naměřený obsah Obsah vitaminu D vitaminu D v µg/100g uváděný v literatuře v µg/100 g Mléko

0,762 ± 0,01

0,1

Vejce

3,541 ± 0,14

3-5

6 ZÁVĚR Předmětem práce bylo prozkoumat stabilitu kyseliny L-askorbové a vybraných lipofilních vitaminů, určit vhodné postupy pro jejich extrakci z matrice a optimalizovat jejich stanovení metodou HPLC. Diplomovou práci jsem řešila na Ústavu technologie potravin AF MZLU v Brně. Kyselina askorbová byla měřena na chromatografu a výsledky byly porovnávány titrační metodou s jodem. Byly použity vzorky ovoce a zeleniny (jahody, zelená paprika, zelený hrozen, kiwi a brokolice). Všechny naměřené hodnoty oběma metodami byly srovnatelné s literárními zdroji, což potvrdilo vhodnost zvolené metodiky, a to jak přesnější a rychlejší stanovení HPLC, tak i dostupnější stanovení pomocí jodu. Protože metoda HPLC pro stanovení kyseliny askorbové v jakýchkoliv vzorcích je jednoduchá, rychlá a přesná, je tedy možno zavést ji k běžnému a rutinnímu stanovení v široké praxi. Pro zjištění stability vitaminu C při vysokých teplotách, které působí na potraviny během kuchyňských úprav, byl zařazen také experiment s tepelnou úpravou zeleniny, konkrétně brokolice. Obsah kyseliny askorbové byl měřen v čerstvé, spařené a ve vařené brokolici. Bylo zjištěno, že více než dvě třetiny původního obsahu vitaminu jsou nenávratně ztraceny. Z toho vyplývá nezbytnost konzumovat ovoce a zeleninu v čerstvém stavu, při tepelných úpravách již dochází ke ztrátám vitaminu C, nejprve přeměnou na biologicky aktivní kyselinu dehydroaskorbovou a při dalším ohřevu až biologicky neaktivní kyselinu 4,5,5,6tetrahydroxy-2,3-diketo-hexanovou. Pro měření lipofilních vitaminů byly vybrány vitaminy A a D. Měření v reálných vzorcích mléka a vajec předcházela poměrně náročná metodika nalezení vhodného způsobu extrakce těchto vitaminů, s co největším koeficientem přestupu vitaminů do extraktu. Naměřené výsledky obsahu vitaminů v mléce a ve vejcích, odpovídaly hodnotám uváděným v odborné literatuře, a to i při použití mnou modifikovaného extrakčního postupu, který byl rychlejší a jednodušší, s velkou úsporou chemikálií. Použité metody pro extrakci jsou o něco složitější než u kyseliny askorbové, ale samotné stanovení pomocí chromatografu je opět snadné a metody lze tedy při stanovení vitaminů A a D v potravinách bez problémů využít.

62

7 LITERATURA [1]

ŠÍCHO V.: Potravinářská biochemie, Nakladatelství technické literatury, Praha 1969, 424s.

[2]

VELÍŠEK J.: Chemie potravin 2, Nakladatelství OSSIS, Tábor 2002, 320s.

[3]

MURRAY R. K., GRANNER D. K., MAYES P. A., RODWELL V. W.: Harperova biochemie, Nakladatelství a vydavatelství H+H, Jinočany 1998

[4]

PETRLOVÁ J., MIKELOVÁ R., ZEHNÁLEK J., KÍZEK R., VACEK J., KLEJDUS B., HAVEL L., JELEN F., KUBÁŇ V.: Analýza kyseliny askorbové pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí. In Sborník souhrnů sdělení XXXI. semináře o jakosti potravin a potravinových surovin. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno 2004, s. 13

[5]

KNOBLOCH

E.:

Fysikálně

chemické

metody

stanovení

vitaminů,

Nakladatelství Československé akademie věd, Praha 1956 [6]

KÁŠ J., KODÍČEK M., VALENTOVÁ O.: Laboratorní techniky biochemie, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Praha 2006

[7]

HERNÁNDEZ Y., LOBO M. G., GONZÁLES M.: Determination of vitamin C in tropical fruits: A comparative evaluation of methods, Food Chemistry 2006, vol. 96, s. 654-664

[8]

FIŠERA M.: Návody do cvičení z analytické chemie potravin, VUT Brno, 2001

[9]

CHURÁČEK J. a kol.: Analytická separace látek, SNTL, Praha 1990, 648s.

[10]

ŠTULÍK K., ŠEVČÍK J., PACÁKOVÁ V., JELÍNEK I., CUFAL P., BOSÁKOVÁ Z.: Analytické separační metody, Nakladatelství Karolinum, Praha 2004

[11]

KLOUDA P.: Moderní analytické metody, Pavel Klouda, Ostrava 1996, 128s.

[12]

SOMMER L.: Teoretické základy analytické chemie III, VUT Brno, 1995

[13]

CHURÁČEK J., HOLZBECHER Z. a kol.: Analytická chemie, SNTL, Praha 1987, 663s.

[14]

JANČÁŘOVÁ I., JANČÁŘ L.: Analytická chemie, MZLU, Brno 2003, 195s.

63

[15]

DOUŠA, Michal. News from HPLC analysis [online]. 1999 , poslední revize 15.3.2006 [cit. 2006-03-18]. Dostupný z WWW: <www.sweb.cz/hplc1>.

[16]

ŠULOVÁ R.: Stanovení vitaminu C (kyseliny askorbové) v ovoci a zelenině metodou HPLC. In Bulletin 2002, ročník VI, číslo 2/2002, Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský, laboratorní odbor, Brno 2002, s. 21-37

[17]

KRONĎÁK M., et al.: Coulometrické stanovení kyseliny askorbové [online]. Ústav analytické chemie VŠCHT Praha, 2006 [cit. 2006-03-26]. Dostupný z WWW: .

[18]

INGR M.: Diplomová práce, MZLU, Brno 1998

64

8 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK CRBP

retinol-vázající protein (retinol binding protein)

LDL

lipoprotein o nízké hustotě (low-density lipoproteid)

ATP

adenosintrifosfát

FMN

flavinmononukleotid

FAD

flavinadenindinukleotid

NAD

nikotinamidadenindinukleotid

NADP

nikotinamidadenindinukleotidfosfát

ACP

protein přenášející acyl

CoA

koenzym A

IF

vnitřní faktor (Intrinsic factor)

EDTA

ethylendiamintetraoctová kyselina

GLC

plynová rozdělovací chromatografie

GSC

plynová adsorpční chromatografie

LLC

kapalinová rozdělovací chromatografie

GPC

gelová permeační chromatografie

LSC

kapalinová adsorpční chromatografie

IEC

iontově výměnná chromatografie

PC

papírová rozdělovací chromatografie

TLC

tenkovrstvá rozdělovací chromatografie

HPLC

vysokoúčinná kapalinová chromatografie

RP

reverzní fáze (reverse phase)