Stanovení trichothecenových mykotoxinů v ječmeni a sladu

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav chemie

Stanovení trichothecenových mykotoxinů v ječmeni a sladu

Diplomová práce

Brno, 2007

Lenka Jedličková

Prohlašuji, že jsem při zpracování této diplomové práce vycházela pouze z uvedené literatury, vlastního výzkumu a z poznatků získaných v laboratořích Katedry analytické chemie Masarykovy univerzity v Brně a v laboratořích Výzkumného ústavu pivovarského a sladařského v Brně.

…………………. Lenka Jedličková

2

Děkuji Ing. Dagmar Gajdošové za odborné vedení a užitečné rady při řešení této diplomové práce. Dále děkuji Doc. Mgr. Janu Havlišovi, Dr. a doc. RNDr. Jiřímu Pazourkovi, PhD. za cenné připomínky a pomoc při získávání experimentálních dat a jejich vyhodnocení. Velké díky také patří všem pracovníkům a studentům Katedry analytické chemie Přírodovědecké fakulty MU v Brně, kteří mi vždy ochotně pomohli a vyšli vstříc.

3

OBSAH ÚVOD .........................................................................................................................9 CÍL PRÁCE ..............................................................................................................10 1 HISTORIE SEPARAČNÍCH METOD .................................................................11 1.1 Dělení chromatografie ..................................................................................12 2 VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE- HPLC ................13 2.1 Dělení HPLC.................................................................................................14 2.2 Kritéria separace látek...................................................................................16 2.3 Chromatografický systém .............................................................................20 2.3.1 Pumpy ......................................................................................................20 2.3.2 Dávkovací zařízení...................................................................................21 2.3.3 Kolona......................................................................................................21 2.3.4 Detektory..................................................................................................22 2.3.4.1 Spektrofotometrické detektory..........................................................22 2.3.4.2 Fluorimetrické detektory...................................................................22 2.3.4.3 Refraktometrické detektory ..............................................................22 2.3.4.4 Elektrochemické detektory ...............................................................23 2.3.4.5 Ostatní detektory...............................................................................23 3 ANALÝZY JEČMENE .........................................................................................24 3.1 Ječmen - botanika, fyziologie ječného zrna..................................................24 3.2 Ječmen - chemické složení ječného zrna, technologické vlastnosti .............27 3.3 Výroba sladu .................................................................................................28 4 MYKOTOXINY ....................................................................................................29 4.1 Trichothecenové mykotoxiny produkované rodem Fusarium......................33 4.1.1 Struktura a názvosloví..............................................................................33 4.1.2 Fyzikální a chemické vlastnosti ...............................................................34 4.1.3 Producenti a výskyt trichothecenů ...........................................................35 4.2 Rod Fusarium ...............................................................................................36 4.2.1 Výskyt v prostředí....................................................................................36

4

4.2.2 Toxicita ....................................................................................................37 4.3 Deoxynivalenol (DON).................................................................................39 4.3.1 Chemické a fyzikální vlastnosti deoxynivalenolu ...................................39 4.3.2 Legislativa................................................................................................40 4.3.3 Gushing ....................................................................................................41 4.4 Nivalenol (NIV) ............................................................................................42 4.4.1 Fyzikálně-chemické vlastnosti.................................................................42 4.5 3–Acetyldeoxynivalenol (3-AcDON) a 15-acetyldeoxynivalenol (15-AcDON) .................................................................................................43 4.5.1 Fyzikálně-chemické vlastnosti.................................................................43 4.6 Metody stanovení mykotoxinů .....................................................................44 4.6.1 Chromatografické metody analýzy mykotoxinů......................................44 4.6.1.1 Plynová chromatografie ....................................................................44 4.6.1.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie .......................................44 4.6.1.3 Tenkovrstvá chromatografie .............................................................44 4.6.2 Imunochemické metody analýzy mykotoxinů .........................................45 4.6.2.1 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) .............................45 5 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST .................................................................................46 5.1 Přístrojové vybavení a software....................................................................46 5.2 Materiál .........................................................................................................46 5.4 Analýza mykotoxinů (DON, NIV) metodou HPLC (Chromatografická kolona Phenomenex Luna C18 (2)) ..............................................................50 5.4.1 Výběr vlnové délky pro detekci...............................................................50 5.4.2 Optimalizace mobilní fáze .......................................................................51 5.4.3 Kalibrační křivky DON, NIV ..................................................................56 5.4.3.1 Výpočet limitu detekce .....................................................................58 5.4.4 Dlouhodobá a krátkodobá opakovatelnost...............................................59 5.5 Analýza 3-AcDON a 15-AcDON metodou HPLC (Chromatografická kolona Phenomenex Luna C18 (2)) ..............................................................62 5.5.1 Optimalizace složení a průtoku mobilní fáze...........................................62 5.6 Analýza cíleně infikovaných vzorků ............................................................69 5

5.6.1 Příprava vzorků.......................................................................................69 5.6.2 Stanovení DON v cíleně infikovaných vzorcích pomocí HPLC .............70 5.7 Stanovení DON v reálných vzorcích ............................................................75 5.7.1 Stanovení deoxynivalenolu pomocí HPLC..............................................75 5.7.2 Sledování vlivu přepěňování ječmene .....................................................77 5.7.2.1 Stanovení přepěňování ječmene za použití H2O2 a kyseliny gibberellinové (dle VÚPS)............................................................................77 5.7.2.2 Stanovení přepěňování sladu třídenním testem Carlsberg................77 6 DISKUZE ..............................................................................................................79 6.1 Možnosti Analýzy mykotoxinů metodou HPLC na chromatografické koloně Onyx Monolithic C18 ...................................................................................79 6.1.1 Optimalizace ............................................................................................79 6.1.2 Kalibrační křivky DON, NIV, 3-AcDON a 15-AcDON změřené na koloně Onyx Monolithic C18 ...........................................................................81 Výpočet limitu detekce .................................................................................85 7 ZÁVĚR ..................................................................................................................86 8 SEZNAM POUŽITÝCH ZNAČEK ......................................................................89 9 SEZNAM LITERATURY .....................................................................................90 10 PŘÍLOHY ............................................................................................................93

6

7

8

ÚVOD Vysokoúčinná

kapalinová

chromatografie

je

velice

významná

a nepostradatelná analytická metoda určená pro separaci široké škály látek. V této práci jsem se zabývala optimalizací podmínek pro separaci trichothecenových mykotoxinů (deoxynivalenol, nivalenol, 3-acetyldeoxynivalenol, 15-acetyldeoxynivalenol) v ječmeni a sladu. Mykotoxiny jsou toxické látky mikroskopických hub nebílkovinné povahy, toxické vůči člověku a nebo hospodářským zvířatům a k expozici jimi dochází proti vůli a zájmům člověka. Mezi hlavní producenty trichothecenových mykotoxinů se řadí plísně rodu Fusarium. Tyto plísně způsobují nemoc zvanou ,,Fusarium head blight“ (FHB), která je celosvětově rozšířená a jíž bývají napadeny zejména obiloviny. Důležitým následkem nemoci ,,Fusarium head blight“ je sklon infikovaného ječmene k přepěňování. Kvalita ječmene a sladu je důležitá zejména v potravinářství a to v oblasti sladařství a pivovarnictví. Přítomnost těchto mykotoxinů v ječmeni a sladu má negativní vliv jak na ekonomiku, jelikož snižují kvalitu výsledného produktu - piva, tak i na lidské zdraví. Konzumace obilí, které je takto napadené, vede ke zvyšování alergických reakcí, při dlouhodobější expozici k výskytu rakoviny, dále jsou známy svými imunosupresivními účinky a inhibicí syntézy proteinů. Mohou způsobovat nervové poruchy, zvracení, podráždění kůže, nechutenství a průjmy. Proto je nutné vyvinout rychlou metodu, pomocí které bude možné kvalitativně i kvantitativně stanovit mykotoxiny v obilí a zabránit tak proniknutí takto kontaminovaného ječmene do výroby. Odstraněním nekvalitního ječmene dojde ke zkvalitnění výroby sladu a následných produktů a zvýšení jejich zdravotní nezávadnosti.

9

CÍL PRÁCE Základním tématem diplomové práce byl vývoj a aplikace metody stanovení trichothecenových mykotoxinů v ječmeni a sladu. 1) Vývoj chromatografické separační metody pro stanovení jejich množství ve vzorcích ječmene a sladu dodaných Výzkumným ústavem pivovarským a sladařským a.s., Brno 2) Možnosti vyhodnocení závislosti obsahu mykotoxinů v ječmeni a sladu na přepěňování piva (gushingu)

10

1 HISTORIE SEPARAČNÍCH METOD Některé pochody, tvořící základ chromatografických metod, jsou známy velmi dlouho. Koncem devatenáctého a začátkem dvacátého století americký chemik a geolog Day studoval složení ropy a možnosti jejího vyčištění metodou, kterou bychom označili jako adsorpční frontální chromatografii [1]. Studiem pigmentů chloroplastů se proslavil ruský botanik a chemik Cvět. Zjistil, že se původní směs barviv dělí na barevné proužky podle míry adsorpce složek na adsorbent. Cvět nazval výsledek procesu chromatogram a metodu chromatografickou [1]. Tato metoda se však začala používat až poté, co v roce 1931 Kuhn, Lederer a Winterstein publikovali své práce o dělení karotenoidů [2]. V roce 1935 se zdařila první syntéza organického měniče iontů – vznikla iontově výměnná chromatografie. Tiselius a Claesson (1940) rozdělili chromatografické procesy do tří skupin, lišících se od sebe principem provedení a mechanismem probíhajících pochodů, a to na frontální, vytěsňovací a eluční chromatografii. Zavedení gradientové eluce v roce 1952 vedlo ke zlepšení chromatografických metod. Ve stejném roce byla udělena Martinovi a Syngemu Nobelova cena za chemii za objev rozdělovací chromatografie. Od roku 1936 jsou známy základy plynové adsorpční chromatografie [1].

Obr.1: Objevitel chromatografie M. S. Cvět [1] 11

1.1 DĚLENÍ CHROMATOGRAFIE Chromatografii můžeme dělit na základě různých hledisek [4]: 1) povaha mobilní fáze a) plynová (GC) b) kapalinová (LC) 2) způsob provedení a) kolonová (sloupcová) b) plošná (planární) 3) princip separace a) rozdělovací b) adsorpční c) iontově výměnná d) gelová 4) pracovní způsob a) eluční (analytická) b) frontální c) vytěsňovací 5) účel a) analytická b) preparativní (preparační)

12

2 VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE-

HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie patří mezi analytické separační techniky a slouží k separaci široké škály analytů. Tato metoda zaznamenala největší vzestup v polovině sedmdesátých let dvacátého století. Princip této metody spočívá v distribuci analytů mezi dvě fáze, ke kterým mají analyty různou afinitu. Jednou z fází je stacionární fáze, která bývá nejčastěji zakotvena na pevném nosiči uvnitř chromatografické kolony a druhou fází je mobilní fáze, která je pod vysokým tlakem protlačována pomocí vysokotlaké pumpy. Na rozhraní obou fází dochází neustále k adsorpci a desorpci analytů, což je hlavním hnacím mechanismem separačního procesu [4]. Na základě mechanismu separačního procesu dělíme kapalinovou chromatografii na pět základních technik [4]: -

adsorpční chromatografie – k dělení látek dochází v důsledku rozdílné adsorpční afinity analytů k stacionární a mobilní fázi. Analyt s větší afinitou ke stacionární fázi bude eluovat později nežli analyt s menší afinitou.

-

rozdělovací chromatografie – k dělení látek dochází v soustavě dvou nemísitelných nebo omezeně mísitelných kapalin, mezi něž se dělí látka podle rozpustnosti v jednotlivých fázích. Distribuce složek je určována rozdělovací (distribuční) konstantou KD.

-

iontově výměnná chromatografie (chromatografie na měničích iontů) – separační technika je založená na jednoduché výměně iontů v roztoku za vyměnitelný ion ionexu, který je elektrostatickými silami vázaný na nosiči.

-

gelová chromatografie – dochází k dělení na základě velikosti molekul separovaných látek, které prochází pórovitou (gelovou) fází.

-

afinitní chromatografie – metoda je založena na specifických interakcích, které jsou charakteristické pro některé biologické a biochemické procesy.

13

2.1 DĚLENÍ HPLC a) dle typu techniky HPLC Z hlediska použitých fází se dá HPLC rozdělit na techniku s „normální fází“ (normal-phase chromatography) a s „obrácenou fází“ (reverse-phase chromatography). U chromatografie s normální fází se jako stacionární fáze využívají látky polární povahy, např. silikagel, aminopropyl, kyanopropyl nebo dioly. Jako mobilní fáze se pak využívají méně polární látky (n-hexan, ethyl ether, chloroform). Chromatografie s normální fází je vhodná pro separaci více polárních sloučenin. Chromatografie s obrácenou fází využívá jako stacionární fázi nepolární látky, které jsou navázané na nosič. Tímto nosičem bývá většinou silikagel. Navázání

je

uskutečněno

reakcí

reaktivních

hydroxylových

skupin

organochlorosilanů na silikagel. Jako organické funkční skupiny jsou nejčastěji používány řetězce C8 nebo C18. Mobilní fáze je více polární a obvykle se používá směs vody s vhodným organickým rozpouštědlem, nejčastěji methanolem nebo acetonitrilem. Chromatografie na obrácených fázích se využívá pro dělení směsí látek málo až hodně polárních, které jsou rozpustné ve značně polárních rozpouštědlech. Patří mezi nejvíce využívané techniky HPLC [4, 5].

volný silanol

silanolová skupina s navázanou vodou

zdvojená silanolová skupina

siloxanová vazba

vodíkově vázaná silanolová skupina

Obr. 2: Modifikace povrchu silikagelu různými funkčními skupinami

14

b) dle typu eluce Kapalinovou chromatografii je možné rozdělit na základě použitého typu eluce. Ta může probíhat buď izokraticky nebo gradientově. Izokratická eluce je charakteristická tím, že je po celou dobu analýzy použita pouze jedna mobilní fáze s neměnným složením. Eluční síla mobilní fáze je stále stejná a při velkém množství analytů s různou polaritou může eluce trvat velmi dlouhou dobu [6]. Pro zkrácení doby analýzy je možné použít gradientovou eluci, při které je pro jednu analýzu použito více mobilních fází s různým složením a tedy různou eluční silou. Větší eluční síla je dosažena zvýšeným obsahem organické fáze. Při použití mobilní fáze s nejmenší eluční silou je vzorek nastříknut do systému. S postupnou změnou mobilních fází, a tedy se vzrůstající eluční silou, jsou z kolony v přijatelném čase eluovány i analyty s vysokou afinitou ke stacionární fázi, které by se jinak eluovaly příliš dlouho. Při analýze na chemicky vázaných nepolárních fázích se zpravidla používá gradient methanolu nebo acetonitrilu ve vodě[6]. Gradientová eluce se používá, když potřebujeme oddělit velký počet analytů s vysoce rozdílnou afinitou ke stacionární fázi a potřebujeme zachovat krátkou dobu analýzy a přijatelné rozlišení. Ve srovnání s izokratickou elucí je s gradientovou elucí dosaženo lepších parametrů separace, hlavně rozlišení [7].

15

2.2 KRITÉRIA SEPARACE LÁTEK Pro úspěšnou separaci je u kapalinové chromatografie zapotřebí dosažení krátké doby separace, tj. nízkého retenčního času všech analytů, dosažení dostatečného rozlišení a také tvaru píků připomínajících tvarem gaussovský pík [7]. Rozdělení dvou látek i a j charakterizujeme rozlišením Ri,j, které lze přímo vyhodnotit z chromatogramu jako rozdíl retenčních časů elučních maxim obou látek dělený součtem šířek chromatografického píku obou látek.

Obr. 3: Rozlišení píků analytů i a j (tR,i = retenční čas analytu i (v min), tR,j = retenční čas analytu j (v min), wi a wj = šířky píků analytů i a j při základně, ∆tR = rozdíl retenčních časů) [7] Rozlišením se myslí míra separace dvou píků, tj. vzdálenost středů dvou píků při základně. Dva píky jsou považovány za rozlišené, je-li hodnota rozlišení RS ≥ 1,5. Parametry separace se volí takové, aby byly píky i při krátkých dobách analýz co nejlépe rozlišeny [8].

R i, j = 2 ⋅

(t R , i − t R , j ) = wi + wj

2 ⋅ ∆ tR wi + wj

(1)

Tvar píku by se měl v ideálním případě shodovat s tvarem gaussovského píku. Často tomu tak není a píky mohou být rozmyté jak zepředu (fronting), tak i zezadu, což je častější jev (tailing) [8]. 16

Obr. 4: Tvary píků [8] a „frontující“ pík, b tvar podobný Gaussově křivce, c „chvostující“ pík A absorbance, t migrační čas Rozlišení i tvar píku jsou vlastnosti, které přímo určují účinnost kolony. Ta je dána počtem teoretických pater (N).

2

2

⎛ tR, j ⎞ ⎛ tR, j ⎞ ⎜ ⎟ ⎟ = 5,545⋅ ⎜ n = 16⋅ ⎜w ⎟ ⎜w ⎟ ⎝ j⎠ ⎝ 1/ 2, j ⎠

(2)

tR (retenční čas analytu), wj (šířka píku j při základně), w1/2,j (šířka píku v půlce výšky píku j) Teoretické patro kolony - místo, kde dochází k ustavení dynamické rovnováhy mezi stacionární a mobilní fází. Počet teoretických pater je vždy jiný v závislosti na uspořádání chromatografického systému (průtoková rychlost, typ stacionární fáze) a druhu analytu a je mírou účinnosti chromatografické kolony [4].

17

Výškový ekvivalent teoretického patra (H, HETP) – čím nižší je teoretické patro kolony a čím vyšší počet pater v koloně existuje, tím je kolona účinnější. Závisí na rychlosti průtoku mobilní fáze kolonou.

H ( HETP) =

L N

(3)

kde L je délka kolony, N je počet teoretických pater kolony. Výškový ekvivalent teoretického patra má rozměr délky a lze jej formálně označit jako délku kolony připadající na jedno teoretické patro [4]. Počet teoretických pater může být pokládán za jeden z hlavních ukazatelů jak a kde danou kolonu použít. Kolona je považována za „dobrou“ v případě, že N je vysoké a H (HEPT) je malé. Zóny dělených látek (analytů) se během postupu kolonou

rozšiřují.

Děje

probíhající

v koloně

během

separace

popisuje

van Deemterova rovnice (4), která odhaluje děje mající vliv na rozšiřování zón

analytu. Výškový ekvivalent teoretického patra (H) závisí na lineární rychlosti mobilní fáze (u) a může být rozdělen do několika složek : H = Hv+ Hp + Hs + Hm Příčiny rozdělování zón [9]:

1. Vířivá difúze (HV) - různé molekuly musí urazit různé vzdálenosti. 2. Podélná molekulární difúze (HP) - molekuly putují z místa o vyšší koncentraci do místa o nižší koncentraci. 3. Odpor proti přenosu hmoty ve stacionární fázi (HS) - různé molekuly difundují různě hluboko do stacionární fáze. 4. Odpor proti přenosu hmoty v mobilní fázi (HM) - rychlostní profil mobilní fáze uvnitř kanálku je parabolický.

18

V praxi se více používá zkráceného tvaru Van Deemterovy rovnice, kde je vyjádřena závislost H na střední lineární rychlosti toku mobilní fáze u.

B H = A+ + C ⋅ u u

(4)

kde A, B a C jsou konstanty pro daný chromatografický systém (složkamobilní fáze-kolona) a pro danou teplotu [9].

Obr. 5: Van Deemterova křivka Minimum křivky odpovídá optimální průtokové rychlosti. Daná kolona vykazuje při této rychlosti největší účinnost [8].

19

2.3 CHROMATOGRAFICKÝ SYSTÉM Základní zařízení pro kapalinovou chromatografii je tvořeno pumpou, kolonou, detektorem, odplyňovačem mobilní fáze, nádobou na mobilní fázi, termostatem, septem pro nástřik vzorku, dávkovacím zařízením a vyhodnocovacím mechanismem, nejčastěji PC.

Obr. 6: Chromatografický systém [9]

2.3.1 Pumpy Pumpy musí být vysokotlaké, průtok musí být konstantní, reprodukovatelný a bezpulsní. Jeho hodnoty se pohybují v nl.min-1 pro kapilární kolony, v µl.min-1 pro mikronáplňové kolony a v ml.min-1 pro běžné náplňové kolony. Pro malé průtoky se používají pístová čerpadla, jejichž výhodou je zejména bezpulsní chod. Nevýhodou je nutnost přerušení analýzy při znovu naplnění [7]. Nejpoužívanějším typem vysokotlakých pump jsou pístové dvoučinné (reciprokační) pumpy. Jejich nevýhoda, pulsní chod, se kompenzuje použitím dvou nebo více čerpadel současně, přičemž jejich písty se nepohybují rovnoměrně, ale parabolicky s časem a jejich činnost je fázově posunuta. Objem jednoho válce se pohybuje v rozmezí od 40 do 400 ml. V okamžiku, kdy jeden píst nasává kapalinu, druhý píst kapalinu vytlačuje skrz ventil do kolony a naopak. Touto pumpou je možné dosáhnout velmi stabilního a konstantního tlaku, který se pohybuje v desítkách až stovkách atmosfér [7]. 20

2.3.2 Dávkovací zařízení Téměř výhradně se používají dávkovací ventily se smyčkou. Nejčastěji se používají šesticestné ventily s výměnnou smyčkou, která se naplní injekční stříkačkou. Objem smyčky se obyčejně pohybuje od desítek nanolitrů po mililitry. Dávkování je reprodukovatelné a lze jej i automatizovat [7].

Obr. 7: Schéma šesticestného ventilu se smyčkou [10]

2.3.3 Kolona Kolona je obvykle vyrobena z nerezové oceli (stainless steel type 316), vyskytují se však také kolony plastové či skleněné. Kolona je naplněna stacionární fází. Jako stacionární fáze je používán silikagel nebo oxid hlinitý (Al2O3), různé druhy gelů, fáze vázané na silikagel nebo na oxid hlinitý, nebo materiály s póry o kontrolované velikosti. Obal kolony musí být schopen odolávat tlakům v řádech desítek až stovek atmosfér a musí být chemicky inertní. Délka kolony se nejčastěji pohybuje od 50 – 250 mm a má vnitřní průměr 2,6 – 3 mm nebo 4,6 – 5 mm [4]. Dalším typem kolon je monolitická kolona. Monolitické stacionární fáze jsou nové typy chromatografických stacionárních fází, které jsou na rozdíl od klasickým náplňových chromatografických kolon tvořeny jedním kusem různě pórovitého materiálu. Tento materiál, který může být jak anorganického tak i organického charakteru, umožňuje rychlejší průtok mobilní fáze kolonou při zachování účinnosti plněných kolon. Abychom zamezili kontaminaci kolony mechanickými nečistotami, vkládáme před hlavní kolonu ještě tzv. předkolonku, která má případné nečistoty zadržet [4]. 21

2.3.4 Detektory Detektor je zařízení monitorující zóny analytu vycházejících z kolony a tím koncentrace odpovídajících separovaných látek. Intenzitu signálu v závislosti na čase poté reprodukuje v podobě chromatografických píků. Je umístěn bezprostředně za kolonu, aby bylo možné detekovat analyty bezprostředně po eluci z kolony. Detektor by měl mít malý objem, aby co nejméně přispíval k rozmytí elučních křivek. Signál detektoru by měl být stabilní a reprodukovatelný, lineárně závislý na koncentraci v co nejširším rozsahu. Citlivost detektoru by měla být co největší a mez detekce co nejnižší. Signál by měl mít co nejnižší šum a neměl by obsahovat drift [7]. 2.3.4.1 Spektrofotometrické detektory

Spektrofotometrické detektory patří mezi nejpoužívanější detektory v HPLC. Jsou jednoduché, spolehlivé a lze s nimi detekovat poměrně velké množství látek. Základním požadavkem je nízká absorbance použité mobilní fáze při daných vlnových délkách. Nejčastěji se používají detektory s diodovým polem (Diode Array Detector), které opakovaně zaznamenávají celá spektra během průchodu látky kyvetou [7]. 2.3.4.2 Fluorimetrické detektory

Tento typ detektorů je velmi selektivní pro látky, které mají přirozenou fluorescenci nebo je lze na fluoreskující deriváty převést. Je asi o 3 řády citlivější než spektrofotometrické detektory [7]. 2.3.4.3 Refraktometrické detektory

Refraktometrické detektory patří mezi nejuniverzálnější detektory. Měří se rozdíl indexů lomu solutu v mobilní fázi proti mobilní fázi. Vzhledem k tomu, ze tyto rozdíly jsou velmi malé, jsou refraktometrické detektory málo citlivé. Mezi další nevýhody patří například závislost indexu lomu na teplotě a použití pouze izokratické eluci [7].

22

2.3.4.4 Elektrochemické detektory

Tento typ detektorů je založen buď na měření vodivosti nebo elektrického proudu odpovídajícího oxidaci nebo redukci analytů. Jsou velmi selektivní a citlivé [7]. 2.3.4.5 Ostatní detektory

Pro speciální aplikace analýz kovů se používají kombinace s AAS nebo se používá ICP ve spojení s AES nebo MS. Pro analýzu proteinů se používá spojení HPLC-NMR nebo např. HPLC-MS [7].

23

3 ANALÝZY JEČMENE Ječmen patří spolu s pšenicí mezi nejstarší obiloviny a počátky jeho pěstování se datují do období 10 000 let př.n.l., a to zejména do oblasti Babylonie a Egypta. V Evropě se ječmen začal pěstovat v období 7 000 – 4 000 let př.n.l., což je spojeno s migrací obyvatelstva ze severní Afriky do západní Evropy. V 17. stol. se postupně začal místo pšenice používat ke sladování ječmen, což vedlo k velkému rozmachu při stavbě sladoven [11]. V roce 1884 vznikla jedna z nejvýznamnějších světových odrůd sladovnického ječmene, Proskowetz Hana pedigree, vyšlechtěná individuálním výběrem Emanuela Proskowetze z hanácké krajové provenience v Kvasicích na Kroměřížsku. Tato odrůda se pěstovala nejen u nás, ale i v zahraničí až do poloviny 20. století. Pro výrobu sladu a sladových výtažků se na našem území pěstují vybrané odrůdy jarního, dvouřadého, ječmene (Hordeum distichum var. nutans), které patří k nejkvalitnějším odrůdám na světě. Pro každý rok musí být odrůdy sladovnických ječmenů schváleny na základě technologických zkoušek a pouze tyto odrůdy jsou potom povoleny [12]. Mezi odrůdy s výběrovou sladovnickou jakostí patří Jersey, Kompakt, Prestige, Scarlett, Tolar a Sabel (sklizeň roku 2003) [11].

3.1 JEČMEN - BOTANIKA, FYZIOLOGIE JEČNÉHO ZRNA Ječmen (rod Hordeum) patří do říše rostlin, oddělení semenných (Spermatophyta),

pododdělení

krytosemenných

(Angiospermae),

třídy

jednoděložních (Monocotyledonae), čeledi lipnicovité (Poaceae) [13]. Podle způsobu růstu se ječmeny dělí na divoce rostoucí plané ječmeny, patřící do podtřídy spontaneum a na seté ječmeny, které patří do podtřídy vulgare. Kulturní ječmeny se dále dělí na ječmeny dvouřadé a víceřadé. Dvouřadé ječmeny se dělí do tří skupin: na ječmeny nící, ječmeny vzpřímené a ječmeny paví, jenž tvoří hlavní skupinu sladovnického ječmene (Hordeum distichum, var. nutans, podle novějšího taxonomického zařazení H. vulgare var. butane, pro šestiřadý ječmen H. vulgare var. pallidum). Zrna těchto ječmenů jsou přirostlá ke klasovému vřetenu,

24

takže osiny jsou souběžné. Klas během zrání háčkuje, na rozdíl od ječmene vzpřímeného. Ječmeny paví mají vějířovitě uspořádané osiny [11]. Pro výrobu sladu se využívá ječné zrno (obilka), která se skládá z obalových částí (pluch a plušek) a zárodku (klíčku a embrya). Ze zárodku vycházejí během klíčení podněty k aktivaci enzymů v celém zrnu. Ječné zrno se dále skládá z endospermu. Endosperm se skládá z vrstvy aleuronových buněk a z moučného jádra. Aleuronová vrstva obsahuje tuk a nejvíce bílkovin, jejich biologická hodnota je však relativně nízká z důvodu malého obsahu lysinu. Zásobní bílkoviny (lepková frakce) mají význam pro pekárenskou hodnotu mouky. Moučné zrno obsahuje škrob ve formě škrobových zrn, jenž jsou typické pro každý druh obilovin, a které zaujímají největší část obilky a jsou hlavním zdrojem zásobních sacharidů, proteinů a dalších složek, které jsou nutné při vytváření charakteristických vlastností sladu [11]. U sladovnického ječmene se posuzují pěstitelské a sladařské vlastnosti. Mezi pěstitelské vlastnosti patří výnos, odolnost a náročnost, mezi sladařské vlastnosti patří chemické složení a vhodnost pro výrobu sladu. Tyto vlastnosti se rozdělují na fyziologické, mechanické a fyzikálně-chemické. Z fyziologických znaků je důležitá klíčivost a klíčivá energie, které udávají procentický podíl zrn schopných vyklíčit za stanovených podmínek během 3 až 5 dnů. Mezi nejdůležitější mechanické znaky patří absolutní hmotnost 1000 zrn, podíl zrn nad sítem 2,5 mm a zejména odrůdová čistota a homogenita dodávaných částí. Důležitým parametrem je i co nejnižší podíl cizích a biologicky poškozených zrn, plesnivých zrn a zrn se zahnědlými špičkami, která mohou být původcem samovolného přepěňování piva (tzv. primární přepěňování) [11].

25

Stavba obilného zrna [11]

Zrno je tvořeno obalovými vrstvami, endospermem a klíčkem (zárodkem) [14].

Obr. 8: Příčný a podélný řez zrnem ječmene Obaly: 1–hřbetní plucha, 2–břišní plucha, 3–oplodí, 4–osemení, 5–nervové svazky Endosperm: 6-aleuronové buňky, 7-škrobové buňky, 8-prázdné buňky Zárodek: 9-štítek, 10-sací epitel, 11-pochva štítková (scutela), 12-pochva kořínková (coleorhysa)

26

3.2 JEČMEN - CHEMICKÉ SLOŽENÍ JEČNÉHO ZRNA, TECHNOLOGICKÉ VLASTNOSTI Při chemickém rozboru ječmene se sleduje především obsah vody, škrobu, celkových extraktivních látek a bílkovin. Kvalitní odrůdy sladovnických ječmenů zpravidla obsahují 62-65% škrobu v sušině. Ječný škrob obsahuje větší podíl rozvětveného amylopektinu (~ 80%) s 1,4- a 1,6-glykosidickými vazbami, než lineární amylosy (~ 20%) s pouze 1,4-glykosidickými vazbami. Kromě amylosy a amylopektinu obsahuje ječný škrob asi 3% příměsí tvořených dusíkatými a minerálními složkami [15, 16]. Ječný škrob je v endospermu zrna lokalizován ve škrobových zrnkách (granulích), které se podle své velikosti dělí na [11]: a)

Větší granule eliptického tvaru o velikosti až 40 µm, které představují až 90% hmotnosti škrobu a obsahují okolo 75% amylopektinu. Jsou snadněji enzymově štěpitelné.

b)

Menší granule sférického tvaru o velikosti 1-10 µm, které tvoří jen 10% hmotnosti škrobu a obsahují ještě větší podíl amylopektinu. Jsou částečně vázané na bílkoviny a enzymově jsou hůře štěpitelné.

Každé zrno je obaleno mikroskopickými vrstvami bílkovin, lipoproteinů a lipidů. Okolo 10% hmotnosti ječného zrna tvoří neškrobové polysacharidy, hlavně celulosa, hemicelulosa, pentosany a lignin. Celulosa tvoří hlavní stavební složku obalových pluch, hemicelulosy se podílejí na stavbě a pevnosti buněčných stěn. Endospermální hemicelulosy jsou složeny ze 75% z ß-glukanů a 25% pentosanů. Zvýšený obsah ß - glukanů v ječmeni a ve sladu má za následek obtížné sladařské a pivovarské zpracování a to zejména kvůli snížené přístupnosti škrobových zrn enzymům, zvyšováním viskozity roztoků a snížením koloidní stability piva. Nízkomolekulární sacharidy, zastoupené hlavně maltosou, sacharosou, rafinosou, glukosou a fruktosou, jsou přítomny jen v nepatrném množství [11, 16]. Bílkoviny jsou v ječném zrnu obsaženy ve formě rozdílně rozpustných frakcí albuminů, globulinů, hordeinů, glutelinů a jejich štěpů a jejich obsah má být v optimálním rozsahu 10,5 až 11,5%. Nebílkovinné dusíkaté složky, např. dusíkaté báze, fosfatidy a amidy, tvoří jen nepatrný podíl a jsou přítomné převážně v klíčku. Z technologického hlediska dalšího zpracování jsou důležitými složkami ječmene enzymy, které jsou přítomné jak v latentní, tak v aktivní formě. Převažují zde

27

hydrolytické enzymy (amylolytické, proteolytické, cytolytické enzymy a fosfatasy). Dusíkaté složky ječného zrna výrazně ovlivňují technologii jeho zpracování na slad i pivovarskou technologii a kvalitu vyrobeného piva [11]. Ječmen dále obsahuje jak peptidy, volné aminokyseliny, polyfenolové látky, tak i řadu vitamínů a minerální látky, z nichž jsou velmi důležité fosforečnany. Ze sladařsko-pivovarského hlediska jsou nejdůležitějšími složkami ječmene a následně i sladu sacharidy, zejména ty, které přejdou do rozpustné a zkvasitelné formy, dále dusíkaté látky s enzymy, polyfenolové a minerální látky včetně stopových prvků a vitamínů. Ječmen není schopen ihned po sklizni klíčit a po dobu několika týdnů po sklizni nastává tzv. období fyziologického dozrávání (dormancie ječmene), po tomto období je ječmen i tzv. citlivý na vodu, někdy se této vlastnosti říká II. dormancie. Během této doby dochází oxidačními procesy v zrnu k odbourání přítomných inhibitorů klíčení a současně dochází k aktivaci stimulátorů klíčení. Důležitý je proto přístup kyslíku ke skladovanému zrnu, které se z tohoto důvodu musí pravidelně provětrávat. Dormancii lze snížit i fyzikálně-chemickými zákroky, např. sušením ječmene horkým vzduchem, máčením ječmene ve vodě sycené kyslíkem či obsahující chemická činidla (kyselinu gibberellinovou nebo látky s -SH skupinami). Dormancie ječmene je odrůdovou vlastností a je závislá i na půdních a klimatických podmínkách pěstování. Odrůdy ječmene s dlouhou dobou posklizňového dozrávání mají většinou nízký obsah enzymů a poskytují méně kvalitní slady [11,16].

3.3 VÝROBA SLADU Pro výrobu sladu jsou základními surovinami ječmen a voda, pro výrobu piva navíc chmel či chmelové výrobky, případně náhražky sladu. Teoreticky je možné sladovat více druhů obilí, prakticky se však používá pouze sladovnický ječmen a v zahraničí v malé míře i pšenice k výrobě pšeničného sladu určeného pro výrobu pšeničných piv [16]. Voda je ve sladařském a pivovarském průmyslu důležitou surovinou, neboť přímo ovlivňuje kvalitu piva a má i jinak široké uplatnění a spotřebuje se jí celkově velké množství. Důležitým kritériem posuzování kvality vody je tvrdost vody. Z technologického hlediska je důležité, že některé ionty svými reakcemi s fosforečnany ječmene a sladu způsobující snížení či zvýšení pH rmutu, sladiny 28

a mladiny. Cílem sladování je vyrobit řízeným procesem klíčení a hvozdění z ječmene slad, obsahující potřebné enzymy a aromatické i barevné látky nezbytné pro výrobu určeného druhu piva. Principem sladování je vytvoření optimálních podmínek pro klíčení ječmene (v zrnu dochází k aktivaci a tvorbě technologicky důležitých enzymů) při zamezení ztrát potlačením růstu. Tím vzniká zelený slad, který je následným hvozděním, kde působením vyšších teplot vyvolávají chemické reakce tvorby aromatických a barevných látek, přeměněn ve slad [16].

4 MYKOTOXINY Mykotoxiny

jsou

toxické

sekundární

metabolity

řady

druhů

mikroskopických vláknitých hub (plísní), které mohou kontaminovat široké spektrum potraviny a krmiv. Producenti těchto nebezpečných kontaminantů vyvolávají různé toxické syndromy, které se souhrnně nazývají mykotoxikózy [17]. K tvorbě mykotoxinů dochází po fázi aktivního růstu hub. Některé metabolity tvoří více chemicky příbuzných entit, jiné pouze jednu nebo velmi omezený počet. Mykotoxiny představují velmi pestrou skupinu sloučenin, jejichž relativní molekulová hmotnost obvykle nepřesahuje 500 Da a většina těchto látek má lipofilní charakter. Kumulují se v tukových frakcích rostlin a zvířat. V současné době je známo kolem 350 druhů toxinogenních plísní. Produkce mykotoxinů je silně závislá na genotypu organismu a na fyzikálně-chemických faktorech. Mezi hlavní fyzikální faktory, které jsou důležité pro biosyntézu mykotoxinů patří teplota a vodní aktivita. Mezi chemické faktory ovlivňující tvorbu mykotoxinů patří dostatečné množství látek, které houby využívají pro zahájení metabolismu. V případě nadbytečného množství těchto látek nedochází k aktivaci enzymatických systémů v houbě, což vede k významnému snížení produkce sekundárních metabolitů. Důležitým biologickým faktorem, který ovlivňuje biosyntézu sekundárních metabolitů je stáří kultury [18].

29

Důležité aspekty produkce mykotoxinů [18]:

1. Určitý mykotoxin může být produkován zástupci několika rodů toxinogenních hub 2. Více mykotoxinů může být syntetizováno jedním druhem hub 3. Jeden mykotoxin může produkovat více rodů a druhů hub 4. Identifikace hub v produktech rostlinné výroby ještě neznamená nutnou přítomnost mykotoxinů 5. Ne všechny kmeny potenciálně toxinogenních hub jsou toxinogenní. Klasifikace mykotoxinů:

Mykotoxiny lze rozdělit podle velkého množství kritérií. Žádné z dosud používaných však nelze považovat za univerzálně použitelné. Nejjednodušší je rozdělení podle chemické struktury. Jeho výhodou je poměrně snadné a jednoznačné zařazení jakékoli látky o známé chemické struktuře. Z hlediska toxikologické praxe má velký význam dělení podle toxicity. Dalším možným hlediskem je dělení podle způsobu biosyntézy. Jeho výhodou je velice dobré postižení vztahu k produkujícímu organismu a do určité míry respektuje i vztahy dané chemickou strukturou [19]. a) Chemické dělení mykotoxinů [19]

Furanofurany Substituované pyreny a hydroxypyreny Substituované chinony

aflatoxiny, sterigmatocystin, versicolorin kyselina koji, sekalonové kyseliny luteoskyrin, rubratoxin, xanthomegnin, viridicatumtoxin patulin, kyselina penicillová, kyselina

Nenasycené laktony

mykofenolová, alternariol, citreoviridin, ochratoxiny, rubratoxin B, 4,5,8-trimetylpsoralen

Griseofulviny

griseofulvin T-2 toxin, diacetoxyscirpenol, deoxynivalenol,

Epoxytrichotheceny

nivalenol, fusarenony, verrucariny, roridiny, satratoxiny

30

Polycyklické substituované indolové deriváty Cyklické dipeptidy

kyselina cyklopiazonová, paspaliny, penitremy gliotoxin, sporidesminy, roquefortin, fumitremorgen, verruculogeny, brevianamidy zearalenon, curvularin, citrinin, PR-toxin,

Mykotoxiny jiné struktury

canthecellin, moniliformin, kyselina betanitropropionová

b) Dělení mykotoxinů podle způsobu biosyntézy [19]

Biosyntéza moniliforminu Biosyntéza z polyketidů

moniliformin (z kyseliny octové) patulin, ochratoxin, emodin, kyselina sekalonová, aflatoxiny

Biosyntéza z isoprenoidů

trichotheceny, roquefortiny

Biosyntéza z aminokyselin

kyselina cyklopiazonová, cyklické dipeptidy

c) Dělení mykotoxinů podle toxicity - kvantitativní [19]

Silně toxické

aflatoxiny, patulin, luteoskyrin, sporidesminy, T-2 toxin ochratoxin A, cyklochlorotin, zearalenon (F-2 toxin), diacetoxyscirpenol, citreoviridin, rubratoxiny

Středně toxické

citrinin, kyselina penicillová, sterigmatocystin, kyselina cyklopiazonová

Slabě toxické

griseofulvin, kyselina koji, trihothecin, kyselina mykofenolová, chaetomin

31

d) Dělení mykotoxinů podle toxicity – kvalitativní [19]

Hepatotoxiny

aflatoxiny, sporidesminy, luteoskyrin, sterigmatocystin

Nefrotoxiny

ochratoxin A, citrinin

Toxiny zažívacího traktu

T-2 toxin další trichotheceny

Neurotoxiny a myotoxiny

tremorgeny (např. penitrem A), citreoviridin

Dermotoxiny

verrucariny, psoraleny, sporidesminy, trichotheceny

Toxiny dýchacího traktu

patulin

Genitotoxiny

zearalenony

Imunotoxiny

aflatoxiny, ochratoxin A, trichotheceny

e) Rozdělení podle účinku na buňku [19]

Inhibitory tvorby energie

citreoviridin, luteoskyrin, xanthomegnin, moniliformin

Inhibitory proteosyntézy

trichotheceny, ochratoxin A

Modifikátory cytoskeletu

griseofulvin, cytochalasiny, cyclochlorotin

Estrogenní mykotoxiny

zearalenon

Tremorgeny

penitremy, fumitremorginy, verruculogeny

Karcinogenní mykotoxiny

aflatoxin B1

32

4.1 TRICHOTHECENOVÉ MYKOTOXINY PRODUKOVANÉ RODEM FUSARIUM Skupina trichothecenových mykotoxinů patří mezi nejznámější toxiny produkovanými houbami rodu Fusarium. Produkce trichothecenů byla prokázána iu

některých

kmenů

rodu

Myrothecium,

Trichoderma,

Trichothecium,

Cylinrocarpon, Phomopsis, Verticimonosporium a Stachybotrytys [20].

4.1.1 Struktura a názvosloví Trichotheceny se odvozují od základního skeletu prvního známého členu této skupiny – trichothekanu. Trichotheceny mají tetracyklickou seskviterpenovou strukturu, zahrnující šestičlenný heterocyklus s kyslíkem, epoxyskupinu v poloze C-12, C-13 a dvojnou vazbu v poloze C-9, C-10. Souhrnně se proto označují jako 12, 13-epoxy-9-trichotheceny [21]. Trichotheceny lze obecně rozdělit do dvou skupin: a) alkoholderiváty trichothecenů a jejich jednoduché estery b) složitější makrocyklické diestery a triestery

Častějším způsobem klasifikace je dělení podle přítomných funkčních skupin [21]: 1. typ A obsahující na uhlíku C-8 jinou funkční skupinu než ketonickou 2. typ B, kde je na uhlíku C-8 karbonylová skupina 3. typ C, který mimo epoxyskupiny v poloze C-12, C-13 také obsahuje

další epoxyskupiny v poloze C-7 a C-8 nebo C-8 a C-9 4. typ D s makrocyklickým kruhovým systémem mezi C-4 a C-15 spojený

esterovými vazbami

Obr. 9: Strukturní vzorce základního skeletu fusariových mykotoxinů

33

Tab. 1: Funkční skupiny nejvýznamnějších mykotoxinů [21] Mr

R1

R2

R3

R4

R5

Diacetoxyscirpenol

366

OH

OAc

OAc

H

H

HT-2 toxin

424

OH

OH

OAc

H

OCOCH2CH(CH3)2

T-2 toxin

466

OH

OAc

OAc

H

OCOCH2CH(CH3)2

Neosolaniol

382

OH

OAc

OAc

H

OH

Deoxynivalenol

296

OH

H

OH

OH

-

3-Acetyl

338

OAc

H

OH

OH

-

Nivalenol

312

OH

OH

OH

OH

-

Fusarenon-X

354

OH

OAc

OH

OH

-

15-Acetyl

338

OH

H

OAc

OH

-

Trichotheceny Typ A

Typ B

deoxynivalenol

deoxynivalenol

4.1.2 Fyzikální a chemické vlastnosti Trichotheceny jsou bezbarvé, opticky aktivní, většinou krystalické pevné látky. Jsou termostabilní do teploty 120 °C, středně stabilní při teplotě 180 °C a rozkládají se během 30-40 minutového působení teplot kolem 200-210 °C [20, 21]. Trichotheceny typu A jsou rozpustné v mírně polárních rozpouštědlech jako je chloroform, diethylether a ethylacetát, zatímco více polární trichotheceny typu B vyžadují více polární rozpouštědla (např. směsi methanol-voda, acetonitril-voda). Většina trichothecenů nemá ve své struktuře konjugované nenasycené vazby s výjimkou uhlíku C-9, z něhož vychází dvojná vazba. Tato skutečnost má za následek nedostatečnou absorpci v UV oblasti spektra. Naopak trichotheceny typu D (makrocyklické trichotheceny) charakteristická spektra poskytují [20, 21]. Trichotheceny patří mezi stabilní látky (např. deoxynivalenol se výrazněji nerozkládá

ani

při

delším

skladování

v

organických

rozpouštědlech,

např. ethylacetátu). Samotná epoxidová skupina C-12, 13 je extrémně stabilní vůči 34

nukleofilní substituci. Při dlouhodobém varu v silně kyselém prostředí dochází k intramolekulárnímu přesmyku trichothecenového skeletu na apotrichothecenový kruh [20, 21].

4.1.3 Producenti a výskyt trichothecenů Jak

jsem

již

zmínila,

trichotheceny

jsou

sekundární

metabolity

mikroskopických vláknitých hub především rodu Fusarium. Fusaria kontaminují široké spektrum zemědělských plodin, zejména cereálie. Pšenice, kukuřice a ječmen tvořící dvě třetiny světové produkce obilnin, patří mezi obilniny nejčastěji obsahující trichotheceny. Znehodnocení těchto cereálií

způsobené

fusarii

je

spojeno

především

s přítomností

plísní

F. graminearum, F. culmorum a F. moniliforme. Mezi další častěji napadané plodiny patří oves a žito. V menších koncentracích byly trichotheceny nalezeny také v rýži, čiroku, hořčičném semenu, sojových bobech, podzemnici olejné, bramborách, slunečnici apod. [18]. V potravinách a v krmivech se nejčastěji a v nejvyšších koncentracích vyskytuje DON, často doprovázený NIV a jejich deriváty např. 3-AcDON, 15-AcDON. Hladiny těchto mykotoxinů se pohybují obvykle pod hranicí 1 mg.kg-1. Pokud dochází k mírné kontaminaci houbami rodu Fusarium s následnou produkcí mykotoxinů, jsou tyto látky nalézány převážně blízko vnějšího povrchu zrna, zatímco vysoké koncentrace (> 4 mg toxinu/kg obilí) jsou rovnoměrně distribuovány v celém zrnu [18].

35

4.2 ROD FUSARIUM Taxonomické zařazení

Říše: Houby Kmen: Ascomyceta Řád: Hypocreales Čeleď: Hypocreaceae Rod: Fusarium

4.2.1 Výskyt v prostředí Houby rodu Fusarium se vyskytují na rostlinách a v půdách. Jsou součástí běžné mykoflóry zemědělských komodit. Většina druhů byla izolována v tropických a subtropických oblastech, ale řada z nich je také přítomna v rostlinách a půdách chladnějších oblastí. Rod Fusarium má více než 20 druhů, z nichž se nejběžněji vyskytují druhy F.solani, F. oxysporum, F. poae, F. sporotrichioides, F. graminearum a F. avenaceum [20]. Plísně rodu Fusarium se řadí mezi hlavní producenty trichothecenových mykotoxinů. Převládajícím mykotoxinem nalézaným na ječmeni je DON (deoxynivalenol). Plísně rodu Fusarium způsobují nemoc zvanou ,,Fusarium head blight“ (FHB). Touto celosvětově rozšířenou nemocí bývají napadeny zejména obiloviny. FHB je známa již od roku 1890, kdy byla plísní Fusarium infikována úroda ve východní části USA. Další epidemie propukla např. v Německu v letech 1987 a 1991 [22, 23]. Plísně produkují odolné toxické metabolity, které jsou schopny přežít sladovací a sušící proces a dostat se až do konečného produktu - piva. Přenos mykotoxinů z ječmene do piva záleží na rozpustnosti a tepelné stabilitě jednotlivých mykotoxinů. Nejčastějším mykotoxinem, který bývá stanoven v infikovaném ječmeni je deoxynivalenol. Množství deoxynivalenolu, který je produkován během sladování infikovaného ječmene je různě vysoké a pravděpodobně závisí na jednotlivých odrůdách stejně jako na sladovacích podmínkách [22, 23].

36

Obr. 10: Cyklus napadení mikromycetami rodu Fusarium [23]

4.2.2 Toxicita Rod Fusarium způsobuje u lidí a stejně tak i u zvířat řadu onemocnění. Infekce vyvolané Fusarium spp. se obecně nazývají fuzariózy. Vývoj fuzariových infekcí je spojován s poraněním rostlinných či živočišných tkání nebo s oslabením imunity. V souvislosti s fuzarii byly u lidí popsány keratitidy, záněty středního ucha, záněty žil, záněty čelních dutin a plic, septická artritida, záněty srdečního svalu a jiné onemocnění. Rod Fusarium produkuje velké množství mykotoxinů. Konzumace obilí, které je takto napadené, vede ke zvyšování alergických reakcí a při

dlouhodobější

expozici

k výskytu

rakoviny.

Sekundární

metabolity

produkovány rodem Fusarium-trichotheceny, jsou známy svými imunosupresivními účinky a inhibicí syntézy proteinů. Mohou způsobovat nervové poruchy, zvracení, podráždění kůže, nechutenství a průjmy [19, 20].

37

Mykotoxikózy se mohou vyskytovat v jedné ze tří forem [19]: 1. akutní primární mykotoxikóza - vzniká po požití vyšších dávek

mykotoxinů. Jejími následky jsou hematotoxikózy a nekrózy různých tkání, jako je gastrointestinální trakt, kostní dřeň a lymfoidní tkáň. 2. chronická primární mykotoxikóza - vyskytuje se při opakovaném

příjmu středních a nízkých množství toxinů a projevují se např.

poruchami

rozmnožování

a imunitního

systému,

zpomaleným růstem, sníženým váhovým přírůstkem apod. 3. sekundární choroby způsobené přítomností mykotoxinů - vznikají po

přijímání velmi nízkých koncentrací specifických mykotoxinů. Jednotlivé trichothecenové mykotoxiny se svojí toxicitou velmi liší. Trichotheceny typu A jsou desetkrát toxičtější než trichotheceny typu B. Rozhodujícími faktory pro celkový toxický účinek mykotoxinů jsou dávka a délka doby

působení. Podstatnou roli hraje také věk, pohlaví a druh exponovaných

živočichů. Také kombinace dvou či více mykotoxinů vyskytujících se v dané surovině současně může působit toxičtěji než jednotlivé mykotoxiny v důsledku jejich synergismu [19]. DON je silné centrální emetikum, na které jsou velmi citlivá prasata. Vyvolává zvracení, akutní průjmy, poruchy koordinace pohybů, hemoragie na sliznicích a náhlý úhyn. DON působí na imunitní systém a potlačuje zánětlivé reakce, způsobuje pokles chemotaxe a fagocytózy, inhibici krevních destiček a zvýšení citlivosti k bakteriálním endotoxinům. Tím je zvíře oslabeno ve prospěch bakteriální, virové či plísňové nemoci [19].

38

4.3 DEOXYNIVALENOL (DON) Deoxynivalenol (triviálním názvem vomitoxin) byl objeven v roce 1973 Yoshizawou a Moorokem. Mezi hlavní producenty deoxynivalenolu patří Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium poae a Fusarium sporotrichioides. Deoxynivalenol se nalézá v obilovinách a v obilných výrobcích, např. v dětských výživách z obilovin, v pečivu, v těstovinách, v ječmeni a ve výrobcích na bázi ječmene, v kukuřici, rýži, prosu, otrubách, sojových bobech, česneku, bramborách, pivu a v mnohých dalších potravinách [20]. Deoxynivalenol je jedním z nejběžnějších a nejznámějších mykotoxinů, které kontaminují

potraviny

a

krmiva.

Obiloviny,

kontaminované

tímto

mykotoxinem, se vyskytují téměř ve všech částech světa. Při používání vhodných agrotechnických opatření a prostředků však můžeme úplně nebo alespoň částečně eliminovat kontaminaci obilovin deoxynivalenolem. Spolu s deoxynivalenolem se v obilovinách často vyskytují i jiné mykotoxiny produkované rodem Fusarium, např. nivalenol, diacetoxyscirpenol, T-2 toxin, 3-acetyldeoxynivalenol a 15-acetyldeoxynivalenol [20].

4.3.1 Chemické a fyzikální vlastnosti deoxynivalenolu Deoxynivalenol je bílá krystalická látka, která má bod tání 151 – 153 °C. Je chemicky i tepelně vysoce stabilní. Deoxynivalenol patří mezi polární trichotheceny a jeho molekulová hmotnost je 296,32 g.mol-1. Deoxynivalenol je rozpustný ve vodě a v polárních rozpouštědlech jako je například methanol, acetonitril, dále je dobře rozpustný v chloroformu, směsi octan etylnatý + acetonitril (4:1) a ve směsi chloroform + methanol (9:1). Je nerozpustný v hexanu a petroletheru [20, 24].

39

Obr. 11: Strukturní vzorec deoxynivalenolu [20]

4.3.2 Legislativa Legislativa i praktická opatření přijímaná pro zajištění hygienickotoxikologické bezpečnosti potravin přistupují stejným způsobem ke kontaminantům i přírodním toxinům a aditivním látkám [17]. Zdrojem mezinárodních potravních standardů je Codex Alimentarius vydávaný Food and Agricultural Organization a World Health Organization (FAO/WHO) Spojených národů (United Nations, UN). V Evropě jsou zdrojem direktivy

European

Economic

Community

(EEC).

Problematikou

aditiv,

kontaminantů a přírodních toxinů v potravinách se komplexně zabívá Codex Committee on Food Additives and Contaminants (CCFAC). Poradním odborným orgánem CCFAC je Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (JECFA), složený z expertů z členských a přidružených zemí FAO/WHO. Doporučení pro EEC pocházejí od komise nominovaných odborníků, orgánů s názvem Scientific Committee for Food (SCF). Tato doporučení jsou v jednotlivých zemích převáděna do legislativní formy [17]. Od 1.1.2003 podléhá veškerá manipulace s trichotheceny povolení Státního úřadu pro jadernou bezpečnost (SÚJB) podle zákona MZd č. 281/2002 Sb., o zákazu biologických a toxinových zbraní. Trichotheceny jsou v příloze tohoto zákona zařazeny do skupiny vysoce rizikových toxinů [22].

40

Limitní množství deoxynivalenolu v potravinách v ČR je uvedeno ve vyhlášce MZd ČR 305/2004 Sb, zákona č. 110/1997 Sb. [25]: Tab. 2: Nejvyšší přípustné množství deoxynivalenolu v potravinách [25] Potravina

obiloviny pro přímou spotřebu a zpracované obilí, kromě tvrdé pšenice chléb a jemné pečivo výrobky z obilovin určené pro dětskou výživu

NPM mg.kg-1

0,50 0,35 0,10

Od 1.7.2007 budou v zemích Evropské Unie platit následující limity pro deoxynivalenol: v dětské výživě má být 200 µg.kg-1, v pečivu, chlebu a snídaňových cereáliích 500 µg.kg-1, v těstovinách 750 µg.kg-1. Vyšší hladiny jsou povoleny pro nezpracované plodiny: 1750 µg.kg-1 pro tvrdou pšenici a oves a 1250 µg.kg-1 pro ostatní nezpracované cereálie [26].

4.3.3 Gushing Důležitým následkem nemoci ,,Fusarium head blight“ je sklon infikovaného ječmene k přepěňování (gushingu) [27]. Přepěňování je charakterizováno tím, že okamžitě po otevření láhve, tzn. po odstranění nadměrného tlaku nad pivem se vytvoří velké množství jemných bublinek v celém objemu piva, které stoupají vzhůru a vytváří pěnu, která přetéká z láhve a v nejhorších případech dokonce z láhve vytryskne. Prudká reakce obvykle po několika vteřinách skončí. Výsledné přepěňování udáváme v ml [28]. Vlastní látky způsobující gushing, nejsou zatím přesně známy. Výskyt gushingu je však spojován s napadením obilky ječmene mikroskopickými vláknitými houbami rodu Fusarium, Aspergillus, Rhizopus, Penicillium a Nigrospora. Předpokládá se, že jde o sloučeniny, které jsou produkovány rostlinou jako odezva na předchozí stres, ať už v období růstu nebo při následném zpracování surovin [29]. Celý komplexní mechanismus reakcí, který se spustí při napadení rostliny patogenem, je velmi složitý. Z tohoto důvodu i problematika gushingu není doposud vyřešena.

41

Přepěňování můžeme dělit na primární nebo sekundární [30]: Primární (přímé) přepěňování - spontánní přepěnění piva, závisí přímo

na určitých charakteristikách kvality použitého sladovnického ječmene, např. na míře zamoření ječmene a sladu Fusariem a jinými plísněmi. Sekundární (nepřímé) přepěňování - závisí na výrobních faktorech, např.

na drsném povrchu lahví, příliš rozpuštěném CO2, na obsahu kyseliny šťavelové a na krystalech šťavelanu vápenatého, 1-2 ppm koncentrací těžkých kovů atd..

4.4 NIVALENOL (NIV) Nivalenol patří stejně jako deoxynivalenol do skupiny mykotoxinů produkovaných rodem Fusarium. Zejména ho produkují Fusarium cerealis (F. crookwellence) a Fusarium poae, mezi méně významné producenty patří Fusarium culmorum a Fusarium graminearum [20].

4.4.1 Fyzikálně-chemické vlastnosti Nivalenol je bílá krystalická látka, která má bod tání 138 – 140 °C. Je chemicky i tepelně vysoce stabilní. Nivalenol patří stejně jako deoxynivalenol mezi polární trichotheceny a jeho molekulová hmotnost je 312,3 g.mol-1. Nivalenol je rozpustný v polárních rozpouštědlech jako je například methanol, acetonitril a octan ethylnatý, méně rozpustný je ve vodě a chloroformu [20, 31].

Obr. 12: Strukturní vzorec nivalenolu

42

4.5 3–ACETYLDEOXYNIVALENOL (3-AcDON) A 15-ACETYLDEOXYNIVALENOL (15-AcDON) 4.5.1 Fyzikálně-chemické vlastnosti 3-Acetyldeoxynivalenol i 15-acetyldeoxynivalenol jsou bílé krystalické látky. 3-Acetyldeoxynivalenol má bod tání 185 – 187 °C , 15-acetyldeoxynivalenol má bod tání 138-140 °C. Jsou chemicky i tepelně vysoce stabilní. Jsou dalšími deriváty dalším ze skupiny polárních trichothecenů. Molekulová hmotnost 3-acetyldeoxynivalenolu i 15-acetyldeoxynivalenolu je 338,4 g.mol-1. Oba dva mykotoxiny jsou rozpustné v polárních rozpouštědlech jako je například methanol, acetonitril a octan ethylnatý, méně rozpustný je pouze ve vodě [32, 33].

CH3

O H

H 3C

H

O

O O

O HO

CH3

H 3C

Obr. 13: Strukturní vzorec 3-acetyldeoxynivalenolu

H

H 3C

O

H

OH O

O HO

O

CH 3 CH 3

O Obr. 14: Strukturní vzorec 15-acetyldeoxynivalenolu 43

4.6 METODY STANOVENÍ MYKOTOXINŮ 4.6.1 Chromatografické metody analýzy mykotoxinů V principu se jedná o migraci v systému dvou fází, z nichž jedna je stacionární a druhá mobilní. Separace se uskutečňuje na základě rozdílného dělení a selektivní retardace složek vzorku v koloně. 4.6.1.1 Plynová chromatografie

Analytická separační metoda využívaná k separaci těkavých organických sloučenin. Plynová chromatografie pracuje v systému plyn-pevná látka nebo plynkapalina. Jako mobilní fáze se používá inertní plyn, nejčastěji dusík, vodík, helium. Objem vzorku nanášeného na kolonu je 0,1-1 µl. Pro úspěch separace je nezbytná teplota komory injektoru, která musí být vyšší než bod varu nejméně těkavé složky roztoku [6]. Dále je nutné dodržovat stanovenou teplotu kolony, na které je závislá rychlost pohybu složek vzorku. Velmi často se pro detekci látek používají hmotnostní detektory, které umožňují kombinaci ionizačního, fragmentačního a separačního procesu [34, 35]. 4.6.1.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Kapalinová chromatografie pracuje v systémech kapalina-kapalina nebo pevná látka-kapalina. Mobilní fáze

může být buď jednosložková nebo

vícesložková. U vícesložkové mobilní fáze můžeme zvolit typ eluce, a to buď izokratický nebo gradientový. Stacionární fázi tvoří převážně sorbenty s alkylovými řetězci s 8-22 uhlíky, které jim dodávají hydrofobní charakter [7]. Pro detekci se nejčastěji používají UV detektory nebo hmotnostní detektory [36, 37]. 4.6.1.3 Tenkovrstvá chromatografie

Jedná se o metodu založenou na vzlínání směsi rozpouštědel (mobilní fáze) v tenké vrstvě sorbentu (stacionární fáze) na povrchu vhodného nosiče. Jednotlivé složky vzorku jsou unášeny po sorbentu různou rychlostí. Jakmile dojde pohyb čela na konec desky, pohyb se zastaví. Jednotlivé složky vzorku můžeme pozorovat přímo jako barevné skvrny nebo je vizualizujeme postřikem vhodným chemickým činidlem. Velkou výhodou je tolerance metody k obsahu balastních látek ve vzorku, což omezuje ztráty zájmové látky čištěním a značně urychluje, usnadňuje a zlevňuje

44

celý proces. Nevýhodou této metody je její komplikovaná a ve srovnání s HPLC nebo GC málo přesná kvantifikace [38].

4.6.2 Imunochemické metody analýzy mykotoxinů Imunochemické

testy

na

zjišťování

mykotoxinů

založené

na

radioimunoanalýzách byly prováděny již od 70.let. V dnešní době se stanovení mykotoxinů provádí pomocí metody ELISA [39]. 4.6.2.1 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Jedná se o velmi běžnou metodu využívanou pro detekci mykotoxinů, která je založena na imunitní reakci sledované látky s protilátkou. Touto metodou jde tedy stanovit všechny látky, které jsou schopny vyvolat imunologickou odpověď. Mykotoxiny zpravidla nevyvolávají imunitní odezvu s tvorbou protilátek, ale působí jako hapteny. To znamená, že k tvorbě protilátek dochází až po navázání na vhodný nosič (např. bílkovina). Výhodou metody je poměrně snadné odečítání výsledků, kdy se zpravidla měří intenzita zabarvení roztoku fotometrem. Nevýhodou je citlivost enzymu, jehož vlastnosti mohou být pozměněny balastními látkami ze vzorku a podílejí se na znehodnocování analytické sady [18].

45

5 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 5.1 PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ A SOFTWARE -

HPLC systém 10AVP (Shimadzu, Tokio, Japonsko) •

Odplyňovač GT-154

•

Řídící jednotka SCL - 10AVP

•

Pumpa LC – 10ADVP

•

Termostat CTO–10ASVP s dávkovacím kohoutem Rheodyne 7120 a dávkovací smyčkou 20 µl

•

Chromatografická kolona Phenomenex Luna C18 (2), 250x3 mm, zrnění 5µm

-

•

Chromatografická kolona Onyx Monolithic C18, 100 x 4,6 mm, 2x

•

Fotometrický detektor s diodovým polem SPD-M10AVP

•

řídící software Class–VP 5.02

Injektování vzorku do systému probíhalo pomocí mikropipety Hamilton (Hamilton Bonaduy AG, Bonaduz, Švýcarsko)

5.2 MATERIÁL Rozpouštědla:

Methanol (CH3OH)

Mr = 32,04 g.mol-1

(Penta, Chrudim, Česká republika)

čistota p.a.

Acetonitril (AcN) (CH3CN)

Mr = 41,05 g.mol-1

(Merck, Darmstadt, Německo)

čistota p.a.

Standardy:

Deoxynivalenol (DON) (C15H20O6)

Mr = 296,32 g.mol-1

(Sigma-Aldrich, Steinheim, Německo)

99% čistota

Nivalenol (NIV) (C15H20O7)

Mr = 312,3 g.mol-1


99% čistota

3-Acetyldeoxynivalenol (3-AcDON) (C17H22O7)

Mr = 338,4 g.mol-1


99% čistota 46

15-Acetyldeoxynivalenol (15-AcDON) (C17H22O7)

Mr = 338,4 g.mol-1


99% čistota

Referenční vzorek:

Non-gushing barley malt – referenční vzorek

vyrobeno 1.3. 2002

sladu (blank) (Carlsberg Research Laboratory, Dánsko) Obohacené vzorky:

Referenční vzorek sladu Carlsberg byl obohacen roztokem DON v acetonitrilu a vysušen při laboratorní teplotě. Na HPLC byly analyzovány čtyři koncentrace: 600, 1500, 2500 a 5000 µg.kg-1 (DON/slad). Všechny roztoky byly připraveny za použití deionizované vody. Deionizace vody byla provedena na zařízení Premier–RO–TFM–5SV (Phoenix, Arizona, USA) Vzorky ječmene a sladu:

Na obsah DON byly vyšetřeny následující vzorky: • 4 vzorky ječmene a sladu odrůdy Kompakt (Tab. 3) Podmínky: předplodina kukuřice, 4 druhy ochrany • 10 vzorků (meziproduktů) odebíraných v průběhu sladování ječmene odrůdy Kompakt Podmínky: předplodina kukuřice, cíleně infikováno směsí spor fusarií (VÚPS, a.s., Brno, Česká Republika)

47

Tab. 3: Přehled vzorků vyšetřených na obsah DON Odrůda

Ochrana

Předplodina

Cíleně infikováno – bez ochrany Cíleně infikováno, fungicid (Horizon 0,5 + Mirage 0,75) Kompakt

kukuřice

Cíleně infikováno, fungicid + Silwet (Horizon 0,5 + Mirage 0,75 + Silwet) Neinfikováno – bez ochrany

Postup sladování ve VÚPS a.s., Brno (Výzkumný ústav pivovarský a sladařský)

Sladování se dělí na tři základní části, a to máčení zahrnující vzdušné přestávky, klíčení a hvozdění. Jednotlivé parametry tohoto procesu jsou uvedeny níže [40]: • celková doba sladování

144 hodin

• obsah vody na počátku klíčení

45 %

• teplota vody v době máčení

14,5 °C

• teplota vody v době klíčení

14,5 °C

• počátek hvozdění

30 °C

• konec hvozdění

80 °C

Tab. 4: Proces sladování dle VÚPS a.s., Brno [40] Číslo odběru

Den

1

5.2.2006

2

6.2.2006

3

7.2.2006

4

8.2.2006

5

9.2.2006

6 7 8

Proces 5 hodin máčení máčení

72 hod.

4 hodiny máčení namáčky jsou podle potřeby, konečný stupeň domočení byl 42,5°

klíčení

72 hod.

odběr na začátku dne

zelený slad 10.2.2006

hvozdění

22 hod.

odběr po 6 hodinách sladování odběr po 12 hodinách sladování

48

Tab. 5: Přehled meziproduktů odebíraných v průběhu sladování ječmene Odrůda

Odběr vzorků během sladování

Ochrana

Předplodina

ječmen 1. odběr Máčení

2. odběr 3. odběr Kompakt

Cíleně

4. odběr Klíčení

5. odběr

infikováno,

kukuřice

bez ochrany

6. odběr 7. odběr

Hvozdění

8. odběr slad

Pro srovnání správnosti výsledků získaných z HPLC-UV byly vzorky ječmene analyzovány pomocí LC-MS (VŠCHT, Praha). LC-MS (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s tandemově hmotnostním detektorem typu iontová past)

Pracoviště: VŠCHT, Praha, Ústav chemie a analýzy potravin Výsledky poskytnuty: Ing. Kateřina Lancová Postup: Homogenizovaný vzorek byl extrahován směsí AcN:H2O. Po filtraci byl extrakt přečištěn pomocí Mycosep kolonky TM 226. Alikvot přečištěného extraktu byl odpařen na vakuové rotační odparce a poté převeden do směsi CH3OH:H2O. Identifikace a kvantifikace byla provedena po separaci cílových analytů na koloně Synergi Hydro RP (Supelco, USA) v gradientu mobilní fáze CH3COONH4:H2O na hmotnostním detektoru LCQ Deca (Finnigen, USA).

49

5.4 ANALÝZA MYKOTOXINŮ (DON, NIV) METODOU HPLC (CHROMATOGRAFICKÁ KOLONA PHENOMENEX LUNA C18 (2)) Úkolem bylo nalézt vhodné podmínky pro separaci DON a NIV jako dvou nejvýznamnějších mykotoxinů vyskytujících se v ječmeni a sladu. Na základě publikací, které se přímo zabývají problémem separací těchto látek [36, 37] a také na základě chemických vlastností konkrétních analytů, byl pro separaci navržen HPLC systém s obrácenou fází C18 v izokratickém elučním módu.

5.4.1 Výběr vlnové délky pro detekci Pro detekci trichothecenových mykotoxinů typu B byla vybrána vlnová

[mAU]

délka 222 nm, jelikož při této vlnové délce mají analyty absorpční maximum.

λ [nm]

Obr. 15: Spektrum DON, MF AcN:H2O 10:90 (v/v), průtok 0,6 ml.min-1, teplota 25 °C

50

5.4.2 Optimalizace mobilní fáze Pro separaci mykotoxinů deoxynivalenolu a nivalenolu v systému s izokratickou elucí a s chromatografickou kolonou s reverzní fází C18 byla na základě publikací jako nejvhodnější mobilní fáze vybrána směs AcN:H2O [36, 37]. Dále byla optimalizována koncentrace, průtok a teplota mobilní fáze tak, aby byly dosaženy krátké retenční časy analytů společně s dostatečným rozlišením (RS > 1,5). Pro zjištění optimální teploty byly vyzkoušeny teploty 25 °C, 30 °C, 35 °C a 40 °C. Jelikož se se změnou teploty pouze snižoval retenční čas analytů a rozlišení i velikost plochy píků se téměř nezměnily, byla jako optimální teplota vybrána teplota 25 °C.

250000 240000

plocha píku [uAU.s]

230000 220000 210000 200000 190000 180000 170000 160000 20

25

30

35

40

45

teplota [°C]

Obr. 16: Závislost plochy píku NIV na teplotě, koncentrace analytů 0,05 mg.ml-1, průtok 0,6 ml.min-1

51

200000


195000 190000 185000 180000 175000 170000 165000 160000 0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

-1

průtok [ml.min ]

Obr. 17: Závislost plochy píku DON na teplotě, koncentrace analytů 0,05 mg.ml-1, průtok 0,6 ml.min-1

7,5

t [min]

7,4

7,3

7,2

7,1 20

25

30

35

40

45

50

teplota [°C]

Obr. 18: Závislost retenčního času DON a NIV na teplotě, koncentrace analytů 0,05 mg.ml-1, průtok 0,6 ml.min-1 Pro zjištění optimálního průtoku MF byly vyzkoušeny průtoky 0,5-0,8 -1

ml.min . Vzhledem k poznatkům z literatury [36, 37] a k tomu, že se měnily pouze retenční časy analytů, ale velikost plochy píků se se změnou průtoku nezměnila, byl jako optimální průtok vybrán průtok 0,6 ml.min-1.

52

200000


195000 190000 185000 180000 175000 170000 165000 160000 0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

průtok [ml.min-1]

Obr. 19: Závislost plochy píku NIV na průtoku, koncentrace analytů 0,05 mg.ml-1, teplota 25 °C

200000


195000 190000 185000 180000 175000 170000 165000 160000 0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

průtok [ml.min-1]

Obr. 20: Závislost plochy píku DON na průtoku, koncentrace analytů 0,05 mg.ml-1, teplota 25 °C

53

Testované mobilní fáze:

AcN:H2O 10:90 (v/v) AcN:H2O 16:84 (v/v) AcN:H2O 20:80 (v/v) Vzhledem k analýzám reálných vzorků, u kterých se v prvních minutách analýzy eluují balastní látky, byla jako optimální koncentrace mobilní fáze vybrána mobilní fáze AcN:H2O 10:90 (v/v). V porovnání s ostatními mobilními fázemi s vyšší eluční silou došlo s touto mobilní fází k lepšímu rozlišení mezi píky balastních látek a píkem nivalenolu.

20000

standard výška píku [uAU]

vzorek balast

0 0

2

4

6

8

10

12

t [min]

Obr. 21: Chromatogram směsi DON a NIV, koncentrace analytů 0,1 mg.ml-1 a vzorku ječmene (neinfikovaný- bez ochrany), obsah DON je 189,1 µg.kg-1 (dle VŠCHT, Praha), MF AcN:H2O, koncentrace 10:90 (v/v), průtok 0,6 ml.min-1, teplota 25 °C

54

25000

NIV tR = 4,11 min

výška [uAU]

20000

DON tR = 7,34 min

15000 10000 5000 0 3

4

5

6

7

8

9

t [min]

Obr. 22: Chromatogram směsi DON a NIV, koncentrace analytů 0,1 mg.ml-1, MF AcN:H2O, koncentrace 10:90 (v/v), průtok 0,6 ml.min-1, teplota 25 °C Závěr: Pro stanovení deoxynivalenolu a nivalenolu byly vybrány tyto podmínky: mobilní fáze

AcN:H2O 10:90 (v/v)

teplota

25 °C

průtok

0,6 ml.min-1

objem nástřiku

20 µl

vlnová délka

222 nm

55

5.4.3 Kalibrační křivky DON, NIV

100000


90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 0

2

4

6

8 -1

koncentrace [ug.ml ]

10 12 y = 9324,7x 2 R = 0,9932

Obr. 23: Kalibrační křivka deoxynivalenolu t = |b/sb| = |-1889,5/ 2511,4| = 0,752 tα= 2,160 (ν = n - 2 = 13; α = 0,05) ⇒ t < tα úsek b je statisticky nevýznamný, proto lze použít rovnici regrese ve tvaru y = ax

100000 90000


80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 0

2

4

6

8

10

12

-1


Obr. 24: Kalibrace deoxynivalenolu (chybové úsečky)

56

800000


700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 0

20

40

60

80

100

120 y = 6754,8x R2 = 0,9981

-1


Obr. 25: Kalibrační křivka nivalenolu t = |b/sb| = |4736,1/ 8052,8| = 0,588 tα= 2,160 (ν = n - 2 = 13; α = 0,05) ⇒ t < tα úsek b je statisticky nevýznamný, proto lze použít rovnici regrese ve tvaru y = ax

800000


700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 0

20

40

60

80

100

120

-1


Obr. 26: Kalibrace nivalenolu (chybové úsečky)

57

5.4.3.1 Výpočet limitu detekce

Limity detekce (LOD – Limit Of Detection) a limity stanovitelnosti (LOQ – Limit Of Quantification) analytů byly určeny z rovnice lineární regrese grafu závislosti výšky píku na koncentraci standardů. Limity detekce a stanovitelnosti byly určeny z průměrných hodnot výšek píků šumu. Hodnoty výšky šumu byly odečítany v oblasti dané 20-ti násobkem pološířky píku analytu. Limit detekce a stanovitelnosti

LOD = 3 σB /ah LOQ = 10 σB /ah ah ..............směrnice určená z rovnice lineární regrese grafu závislosti výšky píku na koncentraci standardů σB.............směrodatná odchylka šumu

Tab. 6: Tabulka hodnot LOD a LOQ pro DON a NIV LOD [µg.ml-1]

LOQ [µg.ml-1]

DON

0,095

0,32

NIV

0,055

0,19

58

5.4.4 Dlouhodobá a krátkodobá opakovatelnost Tato metoda byla vyvinuta pro analýzy reálných vzorků a bylo nutné zjistit, jaká je opakovatelnost. Největší vliv na opakovatelnost má stav chromatografické kolony, která může být ovlivněna používáním různých mobilních fází s vysokým obsahem solí nebo s extrémním pH, a také nedostatečná ekvilibrace kolony. Nevhodné zacházení s kolonou způsobí pokles účinnosti kolony, rozdílné hodnoty retenčních časů, nižší rozlišení, dochází k rozmývání píků. V tab. 7 až 12 jsou uvedeny jednotlivé parametry separace analytů. Tab. 7: Porovnání hodnot retenčních časů (tR) na identickém chromatografickém systému za identických podmínek a při použití stejných koncentrací analytů v různých obdobích. Složení mobilní fáze: AcN:H2O 10:90 (v/v), průtok 0,6 ml.min-1, teplota 25 °C prosinec

leden

únor

březen

2005

2006

2006

2006

tR

tR

tR

tR

průměrný tR

[min]

[min]

[min]

[min]

[min]

DON

7,72

7,46

7,40

7,72

7,58

1,94

NIV

4,17

4,05

4,04

4,22

4,12

1,87

RSD [%]

Tab. 8: Porovnání hodnot rozlišení (RS) na identickém chromatografickém systému za identických podmínek a při použití stejných koncentrací analytů v různých obdobích. Složení mobilní fáze: AcN:H2O 10:90 (v/v), průtok 0,6 ml.min-1, teplota 25 °C prosinec

leden

únor

březen

2005

2006

2006

2006

RS

RS

RS

RS

průměrné RS

RSD [%]

5,43

5,43

5,65

5,57

5,52

1,71

DON NIV

59

Tab.

9:

Porovnání

hodnot

velikosti

plochy

píků

(A)

na

identickém

chromatografickém systému za identických podmínek a při použití stejných koncentrací analytů v různých obdobích. Složení mobilní fáze: AcN:H2O 10:90 (v/v), průtok 0,6 ml.min-1, teplota 25 °C prosinec

leden

únor

březen

2005

2006

2006

2006

A

A

A

A

průměrné A

RSD [%]

DON

244259

285637

290283

274782

273740

6,55

NIV

664268

703805

671632

622616

665580

4,35

Tab. 10: Porovnání počtů teoretických pater (N) na identickém chromatografickém systému za identických podmínek a při použití identických druhů i koncentrací analytů v různých obdobích. Složení mobilní fáze: AcN:H2O 10:90 (v/v), průtok 0,6 ml.min-1, teplota 25 °C prosinec

leden

únor

březen

2005

2006

2006

2006

N

N

N

N

průměrné N

RSD [%]

DON

8181

8647

8571

8270

8417

2,33

NIV

4489

4852

4936

4596

4718

3,86

Tab. 11: Porovnání hodnot retenčních časů (tR), hodnot rozlišení (RS) a počtu teoretických pater (N) na identickém chromatografickém systému během jednoho dne, 10 měření, složení mobilní fáze: AcN:H2O 10:90 (v/v), průtok 0,6 ml.min-1, teplota 25 °C interval jednoho dne, 10 měření tR DON

7,72

NIV

4,22

RS

5,63

N

A

7990

33547

4433

175686

60

Tab. 12: Změny separačních vlastností identického chromatografického systému vyjádřené pomocí RSD interval jednoho dne, 10 měření RSD [%] tR DON

0,25

NIV

0,14

RS

0,75

N

A

1,06

1,33

1,53

1,84

Z výše uvedených hodnot je patrné, že výsledky měření při použití identického chromatografického systému s identickým složením mobilní fáze vykazují téměř shodné hodnoty, a že se vlastnosti kolony v průběhu intenzivního měření během jednoho dne i v průběhu několikaměsíčního měření téměř nemění.

61

5.5 ANALÝZA 3-AcDON A 15-AcDON METODOU HPLC (CHROMATOGRAFICKÁ KOLONA PHENOMENEX LUNA C18 (2)) 3-AcDON a 15-AcDON patří stejně jako deoxynivalenol či nivalenol do skupiny mykotoxinů produkovaných rodem Fusarium. Zejména ho produkují Fusarium cerealis (F. crookwellence) a Fusarium poae, mezi méně významné producenty patří Fusarium culmorum a Fusarium graminearum [20]. Úkolem bylo nalézt vhodné podmínky pro separaci 3-AcDON a 15-AcDON, jelikož předchozí metoda pro tyto mykotoxiny není vhodná, a to zejména z důvodů dlouhých časů separace (tR > 45 min) a nedostatečného rozlišení.

5.5.1 Optimalizace složení a průtoku mobilní fáze Vzhledem k tomu, že oba analyty mají až na rozdílnou polohu substituované acetylové skupiny stejnou strukturu, bylo velmi obtížné najít mobilní fázi, která by zaručovala krátké retenční časy analytů a dostatečné rozlišení. Objem nastřikované směsi byl konstantní (20 µl), teplota 25 °C, průtok se měnil v závislosti na použité mobilní fázi, dále jsem byla limitována tlakem na koloně (zvýšení rychlosti průtoku mobilní fáze → zvýšení tlaku na koloně). Testované mobilní fáze:

Pro separaci byly testovány mobilní fáze o složení: a) AcN:H2O 16:84 (v/v) [41] b) AcN:H2O 10:90 (v/v) [37] c) AcN:MeOH:H2O 9:9:82 (v/v) [42] d) AcN:MeOH:H2O 9:15:76 (v/v) [43] e) AcN:H2O 8:92 (v/v) f) AcN:H2O 7:93 (v/v)

62

Nejdříve byly vyzkoušeny mobilní fáze uváděné v literatuře - MF a) – d). Při použití mobilní fáze AcN:H2O o koncentraci 16:84 (v/v) a průtoku 0,6 ml.min-1 nedošlo k separaci 3-acetyldeoxynivalenolu a 15-acetyldeoxynivalenolu, rozlišení je nulové. Proto je tato mobilní fáze nevhodná pro separaci těchto mykotoxinů. 55000

3- a 15-AcDON tR = 15,96 min

výška píku [uAU]

45000 35000 25000 15000 5000 -5000 10

12

14

16

18

20

t [min]

Obr. 27: Chromatogram 3-AcDON a 15-AcDON, koncentrace analytů 0,1 mg.ml-1, MF AcN:H2O, koncentrace 16:84 (v/v), průtok 0,6 ml.min-1 Při použití mobilní fáze AcN:H2O o koncentraci 10:90 (v/v) a průtoku 0,6 ml.min-1 a 1 ml.min-1 došlo k částečné separaci 3-acetyldeoxynivalenolu a 15-acetyldeoxynivalenolu. Změna rychlosti průtoku na separaci analytů byla zanedbatelná. Jelikož bylo rozlišení píků těchto dvou mykotoxinů nízké a retenční časy analytů byly vysoké, byla tato mobilní fáze vyhodnocena jako nevyhovující.

63

3-AcDON tR = 44,21 min

9000


výška píku [uAU]

7000 5000 3000 1000 -1000 -3000

35

40

45

50

55

60

-5000 t [min]

Obr. 28: Chromatogram 3-AcDON a 15-AcDON, koncentrace analytů 0,05 mg.ml-1, MF AcN:H2O, koncentrace 10:90 (v/v), průtok 0,6 ml.min-1 20000


výška píku [uAU]

15000


10000 5000 0 19

21

23

25

27

29

31

33

-5000 t [min]

Obr. 29: Chromatogram 3-AcDONa 15-AcDON, koncentrace analytů 0,1 mg.ml-1, MF AcN:H2O, koncentrace 10:90 (v/v), průtok 1 ml.min-1 Pro separaci 3-acetyldeoxynivalenolu a 15-acetyldeoxynivalenolu byly také vyzkoušeny mobilní fáze AcN:MeOH:H2O o koncentraci 9:9:82 (v/v) a 9:15:76 (v/v) a průtoku 0,6 a 0,9 ml.min-1. Při použití těchto mobilní fází sice došlo ke snížení retenčních časů analytů, ale zároveň i ke zhoršení rozlišení. V případě MF AcN:MeOH:H2O 9:15:76 (v/v) došlo k eluci analytů ve stejném retenčním čase. Vzhledem k tomu byly tyto mobilní fáze vyhodnoceny jako nevyhovující.

64

20000 3-AcDON tR = 30,04 min

výška píku [uAU]

15000


10000 5000 0 -5000

25

27

29

31

33

35

37

t [min]

Obr. 30: Chromatogram 3-AcDONa 15-AcDON, koncentrace analytů 0,1 mg.ml-1, MF AcN:MeOH:H2O, koncentrace 9:9:82 (v/v), průtok 0,6 ml.min-1

výška píku [uAU]

19000

3- a 15-AcDON tR = 18,71 min

14000

9000

4000

-1000 15

16

17

18

19

20

21

22

t [min]

Obr. 31: Chromatogram 3-AcDONa 15-AcDON, koncentrace analytů 0,1 mg.ml-1, MF AcN:MeOH:H2O, koncentrace 9:15:76 (v/v), průtok 0,6 ml.min-1 Jak je patrné z předchozích výsledků, mobilní fáze uváděné v literatuře se pro separaci 3-acetyldeoxynivalenolu a 15-acetyldeoxynivalenolu ukázaly jako nevyhovující. Hlavním důvodem byla velká eluční síla mobilních fází.

65

Proto byla dále použita mobilní fáze AcN:H2O o nižší eluční síle než měly předchozí mobilní fáze, konkrétně o koncentraci 7:93 (v/v) a průtoku 0,9 ml.min-1. Při použití této mobilní fáze došlo k separaci 3-acetyldeoxynivalenolu a 15-acetyldeoxynivalenolu (rozlišení bylo 2,38), avšak retenční časy analytů se pohybovaly okolo 65 minut, což je nepřijatelně dlouho. Proto byla i tato mobilní fáze zamítnuta.

13000


výška píku [uAU]

11000


9000 7000 5000 3000 1000

55

60

65

70

75

80

-1000 t [min]

Obr. 32: Chromatogram 3-AcDONa 15-AcDON, koncentrace analytů 0,1 mg.ml-1, MF AcN:H2O, koncentrace 7:93 (v/v), průtok 0,9 ml.min-1 Dále byla použita mobilní fáze AcN:H2O 8:92 (v/v) o průtoku 0,9 ml.min-1. Vzhledem k tomu, že se zvýšila eluční síla mobilní fáze, došlo i ke snížení retenčních časů analytů a také ke snížení rozlišení na 1,70. Další snížení retenčních časů 3-acetyldeoxynivalenolu a 15-acetyldeoxynivalenolu by bylo možné dosáhnout dalším zvýšením eluční síly mobilní fáze nebo zvýšením průtoku mobilní fáze. Proto byla vyzkoušena mobilní fáze AcN:H2O o koncentraci 9:91 (v/v) o průtoku 0,9 ml.min-1, avšak tato MF byla nevhodná kvůli snížení rozlišení.

66

9000

výška píku [uAU]

7000



5000 3000 1000 -1000 40

45

50

55

60

t [min]

Obr. 33: Chromatogram 3-AcDONa 15-AcDON, koncentrace analytů 0,05 mg.ml-1, MF AcN:H2O, koncentrace 8:92 (v/v), průtok 0,9 ml.min-1

67

Tab. 13: Shrnutí optimalizace složení a průtoku MF pro analýzu 3-AcDON a 15-AcDON Mobilní fáze

tR 3-AcDON

Rozlišení

0,6

0

47,05

0,6

AcN:H2O 10:90

44,21

AcN:H2O 10:90

26,75

AcN:H2O 8:92

48,25

AcN:H2O 7:93

63,10

69,69

0,9

2,38

30,04

31,18

0,6

0,54

20,05

20,82

0,9

0,56

0,6

0

AcN:MeOH:H2O 9:9:82 AcN:MeOH:H2O 9:9:82 AcN:MeOH:H2O 9:15:76

Vhodná mobilní fáze

15-AcDON

15,96

AcN:H2O 16:84

Průtok ml.min-1

28,24 52,14

1,0 0,9

0,58 0,67 1,70

ne špatné rozlišení ne špatné rozlišení ne špatné rozlišení ano dobré rozlišení ne

18,71

dlouhý retenční čas ne špatné rozlišení ne špatné rozlišení ne špatné rozlišení

Závěr: Vzhledem k dlouhým retenčním časům a nízkému rozlišení ostatních

mobilních fázi, byla jako nejlepší mobilní fáze pro separaci 3-acetyldeoxynivalenolu a 15-acetyldeoxynivalenolu na chromatografické koloně Phenomenex Luna C18 (2) vybrána mobilní fáze AcN:H2O 8:92 (v/v) o průtoku 0,9 ml.min-1.

68

5.6 ANALÝZA CÍLENĚ INFIKOVANÝCH VZORKŮ Pro další stanovení, zejm. deoxynivalenolu v ječmeni a sladu, bylo nutné ověřit přesnost metody, což jsem provedla stanovením deoxynivalenolu v cíleně infikovaných vzorcích a porovnáním skutečných koncentrací DON ve vzorcích s experimentálně zjištěnými hodnotami.

5.6.1 Příprava vzorků Pro cílenou infikaci vzorků byl použit referenční vzorek sladu Carlsberg, který byl obohacen roztokem deoxynivalenolu v acetonitrilu a vysušen při laboratorní teplotě. Nejdříve bylo nutné zjistit, zda se účinněji extrahuje DON z pomletého ječmene nebo z celé obilky. Byly analyzovány čtyři koncentrace: 600, 1500, 2500 a 5000 µg.kg-1 (DON/slad). Postup přípravy cíleně infikovaného vzorku: Před vlastní extrakcí byl připraven cíleně infikovaný vzorek sladu Carlsberg (600, 1500, 2500 a 5000 µg.kg-1). Tento vzorek vznikl obohacením 5 g rozemletého smíšeného homogenního referenčního vzorku sladu Carlsberg roztokem DON v acetonitrilu a následným sušením při laboratorní teplotě [44, 45]. Extrakce byla provedena 20 ml směsí AcN:H2O (84:16, v/v, smíchané do 3 minut) třepáním po dobu 30 minut. Supernatant byl zfiltrován přes skládaný filtr do 100 ml Erlenmeyerovy baňky, bylo odebráno 5 ml hrubého extraktu do skleněné zkumavky [45] (před purifikací může být extrahovaný vzorek uchováván v ledničce při 4 ºC, maximálně po dobu 2 týdnů [45]). Hrubý extrakt byl přečištěn kolonkou Mycosep®225. Z přečištěného extraktu byly odebrány 2 ml, které byly vysušeny dosucha vakuovou rotační odparkou. Opětovné rozpuštění bylo provedeno 0,4 ml AcN. Takto upravený vzorek již může být použít k měření na HPLC [45].

69

Výpočet obsahu DON

Vzorec přepočtu DON při extrakci (tj. µg.kg-1 → µg.ml-1): µg.ml −1 =

µg.kg −1 ⋅ 5 1000 ⋅ 10 ⋅ 0,4

(16)

kde je 1000 ~ přepočet na gramy 5 ~ navážka v gramech 10 ~ ředění při použití směsi AcN:H2O o objemu 20 ml. Podle manuálu poskytnutého společností Romer Labs® [46] se 25 g homogenního vzorku extrahuje 100 ml směsí AcN:H2O (84:16). 0,4 ~ ředění rozpuštěním v AcN

5.6.2 Stanovení DON v cíleně infikovaných vzorcích pomocí HPLC Podmínky analýzy: mobilní fáze

AcN:H2O 10:90 (v/v)

teplota

25 °C

průtok

0,6 ml.min-1

objem nástřiku

20 µl

vlnová délka

222 nm

5000 4000 výška píku [uAU]

3000 2000 1000 0 -1000

4

5

6

7

8

9

10

-2000 -3000 t [min]

Obr. 34: Chromatogram referenčního vzorku sladu Carlsberg

70

pomletý ječmen

výška píku [uAU]

9000

celá obilka

DON tR = 7,76 min

7000 5000 3000 1000 -1000 4

5

6

7

8

9

10

-3000 t [min]

Obr. 35: Porovnání chromatogramů cíleně infikovaného pomletého ječmene a celé obilky Porovnáním výsledků analýz pomletého ječmene i celé obilky jsem zjistila, že k účinnější extrakci dojde u pomletého ječmene. Tento poznatek byl velmi důležitý pro následné analýzy reálných vzorků.

60000


50000 40000 30000 20000 10000 0 0

1

2

3

4

5 -1


6 7 y = 8362x 2 R = 0.991

Obr. 36: Kalibrační křivka cíleně infikovaných vzorků t = |b/sb| = |2015,4/ 991,3| = 2,033 tα= 2,160 (ν = n -2 = 13) ⇒ t < tα úsek b je statisticky nevýznamný, proto lze použít rovnici regrese ve tvaru y = ax 71

60000


50000 40000 30000 20000 10000 0 0

1

2

3

4

5

6

7

-1


Obr. 37: Kalibrace cíleně infikovaných vzorků (chybové úsečky) Tab. 14: Porovnání teoretických a změřených koncentrací cíleně infikovaných vzorků

Koncentrace cíleně infikovaných vzorků DON -1

DON -1

Experimentálně zjištěné koncentrace cíleně infikovaných vzorků DON -1

DON -1

Výtěžnost

[µg.kg ]

[µg.ml ]

[µg.kg ]

[µg.ml ]

%

600

0,75

456,5

0,57

76,08

1500

1,88

1191,8

1,49

79,45

2500

3,13

2312,5

2,89

92,50

5000

6,25

4322,0

5,40

86,44

72

120000 y = 9852,7x R2 = 0,9946


100000 80000

standard 60000

cíleně inf. vzorek

40000

y = 8362x R2 = 0,991

20000

0 0

2

4

6

8

10

12

-1


Obr. 38: Porovnání kalibračních křivek standardu deoxynivalenolu a cíleně infikovaných vzorků Odchylka směrnic (15,12 %) ukazuje na vliv matrice (obilky). Proto je nutné používat pro stanovení DON v reálných vzorcích kalibrační křivku standardu s matricí. Výtěžnost metody je 85 %. Tab. 15: Porovnání exp. zjištěných koncentrací, paralelní extrakce cíleně infikovaného vzorku, konc. 3,13 ug.ml-1, složení mobilní fáze: AcN:H2O 10:90 (v/v), průtok 0,6 ml.min-1, teplota 25 °C konc. koncentrace plocha píku analytu RSD [%] analytu HPLC [uAU.s] -1 [µg.ml ] [µg.ml-1]

3,13

23532

2,89

26283

3,23

10,46

Přesnost metody je 10,46 %

73

Tab. 16: Tabulka hodnot LOD a LOQ pro cíleně infikované vzorky (standard + matrice) LOD

LOQ

LOD

[µg.ml-1] [µg.ml-1] [µg.kg-1] Cíl. inf. vzorky

0,16

0,53

127,8

LOQ [µg.kg-1]

426,2

7000 6000 DON tR = 7,61 min

výška píku [uAU]

5000 4000 3000 2000 1000 0 -1000

5,5

6

6,5

7

7,5

8

8,5

9

t [min]

Obr. 39: Chromatogram cíleně infikovaného vzorku, koncentrace 6,25 mg.ml-1, MF AcN:H2O, koncentrace 10:90 (v/v), průtok 0,6 ml.min-1

74

5.7 STANOVENÍ DON V REÁLNÝCH VZORCÍCH 5.7.1 Stanovení deoxynivalenolu pomocí HPLC Pro analýzu reálných vzorků byly vybrány čtyři vzorky ječmene odrůdy Kompakt, čtyři vzorky sladu odrůdy Kompakt a 10 vzorků (meziproduktů) odebíraných v průběhu sladování ječmene odrůdy Kompakt. Měřené vzorky ječmene a sladu byly vystaveny různému působení plísně r. Fusarium a ochrannému účinku fungicidů. Podmínky analýzy: mobilní fáze

AcN:H2O 10:90 (v/v)

teplota

25 °C

průtok

0,6 ml.min-1

objem nástřiku

20 µl

vlnová délka

222 nm

Tab. 17: Vyhodnocení obsahu DON v ječmeni, porovnání hodnot výsledků získaných z LC-MS (VŠCHT, Praha) a HPLC-UV Ječmen LC-MS Druh ochrany

DON -1

Cíleně infikováno – bez ochrany Cíleně infikováno, fungicid Cíleně infikováno, fungicid + silwet Neinfikováno – bez ochrany

HPLC

DON -1

DON -1

DON -1

odchylka

[µg.kg ]

[µg.ml ]

[µg.kg ]

[µg.ml ]

[%]

295,4

0,369

277,6

0,347*

- 5,96

317,0

0,396

346,4

0,433*

+ 8,49

313,5

0,392

340,0

0,425*

+ 7,79

189,1

0,236

-

-

-

- pod limitem detekce *

detekováno, ale pod limitem stanovitelnosti (LOQ = 0,53 µg.ml-1)

75

Tab. 18: Vyhodnocení obsahu DON ve sladu, porovnání hodnot výsledků získaných z LC-MS (VŠCHT, Praha) a HPLC-UV Slad LC-MS Druh ochrany

DON -1

[µg.kg ] Cíleně infikováno – bez ochrany Cíleně infikováno, fungicid Cíleně infikováno, fungicid + silwet Neinfikováno – bez ochrany

HPLC DON

DON

-1

DON

-1

[µg.ml ] [µg.kg ]

odchylka

-1

[µg.ml ]

[%]

779,5

0,974

843,2

1,054

+ 7,55

528,0

0,660

499,2

0,624

- 8,49

682,9

0,854

771,2

0,964

+ 11,45

830,1

0,974

683,2

0,854

- 17,70

Tab. 19: Vyhodnocení obsahu DON v meziproduktech odebíraných v průběhu sladování, porovnání hodnot výsledků získaných z LC-MS (VŠCHT, Praha) a HPLC-UV

Druh vzorku

LC-MS DON -1

HPLC DON -1

DON -1

DON -1

odchylka

[µg.kg ]

[µg.ml ]

[µg.kg ]

[µg.ml ]

[%]

Ječmen

409,5

0,512

451,2

0,564

+ 9,24

1.odběr

294,0

0,368

252,0

0,315*

- 14,40

2.odběr

175,4

0,219

-

-

-

3.odběr

227,8

0,285

-

-

-

4.odběr

541,6

0,677

483,2

0,604

- 10,78

5.odběr

527,8

0,660

491,2

0,614

- 6,94

6.odběr

394,0

0,493

425,6

0,532

+ 7,44

7.odběr

733,5

0,917

786,4

0,983

+ 6,73

8.odběr

605,6

0,757

634,4

0,793

+ 4,54

Slad

680,3

0,850

738,4

0,923

+ 7,87

- pod limitem detekce *

detekováno, ale pod limitem stanovitelnosti (LOQ = 0,53 µg.ml-1)

76

5.7.2 Sledování vlivu přepěňování ječmene Místo analýzy: Výzkumný ústav pivovarský a sladařský, a.s., Brno Sledovaná odrůda: KOMPAKT Charakteristika odrůdy:

Poloraná odrůda středně vysokého typu se středně velkým zrnem, výtěžnost předního zrna je středně vysoká až vysoká. Odrůda je vhodná do všech poloh, kde se pěstují sladovnické ječmeny. Tato odrůda má menší odolnost proti napadení padlím travním. Bez fungicidního ošetření je nízký výnos [47]. 5.7.2.1 Stanovení přepěňování ječmene za použití H2O2 a kyseliny gibberellinové (dle VÚPS)

Na analytických vahách se naváží 225 g ječmene a na vzorek nalije 500 ml roztoku kyseliny gibberellinové (90 mg kyseliny gibberellinové + 44 ml H2O2 se doplní deionizovanou vodou na celkový objem 2 litry). Po dobu 24 hodin se směs zahřívá na vodní lázní, poté se extrakt slije. Potom se 3krát nahradí 76 ml objemu piva z láhve extraktem o stejném objemu a na 20 minut vloží do vodní lázně vyhřáté na 62 ºC. Láhve se uloží horizontálně při 20 ºC na tři dny do třepačky (50 kyvů za minutu). Po třech dnech se láhve vyjmou a na 10 minut postaví kolmo. Poté se láhve obrátí 3krát během 10 s a po dalších 30 s se otevřou. Vypočítá se rozdíl mezi váhou před a po otevření [44]. 5.7.2.2 Stanovení přepěňování sladu třídenním testem Carlsberg

Na analytických vahách se naváží 150 g sladu a přidá se 600 ml deionizované vody. Směs se 1,5 minuty míchá a potom odstředí po dobu 10 minut. Horní frakce se slije do kádinky, roztok se svaří na objem 300 ml a ochladí na teplotu místnosti. Roztok se zfiltruje filtrem Whatman č.1 a upraví deionizovanou vodou na objem 300 ml. Poté se 3krát nahradí 76 ml objemu piva z láhve extraktem o stejném objemu a na 20 minut vloží do vodní lázně vyhřáté na 60 ºC. Láhve se pak uloží horizontálně při 20 ºC na tři dny do třepačky (50 kyvů za minutu). Po třech dnech se láhve vyjmou a na 10 minut postaví kolmo. Poté se láhve obrátí 3krát během 10 s a po dalších 30 s se otevřou. Vypočítá se rozdíl mezi váhou před a po otevření [44].

77

Porovnání hodnot přepěňování

Tab. 20: Zařazení hodnot přepěňování do stupnice pro statistické vyhodnocení [44] tříbodová

čtyřbodová

rozsah

rozsah

ml

ml

stupnice

1

0

0

2

1–5

1 –5

3

5 a více

5 –20

4

20 a více

Byly provedeny testy na gushing reálných vzorků. Stanovení gushingu bylo prováděno metodou dle VÚPS a metodou Carlsberg. Výsledky těchto analýz jsou uvedeny v Tab. 21. Tab. 21: Porovnání metod stanovení gushingu v obilce ječmene a ve sladu Gushing

Předplodina KUKUŘICE Odrůda KOMPAKT Druh ochrany

Ječmen

Slad

VÚPS

Carlsberg

ml

skupina

ml

skupina

Infikované – bez ochrany

0

1

0

1

Infik. fungicid (Horizon 0,5 + Mirage 0,75)

0

1

0

1

0

1

0

1

0

1

0

1

Infik. fungicid + silwet (Horizon 0,5 + Mirage 0,75 + Silwet) Neinfikované – bez ochrany

Závěr: Srovnáním se správnými hodnotami obsahu deoxynivalenolu v ječmeni a

sladu (LC-MS, VŠCHT, Praha) jsem zjistila, že odchylky se pohybují v kladných i záporných hodnotách. Metoda nevykazuje systematickou chybu (bias) a RSD je na úrovni přesnosti metody (10,46%). Dále bylo dokázáno, že přestože byl ve vzorcích ječmene a sladu stanoven deoxynivalenol, testy na přepěňování byly negativní. U některých vzorků (nejsou zde uvedeny) s přepěňováním na stupnici 2 – 4 byl obsah DON pod limitem detekce. Lze z toho soudit, že obsah trichothecenových mykotoxinů typu B nemá vliv na velikost přepěňování.

78

6 DISKUZE 6.1 MOŽNOSTI ANALÝZY MYKOTOXINŮ METODOU HPLC NA CHROMATOGRAFICKÉ KOLONĚ ONYX MONOLITHIC C18 Vzhledem k tomu, že se na náplňové koloně nepodařilo snížit retenční časy 3-acetyldeoxynivalenolu a 15-acetyldeoxynivalenolu na přijatelnou hodnotu, bylo nutné najít jinou alternativu. Tou byla monolitická kolona Onyx Monolithic C18, která dovoluje zvýšit průtok na 2 ml.min-1 a snížit tak retenční časy analytů. Pro srovnání byly změřeny i DON a NIV.

6.1.1 Optimalizace Objem nastřikované směsi byl konstantní (20 µl), teplota byla 25 °C. Jako optimální mobilní fáze pro separaci analytů byla vzhledem k vyhovujícímu rozlišení a krátké době separace zvolena směs AcN:H2O o koncentraci 8:92 (v/v). Jako optimální průtok pro analýzy DON, NIV, 3-AcDON a 15-AcDON byl zvolen průtok 2 ml.min-1 (Obr. 40). Při zvýšení průtoku na 3 ml.min-1 došlo ke snížení rozlišení (Obr. 41).

15000


výška píku [uAU]

13000 15-AcDON tR = 23,54 min

11000 9000 7000 5000 3000 1000 -1000 15

20

25

30

t [min]

Obr. 40: Chromatogram 3-AcDON a 15-AcDON,

koncentrace 0,1 mg.ml-1,

MF AcN:H2O, koncentrace 8:92 (v/v), průtok 2,0 ml.min-1

79

15000 13000

výška píku [uAU]

11000



9000 7000 5000 3000 1000 -1000 10

12

14

16

18

20

-3000

t [min]

Obr. 41: Chromatogram 3-AcDON a 15-AcDON,

koncentrace 0,1 mg.ml-1,

MF AcN:H2O, koncentrace 8:92 (v/v), průtok 3,0 ml.min-1

80

6.1.2 Kalibrační křivky DON, NIV, 3-AcDON a 15-AcDON změřené na koloně Onyx Monolithic C18 300000


250000 200000 150000 100000 50000 0 0

20

40

60

80 -1


100 120 y = 2534,7x R2 = 0,9908

Obr. 42: Kalibrační křivka deoxynivalenolu (kolona Onyx Monolithic) t = |b/sb| = |5581,1/ 2730,9| = 2,044 tα = 2,160 (ν = n - 2 = 13; α = 0,05) ⇒ t < tα úsek b je statisticky nevýznamný, proto lze použít rovnici regrese ve tvaru y = ax

300000


250000 200000 150000 100000 50000 0 0

20

40

60

80

100

120

-1


Obr. 43: Kalibrační křivka deoxynivalenolu (chybové úsečky)

81

90000 80000 plocha píku [uAU.s]

70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 0

20

40

60

80 -1


100

120 y = 767,34x 2 R = 0,9887

Obr. 44: Kalibrační křivka nivalenolu (kolona Onyx Monolithic) t = |b/sb| = |1858,3/7523,5| = 0,247 tα= 2,160 (ν = n - 2 = 13; α = 0,05) ⇒ t < tα úsek b je statisticky nevýznamný, proto lze použít rovnici regrese ve tvaru y = ax

80000


70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 0

20

40

60

80

100

120

-1


Obr. 45: Kalibrační křivka nivalenolu (chybové úsečky)

82

800000


700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 0

20

40

60

80

100

-1


120 y = 7417,3x 2 R = 0,998

Obr. 46: Kalibrační křivka 15-acetyldeoxynivalenolu (kolona Onyx Monolithic) t = |b/sb| = |13231,3/15414,3| = 0,858 tα= 2,160 (ν = n - 2 = 13; α = 0,05) ⇒ t < tα úsek b je statisticky nevýznamný, proto lze použít rovnici regrese ve tvaru y = ax

800000 700000


600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 0

20

40

60

80

100

120

-1


Obr. 47: Kalibrační křivka 15-AcDON (chybové úsečky)

83

700000


600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 0

20

40

60

80 -1


100 120 y = 5599,1x 2 R = 0,9929

Obr. 48: Kalibrační křivka 3-acetyldeoxynivalenolu (kolona Onyx Monolithic) t = |b/sb| = |17284,8/12135,7| = 1,424 tα= 2,160 (ν = n - 2 = 13; α = 0,05) ⇒ t < tα úsek b je statisticky nevýznamný, proto lze použít rovnici regrese ve tvaru y = ax

700000


600000 500000 400000 300000 200000 100000 0 0

20

40

60

80

100

120

-1


Obr. 49: Kalibrace 3-AcDON (chybové úsečky)

84

Výpočet limitu detekce Limity detekce a limity stanovitelnosti analytů byly stejně jako

v předchozích případech určeny z kalibračních křivek závislosti výšky píku na koncentraci standardů. Limity detekce a stanovitelnosti byly určeny z průměrných hodnot výšek píků šumu, které byly odečítany v oblasti dané 20-ti násobkem pološířky píku analytu. Grafy závislosti výšky píku na koncentraci byly proloženy rovnicí regrese. Do těchto rovnic byly dosazeny hodnoty limitu detekce a limitu stanovitelnosti vyjádřené výškou píku a byly získány hodnoty limitu detekce a limitu stanovitelnosti v µg.ml-1 pro DON, NIV, 3-AcDON, 15-AcDON (Tab. 22). Tab. 22: Tabulka hodnot LOD a LOQ pro DON, NIV, 3-AcDON a 15-AcDON LOD [µg.ml-1]

LOQ [µg.ml-1]

DON

0,20

0,67

NIV

0,75

2,49

3-AcDON

0,60

2,00

15-AcDON

0,67

2,24

Tab. 23: Porovnání hodnot LOD a LOQ získaných kolonou Phenomenex Luna C18 (2) a Onyx Monolithic C18 Phenomenex Luna C18 (2)

Onyx Monolithic C18

LOD [µg.ml-1] LOQ [µg.ml-1] LOD [µg.ml-1] LOQ [µg.ml-1] DON

0,095

0,32

0,20

0,67

NIV

0,055

0,19

0,75

2,49

85

7 ZÁVĚR V této diplomové práci byla řešena problematika separace a kvantifikace trichothecenových mykotoxinů vyskytujících se v ječmeni a sladu a následně vliv těchto mykotoxinů na přepěňování ječmene. Na základě informací z literatury byla vyvinuta metoda pro stanovení deoxynivalenolu a nivalenolu na chromatografické koloně Phenomenex Luna C18 (2). Jako optimální mobilní fáze byla použita AcN:H2O o koncentraci 10:90 (v/v), teplota byla 25 °C, průtok byl 0,6 ml.min-1. Limit detekce pro deoxynivalenol byl 0,095 µg.ml-1 a limit kvantifikace byl 0,32 µg.ml-1. Limit detekce pro nivalenol byl 0,055 µg.ml-1 a limit kvantifikace byl 0,19 µg.ml-1 (Tab. 6). Pro ověření přesnosti metody byly analyzovány cíleně infikované vzorky, jako referenční vzorek byl použit slad Carlsberg. Bylo nutné zjistit, zda má stav ječmene vliv na účinnost extrakci mykotoxinů. Porovnáním výsledků analýzy pomletého ječmene i celé obilky jsem zjistila, že k účinnější extrakci dojde u pomletého ječmene. Tento poznatek byl velmi důležitý pro následné analýzy reálných vzorků. Porovnáním směrnic kalibračních křivek standardu DON a kalibrační křivky cíleně infikovaných vzorků jsem zjistila, že odchylka směrnic (15,46 %) ukazuje na vliv matrice (obilky), a proto je nutné používat pro stanovení DON v reálných vzorcích kalibrační křivku standardu s matricí. Limit detekce pro deoxynivalenol byl 0,16 µg.ml-1 a limit kvantifikace byl 0,53 µg.ml-1, tedy 127,8 µg.kg-1 resp. 426,2 µg.kg-1 (Tab. 16). Přesnost metody je 10,46 % a výtěžnost 85 %. Pro analýzu reálných vzorků byly vybrány čtyři vzorky ječmene odrůdy Kompakt, čtyři vzorky sladu odrůdy Kompakt a 10 vzorků (meziproduktů) odebíraných v průběhu sladování ječmene odrůdy Kompakt. Měřené vzorky ječmene a sladu byly vystaveny různému působení plísně rodu Fusarium a ochrannému účinku fungicidů. Srovnáním experimentálně zjištěných hodnot (HPLC-UV) se správnými hodnotami obsahu deoxynivalenolu v ječmeni a sladu (LC-MS, VŠCHT, Praha) jsem zjistila, že odchylky se pohybují v kladných i záporných hodnotách. Metoda nevykazuje systematickou chybu (bias) a RSD je na úrovni přesnosti metody. 86

Pro zjištění vlivu obsahu mykotoxinů na přepěňování byly provedeny testy na přepěňování a to metodou stanovení přepěňování ječmene za použití H2O2 a kyseliny gibberellinové (dle VÚPS) a stanovením přepěňování sladu třídenním testem Carlsberg. Bylo dokázáno, že přestože byl ve vzorcích ječmene a sladu stanoven deoxynivalenol, testy na přepěňování byly negativní. U některých vzorků (nejsou zde uvedeny) s přepěňováním na stupnici 2 až 4 byl obsah DON pod limitem detekce. Lze z toho soudit, že obsah trichothecenových mykotoxinů typu B nemá vliv na velikost přepěňování. Vzhledem k vysokým retenčním časům 3-AcDON a 15-AcDON na chromatografické koloně Phenomenex Luna C18 (2) není analýza těchto analytů vhodná. Proto byla vyzkoušena chromatografická kolona Onyx Monolithic C18, která umožňuje použít vyšší průtokovou rychlost mobilní fáze a tím snížit retenční časy. Nevýhodou této kolony je však snížení účinnosti separace analytů. Pro separaci trichothecenových mykotoxinů byla jako optimální mobilní fáze použita směs AcN:H2O o koncentraci 8:92 (v/v). Jako optimální průtok pro analýzy DON, NIV, 3-AcDON a 15-AcDON byl zvolen průtok 2 ml.min-1, teplota byla 25 °C. Limit detekce pro deoxynivalenol byl 0,20 µg.ml-1 a limit kvantifikace byl 0,67 µg.ml-1. Limit detekce pro nivalenol byl 0,67 µg.ml-1 a limit kvantifikace byl 2,49 µg.ml-1. Limit detekce pro 3-acetyldeoxynivalenol byl 0,60 µg.ml-1 a limit kvantifikace byl 2,00 µg.ml-1. Limit detekce pro 15-acetyldeoxynivalenol byl 0,67 µg.ml-1 a limit kvantifikace byl 2,24 µg.ml-1 (Tab. 22). Při srovnání těchto hodnot s hodnotami limitů detekce na chromatografické koloně Phenomenex Luna C18 (2) jsem zjistila, že limity detekce na koloně Onyx Monolithic C18 jsou vyšší než na koloně Phenomenex Luna C18 (2) a v případě deoxynivalenolu je limit kvantifikace vyšší, než zákonem daná přípustná hodnota obsahu tohoto mykotoxinu v potravinách. Vzhledem k tomu není kolona Onyx Monolithic C18 vhodná pro stanovení DON a NIV. Ukázala se však být dobrou alternativou pro stanovení analytů s dlouhými retenčními časy a v případě, že jsme limitováni tlakem na koloně a nemůžeme

87

zvýšit průtok mobilní fáze. V případě stanovení trichothecenových mykotoxinů však bude nutná další optimalizace, která by vedla ke snížení limitů detekce.

88

8 SEZNAM POUŽITÝCH ZNAČEK A – plocha píku AAS – atomová absorbční spektrometrie 3-AcDON – 3-acetyldeoxynivalenol 15-AcDON – 15-acetyldeoxynivalenol AES – atomová emisní spektrometrie DON – deoxynivalenol FHB – Fusarium head blight GC – plynová chromatografie H, HETP – výškový ekvivalent teoretického patra HPLC – vysokoúčinná kapalinová chromatografie ICP – indukčně vázané plazma KD – distribuční konstanta LC – kapalinová chromatografie MS – hmotnostní spektrometrie N – počet teoretických pater NIV – nivalenol NMR – nukleárně magnetická rezonance R – rozlišení tR – retenční čas

89

9 SEZNAM LITERATURY 1. Smolková-Keulemanová E., Chem. Listy, 97, 2003, 134-139 2. Kuhn R., Winterstein A., Lederer E., Hoppe Seyler´s Z. Physiol. Chem., 197, 1931, 31. 3. Claesson S., Ark. Kemi. Mineral. Geol., 23A (1), 1946. 4. Churáček J. a kol., Analytická separace látek, SNTL, Praha, 1990. 5. Kardoš E., Berek D., Základy kvapalinovej chromatografie, Alfa, Bratislava, 1976. 6. Tomáš R., Inosin, deoxyinosin, adenosin, deoxyadenosin jako metabolické markery. Jejich stanovení pomocí metody HPLC a HPLC s kapilární monolitickou kolonou, Diplomová práce, MU, Brno, 2005 7. Štulík K. a kol., Analytické separační metody, Karolinum, Praha. 8. Havliš J., Separační metody A, studijní materiál k přednáškám. 9. Šimek Z., Chromatografické metody 1, materiál k přednáškám. 10. hplc.chem.shu.edu/.../inj_load.gif, [online] [cit. 2007-04-19]. 11. Basařová G, Čepička J., Sladařství a pivovarství, skriptum VŠCHT, SNTL, Praha, 1986. 12. Polák B., Váňová M., Onderka M., Základy pěstování a zpracování sladovnického ječmene, Institut výchovy a vzdělání Min. zemědělství ČR, Praha, 1998. 13. Rozsypal S., Přehled biologie, SPN, Praha, 1987. 14. Tichá M., Polní plodiny. Zrniny. Studijní materiál pro absolventy přednášek

a

cvičení

Pěstování

zemědělských

rostlin,

2004,

nepublikován. Brno: Ústav vegetabilních potravin a rostlinné produkce, FVHE VFU, 2004, 31 s. 15. Gajdošová A., Šturdík E., Biologické, chemické a nutričnozdravotné charakteristiky pekárskych cereálií. In Nova biotechnologica: Revue fakulty přírodných vied Nova Biotechnologova IV-1 2004, [online], [cit. 2005-11-02]. Dostupné na www: http://www.ucm.sk/FPV/katedry/biotechnolog/index/html 16. Kadlec P. a kol., Technologie potravin II, vyd. Praha: VŠCHT, Fakulta potravinářské a biochemické technologie, 2002, 236 s 90

17. Velíšek J., Chemie potravin 3, 2. vyd. Tábor: OSSIS, 2002. 368 s. 18. Drastichová K., Faktory ovlivňující mykotoxikologickou kvalitu ovsa, Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, 2005. 19. www.med.muni.cz/dokumenty/pdf/plisne_a_mykotoxiny.pdf, [online] [cit. 2007-01-29]. 20. Malíř F., Ostrý V. a kol., Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka, NCO NZO, Brno, 2003. 21. Radová Z., Hajšlová J., Mykotoxiny v zemědělské produkci ve vazbě na agrární systém. Vědecký výbor fytosanitární a životního prostředí [online], č. 15, 2003, s. 34 [cit. 2005-11-04]. Dostupné na www.phytosanitary.org/projekty/2003/vvf-13-03.pdf , [online], [cit. 2007-01-31]. 22. Sýkorová S., Nedělník J. a kol., Mykotoxiny – stav výskytu v zemědělských surovinách a krmivech v ČR a v Evropě. Vědecký výbor fytosanitární a životního prostředí [online]. 2006, č. 15, s. 34 [cit. 200611-04]. Dostupné na www: http://www.phytosanitary.org/projekty/vvf-15-3.html 23. Gudmestad N., Taylor R., Schwarz P., How healthy is your malt? What you should know about a disease that could affect your beer., The Brewers Market Guide [online], 1997, [cit. 2005-11-20]. Dostupné na www: http://www.brewingtechniques.com/bmg/gudmestad.html 24. Data sheets, deoxynivalenol, Biopure Dostupné na www: http://www.biopure.org/biopureindex/datasheets/mdc/DataCollection_Mycs/Deoxynivalenol.pdf, [online], [cit. 2007-02-01]. 25. Vyhláška Ministerstva zdravotnictví České Republiky č. 305/2004 Sb., kterou se stanoví druhy kontaminujících a toxikologicky významných látek a jejich přípustné množství v potravinách. Ministerstvo vnitra, Sbírka zákonů a mezinárodních smluv [online], [cit. 2006-12-01]. Dostupné na www: http://www.mvcr.cz/sbirka/2004/zakon_05.html#castka_100 26. Suková

I.,

Navržené

limitní

hodnoty

pro

fusariové

toxiny.

Agronavigátor [online]., č. 31364, 2004 [cit. 2007-02-05]. 91

Dostupné na www: http://www.agronavigator.cz/default.asp?ids=158&ch=13&typ=1&val= 31364 27. Schwarz P., J.Inst. Brew.,Vol.102, 1996, 93-96. 28. Casey G. P., Technical Quartely, 33 (1996), 229 – 235. 29. Dilly P., Gushing – eine Bestandsaufnahme, Brauwelt, 45, 1988, 20622072. 30. Havlová P., Sypecká Z., Nevrklová M., Stanovení deoxynivalenolu (DON) ve sladu vyrobeném z ječmene cíleně infikovaných izobáty Fusarium spp., Kvasný průmysl, 2003, roč. 49, č. 6, s. 146-153. 31. data sheets, nivalenol, Biopure, [online], [cit. 2006-02-01]. Dostupné na www: http://www.biopure.org/biopureindex/datasheets/mdc/DataCollection_Mycs/Nivalenol.pdf 32. data sheets, 3-acetyldeoxynivalenol, Biopure, [online], [cit. 2006-02-01]. Dostupné na www: http://www.biopure.org/biopureindex/datasheets/mdc/DataCollection_Mycs/3-Acetyldeoxynivalenol.pdf 33. data sheets, 15-acetyldeoxynivalenol, Biopure, [online], [cit. 2006-02-01]. Dostupné na www: http://www.biopure.org/biopureindex/datasheets/mdc/DataCollection_Mycs/15Acetyldeoxynivalenol.pdf 34. Olsson J., Börjesson T., Lundstedt T., Schnürer J., Int. J. Food Microbiol. 72, 2002, 203-214. 35. Onji J. a kol., J. Chromatogr. A, 815, 1998, 59-65. 36. Razzazi-Fazeli E., Böhm W., J. Chromatogr. A, 854, 1999, 45-55. 37. Kotal F., Radová Z., Czech J. Food Sci., 20, 2002, 63-68. 38. Snyder A. P., 1986. J. Food Prot., 49, 544. 39. Koch P., Toxicol. Lett., 153, 2004, 109-112. 40. Mikrosladovací zkouška 3200, metoda vychází z metody MEBAK 2.5.3.1 (MEBAK 1997) a změny přijaté Barley & Malt Committe EBC (Perugia, 31.5.2000), materiál poskytnutý VÚPS Brno, nepublikován, Brno: VÚPS, 2006, 2 s. 41. Curtui V., Brockmeyer A., Dietrich R., Kappenstein O., Klaffke H., Analytik und Vorkommen wichtiger Fusarientoxine (Deoxynivalenol, 92

Zearalenon) sowie Aufnahme dieser Toxine durch den deutschen Verbraucher, Verbundforschungsprojekt 00HS 055. 42. Razzazi-Fazeli. E., Böhm. W., Jarukamjorn. K., Zentek. J.: J. Chromatogr. B, 796, 2003, 21-33. 43. Tims M.C., The Chemical Ecology of Hydrastis canadensis L. (Ranunculaceae): Effects of Root Isoquinoline Alkaloids on the Hydrastis Endophyte, Fusarium oxysporum University of Maryland, 2006. Dostupné na: https://drum.umd.edu/dspace/bitstream/1903/4052/1/umiumd-3762.pdf 44. Havlová P., Kosař K., Předpověď přepěňování piva z ječmene.VÚ 07: výzkumná zpráva. vyd. Brno: VÚPS, 2005. 48 s., 28 příl. 45. Radová Z., Holadová K., Hajlová J., Comparison of two clean-up principles for determination of trichothecenes in braun extrakt, J. Chromatogr. A, 829, 1998, 259-267 46. MycoSep 225 Trich Push-through format, Clean-up for Type A and B Trichothecenes. Manuál pro způsob přečištění trichothecenu typu A a B. Romer Labs. 47. Čapková V., Ječmenářská ročenka 2006, vyd. Brno: VÚPS, 2005, 317 s.

93

94

Stanovení trichothecenových mykotoxinů v ječmeni a sladu

Recommend Documents