Stanovení organofosforových pesticidů ve vodě a půdě micelární elektrokinetickou chromatografií Úkol: Proveďte extrakci organofosforových pesticidů z reálných vzorků vody a půdy. Dále proveďte jejich separaci a následné stanovení pomocí micelární elektrokinetické chromatografie s laserem indukovanou fluorescencí. Teoretická část: Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) je elektromigrační separační metoda vyznačující se vysokou účinností separace, rychlou analýzou, malou spotřebou vzorku a rozpouštědla a krátkou dobou potřebnou na optimalizaci separačních podmínek. Jedná se o techniku užívanou především pro analýzu neutrálních molekul hydrofobní i hydrofilní povahy. Separační pufr v MEKC obsahuje látku schopnou vytvářet útvary zvané micely, které vytváří micelární fázi. Mezi tyto látky patří například tenzidy, tedy povrchově aktivní látky. Dělení analytů v MEKC probíhá na základě jejich rozdílné distribuci mezi vodnou a micelární fázi. V MEKC jsou většinou používány hodnoty pH pufrů v rozmezí 7-10 (např. borátový a fosfátový pufr). Tyto pufry generují při vloženém napětí napříč kapilárou vysoký elektroosmotický tok (EOF), který směřuje přes detektor ke katodě. Pro separaci nenabitých molekul analytů je potřeba vzniku nabitých micel, jež migrují v elektrickém poli vlastní elektroforetickou rychlostí, která je úměrná jejich poměru náboje k velikosti. Dělení nenabitých molekul analytů probíhá na základě jejich rozdílné distribuci mezi vodnou a micelární fázi, která je pomocí elektroosmotického toku unášena směrem k detektoru. V případě nabitých molekul analytů probíhá navíc i dělení podle jejich rozdílných elektroforetických mobilit. Mechanismus separace je představený na Obr 1.
Obr. 1 Mechanismus MEKC při použití aniontového tenzidu
V MEKC může být selektivita ovlivněna typem použitého iontového tenzidu tvořícího micelární fázi a jeho koncentrací. Aniontové micely migrují v nepokryté křemenné kapiláře v opačném směru než elektroosmotický tok. Rychlost elektroosmotického toku je však větší než elektroforetická rychlost micel a aniontové micely jsou tímto tokem unášeny ke katodě. Při použití kationtových micel (v dostatečné koncentraci) dochází v důsledku pokrytí stěny kapiláry pozitivními náboji tenzidů
k převrácení elektroosmotického toku směrem
k anodě. Proto je nutné k zajištění detekce obrátit polaritu elektrod. Selektivita může být taktéž ovlivněna použitím organických aditiv, které mají vliv na změnu migračních vlastností analytů. Těmito aditivy jsou např. organická rozpouštědla a močovina. Nejpoužívanějšími organickými rozpouštědly jsou methanol a acetonitril, a to kvůli jejich vyhovujícím bodům varu a tuhnutí, nízké absorpci v UV oblasti a nízké viskozitě. Obdobně jako v chromatografii je retenční faktor pro nenabité analyty k´ v MEKC definován poměrem látkového množství analytu v micelární fázi nmc a látkového množství analytu ve vodné fázi naq, což znázorňuje rovnice (1). k´=
nmc n aq
(1)
Elektroforetická mobilita analytů μeff může být vyjádřena pomocí migračních časů, které odečteme z příslušného elektroferogramu. Tento vztah vystihuje rovnice (2). ć 1 1 ö ćL ×L ö m eff = çç - ÷÷ × ç t d ÷ , č t r t eo ř č V ř
(2)
kde tr je migrační čas příslušného analytu, teo retenční čas nezadržované molekuly (tzv. marker EOF), Lt celková délka kapiláry, Ld efektivní délka kapiláry a V napětí vložené napříč kapilárou.
Detekce v CE V kapilární elektroforéze jsou možné dva způsoby detekce, kterými jsou off-line a on-line detekce. Častěji využívanou detekcí je on-line detekce probíhající přímo. Nejčastěji využívanými typy detektorů jsou spektrofotometrické detektory, jejichž citlivost je však omezena krátkou optickou délkou danou průměrem separační kapiláry.
Pro citlivou detekci je možné použít např. fluorescenční detekci, a to laserem indukovanou fluorescenci (LIF). Tato metoda je vhodná pouze pro látky schopné absorbovat záření v UV oblasti a následně vysílat záření o vyšší vlnové délce. Nevýhodou laserem indukované fluorescence, je fakt, že pokud látka neobsahuje fluorofor, je nutné provést derivatizaci analytů reakcí s látkou obsahující fluorofor nebo provést nepřímou detekci. Tab. I Nejčastěji používané lasery a jejich excitační vlnové délky Laser HeNe Ar+ Diodový
Vlnová délka (nm) 543, 632 488, 514 645 - 840
V našem případě budeme používat detektor vybavený Ar+ laserem s excitační vlnovou délkou 488 nm. Proto je nutné v případě použití nepřímé LIF detekce přidat do základního elektrolytu určitou koncentraci látky, která je schopna absorbovat UV záření v této oblasti a následně ho emitovat při vyšší vlnové délce (λem. = 520 nm). V našem případě budeme používat fluorescein. Principem nepřímé detekce je fakt, že pokud doputuje zóna analytu k detektoru, dojde ke „zředění“ fluoreskujícího aditiva a tím tedy i k poklesu fluorescence a detektor zaznamená negativní pík.
Organofosfáty Pesticidy jsou přípravky a prostředky určené k prevenci, tlumení a hubení nežádoucích mikroorganismů rostlin a živočichů. Slouží tedy k ochraně rostlin, skladových zásob, zemědělských komodit a krmiv atd. Nejrozšířenější uplatnění mají v zemědělství. Vzhledem k jejich toxicitě je potřeba monitorovat jejich koncentrace. Pesticidy se silně sorbují v půdě, proto jejich pronikání do podzemních vod probíhá jen v omezené míře. Prokazatelné jsou tehdy, když je sorpční kapacita půdy nedostatečná. Pesticidy se vyskytují zejména v povrchových vodách, kde mohou být přítomny v rozpuštěné nebo nerozpuštěné formě. Z velké části mohou být sorbovány na nerozpuštěných minerálních i organických látkách. Po vstupu organofosfátů do organismu dochází k jejich metabolizaci. Jejich nevýhodou je, že mají velkou akutní toxicitu. Z chemického hlediska se převážně jedná o estery kyselin fosforečné, popř. thiofosforečné. Organofosfáty jsou rovněž vysoce lipofilní
látky. Obecný vzorec pro organofosfáty je znázorněn na obrázku 3. Na obr. 4 jsou znázorněny organofosforové pesticidy, které budou stanovovány ve cvičení.
Obr. 2 Obecný vzorec pro organofosfáty
diazinon Obr. 3 Strukturní vzorce izofenfosu, malationu a diazinonu
Odběr vzorku vody a půdy Vzorky vody se odebírají do tmavých skleněných lahví o objemu minimálně 1 L. Láhve se plní vodou až po zátku. Měly by být uchovávány v chladu (kolem 4 °C) a na tmavém místě. Během transportu do laboratoře je nutné zamezit degradaci pesticidů a kontaminaci odebraných vzorků. Vzorky vody je vhodné analyzovat v co nejkratší době po odběru. Vzorky půdy se odebírají sondážními tyčemi, průměrný vzorek se skládá z minimálně 30 odběrových míst. Hloubka odběru se řídí především typem pěstovaných plodin. Pesticidy se ve vodách a půdách většinou nacházejí v nízkých koncentračních řádech (ng/l nebo menší), a proto je nutné tyto látky před vlastní separací zakoncentrovat. K tomuto účelu slouží extrakce.
Extrakce Extrakce je separační metodou sloužící pro izolaci, čištění, k zakoncentrování cílových analytů a odstranění nežádoucích látek, které by mohly rušit analytická stanovení. Podle skupenství fází, mezi kterými dochází k přechodu látek, se může jednat o extrakci z pevné fáze do kapaliny, extrakci z kapaliny do kapaliny nebo extrakci z kapaliny nebo plynu na pevnou fázi. Vysoce účinnou extrakční technikou je superkritická fluidní extrakce využívající superkritickou tekutinu oxidu uhličitého jako extrakční médium.
Praktická část: Chemikálie Deionizovaná voda, kyselina boritá, standardy organofosfátů (malation, isofenos, diazinon), aceton, dichlormetan, fluorescein, aceton, dichlormethan, acetonitril, dodecyl sulfát sodný, vzorky půdy a vody (řeka Morava). Pomůcky 3 Kádinky, 2 odměrné baňky 100 ml, 2 odměrné baňky 50 ml, nylonové filtry s velikostí pórů 0,45 µm, teflonové míchadlo, křemenná kapilára s vnitřním průměrem (50 µm a celkové délky 65 cm), řezátko, viálky, SPE kolonky, ependorfky.
Přístroje: Agilent HP
3D
CE s LIF detektorem, elektromagnetická míchačka, vypalovač detekčních
okýnek, ultrazvuk, pH metr, váhy, aparatura pro SPE
Separační parametry: Separační napětí:
+ 20 kV
Dávkování:
hydrodynamicky 50 mbar/5s
Promývání mezi analýzami:
5 minut separačním pufrem
Teplota:
20 °C
Příprava roztoků: · Příprava separačního elektrolytu (100 ml): 50 mM borát sodný o pH 9,0 + 20 mM SDS + 5∙10-7 M fluorescein
o připravte 50 mM roztok kyseliny borité, navažte potřebné množství SDS (výsledná koncentrace 20 mM) a pomocí NaOH dotitrujte na potřebnou hodnotu pH o k roztoku navažte potřebné množství fluoresceinu – výsledná koncentrace 5∙10-7 M (v první řadě připravte koncentrovanější roztok a potřebnou koncentraci získejte ředěním pufrem) o před analýzou přefiltrujte elektrolyt přes nylonový filtr s velikostí pórů 0,45 µm · připravte sadu kalibračních roztoků v koncentračním rozmezí, které vám zadá vedoucí cvičení
Příprava vzorku: · Vzorek vody: o Odměřte 10 ml vzorku vody a podle pokynů vedoucího cvičení proveďte SPE extrakci (nejprve je nutné provést kondicionaci SPE kolonky, následně aplikovat vzorek a provést eluci analytu z kolonky – aceton/dichlormetan) o Vzorek získaný SPE extrakcí odfoukejte pomocí dusíku do sucha a rozpusťte v 1 mL směsi acetonitril : pufr (1:1) · Vzorek půdy: o Navažte 5 g předloženého vzorku půdy a podle instrukcí vedoucího cvičení proveďte superkritickou fluidní extrakci (SFE).
Postup: · Podle instrukcí vedoucího cvičení uřízněte potřebnou délku separační kapiláry (65 cm). · Ve vzdálenosti 50 cm odstraňte (pomocí vypalovače) polyimidovou vrstvu kapiláry (cca 0,5 cm), čímž vytvoříte detekční okýnko potřebné pro online detekci · Okýnko omyjte methanolem a důkladně vysušte · Podle instrukcí vedoucího cvičení umístěte na kapiláru interface a vložte kapiláru do CE kazety a následně do přístroje · Za pomoci vedoucího cvičení zapněte přístroj, promyjte kapiláru (10 minut H2O, 10 minut separační pufr) a nastavíte všechny parametry metody (separační napětí, způsob dávkování, promývání, teplotu, atd.). · Do dvou plastových viálek odpipetujte 600 µl separačního elektrolytu: 1. viálka bude sloužit jako promývací, 2. jako separační. · Dále připravte viálky obsahující připravený vzorek a kalibrační vzorky.
· Postupně proměřte všechny kalibrační roztoky a poté vzorky (každé měření provádějte 3x!) · Sestavte kalibrační křivky a vypočtěte množství isofenosu, malationu a diazonanu ve vodě a půdě (nezapomeňte na ředění při úpravě vzorku).
Otázky: · Jaký je obecný vzorec pro organofosfáty? · Jakým způsobem se odebírají vzorky vody? · Jaké jsou výhody spojení kapilární elektroforézy s LIF detektorem? · Co znamenají zkratky MEKC, SDS, CMC? · Jaký je princip micelární elektrokinetické chromatografie?
Literatura: 1. Principles of Fluorescence Spectroscopy: J.R. Lakowicz. 2. Micellar elektrokinetic chromatography, Procedia Chemistry, 2 (2010) 2, S. Terabe. 3. Teoretické základy a separační principy kapilárních elektromigračních metod, Chemické listy, 91 (1997) 320 – 329, V. Kašička.
