MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE
Stanovení obsahu stilbenových fytoalexinů u stresovaných buněčných suspenzních kultur révy vinné Bakalářská práce
Jan Blažek
Vedoucí práce: Mgr. Tomáš Kašparovský, Ph.D.
Brno 2015
Bibliografický záznam Autor:
Název práce:
Jan Blažek Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie Stanovení obsahu stilbenových fytoalexinů u stresovaných buněčných suspenzních kultur révy vinné
Studijní program:
Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Vedoucí práce:
Mgr. Tomáš Kašparovský, Ph.D.
Akademický rok:
2014/2015
Počet stran:
39
Klíčová slova:
fytoalexiny; stilbeny; resveratrol; piceid; Vitis vinifera cv. Gamay
Bibliographic Entry Author
Title of Thesis:
Jan Blažek Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry Determination of stilbene phytoalexin content in stressed grapevine cell suspension cultures
Degree programme:
Biochemistry
Field of Study:
Biochemistry
Supervisor:
Mgr. Tomáš Kašparovský, Ph.D.
Academic Year:
2014/2015
Number of Pages:
39
Keywords:
phytoalexins; stilbenes; resveratrol; piceid; Vitis vinifera cv. Gamay
Abstrakt Fytoalexiny jsou nízkomolekulární látky s antimikrobiálními vlastnostmi. Jsou syntetizované de novo v reakci na biotický a abiotický stres. Fytoalexiny jsou důležitým prvkem složitých obranných reakcí rostlin, které jsou dnes intenzivně zkoumány. Člověk je závislý na rostlinné výrobě, na kterou navazuje také živočišná výroba. Ovšem kvůli patogenním onemocněním rostlin o velkou část úrody přicházíme, proto objasnění obranného mechanismu rostlin může přispět ke šlechtění rezistentních odrůd nebo k vývoji postřiků na přírodní bázi, které by pouze nastartovaly vlastní obranu rostliny. Dnes je totiž tendence vyvarovat se chemickým postřikům, které jsou často škodlivé nejen pro vlastní patogen, ale i pro další složky ekosystému, včetně člověka. Cílem práce bylo stanovení obsahu stilbenových fytoalexinů po působení biotického a abiotického stresu u třídenních a pětidenních buněčných suspenzních kultur Vitis vinifera cv. Gamay v extracelulárním médiu a v extraktu z buněk. K analýze stilbenů byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie s reverzní fází. Výsledky potvrzují hypotézu, že k syntéze stilbenových fytoalexinů dochází po působení biotického a abiotického stresu, přičemž významnější produkce byla zaznamenána u biotického stresu. Resveratrol se nacházel v extracelulárním médiu i v extraktu z buněk. Piceid se vyskytoval jen v extraktu z buněk, což by potvrzovalo, že má zásobní funkci.
Abstract Phytoalexins are low molecular compounds with antimicrobial properties. They are synthesized de novo in response to biotic and abiotic stresses. Phytoalexins are an important element of complex defense reactions in plants, which are currently intensively investigated. Humans depend on crop production, which also builds on livestock production. However, a large part of the crop yield is lost due to the plant pathogenic diseases, and therefore clarification plant defense mechanisms may contribute to the breeding of
resistant varieties or to developing sprays on a natural basis, which would start up the plant´s own defense. Currently there is also a tendency to avoid chemical sprays which are often harmful not only for the pathogen, but also for other components of the ecosystem including humans. The aim of this work was to determine the content of stilbene phytoalexins after exposure to biotic and abiotic stress in three-day and five-day old cell suspension cultures of Vitis vinifera cv. Gamay in the extracellular medium and in the cell extract. Reversed-phase high performance liquid chromatography was used to analyze stilbenes. The results confirm the hypothesis that the synthesis of stilbenic phytoalexins occurs when the cells are exposed to biotic and abiotic stress, where significant production was observed upon biotic stress. Resveratrol was found in the extracellular medium and in cell extract. Piceid was found only in cell extract, which would confirm that it has a storage function.
Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat vedoucímu práce Mgr. Tomáši Kašparovskému Ph.D. a své konzultantce Mgr. Kateřině Dadákové za cenné rady a pomoc při vypracování bakalářské práce.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 11. 5. 2015
……………………………… Jan Blažek
1. OBSAH
1. OBSAH .................................................................................................................. 8 2. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ............................................................................... 9 3. TEORETICKÁ ČÁST ............................................................................................... 10 3.1 Vztahy mezi patogenem a rostlinou ............................................................. 10 3.2 Elicitory ............................................................................................................... 11 3.3 Obranné mechanismy rostlin ......................................................................... 13 3.3.1 Konstitutivní obrana ............................................................................... 13 3.3.2 Indukovaná obrana .................................................................................. 13 3.4 PR proteiny ......................................................................................................... 14 3.5 Reaktivní formy kyslíku a dusíku ................................................................... 15 3.6 Hypersenzitivní reakce..................................................................................... 16 3.7 Fytoalexiny.......................................................................................................... 17 3.8 Stilbenové fytoalexiny ..................................................................................... 18 3.9 Fytoalexiny z jiných skupin látek ................................................................... 21 3.9.1 Fenylpropanoidy ....................................................................................... 21 3.9.2 Terpenoidy ................................................................................................. 23 3.9.3 Acetyleny.................................................................................................... 23 4. PRAKTICKÁ ČÁST ................................................................................................. 25 4.1 Materiál a metody ............................................................................................ 25 4.1.1 Biologický materiál a chemikálie ......................................................... 25 4.1.2 Působení stresových faktorů ................................................................. 25 4.1.3 Příprava vzorků ........................................................................................ 25 4.1.4 HPLC analýza ............................................................................................. 26 4.2 Výsledky a diskuze ............................................................................................ 26 5. ZÁVĚR ................................................................................................................. 32 6. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ............................................................................ 33
8
2. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns)
s patogenem spojené molekulární vzory
DMAPs (Damage-Associated Molecular Patterns)
s nebezpečím/poškozením spojené molekulární vzory
MAMPs (Microbe-Associated Molecular Patterns)
s mikroby spojené molekulární vzory
PGPR (plant growth-promoting rhizobacteria)
rhizobakterie podporující rostlinný růst
PTI (PAMP-tiggered immunity)
PAMP vyvolaná imunita
ETI (effector-triggered imunity)
efektory vyvolaná imunita
PR proteiny (Pathogenesis-related proteins)
proteiny spojené s patogenezí
ROS (reactive oxygen species)
reaktivní formy kyslíku
RNS (reactive nitrogen species)
reaktivní formy dusíku
HR (hypersensitive response)
hypersenzitivní reakce
PCD (programmed cell death)
programovaná buněčná smrt
EC50 (effective dose)
účinná dávka nutná k dosažení 50 % úmrtnosti
STS (stilbene synthase)
stilben syntáza
CHS (chalcone synthase)
chalkon syntáza
KONT
negativní kontrola
10 °C / 35 °C
teplotní stres
MECH
mechanický stres
NaCl
stres zasolením
BS
Botrytis cinerea
ND
nedetekováno 9
3. TEORETICKÁ ČÁST 3.1 Vztahy mezi patogenem a rostlinou Rostliny se nemohou pohybovat, aby se vyhnuly problémům ve svém životním prostředí, a proto jsou vystaveny jak abiotickému stresu, tak patogenním mikroorganizmům jako jsou houby, bakterie, viry, hlístice a hmyz [1], [2]. Ale pouze malá část patogenů nakonec napadne rostlinu a vyvolá onemocnění [3], [4]. Rostliny tedy vyvinuly širokou škálu složitých mechanismů rezistence, kterými se snaží útoky patogenů rozpoznat a účinně se proti nim bránit [2], [5]. Rezistence (odolnost) je schopnost rostliny zablokovat nebo oddálit aktivitu patogenu a následnou infekci, citlivost je naopak podlehnutí infekci patogenu [3], [6]. Po kontaktu rostliny a patogenu mezi nimi dochází k vzájemné interakci [7]. Téměř každá interakce hostitel-patogen je jedinečná v jednotlivostech vzájemného kontaktu a je specifická pro danou kombinaci patogenu a hostitele [8]. Interakce může být pro patogen úspěšná, pak dochází k infekci (kompatibilní odpověď), nebo neúspěšná a dochází k rezistenci (nekompatibilní odpověď) [9]. Patogen se snaží o kolonizaci hostitele a využití jeho zdrojů, přičemž musí být nejprve schopen rozpoznat přítomnost svých hostitelských rostlin a potom prolomit několik obranných linií rostliny před dosažením živé buňky [8]. Úspěšné patogeny musí být také schopny rozpoznat a překonat reakce obrany rostlin [7], [10]. Patogenní mikroorganismy používají různé strategie, jak získat přístup do rostlinné tkáně. Bakterie obvykle vstupují prostřednictvím kořenového systému, protože většina bakterií žije v půdě, nebo prostřednictvím průduchů či zranění. Patogenní houby pronikají přímo do epidermální nebo mezofilní vrstvy pomocí hyf, někdy vytváří specializované struktury haustoria [11]. Existují dva základní typy patogenů: nekrotrofní (produkují toxické enzymy a metabolity, které narušují buněčné stěny a membrány a po usmrcení buňky využívají její metabolity ke svému růstu), biotrofní (živí se na rostlinách paraziticky a je pro ně nežádoucí, aby byla buňka usmrcena) a hemibiotrofní (nejprve se živí paraziticky a po usmrcení buňky jejími metabolity) [12].
10
3.2 Elicitory Dříve se jako elicitor označovaly látky vedoucí k syntéze fytoalexinů, dnes se elicitorem označuje každá látka schopná vyvolat jakoukoliv formu obranné reakce [10], [13]. Elicitory mohou vyvolávat obrannou rekci i v malé koncentraci, čímž se liší od toxinů, které působí až při vyšších koncentracích a navíc mají na rostlinu jen škodlivý účinek [13]. Elicitory se dělí na nespecifické (obecné), které jsou schopné vyvolat obranu v širokém spektru rostlinných druhů, tedy v hostitelských i nehostitelských rostlinách, a specifické, které vyvolají rezistenci jen v některých kultivarech, které disponují příslušnými receptory [13], [14] (Obr. 1). Mezi nespecifické (obecné) elicitory patří: s patogenem spojené molekulární vzory (PAMPs – Pathogen-Associated Molecular Patterns), s nebezpečím/poškozením spojené molekulární vzory (DAMPs – Damage-Associated Molecular Patterns), s mikroby spojené molekulární vzory (MAMPs – Microbe-Associated Molecular Patterns) a abiotické elicitory [14], [15]. PAMPs, často označované jako exogenní biotické elicitory, jsou vylučovány patogenem nebo se uvolňují z jeho buněčných stěn a dalších struktur působením různých hydrolytických enzymů. DAMPs, označované také jako endogenní biotické elicitory, mají původ v hostiteli, kde jsou generovány při interakci mezi patogenem a hostitelem, tedy narušováním hostitelských buněčných struktur. Zdrojem MAMPs jsou nepatogenní kmeny některých bakterií označované jako plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR). Elicitory MAMPs se mohou označit také jako exogenní biotické elicitory [14], [15], [16]. Strukturně mohou nespecifické elicitory patřit mezi proteiny, glykoproteiny, polysacharidy, lipidy, lipopolysacharidy, glykany, oligosacharidy atd. [13], [17]. Mezi abiotické elicitory se řadí chemické a fyzikální elicitory. Chemické elicitory zahrnují rozmanitou sbírku molekul, které ovšem nejsou odvozeny od přírodních složek. Patří sem například soli těžkých kovů, detergenty nebo i syntetické molekuly, z nichž se některé dokonce využívají jako postřik [14]. Mezi fyzikální elicitory řadíme UV záření, teplotní a mechanický stres [17], [18]. Rostlina k rozpoznání nespecifických elicitorů využívá receptory na povrchu buněk, přičemž elicitor působí jako ligand a po navázání na receptor je spuštěna signální kaskáda vedoucí k rezistenčním reakcím, i když ke spoustě elicitorů ještě nebyly konkrétní receptory nalezeny nebo potvrzeny [10], [19]. Taktéž fyzikální elicitory spouští signální kaskádu vedoucí k obranným reakcím ovlivněním propustností membrán, změnou iontové síly, osmolarity nebo redoxního prostředí [20]. Nespecifické elicitory spouští bazální obrannou reakci nazývanou PAMPtriggered immunity (PTI) [14], [16]. Obranná reakce spuštěná nespecifickými elicitory může být dostatečně účinná, aby zastavila postup patogenu, ale i přes to mohou některé patogenní mikroorganismy tuto spuštěnou rezistenci překonat vpravením virulentních efektorových proteinů (nemusí to být nutně jen proteiny) do hostitelských 11
buněk [14], [21]. Tyto efektorové proteiny mají za úkol inhibovat signalizační cesty obranných reakcí, což je příčinnou citlivosti mnoha rostlin na virulentní patogeny. Proto rostliny vyvinuly další obrannou strategii. K některým efektorům, které jsou produkty genů avirulence (Avr) patogenů, disponují rezistentní rostliny geny rezistence (R), jejichž produkty jsou cytosolické receptory. Tyto receptory rozpoznávají příslušné efektory (tím se z efektorů stávají specifické elicitory) a spouští cílenou a účinnou obrannou reakci [6], [14]. Rezistentní rostlina musí mít ke genu avirulence gen rezistence [21]. Pokud rostlina gen rezistence nemá, je napadena a nezačne se účinně bránit. Specifické elicitory spouští obrannou reakci nazývanou effector-triggered imunity (ETI) [14], [15].
Obr. 1: Dělení elicitorů; převzato z [14] a upraveno
12
3.3 Obranné mechanismy rostlin Rostliny vyvinuly množství obranných mechanismů proti nejrůznějším patogenům [22]. Obranné mechanismy se různým způsobem překrývají [23]. Základní rozdělení obranných mechanismů je na konstitutivní obranu a indukovanou obranu [24]. Konstitutivní obrana je založená na předem vytvořených bariérách bránících patogenu v napadení [4]. Pokud patogen překoná tyto bariéry a rostlina dokáže rozpoznat, že je napadena, může spustit indukovanou obranu, která se snaží zastavit šíření patogenu a zlikvidovat jej [4], [25].
3.3.1 Konstitutivní obrana Konstitutivní (pasivní) obrana je založena na přirozených překážkách, které mají rostliny vytvořené předem, ještě před napadením [24], [25]. Mezi konstitutivní obranu patří morfologické, strukturní a chemické bariéry [25]. Příkladem morfologické bariéry je výška rtů svěracích buněk průduchů. Průduchy jsou nejčastějším místem vstupu patogenu do rostliny a například některé patogenní rzi dokážou detekovat svého hostitele právě podle morfologické stavby průduchů. Strukturními bariérami je kutikula obsahující kutin, který je částečně prostoupen voskem [4], [26]. Strukturní bariérou je i vosková vrstva na povrchu kutikuly, která chrání rostlinu jak proti patogenům, tak i proti vysychání. Dalšími strukturními bariérami jsou trichomy popřípadě trny, které rostlinu chrání proti hmyzu a býložravým živočichům a neposlední řadě jednou z hlavních strukturních bariér je buněčná stěna tvořená převážně ligninem a celulózou [27], [28]. Lignin, způsobující dřevnatění, vzniká polymerací prekurzorů produkovaných fenylpropanoidovou dráhou a zvyšuje mechanickou odolnost proti degradujícím enzymům vylučovaných patogenem [27]. Chemickou bariérou jsou různé sekundární metabolity (terpenoidy, steroidy, glykosidy atd.) většinou specifické pro určitý rostlinný druh [3], [25]. Mnoho z těchto sekundárních metabolitů působí jako antimikrobiální látky, v tomto případě označované jako fytoanticipiny [8], [17].
3.3.2 Indukovaná obrana Indukovaná (aktivní) obrana vede k expresi obranných genů a spouštění různých obranných reakcí jako je rychlé oxidační vzplanutí, hypersenzitivní reakce, syntéza PR proteinů, syntéza fytoalexinů a zesílení buněčné stěny včetně většího zesíťování jejích stavebních složek [4], [8]. Pro rostlinu je výhodné aktivovat obranné mechanismy až po napadení, protože udržovat obranné mechanismy stále aktivní by stálo mnoho energie [29]. Indukovaná obrana se po působení stresového faktoru rozvíjí i v jiných orgánech rostliny díky tzv. systémové rezistenci, kdy je od místa působení stresového faktoru 13
šířen signál v podobě kyseliny salicylové, kyseliny jasmonové nebo etylenu (v závislosti na rozpoznaném typu elicitoru) do celé rostliny a i zde dochází k expresi obranných genů [9], [14]. Tím se stávají i vzdálené buňky od místa působení stresového faktoru odolnější proti případnému šíření stresu [3].
3.4 PR proteiny PR proteiny (Pathogenesis-related protein) hrají důležitou roli při obraně proti patogenu, ať už to jsou houby, bakterie viry, hmyz a býložravci, ale i při všeobecném přizpůsobení na stresové prostředí vyvolané abiotickým stresem. U některých rostlinných druhů se PR proteiny vyskytují i ve zdravých tkáních, ale výrazná produkce nastává až v reakci na stresové prostředí. V minulosti byl často termín PR protein nesprávně používán pro označení všech patogenem indukovaných proteinů, včetně enzymů, jako je fenylalanin amoniak lyáza, které jsou konstantně přítomné u zdravé rostliny, ale také se zvyšuje jejich koncentrace během infekce [4], [5], [30]. Na rozdíl od fytoalexinů, které jsou vyráběny převážně ve zdravých buňkách lokalizovaných kolem poškozených a nekrotických buněk, se PR proteiny hromadí kromě buněk tkání kolem infikovaných částí také v odlehlých neinfikovaných částech rostliny. Produkce PR proteinů v neinfikovaných částech rostliny může zabránit další infekci nebo jejímu rozrůstání do dalších částí rostliny. PR proteiny v rostlinách byly poprvé objeveny v návaznosti na atak patogenem u tabáku (Nicotiana tabacum), infikovaných virem tabákové mozaiky [31]. Později byly tyto proteiny nalezeny v mnoha rostlinách jak jednoděložných tak dvouděložných. PR proteiny se vyznačují druhovou specificitou, což umožňuje jejich použití jako genetických markerů v taxonomické, fylogenetické a evoluční studii. PR proteiny se vyznačují specifickými biochemickými vlastnostmi. Jedná se o heterogenní skupinu nízkomolekulárních proteinů s velikostí v rozmezí 5 až 75 kDa [4]. Jsou extrahovatelné a stabilní při nízkém pH (<3), dále termostabilní a vysoce odolné vůči proteolytické degradaci [18]. PR proteiny mohou být v závislosti na svých izoelektrických bodech rozděleny na kyselé nebo zásadité proteiny, přičemž ale mají podobné funkce. Většina kyselých PR proteinů se nachází v mezibuněčných (apoplastických) prostorách a zásadité se nachází ve vakuolách, ale není to pravidlem [5], [18], [32]. PR proteiny byly nalezeny v primárních a sekundárních buněčných stěnách a obecně ve všech rostlinných orgánech (listy, stonky, kořeny, květy). To znamená, že výskyt PR proteinů není omezen jen na fotosyntetizující tkáně. Nejvíce jich bylo nalezeno v listech, kde mohou dosahovat až 5-10 % z celkového počtu proteinů. V listech jsou přítomny v mezofylu a v epidermální tkáni. Jsou také lokalizovány v zóně padání listů a květenství. V květenství byly detekovány v kalichu, prašnících a pestících.
14
V současné době jsou PR proteiny rozděleny do 17 rodin (PR-1 až PR-17) podle svých vlastností a funkcí [18], [30]. Mezi nejznámější patří hydrolytické enzymy (chitinázy, β-1,3-glukanázy a proteinázy). Chitinázy patří např. do PR-3 rodiny. Jsou to enzymy katalyzující štěpení vazby mezi C1 a C4 dvou po sobě následujících N-acetyl-D-glukosaminových monomerů chitinu. Ty jsou značně rozšířeny v přírodě, vyskytují se u bakterií, hub i živočichů. Chitin je společná součást buněčné stěny hub a exoskeletu členovců. β-1, 3-glukanázy patří do PR-2 rodiny. β-1,3-glukanázy jsou schopny katalyzovat štěpení β-1,3-glykosidových vazeb v β-1,3-glukanu. β-1,3-glukan je další hlavní strukturální složkou buněčných stěn mnoha patogenních hub. Tyto enzymy hydrolýzou buněčné stěny hub způsobí tvorbu dalších oligosacharidových elicitorů, které vyvolávají tvorbu dalších PR proteinů nebo fytoalexinů. Dalšími PR proteiny jsou peroxidázy, jiné mohou narušit buněčnou stěnu grampozitivních bakterií vlivem lysozymu, nebo působí na propustnost membrán a přispívají k plazmolýze patogenů, rozptýlení membránového gradientu a tvorbě pórů v membránách. Některé dokonce působí jako ribonukleázy [5], [18].
3.5 Reaktivní formy kyslíku a dusíku Mezi reaktivní formy kyslíku (ROS – reactive oxygen species) patří peroxid vodíku (H2O2), superoxidový anion-radikál (O2–•), hydroxylový radikál (OH•), singletový kyslík (1O2) [20], [33]. ROS jsou v malém množství produkovány jako nechtěné toxické látky při běžném metabolismu jak u živočichů tak i rostlin a to hlavně v mitochondriích, peroxizomech a chloroplastech [34], [35]. ROS jsou aktivně odstraňovány činností antioxidačních enzymů pro udržení redoxní homeostázy, aby nedocházelo k oxidačnímu poškození proteinů, DNA a lipidů, protože ROS mají krátkou životnost a okamžitě reagují [36], [37]. Mezi antioxidační enzymy patří superoxiddismutáza (SOD), která převádí superoxid na peroxid vodíku, kataláza (CAT), která rozkládá peroxid vodíku na vodu a kyslík, peroxidáza a některé další [20], [34]. Mimo to se ještě na odstraňování ROS podílí nízkomolekulární antioxidanty (kyselina askorbová, glutathion, tokoferoly, karotenoidy, antokyany, atd.) [11], [34]. Rovnováha mezi vznikem a odstraňováním ROS může být narušena tak, že rostlina sama začne produkovat ROS aktivací různých oxidáz a peroxidáz nebo inhibicí antioxidačních enzymů a to v reakci na biotický a abiotický stres [34], [36]. Tomuto přechodnému velmi rychlému nárůstu ROS (během časového období od několika minut do několika hodin) se říká oxidativní vzplanutí, kdy je produkován převážně peroxid vodíku [34], [35]. Zvýšená koncentrace ROS působí nejen jako antimikrobiální činidlo, ale jsou také zapojeny do buněčné signalizace spojené s indukcí exprese obranných genů a aktivací proteinů, které jsou závislé na redoxním stavu buňky [35], [36]. 15
Peroxid vodíku má vliv i na síťování stavebních komponent v buněčné stěně a stimuluje tvorbu fytoalexinů [38], [39]. Při lokalizovaném nahromadění velké koncentrace ROS dochází k silnému oxidativnímu poškození např. kondenzaci chromatinu, endonukleolytickému štěpení DNA, peroxidaci lipidů membrán (narušení její integrity) a to i membrán patogenů a dochází k rozvoji tzv. hypersenzitivní reakce (HR) [36], [38]. Na HR se kromě ROS podílí i reaktivní formy dusíku (RNS – reactive nitrogen species) [37], [40]. Mezi RNS patří např. oxid dusnatý (NO), radikál oxidu dusnatého (NO•), peroxynitril (ONOO-) a nitrosoniový kationt (NO+) [37], [40]. NO je nejdůležitější diatomický plyn, který je významným regulátorem velké řady fyziologických procesů nejen u zvířat, kde byl i jako první objeven, ale i u rostlin. NO nejčastěji reaguje s ROS za vzniku různých forem RNS, které reagují dále s cílovými molekulami (oxidace, peroxidace a nitrace lipidů, nukleových kyselin a proteinů) nebo může reagovat přímo jako radikál [41]. NO se účastní různých biologických pochodů jako je růst kořenů, klíčení, zavírání průduchů a hormonální signalizace, kdy interaguje s rostlinnými hormony a dalšími endogenními molekulami [40], [42]. Syntéza NO probíhá buď neenzymaticky nebo enzymaticky z dusitanů, polyaminů a L-argininu. U živočichů probíhá enzymatická syntéza NO pomocí enzymu NO-syntázy, u rostlin zatím nebyl spolehlivě analogický enzym prokázán. Zatím je spolehlivě popsána jen nitrátreduktáza, která redukuje dusičnany na dusitany, a nitrit: NO reduktáza, která redukuje dusitan na NO [42], [43], [44]. Ke zvýšení koncentrace RNS dochází, tak jako u ROS, při biotickém a abiotickém stresu [40], [42]. RNS se podílí také na modifikaci transkripčních faktorů a posttranslační modifikaci proteinů, mezi které patří nitrosylace metaloproteinů přes koordinačně-kovalentní vazbu, nitrace tyrosinových zbytků na 3-nitrotyrosin a Snitrosylace cysteinových zbytků (obecný vzorec RSNO), která je reverzibilní [42]. Na odstraňování RSNO se podílí enzym S-nitrosoglutathionreduktáza [45]. ROS a RNS spolu vzájemně interagují, při signalizaci procházejí značně složitou signální kaskádou, přičemž ovlivňují jiné signální molekuly a hormony a podílí se tím i na systémové rezistenci [11], [40].
3.6 Hypersenzitivní reakce Jedním z indukovaných obranných mechanismů je hypersenzitivní reakce (HR – hypersensitive response). Projevuje se nekrózou (odumřením buněk) rostlinné tkáně v místě infekce. Jedním z důvodů této hypersenzitivní rekce je, že buněčná smrt je přímo odpovědná za omezení růstu patogenu, jeho množení a šíření [46], [47], [48]. To hlavně u těch patogenů, které vyžadují pro svůj růst a rozvoj živé buňky hostitele. Naopak některé patogeny mohou mít prospěch z uvolnění živin z mrtvých buněk a
16
buněčná smrt tím pádem spíše pomůže patogenu v rozvoji. Účinky smrti hostitelské buňky na patogen se tedy mohou výrazně lišit v závislosti na životním stylu parazita. Rychlý kolaps buňky může mít i vliv na plazmodezmata, kterými může patogen cestovat z jedné buňky do druhé. Hypersenzitivní reakce je výsledkem aktivního procesu hostitele, i když k ní může přispět patogen svými toxiny a pochopitelně i produkce vlastních fytoalexinů hostitele, které jsou též toxické [21], [46]. Jedná se tedy o programovanou buněčnou smrt (PCD – programmed cell death), která se ovšem liší od vývojové PCD [49].
3.7 Fytoalexiny Antimikrobiální látky z rostlin se dají obecně rozdělit do dvou kategorií na fytoanticipiny a fytoalexiny. Rozdíl mezi fytoanticipiny a fytoalexiny není založen na jejich chemické struktuře, ale spíše na tom, jak a kdy se vyrábí [17], [50]. Fytoanticipiny jsou popisovány jako nízkomolekulární antimikrobiální látky, které jsou přítomny v rostlinách i před infekcí mikroorganismy a abiotickým stresem, nebo jsou vyráběny po infekci, ale pouze z již existujících prekurzorů. Jsou tedy syntetizovány jako součást normálního vývoje rostlin a jsou součástí konstitutivního mechanizmu obrany rostlin [17], [51]. Pojem fytoalexinů byl zaveden již v roce 1940 [1]. V současnosti je známo asi 200 struktur fytoalexinů [52]. Fytoalexiny jsou nízkomolekulární sekundární metabolity s antibiotickými a antimykotickými vlastnostmi, které jsou syntetizovány a akumulovány v rostlině de novo v reakci na stresové prostředí (na útok patogenů a abiotický stres) [17], [53], [54]. Tyto toxické molekuly narušují metabolismus nebo buněčnou strukturu patogenů, ale jejich toxicita je často specifická k určitému patogenu [53]. Fytoalexiny představují jednu složku indukovaných obranných mechanismů [17]. Fytoalexiny se hromadí v místech infekce. V závislosti na typu fytoalexinů je EC50 pro houby obvykle 10-3 až 10-5 M, což naznačuje, že jsou poměrně slabá antifungální činidla. Ale při jejich rychlém hromadění v místě infekce se může patogen setkat s koncentrací daleko větší, hlavně v raných fázích procesu infekce [17]. Fytoalexiny jsou heterogenní skupina sloučenin, které patří po chemické stránce mezi fenylpropanoidy (stilbeny, flavonoidy, isoflavonoidy, kumariny, dihydrofenanthreny atd.), terpenoidy, acetyleny a jiné třídy sloučenin [54], [55]. Fytoalexiny jsou většinou specifické pro určitou rostlinnou čeleď nebo dokonce i druh. Jedněmi z málo specifických fytoalexinů jsou stilbeny, vyskytující se v poměrně širokém spektru nepříbuzných rostlin např. (Vitaceae, Pinaceae, Fabaceae, Poaceae) [54]. Nicméně, mnoho fytopatogenních hub má enzymy, které mohou detoxikovat fytoanticipiny nebo fytoalexiny svého hostitele, což znamená, že tyto patogeny vyvinuly mechanismy rezistence proti produkci rostlinných antibiotik [51]. 17
3.8 Stilbenové fytoalexiny Stilbeny jsou relativně jednoduché sloučeniny, které v rostlině působí jako fytoalexiny. Stilbeny jsou vysoce senzitivní na světlo a oxidaci vzdušným kyslíkem [56]. V poslední době se staly centrem pozornosti řady studií v lékařství a fyziologii rostlin. Stilbeny se vyskytují v mnoha rostlinných čeledích včetně Vitaceae, Dipterocarpaceae, Pinaceae, Fabaceae, Poaceae, Leguminoseae a Cyperaceae. Jejich účinek je antimikrobiální, repelentní nebo i alelopatický, kdy mohou inhibovat růst nebo fotosyntézu sousedních rostlin [1]. Jsou syntetizovány v reakci na atak patogeny a abiotický stres [57]. Kostra všech molekul stilbenů je založená na resveratrolu. Syntéza probíhá šikimátovou dráhou na fenylalanin a dále fenylpropanoidovou dráhou přes kyselinu skořicovou na daný stilben (Obr. 2). Poslední krok této biosyntézy je katalyzován stilben syntázou (STS), kdy jsou ke kyselině kumarové, která je esterově vázaná na CoA, kondenzovány tři molekuly malonyl-CoA. STS patří k tzv. typu III polyketidových syntáz. STS je úzce spojena s chalkon syntázou (CHS). STS a CHS používají stejné substráty a katalyzují stejné enzymatické reakce kondenzačního typu, ale uzavírání kruhu je zcela odlišné, což vede ke dvěma velmi výrazným produktům (chalkonům - CHS, stilbenům – STS). Exprese genů STS je často indukována v závislosti na biotických a abiotických stresech [1], [58]. Stilbeny mohou být ještě dále modifikovány (Obr. 3). Nejčastěji to bývá glykosylace, kdy se přidáním sacharidové skupiny mohou měnit vlastnosti jako hydrofilnost, stabilita, subcelulární lokalizace a biologická účinnost. Glykosylace probíhá pomocí endogenních nespecifických glukosyltransferáz. Glykosylace může také chránit vlastní rostlinné buňky před potenciálně toxickými účinky stilbenů. Další modifikací jsou methoxylace např. resveratrolu na pterostilben nebo tvorba oligomerů (např. viniferiny) vyplývající z oxidační kopulace resveratrolu a jeho derivátů. Nejčastější konformace stilbenů je trans-, protože je více stabilní s menšími sterickými zábranami mezi aromatickými kruhy, i když v některých případech se ve větším množství vyskytují i cis- izomery [58]. Významná produkce stilbenových fytoalexinů nastává u vinné révy např. po napadení plísní Botritis cinerea nebo působením abiotického stresu. Nejvíce se ve vinné révě vyskytuje resveratrol, ale objevuje se zde i piceid a viniferiny, přičemž jejich množství a zastoupení se liší v závislosti na odrůdě. V případě napadení plísní Botrytis cinerea závisí množství resveratrolu i na kmenu plísně, protože některé kmeny dokážou resveratrol v určitém množství degradovat [59], [60].
18
Obr. 2: Biosyntéza stilbenů resp. resveratrolu
Resveratrol: Resveratrol (3,4´,5-trihydroxystilben) byl poprvé izolován v roce 1940 z kýchavice velkokvěté (Veratrum grandiflorum) [61], [62]. Resveratrol byl nalezen ve více než 72 rostlinných druzích [61]. Resveratrol je obsažen i v řadě druhů zeleniny (červené zelí, brokolice nebo červená řepa), ale bohatým zdrojem resveratrolu jsou hrozny vinné révy [56]. Z hroznů pochopitelně resveratrol přechází do vína, kde je jeho střední koncentrace v červených vínech udávána na cca 2-6 mg · l-1, v bílých vínech je jeho koncentrace nižší, cca 0,2-0,8 mg · l-1 [61]. Obsah resveratrolu se zvyšuje zráním hroznů a je ovlivněn i zeměpisnou šířkou a nadmořskou výškou vinice (v chladnějších oblastech je obsah resveratrolu vyšší) [62]. V rostlinných materiálech je přirozeně přítomna směs trans- a cis- izomeru, trans- forma však převažuje a v hroznech cis- izomer v podstatě chybí [56]. Resveratrol je citlivý na působení vzdušného kyslíku [61]. Při působení UV záření dochází k izomeraci ze stabilnějšího trans- izomeru na méně stabilní cis- izomer [63]. Resveratrol má na lidský organismus vliv díky svým antioxidačním vlastnostem. Některé studie uvádí resveratrol jako možnou léčivou látku proti různým chorobám a navrhují možné mechanismy účinku, jiné studie toto vyvracejí, dodnes se o tom vedou spory [61], [64]. 19
Piceid: Piceid (3,5,4´-trihydroxystilbene-3-O-β-D-glukopyranosid) je glukosylovaná forma resveratrolu někdy nazývaná polydatin. Piceid představuje zásobní formu resveratrolu v buňkách révy vinné [97]. Pterostilben: Pterostilben (3,5-dimethoxy-4´-hydroxystilben) má podobné vlastnosti jako jeho mateřské sloučeniny a navíc vykazuje významně vyšší fungicidní účinnost proti houbovým patogenům, jako je Botrytis cinerea a Plasmopara viticola, ve srovnání s resveratrolem [65]. Pterostilben byl ve větších množstvích zjištěn v listech révy vinné napadené plísní Plasmopara viticola [56]. Viniferiny: Polymerní formy (dimery, oligomery) resveratrolu se nazývají viniferiny nalezené též u vinné révy. Příkladem může být dimer ε-viniferin a pallidol, trimer αviniferin nebo celá řada amuresinů, které jsou oxidačními produkty viniferinů [56]. Amurensin H byl zjištěn v podzemní části révy amurské (Vitis amurensis), je to oxidační produkt ε-viniferinu [61]. Pinosylvin: Pinosylvin (3,5-dihydroxystilben) je syntetizován jehličnany [56]. U borovice lesní Pinus sylvestris nalezený pinosylvin a jeho methyl-ether deriváty vykazují fungicidní aktivitu vůči dřevokazným houbám a působí zde jako fytoanticipiny [66].
20
Obr. 3: Zástupci stilbenových fytoalexinů
3.9 Fytoalexiny z jiných skupin látek 3.9.1 Fenylpropanoidy Fenylpropanoidy zahrnují spoustu skupin látek členěných podle jejich struktury na flavonoidy, isoflavonoidy, kumariny, již zmíněné stilbeny a další. Některé látky z těchto skupin mohou v rostlině plnit funkci fytoalexinů [52]. Kumariny: Mezi kumarinové fytoalexiny patří např. umbelliferon, skopoletin, xanthyletin a ayapin. Kumarinové fytoalexiny ayapin a skopoletin se hromadí ve slunečnici roční Helianthus annuus po napadení patogenní houbou Alternaria helianthi, ale i po naočkování nepatogenní houby Helminthosporium carbonum. V rostlině se vyskytuje i glykosylovaný skopoletin tzv. skopolin [67]. Biosyntéza skopoletinu vychází z pkumarátu přes kyselinu kávovou a felurovou [68]. Skopoletin při vyšších koncentracích zpomaluje klíčení spor Aspergillus niger a Penicillium glaucum [69]. 21
Syntéza umbelliferonu (Obr. 4) byla zjištěna u platanu Platanus acerifolia infikovaného houbou Ceratocystis fimbriata, u povijnice batátové Ipomoea batatas po infekci houbou Ceratocystis fimbriata a elicitaci toxickými chemikáliemi, ale nalezen byl i u grapefruitu Citrus paradisi. [70], [71], [72]. Z citrusových plodů infikovaných patogenem Phytophthora citrophthora byl izolován také xanthyletin, který šíření tohoto patogenu účinně inhibuje [73]. Flavonoidy: Flavonoidovými fytoalexiny jsou např. sakuranetin, nobiletin a tangeritin. Sakuranetin (Obr. 4) je fytoalexin syntetizovaný v rýži proti houbě Pyricularia oryzae a má větší antifungální aktivitu než hlavní diterpenový fytoalexin rýže momilakton A [74]. Citrusy jsou považovány za významný zdroj polymethoxylovaných flavonoidů. Příkladem jsou nobiletin a tangeritin hrající důležitou roli proti mikrobiálním patogenům (Penicillium digitatum, Colletotrichum sp.) a abiotickému stresu, jako je UV záření. Tyto sloučeniny mají antimikrobiální aktivitu i proti lidským patogenním houbám a bakteriím, čehož lze využít v medicíně [75]. Isoflavonoidy: Fytoalexiny patřícími mezi isoflavonoidy jsou např. pisatin, faseolin, glyceolin a medikarpin. Všechny jmenované fytoalexiny mají stejný základní skelet pterokarpan, proto jsou také nazývány jako pterokarpanoidy [76]. Jejich biosyntéza vychází z kondenzace p-kumaroyl-CoA se třemi malonyl-CoA katalyzovaná chalkon syntázou. Posledním společným meziproduktem je daidzein, kde se dráha větví k jednotlivým produktům [77]. Pisatin (Obr. 4) je syntetizován v hrachu setém Pisum sativum při abiotickém stresu nebo při napadení patogeny jako Fusarium solani, Mycosphaerella pinoides [78], [79]. Pisatin je opticky aktivní. Je jen mírně rozpustný ve vodě, ale je dobře rozpustný v organických rozpouštědlech. Pisatin je stabilní v neutrálních nebo alkalických roztocích, ale je velmi labilní v kyselém prostředí [80]. Biosyntéza pisatinu navazuje na daidzein a přes další meziprodukty (sophorol, maackiain) vzniká pisatin [81]. Syntéza faseolinu byla zjištěna ve fazolu obecném Phaseolus vulgaris v reakci na plíseň Colletotrichum lindemuthianum a abiotický stres těžkých kovů [78]. Významným meziproduktem při biosyntéze faseolinu je faseolidin [82]. Glyceolin je fytoalexin nalezený v sóji luštinaté Glycine max [83]. Syntézu indukují např. Phytophthora megasperma a Pratylenchus penetrans [78], [84]. Gylceolin má antimikrobiální účinek proti širokému spektru patogenů [84]. Glyceolin je syntetizovaný i při kolonizaci kořenů sóji symbiotickými bakteriemi, kdy jsou interakce v rané fázi kolonizace podobné patogenům. Symbiotické bakterie se ale na vyšší hladiny glyceolinu adaptují a dokonce je ho potřeba k ovlivnění exprese genů bakterií pro úspěšnou symbiózu [85]. 22
3.9.2 Terpenoidy Mezi terpenoidní fytoalexiny patří například rishitin, lubimin, kapsidiol, momilakton A, B, oryzalexin, zealexin, ipomeamaron. Rishitin a lubimin jsou seskviterpenické fytoalexiny nalezené nejen v bramborových hlízách Solanum tuberosum infikovaných plísní Gibberella pulicaris, Phytophthora infestans a dalšími, ale také v tabáku a rajčeti [78], [86], [87]. Virulentní kmeny Gibberella pulicaris ovšem dokážou rishitin metabolizovat a jsou pro brambory mnohem nebezpečnější [86]. Abiotickými elicitory byly zjištěny těžké kovy [78]. Kapsidiol (Obr. 4) je hlavní sesviterpenický fytoalexin tabáku Nicotiana tabacum a papriky Capsicum annuum produkovaný v reakci na plísňové patogeny, UV záření atp. [89]. Prekurzorem kapsidiolu je 5-epi-aristolochen vznikající cyklizací farnesyldifosfátu [90]. Momilakton (A a B) a oryzalexin (A, B, C, D) jsou dva známé fytoalexiny rýže Oryza sativa. Jsou to ditepenické látky syntetizované z geranylgeranyl difosfátu v reakci na Pyricularia oryzae a UV záření [78], [91].
3.9.3 Acetyleny Asi nejznámějším acetylenovým fytoalexinem je wyeron (Obr. 4) pocházející z bobu obecného Vicia faba a dalších z rodu vikvovitých rostlin produkovaný v reakci na infekci plísní Botrytis fabae a Botritis cinerea [92]. Tyto patogeny mají ovšem i schopnost tento fytoalexin převádět na wyerol, který má nižší antifungální aktivitu, přičemž Botrytis fabae, která je virulentnější a provádí konverzi mnohem rychleji než Botritis cinerea [93], [94]. Wyeron je furanoidní sloučenina syntetizovaná acetátmalonátovou cestou přes dráhu mastných kyselin [95]. Kromě wyeronu jsou antimikrobiálně aktivní také jeho deriváty (kyselina wyeronová a wyeron epoxid) [93].
23
Obr. 4: Příklady fytoalexinů z jiných skupin látek
24
4. PRAKTICKÁ ČÁST 4.1 Materiál a metody 4.1.1 Biologický materiál a chemikálie Byly požity suspenzní buněčné kultury odvozené z kalusu révy vinné (Vitis vinifera L. cv. Gamay) původem z Francie. Buňky byly pěstovány v tekutém NitschNitsch médiu při teplotě 25 °C, světelné intenzitě 80 µE · m-2 · s-1 na rotační třepačce při 125 otáčkách za minutu. Buňky byly vždy po 14 dnech přeočkovány. Používány byly třídenní a pětidenní buňky v aktivní fázi růstu. Jako biotický stres byla použita plíseň šedá Botrytis cinerea (DSM č.: 5145) z Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur (DSMZ). Byla uchovávána v tekutém médiu Potato Dextrose. K pokusu byl použit 1 mg suspenze mycelia B. cinerea na 26 mil. buněk Vitis vinifera. Standard resveratrolu od firmy TOKYO CHEMICAL INDUSTRY Co. LTD. Standard piceidu od firmy SIGMA – ALDRICH Co. LLC.
4.1.2 Působení stresových faktorů Pro pokus bylo použito vždy 6 baněk třídenních nebo pětidenních buněčných suspenzních kultur. Pět baněk bylo vystaveno jednotlivým typům stresových faktorů a šestá sloužila jako kontrola bez stresového faktoru. Biotický stres zahrnoval naočkování 1 μl suspenze mycelia Botritis cinerea do suspenze rostlinných buněk. Abiotický stres zahrnoval teplotní stres, mechanický stres a stres zasolením. Při teplotním stresu byly buňky inkubovány při 10 °C nebo 35 °C. U mechanického stresu byla baňka se suspenzí umístěna na rotační třepačku při 250 ot/min. U zasolení byl k suspenzi přidán chlorid sodný NaCl do výsledné koncentrace 50 mM.
4.1.3 Příprava vzorků Po 8 hod. stresování byly odebrány 3 vzorky extracelulárního média po 1 ml od každého stresu a kontrolního vzorku. Po 24 hod. byly odebrány opět tři vzorky extracelulárního média. Všechny vzorky byly centrifugací zbaveny případných buněk nebo nečistot a byly podrobeny HPLC. Po odebrání extracelulárního média 24 hod. byly ze zbylé suspenze získány samotné buňky odsátím extracelulárního média. 0,1 g čistých buněk byl pro získání extraktu z buněk nejprve homogenizován pomocí tekutého dusíku a ultrazvuku a poté extrahován do 1 ml 80 % roztoku methanolu. Po centrifugaci byl extrakt podroben HPLC. 25
4.1.4 HPLC analýza Analýza stilbenů byla prováděna vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s reverzní fází na přístroji Agilent technologies; series 1100. Detekce byla prováděna fluorescenčním detektorem (FLD) s vlnovou délkou excitačního záření 330 nm a emisní vlnovou délkou 374 nm a absorpčním detektorem s diodovým polem (DAD) s absorbancí měřenou při vlnové délce 210,8 nm a 320,8 nm. Referenční záření mělo vlnovou délku 500,50 nm. Nejprve byla použita kolona SUPELCOSIL™ LC-18-DB, po skončení její životnosti byla použita druhá kolona s označením Ascentis® Express C18. Mobilní fáze byla složena s vody a acetonitrilu (CH3CN). Analýza probíhala gradientovou elucí (Tab. 1). Množství stilbenů bylo vypočteno z rovnice kalibrační přímky, která byla určena dříve v naší laboratoři. Rovnice pro resveratrol je y = (plocha píku + 0,89)/9,34, rovnice pro piceid je y = (plocha píku + 0,24)/5,12. Výsledné množství stilbenu je v nanogramech. Tabulka 1: Složení mobilní fáze: Čas 0,00 18,00 23,00 23,01 30,00
% H2 O 90,0 15,0 15,0 90,0 90,0
% AcN 10,0 85,0 85,0 10,0 10,0
4.2 Výsledky a diskuze Hmotnost obsahu daného stilbenu je u všech tabulek uváděna v ng/10μl objemu injektovaného na kolonu. Uvedený rozdíl významnosti je srovnatelný, pokud je hmotnost stilbenu přepočítána na množství rostlinných buněk. Množství buněk v 10 μl mně bylo poskytnuto kolegou, který pracoval s totožnými kulturami [96].
26
Tabulka 2: Obsah resveratrolu u třídenních buněčných kultur EXTRACELULÁRNÍ MÉDIUM po 8 hod. Plocha píku Hmotnost (mAU*s) (ng/10μl) KONT
10 °C
1
1,852
0,2936
2
2,118
0,3220
3
1,935
0,3025
1
2,341
0,3459
2
2,441
0,3566
3
2,685
0,3828
ND
ND
1
2,082
0,3182
2
2,166
0,3272
3
2,609
0,3746
ND
ND
1
2,422
0,3546
2
8,181
0,9712
3
7,783
0,9286
35 °C 1-3 MECH
NaCl
BS
Průměrná hmotnost
1-3
EXTRACELULÁRNÍ MÉDIUM po 24 hod. Plocha píku Hmotnost (mAU*s) (ng/10μl) KONT
10 °C
1-3
Směrodatná odchylka
0,3060
0,0146
0,3618
0,0189
ND
ND
0,3400
0,0303
ND
ND
0,7515
0,3444
Průměrná hmotnost
ND
ND
1
2,071
0,3170
2
0
0
3
0,340
0,1317
Směrodatná odchylka ND
ND
0,1496
0,1593
35 °C
1-3
ND
ND
ND
ND
MECH
1-3
ND
ND
ND
ND
NaCl
1-3
ND
ND
ND
ND
1
14,549
1,6530
2
13,448
1,5351
1,5807
0,0633
3
13,624
1,5540
BS
27
EXTRAKT Z BUNĚK po 24 hod. Plocha píku (mAU*s) KONT
10 °C
35 °C
MECH
NaCl
BS
1-3
Hmotnost (ng/10μl)
Průměrná hmotnost
ND
ND
1
1,760
0,2837
2
0
0
3
0
0
ND
ND
1
1,180
0,2216
2
0
0
3
0
0
ND
ND
1
14,122
1,6073
2
13,219
1,5106
3
14,050
1,5995
1-3
1-3
Směrodatná odchylka ND
ND
0,0946
0,1638
ND
ND
0,0739
0,1280
ND
ND
1,5725
0,0537
U extracelulárního média třídenních buněčných kultur po 8 hod. (Tab. 2) je vidět, že resveratrol byl nalezen po působení teplotního stresu 10 °C, mechanického stresu a po působení plísně šedé. Resveratrol byl nalezen i v kontrole, ale pouze v čase 8 hod. po manipulaci s kulturou. V kontrole po 24 hod. již žádný resveratrol nebyl. Je možné, že manipulace s kontrolní kulturou během procesu založení experimentu způsobila mírný stres a syntézu malého množství resveratrolu, který se během experimentu rozložil. Podobně i u mechanického stresu chladem došlo během experimentu ke snížení množství resveratrolu. U extracelulárního média třídenních buněčných kultur po 24. hod. (Tab. 2) byl zaznamenán pokles množství resveratrol, jak již bylo zmíněno, u teplotního stresu 10 °C a u mechanického stresu žádný resveratrol detekován nebyl. Ale naopak byl zaznamenán nárust resveratrolu u plísně šedé. Taktéž v extraktu z buněk (Tab. 2) byl ve větším množství nalezen jen u plísně šedé. U teplotního stresu 10 °C a mechanického stresu byl detekován jen ve velmi nepatrném množství. Rozdíl podle Studentova testu na hladině významnosti (P=0,05) byl oproti kontrole významný u teplotního stresu 10 °C a u biotického stresu, jak v extracelulárním médiu, tak i v extraktu z buněk (zvýrazněno barevně).
28
Tabulka 3: Obsah resveratrolu u pětidenních buněčných kultur EXTRACELULÁRNÍ MÉDIUM po 8 hod. Plocha píku Hmotnost (mAU*s) (ng/10μl)
Průměrná hmotnost
Směrodatná odchylka
KONT 1-3
ND
ND
ND
ND
10 °C 1-3
ND
ND
ND
ND
35 °C 1-3
ND
ND
ND
ND
MECH 1-3
ND
ND
ND
ND
NaCl
ND
ND
ND
ND
1
7,005
0,8453
2
6,452
0,7861
0,9440
0,2242
BS
1-3
3
10,324 1,2006 EXTRACELULÁRNÍ MÉDIUM po 24 hod. Plocha píku Hmotnost (mAU*s) (ng/10μl) KONT 1-3 ND ND
Průměrná hmotnost ND
Směrodatná odchylka ND
10 °C
1-3
ND
ND
ND
ND
35 °C
1-3
ND
ND
ND
ND
MECH
1-3
ND
ND
ND
ND
NaCl
1-3
ND
ND
ND
ND
1
6,326
0,7726
2
6,371
0,7774
0,7600
0,0261
5,928 EXTRAKT Z BUNĚK po 24 hod. Plocha píku (mAU*s)
0,7300
BS
3
Hmotnost (ng/10μl)
Průměrná hmotnost
Směrodatná odchylka
KONT
1-3
ND
ND
ND
ND
10 °C
1-3
ND
ND
ND
ND
35 °C
1-3
ND
ND
ND
ND
MECH
1-3
ND
ND
ND
ND
NaCl
1-3
ND
ND
ND
ND
1
3,581
0,4787
2
2,600
0,3737
0,4426
0,0598
3
3,552
0,4756
BS
29
U pětidenních buněčných kultur byl v extracelulárním médiu po 8 a 24 hod. i v extraktu z buněk (Tab. 3) nalezen resveratrol jen po působení plísní šedou a ve všech zmíněných případech byl rozdíl na hladině významnosti (P=0,05) významný. Syntéza resveratrolu u révy vinné napadené plísní šedou byla pozorována už dříve, přičemž množství resveratrolu závisí na odrůdě vinné révy a také na kmenu plísně šedé [59]. Obecně lze ale říci, že třídenní buněčné kultury zareagovaly na stresové prostředí výraznější syntézou stilbenů.
Tabulka 4: Obsah piceidu u třídenních buněčných kultur EXTRAKT Z BUNĚK po 24 hod. Plocha píku (mAU*s) KONT
10 °C
35 °C
MECH
NaCl
BS
1-3
Hmotnost (ng/10μl)
Průměrná hmotnost
ND
ND
1
2,016
0,4406
2
0
0
3
0
0
1
2,966
0,6262
2
0
0
3
0
0
1
1,789
0,3963
2
0
0
3
0,427
0,1304
ND
ND
1
4,185
0,8642
2
1,385
0,3174
3
0,888
0,2203
1-3
30
Směrodatná odchylka ND
ND
0,1469
0,2544
0,2087
0,3615
0,1755
0,2020
ND
ND
0,4673
0,3472
Tabulka 5: Obsah piceidu u pětidenních buněčných kultur EXTRAKT Z BUNĚK po 24 hod. Plocha píku (mAU*s)
Hmotnost (ng/10μl)
Průměrná hmotnost
Směrodatná odchylka
KONT
1-3
ND
ND
ND
ND
10 °C
1-3
ND
ND
ND
ND
1
2,132
0,4633
2
0
0
0,1544
0,2675
3
0
0
1
1,149
0,2713
2
0
0
0,0904
0,1566
3
0
0
ND
ND
ND
ND
1
3,302
0,6918
2
2,451
0,5256
0,6049
0,0834
3
2,818
0,5973
35 °C
MECH NaCl BS
1-3
V žádném z extracelulárních médií třídenních ani pětidenních buněčných kultur nebyl piceid detekován. Piceid byl nalezen jen v extraktu z buněk u biotického i abiotického stresu a to jak u třídenních buněčných kultur (Tab. 4), tak u pětidenních buněčných kultur (Tab. 5). Absence piceidu v extracelulárním médiu potvrzuje teorii, že piceid má zásobní funkci [97]. Rozdíl na hladině významnosti (P=0,05) byl významný jen u biotického stresu pětidenních buněčných kultur. U stresového faktoru zasolení bylo ve všech případech množství resveratrolu a piceidu pod detekovatelnou hranicí, i přes to, že byla po působení vysoké hladiny chloridu sodného jejich syntéza popsána v literatuře [98]. U teplotního stresu 35 °C byl detekován jen piceid v extraktu z buněk, což by mohlo být tím, že buňky tuto teplotu nepovažovaly za nějaký extrémní stres s ohledem na to, že rostliny na vinici vystavené přímému slunečnímu záření mohou snášet zvýšení teplot nad optimální teplotu snáze, než pod optimální teplotu, kdy se například při příchodu studené fronty může rychle ochladit v ročním období, kdy se to nečeká. Na množství stilbenů mohla mít vliv také skutečnost, že z každé sady tří vzorků byl analyzován v den odběru vždy jen jeden vzorek a z časových důvodů byly další dva zamraženy na -70 °C a zanalyzovány později.
31
5. ZÁVĚR Stilbenové fytoalexiny resveratrol a piceid syntetizované jako součást obranných reakcí na biotický a abiotický stres byly sledovány u třídenních a pětidenních suspenzních buněčných kultur vinné révy (Vitis vinifera cv. Gamay). Bylo zjištěno, že obecně na stresové prostředí reagují silněji třídenní buněčné kultury než pětidenní buněčné kultury. Dále bylo zjištěno, že k výraznější syntéze stilbenů došlo po působení plísně šedé (Botritis cinerea). Také rozdíl na hladině významnosti (P=0,05) byl významný u většiny vzorků s plísní šedou. U abiotického stresu byla syntéza podstatně nižší, v řadě případů bylo množství stilbenů pod hranicí detekce. Rozdíl na hladině významnosti (P=0,05) byl u resveratrolu významný jen u teplotního stresu 10 °C extracelulárního média po 8 hodinách u třídenních buněčných kultur. Resveratrol se nacházel v jak extracelulárním médiu po 8 a 24 hodinách, tak i v extraktu z buněk. Piceid se nacházel jen v extraktu z buněk, což svědčí o tom, že plní zásobní funkci.
32
6. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY [1] Jeandet, P., Delaunois, B., Conreux, A., Donnez, D., Nuzzo, V., Cordelier, S., Cle´ment, C., Courot, E. (2010): Biosynthesis, metabolism, molecular engineering, and biological functions of stilbene phytoalexins in plants. Biofactors, 36(5): 331-341. [2] Dangl, J. L., Jones, D. G., (2001): Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature, 411(6839): 826. [3] Lieberherr, D. (2001): Analysis of pathogen-induced glutathione S-transferases in Arabidopsis thaliana and a gene related to systemic acquired resistance in cucumber (Cucumis sativus L.). Disertační práce. Fribourg, 54 s. No. 1338. [4] Sels, J., Mathys, J., De Coninck, B. M. A., Cammue, B. P. A., De Bolle, M. F. C. (2008): Plant pathogenesis-related (PR) proteins: A focus on PR peptides. Plant Physiology and Biochemistry, 46(11): 941-950. [5] Saboki, E., Usha, K., Bhupinder, S.: (2011): Pathogenesis Related (PR) Proteins in Plant Defense Mechanism. Academia.edu, New Delhi, India. [6] Ellis, J. G., Jones, D. A. (2003): Plant Disease Resistance Genes. Innate Immunity, 27-45. [7] Věchet. L. (2007): Význam interakcí hostitel patogen a poznávací systémy v interakci hostitel-patogen. In: Interakce mezi rostlinami a patogenními mikroorganizmy. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha 6 – Ruzyně, s. 2-7. [8] Grayer, R. J., Kokubun, T. (2001): Plant-fungal interactions: the search for phytoalexins and other antifungal compounds from higher plants. Phytochemistry, 56(3):253-263. [9] Heil, M., Bostock, R. M. (2002): Induced Systemic Resistance (ISR) Against Pathogens in the Context of Induced Plant Defences. Annals of Botany, 89(5): 503-512. [10] Hahn, M. G. (1996): Microbial elicitors and their receptors in plants. Annual Review Of Phytopathology, 34, 387-412. [11] O'Brien, J. A., Daudi, A., Butt, V. S., Bolwell, G. P. (2012): Reactive oxygen species and their role in plant defence and cell wall metabolism. Planta, 236(3): 765-79. [12] Stuiver, M. H., Custers, J. H. (2001): Engineering disease resistance in plants. Nature, 411(6839): 865-8. [13] Meenakshi, T., Baldev, S. S. (2013): Role of Elicitors in Inducing Resistance in Plants against Pathogen Infection. ISRN Biochemistry, 2013(762412): 10. [14] Henry, G., Thonart, P., Ongena, M. (2012): PAMPs, MAMPs, DAMPs and others: an update on the diversity of plant immunity elicitors. Biotechnologie, Agronomie, Societe et Environnement, 16(2): 257-268.
33
[15] Boller, T., He, S. Y. (2009): Innate immunity in plants: An arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science, 324(5928): 742744. [16] Yang, D.-L., Yang, Y., He, Z. (2013): Roles of Plant Hormones and Their Interplay in Rice Immunity. Molecular Plant, 6(3): 675-685. [17] Mert-Türk, F. (2002): Phytoalexins: Defence or just a response to stress?. Journal of Cell & Molecular Biology, 1(1): 1. [18] Edreva, A. (2005): Pathogenesis-related proteins research progress in the last 15 years. General and Applied Plant Physiology, 31, No. 1-2, 105-124. [19] Boller, T., He, S. Y. (2009): Innate immunity in plants: An arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science, 324(5928): 742744. [20] Ahmad, P., Jaleel, C. A., Salem, M. A., Nabi, G., Sharma, S. (2010): Roles of enzymatic and nonenzymatic antioxidants in plants during abiotic stress. Critical Reviews in Biotechnology, 30(3): 161-175. [21] Greenberg, J. T. (1997): Programmed cell death in plant-pathogen interactions. Annual Review of Plant Physiology & Plant Molecular Biology, 48(1): 525. [22] Garcia-Brugger, A., Lamotte, O., Vandelle, E., Bourque, S., Lecourieux, D., Poinssot, B., Wendehenne, D., Pugin, A. (2006): Early Signaling Events Induced by Elicitors of Plant Defenses. Molecular Plant-Microbe Interactions, 19(7): 711-724. [23] Choudhary, D. K., Prakash, A., Johri, B. N (2007): Induced systemic resistance (ISR) in plants: mechanism of action. Indian Journal of Microbiology, 47(4): 289-297. [24] Mauch-Mani, B., Metraux, J.-P. (1998): Salicylic Acid and Systemic Acquired Resistance to Pathogen Attack. Annals of Botany, 82(5): 535-540. [25] Ferreira, R. B., Monteiro, S., Freitas, R., Santos, C. N., Zhenjia C., Batista, L. M., Duarte, J., Borges, A., Teixeira, A. R. (2007): The role of plant defence proteins in fungal pathogenesis. Molecular Plant Pathology, 8(5): 677-700. [26] Serrano, M., Coluccia, F., Torres, M., L'Haridon, F., Métraux, J.-P. (2014): The cuticle and plant defense to pathogens. Frontiers in Plant Science, 5, 1-8. [27] Sticher, L., Mauch-Mani, B., Metraux, J. P., (1997): Systemic acquired resistance. Annual Review of Phytopathology, 35(1): 235. [28] Agrawal, A. A., Rutter, M. T. (1998): Dynamic anti-herbivore defense in ant-plants: the role of induced responses. Oikos, 83(2): 227-236. [29] Šašek, V., Burketová, L. (2006): Induktory a elicitory systémově získané rezistence řepky olejky vůči Leptosphaeria. Sborník abstraktů z XVII. české a slovenské konference o ochraně rostlin, Česká zemědělská univerzita v Praze, ISBN 80-213-1516-4. 34
[30] Hegde, Y. R., Keshgond, R. S. (2013): Role of pathogenesis-related proteins in plant disease management – a review. Agricultural Reviews, 34(2): 145-151. [31] Jean-Luc J., Fritig, B., Hahne, G. (1993): Sunflower (Helianthus annuus L.) PathogenesisRelated Proteins: Induction by Aspirin (Acetylsalicylic Acid) and Characterization. Plant Physiology, 101(3): 873-880. [32] Heil, M., Bostock, R. M. (2002): Induced Systemic Resistance (ISR) Against Pathogens in the Context of Induced Plant Defences. Annals of Botany, 89(5): 503-512. [33] Bestwick, C. S., Brown, I. R., Mark H. R. B., Mansfield, J. W. (1997): Localization of Hydrogen Peroxide Accumulation during the Hypersensitive Reaction of Lettuce Cells to Pseudomonas syringae pv phaseolicola. The Plant Cell, 9(2): 209-221. [34] Apel, K., Hirt, H. (2004): Reactive oxygen species: metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Annual Review of Plant Biology, 55, No. 1, 373-399. [35] Kreslavski, V., Los, D., Allakhverdiev, S., Kuznetsov, V. (2012): Signaling Role of Reactive Oxygen Species in Plants under Stress. Russian Journal of Plant Physiology, 59(2): 141-154. [36] Skopelitis, D. S., Paranychianakis, N. V., Paschalidis, K. A., Pilakonis, E. D., Delis, I. D., Yakoumakis, D. I., Kouvarakis, A., Papadakis, A. K., Stephanou, E. G., Roubelakis-Angelakis, K. A (2006): Abiotic Stress Generates ROS That Signal Expression of Anionic Glutamate Dehydrogenases to Form Glutamate for Proline Synthesis in Tobacco and Grapevine. The Plant Cell, 18(10): 2767-2781. [37] Wang, Y., Lin, A., Loake, G. J., Chu, C. (2013): H2O2-induced Leaf Cell Death and the Crosstalk of Reactive Nitric/Oxygen Species. Journal of Integrative Plant Biology, 55(3): 202208. [38] Popham, P. L., Novacky, A. (1991): Use of Dimethyl Sulfoxide to Detect Hydroxyl Radical during Bacteria-induced Hypersensitive Reaction. Plant Physiology, 96(4): 1157-1160. [39] Thordal, C. H., Zhang, Z. Y. W., Collinge, D. B. (1997): Subcellular localization of H2O2 in plants. H2O2 accumulation in papillae and hypersensitive response during the barley-powdery mildew interaction. PLANT JOURNAL, 11(6): 1187-1194. [40] Yiqin, W., Loake, G. J., Chengcai C. (2013): Cross-talk of nitric oxide and reactive oxygen species in plant programed cell death. Frontiers in Plant Science, 4, 1-7. [41] Wink, D. A., Mitchell, J. B. (1998): Chemical biology of nitric oxide: insights into regulatory, cytotoxic, and cytoprotective mechanisms of nitric oxide. Free Radical Biology & Medicine, 25(4–5): 434–456. [42] Astier, J., Lindermayr, C. (2012): Nitric Oxide-Dependent Posttranslational Modification in Plants: An Update. International Journal of Molecular Sciences, 13(11) 15193-15208. [43] Stöhr, C., Stremlau, S. (2006): Formation and possible roles of nitric oxide in plant roots. Journal of Experimental Botany, 57(3) 463-470. 35
[44] del Río, L. A., Corpas F. J. (2004): Nitric oxide and nitric oxide synthase activity in plants. Phytochemistry, 65(7): 783–792. [45] Liu, L., Hausladen, A., Zeng, M., Que, L., Heitman, J., Stamler, J. S. (2001): A metabolic enzyme for S-nitrosothiol conserved from bacteria to humans. Nature, 410(6827): 490-4. [46] Pontier, D., Balagué, C., Roby, D. (1998): The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistence. Comptes Rendus de l Académie des Sciences - Series III Sciences de la Vie, 321(9): 721–734. [47] Klement, Z., Goodman, R. N. (1967): The Hypersensitive Reaction to Infection by Bacterial Plant Pathogens Klement. Annual Review of Phytopathology, 5(1): 17-44. [48] Jakobek, J. L., Lindgren, P. B. (1993): Generalized Induction of Defense Responses in Bean Is Not Correlated with the Induction of the Hypersensitive Reaction. The Plant Cell, 5(1): 49-56. [49] Heath, M. C. (2000): Hypersensitive response-related dech. Plant Molecular Biology, 44(3): 321-334. [50] VanEtten, H. D., Mansfield, J. W., Bailey, J. A., Farmer, E. E. (1994): Two Classes of Plant Antibiotics: Phytoalexins versus "Phytoanticipins". The Plant Cell, 6(9): 1191-1192. [51] Vanetten, H. D., Sandrock, R. W., Wasmann, C. C., Soby, S. D., McCluskey, K., Wang, P. (1995): Detoxification of phytoanticipins and phytoalexins by phytopathogenic fungi. Canadian Journal of Botany, 73(S1): 518-525. [52] Macholán, L. (2003): Sekundární metabolity. 2. vydání. Masarykova univerzitaPřírodovědecká fakulta, Brno, 150 str., ISBN 80-210-3068-2. [53] ] Freeman, B. C., Beattie, G. A. (2008): An Overview of Plant Defenses against Pathogens and Herbivores. The Plant Health Instructor, DOI: 10.1094/PHI-I-2008-0226-01. [54] Ebel, J (1986): Phytoalexin Synthesis: The Biochemical Analysis of the Induction Process. Annual Review of Phytopathology, 24(1): 235-264. [55] Douglas, C., Hoffmann, H., Schulz, W., Hahlbrock, K. (1987): Structure and elicitor or u.v.light-stimulated expression of two 4-coumarate:CoA ligase genes in parsley. The Embo Journal, 6(5): 1189–1195. [56] Mikeš, O. (2009): Stanovení vybraných zdravotně prospěšných polyfenolických látek v hroznech révy vinné v podmínkách stresových faktorů. Disertační práce. Zahradnická fakulta Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity, Brno, 78 s. [57] Adrian, M., Douillet-Breuil, A. C., Tesson, L., Bessis, R., Jeandet, P. (2000): Stilbene Content of Mature Vitis vinifera Berries in Response to UV-C Elicitation. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48(12): 6103-6105. [58] Chong, J., Poutaraud, A., Hugueney, P. (2009): Metabolism and roles of stilbenes in plants. Plant Science, 177(3): 143-155.
36
[59] Bavaresco, L., Petegolli, D., Cantù, E., Fregoni, M., Chiusa, G., Trevisan, M. (1997): Elicitation and accumulation of stilbene phytoalexins in grapevine berries infected by Botrytis cinerea. Vitis, 36(2): 77-83. [60] Jeandet, P., Bessis, R., Sbaghi, M., Meunier, P. (1995): Production of the Phytoalexin Resveratrol hy Grapes as a Response to Botrytis Attack Under Natural Conditions. Journal of Phytopathology, 143(3): 135-139. [61] Šmidrkal, J., Filip, V., Melzoch, K., Hanzlíková, I., Buckiová, D., Křísa, B. (2001): Resveratrol. Chemické Listy, 95(10): 602-609. [62] Šestinová, A. (2013): Resveratrol v onkogynekologii. Praktická gynekologie, 17(3): 217-219. [63] Bonda, C., Jean Z., Pavlovic, A. (2011): The Photostability and Photostabilization of transResveratrol. Cosmetics & Toiletries, 126(9): 652-660. [64] Semba, R. D., Ferrucci, L., Bartali, B., Urpí-Sarda, M., Zamora-Ros, R., Sun, K., Cherubini, A., Bandinelli, S., Andres-Lacueva, C. (2014): Resveratrol Levels and All-Cause Mortality in Older Community-Dwelling Adults. JAMA Internal Medicine, 174(7): 1077-84. [65] Rimando, A. M., Pan, Z., Dayan, F. E., Mizuno, C. S., Baerson, S. R., Polashock, J. J., Snook, M. E., Liu, C.-J. (2012): In planta production of the highly potent resveratrol analogue pterostilbene via stilbene synthase and O-methyltransferase co-expression. Plant Biotechnology Journal, 10(3): 269-283. [66] Hovelstad, H., Leirset, I., Oyaas, K., Fiksdahl, A. (2006): Screening Analyses of Pinosylvin Stilbenes, Resin Acids and Lignans in Norwegian Conifers. Molecules, 11(1): 103-114. [67] Tal, B., Robeson, D. J. (1986): The Metabolism of Sunflower Phytoalexins Ayapin and Scopoletin. Plant Physiology, 82(1): 167-172. [68] Chong, J., Baltz, R., Schmitt, C., Beffa, R., Fritig, B., Saindrenan, P. (2002): Downregulation of a Pathogen-Responsive Tobacco UDP-Glc:Phenylpropanoid Glucosyltransferase Reduces Scopoletin Glucoside Accumulation, Enhances Oxidative Stress, and Weakens Virus Resistance. The Plant Cell, 14(5): 1093-1107. [69] Mabry, T. J., Ulubelen, A. (1980): Chemistry and Utilization of Phenylpropanoids Including Flavonoids, Coumarins, and Lignans. Journal Of Agricultural And Food Chemistry, 28(2): 188-95. [70] Smith, R. A., Drummond, S., Haines, A., Porter, J. R., Hock, R. S. (2001): Induction of umbelliferone in sweet potato cell suspenzion culture using mercuric chloride. Biotechnology Letters, 23(17): 1397-1400. [71] El Modafar, C., Clerivet, A., Vigouroux, A., Macheix, J. J. (1995): Accumulation of phytoalexins in leaves of plane tree (platanus spp.) expressing susceptibility or resistance toceratocystis fimbriata f. sp.platani, European Journal of Plant Pathology, 101(5): 503-509. [72] Afek, U., Orenstein, J., Carmeli, S., Rodov, V., Joseph, M. B. (1999): Umbelliferone, a phytoalexin associated with resistance of immature Marsh grapefruit to Penicillium digitatum. Phytochemistry, 50(7): 1129-1132. 37
[73] Khan, A., Kunesch G., Chuilon S., Ravisé, A. (1985): Structure and biological activity of Xanthyletin a new phytoalexin of Citrus. Fruits, 40(12): 807-811. [74] Hasegawa, M., Mitsuhara, I., Seo, S., Okada, K., Yamane, H., Iwai, T., Ohashi, Y. (2014): Analysis on Blast Fungus-Responsive Characters of a Flavonoid Phytoalexin Sakuranetin; Accumulation in Infected Rice Leaves, Antifungal Activity and Detoxification by Fungus. Molecules, 19(8): 11404-11418. [75] Johann, S., de Oliveira, L. V., Pizzolatti, M. G., Schripsema, J., Braz-Filho, R., Branco, A. S. (2007): Antimicrobial activity of wax and hexane extracts from Citrus spp. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 102(6): 681-685. [76] Tiemann, K., Hinderer, W., Barz, W. (1987): Isolation of NADPH: isoflavones oxidoreductase, a new enzyme of Pterocarpan phytoalexin biosynthesis in cell suspension cultures of Cicer arietinum. FEBS Letters, 213(2): 324-328. [77] Dixon, R. A., Paiva, N. L. (1995): Stress-Induced Phenylpropanoid Metabolism. The Plant Cell, 7(7): 1085-1097. [78] Purkayastha, R. P. (1994): Progress in Phytoalexin Research During the Past 50 Years. In: Daniel, M., Purkayastha, R. P.: Handbook of phytoalexin metabolism and action. New York, 1-41 [79] Cruickshank, I. A. M., Perrin, D. R. (1963): Studies on Phytoalexins VI. Pisatin: the Effect of Some Factors on its Formation in Pisum Sativum l., and the Significance of Pisatin in Disease Resistance. Australian journal of biological science, 16(1): 111-128. [80] Perrin, D. R., Bottomley, W. (1962): Studies on Phytoalexins. V. The Structure of Pisatin from Pisum sativum L. Journal of the American Chemical Society, 84(10): 1919–1922. [81] Preisig, C. L.; Bell, J. N., Sun, Y., Hrazdina, G., Matthews, D. E., VanEtten, H. D. (1990): Biosynthesis of the Phytoalexin Pisatin; Isoflavone Reduction and Further Metabolism of the Product Sophorol by Extracts of Pisum sativum. Plant Physiology, 94(3): 1444-1448. [82] Durango, D., Quiñones, W., Torres, F., Rosero, Y., Gil, J., Echeverri, F. (2002): Phytoalexin Accumulation in Colombian Bean Varieties and Aminosugars as Elicitors. Molecules, 7(11): 817832 [83] Schmidt, P. E., Parniske, M., Werner, D. (1992): Production of the Phytoalexin Glyceollin I by Soybean Roots in Response to Symbiotic and Pathogenic Infection. BOTANICA ACTA, 105(1): 18-25. [84] Ng, T. B., Ye, X. J., Wong, J. J., Fang, E. F., Chan, Y. S., Pan, W., Ye, X. Y., Sze, S. C., Zhang, K. Y., Liu, F., Wang, H. X. (2011): Glyceollin, a soybean phytoalexin with medicinal properties. Applied Microbiology & Biotechnology, 90(1): 59-68. [85] Parniske, M., Ahlborn, B., Werner, D. (1991): Isoflavonoid-Inducible Resistance to the Phytoalexin Glyceollin in Soybean Rhizobia. Journal of Bacteriology, 173(11): 3432-3439.
38
[86] Desjardins, A. E., Gardner, H. W. (1989): Genetic analysis in Gibberella pulicaris: rishitin tolerance, rishitin metabolism, and virulence on potato tubers. Molecular plant-microbe interactions, 2, No. 1, 26-34. [87] Olívia, C. M., Cândido, P. R. (2006): Screening of plants against fungi affecting crops and stored fous. Advances in Phytomedicine, 3, 139–169. [89] Maldonado-Bonilla, L. D., Betancourt-Jiménez, M., Lozoya-Gloria, E. (2008): Local and systemic gene expression of sesquiterpene phytoalexin biosynthetic enzymes in plant leaves. European Journal of Plant Pathology, 121(4): 439-449. [90] Starks, C. M., Back, K., Chappell, J., Noel, J. P. (1997): Structural Basis for Cyclic Terpene Biosynthesis by Tobacco 5-Epi-Aristolochene Synthase. Science, 277(5333): 1815-1820. [91] Toyomasu, T., Kagahara, T., Mitsuhashi, W., Sassa, T., Okada, K., Yamane, H., Koga, J., Hasegawa, M. (2008): Diterpene Phytoalexins Are Biosynthesized in and Exuded from the Roots of Rice Seedlings. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 72(2): 562-567. [92] Nawar, H. F., Kuti, J. O. (2003): Wyerone Acid Phytoalexin Synthesis and Peroxidase Activity as Markers for Resistance of Broad Beans to Chocolate Spot Disease, Journal of Phytopathology, 151 (10): 564. [93] Harrison, J. G. (1980): Phytotoxicity of Wyerone Acid, Wyerone and Wyerone Epoxide to Field Bean Leaves. Journal of Phytopathology, 97(1): 14-18. [94] Görge, E., Werner, D. (1991): Degradation of Weyrone, the Phytoalexin of Faba Beans by Rhizobium leguminosarum. Current Microbiology, 23(3): 153-157. [95] Al-Douri, N. A., Dewick, P. M. (1986): Biosynthesis of the Furanoacetylene Phytoalexin Wyerone in Vicia faba. Zeitschrift für Naturforschung, 41(1-2): 34-38. [96] Zapletal, D. (2015): Stanovení biomasy a životaschopnosti u stresovaných buněčných suspenzních kultur révy vinné. Bakalářská práce [97] Duan, D., Halter, D., Baltenweck, R., Tisch, C., Tröster, V., Kortekamp, A., Hugueney, P., Nick, P. (2015): Genetic diversity of stilbene metabolism in Vitis sylvestris, Journal of Experimental Botany, doi: 10.1093/jxb/erv137 [98] Ismail, A., Nick, P., Seo, M., Takebayashi, Y., Kamiya, Y., Eiche, E. (2014):. Salt adaptation requires efficient fine-tuning of jasmonate signalling. Protoplasma. 251(4):881-898
39
