Stanovení kreatininu v mase pomocí kapilární izotachoforézy
Úkol: Pomocí kapilární izotachoforézy určete, zda je v předloženém reálném vzorku (vařená šunka) obsažen kreatinin.
1. Teoretická část 1.1.Kreatinin Kreatinin je organická dusíkatá látka (chemická struktura viz Obr. 1) vznikající ve svalech jako konečný produkt degradace kreatinfosfátu. Množství kreatininu v organismu je přímo úměrné množství svalové hmoty. Koncentraci kreatininu v séru je možno použít např. jako ukazatele funkce ledvin. Kromě endogenní syntézy je možné dostat kreatinin do organismu také prostřednictvím potravy. Potraviny obsahující kreatinin jsou např. maso, mastné výrobky a ryby. Při tepelném zpracování masa a masných výrobků je kreatin dehydratován na kreatinin. Jeho obsah může tedy sloužit jako kritérium pro určení míry tepelného zásahu při výrobě masných produktů. Kreatinin může být taktéž prekurzorem toxických látek, které vznikají při teplotách kolem 200 °C, vyskytujících se především v grilovaném mase.
Obr. 1 Chemická struktura kreatininu (2-imino-1-methylimidazolidin-4-onu)
1.2.Kapilární izotachoforéza Kapilární izotachoforéza (CITP) je elektromigrační separační technika umožňující analýzu nabitých látek (kationtů či aniontů) při vloženém konstantním proudu (gradientu
napětí). Vzorek je dávkován mezi dva základní elektrolyty – vedoucí a koncový – obsahující ionty mající rozdílné hodnoty pohyblivostí (mobilit). Vedoucí elektrolyt obsahuje ionty se stejným znaménkem jako separované analyty (koionty) mající nejvyšší mobilitu v daném elektrolytovém systému. Koncový elektrolyt obsahuje koionty mající nejnižší mobilitu v daném elektrolytovém systému. Separované látky (analyty) jsou poté rozděleny mezi vedoucí a koncový elektrolyt na základě jejich rozdílných pohyblivostí. Každý separovaný analyt vytváří během CITP analýzy vlastní oddělenou zónu. Výsledkem analýzy je při použití univerzálního vodivostního detektoru schodovitý záznam tzv. izotachoforegram. Z výšky schodu usuzujeme kvalitu a délka zóny je přímo úměrná kvantitě (viz Obr. 2).
Obr. 2 Izotachoforegram znázorňující CITP analýzu vzorku obsahující analyt A a B
U elektromigračních metod se můžeme setkat s nízkou opakovatelností migračních časů, což je způsobeno především elektroosmotickým a hydrodynamickým tokem uvnitř separační kapiláry. V případě izotachoforetického analyzátoru je možné elektroosmotický tok potlačit, a to použitím kapilár (kolon) z inertního materiálu (např. z kopolymeru fluorovaného ethylenu a propylenu – FEP) a/nebo přídavkem vhodného aditiva do pracovního elektrolytu (např. hydroxyethylcelulóza - HEC). Hydrodynamický tok je v tomto případě potlačen použitím hydrodynamicky uzavřeného systému (použitím semipermeabilních celofánových membrán oddělujících elektrolytové nádobky od elektrolytu, kterým je naplněna separační kapilára).
Při použití dvoukolonového izotachoforetického analyzátoru je využívána tzv. technika spojených kolon umožňující dvoudimenzionální CITP (2D-CITP). První kolona (kapilára) v níž dochází k odstranění nežádoucích interferentů a zakoncentrování cílových analytů je tzv. předseparační kolona. V druhé koloně – analytické – dochází k separaci zakoncentrovaných analytů.
2. Praktická část 2.1.Přístroje •
Dvoukolonový
izotachoforetický
analyzátor
s vodivostní
detekcí
vybavený
autosamplerem •
Homogenizátor IKA
•
Ultrazvuková lázeň
•
pH metr
•
Analytické váhy
2.2.Pomůcky Plastové kádinky, plastové nádobky, elektrolytové nádobky, plastové odměrné baňky, jednorázové navažovací lodičky, špachtle, lžička, pipety, balónek, vatové tampony, stříkačkové mikrofiltry, injekční stříkačka, viálky, eppendorfky.
2.3.Chemikálie Standard kreatininu, reálný vzorek (vařená šunka), 5 % trichloroctová kyselina, hydroxid amonný, 2-(N-morpholino)ethansulfonová kyselina (MES), ɛ-aminokapronová kyselina (EACA), kyselina octová, hydroxyethylcelulóza (HEC), deionizovaná voda, kalibrační roztoky pro kalibraci pH metru.
2.4.
Pracovní postup
2.4.1. Úprava reálného vzorku •
do plastové nádobky navážíme 1 g nadrobno nakrájené vařené šunky a přidáme (pipetou) 10 ml 5 % trichloroctové kyseliny
•
nádobku umístíme do homogenizační aparatury a vzorek homogenizujeme po dobu 20 minut
•
zhomogenizovaný vzorek vložíme na 15 minut do ultrazvukové lázně
•
poté vzorek 5 x naředíme deionizovanou vodou a okyselíme ɛ-aminokapronovou kyselinou
•
vzorek přefiltrujeme přes stříkačkový mikrofiltr (0,45 µm) a převedeme do viálky
•
viálku umístíme do autosampleru připojeného k izotachoforetickému analyzátoru
2.4.2. Příprava elektrolytů •
podle tabulky složení elektrolytového systému (viz Tab. 1) navážíme nebo odměříme do odměrné baňky vypočtené množství a doplníme deionizovanou vodou po rysku
•
roztok vložíme na 10 minut do ultrazvukové lázně
•
pomocí pH metru (pH metr nutno pomocí návodu nakalibrovat) změříme pH elektrolytů a hodnoty zaznamenáme
•
připravené elektrolyty převedeme do elektrolytových nádobek a umístíme do analyzátoru
2.4.3. Příprava standardního roztoku •
do eppendorfky navážíme 5 mg standardu kreatininu a rozpustíme v 1 ml deionizované vody
•
připravený roztok zředíme 20 x deionizovanou vodou a převedeme do viálky
2.4.4. ITP analýza •
izotachoforetický analyzátor postupně naplníme elektrolytovým systémem (dle pokynů vedoucího cvičení)
•
nastavíme metodu (časový průběh separace, hodnoty hnacích proudů, přepnutí kolon, volba módu)
•
pomocí návodu k přístroji a vedoucího laboratorního cvičení provedeme v kationtovém módu ITP-ITP analýzu: 1. Slepého vzorku (koncový elektrolyt) 2. Připraveného reálného vzorku 3. Reálného vzorku s přídavkem standardního roztoku kreatininu
Tab. 1 Složení elektrolytového systému Předseparační kolona
Analytická kolona
(90x0.8 mm)
(90x0.3 mm)
Vedoucí
10 mM NH4OH + 20 mM MES +
5 mM NH4OH + 10 mM MES +
elektrolyt
0,1 % HEC
0,1 % HEC
Koncový
10 mM EACA + 5 mM kyselina
10 mM EACA + 5 mM kyselina
elektrolyt
octová + 0,05 % HEC
octová + 0,05 % HEC
Použitý hnací proud
200 µA
20 µA při detekci 5 µA
3. Vyhodnocení S použitím naměřených dat (izotachoforegramů) určete, zda je v předloženém reálném vzorku (vařená šunka) obsažen kreatinin. Výsledek zdůvodněte.
4. Otázky k prozkoušení 1.
Bude se lišit obsah kreatininu u mastných výrobků, které budou odlišně tepelně upraveny?
2.
Bylo by možné v případě stanovení kreatininu pomocí CITP
použít také aniontový
separační mód? Odpověď zdůvodněte. 3.
Navrhněte jinou analytickou metodu, kterou by bylo možné stanovit obsah kreatininu.
4.
Navrhněte vhodné separační pH pro ITP analýzu analytu mající kyselý charakter s pKa hodnotou 4,5. Odpověď zdůvodněte.
5.
Je možné během jedné izotachoforetické analýzy stanovit jak kationty, tak anionty?
6.
Popište základní rozdíly mezi kapilární elektroforézou a kapilární izotachoforézou.
7.
Jaké jiné elektromigrační metody znáte?
8.
Vysvětlete rozdíl mezi univerzálním a selektivním detektorem.
9.
Z jakého materiálu jsou nejčastěji vyrobeny kapiláry (kolony) v izotachoforetickém analyzátoru. Odpověď zdůvodněte.
10. Z jakého důvodu je do vedoucího a koncového elektrolytu přidáváno aditivum hydroxyethylcelulóza.
5. Doporučená literatura 1. Boček P. a kol.: Analytická kapilární izotachoforéza, Pokroky chemie. Academia, Praha 1987. 2. Everaerts F. M. a kol.: Isotachophoresis: theory, instrumentation, and applications. Elsevier, Amsterdam 1976. 3. Šťulík K.: Analytické separační metody. Karolinum, Praha 2004. 4. Baker D.R., Capillary electrophoresis: Techniques in analytical chemistry. John Wiley and Sons Ltd, New York 1995. 5. Coultate T. P.: Food: The chemistry of its components. RSC Publishing, Cambridge 2009. 6. Ötleş S.: Handbook of food analysis instruments. CRC Press, Boca Raton 2008. 7. Velíšek J.: Chemie potravin. OSSIS, Tábor 2002.
