STABILITA GENOMU
III. Opravné mechanismy DNA
Sources, Damage and Repair
Responses to DNA damage Transient blockage of:
End result:
Cell cycle
Damage Repair
Transcription
Damage Tolerance
Replication
Cell cycle arrest
Chromosome segregation
Cell death
• Low dose of damage – incorrect repair ‐> mutations – damage tolerance ‐> mutations + persistence of damage
• High dose of damage – genomic instability – apoptosis (p53 dependent)
DNA damage and cell status • Block transcription – decreased transcription of damaged genes – transcription up-regulation of specific genes (p53, XPC, XPE) • Block replication – polymerase switch (translesion DNA synthesis) – template switch (recombination-dependent daughter-strand gap repair) (Ubc13/Mms2) • Checkpoint activation and cell cycle arrest – G1, S, G2, and M to allow repair
Inability to proper repair DNA damage • Low dose of damage – incorrect repair ‐> mutations – damage tolerance ‐> mutations + persistence of damage
• High dose of damage – genomic instability – apoptosis (p53 dependent)
Následky vrozených defektů reparace DNA • Nádorová predispozice (či maligní transformace) – Nádory kůže (Nucleotide Excision Repair) – Nádory prsu (Homologous Recombination) – Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Mismatch Repair) – … a jiné
• • • •
Vývojové abnormality Neurologické poruchy Předčasné stárnutí (Homologous Recombination) Selhání kostní dřeně (DSB repair and cell cycle checkpoint)
Vrozené mutace genů účastnících se oprav vedou ke vzniku specifických syndromů... Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Syndrom dědičné rakoviny prsu a ovaria Fanconiho syndrom Li‐Fraumeniho syndrom Xeroderma pigmentosum Cockaynův syndrom Bloomův syndrom Wernerův syndrom Rothmundův‐Thomsonův syndrom Nijmegen syndrom (NBS) Ataxia telangiectasia ATLD (Ataxia telangiectasia‐like disease) Seckelův syndrom
MSH2, MLH1,... BRCA1 FANC, BRCA2 TP53 XPA‐XPG CSA, CSB BLM WRN RecQL NBS1 ATM MRE11 ATR
1) HIERARCHY OF DNA DAMAGE RESPONSE DNA damage
Damage sensing
DNA repair
DNA damage checkpoints
Transcription response
Cell cycle arrest Cellular senescence
Cell death
Kategorie faktorů účastnících se DDR
Sensors PCNA/RFC clamp loader homologues
Mediators Transducers Ser-Thr kinases
Effectors cdk inhibition
2 ) REPARAČNÍ MECHANISMY
globální reparace genomu (nespřažené s transkripcí)
reparace spřažené s transkripcí (transcription‐coupled repair)
Reparační systémy: specializace a zástupnost Specializace: specifické reparační mechanismy pro různé typy lézí Zástupnost: jeden opravný systém pro několik typů lézí
Přehled opravných mechanismů DNA 1. Mismatch repair – MMR (oprava záměn bází) 2. Direct repair of a) chemical adducts b) photodamage (oprava fotopoškození) 3. Base excision repair – BER (excize bází) 4. Nucleotide excision repair – NER (excize nukleotidů) 5. Strand break repair (oprava zlomů řetězců) a) single strand break repair b) double strand break repair ‐ homologous recombination ‐ HR ‐ nonhomologous end‐joining ‐ NHEJ
1. Mismatch repair – MMR (oprava záměn bází) 2. Direct repair of a) chemical adducts b) photodamage (oprava fotopoškození) 3. Base excision repair – BER (excize bází) 4. Nucleotide excision repair – NER (excize nukleotidů) 5. Strand break repair (oprava zlomů řetězců) a) single strand break repair b) double strand break repair ‐ homologous recombination ‐ HR ‐ nonhomologous end‐joining ‐ NHEJ
MISMATCH REPAIR ‐ MMR – opravuje špatně inkorporované báze (ne tedy poškozenou DNA) –
avšak léze způsobené alkylačními a interkalačními činidly mohou zmást MMR a spustit chybnou nebo neúčinnou MMR
–
typ NER vázaný na probíhající replikaci
– zahrnuje rozpoznání léze, incizi, odstranění krátkého úseku nukleotidů, resyntézu a ligaci, vstupním místem jsou pravděpodobně existující jednovláknový zlom (SSB)
MISMATCH REPAIR (MMR) –
repairs mismatched bases (not DNA damage)
– however, lesions caused by alkylating agents and intercalators, may fool MMR and trigger erroneous or futile MMR –
typ NER vázaný na probíhající replikaci, zahrnuje rozpoznání léze, incizi, odstranění krátkého úseku nukleotidů, resyntézu a ligaci, vstupním místem jsou pravděpodobně existující SSBs
MISMATCH REPAIR (MMR) Záměny během replikace a rekombinace hMSH2/6 – záměny a jednobázové vlásenky
hMSH2/3 – inserce/delece (1>10 nt)
Nově syntetizované vlákno je zdegradováno za záměnou a resyntetizováno: Polδ/ε, RPA, PCNA,
RFC, exonukleáza 1, FEN1 Hoeijmakers, Nature 411:366‐374, 2001
Vrozené poruchy MMR Vrozená nepolypózní rakovina tlustého střeva a konečníku ‐ HNPCC (Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer) „Dominantně“ autosomální dědičnost ‐ mutace několika odlišných genů: MSH2, MLH1, PMS2, MSH6, PMS1, MBD4, MYH ‐ pozorována nestabilita mikrosatelitů (variace počtu jednotek opakujících se krátkých sekvencí DNA) Klinické příznaky: ‐ predispozice k určitým typům zhoubných nádorů, především tlustého střeva a rekta s nástupem v časném věku ‐ nádory endometria, žaludku, vaječníků, hepatobiliárního systému ‐ u tumorů sporadicky rezistence vůči alkylačním a interkalačním činidlům
1. Mismatch repair – MMR (oprava záměn bází) 2. Direct repair of a) chemical adducts b) photodamage (oprava fotopoškození) 3. Base excision repair – BER (excize bází) 4. Nucleotide excision repair – NER (excize nukleotidů) 5. Strand break repair (oprava zlomů řetězců) a) single strand break repair b) double strand break repair ‐ homologous recombination ‐ HR ‐ nonhomologous end‐joining ‐ NHEJ
Přímá oprava metylačního poškození pomocí proteinu AlkB
AlkB nalezen u všech žijících organismů ‐ patří mezi α−ketoglutarát‐ a Fe‐dependentní oxygenázy ‐ α−ketoglutarát je konvertován na sukcinát a CO2 a metylová skupina báze je hydroxylována ‐ hydroxymetylová skupina se pak spontánně uvolňuje ve formě formaldehydu a dochází tak k obnovení původní báze
1. Mismatch repair – MMR (oprava záměn bází) 2. Direct repair of a) chemical adducts b) photodamage (oprava fotopoškození) 3. Base excision repair – BER (excize bází) 4. Nucleotide excision repair – NER (excize nukleotidů) 5. Strand break repair (oprava zlomů řetězců) a) single strand break repair b) double strand break repair ‐ homologous recombination ‐ HR ‐ nonhomologous end‐joining ‐ NHEJ
Přímá oprava fotodimerů fotoreaktivací ‐ první objevený mechanismus reparace DNA (1949) CPD fotolyáza obsahuje dva chromofory, FADH a buď metenyltetrahydrofolát (MTHF) nebo 8‐hydroxy‐5‐ deazaflavin (8‐HDF) MTHF či 8‐HDF absorbují viditelné světlo, přenášejí takto získanou energii na FADH, tato energie je potom použita na rozštěpení dimeru ‐ není přítomen u placentálních savců
1. Mismatch repair – MMR (oprava záměn bází) 2. Direct repair of a) chemical adducts b) photodamage (oprava fotopoškození) 3. Base excision repair – BER (excize bází) 4. Nucleotide excision repair – NER (excize nukleotidů) 5. Strand break repair (oprava zlomů řetězců) a) single strand break repair b) double strand break repair ‐ homologous recombination ‐ HR ‐ nonhomologous end‐joining ‐ NHEJ
BASE EXCISION REPAIR – BER ‐ hlavní „cesta“ (mnoho variant) opravy oxidačního poškození DNA, metylací, deaminací a jednovláknových zlomů 1.
Odstranění nesprávné báze danou DNA N‐glykoslyázou (specifickou pro daný typ modifikované báze) za vzniku AP místa
2.
Přetnutí poškozeného DNA řetězce AP endonukleázou po směru od AP místa ‐ za vzniku 3ʹ‐ OH konce přilehlého k AP místu
3.
Extenze 3ʹ‐OH konce DNA polymerázou (β), doprovázená excizí AP místa deoxyribózo‐ fosfatázovou (dRPáza) aktivitou Polβ; DNA ligáza IV plus XRCC1
BER in steps P S
P glycosylase
S
Base Base
Base
S P
S P
BASE DAMAGE
P AP SITE
P - apurinic - apyrimidinic
BER in steps P
P
S AP endonuclease
Base
Base
S
S
AP SITE
strand break
BER in steps P
P polymerase ligase
Base
S Base Base
S
S P
strand break
P
DEFECTS IN BER • MUTYH ‐/‐ (DNA glycosylase excises adenine from 8‐oxoG:A base pairs) – MUTYH interacts with MSH2/MSH6 heterodimer – the first BER gene associated with a human cancer syndrome (multiple colorectal tumors, Al‐Tassan et al, 2002)
• Mouse models knockout: – individual glycosylases no overt phenotype, but double mutants have increased mutagenesis and cancer susceptibility – core proteins – embryonic lethality
1. Mismatch repair – MMR (oprava záměn bází) 2. Direct repair of a) chemical adducts b) photodamage (oprava fotopoškození) 3. Base excision repair – BER (excize bází) 4. Nucleotide excision repair – NER (excize nukleotidů) 5. Strand break repair (oprava zlomů řetězců) a) single strand break repair b) double strand break repair ‐ homologous recombination ‐ HR ‐ nonhomologous end‐joining ‐ NHEJ
NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR ‐ NER ‐ hlavní cesta opravy poškození způsobeného UV, tabákem a ostatními karcinogeny ‐ podílí se také na opravě oxidačního poškození, odstranění velkých aduktů, fotoproduktů a jiných lézí distortujících DNA či blokujících RNA Pol
NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR ‐ NER ‐ účast 6 korových faktorů zahrnujících 15 až 18 polypeptidových řetězců pro excizi, opravnou resyntézu a ligaci slow
fast
Sensors
Endonucleases
Helicases 18‐24 nt
Pol δ/ε, ligase I
Vrozené poruchy NER Cockaynův syndrom (porucha NER spřažená s transkripcí – TCR‐NER) dominantně recesivní onemocnění mutace genů CSA či CSB
Trichothiodystrofie specifické mutace genů XPB či XPD, někdy TTD‐A Pro oba syndromy jsou společné růstové defekty, progredující mentální retardace Pro trichothiodystrofii jsou charakteristické kožní problémy – šupinatá kůže (ichthyosis), lámavé vlasy a nehty Symptomy předčasného stárnutí, není výrazně vyšší incidence zhoubných nádorů
Xeroderma pigmentosum (porucha globálního NER – GG‐NER) Autosomálně recesivní dědičné onemocnění ‐ 7 komplementačních skupin, mutace genů XPA‐XPG Klinické příznaky: ‐ citlivost ke slunečnímu záření ‐ dermatózy ‐ hyperpigmentace ‐ degenerace sítnic ‐ mentální retardace (skupiny A, B, D, G) ‐ nádorová onemocnění kůže a vnitřních orgánů ‐ 2000 násobná incidence Biochemický nález: ‐ citlivost buněk k UV záření ‐ hořčičnému plynu ‐ psoralenům ‐ cisplatině ‐ defekty reparace DNA
Funkce genů postižených u Xeroderma pigmentosum a trichothiodystrofie
1. Mismatch repair – MMR (oprava záměn bází) 2. Direct repair of a) chemical adducts b) photodamage (oprava fotopoškození) 3. Base excision repair – BER (excize bází) 4. Nucleotide excision repair – NER (excize nukleotidů) 5. Strand break repair (oprava zlomů řetězců) a) single strand break repair b) double strand break repair ‐ homologous recombination ‐ HR ‐ nonhomologous end‐joining ‐ NHEJ
Oprava složitých jednovláknových zlomů ‐ SSBR 1) vazba polyADP‐ ribózapolymerázy do místa zlomu, syntéza polyA 2) vazba XRCC1 a DNA ligázy 3 do místa zlomu 3) vazba polynukleotidkinázy a polymerázy beta, vyplnění mezery 4) ligace řetězce DNA (DNA ligáza 3)
1. Mismatch repair – MMR (oprava záměn bází) 2. Direct repair of a) chemical adducts b) photodamage (oprava fotopoškození) 3. Base excision repair – BER (excize bází) 4. Nucleotide excision repair – NER (excize nukleotidů) 5. Strand break repair (oprava zlomů řetězců) a) single strand break repair b) double strand break repair ‐ homologous recombination ‐ HR ‐ nonhomologous end‐joining ‐ NHEJ
DNA DOUBLE STRAND BREAK REPAIR
HR
NHEJ
(sister chromatid)
(no template)
Hoeijmakers, Nature 411:366‐374, 2001
DNA DOUBLE STRAND BREAK REPAIR DNA double‐strand‐break
Nonhomologous end joining (NHEJ) • no homology • error prone • G1 phase • Ku/DNA‐PK
Homologous recombination (HR) • homologous template • error free • S/G2 phase • Rad 52/51 complex
1. Mismatch repair – MMR (oprava záměn bází) 2. Direct repair of a) chemical adducts b) photodamage (oprava fotopoškození) 3. Base excision repair – BER (excize bází) 4. Nucleotide excision repair – NER (excize nukleotidů) 5. Strand break repair (oprava zlomů řetězců) a) single strand break repair b) double strand break repair ‐ homologous recombination ‐ HR ‐ nonhomologous end‐joining ‐ NHEJ
HOMOLOGOUS RECOMBINATION ‐ HR
1. Mismatch repair – MMR (oprava záměn bází) 2. Direct repair of a) chemical adducts b) photodamage (oprava fotopoškození) 3. Base excision repair – BER (excize bází) 4. Nucleotide excision repair – NER (excize nukleotidů) 5. Strand break repair (oprava zlomů řetězců) a) single strand break repair b) double strand break repair ‐ homologous recombination ‐ HR ‐ nonhomologous end‐joining ‐ NHEJ
NON‐HOMOLOGOUS END JOINING ‐ NHEJ
Překlenutí poškození (Damage Bypass; Translesion Synthesis)
Oprava příčných vazeb mezi vlákny DNA hypotetický model G1‐fáze
G2‐fáze
‐ vážná překážka transkripci a replikaci DNA, oprava je často možná obětí fragmentu DNA
Fanconiho anémie ‐ recesivně autosomální dědičné onemocnění ‐ mutace více než 7 genů kódujících FANC proteiny (včetně BRCA2=FANCD1) ‐ zhoršená reparace zlomů DNA Klinické příznaky: ‐ malý vzrůst, malformace různých orgánových systémů (nejčastěji rádia a palce, GUT, GIT, srdce a CNS) ‐ výskyt „café au lait“ skvrn na kůži ‐ nejproblematičtější je snížená funkce hematopoietického systému (pancytopenie) vznikající od raného dětství ‐ krvácení, anémie, náchylnost k infekcím ‐ predispozice k určitým typům zhoubných nádorů (tzv. preneoplastický myelodysplastický syndrom, především leukémiím ‐ AML) ‐ přecitlivělost na crosslinkery (mitomycin A, cisplatinu a diepoxybutan), vyvolávají G2 blok buněčného cyklu
