Specifickým odvětvím chemie se farmakochemie stala až v posledních dekádách 20. století

Úvod do chemie léčiv Proč se zabývat chemií léčiv Léčiva lze definovat různými způsoby. Jedna definice říká: Léčiva jsou něčím, co v nejlepším případě může pouze přispět k prodloužení stavu, jehož příčinou je nechráněný pohlavní styk, stavu, který může být velice bolestný a stejně vždy končí smrtí. Má cenu se zabývat léčivy a jejich chemií neboli farmakochemií? Odpověď zní ano, protože ten stav, o kterém se v definici hovoří je život. A ten stojí za to žít, i když může být bolestný a stejně vždy končí smrtí. Ano, protože léčiva mohou bolesti života zmírnit a smrt oddálit.

Rozmach chemie léčiv v posledních desetiletích je obrovský. Chemie léčiv spolu s chemií materiálů patří mezi nejdynamičtěji se rozvíjející obory chemie. Před poměrně krátkou dobou byla chemie léčiv založena jen na zkušenostech, intuici, šťastných náhodách nebo metodě pokusu a omylu. Obrovský rozvoj v tzv. biodisciplinách (biochemie, molekulární a buněčná biologie) umožnil racionální přístup k navrhování léčiv. Farmakochemie je interdisciplinárním oborem, který shrnuje poznatky chemické syntézy, molekulového modelování, farmakologie, chemické a farmaceutické technologie, analytické chemie, chemometrie a statistiky, biochemie a molekulové biologie, fyziologie a mediciny, ale i informatiky, ekonomiky, zdravotní politiky, marketingu, patentového práva a v neposlední řadě i lékařské etiky.

Specifickým odvětvím chemie se farmakochemie stala až v posledních dekádách 20. století. Ve středověku nebyla skutečně účinná léčba možná. Chirurgie byla pouhým ranhojičstvím, jako léčiva se používaly jen některé anorganické látky a rostlinné extrakty. Jen málo z nich bylo dostatečně účinných, mnohé měly jen placebový účinek a některé „léky“ byly jedy, které více škodily než pomáhaly. Nejúčinnější přírodní léky, např. opium k tišení bolestí nebo kůra chinovníku pro léčbu horečnatých stavů, pocházely z teplých krajů a v Evropě si mohl dovolit jen málokdo. Rostliny rostoucí v mírném pásmu obsahovaly látky méně účinné nebo obsah skutečně účinných látek v nich byl jen nízký. Hygiena byla neznámým pojmem, šířily se infekce, které měly více obětí než války. V letech 1558 - 1626 podle podrobných zápisů vedených zachovaných na londýnské faře u kostela svatého Botolpha přežilo ze 100 novorozenců jeden den 93, 1 měsíc 84, 1 rok 70, pět let 48 a 15 let pouze 27.

Situace se výrazně zlepšila až v 19. století, kdy se chemie konstituovala jako vědecký obor s experimentálním i teoretickým aparátem. V 19 století začala medicina stále více spoléhat na různé chemické látky a to vedlo k dramatickému poklesu úmrtnosti. Ignác Semmelweis, prosadil v r.1848, aby si porodníci myli ruce ve vodě s chlorovým vápnem. To vedlo k poklesu úmrtí rodících žen na „horečku omladnic“ z 18% na 1,2-1,3%. Joseph Lister začal roku 1865 ošetřovat rány „karbolem" (nečistý fenol). Do té doby umíraly více než tři čtvrtiny zraněných na sepsi ran, i malá zranění byla často smrtelná. Použití etheru a chloroformu k narkóze přineslo průlom do chirurgie. Chemici se naučili izolovat složky přírodních léčiv, vyčistit je a identifikovat. Byly získány „aktivní principy“ opia (morfin), kůry chinovníku (chinin), tabáku (nikotin), kávy (kofein) apod., které byly mnohem účinnější, než původní extrakty nebo odvary. Určení struktury přírodních látek otvíralo cestu k jejich syntetické přípravě nebo jejich modifikaci na deriváty s lepšími vlastnostmi (např. aspirin). Vývoj léčiv a léčebných postupů významně ovlivnily objevy mikrobiálních původců různých infekčních onemocnění.. Ale i zdánlivě malé objevy, jako bylo zkonstruování injekční stříkačky v polovině 19. století, se staly důležitým mezníkem historie výzkumu, vývoje a výroby léčiv.

Další pokrok přineslo 20. století. Do lékařské praxe byla postupně zaváděna řada skutečně účinných léčiv. Zprvu byla úspěšná léčiva především tam, onemocnění mělo jednoduchou příčinu, např. bakteriálního původce (sulfonamidy a pak antibiotika), ve druhé polovině století se pak objevily účinné léky na nemoci způsobené nahromaděním různých faktorů (léčiva na onemocnění kardiovaskulárního a centrálního nervového systému, protinádorové léky apod.) Význam moderních léčiv pro terapii lze ilustrovat na příkladu infekčních onemocnění v USA. Ještě v r. 1900 tam na infekční onemocnění ročně umíralo 8.080 lidí na 1 mil. obyvatel. V éře sulfonamidů tento počet klesl na polovinu (např. v r. 1940 to bylo 4.410 pacientů z milionu) a po zavedení antibiotik se úmrtnost na infekční choroby snížila řádově (v r. 1990 to bylo pouhých 410 pacientů z milionu, z toho 313 zemřelo na zápal plic).

Dnes je možné úspěšně léčit chirurgickým zákrokem (včetně transplantací), fyzikální terapií (včetně ozařování), psychoterapií, chemoterapií a imunoterapií (sem patří např. vakcinace). Léčebné metody se vzájemně kombinují a ovlivňují - rozvoj chirurgie přinesl potřebu nových anestetik, transplantace byly umožněny objevem imunosupresiv, podávání léků proti srážlivosti krve snížilo riziko pooperačních embolií,

1

naopak podávání preparátů, které srážlivost krve zvyšují, snížilo v jiných případech riziko vykrvácení pacienta, radioprotektiva chrání zdravé tkáně pacientů před ozářením a tím umožňují aplikovat vyšší dávky záření na nádorovou tkáň, antidepresiva pomáhají při psychoterapii pacientů, kteří přežili pokusy o sebevraždu apod. Výhodná může být i kombinace různých typů léků - mnohé protinádorové léky mohou být podávány ve vyšších dávkách díky tomu, že se po jejich aplikaci nasadí léky podporující krvetvorbu.

Boj s nemocemi však nekončí ani v 21. století. Objevují se nové (AIDS, legionářská nemoc aj.), bakterie a viry, ale i nádorové buňky získávají rezistenci na léčiva. Se stárnutím populace se dříve vzácná onemocnění stávají běžnými.Léčiva pomáhají léčit poruchy, o nichž se dříve nepředpokládalo, že by mohly být medikamentózně ovlivněny (např. impotence, poruchy pozornosti spojené s hyperaktivitou, obezita, inkontinence apod.). Lidstvo sice dbá více na prevenci a zdravý životní styl, ne však dostatečně. Zvyšuje se počet "civilizačních chorob" a onemocnění způsobených environmentálními faktory (astma, alergie) nebo změnou životních podmínek. Někdy přitom platí, že zlepšování kvality života nevede vždy ke zlepšení zdravotního stavu. Tak např. růst počtu pacientek s nádory prsu, vaječníků, děložního těla nebo čípku je dáván do souvislosti s výrazným zvýšením počtu periodických změn hladiny hormonů při ovulačním cyklu. V 19. století se ženy začínaly menstruovat až po 15. roce, většinou se vdávaly před dosažením 20 let a mívaly velký počet dětí, které kojily. Periodických změn hladiny ženských pohlavních hormonů spojených s ovulací a menstruací mívaly proto jen několik desítek. Dnešní ženy začínají menstruovat kolem 12 let, vdávají se kolem 30 let, mají 1-2 děti a ovulačních cyklů prožívají proto v průměru 400. Zvýšený výskyt alergií v poslední době je podle jedné nedávné teorie dáván do souvislosti s vyšší úrovní hygieny: malé děti rostoucí ve špinavějším prostředí se dostávaly do styku s mnohými alergeny dříve než nyní a organismus jim "přivyknul" a při dalším kontaktu na ně nereagoval hypersenzitivně.

Do poloviny 20. století nebyla léčiva řádně testována, sledována byla jen jejich účinnost. Teprve některé tragické události vedly k tomu, že se do popředí zájmu dostala i bezpečnost a s ní úzce související kvalita léčiv. Legislativně byla kodifikována opatření zajišťující, že se na trh nedostanou nebezpečná léčiva. V 19. století zkoušeli lékaři a chemici nejčastěji sami na sobě, dodnes je populární Freudův popis účinků kokainu. Nikdo se nezabýval vedlejšími účinky léčiv, což mělo za následek pozdější komplikace a zákaz řady léčiv zpočátku považovaných za téměř zázračné. Např. na konci 19. století byl do praxe s velkou slávou zaveden do lékařské praxe heroin jako lék pro „hrdiny“, který účinně potlačuje bolest. Již o pár let později však musel být zakázán jako silně návyková látka. Ve 30. letech došlo v USA k řadě úmrtí pacientů léčených „sulfonamidovým elixírem“. Ukázalo se, že tato úmrtí zavinil diethylenglyko obsažený v „elixíru. Aby se podobné případy neopakovaly, byl v USA přijat nový zákon o léčivech, potravinách a kosmetice, v němž byly poprvé vytýčeny zásady analytické kontroly léčiv. Podobné zákony pak byly přijaty i v dalších zemích. Koncem 50. let se v řadě zemí narodilo mnoho dětí s nevyvinutými končetinami. V r. 1962 bylo zřejmé, že to bylo v souvislosti s používáním thalidomidu (Contergan), který byl často předepisován těhotným ženám jako „bezpečné“ sedativum pro potlačení ranní nevolnosti. Thalidomid je sice výtečným sedativem a hypnotikem, je však současně teratogenem, který negativně ovlivňuje růst embrya v děloze. Do té doby nikoho nenapadlo, že to, co u některých pacientů výtečně účinkuje, může jiné pacienty poškodit. Výsledkem bylo další zpřísnění lékové legislativy. Výrobci museli před uvedením léčiva na trh prokazovat nejen jeho účinnost, ale i bezpečnost. Bylo rozšířeno preklinické testování a při pokusech na zvířatech se mimo jiné musí zkoumat embryotoxicita a teratogenita. U nových léčiv se musí ještě po uvedení na trh sledovat vedlejší účinky (provádět tzv. farmakovigilanci) a občas dochází k tomu, že léčivo je po několika letech z trhu staženo.

Velký důraz kladený na preventivní opatření směřující k tomu, aby se na trh dostala jen ta léčiva, která jsou účinná, kvalitní a bezpečná, vyústil ve formulování tzv. správné výrobní praxe (SVP, anglicky Good Manufacturing Practice, GMP), souboru zásad a opatření, kterými se musí řídit každý výrobce léčiv a správné klinické praxe vymezující podmínky zkoušení léčiv. Účinná prevence je drahá, takže ceny léků rostou.Do ceny léčiv se promítají náklady na výzkum a vývoj, kam patří i klinické zkoušení. Průměrné náklady na vývoj nového léčiva od objevu až po povolení k prodeji se nyní vyšplhaly až na 800 mil.$. Výrazně vzrostly náklady na technicky zabezpečenou a řádně zdokumentovanou výrobu podle zásad SVP. Rostou i náklady na nové léčebné postupy a techniky, nové diagnostické postupy, na nové vybavení a na mzdy zdravotníků. Objem prostředků, které má zdravotnictví k dispozici však roste mnohem pomaleji nebo i stagnuje.

Před zdravotnictvím prakticky všech zemí světa tak stojí neřešitelný problém, jak bez výrazného nárůstu finančních nákladů zajistit široce dostupnou nejvyšší možnou léčebnou péči. Nákladnost pokroku ve zdravotnictví lze ilustrovat tím, že mezi roky 1950 - 2000 vzrostly náklady na léčbu nemocí asi 800 x. Různé země vynakládají v současné době na zdravotní péči 2-13% HDP. Nejvyšší podíl výdajů na zdravot2

nictví mají vyspělé státy - na konci 90. let to bylo v USA 12,7% HDP, v Evropě nejvíce v Německu (10,5%) a pak Švýcarsku (9,8%). V ČR se podíl výdajů na zdravotnictví pohybuje kolem 6,5% HDP. Výši výdajů do jisté míry odpovídá stav zdraví:

např. v USA přežívalo 5 let po stanovení diagnózy nádorů prsu 82% pacientek, ve Švýcarsku 76%, zatímco ve Spojeném království s podílem výdajů na zdravotnictví pouze 6,9% HDP jen 63% pacientek.

Léčiva představují pouze menší část celkových nákladů na zdravotní péči. V ČR to v minulých letech bylo asi 30%. V západních zemích, kde náklady na zdravotnictví ovlivňují mimo jiné vyšší mzdy zdravotnického personálu a vyšší standard vybavení, je tento podíl menší.

To, že několik miligramů léčiva může stát tisíce korun, někdy vede k představě, že růst výdajů na zdravotnictví lze zabrzdit hlavně šetřením na lécích. Nahrává tomu skutečnost, že spotřeba léčiv roste rychlejším tempem než výběr pojistného a ještě rychleji rostou průměrné ceny léčiv (nárůst spotřeby léčiv v "ddd", doporučených denních dávkách, je pomalejší, než růst spotřeby léků vyjádřený finančně). Šetření na lécích je správné, nesmí se však šetřit za každou cenu. Podle odborných odhadů, lze v ČR racionálnějším předepisováním léků ušetřit asi 10% jejich celkové spotřeby bez významnějších dopadů na zdraví pacientů. Tato úspora se však do celkových nákladů na zdravotní péči promítne pouze 3%. Podstatně větší úspory lze dosáhnout racionalizací sítě poskytovatelů zdravotní péče, omezováním zbytečných výkonů a snižováním doby hospitalizace pacientů.

Přes vysokou cenu se moderní léčiva většinou vyplácejí: zkracují dobu hospitalizace, umožňují nahradit nemocniční léčbu ambulantní, mají menší nežádoucí vedlejší účinky. Lék, který je sice několikrát dražší, ale na rozdíl od svého předchůdce se nemusí podávat několikahodinovou infuzí, ale orálně ve formě tablet nebo kapslí, se může vyplatit, protože se pacient může léčit doma a ne v nemocnici. Náklady na léčbu může snížit i to, že nové léčivo má méně nežádoucích vedlejších účinků. V Německu si např. spočítali, že náklady na hospitalizaci pacientů zapříčiněnou vedlejšími účinky léků činí ročně přes 0,5 mld. €.

Místo omezování preskripce nových drahých léků je v boji proti zvyšování nákladů na zdravotní péči daleko účinnějším opatřením to, že instituce, které léky schvalují a povolují, začínají vyžadovat u nových léčiv nejen zkoušky účinnosti a bezpečnosti, ale i provedení farmakoekonomických studií. Tyto studie jsou ekonomickým rozborem, který ukazuje, jak se léčba novým přípravkem promítne do celkových nákladů na zdravotní péči. Farmakoekonomické posuzování je snadné u léků, které zkracují a zjednodušují léčbu. Jsou však léčiva, kde toto kriterium nelze použít. Např. u protinádorových léků se výhodnost léčiva posuzuje podle toho, jak prodlouží dobu přežití pacientů. V tomto případě je otázkou, jakou cenu lidskému životu přisoudit. Počítání s cenou života se může jevit jako neetické. Prostředky na zdravotní péči však nejsou neomezené. To, že drahá léčba prodlouží život jednoho pacienta o pár dní může znamenat, že budou scházet peníze na trvalejší léčbu jiného pacienta. V USA jsou náklady na prodloužení života považovány za efektivní, jestliže nepřesáhnou 50 tis. $ na jeden člověkorok. Tato částka byla na základě doporučení expertů odvozena z průměrných ročních nákladů na dialýzu pacientů se selháním ledvin. Podle údajů o nákladovosti dialyzační léčby v ČR se tyto náklady v našich nemocnicích v r. 1997 pohybovaly mezi 300-400 tis. Kč, nyní to bude částka kolem 0,5 mil. Kč.

Vedle doby přežití je pro pacienty důležitá i kvalita života. Ta je odlišná u pacienta, který po skončení terapie žije zcela normálním životem a jiná u pacienta, kterému léčba sice prodloužila život, ale za cenu narušení funkce některého orgánu. Ve farmakoekonomických studiích se proto doba přežití nevyjadřuje prostým časovým údajem, ale v tzv. jednotkách QALY (Quality Adjusted Life Year), které jsou přepočtem na roky života se standardní kvalitou. Ta např. u pacienta s jednou amputovanou končetinou se léta života přepočítávají na QALY vynásobením koeficientem 0,5.

Náklady na léčbu pacientů v posledním půlroce před smrtí jsou v průměru stejné, jako náklady na zdravotní péči za celý zbytek života. Přesto nesmí lékařská péče polevit ani v tomto posledním období života. Farmakoekonomika musí přitom vždy kráčet ruku v ruce s lékařskou etikou. Moderní medicína mnohdy dokáže prodlužovat život na velmi dlouhou dobu. Přitom však může překročit hranici, kdy se smysluplné prodlužování života mění v neúčelné oddalování smrti. Jde např. o nákladné udržování životních funkcí pomocí podpůrných přístrojů prakticky již nežijícího pacienta. U pacientů v terminálním stadiu nádorového onemocnění musí onkologové řešit otázku, zda aplikovat další cykly chemoterapie, která způsobuje pacientovi obtíže a nakonec stejně nepomůže, nebo zda paliativní léčbou zbavit pacienta bolesti a zlepšit kvalitu jeho posledních dnů. Podle doporučení onkologické společnosti J.E. Purkyně má o ukončení neprospěšné léčby rozhodnout odborný tým, a to především na základě medicinských důvodů. Ošetřující lékař má o ukončení neúčinné chemoterapie informovat pacienta s tím, že léčba nekončí, ale že se soustředí na zlepšení kvality života 3

Základní pojmy chemie léčiv Chemie léčiv (farmakochemie) se zabývá navrhováním a syntézou nových léčiv na základě poznání jejich účinku na molekulární úrovni. Léčiva jsou sloučeniny, které interagují s cílovými (bio)makromolekulami v organismu, přičemž tato interakce vyvolává biologickou odezvu → léčivo má farmakologický účinek. Interakce léčiva s cílovou strukturou studuje farmakodynamika. Aby léčivo mělo farmakologický účinek, musí nejen být schopné interakce s cílovou strukturou v organismu, ale musí se k této cílové struktuře dostat v dostatečně vysoké koncentraci a působit na ni dostatečně dlouhou dobu. Studiem těchto aspektů se zabývá farmakokinetika.

Farmakologický účinek může být příznivý a nepříznivý. Vztah mezi prospěchem a poškozením organismu je proto třeba u každého léčiva velmi pečlivě posuzovat. Cílem výzkumu a vývoje léčiv je maximalizovat příznivý účinek a současně co nejvíce potlačit nežádoucí nepříznivé účinky. Např. nádorová onemocnění jsou zapříčiněna selháním mechanismu kontroly růstu buněk. Některá léčiva mohou nekontrolovaný růst buněk zastavit, jejich zásah však nemusí být dostatečně jemný. V dospělém organismu rostou nové buňky jen velmi pomalu. Výjimkou jsou nádorové buňky, ale i krvinky, které se vytvářejí v kostní dřeni, buňky vlasových kořínků nebo některých sliznic. Vedlejším účinkem protinádorových léčiv zastavujících růst nádorových buněk proto bývá narušení krvetvorby, alopecie, zvracení apod. Někdy se stane, že vedlejší účinky neumožní, aby léčivo bylo povoleno, jindy se vedlejší účinky mohou projevit i po uvedení na trh. Jsou-li tyto účinky závažné, může dojít ke stažení léčiva. Nedávno se to stalo u cerivastatinu (Lipobay nebo Baycol), léku snižujícího hladinu cholesterolu. Předepsán byl asi 6 milionům pacientů. Naprosté většině pomohl, současně však zapříčinil smrt 52 z nich. Nejprve se na balení léku objevilo varování, kterým pacientům nesmí být předepisován a když ani to nepomohlo, byl stažen z trhu. Případ měl velkou publicitu, podobně však dříve bylo z trhu staženo více léků.

Ve vztahu k nemoci může mít léčivo účinek léčebný - kurativní, zmírňující - paliativní (nemoc neléčí, ale zmírňuje její průběh, zvyšuje kvalitu života a dobu přežití), podpůrný, doplňkový - adjuvantní a ochranný - preventivní. Farmakologický účinek, ať již příznivý nebo nežádoucí, má pravděpodobnostní charakter. Žádný lék nepůsobí na všechny stejně - nemá stejnou terapeutickou odezvu. Mnohé nemoci, jako je rakovina, kardiovaskulární onemocnění, astma apod., mají multifaktoriální charakter - stejné onemocnění může být způsobeno různými typy poruch, např. narušením funkce různých enzymů podílejících se na určitém biologickém procesu, např. buněčném dělení. Určité léčivo obvykle interaguje pouze s jedním enzymem metabolické dráhy. Bude působit u pacienta, u něhož bylo onemocnění způsobeno narušením funkce tohoto enzymu, u jiného, kde poruchu ovlivnila funkce jiného enzymu účinné nebude.

Organismus je složitým útvarem s individuálními odchylkami, které se mohou projevit i na úrovni cílové struktury pro léčivo, např. u enzymů nebo receptorů. Změny mohou být tak malé, že cílová struktura zůstane funkční, mohou však ovlivnit interakci léčiva s touto strukturou, čili účinek léčiva. Interakce může být usnadněná nebo naopak zhoršená. U jednoho pacienta pak bude stejné léčivo působit silněji než u druhého. Změny v cílové struktuře jsou velmi často způsobeny bodovou mutací genů, které mají za následek změnu jedné aminokyseliny v kódované bílkovině. Mutace tohoto typu jsou označovány jako polymorfismus jednotlivých nukleotidů (Single Nucleotide Polymorphismus, zkratka SNP) a jejich zjišťování je věnována značná pozornost v souvislosti s tzv. individualizovanou terapií.

Důležité jsou nejen rozdíly v interakcích léčiva s cílovou strukturou (tj. farmakodynamických vlastnostech), ale i individuální odchylky v metabolismu léčiva způsobené odchylkami ve struktuře enzymů katalyzujících přeměny a odbourání léčiva (farmakokinetické vlastnosti). Některý pacient může léčivo odbourávat (nebo naopak aktivovat) rychleji, jiný pomaleji. U prvního je pak třeba k dosažení stejného účinku zvýšit dávku, u druhého se naopak může v důsledku zpomalené eliminace léčivo hromadit, což může způsobit prohloubení nežádoucích vedlejších účinků. Metabolismus léčiva mohou ovlivnit nejen malé změny ve struktuře degradujících nebo transformujících enzymů, ale i jiná léčiva, složky potravy, nikotin z tabákového kouře apod., které soutěží o stejný enzym, popř. mohou stimulovat nebo naopak inhibovat aktivující nebo odbourávající enzymy

4

Výzkum a vývoj nových léčiv Výzkum a vývoj nových originálních léčiv je zdlouhavý, velice nákladný a přitom značně rizikový. Kompletní výzkum a vývoj si mohou dovolit pouze finančně velmi silné farmaceutické koncerny. Zcela nových léčiv je proto uváděno na světový trh každým rokem jen poměrně málo. V posledních letech to bývá každý rok jen 40-50 originálních léčiv. S tímto malým počtem kontrastuje velký počet publikovaných prací věnovaných přípravě nových potenciálních léčiv. Jejich autoři jsou často pracovníci akademických institucí nebo malých firem, kteří se domnívají, že výsledky své práce prodají formou licence k dokončení vývoje farmaceutickým gigantům. Pravděpodobnost, že se jim podaří připravit nové léčivo je však jen velmi malá – z desetitisíců nových sloučenin se léčivem stane jediná. Malá pravděpodobnost však neznamená nulovou pravděpodobnost, ale nutnost přistupovat k výzkumu a vývoji léčiv racionálně. Zjistí-li se u nějaké látky zajímavé biologické účinky, je třeba učinit vše proto, aby se ze slibné látky léčivo stalo. Objev nového léčiva je třeba ochránit (zapatentovat), zajistit si potřebné zdroje účelnou spoluprací, postupovat rychle a účelně neopomenout nic, co rozhoduje o úspěchu.

Má-li být výzkum a vývoj léčiv úspěšný, je třeba si uvědomit, že jde o službu, která má různé zákazníky s různými zájmy, které je třeba uspokojit. ¾

¾ ¾ ¾ ¾

Pacienti požadují, aby jim léčiva pomáhala zlepšit kvalitu života, tj. vyléčila onemocnění nebo alespoň odstranila jeho symptomy a prodloužila dobu do dalšího projevu symptomů, prodloužila dobu života, zmírnila bolesti, zkrátila dobu neschopnosti, byla účinná a současně měla minimum vedlejších účinků, byla hrazená pojišťovnou nebo alespoň byla levná a aby jejich podání bylo snadné a komfortní Lékaři mají podobné požadavky na léčivo jako pacienti, navíc požadují minimum kontraindikací (stavů, kdy léčivo nelze předpisovat), protože omyl může mít nepříznivé následky nejen pro pacienta, ale i lékaře Lékárníci a distributoři léčiv požadují od léčiv reprodukovatelnou kvalitu a co největší stabilitu Poskytovatele a plátce zdravotní péče (pojišťovny) chtějí, aby jejich finanční zátěž spojená s podáním léčiva byla co nejnižší (nízká cena, vysoká farmakoekonomická výhodnost) Vedení a akcionáři farmaceutické firmy mají zájem o široké uplatnění léčiva (rozsáhlé indikace, využitelnost u nejčetnějších onemocnění, minimální konkurence), co nejdelší patentovou ochranu (u originálních léčiv), nízkou nákladovost a vysokou ziskovost výroby a také o to,aby léčivo vytvářelo u veřejnosti příznivý obraz firmy.

Výzkum a vývoj nových léčiv lze rozdělit do několika fází. První fází u nových léčiv je fáze objevu (Drug Discovery). Přitom se nejprve určí cíl výzkumu, tedy nemoc nebo poruchu, kterou má nová látka léčit. Dále je třeba určit, jak bude prováděn screening, tj. jak budou potenciální léčiva zkoušena. Zkoušení usnadní, je-li na molekulární nebo buněčné úrovni známa cílová struktura (enzym, receptor apod.), která hraje při onemocnění závažnou roli a jejíž interakcí s léčivem (např. inhibicí enzymu) lze ovlivnit průběh onemocnění. V takovém případě lze screening provádět in vitro, „ve zkumavce“. Pak následuje hledání první (základní) účinné látky, vodítka – „lead compound“. Přitom lze zkoušet řadu syntetizovaných látek nebo různé přírodní látky izolované z rostlin a živočichů. Pokud jsou k dispozici informace o prostorové stavbě cílové struktury lze dokonce molekulu potenciálního léčiva nejprve navrhnout pomocí počítače a teprve pak syntetizovat a ověřit, zda má předpokládané vlastnosti. V minulosti mnohdy napomohla nalezení účinných látek šťastná náhoda (serendipita) a její podíl na objevech nových léčiv nelze vyloučit ani nyní (viz příklad Viagry).

Pokud systematická práce nebo i šťastná náhoda přinesla objev první účinné látky, vodítka, následuje druhá fáze, fáze návrhu (Drug Design). V této fázi se zkoumají analoga „vodítka“. Tato fáze zahrnuje spoustu systematické práce v řadě oblastí. Obvykle se v této fázi provádí příprava velkého počtu analog základní účinné látky a jejich testování. V minulosti byla tato fáze velmi pracná, v posledních letech však byly vyvinuty postupy kombinatoriální chemie umožňující přípravu velkého počtu analog („knihoven látek“) naráz. Přípravu analog usnadňuje, mohou-li se na základě srovnání účinnosti několika látek odvodit strukturní rysy důležité pro biologickou aktivitu, tzv. farmakofor. Vztah mezi strukturou a aktivitou (SAR, Structure-Activity Relationship) lze modelovat i pomocí výpočetní techniky. Přitom se nesleduje jen základní účinnost, ale i toxicita, popř. další vedlejší účinky. Synteticky se pak připraví jen několik analog, u nichž se při screeningu prověří správnost modelu. Model se pak podle potřeby doladí. S růstem znalostí o vztazích mezi strukturou a aktivitou se výběr připravovaných látek zužuje. U vybraných látek s nejslibnějším farmakologickým profilem a nejnižší toxicitou se pak zahájí testování in vivo, na pokusných zvířatech. Přitom se zjišťují jak základní farmakodynamické, tak i farmakokinetické parametry (ADME, adsorpce, distribuce, metabolismus, exkrece). V případě nutnosti se pak modifikací molekuly léčiva, které je sice vysoce účinné, ale má nevýhodné vlastnosti (např. malou rozpustnost, nedostatečnou lipofilitu, malou stabilitu v kyselém prostředí žaludku apod.) tyto parametry upravují. Přitom se např. z léčiva připraví acylací, esterifikací a jinými reakcemi „proléčivo“ (prodrug), derivát, který se na skutečně účinnou látku přemění až po proniknutí k cílové buňce působením buněčných enzymů. Jinou možností je, že se nerozpustná molekula léčiva uzavře do inkluzních komplexů nebo liposomů. V této formě se podá pacientovi a uvolní se opět až po dosažení cíle. 5

Vybraná molekula léčiva nakonec přechází do vývojové fáze (Drug Development). V této fázi se optimalizuje postup syntézy léčiva a řeší technologické problémy (včetně otázek bezpečnosti práce a ochrany životního prostředí): Vypracovaný postup se pak převede do výrobního měřítka (scaling up). Současně se vyvíjí léková forma (tablety, injekce apod.) a postup její výroby, určí se jakostní parametry a vypracují postupy analytického hodnocení. Identifikují se nečistoty a případné rozkladné produkty a připraví se (izolací nebo synteticky) jejich standardy, a provedou se zkoušky stability účinné látky i finální lékové formy. U nových léčiv se rozšíří rozsah biologického testování na pokusných zvířatech, aby se získaly informace o farmakologickém profilu látky potřebné pro povolení zahájení zkoušek na člověku. Pak se zahájí klinické zkoušky. Nejprve se v tzv. fázi I zjišťuje na malém počtu dobrovolníků, jak závisí hlavní i vedlejší účinky na dávce léčiva. Poté se s vhodně zvolenou dávkou provede zkoušení na menších nebo větších souborech pacientů (fáze II a III). Jedna část pacientů dostává nové léčivo, druhá část neúčinnou napodobeninu (placebo) nebo v případech závažných onemocnění známé osvědčené léčivo. Pacienti se do obou skupin dostávají náhodným výběrem (randomizovaná studie) a při zkoušení neví, zda nové léčivo dostávají (zaslepená studie). Často to neví ani ošetřující lékař (dvojitě zaslepené klinická studie). Veškeré výsledky se pečlivě dokumentují a po dokončení zkoušek se dokumentace předává registračním orgánům, které rozhodnou o povolení nového léčiva. I když se klinické zkoušky provádí s velkým souborem náhodně vybraných pacientů, nemusí se při nich vždy zjistit všechny vedlejší účinky. Práce na vývoji nového léčiva proto ještě nekončí, ještě několik let po uvedení na trh se musí provádět tzv. farmakovigilance, shromažďování informací o nežádoucích vedlejších účincích.

Časovou náročnost výzkumu a vývoje nového léčiva ilustruje následující přehled: Patentové aktivity Objev Návrh 1

Preklin. zkoušky IND

10000 → 10 látek

1-3 roky

Technologie Farmakologie I Fáze II III Klinické zkoušení

10 → 1-2 Analytika

Toxikologie 1 –3 roky

Registr. NDA řízení 1 lék

Farmakovigilance

Zkoumání metabolismu 3 – 6 let

Uvedení na trh

1- 3 roky

5 let

IND = žádost o povolení klinického zkoušení (Investigational New Drug application, NDA = žádost o registraci nového léčiva (New Drug Application)

Zda VaV nového léčiva zahrne všechny zmiňované fáze, závisí na jeho inovativnosti. Podle inovativnosti lze léčiva rozdělit do několika kategorií: ¾ Nová struktura, nové přínosy pro terapii ¾ Nová struktura, známé přínosy („me too“) ¾ Známá struktura, nové přínosy pro terapii („prodrug“, jediný enantiomer, nový typ soli, směrování, nové indikace, nové lékové formy) ¾ Známá struktura, známé přínosy (generika) Náročnost, nákladnost i rizikovost výzkumu a vývoje klesá směrem dolů. Nejnáročnější (a nejdražší) je pochopitelně vývoj zcela nových léčiv s novým typem účinku. Jejich výzkum a vývoj začíná již objevitelskou fází. Výzkum a vývoj analog zavedených léčiv, avšak se zlepšenými vlastnostmi, jako jsou tzv. „me too“, „proléčiva“, liposomální formy léčiv, enantiomery místo racemátů apod., zahajuje až ve druhé fázi, u generik – kopií zavedených léčiv – se provádí pouze vývoj (třetí fáze).

Generika lze uvést na trh až po vypršení patentové ochrany originálního přípravku, podle nové legislativy EU mohou však být vyvíjena již před skončením platnosti patentu (v ČR se zatím nesmí před vypršením patentu provádět ani vývoj generik). Vedle patentové ochrany je však třeba brát v úvahu i tzv. ochranu farmaceutických dat. Trvá-li ochrana farmaceutických dat i po vypršení platnosti patentu, je sice možné léčivo vyrábět, ale aby bylo povoleno, je třeba provést všechny předepsané preklinické a klinické zkoušky a výsledky předložit příslušné lékové registrační instituci (v ČR Státnímu ústavu pro kontrolu léčiv, SÚKL). To je ovšem velice nákladné. Výrobci generik proto raději čekají až ochrana dat skončí (v ČR zatím za 6 let, v EU podle nové legislativy za 8 let). Pak je možné se v žádosti o povolení odvolat na výsledky zkoušek originálního přípravku s tím, že se pouze provede průkaz bioe6

kvivalence generika. Tím může být výsledek porovnání výsledků podání generika a originálního přípravku u malého souboru pacientů, u injekcí se registrační orgány mohou spokojit s porovnáním složení a stability léčiva.

Farmakodynamika Farmakodynamika se zabývá studiem účinků léčiv na organismus. V současné době stojí na začátku projektů výzkumu a vývoje léčiv určení místa terapeutického zásahu léčiva - cílové struktury. Při vazbě léčiva na cílovou strukturu se uplatňují různé typy interakcí a vazeb Jedna molekula léčiva se přitom obvykle váže na cílovou strukturu v důsledku interakcí více skupin stejného nebo různého charakteru. • Iontové interakce mezi ionizovanými skupinami nesoucími opačný náboj jsou velmi silné. Hrají významnou roli při účinku některých neurotransmitérů nebo hormonů, jako je např. dopamin nebo adrenalin (epinefrin) s jejich receptory. Účinné látky přitom nesou v molekule aminoskupinu, která je ionizována a interaguje s ionizovanou karboxylovou skupinou receptoru (např. adrenalin se iontově váže na aspartátový zbytek Asp 113 vazebného místa adrenergních receptorů). • Vodíkové vazby se vytvářejí mezi skupinami majícími charakter donorů a akceptorů protonu. Přestože jsou mnohem slabší než vazby iontové, hrají při interakcích účinných látek s jejich cílovou strukturou významnou roli. Při zmíněné vazbě adrenalinu na adrenergní receptor nehraje roli jen iontová vazba methylamoniové skupiny na karboxylátový iont zbytku asparagové kyseliny, ale i vodíkové vazby mezi fenolickými hydroxyly molekuly adrenalinu (donory) a hydroxyskupinami serinových zbytků 204 a 207 receptoru. • Význam interakcí dipól-dipól pro vazbu léčiv na jejich cílovou strukturu je poměrně málo prostudovaný. Přesto je zřejmé, že interakce látek, které mají charakter dipólu, s dipolárními skupinami strukturami ve vazebném místě cílové struktury účinnost léčiv významně ovlivňují. Pokud ze sterických důvodů nemůže dipolární látka ve vazebném místě zaujmout správnou orientaci, tak, aby opačně nabité části dipolů mohly vzájemně interagovat, účinnost klesá. Ukázalo se to např. při studiu účinnosti analog cimetidinu, léčiva proti žaludečním vředům. • Změny elektronové hustoty způsobené pohybem elektronů v nepolárních skupinách vedou k tomu, že se přechodně vytvoří místa s vyšší a nižší elektronovou hustotou, která můžeme považovat za přechodné dipóly. Přestože mají časově omezenou životnost, umožňují, aby docházelo k van der Waalsovským interakcím mezi místy, kde přechodně vzniká elektronový deficit s místy, kde je elektronová hustota krátkodobě zvýšena. • Při interakcích léčiv s vazebnými místy cílové struktury hraje často velkou roli přítomnost alkylových a arylových skupin, které propůjčují molekule léčiva určitý hydrofobní charakter. Hnací silou hydrofobních interakcí těchto skupin s „hydrofobními kapsami“, paralelně orientovanými planárními aromatickými skupinami cílové struktury apod. jsou jednak van der Waalsovy síly, jednak entropické změny v systému vyvolané změnami struktury vody v okolí hydrofobních skupin. Kapalná voda není zcela homogenní, ale jsou v ní místa se zvýšenou uspořádaností. V okolí hydrofobních skupin je těchto uspořádaných míst více než v jiných místech objemu vody. Přesný fyzikální popis změn struktury vody při hydrofobních interakcích by byl velmi složitý. Velmi zjednodušeně si místa se zvýšenou uspořádaností struktury můžeme představit jako mikroskopické „ledovečky“. Dojde-li k interakci, pak celkový počet „ledovečků“ v systému klesne, protože se do prostoru v okolí interagujících skupin nevejdou. Část jich proto musí „roztát“. Tím se zvýší neuspořádanost systému, takže entropie vzroste. Hydrofobní interakce mezi aromatickým kruhem molekuly adrenalinu a fenylovým zbytkem fenylalaninu 290 je třetím typem interakcí, které se spolupodílejí na již zmíněné vazbě adrenalinu na adrenergní receptor. • Většina léčiv se váže na cílové struktury nekovalentními vazbami. Jsou však známa i některá léčiva, která se mohou na svoji cílovou strukturu vázat kovalentně. Patří mezi ně např. alkylační cytostatika, která mohou zablokovat buněčné dělení tím, že vytvoří irreversibilní kovalentní vazbu mezi zbytkem léčiva a nukleofilními skupinami guaninu z molekuly DNA a tím znemožní transkripci a translaci genů.

Cílovými strukturami léčiv mohou být: ► Enzymy, které katalyzují metabolické přeměny v organismu. těle. Léčiva, jejichž cílovou strukturou jsou enzymy, působí tak, že buď enzymy inhibují nebo naopak aktivují Enzymy působí tak, že se do jejich aktivního místa naváže substrát, který je pak reakcí katalyzovanou enzymem přeměněn na produkt. Ten je z aktivního místa uvolněn. Při vazbě substrátu do aktivního místě se uplatňují různé typy nekovalentních interakcí, jako jsou iontové nebo vodíkové vazby, interakce dipól-dipól nebo van der Waalsovy síly. Aby enzymová reakce mohla proběhnout musí charakter aktivního místa umožnit dostatečně pevnou vazbu substrátu, avšak poměrně slabou vazbu produktu. Jinak by aktivní místo zůstalo zablokované produktem. Aktivní místo nemusí mít vždy ideální tvar pro substrát, při interakci se substrátem často dochází k indukované konformační změně. Při ní se tvar aktivního místa změní tak, aby nekovalentní vazebné síly byly maximální měrou využity pro vazbu substrátu.

7

Æ

Kompetitivní inhibitory soutěží s přirozeným substrátem o aktivní místo enzymu. Čím větší je koncentrace inhibitoru, tím více aktivních míst je obsazeno a tím menší množství substrátu se může přeměnit. Naopak, čím větší je koncentrace substrátu, tím více se jej přemění na produkt.

Æ

Nekompetivní inhibitory se neváží v aktivním místě, ale na jiném místě enzymové molekuly, tzv. alosterickém místě. Při vazbě nekompetivního inhibitoru do alosterického místa dochází ke změně tvaru celé molekuly enzymu, tedy i aktivního místa. Substrát pak je vázán slaběji nebo nemůže být navázán vůbec.

Kompetitivní i nekompetitivní inhibitory mohou být reversibilní nebo irreversibilní. Reversibilní inhibitory jsou vázány poměrně slabě, takže mohou být z vazby na enzym vytěsněny přirozeným substrátem. Vazba irreversibilních inhibitorů je naopak velmi pevná, často kovalentní. Blokují aktivitu enzymu trvale, protože nemohou být z vazebného místa vytěsněny. Æ

Aktivátory enzymů jsou látky, které naopak reakci enzymu se substrátem podporují Aktivátory působí tak, že zlepšují podmínky pro přeměnu substrátu na produkt tím, že příznivě ovlivňují prostorové uspořádání aktivního centra enzymu. Dochází k tomu zpravidla při vazbě aktivátoru do alosterického centra molekuly enzymu. Podobně jako inhibitory, mohou i aktivátory enzymů být reversibilní nebo irreversibilní. Aktivace může být i nepřímá, prostřednictvím jiných enzymů. Ty mohou aktivovat první enzym buď kovalentním navázáním vhodné skupiny, nejčastěji fosfátové (proteinkinasy) do alosterického centra nebo naopak odštěpením části molekuly, jejíž přítomnost průběh enzymatické reakce blokuje (patří sem např. přeměna neaktivních zymogenů na aktivní enzym, např. trypsinogenu na trypsin.

► Receptory. Jsou to bílkovinné útvary na povrchu nebo i uvnitř buněk, jejichž prostřednic-

tvím jsou buněčné funkce řízeny signály z vnějšího prostředí prostřednictvím signálních molekul, tzv. chemických poslů, neurotransmitérů nebo hormonů. Přenos signálů může být endokrinní (prostřednictvím hormonů sekretovaných endokrinními žlázami a transportovaných krevním oběhem k cílovým buňkám), parakrinní (uvnitř tkáně), kontaktní nebo synaptický (mezi dvěma zakončeními nervových buněk) Při navázání signální molekuly změní receptor svůj tvar a tím umožní předání signálu buňce. Látky, které s receptorem interagují stejně jako přirozená signální molekula se nazývají agonisté. Antagonisté jsou látky, které se na receptor sice mohou navázat, přitom jej však neaktivují, ale naopak zablokují a tím zablokují i přirozený přenos signálu. Některá léčiva mohou ovlivňovat více typů nebo podtypů receptorů, což pak může být příčinou vedlejších účinků těchto léčiv (např. antagonista jednoho receptoru může být agonistou druhého).

Receptory na povrchu buněk přenášející signály z vnějšího prostředí dovnitř buněk jsou trojího typu. Jsou to: Æ iontové kanály otevírané ligandem (mediátorově ovládané iontové kanály) - regulují průchod iontů (Na+, K+, Ca2+, Cl-) buněčnou membránou. Řada procesů v buňce je ovlivňována koncentrací iontů. Ionty nemohou normálně procházet buněčnou membránou. Ta je tvořena lipidickou dvojvrstvou a vytváří tak pro polární látky nepropustnou bariéru. K tomu, aby se ionty dostaly do buňky nebo z ní ven slouží iontové kanály. Jsou to jakési "tunely" tvořené soustavou bílkovin procházejících napříč buněčnou membránou. Nemohou být trvale otevřeny, protože průchod iontů do buňky a zpět by byl nekontrolovatelný. V buňce by byly jen ty ionty, které jsou v jejím okolí a stejné by byly i koncentrace iontů vnitř a vně buňky. Normálně jsou proto iontové kanály zavřené a otevírají se, až k tomu dostanou signál. Ten jim zajistí „nasednutí“ určité řídící látky na receptorové místo jedné z bílkovin iontového kanálu. Bílkovina přitom změní konformaci. Tím zahájí dominovým efektem změnu konformace dalších bílkovin, iontový kanál se otevře a ionty mohou procházet buněčnou stěnou. Některá léčiva mohou ovlivňovat funkce iontových kanálů. Příkladem mohou být "Ca blokátory" - léky snižující krevní tlak tím, že blokují iontové kanály pro vápenaté ionty Æ

receptory spojené s G-proteiny – zprostředkují přenos signálu z vnějšku do vnitřku buňky. Aktivace těchto receptorů extracelulárními přenašeči signálů (obvykle to jsou hormony), vyvolává tvorbu "druhých poslů", tj. molekul cAMP, IP3, DG apod., které přenáší různé signály uvnitř buňky. Jsou tvořeny bílkovinou, která prochází buněčnou membránou. Vazebné místo pro ligand mají na extracelulární straně, uvnitř buňky mají vazebné místo pro tzv. G-protein. Přenos signálu do buňky má dosti složitý mechanismus. Po nasednutí signalizační molekuly na extracelulární část receptoru se změní konformace bílkoviny a na intracelulární straně se otevře receptor pro G-protein. G-protein je složen ze tří podjednotek a obsahuje GDP. Při navázání na otevřený vnitrobuněčný receptor se změní charakter vazebného místa G-proteinu pro GDP. GDP se pak uvolní a místo něho se nyní do vazebného místa G-proteinu naváže GTP. Tím se destabilizuje struktura G-proteinu, který se rozpadne. Podjednotka α s navázaným GTP se uvolní a putuje buněčnou membránou, až se dostane k dalšímu 8

enzymu, adenylátcyklase a naváže se na něj. Přitom se změní struktura adenylátcyklasy a zpřístupní se její vazebné místo. V tom pak probíhá přeměna molekuly ATP na cAMP, vnitrobuněčnou signalizační molekulu, která v buňce spouští kaskádu různých aktivačních reakcí. Po zpřístupnění vazebného místa pro ATP katalyzuje adenylátcyklasa přeměnu více molekul ATP na cAMP, čímž se signál uvnitř buňky zesiluje. Existují však i jiné typy G-proteinů: Gi protein, jehož podjednotka α naopak adenylátcyklasu deaktivuje nebo G-protein, který aktivuje fosfolipasu C. Ta štěpí fosfatidylinositoldifosfát na inositoltrifosfát (IP3) a diacylglycerol (DG), které spouští jiné signalizační dráhy v buňce. cAMP zprostředkovává v buňce přenos signálů řady nízkomolekulárních látek a peptidických hormonů, jako je adrenalin, histidin, kortikotropin (ACTH), FSH a další, IP3 a DG se podílejí na přenosu signálů od zprostředkovaných noradrenalinem nebo vasopressinem. Æ

receptory s tyrosinkinasovou aktivitou Tyto receptory-enzymy prochází buněčnou membránou. Na extracelulární straně je receptorové místo, uvnitř buňky aktivní místo enzymu. Po navázání ligandu do receptorového místa se změní struktura receptoru a otevře se aktivní místo enzymu a enzym začne katalyzovat fosforylaci intracelulárních bílkovin.Ligandy tyrosinkinasových receptorů jsou opět peptidické hormony (insulin), růstové faktory a cytokiny. V poslední době je v protinádorové terapii věnována velká pozornost receptorům pro epidermální růstový faktor (EGF). EGF aktivuje prostřednictvím tyrosinkinasy svého receptoru celou řadu buněčných bílkovin, což vede k růstu a dělení buněk. Ukázalo se, že při řadě nádorových onemocnění může docházet k fúzi některých genů, což pak způsobí, že tyrosinkinasa receptoru pro EGF je mimořádně aktivní. To má za následek rychlý růst nádorových buněk. Látky inhibující tyrosinkinasovou aktivitu receptoru pro EGF jsou proto potenciálně velmi zajímavými protinádorovými léčivy. První z nich, imatinib (Glivec, Novartis), byl úspěšně zaveden do klinické praxe pro léčení chronické myeloidní leukemie, další (gefinitib - Iressa, AstraZeneca a erlotinib - Tarceva, OSI Pharma) jsou v konečné fázi klinického zkoušení.

intracelulární receptory - interagují se jako jsou steroidy, hormony štítné žlázy a retinoidy. Tyto přenašeče signálu jsou lipofilní, takže mohou proniknout membránou do buňky. Příkladem jsou estrogenní receptory v buňkách některých tkání, jako je prs nebo děloha. Vyskytují se tam ve formě komplexu s jiným proteinem. Když dojde k interakci receptoru s ženským pohlavním hormonem estrogenem, komplex se rozštěpí. Uvolněný receptor s navázaným estrogenem pak může v buněčném jádře interagovat s aktivátory procesu transkripce genů regulujících růst a dělení buněk. To má velký význam pro vývoj organismu, estrogeny však aktivují i růst buněk některých nádorů prsu. Látky blokující estrogenní receptory (tamoxifen, toremifen) jsou proto používány jako protinádorová léčiva. ► Bílkovinné přenašeče (transportéry). Jsou to bílkoviny s lipofilním povrchem a hydrofilní duti-

nou. Do té mohou uzavřít hydrofilní látky a pak díky svému lipofilnímu povrchu procházet buněčnou membránu. S jejich pomocí se do buněk dostávají např. aminokyseliny nebo nukleotidy, ale i některé signální molekuly jako jsou neurotransmitéry adrenalin (epinefrin) nebo dopamin. Některá látky mohou dutiny přenašečů zablokovat, takže normálně transportovaná látka se do buňky nedostane. Patří mezi ně některá léčiva onemocnění centrálního nervového systému, např. tricyklická antidepresiva, ale i drogy. Jestliže např. přenašeč adrenalinu obsadí amfetamin, pak na povrchu nervových buněk je adrenalinu přebytek, protože nemůže být "stažen" zpět do buňky. Přebytečný adrenalin aktivuje více receptorů než normálně, což zvyšuje adrenergní aktivitu organismu. Jiná léčiva bílkovinné přenašeče neblokují, ale využívají jako "černí pasažéři" k proniknutí do buněk (např. antiparkinsonikum DOPA se tak dostává do buněk místo dopaminu).

Existuje i druhá skupina bílkovinných přenašečů, které naopak transportují některé látky ven z buněk proti koncentračnímu gradientu. Jsou to tzv. ABC přenašeče (ATP-Binding Cassette transporter), které získávají energii pro transport z molekul ATP. Hrají důležitou úlohu při mnohočetné lékové rezistenci (MDR, MultiDrug Resistance), která se může vyvinout u některých nádorů a zapříčiňuje selhání chemoterapie. Patří mezi ně např. MRP1 (Multidrug Resistance Protein 1), BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) nebo P-gp1 (P-glycoprotein 1). Látky blokující aktivitu ABC přenašečů mohou přispět ke zvýšení účinnosti chemoterapie nádorových onemocnění a jsou proto v poslední době intenzivně studovány. Patří mezi ně např. deriváty cyklosporinu, léčiva používaného při transplantacích, nebo kardiovaskulárního léčiva verapamilu. Mechanismus jejich účinku zatím není dostatečně prozkoumán, některé z těchto látek ovlivňují hladinu glutathionu, který se na transportu léčiv z buněk podílí. ► Strukturní bílkoviny jsou bílkoviny vytvářející vnější a vnitřní strukturu buněk a tkání. Patří

mezi ně např. kolagen a keratin. Obvykle nejsou cílem působení léčiv, výjimkou je tubulin Tubulin je bílkovina, která uvnitř buňky polymeruje za vzniku miniaturních trubiček - mikrotubulů. Ty jsou zodpovědné za integritu buněk a mobilitu struktur v buňkách - např. při dělení buněk vytváří "mitotické vřetánko" které se primárně podílí na rozdělení chromosomů a následně na dělení buněk. Po rozdělení buňky mikrotubuly depolymerují. Zablokování polymerace tubulinu (alkaloidy Vinca) nebo depolymerace mikrotubulů (paklitaxel) blokuje dělení buněk. Léky působící na mikrotubuly se proto používají v protinádorové terapii. 9

► Nukleové kyseliny. Jsou důležitou cílovou strukturou zejména pro řadu protinádorových léčiv.

Patří mezi ně řada léčiv, které na nukleové kyseliny působí různými mechanismy. Jsou to: Látky síťující DNA - sesítěním je narušena normální funkce DNA a tedy i dělení buněk. Mezi látky síťující DNA patří řada protinádorových léčiv. Jsou to v prvé řadě bifunkční nebo i vícefunkční alkylační činidla. Působí tak, že alkylují báze DNA, nejčastěji reagují s dusíkem v poloze 7 guaninu. Přitom dochází k propojení řetězců dvojité spirály DNA, a to buď uvnitř jednoho řetězce nukleotidů (intrastrand cross-linking) nebo k propojení bazí mezi dvěma řetězci (interstrand cross-linking). Podobným mechanismem působí platinová cytostatika, která však nepropojují báze DNA kovalentní, ale koordinační vazbou s atomem platiny. U bifunkčních alkylujících látek dochází spíše k propojení bazí komplementárních řetězců, platinové deriváty reagují přednostně se sousedícími guaninovými zbytky jednoho řetězce.

Interkalační látky - "vmezeřují" se mezi páry bazí v řetězcích DNA. Interkalační látky mají planární molekulu, jinak by nemohly proniknout mezi spárované báze a jsou zpravidla poměrně hydrofobní. Mají antimikrobní a protinádorové účinky, což je vysvětlováno tím, že brání působení enzymu topoisomerasy II, enzymu, který řídí prostorové uspořádání DNA. Patří mezi ně např. anthracyklinová protinádorová antibiotika, jako je široce používaný doxorubicin. Mezi interkalační látky lze řadit i planární sloučeniny interagující s „G-kvadruplety“ na konci telomer. Telomery jsou zvláštní struktury na konci chromosomů, které obsahují mnohonásobně se opakující sekvence nukleotidů bohaté na guanin. Při každém buněčném dělení se konce telomer zkracují, zkrácení pod minimální délku dává signál k buněčné smrti – apoptose. Telomery tak působí tak jako určité biologické hodiny. Zárodečné a nádorové buňky obsahují aktivní formu enzymu telomerasy, který koncové struktury telomer prodlužuje, takže ke zkrácení nedochází. V normálních buňkách dospělého organismu je telomerasa inaktivní. Předpokládá se proto, že inhibice telomerasy by mohla zastavit dělení nádorových buněk a inhibitory telomerasy jsou proto intenzivně studovány jako potenciální protinádorové léky. Účinek telomerasy lze však zablokovat i jiným mechanismem. Oligonukleotidové sekvence bohaté na guanin vytváří na konci telomer zvláštní struktury se čtyřmi paralelními řetězci oligonukleotidů, tzv. G-kvadruplety. Tyto struktury je třeba rozrušit, aby telomerasa mohla řetězce prodloužit. Potenciálním protinádorovými léčivy proto mohou být i takové látky, které G-kvadruplety pomáhají vytvářet nebo tyto struktury stabilizují. Podobně jako běžné interkalátory mají tyto látky planární strukturu a blokují činnost topoisomerasy II, planární část jejich molekuly je však rozsáhlejší a s kvadruplexy interagují silněji než se zdvojenými řetězci standardní DNA.

Látky přerušující řetězce DNA se váží do malého žlábku dvojité spirály DNA, kde štěpí řetězec nukleotidů, obvykle za vzniku radikálů. Do této skupiny patří endiiny, zajímavá skupina látek produkovaných mikroorganisny, která má výrazný protinádorový účinek (kalicheamycin, neokarzinostatin). V poslední době jsou zástupci této skupiny se zajímavou strukturou intenzivně studovány, zatím však nejsou používány jako léčiva pro malou účinnost vůči běžným solidním nádorům a nepříznivé vedlejší účinky. Jejich endiinové seskupení cykloaromatizuje na aromatický biradikál, který se stabilizuje odstštěpením dvou vodíků z DNA. Přitom vzniká biradikál v molekule DNA, jehož reakce s kyslíkem vede k rozštěpení nukleotidového řetězce

Komplementární („antisense“) oligonukleotidy jsou řetězce nukleotidů vytvářející sekvenci, která odpovídá sekvenci ve vybraném úseku m-RNA a může se tedy na něj vázat na základě párování bází. Tím je zablokován přepis m-RNA do bílkoviny. Komplementární oligonukleotidy nabízí vysoce specifický účinek v přerušení exprese některých genů (např. "onkogenů") na jejich bílkovinné produkty. Studovány jsou již od 70. let, jejich využití v terapii však naráží na řadu problémů se stabilitou a přípravou, které jsou postupně řešeny. Do klinického zkoušení se dostaly první komplementární oligonukleotidy až v poslední době. Za specifický druh komplementárních oligonukleotidů lze považovat i malé interferující ribonukleové kyseliny, siRNA. Jsou to krátké zdvojené řetězce RNA s 21-25 nukleotidy, které mohou způsobit „postranslační umlčení genů, tj. zablokovat přepis mRNA na odpovídající bílkovinný produkt. Působí tak, že asociují s nukleasovým komplexem nazvaným RISC (RNA-induced silencing complex) a tím jej nasměrují k m-RNA se strukturou komplementární k siRNA. RISC potom část m-RNA komplementární k siRNA rozštěpí. Zbytek molekuly se tak stane vysoce náchylný k další degradaci. Studium siRNA se stalo jedním z nejžhavějších aktuálních témat molekulární biologie, výzkum v této oblasti však zatím je jen na samém počátku. Přesto se už objevují projekty zaměřené na potenciál siRNA v léčbě virových a nádorových onemocnění, genové terapii apod.

Látky inreagující s ribosomální RNA - blokují biosyntézu bílkovin v ribosomech. Ribosomální RNA je cílovou strukturou účinku některých antibiotik, jako je streptomycin, tetracykliny nebo chloramfenikol. Působí tak, že inhibují pohyb ribosomu podél mRNA a inhibují přenos rostoucího polypeptidového řetězce z jednoho zbytku tRNA na druhý.

10

► Lipidy jsou základní složkou buněčných membrán. Membrány jsou tvořeny dvěma vrstvami

fosfolipidů uspořádanými tak, že na vnějším povrchu jsou skupiny hydrofilní, zatímco uvnitř dvojvrstvy jsou hydrofobní skupiny. Dvojvrstva fosfolipidů představuje bariéru mezi vnějším a vnitřním prostředím buňky, která brání průchodu vody, iontů a polárních molekul a umožňuje, aby koncentrace těchto látek uvnitř a vně buněk byla odlišná. Předpokládá se, že mnohá anestetika působí tak, že zvyšují fluiditu buněčných membrán a tím narušují přenos signálů, především nervového vzruchu. Některá antibiotika a antimykotika vytváří spirálové struktury procházející buněčnou membránou. Ty pak fungují jako kanálky pro průchod iontů a polárních molekul membránou. Jiná antibiotika slouží jako přenašeče iontů přes buněčnou membránu. Vankomycin - antibiotikum používané jako poslední šance v těch případech, kdy jiná antibiotika selhávají, atakuje bakteriální přenašeče lipidů (přesněji stavebních bloků buněčných membrán sestávajících z lipidické, disacharidické a peptidické složky). Tím blokuje výstavbu buněčných stěn rezistentních bakterií nezbytnou pro jejich růst a množení. ► Sacharidy (glykokonjugáty) na povrchu buněk. Konjugáty sacharidů s proteiny nebo lipidy

zakotvené v buněčné membráně mají velký význam pro rozpoznávání a komunikaci buněk. Jsou rovněž důležité pro vzájemnou adhezi buněk mezi sebou v tkáních. Na povrchu nádorových buněk jsou některé specifické glykoproteiny, které se nazývají nádorové antigeny. Protilátky proti těmto antigenům mohou být využity k přípravě tzv. cíleně směrovaných protinádorových léčiv. Konjugát léčiva s protilátkou zařídí, aby léčivo bylo přivedeno přímo k nádorové buňce. Protilátky proti nádorovým antigenům mají určitý potenciál i jako protinádorové vakciny, v posledních letech dokonce připravených synteticky. Glykoproteiny povrchu buněčných stěn hrají velkou roli i v mechanismech virové nebo bakteriální infekce. Virus nebo bakterie rozpoznají určitou glykoproteinovou strukturu na povrchu hostitelské buňky, adherují k ní a tím nastartují proces infekce. Zablokování procesu rozpoznání nebo adheze může zabránit infekci. V poslední době se tímto směrem ubírá např. výzkum nových léků proti HIV. Látky, které blokující interakce tzv. selektinů, glykoproteinů buněčných membrán cévní výstelky, s povrchovými sacharidy bílých krvinek, mohou být novými protizánětlivými léky, jiné látky interagující s glykoproteiny zprostředkujícími buněčnou adhezi mohou být použity jako léky proti nadměrné srážlivosti krve nebo i nové antikoncepční přípravky. Interakce glykokonjugátů povrchu buněk hrají velkou roli i při alergických a autoimunitních onemocněních.

Mezi cílovými strukturami mohou být malé, ale pro účinnost léků významné rozdíly. Stejné individuální rozdíly mohou být i mezi enzymy, které ovlivňují farmakokinetické vlastnosti léků, především mechanismy jejich odbourávání a eliminace z organismu (viz dále). Tyto rozdíly jsou způsobeny variabilitou genů, které enzymy, receptory a další buněčné struktury kódují. Individuální rozdíly ve struktuře genů kódujících stejný bílkovinný produkt jsou nazývány genový polymorfismus (pozor – nezaměňovat s polymorfií léčiv). Polymorfismus genů je způsoben zděděnými nebo nově vzniklými mutacemi. V mnoha případech jde o rozdíly způsobené „bodovými mutacemi“, změnami jediné nukleotidu. U bílkoviny kódované takto mutovaným genem se to projeví záměnou jedné aminokyseliny. V takovém případě hovoříme o jednonukleotidovém polymorfismu (Single Nucleotide Polymorphism, zkratka SNP). Změněná bílkovina (enzym, receptor, strukturní bílkovina) přitom může zůstat funkční, ale v její funkci se mohou projevit rozdíly (např. enzymová reakce se zpomalí). To pak je příčinou, proč některá léčiva někdy nepůsobí na některé pacienty tak, jak by měla, nebo jejich podání může dokonce některé pacienty ohrozit na zdraví. Rostoucí znalosti molekulární biologie umožňují definovat a zjišťovat stále více takových individuálních rozdílů genomu pacientů a tato zjištění se začínají využívat v terapii.

Počet již nyní prováděných genetických vyšetření roste, testy umožňující zjišťování SNP budou brzy zavedeny do biochemické diagnostiky. Očekává se, že široké uplatnění genové diagnostiky se stane základem tzv. individualizované terapie, podávání léků "na míru". Ta je v zásadě možná již nyní, do běžné terapeutické praxe by měla být kolem zavedená roku 2020.

Farmakokinetika Mnoho látek, které při zkouškách in vitro mají vynikající účinnost, tj. velmi dobře interagují se svojí cílovou strukturou, se nikdy nestane používaným léčivem. Je to proto, že účinné léčivo musí být pacientovi podáno, dostat se v dostatečné koncentraci do krevního oběhu a doputovat s krví k cílové struktuře, na níž působí.

Zatímco farmakodynamika studuje působení léčiva na organismus, o farmakokinetice lze říci, že se zabývá působením organismu na léčivo, tj. osudem léčiva v organismu od podání k interakci s cílovou strukturou. Farmakokinetika proto studuje u léčiv především tyto 4 faktory: absorpci, distribuci v organismu, metabolismus a vylučování z organismu, exkreci (ADME) 11

Většina léčiv se dostává k místu působení krevním oběhem. Přímé podání léčiva do krevního oběhu formou jednorázové injekce nebo pomalé podání infuzí je však nepohodlné, velmi často vyžaduje asistenci a v případě infuze i pobyt pacienta na lůžku. Přednost je proto dávána neinvazivním způsobům podání, především orálnímu (tablety, kapsle), popř. podání přes sliznice (čípky, nosní kapky, spreje a inhalační roztoky) resp. přes kůži (masti, krémy, tinktury, léčivé náplasti).

Při těchto neinvazivních způsobech podání vystupuje do popředí absorpce léčiva. Většina orálně podaných léčiv je absorbována v zažívacím traktu. Aby se dostala do krevního oběhu musí projít střevní sliznicí. Látky s velmi malou molekulovou hmotností (nanejvýš 200) se mohou přitom „protlačit“ mezi buňkami, většina však musí proniknout do buněk lemujících střevní stěnu a odtud do krevních kapilár. Léčivo přitom musí opakovaně pronikat buněčnými membránami tvořenými fosfolipidickou dvouvrstvou, která brání průchodu polárních látek. Pomineme-li možnost průniku molekuly léčiva přes buněčnou membránu pomocí transportních bílkovin, popř. jiným mechanismem (pinocytosa), pak tato molekula musí mít dobře vyváženou polaritu – musí být natolik polární, aby léčivo bylo dostatečně rozpustné ve vodném prostředí, současně však tak hydrofobní, aby se ve vnitřní lipidické části dvouvrstvy buněčné membrány „rozpouštělo“ a mohlo tak membránou proniknout. Vyváženost hydrofilnosti a hydrofobnosti léčiva je proto klíčovým parametrem ovlivňujícím absorpci. Jako obecné pravidlo přitom platí, že by léčivo nemělo mít molekulovou hmotnost větší než 500 (látky s větší molekulou obsahují zpravidla větší počet polárních skupin), nemělo by mít více než 5 skupin, které jsou při tvorbě vodíkových můstků donory a ne více než 10 skupin, které jsou akceptory. Polární léčiva, která tyto podmínky nesplňují, musí obvykle být podávána injekčně.

Jakmile léčivo pronikne do krevního oběhu, dochází k jeho distribuci v organismu. Distribuce v krevním oběhu následuje prakticky okamžitě poté, co léčivo do něho pronikne. Přesto však léčivo nemusí být v organismu rozloženo rovnoměrně, protože některé orgány jsou krví více zásobeny než jiné. Při distribuci léčiva krevním oběhem hraje významnou roli i skutečnost, že některá léčiva se mohou reversibilně absorbovat na plasmatické bílkoviny krve (albumin) i na různé další látky V krvi se pak ustaví rovnováha mezi absorbovaným a volným léčivem. Účinná koncentrace volného léčiva v krvi je přitom snížena a do tkání a buněk ho může proniknout méně. Póry ve stěnách krevních kapilár proniká léčivo poměrně rychle z krevního oběhu do tkání. Od krevních kapilár ve většině tkání se liší kapiláry zásobující krví mozek. Ty jsou tvořeny velice těsně uspořádanými buňkami, které nemají póry. Navíc jsou lemovány buňkami s povrchem se zvýšenou lipofilitou, takže mnohá polární léčiva do mozkové tkáně nemohou vůbec proniknout. Tato tzv.hematoencefalická bariéra chrání mozkovou tkáň před nežádoucími účinky některých léčiv a dalších látek. Překonat ji mohou jen léčiva využívající transportní proteiny nebo speciálně navržená léčiva, která ve své molekule mají minimum polárních skupin. Naproti tomu jiná přirozená tkáňová bariéra organismu, placentální bariéra oddělující krev matky od krve plodu, musí být poměrně propustná, protože musí zajistit přísun živin k buňkám rostoucího embrya, tak i odvod jejich rozkladných produktů. Léčiva proto touto bariérou pronikají velmi snadno, např. koncentrace barbiturátů v krvi matky a plodu je pak prakticky stejná. Stejně snadno proniká placentální bariérou alkohol, nikotin nebo drogy, které mohou embryo s nevyvinutými detoxifikačními mechanismy značně poškodit. Pokud léčivo nepůsobí na povrchové struktury buněk (receptory apod.), ale až uvnitř buňky, pak o jeho charakteru platí to, co bylo řečeno v souvislosti s absorpcí léčiva. Aby se mohlo přes buněčnou membránu tvořenou fosfolipidickou dvouvrstvu dostat ke svým cílovým strukturám v buňce musí mít vyvážený poměr mezi hydrofilitou a lipofilitou. U některých silně polárních léčiv se k průniku do buněk musí využít určitý trik: Na polární skupiny se naváží lipofilní substituenty. Tím vzniknou "proléčiva" neboli "profarmaka" (prodrug), prekurzory léčiv které již do buňky proniknout mohou. Sama o sobě jsou proléčiva neúčinná, působením buněčných enzymů se z nich však uvnitř buňky uvolní účinné polární léčivo. Příkladem mohou být fosfonátová analoga nukleotidů adefovir a tenofovir, léčiva proti hepatitidě B a AIDS vyvinutá dr. Holým na ÚOChB AV ČR. Ta sama jsou příliš hydrofilní, proto se aplikují jako estery pivaloyloxymethanolu nebo isopropyloxymethanolu, které se v buňkách hydrolyticky rozštěpí na účinné látky.

Léčivo může v organismu podléhat různým metabolickým přeměnám katalyzovaných enzymy. S některými enzymy přichází léčiva do styku již v zažívacím traktu nebo krevním oběhu. Má-li léčivo dospět ke své cílové struktuře, musí jejich působení pokud možná odolávat. Metabolické přeměny v cílových tkáních jsou důležité pro účinnost léčiv, která mají sama o sobě charakter profarmak..

Další metabolické přeměny jsou důležité pro exkreci, odstraňování léčiva z organismu. Léčiva mohou být z organismu vylučována v nezměněné formě, častěji jsou však exkretovány jejich metabolity.. Z enzymů různých tkání hrají v metabolismu léčiv klíčovou roli jaterní enzymy katalyzující reakce zvyšující polaritu molekul léčiva. To exkreci usnadňuje, protože polárnější látky jsou vylučovány snáze než látky méně polární.

Metabolické reakce probíhající v játrech jsou někdy klasifikovány jak reakce fáze I a fáze II. Mezi reakce fáze I patří především oxidativní přeměny léčiv a hydrolýza amidů a esterů, řazeny do této skupiny jsou i redukce nitro a azosloučenin a reduktivní dehalogenace. Oxidativní reakce jsou katalyzovány skupinou jaterních enzymů nazývaných cytochromy P 450. Jsou to červené hemoproteiny obsahující porfyrinový kruh s centrálním atomem železa, které byly pojmenovány podle vlnové délky jejich absorpčního pásu. Je známo nejméně 12 tříd těchto enzymů. Jejich primární úlohou je odstraňovat z organismu 12

škodlivé látky. Substrátem mohou být vedle léčiv i toxické látky obsažené v potravě nebo i chemikálie z životního prostředí. Cytochromy jsou schopné oxidovat methylové skupiny na primární alkoholy, demethylovat aminy, oxidovat aromatické uhlovodíky na fenoly a látky s dvojnými vazbami na epoxidy. Jejich role nemusí však být pouze pozitivní, cytochromy např. oxidují polycyklické aromatické uhlovodíky na látky, které mohou iniciovat nádorové bujení. Velká variabilita cytochromů P450 vede k tomu, že jejich aktivita je vysoce individuální. Metabolismus léčiv se u jednotlivých pacientů často značně liší. U někoho je léčivo oxidováno a dále odbouráváno velmi rychle, takže jeho hladina je nízká a k dosažení potřebného účinku je třeba podat vyšší dávky nebo dokonce jiný lék. U jiného pacienta může být naopak odbourávání značně zpomaleno, hladina léčiva v jeho organismu je proto vysoká a i malá dávka stačí k vysoké účinnosti. Přitom se však zvyšuje i riziko nežádoucích vedlejších účinků. Účinnost různých cytochromů P 450 není dána jen individuálními rozdíly, mohou ji ovlivňovat i některá léčiva. Tak např. fenobarbitáty aktivitu cytochromů zvyšují, zatímco např. léčiva proti žaludečním vředům ji snižují. To pak znamená, že při současném podání více léčiv může být jejich hladina odlišná od toho, když se lék podá samostatně. Takové lékové interakce proto mohou u léků s úzkým terapeutickým intervalem (jako např. warfarin) vést k předávkování. Chemici zabývající se výzkumem léčiv se proto snaží, aby nová léčiva aktivitu cytochromů P 450 výrazněji neovlivňovala. Vedle syntetických léčiv mají na aktivitu cytochromů vliv i látky obsažené v některých léčivých bylinách (např. třezalce) nebo potravinách (např. růžičkové kapustě nebo šťávě grapefruitu).

Reakce fáze II zahrnují enzymově katalyzovaný vznik konjugátů léčiva. Jde např. o vznik látek s navázanou kyselinou glukuronovou, kde se cukerná složka napojuje na hydroxylové nebo aminové skupiny. Některé steroidy vytváří sulfáty, epoxidy nebo halogenderiváty reagují s cysteinovým zbytkem tripeptidu glutathionu za vzniku derivátů merkapturové kyseliny.

Po játrech jsou nejdůležitějším orgánem pro exkreci léčiv ledviny. Léčiva a jejich metabolity však mohou být z organismu vylučovány i přes pokožku nebo sliznice (potem, slinami, slzami), plícemi (dechem), žlučové cesty (stolicí), ale i přes mléčné žlázy. V ledvinách se krev obsahující léčiva a jejich metabolity dostává z přívodní tepny do uzlíků kapilár nazývaných glomeruly, které zapadají do kanálků nazývaných nefrony. Krev je v glomerulách pod tlakem, který působí tak, že je ultrafiltrována. Přitom krvinky, ale i vysokomolekulární složky krve krevními kapilárami neprochází, zatímco nízkomolekulární látky, tedy i běžná léčiva a jejich metabolity ano. Protože jde o proces ultrafiltrace, nezávisí průstup látek stěnou kapilár výrazněji na jejich polárním nebo nepolárním charakteru. Nefron je však obklopen hustou sítí vlásečnic, jejichž stěnami mohou být exkretované látky reabsorbovány a dostávají se do žilní krve. Zde již polarita látek hraje důležitou roli. Přeměny vedoucí k produktům se zvýšenou polaritou proto mají za následek, že k reabsorpci metabolitů léčiva buď nedochází nebo je tato reabsorpce silně potlačena. Přes pokožku může být potem exkretováno až 10-15% léčiva. Plicní exkrece je důležitá pro eliminaci plynů podávaných anestezí, přes plíce jsou exkretovány i některé těkavé metabolity léčiv. Mnoho metabolitů vznikajících v játrech přechází do žlučových cest, odkud se dostávají do zažívacího traktu. Část pak je v tenkém střevě reabsorbována, zbytek přechází do stolice. Stolicí jsou exkretovány i ty podíly léčiva, které zůstaly při perorálním podání neabsorbovány. Možnost exkrece léčiv v mateřském mléce není ani tak významná z hlediska farmakinetiky jako ochrany zdraví kojence, protože vylučovaná léčiva a jejich metabolity mohou na nezralý organismus působit toxicky. Přes mléčné žlázy může být vylučován i alkohol, nikotin a další drogy.

13

FARMAKOCHEMIE 2 Základní (vodítková) struktura léčiva a farmakofor Při návrhu nového léčiva je výchozím bodem látka sloužící jako vodítko (lead compound), sloučenina, o níž víme, že je schopná interakce s cílovou strukturou a že tato interakce vyvolává určitou biologickou odezvu, která nás zajímá. Sloučenina, kterou slouží jako vodítko, nemusí sama mít ani příliš velkou nebo specifickou (tj. bez vedlejších účinků) biologickou odezvu, protože se v terapii nemusí vůbec použít. Jde o pouze látku stojící na startovní čáře vývoje. Může to být látka připravená syntézou nebo izolovaná z různých přírodních zdrojů (rostliny, živočichové, mikroorganismy, v poslední době velmi často i mořská flora a fauna), popř. to může být i již používané léčivo, k němuž má být připraven analog s vyšší účinností, nižšími vedlejšími účinky, jinými výhodnými vlastnostmi nebo jen látka s stejnou účinností, ale zatím patentově nechráněná. Někdy dokonce může být "vodítko" vybráno mezi přirozenými látkami s přesně opačným účinkem, než má mít vyvíjené léčivo - např. při vývoji antagonistů určitého receptoru může být vodítkem struktura příslušného přirozeného agonisty.

Základním předpokladem hledání jak vodítka, tak i dalších účinných látek s výhodnějšími vlastnostmi, je vypracování vhodného screeningového testu. Nejvhodnější a nejrychlejší je screening v případě, že se podaří nalézt a navrhnout test na molekulární úrovni - např. na základě inhibice některého enzymu, který je považován za významný v případě příslušného onemocnění. Pokud je k dispozici izolovaná cílová struktura, lze pomocí některých moderních metod, jako je např. NMR, sledovat přímo i její interakce s molekulou zkoumané látky. V některých případech lze předběžný screening provádět i "in silico", tak, že se interakce látky s cílovou strukturou modelují počítačem. Rychlé jsou testy prováděné na buněčné úrovni - např. zkoušky inhibice růstu nádorových buněk v tkáňové kultuře působením cytostatik nebo působení antibiotik na cílový mikroorganismus. V některých případech však může být nutné provádět zkoušky i na úrovni izolovaného orgánu nebo dokonce in vivo, na pokusných zvířatech. Zkoušky in vivo jsou nezbytné pro testování užšího výběru látek v pokročilejších stadiích vývoje, při screeningu se používají jen výjimečně, když se nepodaří nalézt jiný vhodný test, který by byl rychlejší a méně zatížený statistickými chybami.

Po nalezení vodítka pro další vývoj nastupuje obvykle práce chemika, který připravuje analoga této látky s cílem zlepšit jejich účinnost a/nebo snížit nežádoucí vedlejší účinky a studuje na nich vztahy mezi strukturou a biologickou účinností (Structure-Activity Relationship, SAR). Vyšší účinnost mají zpravidla ty látky, které se mohou lépe vázat na cílovou strukturu díky svému sterickému uspořádání a přítomnosti funkčních skupin, které se účastní interakcí s funkčními skupinami cílové struktury.

Studium SAR umožňuje zjistit, které skupiny jsou nutné k vazebným interakcím léčiva s jeho cílovou strukturu. Přitom se obvykle začíná s přípravou analog modifikováním nebo záměnou funkčních skupin na látce s vodítkovou strukturou. Lze tak zjistit, které funkční skupiny jsou nezbytné pro účinnost (tj. pro interakci s cílovou strukturou). Tento přístup je velmi starý, byl využit již při přípravě aspirinu z kyseliny salicylové. Nevýhodou je, že počet funkčních skupin vodítka je omezený a že u přírodních produktů mohou být analoga jen velmi obtížně dostupná. Jako modifikační reakce se používají běžné reakce, jako je příprava esterů a etherů z alifatických alkoholů a fenolů, alkylace aminů, esterifikace karboxylových kyselin nebo naopak zmýdelnění esterů, redukce dvojných a trojných vazeb, ketonů, esterů, nukleofilní i elektrofilní substituce apod. Někdy je přitom nutné určité funkční skupiny chránit a po provedení modifikace chránící skupiny odštěpit. V případě některých přirozených látek je modifikace existujících funkčních skupin jedinou cestou, jak připravit postupy parciální syntézy vhodná analoga. Jindy lze žádané látky připravovat totální syntézou. V poslední době se při přípravě účinnějších analog začínají využívat i biotransformace - přeměny látek využívající mikroorganismů nebo enzymů (např. penicillin G se připravuje tak, že se do fermentačního média přidává kyselina fenyloctová, zatímco přídavek fenoxyoctové kyseliny vede ke vzniku penicillinu V. Z přirozených penicillinů lze také působením enzymu penicillinacylasy odštěpit karboxylovou skupinu, aniž by byl narušen labilní laktamový kruh a uvolněnou aminoskupinu chemickými postupy acylovat. Připravuje se tak např. ampicillin a další polosyntetické penicilliny.

Studie SAR umožňují zjistit, které funkční skupiny a stereospecifické charakteristiky molekuly (vzájemná poloha a vzdálenosti funkčních skupin) jsou nezbytné pro vazbu látky na cílovou struktury a tedy i účinnost léčiva. Tyto charakteristiky molekuly se nazývají farmakofor.

14

Farmakofor lze odvodit nejen na základě přípravy a studia analog, ale i porovnáním struktury skupiny známých léčiv se stejným mechanismem účinku. Tak např. struktura farmakoforu opiátových analgetik vyplynula z porovnání struktur morfinu, morfinanu a benzomorfonu. Benzomorfany

Morfinany

Morfin a deriváty

HO

HO

HO

FARMAKOFOR

HO

O H

H

N CH3 H

H

N

H3C CH3

H

N

N

HO

MORFIN Slovalgin, Doltard

PENTAZOCIN Fortral

BUTORFANOL Beforal

Porovnání struktury účinných látek a/nebo příprava a studium biologických vlastností analog ukáže, které funkční skupiny jsou nutné pro biologickou aktivitu a jaké musí mít prostorové uspořádání. Důležitý je především charakter funkčních skupin farmakoforu - zda jde o skupiny schopné ionizace (aminodusík, karboxylová skupina apod.), tvorby vodíkových můstků (charakter donoru a/nebo akceptoru - např. hydroxylová skupina může být jak donorem, tak i akceptorem, kyslík karbonylové skupiny je pouze akceptorem vodíku), či hydrofobních skupin. Neméně důležité je rozmístění těchto skupin v prostoru. U opiátových analgetik např. jde o vzdálenost aminodusíku od středu aromatického kruhu a úhly, které svírá spojnice atomu a středu kruhu s osou nebo rovinou aromatického cyklu). H-donor/H-akceptor

Bázická skupina

y

HD/HA Arom.kruh. γ

x

β

y Arom. kruh

x α Bázická skupina

Prostorové rozmístění funkčních skupin důležitých pro biologickou účinnost závisí i na konformaci molekuly. U rigidních molekul není určení aktivní konformace složité. Horší je situace u flexibilních molekul. Údaje o prostorovém uspořádání pro jednotlivé konforméry lze vypočítat, stejně jako jejich energetický obsah. Problémem však je, že konformace látky, která nejlépe odpovídá vazebnému místu cílové struktury, nemusí být nejstabilnější konformací. V některých případech může při hledání aktivní konformace pomoci příprava derivátů, u nichž je konformace fixována a posouzení jejich biologické účinnosti. Příkladem může být studium účinnosti látek I a II odvozených od dopaminu. Ukázalo se, že látka II je účinná, látka I nikoliv: DOPAMIN

HO

BICYKLICKÁ ANALOGA

NH 2

HO

flexibilní konformace (volná rotace kolem vazeb)

STRUKTURA FARMAKOFORU

NH 2

HO

NH 2

NH 2 HO

HO

HO

I.

HO HO

II.

aktivní konformace

fixovaná konformace (volná rotace zablokována)

K definování farmakoforu lze dospět nejen na základě znalosti struktury účinné látky a jejich analog, možný je i opačný způsob. Pokud je známa cílová struktura a prostorové uspořádání její15

ho vazebného místa lze definovat farmakofor jako "negativ" této struktury. Správnost navrženého farmakoforu se pak může ověřit přezkoumáním, zda jej obsahují látky, o nichž je známo, že se mohou vázat v aktivním místě cílové struktury. Předpokládejme, že cílovou strukturou je bílkovina a vazebné místo vytváří karboxylová skupina asparagové kyseliny (karboxylátový aniont), hydroxylová skupina serinu, a aromatický kruh fenylalaninu. Léčiva, která mají interagovat s tímto vazebným místem by měly obsahovat skupiny schopné vytvářet iontovou a vodíkovou vazbu a účastnit se van der Waalsových interakcí s aromatickým jádrem, tj. aminoskupinu, skupinu působící jako donor nebo akceptor vodíku a hydrofobní skupinu (podle G. Patrik, Medicinal Chemistry. Instant Notes. BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford, UK, 2001)

Asp

Ser

FARMAKOFOR

COO O

Báze nebo kladny náboj

Báze nebo kladný náboj

H D onor nebo akceptor Aromatické vodíku centrum

Vazebné místo

⎭

H donor/akceptor

Aromatické centrum

Phe

Koncept farmakoforu prožívá svoji renesanci v poslední době, kdy výsledky rengenografické analýzy řady enzymů, receptorů a dalších cílových struktur resp. dokonce jejich komplexů s léčivy na straně jedné a počítačové modelování na straně druhé umožňují získávat informace o prostorové struktuře farmakoforu a využívat je při navrhování nových léčiv. Prudce se rozvíjející discipliny molekulární biologie, genomika a proteomika, umožňují identifikovat zcela nové cílové struktury, jejichž přirozené ligandy, agonisté nebo antagonisté nemusí být známy a navrhnout farmakofor látek, které jsou potenciálně schopné s těmito strukturami interagovat. Prohledávání databází známých sloučenin pak umožňuje zjistit, které látky obsahují struktury odpovídající navrženému farmakoforu. Využití obecně definovaného farmakoforu přitom může vést k tomu, že se zjistí podobný účinek mezi sloučeninami, které jsou chemicky značně odlišné. Potvrdí-li experiment účinnost těchto látek, mohou se stát vodítkem pro vývoj nových léčiv.

Stereochemické aspekty syntézy léčiv Koncepce farmakoforu ukazuje nejen na nutnost přítomnosti určitých funkčních skupin v molekule léčiva, ale i jejich určitého prostorového uspořádání, tj. správné konfigurace funkčních skupin a správné enantiomerní struktury. Biologická účinnost závisí dokonce na převládající konformaci molekul. Nutnost zaujmout správnou konfiguraci je zřejmá. Je-li prostorová stavba cílové struktury taková, že interakce se může účastnit jen jediný geometrický nebo isomer (např. s estrogenním receptorem může interagovat pouze trans neboli E isomer tamoxifenu), pak druhý geometrický isomer je neúčinný nebo může mít i zcela jiné účinky, popř. dokonce může zvyšovat nežádoucí toxicitu (o cis- neboli Z-isomeru tvrdí některé práce, že právě jeho malá příměs je příčinou vzniku nádorů děložní sliznice při dlouhodobém podávání přípravku). Podobná situace nastává i u optických isomerů: C

D

B

C

D C

A

A

A

B C´ A´

C´ B´

Z-isomer

A´

A´ B´

E-isomer

B A

B

R- enantiomer

C´ B´

C

A´

C´ B´

S- enantiomer

Enantiomer, který má vyšší biologickou účinnost, se někdy nazývá eutomer, méně účinný enantiomer je distomer. Poměr mezi biologickou aktivitou eutomeru a distomeru je označován jako eudismický poměr. 16

Má-li eudismický poměr vysokou hodnotu, pak je účelné se při syntéze léčiva zaměřit na možnosti získání pouze účinnějšího enantiomeru, eutomeru.

Standardní způsoby syntézy obvykle poskytují racemické směsi enantiomerů. Chceme-li z takové směsi získat jediný enantiomer, je třeba racemickou směs rozdělit, provést resoluci. V některých případech může jeden z enantiomerů spontánně vykrystalovat z roztoku racemické směsi. To je však spíše výjimkou. Spíše se využívá převedení racemátu na směs diastereomerních sloučenin. Ty na rozdíl od enantiomerů mají odlišné fyzikálně chemické vlastnosti, čehož lze využít k dělení. Nejjednodušší je krystalizace diastereomerních solí připravených z racemátu a vhodné enantiomerní sloučeniny - pro látky s kyselým charakterem lze např. použít některé chirální přirozené nebo syntetické aminy, z bázických racemátů lze připravovat diasteromerní soli chirálních kyselin jako je kyselina vinná a její O-acyderiváty (nejčastěji kys. dibenzoylvinná), jablečná, mandlová, kafrsulfonová, v poslední době se používá kyselina 1,1´-dinaftyl-2,2´-fosforečná. Pokud racemát neobsahuje kyselé ani bazické skupiny musí být pro dělení modifikován, např. reakcí racemických alkoholů s chloridem kyseliny kafrsulfonové lze připravit diastereomerní estery. Ty se liší svými fyzikálně chemickými vlastnostmi, čehož lze využít k jejich rozdělení. Po rozdělení se navázaná skupina odštěpí.

V případě reakce racemátu s enantiomerně čistým činidlem lze k dělení využít i tzv. kinetickou resoluci, při níž se využívá skutečnosti, že vznikají dva diastereomerní přechodové stavy s odlišnou stabilitou. Při reakci pak rychleji vzniká jeden diastereomerní produkt. K dělení racemátů lze využít i enzymatickou resoluci, při níž se využívá stereospecificity enzymů. Např. Dfenylglycin, výchozí látka pro parciální syntézu ampicillinu se připravuje působením aminopeptidasy na racemický fenylglycinamid. Přitom hydrolyzuje pouze L-enantiomer, takže vznikne směs L-fenylglycinu a D-fenylglycinamidu, který se pak chemicky hydrolyzuje na žádaný produkt.. Podobně lze rozdělit racemické estery pomocí acylas. Ty selektivně rozštěpí pouze jednu enantiomerní formu esteru na alkohol a kyselinu.

Jiné možnosti dělení racemátů představuje chromatografie na chirálních fázích a tvorba inkluzních komplexů. Speciálně připravované chirální fáze jsou drahé a používají se proto spíše v analýze (HPLC na chirálních fázích bývá předepisována v lékopisech). V preparativní chromatografii lze využít některé přirozené chirální polymery (triacetylcelulosa, sesítěný albumin) nebo silikagel impregnovaný vhodnou enantiomerní látkou jako je např. kyselina vinná. Chromatografickými technikami lze rozdělit i racemáty s neutrálními skupinami. Některé chirální fáze obsahují navázané látky s dutinami, do nichž může být uzavřena pouze jedna enantiomerní forma produktu. Příkladem mohou být cyklodextriny navázané na silikagel. Cyklodextriny a další látky vytvářející inkluzní komplexy mohou být využity i k dělení racemátů krystalizací.

Obecnou nevýhodou přípravy enantiomerů rozdělením racemátů je, že se získává pouze poloviční výtěžek účinné enantiomerní formy léčiva. Ztráta poloviny produktu tvořeného nežádoucím enantiomerem přípravu chirálních léčiv resolucí racemátů prodražuje. Dražší je resoluce racemátů i v případech, kdy lze odpadající enantiomer racemizovat a resoluci opakovat nebo převést vhodným postupem na žádaný. Racemizace může být prováděna přes achirální meziprodukt (např. oxidací enantiomerního alkoholu na keton a jeho následnou redukcí na racemický alkohol). Např. výše zmíněný L-fenylglycin lze racemizovat působením kyseliny sírové. Získaný racemát se pak převede na amid, který se znovu dělí pomocí aminopeptidasy). Příkladem převedení odpadního enantiomeru na žádaný je nukleofilní substituce probíhající s Waldenovým zvratem: Nežádoucí R-formu alkoholu se tosyluje a R-tosylát podrobí hydrolýze SN2 mechanismem na S-alkohol.

Ekonomicky výhodnější proto mohou někdy být postupy asymetrické neboli enantioselektivní syntézy, při nichž selektivně vzniká určitý enantiomer chirálního produktu. Přitom musí být při reakci přítomen vhodný chirální element - chirální musí být buď výchozí látka nebo reakční činidlo, popř. se použije chirální katalyzátor. Dobrý postup asymetrické syntézy musí poskytovat žádaný produkt ve vysokém chemickém i optickém výtěžku. Optický výtěžek je vlastně mírou enantioselektivity reakce. Optický výtěžek je někdy nazýván enantiomerní přebytek a označován v reakčních schematech jako e.e. (z anglického enantiomeric excess). Optický výtěžek se zjišťuje jako poměr mezi naměřenou otáčivostí produktu reakce a hodnotou otáčivosti čistého enantiomeru. Jeho hodnota odráží poměr obou enantiomerů v produktu reakce. Např. optický výtěžek 40% znamená, že ve směsi je 40% čistého enantiomeru, zbývajících 60% je racemát nevykazující žádnou optickou aktivitu, tj. směs 30% S- a 30% R- formy. Poměr jednoho enantiomeru ke druhému v produktu reakce pak je 70 : 30. V ideálním případě by e.e. měl být vyšší než 98%, což odpovídá obsahu čistého enantiomeru v produktu nad 99%. V praxi se však bez další purifikace produktu tak vysoké enantioselektivity obvykle nedosahuje.

17

Nejsnáze lze dospět k chirálním produktům, pokud je k dispozici vhodná chirální výchozí látka. Takovou látkou mohou být např. přirozené aminokyseliny nebo cukry. Nevýhodou je, že se přitom někdy syntéza prodlouží o několik reakčních kroků a že musí být vyloučeny operace, při nichž by mohlo během syntézy docházet k racemizaci (zahřívání na vyšší teploty, přítomnost silných kyselin nebo basí apod.).

V případě, že v molekule výchozí látky je již přítomno jedno nebo více chirálních center, pak při reakci, při níž vzniká další chirální centrum, může být preferována určitá konfigurace produktu. Obvykle se s tím setkáváme při parciálních syntézách léčiv vycházejících z přirozených produktů (alkaloidů, steroidů, cukrů apod.). Přítomnost chirálního centra nemusí však vždy vést ke vzniku enantiomerně čistého produktu. Je-li nově vznikající chirální seskupení vzdálené, pak vliv původního centra chirality může být jen velmi malý.

K vnášení chirálního centra do achirálních molekul lze využít pestrou škálu chirálních činidel a pomocných chirálních látek. Je např. výhodné, přináší-li při asymetrické syntéze chirální informaci opticky aktivní katalyzátor, kterého se na rozdíl od chirálního činidla používá zpravidla jen velmi malé množství. Vysoce účinnými chirálními katalyzátory jsou enzymy, které lze

využít k přípravě enantiomerně čistých látek i v průmyslovém měřítku. Příkladem enantioselektivní enzymově katalyzované reakce může být příprava L-asparagové kyseliny, složky umělého sladidla aspartamu, z kyseliny fumarové pomocí enzymu aspartasy. Enzymy přitom nemusí být isolované, podobné reakce jsou někdy katalyzovány imobilizovanými buňkami obsahujícími příslušný enzym.

Kvantitativní vztahy mezi strukturou a biologickou účinností Struktura molekuly léčiva definuje její interakce s ostatními molekulárními strukturami organismu. To znamená, že bezpečnost a účinnost léčiva je funkcí jeho chemické struktury. Studium kvantitativních vztahů mezi strukturou a biologickou účinností látek (Quantitative StructureActivity Relationships, QSAR,) umožňuje zjistit, jak fyzikálně chemické vlastnosti molekul ovlivňují biologickou účinnost látek. Cílem tohoto studia je vypracovat algoritmy, které by byly použitelné pro předpověď biologické účinnosti různých sloučenin a využít je k návrhu látek s optimálními terapeutickými vlastnostmi. Tyto terapeutické vlastnosti jsou určovány jak schopností látky interagovat s cílovou strukturou, tak i k této cílové struktuře Klasický přístup ke studiu QSAR vychází z přípravy řady látek se společným základním skeletem a rozdílnými substituenty a studia jejich účinnosti. Ze zjištěných vztahů se vyvodí, jaké fyzikálně chemické charakteristiky skupiny jsou významné z hlediska žádaného účinku. To pak umožňuje navrhnout nové, ještě účinnější látky.

Studium QSAR ukázalo, že pro účinnost látky má největší význam hydrofobita (neboli jinými slovy lipofilita), elektronový charakter a sterické parametry molekuly a/nebo jejích funkčních skupin. Moderní léčiva mají ovšem velmi složitou strukturu, což predikci vlastností pomocí QSAR znesnadňuje. Jednotlivé funkční skupiny molekuly se vzájemně ovlivňují, změna charakteru jedné skupiny má dopad na vlastnosti jiných funkčních skupin. Situaci navíc komplikuje to, že účinnost sama není jediným faktorem ovlivňujícím úspěch léčiva, mnoho velmi účinných látek selhalo při zkouškách in vivo pro omezenou rozpustnost nebo stabilitu, popř. vysokou nežádoucí toxicitu. Navrhování léčiv pomocí moderních počítačů, CADD (Computer-Assisted Drug Design), proto stále ještě limituje složitost příslušných korelačních algoritmů. Vztahy mezi strukturou látky a jejími vlastnostmi zajímají chemiky již od 19. století. V r. 1863 zjistil A.F.A. Cros, že toxicita vyšších alkoholů roste s tím, jak se snižuje jejich rozpustnost ve vodě. Závislost toxicity organických látek na jejich hydrofobním charakteru byla obecněji potvrzena v 90. letech Meyerem a Overtonem.

Význam hydrofobity pro biologickou účinnost byl později potvrzen dalšími studiem. Jako míra hydrofobity se při studiu kvantitativních vztahů mezi strukturou a účinností využívá logaritmus rozdělovacího koeficientu látky mezi n-oktanolem a vodou, logP. Pro většinu léčiv platí, že čím větší je koncentrace látky v n-oktanolové fázi, tj. čím větší je hodnota P resp. logP, tím větší je aktivita. Je to dáno tím, že vyšší hydrofobita znamená, že molekuly léčiva snáze pronikají přes buněčné membrány ke svým cílovým strukturám. Neplatí to však neomezeně. Z experimentů s přípravou a studiem aktivity řady analog výchozí vodítkové struktury vyplývá, že po příliš velkém zvýšení hydrofobity (např. zavedením velkých objemných alifatických substituentů) se účinnost může naopak snížit.

18

Vztah mezi biologickou účinností a hydrofobitou látky je dán rovnicí: log účinnosti = – k1 . (log P)2 + k2 . log P + k3, kde k1, k2 a k3 jsou konstanty. Je-li celková hydrofobita molekuly relativně malá, pak účinnost určuje především logP. U vysoce hydrofobních látek určuje naopak výslednou hodnotu spíše (log P)2 , který je v rovnici vystupuje se záporným znaménkem, takže účinnost klesá. Vztah mezi účinností a hydrofobitou molekuly se uplatňuje především in vivo, při sledování účinku látky na živé organismy, kdy molekula látky musí ke svému místu působení pronikat přes buněčné membrány. Při testech in vitro se látka může dostávat do interakce s cílovou strukturou přímo, takže tento vztah platit nemusí.

Rozdělovací koeficient popisuje celkovou hydrofobitu molekuly. Tuto celkovou hydrofobitu molekuly je možné vyjádřit jako určitý součet příspěvků jednotlivých části molekuly. Měřítkem hydrofobity jednotlivých substituentů je konstanta πx, kterou lze experimentálně stanovit porovnáním logP standardní sloučeniny s derivátem, u něhož je vodík nahrazen příslušným substituentem (x): , kde PH je rozdělovací koeficient standardní sloučeniny a Px rozdělovací koeficient derivátu s příslušným substituentem. Je-li hodnota konstanty πx kladná, pak substituent je hydrofobnější než vodík, je-li záporná, je tomu naopak.

Znalost konstant πx pro různé substituenty umožňuje získat údaj informaci o celkové hydrofobitě látky výpočtem. Příkladem zjednodušeného výpočtu může být určení celkové hydrofobity látky podle vzorce: log P = log PH + Σ πx Je-li např. log PH benzenu 2,13, a π konstanty pro brom a methoxyskupinu 0,86 resp. –0,02, pak lze snadno vypočítat logaritmus rozdělovací konstanty pro p-bromanisol, který činí 2,97. Situace je však složitější. V úvahu je třeba brát sterické uspořádání substituentů a zejména pak kolísání hodnot π konstant pro různé systémy. Uvedené π konstanty např. platí pro deriváty benzenu, ale již ne zcela pro různé heteroaromatické systémy. V ideálním případě by měly být používány π konstanty platné pro určitý systém. To však není v praxi vždy možné, takže je třeba počítat s určitými nepřesnostmi předpovědi.

Biologická účinnost však nezávisí pouze na schopnosti látek pronikat přes buněčné membrány, ale i na schopnosti interagovat s cílovou strukturou. Při těchto interakcích se uplatňují i elektronické vlivy substituentů. Mírou elektronických vlivů substituentů na vlastnosti látky s aromatickým charakterem jsou Hammettovy konstanty σ, které odvozené na základě porovnání disociačních konstant nesubstituované kyseliny benzoové a jejich substituovaných derivátů. Hammettovy konstanty se běžně uplatňují v různých korelačních vztazích v organické chemii, mají však vztah i k biologické aktivitě látky. Tak např. minimální inhibiční koncentraci C různých aromatických sloučenin vůči bakteriím Escherichia coli lze vypočítat ze vztahu: log ⎛⎜

1⎞ ⎟ = 1,05 σ – 1,28 ⎝C ⎠

Ze vztahu lze např. vyvodit, že deriváty se substituenty s elektronovým deficitem budou růst bakterií inhibovat více než látky se substituenty s vlastnostmi elektron-donorů.

Vedle hydrofobity a elektronické struktury ovlivňují biologickou aktivitu i sterické faktory. Objemné substituenty mohou snižovat biologickou účinnost tím, že brání molekule léčiva aby správně „zapadla“ do vazebného místa své cílové struktury. V jiných případech však přítomnost objemných substituentů může fixovat právě tu konformaci, která je pro interakci s cílovou strukturou nezbytná. K vyjádření sterických vlivů se používá několik různých parametrů, nejčastěji Taftovy sterické faktory ES. Ty jsou odvozeny ze vztahu mezi objemem substituentu v řadě příbuzných sloučenin a rychlostí určité základní reakce. Jiným parametrem, který vyjadřuje míru sterického vlivu, je molekulová refraktivita, která se vypočte z indexu lomu, hustoty a molekulové hmotnosti. Další mírou sterického vlivu mohou být Verloopovy sterické parametry, které lze zjistit pomocí výpočtu z údajů o vazebných úhlech, délce vazeb, van der Waalsových poloměrech a předpokládané konformaci substituentu.

Vztahem, který při předpovědi biologické účinnosti bere v úvahu jak hydrofobitu látky, tak i její elektronický charakter a prostorovou strukturu je Hantschova rovnice, základní rovnice QSAR: log ⎛⎜ 1 ⎞⎟ = – k1 (logP)2 + k2logP + k3π + k4- + k5ES + k6. ⎝C ⎠

C je koncentrace látky potřebná k tomu, aby se projevil určitý účinek (např. byl z 50% inhibován určitý enzym). Čím je látka účinnější, tím je pro dosažení příslušného účinku zapotřebí menší koncentrace látky a hodnota logaritmu 1/C je tedy vyšší. 19

Konstanty k1 – k6 se odvozují z údajů o aktivitě známých látek. Na výběru těchto látek pak závisí správnost předpovědi. Výběr usnadňuje pomůcka sestavená Craigem. Ten vynesl do grafu hodnoty σ a π pro různé substituenty. Osy x a y dělí substituenty podle hodnot σ a π do 4 kvadrantů (+σ+π, +σ–π, –σ+π, –σ–π). Připraví-li se látky se substituenty z jediného kvadrantu (např. Cl, Br, I, CF3 a NO2, všechny s hodnotami +σ+π), bude pravděpodobně předpověď dosti špatná. Ke zjištění konstant Hantschovy rovnice by proto měly být použity látky pokud možná se substituenty, jejichž hodnoty patří do každého ze čtyř kvadrantů, např. CF3 (+σ+π), Et (–σ+π), CN (–σ+π) a OH (–σ–π).

Korelace mezi strukturou a aktivitou byly dále zlepšovány rozšířením Hantschovy rovnice o další fyzikálně chemické parametry. Podstatné zlepšení korelací přineslo trojrozměrné počítačové modelování interakcí léčiva s cílovou strukturou umožněné výkonnými počítači a sofistikovaným software. Návrhy nových léčiv „in silico“ stále ještě nemohou nahradit experimentátory. I ty nejlepší modely zatím často poskytují zkreslené výsledky. V literatuře lze nalézt řadu příkladů léčiv, kdy predikce účinnosti pomocí výpočtů byla úspěšná, ale i případy, kdy se naopak ukázalo, že léčiva interagují se svojí cílovou strukturou jinak, než bylo vypočteno. Výkonné počítače umožňují provádět výpočty interakcí protein-ligand ab initio, ani v tomto případě však nejsou zatím výsledky dostatečně spolehlivé. Je to proto, že naše znalosti o vztazích různých parametrů a strukturou látky jsou stále ještě jen omezené. Situace se však rychle zlepšuje. Nejlepší výsledky počítačového modelování lze získat v případě, že je možné se opřít o znalost detailního prostorového uspořádání cílové struktury (enzymu, receptoru apod.). Do r. 2000 byly známy detailní prostorové struktury 460 enzymů, na konci roku 2003 to bylo už 1.900 struktur. Krystalografická studia usnadňují nové techniky přípravy krystalických bílkovin. Ještě lepší výsledky se získají v případě, že z rentgenostrukturních nebo NMR měření jsou k dispozici informace o detailní struktuře komplexu cílové struktury s určitým léčivem. Těchto případů je zatím jen málo, ale jejich počet rychle roste.

Kombinatoriální syntéza a vysokokapacitní screening Počítačové modelování umožňuje redukovat požadavky na syntézu sérií příbuzných látek. Přesto se experimentální farmakochemie neobrací k přípravě a testování rozsáhlých souborů látek zády, hledá však možnosti jak si tyto činnosti ulehčit a zrychlit. Mezi nástroje, které to umožňují patří zejména techniky kombinatoriální syntézy a vysokokapacitního screeningu (high-throughput screening). Ještě na počátku v 90. let zajímala kombinatoriální syntéza jen pár chemiků a je proto překvapivé, jak rychle se vyvinula v široce používanou rutinní metodu, kterou dnes žádná významná farmaceutická firma vyvíjející nová léčiva nemůže ignorovat. V r. 1992 byla kombinatoriální syntéza využita k přípravě pouhých 3 „knihoven“ nových látek, z čehož jen u 1 byla zjištěna terapeutická účinnost. V r. 1999 bylo takových knihoven látek připraveno již 292 a terapeutická účinnost byla zjištěna u 85 z nich. Na konci 90. let kromě toho pronikla metodologie kombinatoriální syntézy i do dalších oblastí a byla využita i při hledání nových materiálů pro mikroelektroniku, agrochemikálií, konzervačních látek, aditiv a dokonce i nových katalyzátorů.

Kombinatoriální syntéza se vyvinula ze syntézy v pevné fázi. Tato technika usnadňuje izolaci produktů a umožňuje automatizovat pracovní postupy. Syntéza v pevné fázi je založena na tom, že se výchozí látka naváže na inertní pevný nosič. Tím je obvykle vhodný polymerní materiál, často ve formě malých kuliček, nosičem však může být i silikagel, porézní sklo apod. Nosič však nemusí být jen pevný, podobně se mohou použít i rozpustné polymery uzavřené v komůrce se semipermeabilní membránou. Tou mohou procházet nízkomolekulární reagenty, ne však polymerní nosič s navázanými meziprodukty a produkty. Nutnost použití membrán použití rozpustných polymerních nosičů komplikuje, jinak je však výhodou hladší průběh reakcí v homogenním prostředí (eliminace difuzních jevů)

Některé typy nosičů již samy obsahují funkční skupiny vhodné pro navázání výchozí látky, např. hydroxyl, karboxyl nebo aminoskupinu. Jiné nosiče je třeba pro vazbu výchozí látky upravit zavedením vhodných „linkerů“, tj. substituentů s koncovými reaktivními skupinami. Linker musí umožnit snadné navázání výchozí látky i snadné odštěpení konečného produktu. Takovým linkerem je např. chlormethylskupina, chlormethylovaný řídce síťovaný kopolymer styrenu s divinylbenzenem se někdy nazývá Merrifieldova pryskyřice (podle průkopníka syntézy peptidů v pevné fázi, který tento nosič poprvé připravil a použil). Někdy je výhodné, jestliže reaktivní funkční skupina je od polymerního skeletu oddálena delším řetězcem, „spacerem“, protože reakci navázané látky pak nebrzdí sterické vlivy.

Na nosič s navázanou výchozí látkou se pak působí roztokem vhodně zvoleného činidla. To se obvykle použije ve velkém přebytku, aby reakce proběhla pokud možná kvantitativně. Vazba na 20

nerozpustný nosič umožňuje, aby produkt byl snadno oddělen od přebytečného činidla pouhou filtrací a promytím. Produkt může být využit v dalším stupni k jiné reakci. Nakonec se konečný produkt od nosiče vhodným postupem (hydrolýza, hydrogenolýza apod.) odštěpí. funkcioX

vychozí

+

látka

nalizace

polymerní nosič

reaktanty

linker

syntéza

odštěpení nosiče

produkt

Syntéza v pevné fázi se např. využívá při přípravě peptidů. Na nosič, kterým jsou kuličky řídce sesítěného polystyrenu aktivované chlormethylací se naváže první aminokyselina. Její karboxylová skupina pak může být aktivována pro reakci s aminoskupinou druhé aminokyseliny. Přitom vznikne navázaný dipeptid, který může být opakovaně podroben reakci se sérií dalších aminokyselin, až se získá navázaný žádaný oligopeptid, který se nakonec od nosiče oddělí. Syntézu je možné automatizovat, automatické syntezátory peptidů se využívají jak ve výzkumu, tak i při výrobě. Podobné automaty slouží i k přípravě oligonukleotidů používaných pro genové manipulace.

Využití pevných nosičů umožňuje provádění paralelních syntéz, tj. provádět současně stejnou reakci v různých reakčních nádobkách, ale s použitím různých reaktant a činidel. Nosič v každé reakční nádobce přitom obsahuje jinou navázanou látku, na níž se může působit stejnými nebo různými činidly. Nakonec se získá v sérii reakčních nádobek série látek, v každé reakční nádobce jedna individuální sloučenina. Paralelní syntéza může urychlit přípravu série různých analog účinné látky s rozdílnými substituenty, např. sérií etherů, esterů, aminů, amidů apod. Provádění paralelních syntéz usnadňují různé laboratorní automaty a syntezátory

Od paralelní syntézy vede přímá cesta ke kombinatoriální syntéze. V tomto případě reakční nádobky neobsahují individuální látky, ale směsi různých produktů navázaných na nosiči, tzv. knihovny sloučenin. Množství látek tvořících „knihovnu“ může být značné, běžné jsou knihovny s desetitisíci látkami. V extrémním případě může každá z kuliček nosiče obsahovat jednu navázanou individuální sloučeninu („one-bead-one compound“). Při přípravě takových kombinatoriálních knihoven se využívá metoda „smíchej a rozděl“ („mix and split method“), kterou lze ilustrovat např. na přípravě knihovny tripeptidů tvořených třemi aminokyselinami. Nejprve se na nosič s linkerem naváže ve třech nádobkách každá ze tří aminokyselin. Získané produkty se smísí a směs se rozdělí do tří nádobek. Do každé nádobky se přidá jiná aminokyselina, takže v každé nádobce vznikne směs tří dipeptidů se stejnou koncovou skupinou, celkem tedy 32, tj. 9 dipeptidů. Postup se pak opakuje, po 3. kroku kombinatoriální syntézy se již získá 33, tj. 27 různých tripeptidů:

1. krok 3 produkty

2. krok

6 dipeptidů

Alanin A

Glycin G

Valin V

smísení, rozdělení směsi do 3 reakčních nádobek Valin

Alanin

Glycin

AA

GG

VV

GA

AG

AV

VA

VG

GV

smísení, rozdělení směsi do 3 reakčních nádobek

21

Alanin

3. krok AAA GAA VAA

GGG AGG VGG

GGA AGA VGA

celkem 27 tripeptidů

Valin

Glycin

VVA AVA GVA

AAG GAG VAG VVG AVG GVG

AAV GAV VAV

VVV AVV GVV

GGV AGV VGV

Kdyby se místo 3 různých aminokyselin použilo všech 20 esenciálních aminokyselin, pak by počet připravených tripeptidů činil již 203, tj. 8.000.

Postupy kombinatoriální syntézy nejsou omezeny jen na chemii peptidů, podobným způsobem byly připraveny rozsáhlé knihovny nízkomolekulárních sloučenin, např. N-alkyl-N-acylaminokyseliny, substituované s-triaziny, různé β-laktamy, deriváty isochinolinu, benzimidazolu apod. Tak např. podle následujících schemat byla v USA připravena rozsáhlá knihovna analog protinádorově účinného purinového derivátu objeveného českými vědci a nazvaného olomoucin:

1.

Cl

NHR 1 N

N

H N

N H

O

1

R NH 2

N H

N

N H

O

N

H N

2.

R2OH

N H

O

N

N

R NH 2

N R

N H

N

N R2

HN N

2

R OH

N

N

1

N

N H H N

HN 1

N

N

H N

H N

HN

F

N

N

H N

NHR 1

1

N H

R

N H

N

N H

N

N

R2

3.

NHR 1

Cl N

N F

N

R1NH 2 F

N

N

NHR 1

N N

2

R NH 2 R

N O

O

N

N 2

N H

N

N O

U připravených látek pak byly zjišťovány inhibiční účinky na cyklin-dependentní kinasu 2, enzym, který hraje důležitou roli v mechanismu dělení buněk. Mezi připravenými deriváty byla látka nazvaná purvulanol B, která byla asi tisíckrát účinnějším inhibitorem cdk2 než výchozí vodítková sloučenina olomoucin COOH

N

N HO

N H

N

N N

Cl

HN

HN

N CH 3

Olomoucin

HO

N H

N

N

Purvulanol B

Připravovat rozsáhlé knihovny sloučenin postupy kombinatoriální syntézy má význam, jen když je možné tyto látky rychle otestovat a vybrat nejlepší kandidáty pro další vývoj. Na kombinatoriální syntézu proto musí navazovat pečlivě navržené postupy vysokokapacitního screeningu. Screeningové systémy bývají propracované tak, aby byly pokud možná eliminovány falešně pozitivní výsledky. V ideálním případě se screening provádí přímo s látkami ještě navázanými na nosiči. Často je screening založen na vazebných interakcích navázaných látek s cílovým enzymem, receptorem apod. („binding assay“). Cílová struktura je 22

přitom opatřena „značkou“, navázanou barevnou nebo fluoreskující látkou, radioisotopem nebo enzymem, který reaguje s chromogenním substrátem (peroxidasa, alkalická fosfatasa) za vzniku barevného produktu. Po inkubaci kuliček nosiče s označeným cílovým biopolymerem a promytí se pak kontroluje zbarvení kuliček nosiče. Kuličky poskytující pozitivní reakci se pak oddělí. Vedle vazebných interakcí mohou být při screeningu knihoven látek na navázaném nosiči využity funkční vlastnosti navázaných látek, např. schopnost inhibovat určitý enzym. Jiné postupy screeningu se provádí v roztoku po odštěpení produktů od nosiče. Přitom se může např. použít destička se souborem mikrofiltrů. Do každého mikrofiltru se vloží 100-500 kuliček nosiče, produkt se přídavkem vhodného činidla odštěpí a odfiltruje od nosiče do mikrotitrační destičky s 96 jamkami. Provede se inkubace a otestuje se biologická aktivita roztoků v jamkách. Kuličky s produktem, který poskytl pozitivní reakci, se pak rozdělí a zkouší se v podstatě individuálně (1 kulička na 1 jamku). Nakonec se produkty identifikují. V některých případech se screening v pevné fázi a roztoku kombinuje. Základním předpokladem úspěchu screeningu přitom je, aby zkouška byla dostatečně citlivá. Na jedné standardní kuličce o průměru 0,1 mm může být navázáno asi 100 pikomol produktu. Objem roztoku v jamce je asi 0,1 ml, takže výsledná koncentrace látky je přibližně 1 μmol/l. Koncentraci produktu lze zvýšit snížením objemu roztoku v jamce (např. použitím mikrotitračních destiček s 384 jamkami) nebo zvýšením množství navázaného produktu (zvětšení kuličky nosiče a/nebo jeho vazebné kapacity může umožnit až 100násobně zvýšit množství produktu). Moderní metody umožňují, aby jeden pracovník během jednoho dne otestoval 107 kuliček nosiče, což je kapacita plně postačující pro knihovnu s <3.106 permutacemi, tedy např. knihovnu pentapeptidů s 20 aminokyselinami. V případě heptapeptidů s 20 aminokyselinami (s 207, tj. 1,28.109 permutacemi) by však ani takto rychlý screening nemusel poskytnout požadovaný výsledek.

Po provedeném screeningu kombinatoriálních knihoven je třeba pozitivně reagující produkty identifikovat. Prvním možnosti identifikace představuje analýza individuálního produktu na jednotlivé kuličce nosiče, druhou možností analýza směsného vzorku založená na statistickém hodnocení pravděpodobnosti výskytu produktu s pozitivními výsledky testování účinnosti. Používané analytické techniky musí být dostatečně citlivé a přitom specifické, aby umožnily určovat látky vyskytující se v mikromolárních koncentracích. K analýze a identifikaci se využívá zejména hmotová spektrometrie, infračervená spektrometrie, kapilární elektroforéza nebo HPLC (často kombinovaná s hmotovou spektrometrií). K charakterizaci individuálních produktů z knihoven peptidů nebo oligonukleotidů lze využít techniky mikrosekvenace.

Úspěch kombinatoriální syntézy závisí na pečlivém naplánování komplexních experimentů. To se neobejde bez multidisciplinárního přístupu kombinujícího znalosti organické chemie, biochemie, biologie, analytiky, matematické statistiky a bioinformatiky.

Polymorfie Postupy výroby léčivých látek musí být natolik propracované a robustní, aby poskytovaly produkty s uniformním chemickým složením i chemickými i fyzikálními vlastnostmi. Jen tak lze zajistit vysokou kvalitu finálních produktů, kterými jsou lékové formy. Vedle chemických charakteristik (čistota) se v poslední době dostává do popředí zájmu institucí povolující výrobu léčiv otázka různých krystalových forem, tzv. polymorfie léčiv.

Polymorfie je schopnost látky vystupovat ve více než jedné krystalové formě, tj. schopnost molekul s určitou strukturou zaujímat různá prostorová uspořádání a přitom vytvářet různé typy krystalové mřížky. Pseudopolymorfie (solvatomorfie) je pak schopnost tvořit různé krystalické solváty, z nichž jsou nejdůležitější hydráty se zabudovanou molekulou vody. Solváty resp. hydráty resp. mohou mít stechiometrické nebo nestechiometrické složení, nestechiometrické solváty jsou nazývány klathráty. U stechiometrických solvátů jsou molekuly rozpouštědla integrální součástí krystalové mřížky a při jejich odstranění sušením dochází ke změně krystalové formy. U nestechiometrických solvátů jsou molekuly rozpouštědla vázány v krystalové mřížce volněji, takže při jejich odstranění sušením se mřížka nezhroutí, ale místa po molekulách rozpouštědla zůstanou volná. Voda zabudovaná do krystalové mřížky nemůže proniknout k hydrolyzovatelným strukturním skupinám látky, takže definované stechiometrické hydráty mohou dokonce být chemicky stálejší než látky bezvodé.

Pro farmaceutické chemiky je polymorfie velmi důležitá, zejména pokud je léčivá látka podávána v pevném stavu ve formě tablet nebo kapslí. Polymorfie hraje důležitou roli i u různých látek určených pro technické použití, např. jsou známy a různě využívány různé polymorfní formy oxidu křemičitého, titaničitého nebo zirkoničitého. Ve farmacii vzrostl její význam zejména v posledních 10 letech a v současné době si žádná farmaceutická firma nedovolí otázky polymorfie léčiv ignorovat. Patentovou ochranu

23

různých polymorfních nebo pseudopolymorfních forem látky, jakož i různých typů solí léčivé látky s farmaceuticky akceptovatelnými kyselinami nebo bázemi využívají farmaceutické firmy k prodloužení patentové ochrany svých výrobků nebo naopak k překonání patentových bariér konkurence. Situace je přitom složitá: Tak např. u acetylsalicylové kyseliny, aspirinu, byly popsány 4 polymorfní formy, u atorvastatinu však už 26 polymorfů a u sulfathiazolu dokonce 120 polymorfů a pseudopolymorfů.

Různé polymorfní nebo pseudopolymorfní formy mohou mít rozdílnou rozpustnost (s níž u léčiv souvisí biologická dostupnost, popř. i toxicita), bod tání a někdy i zbarvení, chemickou a fyzikální stabilitu, hygroskopičnost, hustotu, sypnou hmotnost a zpracovatelnost (filtrovatelnost, stlačitelnost směsí, mísitelnost s pomocnými látkami, soudržnost částic, smáčivost, tokové vlastnosti pevných směsí apod.). Největší rozdíly ve vlastnostech mají obvykle krystalické a amorfní formy látek. Použije-li se např. k přípravě tablet méně stálá polymorfní forma, pak během skladování tablet může dojít ke změně na stálejší formu a to se může projevit rozpadáním tablet.

Látka krystalickém stavu má atomy nebo molekuly uspořádány v definované krystalové mřížce. Amorfní nebo nekrystalické pevné látky mají naopak v pevných částicích molekuly uspořádané nepravidelně, jejich vzájemné vzdálenosti a úhly kolísají v širokém rozmezí.. Krystalické látky mají rentgenová difrakční spektra se zřetelně odlišenými pásy nebo obrazci a v poli polarizačního mikroskopu často vykazují dvojlom. Rentgenová difrakční spektra amorfních látek nemívají charakter diskrétních, ale spíše difuzních obrazců. Různé polymorfní nebo pseudopolymorfních formy látky lze mnohdy rozpoznat pod mikroskopem podle různého tvaru krystalků, „krystalového habitu“ (jehlice, lístky, tyčinky apod.), který je určován vlastnostmi krystalové mřížky. Na různých krystalových mřížkách dochází k různému ohybu rentgenových paprsků. Rengenová difrakční spektra proto jsou jednoznačnou charakteristikou polymorfních forem. Polymorfní a pseudopolymorfní formy látky mají rovněž svá charakteristická 13C NMR spektra v pevné fázi.

Krystalické formy látek se získávají při chladnutí par sublimujících látek, ochlazování roztoků nebo tavenin, odpařování roztoků a srážení, přičemž molekuly musí mít dostatek času na to, aby se mohly uspořádat do krystalové mřížky. Při použití různých způsobů a postupů krystalizace látky mohou vznikat různé polymorfní a pseudopolymorfní formy.Amorfní formy naopak vznikají při rychlém srážení nebo rychlém ochlazení taveniny, rychlém odstranění rozpouštědla, popř. po zmražení vodných roztoků a odstranění ledu mrazovou sublimací (lyofilizací). Lyofilizace je standardně využívána při přípravě tzv. suchých injekcí léčiv, které se před aplikací „rekonstituují“ přídavkem vody. Existují však i techniky lyofilizace, které umožňují vznik produktů s krystalickým charakterem.

Ještě donedávna mělo nalézání různých krystalových forem spíše náhodný charakter, systematický přístup se prosazuje až v posledních letech. Screening polymorfních forem by měl být zahájen v časných stadiích práce na projektu vývoje léčiva, protože znalost těchto forem je důležitým vodítkem pro chemiky zabývající se vývojem procesů přípravy účinné látky i léčivých přípravků. Cílem screeningu je nalezení co největšího počtu polyformních forem látky, které jsou za běžných teplot okolí stálé. Aby bylo možné polymorfy řádně studovat, musí současně se screeningem probíhat vývoj metod analytického hodnocení (analytika pevné fáze). Vedle studia různých polymorfních forem je třeba věnovat pozornost i otázkám souvisejícím s velikostí částic, protože i tento parametr významně ovlivňuje farmaceutické charakteristiky finálních přípravků. Vznik polymorfních forem závisí mnohdy na čistotě látky, ke screeningu by proto měl být použit co nejčistší produkt. Jinak by mohlo být později nutné vliv přítomnosti nečistot ověřit a v krajním případě screening zopakovat s čistším léčivem.

Hledání stabilních pevných forem látky může být zahájeno studiem stárnutí suspenzí. Přitom se připraví suspenze dostupné pevné látky v různých čistých rozpouštědlech nebo rozpouštědlech obsahujících definované množství vody a nechá se stárnout za definovaných podmínek skladování po dobu jednoho měsíce nebo i déle. Pokud látka nevytváří solvát, po dostatečně dlouhé době by měla přejít na stabilní formu. Tvorbu stabilní formy lze urychlit aplikací ultrazvuku, cykly zahřátí a ochlazení (za předpokladu, že nedojde k úplnému rozpuštění), popř. použitím oček podobné látky. Zjistí-li se, že vznikla nová krystalová forma, studium stárnutí by se mělo opakovat se suspenzí této formy.

Jiný způsob hledání stabilních polymorfních forem nabízí studium tepelného působení. Pokud se látka při zahřívání nerozkládá, zahřeje se až roztaje a pak se nechá chladnout rozdílnou rychlostí (rychle, středně, pomalu) a sleduje se vznik krystalových forem. Jakmile vznikne pevný produkt, změří se jeho rentgenové spektrum, aby se zjistilo, zda jeho krystalová forma je odlišná od původní. Při rychlém zchlazení vznikají spíše metastabilní formy, při dostatečně pomalém formy termodynamicky stálé. Při jiném metodickém postupu se látka zahřeje těsně pod bod tání, nechá

24

určitou dobu při této teplotě a zjišťuje se, zda dochází k přeměnám krystalové mřížky. Někdy se látka nechá vypařit a zchladí se její páry. U sublimátu se pak zjišťuje, zda jeho forma se liší od původní látky.

Nejběžnějším postupem screeningu polymorfních forem je studium krystalizace látky z roztoku. Zkouší se přitom rozpouštědla s různou polaritou, směsi rozpouštědel o různém složení a různé parametry, jako je teplota, koncentrace roztoku, rychlost ochlazování, obsah vody, vliv míchání, pH a přítomnosti iontů. Podchlazené roztoky se přitom mohou očkovat krystalky polymorfních forem získaných stárnutím suspenzí nebo působením tepla. Ke studiu vzniku a přeměn polymorfů jsou vyvíjeny techniky (skenovací transitometrie), kdy se v krystalizačním systému kontinuálně měří objemové a entalpické změny provázející fázové přechody.

Různé hydráty (resp. solváty) se připravují buď krystalizací z roztoků, obvykle obsahujících definované množství vody jako kosolventu, nebo působením vlhkosti. Vliv vlhkosti se studuje pomocí mikrovah v komůrce s definovanou vlhkostí prostředí. Přitom se zjišťuje, zda látka vodu absorbuje nebo naopak uvolňuje. Pokud se voda absorbuje, je třeba zjistit, zda dochází ke stechiometrické nebo nestechiometrické hydrataci. Vzniká-li hydrát je třeba vědět, zda vzniká přímo nebo přes meziprodukty s nižším obsahem vody. Pokud může látka vytvářet hydrátů několik, může být systém velmi složitý a jeho studium náročné.

Polymorfní formy mají odlišnou krystalovou formu a tedy i různou energii krystalové mřížky. Forma, která má za daných podmínek vyšší obsah Gibbsovy volné energie je termodynamicky méně stálá a má snahu přecházet na formu s nižší energií. Znalost termodynamiky polymorfního systému je důležitá pro návrh procesu krystalizace, při němž má vznikat žádaná forma. Proces, který „jde proti termodynamice“ se jen obtížně definuje, je méně robustní a jeho výsledek závisí na pečlivém dodržení kritických parametrů.

Stejně tak je pro návrh procesu přípravy definované polymorfní formy důležitá i znalost rychlosti přeměn probíhajících v polymorfním systému – jejich kinetiky. Dobu konverze metastabilní formy na stálejší je zatím třeba zjišťovat experimentálně, předpovědi zatím nejsou spolehlivé. Některé metastabilní polymorfní formy mohou přecházet na stálejší formy velmi pomalu (extrémně pomalý je např. přechod metastabilní formy uhlíku – diamantu – na stálejší grafit), jindy však může být přechod forem tak rychlý, že některé metastabilní polymorfní formy nemusí ani být za běžných podmínek izolovatelné. U některých látek k takovému přechodu dochází již působením mechanických sil při mletí. Jinak lze k přechodu na stabilní formu využít i metody odvozené od postupů screeningu polymorfů – např. zahřívání suspenze látky ve „špatném“ rozpouštědle. Přechod metastabilního polymorfu na stabilní lze urychlit naočkováním krystalky stálejší formy. Pro přípravu finálních léčivých látek je důležitá znalost podmínek vzájemného přechodu polymorfních forem důležitá i vzájemné přeměny pseudopolymorfů, tj. různých typů hydrátů nebo solvátů.

Vývoj léčiv – vývoj výrobních procesů Ve fázi objevu a návrhu léčiva bylo úkolem chemika připravit látku s optimální účinností, ve vývojové fázi se cílem stává příprava látky optimálním postupem. Vývoj procesu výroby je úkolem technologických laboratoří. Je zahajován, jakmile je na základě zkoušek nové látky nebo marketingového rozboru vybráno léčivo, které má být vyráběno. Vývoj výrobního procesu léčiva vychází z laboratorního postupu jeho přípravy, bylo by však chybou se domnívat, že jde o pouhé zvětšení měřítka. Výsledkem vývoje výrobního procesu může být postup výrazně se odlišující od původního laboratorního postupu.

Výsledkem vývoje postupu přípravy léčiva musí být výrobní proces, který je účelný, účinný, levný, uskutečnitelný v reálných podmínkách, optimální a reprodukovatelný. Náročnost vývoje procesu výroby léčiva se v současné době podstatně zvýšila. ¾ Molekuly léčiv jsou stále složitější – mají vyšší molekulovou hmotnost, komplikovanější strukturu, vyšší obsah heteroatomů a chirálních center ¾ Požadavky na kvalitu léčiv a postupy jejího stanovení jsou stále náročnější – obvykle se vyžaduje, aby léčiva měly čistotu vyšší než 99% a obsah nečistot se pohyboval pod 0,1%. ¾ Zvyšuje se počet sledovaných parametrů produktu (optická čistota, polymorfie atd.) i procesu ¾ Analytické hodnocení se stává nedílnou součástí vývoje procesu ¾ Současná farmaceutická legislativa klade vysoké nároky na dokumentovaný průkaz kvality, bezpečnosti a účinnosti léčiva. S ohledem na rozsah požadované dokumentace jsou větší změny již vyvinutého procesu výroby léčiva proveditelné jen obtížně a jsou náročné časově i finančně (nutnost provádění řady nových zkoušek). Pokud je substance léčiva je vyráběna pro externího odběratele, je nutné mu změny oznámit a nechat si je odsouhlasit.

25

Přes zvyšující se nároky je pro vývoj nových postupů a procesů k dispozici stále méně času – v 80. letech trval vývoj výrobních procesů v průměru 8-10 let, nyní je požadováno 4-6 let. Pro klinické zkoušky je zapotřebí připravovat léčiva již v poměrně velkých množstvích a v podstatě již řádně vyvinutým procesem. Jakmile je produkt zaregistrován na základě klinických zkoušek s přípravkem získaným určitým procesem, jakékoliv další změny ve specifikaci produktu (např. obsah nečistot z přípravy) vyžadují finančně i časově náročné zkoušení a dokazovávání, že se nesnížila jakost, účinnost a bezpečnost produktu. Vývoj výrobních procesů proto často významně ovlivňuje dobu uvedení léčiva na trh, jeho obchodní úspěch a nákladovost výroby. Odpovědný přístup k vývoji procesů zahrnuje pečlivé plánování a integraci různých aktivit, využívání výpočetní techniky při návrhu a hodnocení experimentů, automatizaci, řízení a monitoringu proměnných parametrů procesu, trvalé rozvíjení znalostí a dovedností a využívání všech možností výhodné spolupráce s externími pracovišti („outsourcing“).

Má-li být vypracován efektivní a dobře reprodukovatelný výrobní proces, je třeba znát, jak různé proměnné faktory ovlivňují výtěžky, čistotu a stabilitu produktu, jakož i jeho farmaceutické vlastnosti a v neposlední řadě i jeho cenu. Vývoj postupu výroby nového léčiva má obvykle několik etap. Poté co je nové léčivo objeveno, je třeba připravit kilogramové množství látky pro vývoj analytických postupů, vývoj způsobu podání léčiva (perorálně, parenterálně) a preformulační zkoušky, testování akutní toxicity a předběžné zkoušky stability. V této etapě jde stále ještě více o rychlou přípravu, než o optimální postup výroby, takže se často pouze zvětší měřítko původního laboratorního postupu. V druhé etapě je třeba látku připravit v množství desítek kg pro pokračování toxikologických studií a vývoj lékové formy, někdy i pro fázi I klinického zkoušení. V následující etapě se na poloprovozním zařízení vyvíjí již v podstatě konečný výrobní proces. Přitom se současně připraví látka ve větším množství (až stovky kg) pro klinické zkoušení. Jakmile jsou zkoušky ukončeny a léčivo zaregistrováno zahajuje pravidelná výroba, někdy až v tunových množstvích. Vyvinutý proces výroby by se přitom už neměl zásadně měnit. Postup přípravy léčiva z 1. etapy vývoje se ještě může odlišovat od konečného postupu. I přitom je však třeba dbát na čistotu a jakost produktu udávanou obsahem účinné látky, druhem nečistot a jejich zastoupením. Podle výsledků se totiž obvykle navrhuje specifikace produktu, tj. určí se zkoumané parametry a metody provedení zkoušek, identifikují se nečistoty a určí standardy látek, které budou zapotřebí pro analytickou kontrolu. Specifikace produktu je uváděna v žádosti o povolení klinických zkoušek. Specifikovaným limitům musí vyhovovat budoucí šarže léčiva, jinak by bylo třeba některé zkoušky opakovat nebo je alespoň doplnit o průkaz jejich bioekvivalence s produktem odpovídajícím původní specifikaci. Zdálo by se, že řešení je jednoduché – určit velmi „měkké“ limity. To však není možné, specifikace musí splňovat určité obecné požadavky na jakost léčiv, které jsou dosti vysoké (např. obsah jednotlivé neznámé nečistoty nemá překročit 0,1%).

Prioritou vývoje procesu proto je poslední stupeň syntézy a zejména pak postupy čištění konečného produktu (krystalizace, jiné způsoby purifikace), kdy se podle výsledků určuje kvalitativní specifikace. Přitom je třeba sledovat nejen obsah účinné látky a nečistot, ale i parametry, které organičtí chemici někdy opomíjejí. Je to např. obsah anorganických příměsí, které mohou být při HPLC, fotomerii apod. „neviditelné“, ale mohou snadno překročit předepsané limity. Jde např. o obsah těžkých kovů (předepisován v tisícinách procenta) nebo některých aniontů. Pozornost je třeba věnovat i krystalové struktuře (polymorfii) a velikosti částic produktu. Jde o důležité charakteristiky produktu, na nichž může záviset rozpustnost a časový průběh rozpouštění (disoluční křivka), biologická dostupnost a stabilita léčiva.

První stupně procesu výroby léčiva se většinou optimalizují až je k dispozici optimalizovaný postup provedení finálního stupně. K jednotlivým stupňům a krokům syntézy se přitom nepřistupuje izolovaně, ale jako k integrální součástí celého procesu výroby léčiva s cílem dosáhnout co nejlepšího celkového výsledku. Jde např. o to, aby byl na minimum omezen počet prováděných operací a manipulace s materiálem. Je tedy třeba také zvážit, který meziprodukt je třeba izolovat a čistit a kdy lze různé operace provádět v jednom zařízení („jednom hrnci“ – one-pot synthesis/Eintopfverfahren), aniž by byla snížena kvalita konečného produktu. Dále je třeba se zaměřit na odstranění „úzkých hrdel“, které nepříznivě ovlivňují efektivnost procesu, tj. objem výroby za časovou jednotku a tím i cenu. Nemalou pozornost je třeba během vývoje procesu věnovat organizaci práce a toku materiálu. Toky materiálu se nesmí křížit, aby byla eliminována možnost chybného použití surovin a činidel. Dále je třeba vypracovat postupy čištění aparatur (včetně analytických postupů hodnocení čistoty výrobního zařízení), postupy mezioperační kontroly a specifikovat kvalitativní parametry surovin, činidel a meziproduktů a řešit i otázky nebo recyklace odpadů a omezení množství odpadů určených na likvidaci a také i emisí těkavých látek.

Chemik zabývající se optimalizací prostupů přípravy léčiva se musí v první řadě důkladně seznámit s problémem, který má přidělen a jasně si uvědomit cíle, kterých má dosáhnout. Těmito cíly jsou

26

v prvé řadě výtěžek a kvalita produktů, s nimiž úzce souvisí cena produktu. Vedle toho musí brát v úvahu i bezpečnost práce a ochranu životního prostředí. Je např. zbytečné se zabývat optimalizací postupu, při němž se použijí suroviny, činidla a pomocné látky, jejichž cena je jen o málo nižší nebo dokonce převyšuje cenu konkurenčního výrobku srovnatelné kvality. Stejně tak nemá cenu optimalizovat postup přinášející závažná bezpečnostní rizika, která za daných podmínek nelze minimalizovat. Takovým rizikem může být např. práce s alkalickými kovy, pokud je k dispozici jen chlazení vodou nebo vysoce hořlavými rozpouštědly, jestliže dostupné zařízení není chráněné proti jiskření. Z environmentálního hlediska může být nevhodné použití chlorovaných rozpouštědel nebo procesy, při nichž dochází k velkému znečištění odpadních vod, nežádoucím emisím těkavých látek a vůbec vzniku většího množství toxických odpadů. Výroba, při níž se používají látky nebo vznikají odpady se značným negativním vlivem na životní prostředí, nemusí být veřejnoprávními orgány povolena.

Po stanovení cílů optimalizace je dalším krokem identifikace faktorů, které ovlivňují cílové parametry. Faktorů, které mohou mít přímý vliv na výsledek procesu, je celá řada. Patří mezi ně zejména teplota a tlak, reakční doba, druh rozpouštědla, koncentrace reaktant, pořadí a rychlost přidávání reaktant, rychlost ohřevu nebo chlazení, rychlost míchání, typ a množství katalyzátoru, pH, způsob purifikace apod.

Určení optimální hodnoty všech faktorů by bylo jen obtížné a nákladné, takže by vývoj procesu mohl stál více, než by optimalizace přinesla. Je proto třeba uvážit, které faktory mají na výsledek velký nebo jen malý vliv. V ekonomice je znám Paretův princip, podle něhož jedna pětina výrobků přináší čtyři pětiny zisku. Tento princip lze aplikovat i na úvahy o významu jednotlivých faktorů, protože v prvém přiblížení lze tvrdit, že výsledky technologických procesů jsou z ze 4/5 ovlivňovány 1/5 variabilních faktorů. Na základě zkušeností s podobnými procesy nebo i podle výsledků orientačních experimentů lze procesní faktory rozdělit do čtyř skupin. První tvoří faktory, které na dosažení cílových parametrů mají nulový nebo jen nepatrný vliv. Při optimalizačních experimentech se tyto faktory zanedbávají. Další skupiny tvoří kvalitativní faktory (typ rozpouštědla, katalyzátoru, extrakčního činidla atd.), kvantitativní faktory, které se mohou v určitém rozmezí libovolně měnit (např. teplota, pH, doba reakce apod.), a konečně faktory „kategorické“ povahy, které za daných podmínek lze buď aplikovat nebo vyloučit (např. míchání – ano/ne, světlo nebo tma apod.).

Z kvalitativních faktorů stojí v popředí výběr prostředí, v němž se reakce provádí Volba rozpouštědla ovlivňuje výtěžky, průběh reakce, nákladovost výroby i environmentální dopady procesu. Při výběru je nejprve třeba brát v úvahu kompatibilitu rozpouštědla s příslušnou reakcí. Např. Friedel-Craftsovy reakce nebo práce s Grignardovými činidly lze provádět jen v určitých typech rozpouštědel. V protických rozpouštědlech probíhají dobře SN1 reakce, v polárních aprotických rozpouštědlech SN2 reakce. Rozpouštědlo může mít vliv i na selektivitu reakcí. Tak např. při redukci tosylátu ω-bromundecylaloholu LiALH4 v etheru dochází k odredukování tosyloxyskupiny, v diethylenglykoldimethyletheru se naopak odredukuje brom. Důležitý je i bod varu – varem rozpouštědla se nejspolehlivěji reguluje teplota reakční směsi. Dále záleží na rozpustnosti výchozích látek, hlavních i vedlejších produktů reakce. Výchozí látka nemusí být úplně rozpuštěná, stačí, když se rozpouští částečně a vznikem rozpustného produktu je porušována rovnováha mezi rozpuštěným a pevným podílem. Vylučování nerozpustného produktu může posouvat reakční rovnováhu žádoucím směrem, jindy však může proces komplikovat např. vznikem méně kvalitního produktu nebo vylučovaný produkt může obalit a tím deaktivovat katalyzátor. V neposlední řadě je třeba brát v úvahu i bezpečnostní aspekty (např. kancerogenitu benzenu) a ochranu životního prostředí (je třeba respektovat přísné předpisy týkající se použití chlorovaných rozpouštědel).

U faktorů kvantitativní povahy („procesních proměnných“) je třeba zvážit, jaké může být rozmezí jejich hodnot a jaké jsou možnosti dosažení tohoto rozmezí z hlediska vybavení, finančních zdrojů, personálních podmínek apod. S růstem teploty roste rychlost chemických reakcí. To však platí i o nežádoucích vedlejších nebo rozkladných reakcích, které zhoršují kvalitu produktu. Podobný vliv může mít koncentrace reaktant: Se vzrůstem koncentrace se zvyšuje reakční rychlost jak hlavních, tak i vedlejších reakcí. U exotermních reakcí nemusí být při vysokých koncentracích zajištěn dostatečný odvod tepla a reakce pak může mít i nekontrolovaný průběh. Rychlostí přidávání reaktant lze průběh exotermních reakcí zmírnit a zajistit tak často vyšší čistotu produktu, na pořadí přidávání reakčních komponent může záviset výsledek reakce. Na poměru množství reaktant závisí poloha reakční rovnováhy. Přebytek jedné komponenty (obvykle levnější) zajistí lepší výtěžek produktu a/nebo může významně přispět ke zvýšení jeho jakosti. Posun reakční rovnováhy lze zajistit i odstraňováním žádaného nebo vedlejšího produktu reakce z reakční směsi – vylučováním v pevném stavu, oddestilováním nebo vychytáním pomocnými činidly (např. odstraňováním vznikající vody azeotropním oddestilováním nebo sušidly). Tlak pozitivně ovlivňuje rychlost takových reakcí, u nichž v přechodovém stavu klesá objem. Vedle reakcí s plynnými reaktantami (hydrogenace, oxidace) jde např. o esterifikace a zmýdelnění esterů, kvarternizace aminů, nukleofilní substituce, Diels-Alderovu reakci, Claisenův přesmyk apod.; významnější efekt se však v těchto případech většinou projeví až při řádových změnách tlaku. Reakční doba je jedním z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících efektivnost a cenu procesu. Cílem optimalizace procesu proto nejčastěji je určit minimální dobu reakce potřebnou k dosažení co nejvyššího výtěžku. To platí zejména pro rovnovážné reakce, protože prodlužovat reakční dobu po dosažení rovnováhy nemá smysl. Vedle výtěžku je 27

však třeba brát v úvahu i možnost vzniku nečistot při prodlužování reakční doby. Někdy je zapotřebí zastavit reakci dříve, než dojde k výraznějšímu rozkladu produktu. Z technologického hlediska je žádoucí, aby reakční doba činila nejvýše 20 hodin, jinak neúměrně roste výrobní režie, jedna z důležitých položek kalkulace výrobních nákladů.

Ve většině případů závisí to, zda faktor je kategorické povahy, na okolnostech. Zatímco jeden typ zařízení lze buď jen míchat nebo nemíchat, v jiném typu zařízení lze měnit otáčky. Kategorický faktor se tak může změnit na kvantitativní, jehož hodnota může být přesněji specifikována. To však obvykle je spojeno se zvýšením nákladů, takže je třeba zvážit, zda to je v daném systému potřebné a účelné Míchání má velký vliv na průběh heterogenních reakcí, u reakcí probíhajících v homogenním prostředí zajišťuje míchání pouze lepší odvod nebo přívod tepla a při postupném přidávání komponent promísení směsi.

Které faktory mají na výsledek procesu významný vliv se zjišťuje při faktorových experimentech Při standardním (úplném) faktorovém experimentu se pro každý z faktorů, o nichž se předpokládá, že ovlivní výsledek, zvolí dvě hodnoty, dolní a horní. Pak se experimentálně ověří, jaký vliv na výsledek tyto faktory mají. Je-li vybraných faktorů 5 a méně, může se provést úplný faktorový experiment, který zahrnuje 2n dílčích pokusů, při nichž se pro každý z faktorů použije zvolená horní a dolní hodnota. Při výběru 4 faktorů (např. teplota, reakční doba, polarita rozpouštědla, míchání – ano/ne) je těchto dílčích experimentů 16, u 5 faktorů 32. Se vzrůstem počtu vybraných faktorů počet dílčích experimentů však již neúměrně narůstá (26 = 64, 27 = 128). Kromě toho faktorový experiment se 2 hodnotami proměnných je sice vhodný pro screening vlivu faktorů na výsledek, neposkytuje však vždy relevantní výsledky pro optimalizaci. Vhodnější může být např. studium vlivu teploty s použitím 3 hodnot proměnného faktoru (víceúrovňový faktorový experiment), pak však počet dílčích experimentů již činí 32, 33, 34 atd., ke sledování 5 faktorů na 4 úrovních by bylo zapotřebí 1024 dílčích experimentů. Aby se počet experimentů snížil, provádí se částečný faktorový experiment s menším počtem dílčích faktorů. Částečný faktorový experiment samozřejmě poskytne méně informací než úplný. K tomu, aby ztráta informací byla minimalizována se používají různé statisticky podložené chemometrické triky, optimalizační a vyhodnocovací počítačové programy. K základnímu sledování 2 úrovní 6 faktorů tak např. postačí 28 dílčích pokusů.

Faktory, které mají zásadní vliv na výsledek se pak dále optimalizují. Při hledání hodnot vybraných faktorů, při nichž se dosahuje nejlepší výsledek, lze provádět tak, že se postupně sleduje vliv vždy jen jednoho faktoru na průběh dané reakce. Tento postup je zdlouhavý, neefektivní a tedy i nákladný. V anglicky psané literatuře označuje příznačným akronymem COST (=Change One Separate factor at a Time). Kromě toho ani nemusí přinášet správné výsledky.

Mezi jednotlivými faktory velmi často existují vzájemné vztahy, změna jednoho faktoru může působit proti změně faktoru druhého nebo naopak může docházet k určité synergii. Postupné sledování vlivu každého jednotlivého faktoru na výsledek proto nemusí vést k nalezení optimálního procesu. Vhodnější proto je sledovat kombinace různých faktorů. Přitom se využívají různé optimalizační postupy. Jedním z nich je sekvenční simplexová optimalizace. Přitom sem provádí 3 dílčí experimenty s třemi různými hodnotami 2 sledovaných faktorů, 4 pro tři faktory atd. Zjistí se výsledky experimentů. Pak se provede další experiment, při němž se proměnné volí tak, aby při grafickém znázornění byla jejich hodnota zrcadlovým obrazem hodnot proměnných při nejhorším experimentu. E

hodnota 1. faktoru D

5. experiment

4. experiment

C 3. experiment

A 1. experiment

B 2. experiment

hodnota 2. faktoru

To se pak opakuje několikrát, až se dosáhne nejlepší hodnoty procesní proměnné. Pokud by se hodnota proměnných měla „zrcadlením“ vrátit na hodnotu odpovídající nejhoršímu výsledku, pak se vychází z druhého výsledku. Při modifikovné simplexové metodě se postupuje podobně, ale v případě, že by se „zrcadlením“ mělo dospět k horšímu výsledku, se průmět zkrátí. V posledních letech byla vyvinuta celá řada dalších optimalizačních postupů s příslušným software pro rychlé nalezení a vyhodnocení optimálních podmínek reakce. Podrobnosti o různých metodách plánování

28

a vyhodnocování experimentů lze nalézt v řadě učebnic chemometrie, popř. matematické statistiky nebo na Internetu (např. na adrese http://www.itl.nist.gov/div898/education/dex/optdesgn/optdesign.pdf).

Validace výrobních postupů Léková legislativa vyspělých zemí vyžaduje, aby vypracovaný optimalizovaný postup výroby léčiva byl validován. Vedle zpracování požadované výrobní dokumentace (Drug Master File, technologický předpis, standardní operační postupy, záznamy o výrobě šarže) je validace poslední etapou vývoje procesu výroby léčiva. FDA definuje validaci procesu výroby jako dokumentovaný důkaz vysoké záruky toho, že proces bude trvale poskytovat produkt vyhovující předem určené specifikaci. Řečeno jinými slovy, validace má zaručit, že příslušným procesem lze spolehlivě a trvale vyrábět účinné, bezpečné a kvalitní léčivo. Validace v podstatě je kontrolou reprodukovatelnosti a robustnosti postupu. Postup je validovatelný, jestliže běžné kolísání hodnot různých faktorů negativně neovlivňují jakost výrobku. Pro kritické faktory se přitom stanoví rozmezí, které nesmí být překročeno, má-li být dosažen požadovaný výsledek (např. ± 5°C u teploty, časové rozmezí přidávání reagentu apod.). Čím užší je toto rozmezí, tím kvalifikovanější a zodpovědnější musí být obsluha, popř. jsou-li výrobní aparáty opatřeny řídicími a regulačními systémy, tím přesněji a citlivěji musí tyto systémy pracovat (což se samozřejmě promítne do jejich ceny).

Validace se provádí podle písemného řídícího plánu validace (Validation Master Plan). Plán vymezuje zodpovědnosti jednotlivých pracovníků, vymezení předmětu a cílů, postupy provedení, způsob dokumentace výsledků ve validačním protokolu, odkazy na stávající dokumentaci, časový sled jednotlivých kroků, postupy při změnách, mohou v něm být i specifikovány nároky na zdroje.

Validační aktivity začínají kvalifikací zařízení. U nového zařízení se přitom nejprve provádí instalační kvalifikace, kdy se posuzuje, zda zařízení odpovídá specifikaci a je správně namontováno. Pak se provádí operační kvalifikace. Při ní se podle schváleného protokolu zjišťuje, jak při provedení reálného nebo simulovaného procesu s příslušným zařízením lze dodržet předepsané parametry. Po operační kvalifikaci následuje procesní kvalifikace, kdy se ověřuje, jak zařízení vyhovuje pro použití při navrhovaném procesu. Je-li např. pro proces nezbytné dodržení teploty v rozmezí ± 3°C a systém kontroly teploty v příslušném zařízení umožňuje regulovat teplotu pouze v rozmezí ± 10°C, pak zařízení nelze kvalifikovat. Při kvalifikaci zařízení se prověřují i měřící, monitorovací a záznamové přístroje a čidle, včetně stavu jejich kalibrace.

Je-li zařízení kvalifikováno, začíná samotná validace procesu. Ta může být prospektivní, prováděná před zahájením výroby, souběžná, při níž z praktických důvodů současně s validací probíhá výroba prvních šarží a konečně retrospektivní validace vycházející z dokumentace o dosavadních vyrobených šaržích (10-30 šarží) u dobře definovaných procesů. Optimalizace procesů výroby léčiva by měla vyústit v prospektivní validaci. Při ní se vychází z popisu výroby s přehledem kritických kroků a parametrů, jejichž změna může mít velký vliv na kvalitu produktu a které je proto třeba prověřit. Validace prokazuje, že pokud se tyto kritické parametry pohybují ve specifikovaném rozmezí, získá se produkt se specifikovanou jakostí. Velikost šarže má být při validaci pokud možná stejná jako u výrobních šarží.

Výrobní proces lze validovat jen tehdy, jsou-li stanovena kriteria přijatelnosti konečného výrobku i meziproduktů a k jejich kontrole ověřené a rovněž validované analytické postupy. Na validaci výrobních procesů navazuje validace postupů čištění zařízení. Zařízení používané univerzálně se musí dát prokazatelně vyčistit od zbytků předchozího výrobku, jinak může být používáno jen pro jediný výrobek.

Prostory, systémy, procesy i postupy čištění musí být v pravidelných intervalech hodnoceny – revalidovány, aby se prokázalo, že během času nedošlo k odchylkám od validovaného stavu.

Literatura pro další studium Banker G.S., Rhodes ChT., Modern Pharmaceutics, Marcel Dekker, New York, 1996 Banwarth W., Felder E. (eds.), Combinatorial Chemistry, Wiley – VCH, Weinheim, 2000 Burger´s Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th Ed., Vol. 1, Principle and Practice (Wolff M.E., ed.), Wiley & Sons, New York, 1995

29

Foye W.O., Lemke T.L., Williams D.A. (eds.), Principles of Medicinal Chemistry, 4th Ed., William and Wilkins, Philadelphia, 1996 Gadamasetti K.G., Process Chemistry in the Pharmaceutical Industry, Marcel Dekker, New York, Basel, 1999

Katzung B.G., Základní a klinická farmakologie, H&H, Praha, 1994 King F.D. (ed.), Medicinal Chemistry. Principles and Practice, Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1994 Lam K.S., Lébl M., Krchňák V., The „One-Bead-One-Compound“ Combinatorial Library Method.Chem. Rev., 1997, 97, 411-448 Lincová D., H. Farghali, Základní a aplikovaná farmakologie, Galén, Praha, 2002 Lüllmann H., Mohr K., Wehling M., Farmakologie a toxikologie, Grada, Praha 2002 Lüllmann H., Mohr K., Ziegler A, Bieger D., Barevný atlas farmakologie, Grada, Praha, 2001 Mutscher E., Derendorf H., Drug Actions. Basic Principles and Therapeutic Aspects, Metpharm, Stuttgart, 1995 Patrick G., Instant Notes. Medicinal Chemistry. BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford, 2001 Rang H.P., Dale M.M., Ritter J.M., Moore P.K., Pharmacology, Churchill Livingstone, Edingburgh, 2003

Thomas G., Medicinal Chemistry, An Introduction. Wiley, Chichester, 2001 Višnovský P., Farmakologie do kapsy, Maxdorf Jessenius, Praha, 1998.

30