Sortování savčích chromozomů a jejich praktické využití Svatava Kubíčková, Jan Fröhlich, Halina Černohorská
2
gene specific
FISH sondy
flow sorting conventional microdissection laser microdissection
centromere specific
Flowcytometrické karyotypování a sorting chromozomů - Historie
Užívána od pol. 70. let 20.stol
První experimenty na chromozomech křečka barvené jen ethidium bromidem (Jednokanálové experimenty).
Konec 70.let - zaveden systém dvou laseru => možnost užití 2 barev vedlo ke zlepšení rozlišovací schopnosti (Dean and Pinkel, 1978, Langlois and Jensen 1979).
Na počátku 90. let sortované chromozomy sloužily pro konstrukci DNA knihoven pro počáteční fáze Human Genome Project (Van Dilla and Deaven 1990).
Navzdory všem vylepšením za posledních 20 let se stále nedaří rozeznat celou řadu chromozomu u různých druhů zvířat => využití FISHIS (Fluorescence in situ hybridization in suspension).
4
(Gray et al., 1975, Wray and Stubblefield, 1970).
Flowcytometrické karyotypování a sorting chromozomů - aplikace
5
Detekce delecí, aneuploidii, translokací, markerových chromozomů nebo jiných chromozomových abnormalit (Gray et al., 1988).
Využití v genomových evolučních studiích (tvorba FISH sond) (Carter et al., 1992).
Flow-sortování chromozomu je jednoduchou a levnou metodikou pro získání velkých množství určitého chromozomu v karyotypu o vysoké čistotě (více jak 90 %) => užití k vytvoření DNA knihoven.
„Sexation“ – pohlaví potomstva založeno na oplodnění spermiemi, které byly rozděleny dle přítomnosti chromozomů X a Y.
Aplikace I - Identifikace derivovaných nebo markerových chromozomů A)
B)
Figure. Pictures shows flow karyotypes of two patients with derivated chromosomes. The peaks representing the normal chromosomes and additionally in case A) chromosomes X, 8, and 7, and the derivative chromosome 8 are indicated. In B) the peaks representing the normal and derivative chromosomes 21 (Carter et al., 1992). 6
Aplikace II - Chromosome painting and genomové evoluční studie
Chromosome painting je metoda využívající principy FISH (fluorescence in situ hybridization).
Malovací sondy vytvořené z chromozomu jednoho druhu jsou hybridizovány na chromozomy příbuzného druhu.
Reciproký chromozomový painting umožňuje zobrazení chromozomových homologií, translokací, delecí a popřípadě inverzí, ke kterým došlo během evoluce (Wienberg et al., 1990, 1992; Jauch et al., 1992, Korstanje 1999).
Figure. Color-banded chromosomes of human and the great apes arranged according to the numbering system of the human idiogram. Chromosomes in each cases colorbanded using multicolor gibbon probe set (Harlequin FISH, Cambio) (Ferguson-Smith et al.,2000).
7
MoFlo™ XDP
DNA specific fluorescent dyes Hoechst 33258 (A-T), Chromomycin A3 (G-C) 8
Karyotyp Homo sapiens
10
Flow kayryotyp - člověk (Homo sapiens)
Figure. Human bivariate flow karyotype from a normal male individual. Different peaks represent chromosomes of varying size and base pair content. Using modern high-end machines, quality preparations have made it possible to resolve two parental alleles for certain chromosomes (NG and Carter, 2006).
11
Figure. Human bivariate flow karyotype of the normal male Lymphocyte cells.
Karyotyp Sus scrofa
12
Flow karyotyp - prase (Sus scrofa)
Figure. Pig bivariate flow karyotype from a normal male (Yerle et al., 1993)
13
Figure. Izolace prasečích chromosomů z linie IPEC (Intestinal Porcine Epitelial Cells )
Karyotyp Bos taurus
14
Flow karyotyp - kráva (Bos taurus)
? 28
Figure. Buňky z linie MDBK (Madine-Darby Bovine Kidney)
15
Figure.Bivariate flow karyotype of the bovine cell culture. (Schmitz et al.,1995)
Karyotyp Vulpes vulpes
16
Flow analýza karyotypu – liška (Vulpes vulpes)
17
Figure. Flow karyotype of the red fox with chromosomal assignments. Cell line derivated from Red Fox skin fibroblasts.
Figure. Flow karyotype of the red fox chromosomal assignments. (Yang et. al, 1999)
with
PALM® MicroLaser system
slide 0,17 mm objective 100x 150x 18
LMM (laser microbeam microdissection)
19
Laser microdissection and catapulting
20
Chromozomové malovací sondy
21
100-500 kopií chromozomů izolovaných průtokovou cytometrií 10-20 kopií chromozomů ( nebo jejich částí) izolovaných mikrodisekcí DNA je amplifikovaná metodou DOP PCR ( primer 5`-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G-3`) značení amplifikačních produktů v sekundární PCR za využití značených nukleotidů: biotin-dUTP, digoxigenin-dUTP, orangedUTP, fluorescein -dUTP ověření sondy FISH
Chromozomové malovací sondy Sus scrofa sus 3 + 7 + 6 + 1 + 14
Sus scrofa - subchromosomální sondy
Chromozomové malovací sondy Homo sapiens
homo 2
homo 21
Chromozomové malovací sondy Bos taurus bos 14 + 16 + 20
bos 5tel
Detekce chromozomálních aberací sus 7 + 18
tranlokace
inzerce
family Bovidae subfamily subfamily subfamily subfamily subfamily subfamily subfamily subfamily subfamily subfamily subfamily
28
Caprinae Cephalophinae Reduncinae Alcelaphinae Hippotraginae Peleinae Aepycerotinae Bovinae Tragelapinae Antilopinae Neotraginae
kráva 2n=60
29
sitatunga 2n=30
stanovení fúzí
Bongo
30
Nyala
Lesser kudu
Greater kudu
Bongo
Common eland
Derby eland
Bushbuck
Sitaunga
11; 22; 2
1; 5
24; 22; 2
3; 22; 2
3; 22; 2
3; 22; 2
3; 22; 2
3; 22; 2
2; 10
4; 5
6; 10
5; 10
5; 10
6; 11
6; 11
4; 7
3; 10
1; 29
4; 12
1; 29
5; 10
5; 10
3; 11
1; 29
4; 15
1; 29
4; 19
4; 12
4; 12
6; 16
6; 20
5; 17
8; 15
6; 21
1; 29
1; 29
12; 18
7; 18
8; 16
6; 24
7; 28
9; 20
9; 20
8; 20
8; 17
11; 20
11; 18
8; 15
8; 24
8; 24
9; 27
12; 16
7; 28
7; 26
9; 23
15; 16
15; 16
15; 22
11; 23
9;26
16; 20
11; 20
7; 28
7; 28
14; 29
9; 27
23; 12
14; 19
14; 27
18; 19
18; 19
19; 21
18; 21
9; 28
16; 17
14; 26
14; 26
14; 26
19; 25
21; 23
18; 26
21; 23
21; 23
17; 27
17; 27
15; 28
17; 27
X
X; 13
X
X
X; 13
XX
X
X
Y; 13
Y; 13
Y; 13
Y; 13
Y; 13
Y; 13
Y; 13
Y; 13
Fylogenetické stromy Y;13
1
2;22
Tragelaphus imberbis kudu malý
Tragelaphus angasii nyala nížinná
2
1;29
Tragelaphus strepsiceros kudu velký
3 3(2;22)
4
5;10
Tragelaphus scriptus lesoň
5 4;12
Rubes et al. 2008
17;27 21;23
Tragelaphus eurycerus bongo
8
Tragelaphus spekei sitatunga Taurotragusus oryx a.losí 15 T. derbianus a.Derbyho
Antilopa čtyřrohá (Tetracerus quadricornis ) – tandemové fúze
Ropiquet et al. 2010
Dik-Dik ( Madoqua kirkii) stanovení cytotypu
BOS 11 qd (green) cen cen
BOS 26 qd (red) BOS 23 qd (green) BOS 27 qd (red) BOS 28 qd (green)
BOS 1 qd (red)
A1 q: BTA 1, BTA 28, BTA 27, BTA 23, BTA 26, A1 p: BTA 11 Cernohorska et al. 2011
Žirafa (Giraffa camelopardalis) a vidloroh (Antilocapra americana ) - přestavby chromozomů BTA1 a BTA3
sondy bos 1tel a bos 3tel
Cernohorska et al. 2013
Antilopini (Bovidae) fúze X;BTA5 - přestavby
GLE, NDA, ETH – tandemová fúze ACE – centrická fúze Cernohorska et al. 2015
translokace rob(1;29) u skotu normalní
rob(1;29)
rob(1;29)
Y
37
X
X
X
Antilopa jelení - polymorfismus fúzovaný a disociovaný chromozom 8 a 14
38
Mountain Reedbuck (Redunca fulvorufula), 2n=56 Chromozomální mosaicismus
X Y
Y
Bahnivec horský ( Redunka fulvorufula ) - extra Y chromozom v 11% buněk
39
Orangutan bornejský a sumaterský Orangutan bornejský ( Pongo pygmeus ) a sumaterský ( Pongo abelii )
Tsend-Ayush et al. 2004
stanovení druhu ( bornejský x sumaterský ): 40
FISH sonda homo 3dist
Komparativní FISH a malovací sondy • • průtoková cytometrie + efektivní, velice rychlé - omezena na Flowcytometricky rozlišitelné chromosomy - sondy pouze pro celé chromosomy
41
laserová mikrodisekce + možnost subchromosomálních sond (specifické pro ramena, oblasti chromosomu) - pomalé, zisk málo chromozomů - nutná znalost karyotypu
Shrnutí
FISH - dobré využití v oblasti detekce chromozomových abnormalit (delecí, translokací, inserce).
Flow-sorting poskytuje vysoká množství specifického chromozomu o vysoké čistotě za relativně krátký čas – vhodné pro FISH sondy konstrukci BAC klonů, NGS.
Flow-sorting chromozomů je silnou metodou pro identifikaci a rozlišení chromozomů u celé řady druhů organismů.
Flow-sorting i laserová mikrodisekce – bezkontaktní získání chromozomů snižuje riziko kontaminace – podstatné u metod založených na PCR
Laserová mikrodisekce – izolace subchromozomálních fragmentů > 1µm
42
