SOMATICKÉ BU KY V MLÉCE Mléko v období laktace, sekrety mlé né žlázy v období kolostrogeneze, v kolostrálním období a v období aktivní involuce, jakož i tekutina obsažená v dutinovém systému juvenilní mlé né žlázy a mlé né žlázy v období trvalé involuce obsahují bu!ky. Paape se spolupracovníky v r. 1963 pro n" zavedl ozna ení somatické bu!ky. Tento pojem dosáhl širokého uplatn"ní: Po et somatických bun"k ve tvr#ovém vzorku z prvních st$ik% je spolu s nálezem bakteriologického vyšet$ení prost$edkem diagnostické klasifikace mastitid. Po et somatických bun"k v individuálním vzorku krav (v konvovém vzorku) je prost$edkem operativního $ízení chovatelských a veterinárních inností v jednotlivých stádech a také prost$edkem šlechtitelské prevence mastitid. Po et somatických bun"k v bazénovém vzorku je významným jakostním znakem syrového mléka. Somatické bu!ky v mléce jsou p$evážn" bu!kami bílé krevní $ady. Jsou to: makrofágy (mononukleární fagocyty, kolostrální t"líska, p"nové bu!ky) neutrofilní granulocyty (polymorfonukleární fagocyty, polymorfonukleáry, neutrofily) lymfocyty V menším zastoupení to jsou epiteliální bu!ky, eozinofily, bazofily, erytrocyty, histiocyty, plazmatické bu!ky, žírné bu!ky. Názory na podíl epiteliálních bun"k v mléce se r%zní. N"kte$í auto$i udávají až 16 % (Miller et al., 1991; Paape, 2003), jiní pouhá 2 % (Lee et al.,1980). Faktory ovliv!ující po"et somatických bun#k Po et somatických bun"k v jednotlivých druzích vzork% mléka je odlišný. Paape a Tucker v r. 1966 totiž prokázali, že se po et bun"k ve frak ních vzorcích mléka odebraných v pr%b"hu dojení významn" liší. V prvních st$icích mléka je vyšší, aby následn" poklesl a v dodojkové porci a v reziduálním mléce výrazn" vzrostl. U sm"sných vzork% se velmi výrazn" uplat!uje $edící fenomén. Proto nem%že existovat jedna obecn" platná limitní hodnota po tu pro rozlišení normálního sekretu, nýbrž existují r%zné limity p$íslušné druhu vzorku mléka. Rozlišujeme: &tvr#ový vzorek (QMS = quarter milk sample): o Vzorek z prvních st$ik% mléka (FQMS = Foremilk quarte milk sample); o Sm"sný tvr#ový vzorek (QCMS = Quarter composite milk sample) Individuální vzorek (konvový vzorek ; ICMS = Individual couws milk sample) Bazénový vzorek mléka (BTMS = Bulk tank milk sample). Nejvýznamn"jším initelem ovliv!ujícím celkový i diferenciální po et somatických bun"k je zán"tlivý proces, p$i kterém vzr%stá po et somatických bun"k ve tvr#ovém vzorku až o n"kolik $ád% (z 104 na 107). Za limitní hodnotu pro rozlišení zán"tlivého sekretu se považovalo u krav 250 . 103 . ml-1, u jalovic 150 . 103 . ml-1 ve tvr#ovém vzorku z prvních st$ik% mléka (IDF, 1987). V sou asnosti se za limitní hodnotu po tu somatických bun"k ve tvr#ovém vzorku považuje 100 . 103 . ml-1 (Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft, 1994; Hamann, 2003). V diferenciálním po tu vzr%stá p$i akutním zán"tu zastoupení polymorfonukleárních leukocyt%, které m%že dosáhnout 90 i více %. Chronický zán"t je provázen vyšším zastoupením makrofág% a lymfocyt%, avšak polymorfonukleární leukocyty z%stávají dominantními. Celkový po et somatických bun"k je ovlivn"n i patogenním agens a jeho patogenitou.
1
Celkový po"et somatických bun#k a patogenní agens Patogen Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae Streptococcus dysgalactiae Streptococcus uberis Enterococcus spp. negativní Tolle, 1975
Aritmetický pr%m"r [. 103 . ml-1] 1616 1965 1358 1125 591 494
Geometrický pr%m"r [. 103 . ml-1] 449 793 477 578 239 174
Celkový i diferenciální po et somatických bun"k je rozdílný v jednotlivých funk ních obdobích mlé né žlázy. Celkový a diferenciální po"et somatických bun#k ve funk"ních obdobích mlé"né žlázy Období laktace kolostrální aktivní involuce Concha, C., 1986
Celkový po et [. 103 . ml-1] 200 280 18000
Makrofágy [%] 60 37 43
Neutrofily [%] 12 37 19
Lymfocyty [%] 28 26 38
Celkový po et somatických bun"k ovliv!uje celá $ada dalších faktor%, n"které z nich jsou jen potenciálním rizikem zvýšení po tu somatických bun"k: Anamnéza mlé"né žlázy. Po et somatických bun"k z%stává zvýšen u tvrtí, které mají ve své anamnéze prod"lanou mastitidu, by# infek ní agens bylo lé ebn" nebo spontánn" eliminováno. N"kdy se uvádí, že zvýšení po tu bun"k trvá do konce laktace a s novou laktací se stav normalizuje. Opakovan" lé ené tvrt" z%stávají trvale postiženy. Tato okolnost souvisí s dalším faktorem ovliv!ujícím po et somatických bun"k. V#k - po$adí laktace. Byl zaznamená významný vzestup lakta ních pr%m"r% po tu somatických bun"k od první do desáté laktace, a to i u krav, které v den vzorkování byly prosté infekce. Lze ovšem p$edpokládat, že mimo termín vyšet$ení tato zví$ata prod"lala subklinické mastitidy. U dojnic v desáté a vyšších laktacích po et somatických bun"k klesá, což se vysv"tluje tím, že tak vysokého v"ku se dožívají pouze zví$ata zvlášt" odolná v% i infekci a zran"ním mlé ných žláz. Plemenná p$íslušnost. Uvádí se, že horská plemena mají o 50 000 až 100 000 bun"k v mililitru mléka nižší po et somatických bun"k, než plemena nížinná. Ne vždy se tento rozdíl poda$ilo prokázat. Rozdíl v po tu somatických bun"k mezi plemeny byl nap$. zaznamenán jen ve vzorcích z infikovaných mlé ných žláz.
2
Lakta"ní pr%m#ry po"tu somatických bun#k podle plemen (individuální vzorky mléka zdravých dojnic) Aritmetický pr%m"r Plemeno [. 103 . ml-1] Holštýnské 177,56 Ayrshirské 154,99 Jerseyské 163,56 Švýcarské hn"dé 121,78
Geometrický pr%m"r [. 103 . ml-1] 121,26 98,53 119,06 89,72
Tvarové vlastnosti vemen. Prokazateln" vyšší po et somatických bun"k byl zaznamenán u dojnic s p$íliš hlubokými vemeny (s distancí hrot% struk% od podlahy pod 400 mm). Dojitelnost. Vyšší po et somatických bun"k mléka byl pozorován u lehce dojitelných krav oproti kravám s normální nebo pomalou intenzitou dojení. Stadium laktace. Po et somatických bun"k je zvýšen na za átku laktace, po 5 až 14 dn%. K podstatnému zvýšení dochází na konci laktace. Z$eteln" je to možné pozorovat, když se mléko za íná m"nit ve starodojný sekret, p$i poklesu denního výdojku pod 4 kg mléka. Frakce výdojku. V prvních st$icích mléka a obzvlášt" pak v dodojkové porci je po et somatických bun"k vyšší než v hlavním výdojku. Vysoký po et p$etrvává 4 až 5 hodin po dojení. Tento fakt má zásadní význam pro standardizaci stanovení po tu somatických bun"k. Podle doporu ení Mezinárodní mléka$ské federace (Bulletin 211, 1987) se mají k vyšet$ení používat tvr#ové vzorky odebrané na za átku regulérního dojení po odstran"ní 10 až 20 ml prvních st$ik% mléka. Frekvence dojení. Po et somatických bun"k se zvyšuje p$i zm"n" frekvence dojení za dvou na jedno denn". Proto se doporu uje p$i postupném zp%sobu zaprahování vylou it z dodávky k mlékárenskému zpracování sekret po zm"n" frekvence dojení. Denní variabilita. Vyšší po et somatických bun"k byl zaznamenám p$i ve erní dojení oproti rannímu. N"kte$í auto$i uvád"jí, že to platí pouze pro sekrety infikovaných mlé ných žláz. Ro"ní sezónnost. Minimum zaznamenáváme v m"sících prosinci až b$eznu, pak následuje vzestup s maximy v kv"tnu až $íjnu a op"t pokles k ro nímu minimu. Krmení. Zvýšení po tu somatických bun"k zaznamenáváme p$i p$echodu ze zimního na letní typ krmné dávky. Za átek pastevního období je rovn"ž provázen zvýšením po tu somatických bun"k. Dyspepsie a pr%jmová onemocn"ní zp%sobovaná zkrmováním zdravotn" závadných statkových krmiv jsou další p$í inou zvýšení po tu somatických bun"k. Metabolická onemocn#ní. Zvýšení po tu somatických bun"k provází zejména onemocn"ní chronickou acidózou a subklinickou ketózou. P$i akutní acidóze a bachorové alkalóze byla zaznamenána vyšší etnost výskytu klinických mastitid. Stres. Manipula ní i sociální stres zp%sobují zvýšení po tu somatických bun"k. Manipula ní stres provází hromadné zákroky, jako jsou vakcinace, odb"ry krve, úprava pazneht% a další. Sociální stres se dostavuje p$i obnovování sociální hierarchie stáda nebo produk ní skupiny po zm"n" jejich složení. Nebyl prokázán vliv krátkodobého teplotního stresu na po et somatických bun"k.v kontrolovaných pokusech, v klimatických komorách. P$i dlouhodobém vystavení dojnic 3
klimaticky vysokým teplotám, ochlazování zví$at vedlo ke snížení po tu somatických bun"k mléka. Dojicí stroj a technika dojení. Po et somatických bun"k ovliv!uje sám typ dojicího stroje. Záporný vliv byl zaznamenán p$i dojení potrubními dojicími stroji ve stáji, p$íznivý vliv, p$i dojení v dojírnách. Byl prokázán vyšší po et somatických bun"k v bazénových vzorcích mléka stád dojených dojicím stroji s nízkou zálohou výkonnosti výv"vy. Proto se zd%raz!uje pozitivní význam soustavné pé e o funk ní stav dojicích za$ízení. Zp%sob p$ípravy dojnic k dojení hraje rovn"ž významnou roli. Po et somatických bun"k p$ízniv" ovliv!uje používání individuálních ut"rek. Nep$íznivý vliv byl zaznamenán p$i toalet" sprchováním vemen. Velmi p$íznivý efekt má dezinfekce struk% po dojení. P$edojování m"lo v n"kterých pozorováních záporný vliv. Ustájení na vazných, extrémn" krátkých stáních (pod 1400 mm), p$íliš dlouhých stáních (nad 1900 mm) a na p$íliš širokých stáních (nad 1200 mm) prokazateln" zvyšovalo po et somatických bun"k mléka. Ve volných typech ustájení má p$íznivý vliv ustájení se slamnatou úspornou podestýlkou. Záporný vliv byl zaznamenán v bezstelivových ustájeních s tvrdým povrchem lehacích box% a v systémech s úspornou podestýlkou. Dlouhodobá variabilita. Všechny uvedené vlivy se uplat!ují jako zdroje prom"nlivosti po tu somatických bun"k jedné dojnice b"hem laktace. Prom"nlivost vyjád$ená koeficientem variability se pohybuje pro individuální vzorky krávy od 59 do 301 %. Prom"nlivost po tu somatických bun"k bazénových vzork% mléka je menší, nicmén" u vzork% odebíraných v m"sí ních intervalech se pohybuje od 4 do 46 %. Z uvedeného vyplývá, že rozhodování na základ" jednoho stanovení po tu somatických bun"k by bylo zatíženo chybou náhodných odchylek. Proto v systémech sledování jakostních znak% syrového mléka bylo zavedeno používání klouzavých geometrických pr%m"r% (obvykle ze 6 stanovení za poslední 3 m"síce). Estrus. U krav nebyl prokázán vliv $íje, ani podávání estrogenních hormon% na po et somatických bun"k mléka. V pokusech s kozami estrus signifikantn" zvyšoval po et bun"k. Zaprahování je provázeno vzestupem po tu somatických bun"k. Proto b"hem postupného zaprahování je nutné vylou it sekret mlé né žlázy z dodávky k mlékárenskému zpracování. Po"et somatických bun#k v individuálních vzorcích mléka Individuální vzorky mléka krav (konvové vzorky) jsou využívány plemená$skými organizacemi ke stanovení látkového složení mléka p$i kontrole užitkovosti již mnoho let. Od p$elomu sedmdesátých a osmdesátých let se vyvíjí snaha použít tyto vzorky i ke stanovení po tu somatických bun"k a takto získané údaje k rozlišení krav s infekcí mlé né žlázy. Po ty somatických bun"k bývají k tomuto ú elu vyjad$ovány v logaritmické transformaci (log2). Tomuto parametru bylo p$i$azeno bodové hodnocení, které se ozna uje skóre po tu somatických bun"k (somatic cell score, SCS). D%vodem pro tuto transformaci je to, že lépe odráží bakteriologický nález hlavních patogen% mlé né žlázy, než prosté hodnoty po tu somatických bun"k.
4
SCS se vypo ítá podle vztahu: SCC SCS = log2 (
————————————
) +3
100 000 SCS = somatic cell score = skóre po tu somatických bun"k; SCC = somatic cell count = po et somatických bun"k v 1 ml Následující tabulka udává hodnoty SCS v konfrontaci s prostým po tem somatických bun"k (SCC) a p$edpokládanou ztrátou produkce mléka. Skóre a celkový po"et somatických bun#k v individuálních vzorcích mléka SCC
SCC
[.103 . ml-1] St$ední hodnota
[.103 . ml-1] Rozmezí
1. laktace
2. laktace
0
12,5
0-17
-
-
1
25
18-34
-
-
2
50
35-70
-
-
3
100
72-140
90,6
181,3
4
200
141-282
181,3
362,6
5
400
283-565
272,0
543,9
6
800
566-1130
362,6
653,2
7
1600
1131-2262
453,3
906,6
8
3200
2263-4525
-
-
9
6400
4526-
-
-
SCS
Pokles produkce mléka [kg/305 dní]
NMC, 2004; SCS = somatic cell score = skóre po tu somatických bun"k; SCC = somatic cell count = po et somatických bun"k v 1 ml Za limitní hodnotu pro rozlišení suspektn" infikovaných dojnic se považuje po et bun"k 200 .103 .ml-1, t.j. SCS 4. Bylo zjišt"no, že však jedno vyšet$ení neposkytuje dostate n" p$esnou informaci. Nicmén" se udává, že z dojnic vykazujících SCS 5 a více, je 80 % infikovaných. Pokud hodnota SCS u p$íslušné dojnice stoupá, lze p$edpokládat, že vzr%stá i po et infikovaných mlé ných žláz. Vzr%st po tu dojnic s p$ekro eným limitem SCS sv"d í o vzr%stu podílu infikovaných dojnic ve stád". Pro prvotelky platí limitní hodnota SCS 3, tedy po et bun"k 100 .103 .ml-1. Signálem pro nezbytnost zlepšení programu tlumení mastitid je p$ekro ení limitní hodnoty SCS u 25 % krav, respektive prvotelek ve stád".
5
Pro hodnocení zdravotního profilu mlé ných žláz dojnic za celou laktaci se skóre somatických bun"k vyjad$uje jako lakta ní skóre (LSCS), tedy aritmetický pr%m"r SCS za celou laktaci. Tyto diagnostické znaky se staly v USA základem systému Dairy Herd Improvement, tedy programu zlepšování mlé ných stád. Obdobný systém byl uplatn"n i v $ad" dalších zemí (skandinávské zem", Francie, Estonsko). Následující tabulka uvádí zp%soby využití po tu somatických bun"k v individuálních vzorcích mléka farmá$i v USA. Využití údaj% o po"tu somatických bun#k v individuálních vzorcích farmá$i Zp%sob využití / P$enos dat
Po"et farem
%
Identifikace infikovaných krav
158
21,0
Hodnocení ú innosti terapie
135
17,8
Výb"r krav k brakaci
121
15,8
Výb"r krav k bakteriologickému vyšet$ení
89
11,7
Výb"r krav k lé ení
81
10,6
Výb"r krav k vylou ení mléka z dodávky do mlékárny
66
8,7
Výb"r krav k p$ed asnému zaprahnutí
49
6,4
Výb"r krav ke zm"n" po$adí dojení
45
5,9
Výb"r krav k selektivní terapii v zaprahlosti
16
2,1
Následující graf p$edstavuje distribuci etnosti stád podle t$íd po tu somatických bun"k v individuálních vzorcích mléka (IDF, 1997 ).
6
Po"et somatických bun#k v bazénových vzorcích mléka P%vodn" byl tento ukazatel považován v našich podmínkách, tak jako je tomu dosud v zahrani í, za parametr odrážející zdravotní stav mlé ných žláz dojnic ve stád". V sou asné dob" však již v našich chovech tento parametr zdravotní stav dojnic neodráží, nebo# se obecn" rozší$il postup vyt$i'ování sekret% s vysokým obsahem somatických bun"k za cenu výrazného snížení tržnosti syrového mléka. Po et somatických bun"k v bazénových vzorcích mléka je významným jakostním znakem syrového mléka. Vyhodnocuje se výpo tem klouzavého geometrického pr%m"ru podle vztahu: n
xg =(x1.x2. ... . xn kde
x1...xn jsou prosté hodnoty po tu somatických bun"k v jednotlivých odb"rech n je po et hodnot zahrnutých do výpo tu
Obvykle se geometrický pr%m"r po tu somatických bun"k po ítá ze 6 stanovení v posledních t$ech m"sících. Závazná limitní hodnota [400 . 103 . ml-1], jakož i zp%sob jejího stanovení vyplývá z legislativy Evropské unie (COMMISSION REGULATION (EC) No 1662/2006): Kritéria pro syrové mléko 3. (a) (i) Syrové kravské mléko: Celkový po et mikroorganism% 30 oC (v ml) ) 100 000 (*) Po et somatických bun"k (v ml) ) 400 000 (**) (*) Klouzavý geometrický pr%m"r za období dvou m"síc% s nejmén" 2 vzorky za m"síc; (**) Klouzavý geometrický pr%m"r za období t$í m"síc% s nejmén" 1 vzorkem za m"síc pokud kompetentní autorita nestanoví jiný metodický postup se z$etelem na sezónní prom"nlivost produkce. (ii) Syrové mléko jiných druh%: Celkový po et mikroorganism% 30 oC (v ml) ) 1 500 000 (*) (b) Pokud je toto mléko ur eno pro výrobu produkt% ze syrového mléka: Celkový po et mikroorganism% 30 oC (v ml) ) 500 000 (*) (*) Klouzavý geometrický pr%m"r za období dvou m"síc% s nejmén" 2 vzorky za m"síc. 4. S p$ihlédnutím k Sm"rnici 96/23/EC producenti a prodejci musí zajistit, aby syrové mléko nebylo obchodováno pokud: (a) obsahuje rezidua antibiotik a jiných látek uvád"ných v Dodatku I a III (EEC) No 2377/90 (1), nebo
7
Na$ízení
(b) pokud celková rezidua antibiotických látek p$ekra ují maximální povolené limity. 5. Jestliže syrové mléko nespl!uje uvedená ustanovení, obchodující s mlékem musí informovat kompetentní autoritu a p$ijmout opat$ení k náprav". Následující graf demonstruje distribuci etnosti stád podle t$íd po tu somatických bun"k v bazénových vzorcích mléka (IDF, 1997).
Graf vyzna uje nejen celostátní geometrický pr%m"r a aritmetický pr%m"r, nýbrž i aritmetický pr%m"r geometrických pr%m"r%, tedy parametr, který se v souladu s doporu ením Mezinárodní mléka$ské federace používá k mezinárodním statistickým analýzám. Po et somatických bun"k v bazénových vzorcích mléka je významným jakostním znakem syrového mléka proto, že nep$ímo odráží funk ní zp%sobilost mlé ných žláz dojnic k produkci mléka k lidské výživ". S r%stem po tu somatických bun"k v syrovém mléce dochází k významným zm"nám smyslových vlastností, chemického složení a fyzikálních vlastností mléka. Tím je narušena technologická zpracovatelnost syrového mléka (viz samostatná p$ednáška). Doporu"ení pro prezentaci hodnot po"tu somatických bun#k Jak vyplývá z p$edešlých graf% zobrazujících distribuci etnosti podle t$íd po tu somatických bun"k, je rozložení tohoto parametru pravostrann" vychýlené, tedy nemá normální Gaussovo rozložení. To p$ináší komplikace p$i statistickém zpracování t"chto dat, jakožto i p$i vývoji algoritm% zpracování t"chto dat k operativnímu $ízení. Proto Mezinárodní mléka$ská federace (IDF, 1997) doporu uje logaritmickou transformaci t"chto dat, nebo# ta vykazuje normální rozložení. To demonstruje následující graf.
8
Tím se dosáhne lepší korelace k r%zným prom"nným, které jsou významné pro konstrukci algoritm% operativního $ízení chovatelské práce. Nap$íklad ke stanovení ztrát v produkci mléka, k p$edpov"di procentického obsahu kaseinu, k p$edpov"di a pravd"podobnosti pozitivních bakteriologických nález% u dojnic ve stád", k opakovatelnosti v heritabilit" a k p$edpov"di po tu somatických bun"k v bazénových vzorcích. Proto se zavád"jí následující parametry prezentace hodnot po tu somatických bun"k: Geometrický pr%m"r nebo pr%m"r hodnot logaritmu po tu somatických bun"k se sm"rodatnou odchylkou. Pr%m"r a interval spolehlivosti logaritmicky transformovaných dat a jejich zp"tná konverze na p%vodní data. Procentuální vyjád$ení distribuce etnosti v dekadicky volených t$ídách po tu somatických bun"k. Limity po tu somatických bun"k pro percentuální dekadické t$ídy. Metody stanovení po"tu somatických bun#k Tyto metody lze v zásad" d"lit na: Laboratorní: P$ímé: Mikroskopické: Elektronické: Nep$ímé:
P$ímá mikroskopická metoda Po íta e ástic Fluorescen ní po íta e Pr%tokové cytometry DNA stanovení Viskozimetrie 9
Stájové: Whiteside test California mastitis test Mastitis test-NK Direct cell counter Uvedené schéma uvádí jen nejznám"jší metody. V následujícím se omezíme pouze na uvedení principu jednotlivých metod a možností jejich využití. P$ímá mikroskopická metoda (&SN EN ISO13366-1: 1998). Spo ívá v tom, že se konstantní mikroobjem mléka rovnom"rn" rozet$e na konstantní plochu podložního skla. Po zaschnutí se nát"r obarví a mikroskopuje. V požadovaném po tu zorných polí se stanoví po et bun"k. Ten se pak p$epo te na objem 1 ml mléka. K tomu je t$eba znát faktor mikroskopu, který udává kolika bu!kám v 1ml mléka odpovídá jedna bu!ka zjišt"ná v náhodn" zvoleném zorném poli. P$esto, že tato metoda byla navržena Precsottem a Breedem již v roce 1910, z%stává dosud referen ní metodou pro standardizaci stanovení po tu somatických bun"k na elektronických po íta ích (p$i sdružených testech laborato$í, p$i výrob" bun" ných standard - EN ISO13366-2: 2006). Elektronické stanovení na po"íta"ích "ástic (&SN EN ISO13366-2: 1998). P$ed vlastním stanovením je t$eba vzorek mléka fixovat, aby se zabránilo cytolýze p$i dispergaci tukových kapének detergentem. Dispergace tukových kapének je nezbytná, protože by p$i normální velikosti kapénky interferovaly se somatickými bu!kami. Vlastní princip p$ístroje spo ívá v tom, že konstantní objem mléka prochází kapilární tryskou napln"nou a pono$enou do elektrolytu. Uvnit$ a vn" kapiláry jsou umíst"ny elektrody, mezi kterými se vytvá$í elektrické pole. Pr%chod každé jednotlivé bu!ky naruší proudov" toto pole. Vzniklé impulzy se elektronicky ítají. Po et somatických bun"k se zobrazuje na displeji. Tato metoda byla navržena v šedesátých letech minulého století. Používá se dosud, i když je vytla ována po íta i využívajícími fluorescen ní mikroskopii. Elektronické stanovení na elektronických po"íta"ích využívajících fluorescen"ní mikroskopii (EN ISO13366-2: 1998). Tato metoda pracuje na principu fluorescen ního barvení jaderné DNA somatických bun"k. Konstantní objem mléka se po automatickém obarvení a na$ed"ní nanáší kapilární tryskou na obvod rotujícího disku. Vzniká lineární nát"r, který prochází pod objektivem a je p$itom ozá$en monochromatickým sv"tlem. Záblesky emitované fluorescence se vracejí p$es objektiv a fotobu!kou m"ní na elektrický impuls. Po automatickém p$epo tu se výsledný po et zobrazuje na displeji p$ístroje. Nát"r po pr%chodu pod objektivem se smývá a disk leští a suší, aby byl na n"j znovu nanášen nát"r. Metoda vznikla v sedmdesátých letech minulého století, doznala širokého uplatn"ní. Pr%toková cytometrie (EN ISO13366-2: 2006). V druhé polovin" devadesátých let minulého století dochází k zavedení principu pr%tokové cytometrie i do stanovení po tu somatických bun"k. Vzorek mléka automaticky obarvený fluorescinem je vst$ikován do laminárn" proudícího transportního media. Proud unášející jednotlivé bu!ky je ozá$en paprskem koherentního monochromatického sv"tla. Záblesky emitované fluorescence se fotobu!kou m"ní na elektrický impuls. Po automatickém p$epo tu je po et bun"k zobrazen na displeji. Metoda se rychle ší$í. Je uznána Mezinárodní mléka$skou federací (Standard IDF 148-2: 2006). Stanovení DNA. Vychází z faktu, že mezi po tem somatických bun"k a množstvím DNA uvoln"né po jejich lýze existuje vysoká pozitivní korelace. Stanovení DNA se provád"lo bu'to v plném mléce, nebo uvoln"ním DNA ze somatických bun"k zachycených filtrací na miliporfiltru. 10
K vlastnímu stanovení obvykle sloužila difenylaminová reakce a spektrofotometrické stanovení. Metody vznikly v padesátých a šedesátých letech minulého století. Pro nízkou citlivost a zna nou pracnost se k rutinní diagnostice již nepoužívají. Viskozimetrie. Podstatou je zjišt"ní, které publikovali v r. 1957 Schalm a Noorlander. DNA uvoln"ná ze somatických bun"k vytvá$í s detergenty viskózní reak ní sm"s. Viskozita sm"si je v pozitivní korelaci s po tem somatických bun"k. K test%m byla použita bu' pr%toková viskozimetrie, zavedená v šedesátých letech (Brabant mastitis test, Wisconsin mastitis test, nebo reoviskozimetrie (Ruakura test, kulové viskozimetry). V devadesátých letech minulého století dosáhly širšího uplatn"ní zejména kulové viskozimetry. Používaly se v chovatelské diagnostické praxi. Whiteside test. Whiteside v roce 1939 popsal fenomén, který byl pozd"ji ozna en jeho jménem. Jeho podstatou je vznik vlo ek v reak ní sm"si mastitidou zm"n"ného mléka s 1M NaOH. Tento princip byl použit v rychlém testu, který však byl provád"n p$evážn" v laboratorních podmínkách. Tím si lze vysv"tlit fakt, že Whiteside fenomén je nejvýrazn"jší u vzork% skladovaných v chladu a jeho podstatou je agregace tukových kapének. Test doznal rozší$ení hlavn" v USA, kde se používal ješt" v sedmdesátých letech minulého století. Podstatn"jší však je, že na n"j navázali Schalm s Noorlanderem (1957) v práci, jejímž výsledkem byl California mastitis test. California mastitis test (CMT). Jak již bylo uvedeno DNA uvoln"ná ze somatických bun"k vytvá$í s detergenty viskózní reak ní sm"s. Zmín"ní auto$i navrhli test jako klasický stájový (cow side) test. Mléko nejlépe oddojené po odstran"ní prvních st$ik% se na diagnostické palet" smíchá stejným dílem s reagens. To obsahuje detergent a barevný indikátor zm"ny pH. Test se hodnotí semikvantitativn" v p"ti stupních podle stupn" viskozity reak ní sm"si. Byla navržena i kvantifikace tohoto testu výpo tem tzv. irita ního indexu stáda, což je sou et bodových hodnot stup!% pozitivity vyšet$ených krav, d"lený jejich po tem. M%že nabývat hodnot 0 až 16. Test byl navržen v padesátých letech minulého století a doznal celosv"tového rozší$ení. Používá se široce dosud.
11
Stupn# pozitivity CMT a rozp#tí po"tu somatických bun#k ve "tvr&ových vzorcích mléka CMT
Charakteristika
Bodová hodnota testu 0
Reak ní sm"s v diagnostické palet" P$i pohledu shora z%stává tekutá. P$i nakláp"ní od sebe a k sob" je slab" slizovitá Výrazn" slizovitá, netvo$í však gel. P$i pohybu s paletou m%že reakce mizet Tvo$i gel, který se shlukuje uprost$ed. P$i kroužení se udržuje p$í okraji misky. Ustáním v pohybu se rozprost$e po dnu. Vytvo$ený gel prominuje nad úrovní dna i po ustání krouživého pohybu. Zjevn" zm"n"ný sekret
0,5 1 2 3 4 Schalm, et al. ,1971
Rozp"tí po tu somatických bun"k [.103 . ml-1] 0 - 200 15 - 200 400 -1500 800 - 5000 Obvykle nad 5000
Shoda a neshoda výsledk% CMT podle limitní hodnoty po"tu somatických bun#k CMT Po et somatických Po et tvrtí bun"k positivní (* 1) negativní (< 1) 3 -1 [.10 . ml ] Falešn" pozitivní Pravdiv" negativní ) 100 861 31,6 % 68,4 % Pravdiv" pozitivní Falešn" pozitivní 565 > 100 95,2 % 4,8 8 Hanann, J. et al., 2005 Z tabulky je z$ejmé, že diagnostická ú innost CMT pro rozlišení limitní hodnoty po tu somatických bun"k (100 . 103 . ml-1) iní pouze 63,2 %. Tato ú innost CMT byla zjišt"na i jinými autory. Shoda a neshoda výsledk% CMT podle kategorií zdravotního stavu mlé"ných žláz Po et somatických bun"k [.103 . ml-1] ) 100
> 100
Patogeny mlé né žlázy zjišt"ny
nezjišt"ny
Normální sekrece * 1 = 24,9 %; < 1 = 75,0 % Nespecifický zán"t * 1 = 93,2 %; < 1 = 6,8 %
Latentní infekce * 1 = 51,1 %; < 1 = 48,9 % Subklinická mastitida * 1 = 96,3 %; < 1 = 3,7 %
Hanann, J. et al., 2005 Z tabulky je z$ejmé, že CMT diagnostikuje s vysoce ú inn" zán"tlivý proces mlé né žlázy, nicmén" jeho velkou nevýhodou je vysoké procento falešných pozitivit u vzork% ze zdravých mlé ných žláz. Proto se v posledních letech uplat!uje jako kritérium hodnocení zdravotního stavu mlé ných žláz dojnic více po et somatických bun"k v individuálních (konvových) vzorcích mléka krav.
12
Prvotní úsp"ch a široké rozší$ení CMT vedly $adu autor% a výrobc% k modifikacím CMT. Jednou z takových je Mastitis test - NK, navržený v šedesátých letech minulého století Neumanem a Kud"lkou. Mastitis test - NK. Funguje na stejném principu jako (CMT). Jeho složení i zp%sob hodnocení byly modifikovány. Pro kvalitní provedení testu je t$eba dodržovat optimální termín vyšet$ení. Jak již bylo uvedeno, nejlépe v regulérním ase dojení, ze vzork% odebraných bezprost$edn" po oddojení prvních st$ik% mléka. Pokud se test provádí mimo tuto optimální dobu, je možné k n"mu p$istoupit až 5 hodin po skon eném dojení. Jinak dochází k nespecificky vyšším pozitivitám. Vyšet$ení v kolostrálním období a v období zaprahování, kdy sekret obsahuje zvýšený po et bun"k, má tento test orienta ní význam. Vyšet$ení má být provedeno komparací nález% na jednotlivých tvrtích. Na základ" poznání mechanismu vzniku stup!% pozitivity jsme navrhli klí k posuzování MT-NK (Ryšánek a Renda, 1971). Stupn# pozitivity MT-NK a rozp#tí po"tu somatických bun#k ve "tvr&ových vzorcích mléka MT-NK
Charakteristika
Bodová hodnota testu
Reak ní sm"s v diagnostické palet" Žádný zvln"ný film na dn" misky 0 p$i nakláp"ní v šikmém pohledu. Zvln"ný film na dn" misky 0,5 p$i nakláp"ní v šikmém pohledu. Reakce m%že mizet. Závojovitý film na dn" misky 1 p$i nakláp"ní misky v šikmém pohledu. P$i kroužení se reak ní sm"s sbaluje 2 uprost$ed. Ustáním v pohybu se rozprost$e po dnu. Reak ní sm"s tvo$í na dn" misky reliéf, který se shlukuje uprost$ed a 3 prominuje nad úrove! dna i po ustání krouživého pohybu. 4 Zjevn" zm"n"ný sekret * Ryšánek a Renda, 1971; Delogaritmovaná data.
Rozp"tí po tu somatických bun"k [.103 . ml-1]* 38 - 140 56 - 360 112 -1112 422 - 5972
1422 - 9300
Z dosud uvedených údaj% je z$ejmé, že v laboratorní diagnostice se užívají metody p$ímého stanovení po tu somatických bun"k v mléce, ve stájových podmínkách p$evážn" nep$ímé metody. Výjimku tvo$í p$ímé po íta e bun"k, pracující na novém principu. Tyto po íta e byly zavedeny po átkem 21. století. Nový princip popíšeme na základ" dostupné firemní literatury (ChemoMetec A/S, Dánsko). NucleoCounter SCC-100 je fluorescen ním mikroskopem integrovaným s ástí ur enou pro analýzu obrazu, která je novou aplikací analýzy obrazu, ur enou v tomto p$ípad" pro po ítání somatických bun"k v mléce. P$ístroj je vybaven portem pro tiskárnu, USB portem, portem pro napájení stejnosm"rným proudem, klávesnicí a displejem.. Na elné ploše p$ístroje je místo pro zasunutí speciální kazety. Kazeta je klí ovou sou ástí p$ístroje. Má n"kolik unikátních rys%. Fluorescen ní barvivo - propidium iodid - je fixováno na vnit$ek pr%to ných kanálk% kazety. 13
Když se kazeta plní nasáváním 50 µl sm"si mléka a reagens, fluorescen ní barvivo se rozpouští a barví jádra somatických bun"k. Jakmile se kazeta zasune do p$ístroje, vzorek o objemu 2 µl je automaticky p$emíst"n do m"$ící kom%rky, ve které je zaznamenán obraz fluoreskujících bun"k. Po analýze z%stává vzorek mléka i fluorescen ní barvivo uvnit$ kazet, což umož!uje neškodnou likvidaci. V kazet" je obsažen jak pr%to ný systém, tak m"$ící komora, proto p$ístroj nevyžaduje žádné išt"ní, ani údržbu, ani kalibraci po celou dobu životnosti. Je tomu tak rovn"ž proto, že zdrojem excita ního sv"tla jsou diody (LED) s extrémní stabilitou zá$ení, prokazateln" po dobu životnosti p$ístroje. Mikroskopická ást p$ístroje je vybavena zeleným excita ním a erveným emisním filtrem. Emitované fluorescen ní sv"tlo je zaost$eno do detektoru, CCD kamery. Další klí ovou vlastností p$ístroje je velmi malé mikroskopické zv"tšení, které umož!uje obraz velkého pole mnohokrát p$esahujícího zorné pole b"žného mikroskopu. Tak jsou po ítány všechny bu!ky v analyzovaném mikroobjemu vzorku. Jedinou nevýhodou p$ístroje je limitované rozp"tí pro stanovení po tu bun"k, které iní 10 .103 až 2000 . 103 bun"k v ml mléka. P$ístroj prokázal vynikající p$esnost a vyhovující opakovatelnost stanovení. Na obdobném principu pracují i další p$ístroje, jiné firemní provenience. Direct Cell Counter (DCC) Je p$enosný, bateriemi napájený p$ístroj. Mlé ný vzorek ur ený k analýze je odebírán do speciální kazety. Zma knutím pístu je do kazety nasát definovaný objem vzorku, p$i emž každá kazeta má kalibra ní kód, který p$ístroj p$i m"$ení rozlišuje. Mléko je protla eno systémem kanálk% a tak promícháno se speciálním reagens, které obarví jádro každé somatické bu!ky. Takto zpracovaný vzorek je pak vystaven excita nímu sv"tlu. Dochází k emisi fluorescen ních signál%, jejichž obraz je zaznamenáván kamerou. Objem vzorku iní p$ibližn" 60 µl, m"$í se 1 µl obarveného vzorku. P$ístroj detekuje po et bun"k na displeji v rozp"tí bun"k od 10 do 4 000 v µl. P$esnost p$ístroje odpovídá p$esnosti p$ístroj% Fossomatic (r² = 0,988). Opakovatelnost vyjád$ená koeficientem variability iní 8 % na hladin" 400 . 103 v ml mléka, 12 % na hladin" 100 . 103 v ml mléka. Analýza trvá 45 sekund. Popsaný princip p$ímého stanovení po tu somatických bun"k dosáhl uplatn"ní v systému robotizovaného dojení (2007 DeLaval VMS milking robot): DeLaval online cell counter OCC umož!uje stanovit po et somatických bun"k u každé z dojnic, b"hem každého dojení. Získávají se tak v reálném ase data, odrážející zdravotní stav mlé ných žláz. Proto výrobce integroval tento diagnostický prost$edek do nového programového vybavení k operativnímu $ízení produkce mléka v etn" managementu zdraví (2007 version of the DeLaval dairy management software). Za necelých 100 let se tak dovršila cesta od p$ímého stanovení po tu somatických bun"k na mikroskopickém podložním skle k on-line stanovení po tu v dopravní cest" mléka p$i robotizovaném dojení. Výzkum a vývoj nových princip% stanovení po tu somatických bun"k se nezastavuje, naopak. V r. 2007 byl publikován nový princip stanovení založený na kapilárním proud"ní v mikrofluidní kom%rce s hydrofiln" modifikovaným povrchem. Mikrofluidní technologie s mikro ipy k jednorázovému použití umož!uje extrémn" snížit spot$ebu reagencií a zavádí tak reagencie k okamžitému použití (ready-to-use reagents). Otevírají se tak dosud neznámé možnosti (Moon et al. 2007). Princip byl aplikován v p$ístroji ozna eném C-reader system. C-reader system Na základ" testování 875 sm"sných vzork% mléka C-reader vykázal vysokou korelaci (R2 = 0.935 to 0.964) a nízkou pr%m"rnou diferenci logaritmicky transformovaných dat po tu somatických bun"k (–0.088 až 0.004) ve srovnání se t$emi komer n" dostupnými p$ístroji (Fossomatic 4000, Somacount 150, Somascope). 14
Lze proto p$edpokládat, že v budoucnu budou nabývat uplatn"ní metody automatického, p$ímého stanovení po tu somatických bun"k, metody nep$ímého stanovení budou na ústupu. Vybrané literární prameny Concha C. Cell types and their immunological function in bovine mammary tissues and secretions – A review. Nort Ve. Med 1986;38:257-272. Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft (DVG): Leitlinien zur Bekämpfung der Mastitis des Rindes als Bestandsproblem. 3. Aufl., Gießen, 1994 IDF Internationa Dairy Federation: Fecommendation for presenattion of mastitis related data. Part 1: Somatic cell count. Bulletin of International Dairy Federation No 321. 1997. s. 10-15. Moon JS, Koo HC, Joo YS, Jeon SH, Hur DS, Chung CI, Jo HS, Park YH.: Application of a new portable microscopic somatic cell counter with disposable plastic chip for milk analysis. J. Dairy Sci. 2007 90, 2253-2259. NMC, National Mastitis Council: The Value and Use of Dairy Herd Improvement Somatic Cell Count. Verona, WI, USA, 2004. http://www.nmconline.org/dhiscc.htm Hamann, J.: Definition of the Physiological cell count treshold based on changes in milk composition. Mastitis Newsletter 25, 2003, 9-12. Hamann, J., Redetzky, R., Grabowski, N.Th.: Diagnostic Potential of the California Mastitis Test to Detect Subclinical Mastitis. Mastitis Newsletter 26, 2005, 15-21. Lee Ch. S., Wooding F.B.P., Kemp P. Identification, properties, and differential counts of cell populations using electron microscopy of dry cows secretions, colostrum and milk from normal cows. J Dairy Res 1980, 48, 39-50. Miller RH, Paape MJ, Fulton LA.: Variation in milk somatic cells of heifers at first calving. J Dairy Sci., 1991, 74, 3782-3790. Paape, M.J., Bannermann, D.D., Zhao, X., Lee, J.W.: The bovine neutrophil: Structure and function in blood and milk. Vet. Res.,34, 2003, 597-627. Ryšánek, D., Renda, V.: Mechanismus reakce Mastitis testu – NK a zp%sob posuzování jeho pozitivity. Vet. Med Praha, 16, 1971, 405-414. Schalm, O.W., Carroll, I.G., Jain, E.C.: Bovine mastitis. Philladelphia 1971. s. 139. Tolle, A.: Mastitis – The disease in relation to control methods. In: Eds: Dodd, F.H., Griffin, T.K., Kingwill, R.G.: Proceeding of the IDF Semina on Mastitis control, 1975. International Dairy Federation, Bruxelles. s. 3-15.
15
Vybrané odborné "lánky autora k tématu Ryšánek, D., Renda, V., Pospíšil, J.: Mastitis test - NK a jeho posuzování. Veteriná$ství 22, 1972, 488-489. Ryšánek,D., Babák, V., Šedivá, I.: Využití po tu somatických bun"k k chovatelské prevenci mastitid. In Problematika Prvovýroby mléka XX. Pod"brady 1997. s. 79-88. Ryšánek, D.:Po et somatických bun"k mléka jako prost$edek monitoringu a tlumení mastitid. Veteriná$ství 55, 2005, 349-354. Poslední aktualizace: Kv"ten 2007 Copyright (c) Dušan Ryšánek. All rights reserved.
16
