SLEDOVÁNÍ EXPRESE ZNAKU CD38 CYTOMEGALOVIROVÉ INFEKCE U PACIENTŮ PO ORGÁNOVÉ TRANSPLANTACI

MASARYKOVA UNIVERZITA LÉKAŘSKÁ FAKULTA ÚSTAV KLINICKÉ IMUNOLOGIE A ALERGOLOGIE

SLEDOVÁNÍ EXPRESE ZNAKU CD38 NA CD8+ T- LYMFOCYTECH V DIAGNOSTICE CYTOMEGALOVIROVÉ INFEKCE U PACIENTŮ PO ORGÁNOVÉ TRANSPLANTACI

Doktorská dizertační práce

Vedoucí dizertační práce:

Autor:

Prof. MUDr. Jiří Litzman, CSc.

Mgr. Olga Tichá

Brno 2012

Jméno a příjmení autora: Mgr. Olga Tichá Název dizertační práce: Sledování exprese znaku CD38 na CD8+ T-lymfocytech v diagnostice cytomegalovirové infekce u pacientů po orgánové transplantaci Pracoviště:

Ústav klinické imunologie a alergologie Lékařské fakulty Masarykovy

univerzity a Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně Vedoucí dizertační práce: Prof. MUDr. Jiří Litzman, CSc. Rok obhajoby dizertační práce: 2012

Souhrn: Pacienti po transplantaci solidních orgánu jsou v prvních měsících po transplantaci nejvíce ohroţeni infekčními a rejekčními komplikacemi. Jedním z běţných oportunních patogenů, které nemocné mohou ohrozit, je cytomegalovirus. Cílem této práce bylo stanovení klinického významu sledování procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů pomocí průtokové cytometrie jako nástroje pro detekci aktivace imunitního systému v průběhu CMV infekce. Analýza byla provedena na souboru pacientů po transplantaci ledvin (n = 269) a transplantaci jater (n = 162) v době jejich hospitalizace. Z těchto nemocných byla diagnóza cytomegalovirové infekce stanovena u 12 osob po transplantaci ledviny (4,5%) a u 10 (6,2%) po transplantaci jater. Při vyuţití arbitrární hranice 20% CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů a CMV diagnózy jako referenčního parametru byla stanovena senzitivita metody 100% pro oba soubory pacientů. Pro soubor pacientů po transplantaci ledviny byla specificita testu stanovena 91% procent, u pacientů po transplantaci jater 48%. Metoda stanovení procenta CD38high z CD3+CD8+ vykazovala vysokou negativní prediktivní hodnotu – 100% v obou souborech pacientů; pozitivní prediktivní hodnoty byly nízké – 34% u pacientů po transplantaci ledvin a 11% po transplantaci jater. U 4/12 pacientů po transplantaci ledvin a 6/10 pacientů po transplantaci jater nebyl detekován počet kopií CMV DNA ≥1000 kopií/ml periferní krve. Diagnóza CMV infekce byla zaloţena na jiných klinických či laboratorních příznacích a procento CD38 high z CD3+CD8+ lymfocytů přesahující arbitrární limit podpořilo rozhodnutí pro zahájení antivirové terapie. U obou souborů pacientů s CMV infekcí byly nalezeny statisticky významná korelace mezi sledovaným procentem CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů a procentem HLA-DR+ z CD3+, procentem CD8+ z CD3+ lymfocytů, procentem CD4+ z CD3+ lymfocytů, poměrem CD3+CD4+/CD3+CD8+ lymfocytů a absolutním počtem leukocytů v krvi. Tyto parametry jsou typickými imunologickými ukazateli virové infekce a jejich korelace podporují smysl vyuţití sledování procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů pro diagnostiku CMV infekce. Monitorování procenta CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů pomocí průtokové cytometrie je rychlá a jednoduchá metoda s vysokou reprodukovatelností a jeví se, vzhledem ke svému komplementárnímu charakteru, vhodnou jako doplněk jiţ konvenčních a rutinně vyuţívaných imunologických a virologických metod, obzvláště u pacientů v riziku orgánově specifických CMV komplikací. Klíčová slova: cytomegalovirus, transplantace solidních orgánu, CD38

Name of the author: Mgr. Olga Tichá The title of the dissertation work: Monitoring of expression of CD38 on CD8+ lymphocytes in diagnosis of cytomegalovirus infection in patients after organ transplantation Workplace:

Department of Clinical Immunology and Allergology, St.Anne’s Faculty

Hospital, Masaryk University in Brno Dissertation work facilitator: Prof. MUDr. Jiří Litzman, CSc. Year of defence of dissertation work: 2012 Abstract: In the first months the patients after solid organ transplantations are endangered mainly by infectious complications and graft rejection. Cytomegalovirus is one of the most significant common opportunistic pathogens, which can cause life threatening complications to the transplant patients. The goal of this study was to evaluate clinical significance of monitoring CD38high of CD3+CD8+ T-lymphocytes estimated by flow cytometry as a tool for detection of immune system activation during a CMV infection. Analysis was performed on group of patients after renal (n=269) and liver (n=162) transplantation during their hospitalization. The test was considered positive if the percentage of CD38high of CD8+ cell exceeded 20%. During post-transplantation hospitalization, the diagnosis of CMV infection was established in 12 (4,5%) patients with transplanted kidney and 10 (6,2%) with transplanted liver. Using clinical decision of treatment of the CMV infection as a reference value, the sensitivity of monitoring percentage of CD38high of CD3+CD8+ T-lymphocytes was 100% in both groups of patients. The test specificity was determined at 91% for the group of patients after renal transplantation and 48% for the patients after liver transplantation. Monitoring percentage of CD38high of CD3+CD8+ showed high negative predictive value – 100% in both groups of patients; but positive predictive value was low – 34% in patients after kidney transplantation and 11% in patients after liver transplantation. In 4/12 patients after kidney transplantation and 6/10 patients after liver transplantation, the amount of copies of CMV DNA ≥1000 copies/ml of peripheral blood was not detected. The diagnosis of CMV infection was based on clinical and laboratory signs and the percentage of CD38high of CD3+CD8+ T-lymphocytes above arbitrary limit supported the decision for antiviral treatment initiation. In both groups of patients with CMV infection statistically significant correlation between percentage of CD38high of CD3+CD8+ lymphocytes and a percentage of HLA-DR+ of CD3+, percentage of CD8+ of CD3+ lymphocytes, percentage of CD4+ of CD3+ lymphocytes, CD3+CD4+/CD3+CD8+ lymphocyte ratio and absolute leucocyte count in peripheral blood was found. These parameters are typical immunologic markers of viral infection and their correlations support significance of monitoring the CD38high of CD3+CD8+ T-lymphocytes for CMV infection diagnosis in post-transplantation period. Monitoring percentage of CD38high of CD3+CD8+ lymphocytes using the flow cytometry is a fast and simple method with high reproducibility and it seems that because of its complementary character it can be useful as an additional method to the conventional and routinely used immunologic and virologic tests mainly in patients in risk of tissue-invasive CMV disease. Keywords: cytomegalovirus, solid organ transplantation, CD38

Prohlašuji, ţe jsem tuto doktorskou dizertační práci vypracovala samostatně pod vedením školitele Prof. MUDr. Jiří Litzmana, CSc. a uvedla v seznamu literatury všechny pouţité literární a odborné zdroje.

V Brně dne

Mgr. Olga Tichá

Poděkování Ráda

bych

v první

řadě

poděkovala

mému

školiteli

MUDr.

Jiřímu

Litzmanovi, CSc. za odborné vedení, podporu v celém období studia, cenné rady a

připomínky

a

také

umoţnění

mé

stáţe

na

Ruprecht-Karls-Universität

v Heidelbergu. Mé poděkování patří také RNDr. Martině Štouračové za poskytnutí dat, uvedení do problematiky a podnětné rady při vzniku této práce. V neposlední řadě děkuji také všem kolegům a celému kolektivu Ústavu klinické imunologie a alergologie LF Masarykovy univerzity a FN u sv. Anny v Brně za vytvoření příjemných pracovních podmínek a zázemí v době mého studia.

Obsah

1. Úvod ..................................................................................................................... 8 2. Komplikace pacientů po transplantaci solidních orgánů ....................................... 9 2.1

Rejekční komplikace ...................................................................................... 9

2.1.1

Hyperakutní humorální rejekce ............................................................ 10

2.1.2

Akutní buněčná (celulární) rejekce ...................................................... 10

2.1.3

Chronická rejekce ................................................................................ 11

2.2

Infekce po transplantacích solidních orgánů ................................................ 11

2.2.1

Bakteriální infekce ............................................................................... 13

2.2.2

Plísňové infekce................................................................................... 14

2.2.3

Virové infekce ...................................................................................... 15

3. Cíle práce ........................................................................................................... 37 4. Materiál a metody ............................................................................................... 38 4.1

Pacienti ........................................................................................................ 38

4.2

Imunosupresivní terapie ............................................................................... 39

4.3

Diagnostika CMV infekce ............................................................................. 41

4.4

CMV PCR .................................................................................................... 41

4.5

CMV serologie ............................................................................................. 42

4.6

Stanovení T-lymfocytárních subpopulací ..................................................... 42

4.7

Další sledované parametry .......................................................................... 45

4.8

Statistická analýza ....................................................................................... 45

5. Výsledky ............................................................................................................. 46 Výsledky I. – pacienti po transplantaci ledvin ......................................................... 46 Výsledky II. – pacienti po transplantaci jater........................................................... 59 6. Diskuze ............................................................................................................... 73 7. Závěr................................................................................................................... 83 8. Seznam zkratek .................................................................................................. 85

9. Seznam pouţité literatury ................................................................................... 87 10. Vlastní publikační činnost ................................................................................. 105 11. Přílohy............................................................................................................... 107

1. Úvod Transplantace solidních orgánů Pro řadu onemocnění je nahrazení selhávajícího orgánu transplantací jedinou moţnou terapií. Vysoká úspěšnost této léčebné moţnosti je důsledkem pokroků v chirurgických technikách, uchovávání orgánů, vylepšených antirejekčních terapií, pouţití imunosupresiv a efektivnějších antibiotik, které chrání před infekčními komplikacemi. V České republice se transplantují tyto solidní orgány: srdce, játra, ledvina, pankreas a plíce. Prvním transplantovaným orgánem byla v roce 1954 ledvina transplantovaná mezi jednovaječnými dvojčaty v Bostonu týmem pod vedením Josepha Murraye, který v roce 1990 obdrţel za svou práci na tomto poli Nobelovu cenu. První úspěšná transplantace ledviny v Československu se uskutečnila 21.3.1966 v Institutu klinické a experimentální medicíny v Praze. Ve světě se podle odhadů Světové zdravotnické organizace (WHO) provede ročně okolo 70 000 transplantací ledviny a 20 000 transplantací jater. V České republice podstoupí tento zákrok okolo 400 pacientů, přibliţně 100 pacientů pak transplantaci jater. V současné době je v České republice transplantace ledvin spojena s výborným jednoročním přeţíváním štěpů (90-93%) i nemocných (95%), u pětiletého období přeţívá 66% štěpů a 79% příjemců (Viklický et al., 2010). U jater se jednoroční přeţívání transplantovaných pacientů pohybuje mezi 90-92%, pětileté přeţívání mezi 81-84% dle transplantačních center.

Stránka | 8

2. Komplikace pacientů po transplantaci solidních orgánů Pacienti, kteří podstoupí transplantaci solidního orgánu, jsou vzhledem k rozsáhlému chirurgickému výkonu a imunosupresivní léčbě rizikovou skupinou. Nejvíce jsou ohroţeni rejekčními komplikacemi, bakteriálními, virovými a plísňovými infekcemi, které často nejsou za normálních podmínek pro imunokompetentního jedince patogenní a nezpůsobují závaţné onemocnění. Mezi další moţné komplikace patří například léková toxicita, nebezpečí lymfoproliferativního onemocnění nebo vedlejší účinky imunosupresivní terapie útlum kostní dřeně, cukrovka.

2.1

Rejekční komplikace

Častou komplikací při alogenních transplantacích je reakce imunitního systému příjemce na aloantigeny přijímaného orgánu či tkáně, kdy dochází k jeho poškození a ohroţení ţivota nemocného. Byla vyvinuta řada předtransplantačních vyšetření, imunosupresiv a specifických protilátek, které výskyt rejekčních komplikací, a to převáţně v peritransplantačním a krátkém potransplantačním období, výrazně sníţily nebo oddálily. Jsou rozlišovány tři základní typy rejekcí, které se liší svou dynamikou a různými mechanismy.

Stránka | 9

2.1.1 Hyperakutní humorální rejekce

Hyperakutní humorální rejekce se rozvíjí velmi rychle, do několika desítek minut, maximálně několika hodin po transplantaci. Jde o reakci imunitního systému příjemce

zprostředkovanou

příjemce předtransplantačně

aktivací

vytvořenými

komplementového

protilátkami

proti

systému

antigenům

dárce.

Nejčastěji jde o protilátky proti HLA (Human Leukocytes Antigens) I. třídy, méně často můţe jít i o inkompatibilitu v systému AB0. Protilátky, jeţ indukují humorální rejekci, bývají zpravidla izotypu IgG (imunoglobulin třídy G) a mohou spouštět komplementovou kaskádu klasickou cestou aktivace. Při spuštění kaskády dochází k uvolňování zánětlivých mediátorů a k aktivaci fibrinolytických a koagulačních systémů. Během několika minut po propojení oběhového systému příjemce s cévami zásobujícími transplantovaný orgán dochází k uzávěru cév transplantátu. Stanovit riziko hyperakutní rejekce při transplantaci solidního orgánu je moţné provedením cytotoxického kříţového testu. Při zvýšeném riziku hyperakutní rejekce bývá indikována plazmaferéza a anti-lymfocytární preparáty. 2.1.2 Akutní buněčná (celulární) rejekce

Akutní buněčná (celulární) rejekce se rozvíjí v průběhu dnů či týdnů po transplantaci orgánu. Je zprostředkována protilátkami a lymfocyty, které jsou namířeny proti HLA antigenům dárce. S endotelem štěpu reagují zejména alospecifické CD8+ T-lymfocyty, jejichţ cytolytický účinek je zaloţen především na působení perforinu a granzymů a na interakci mezi receptorem Fas (CD95)

Stránka | 10

a

Fas-ligandem

(CD95L)

vedoucí

k apoptóze.

Dochází

k masivní

infiltraci

transplantované tkáně makrofágy a CD4+ a CD8+ lymfocyty. K léčbě akutní rejekce jsou pouţívány vysoké pulzní dávky steroidů nebo anti-lymfocytární preparáty. Akutní rejekce je v 80-90% případů reverzibilní (Chinen et al., 2010). 2.1.3 Chronická rejekce

Chronická rejekce je dlouhodobým procesem nastupujícím měsíce aţ roky po transplantaci orgánu. Mechanismus chronické rejekce je zaloţen na buněčné i humorální sloţce imunitního systému příjemce. Hlavními rizikovými faktory chronické rejekce jsou neshoda v HLA antigenech dárce a příjemce a předchozí akutní rejekce. Proces chronické rejekce nebývá citlivý k léčbě a můţe vést k nutnosti další transplantace. Díky imunosupresivní léčbě se podařilo zvýšit mnoţství štěpů přeţívajících v delším časovém horizontu po transplantaci, dobu dlouhodobého přeţívání se ale výrazně prodlouţit zatím nepodařilo.

2.2 Infekce po transplantacích solidních orgánů

Pacienti

po

transplantaci

solidních

orgánů

jsou

v důsledku

uţívání

imunosupresivní léčby ohroţeni zvýšeným výskytem infekcí, které jsou významným faktorem pro morbiditu a mortalitu pacientů a mohou být asociovány s rejekcí orgánu (viz Obr. č. 1). Pro dobré přeţívání štěpu i příjemce je tedy důleţitá prevence, brzké stanovení diagnózy a cílená léčba infekčních komplikací. Základním kamenem je důkladné lékařské vyšetření příjemce a dárce orgánu – anamnéza, podrobné klinické a laboratorní vyšetření vylučující akutní nebo chronickou infekci. V perioperačním

Stránka | 11

a potransplantačním období, kdy je pacient po chirurgickém výkonu a kdy je imunosuprese pacientů největší a je nastavována její hladina, jsou pacienti ohroţeni mnoha faktory, jeţ mohou vést k infekční komplikaci (viz Tab. č. 1).

Konvenční

Nekonvenční nebo oportunní

Získané a perzistentní

nozokomiální

infekce

infekce

virové infekce HSV

nástup CMV infekce

CMV retinitida a kolitida

EBV, VZV, virus chřipky, RSV, adenovirus Papillomavirus hepatitida B nebo C

bakteriální Infekce z rány nebo katetru; pneumonie Nocardia Listerie; tuberkulóza

plísňové Pneumocystis Cryptococcus

Aspergillus Candida

parazitické

Strongyloides Toxoplasma Leishmania Trypanosoma cruzi

Měsíce po transplantaci

Obr. č. 1 Diagram nástupu infekčních komplikací po transplantaci solidních orgánů. CMV cytomegalovirus, EBV – virus Epsteina-Barrové, HSV – virus herpes simplex, PTLD - potransplantační lymfoproliferativní onemocnění, RSV – respirační syncytiální virus, VZV – varicela zoster virus. Upraveno podle Fishman et al, 1998.

Stránka | 12

špatný klinický stav pacienta před transplantací předchozí imunosupresivní léčba

Předtransplantační rizikové faktory

nerozpoznaná nebo neadekvátně léčená infekce příjemce kolonizace příjemce rezistentními patogeny uţívání antibiotik v nedávném období častý pobyt v nemocnici faktory související s explantací či implantací štěpu prodlouţený operační čas, prodlouţena teplá či studená ischemie s poškozením štěpu

Perioperační rizikové faktory

krvácení se vznikem hematomu perioperační bakteriémie mikrobiální kontaminace reperfúzního roztoku či orgánu nepoznaná infekce dárce dysfunkce štěpu komplikovaný pooperační stav (hyperglykémie, jaterní poškození, respirační insuficience, opakované krevní převody,…) infekce viry (CMV, HHV, respirační viry, …) prodlouţená doba pouţití centrálních cévních katétrů, močových katétrů, stentů či

Potransplantační rizikové faktory

nefrostomií stenóza vývodných močových cest, močové píštěle hematom, lymfokéla v okolí transplantovaného orgánu prodlouţená doba umělé plicní ventilace přítomnost leukopenie, trombocytopenie, hypogamaglobulinémie prodlouţená antibiotická léčba se vznikem rezistentních nozokomiálních patogenů pulzy kortikosteroidů, polyklonálních protilátek a jiné zvýšení imunosupresivní léčby

Tab. č. 1 Rizikové faktory, které mohou vést k infekčním komplikacím po transplantaci solidního orgánu. Upraveno podle Viklický et al., 2008.

Pokud dojde přes všechna opatření k infekční komplikaci, je při medikaci nezbytné brát v úvahu moţné interakce antimikrobiálních léčiv s imunosupresivy a jinými léky, délku expozice léčivům a jejich vedlejší účinky (často nefrotoxicita), specifičnost terapie (Tolkoff-Rubin et al., 2000). 2.2.1 Bakteriální infekce

Nejčastějšími infekčními komplikacemi po transplantaci solidního orgánu jsou infekce bakteriálního původu. Typickými místy, z nichţ infekce vychází, jsou močové cesty, operační rána, plíce a gastrointestinální trakt. Po prvním měsíci se v důsledku imunosupresivní léčby začnou objevovat oportunní infekce. Bakteriální infekce Stránka | 13

nastupující v těsném pooperačním období odráţejí nosokomiální infekce daného zdravotnického zařízení. Bakteriálními patogeny ohroţujícími pacienty po transplantaci jsou nejčastěji bakterie z čeledi Enterobacteriaceae – zejména rod Klebsiella, Pseudomonaceae – zejména

bakterie

Pseudomonas

aeruginosa,

dále

z

rodu

Staphylococcus,

Mycobacterium, Enterococcus, Listeria monocytogenes, Mycoplasma hominis, rod Nocardia, Clostridium difficile, (Chiu et al., 2004; del Pozo et al., 2008; Fishman et al., 2007). 2.2.2 Plísňové infekce

Incidence plísňových onemocnění, která je závislá na transplantovaném orgánu a průběhu operačního výkonu, je udávána mezi 4 a 20%. Niţší výskyt je u pacientů po transplantaci ledviny (1-5%), vyšší procento výskytu je u pacientů po transplantaci jater (~20%) (Alangaden et al., 2006; Paya et al., 2002). Riziko fungálního onemocnění se zvyšuje s pouţitím silných imunosupresivních přípravků monoklonálních protilátek či s virovou infekcí modulující funkci imunitního systému (Singh et al., 2003). Nejčastějšími plísněmi, které u pacientů po transplantaci solidních orgánů způsobují infekce, jsou Candida sp., Aspergillus sp., Pneumocystis jiroveci, Histoplasma sp., Coccidioides sp. a Blastomyces sp. (Chiu et al., 2004; Paya et al., 2002; Fishaman et al., 2007).

Stránka | 14

2.2.3 Virové infekce

Nejčastějšími virovými patogeny, které ohroţují pacienty po transplantaci solidních orgánů, jsou: Cytomegalovirus (CMV), virus Epsteina-Barrové (EBV), lidský herpes virus (HHV) -6, HHV-7, HHV-8, virus varicelly zoster; Influenzavirus A, B; virus hepatitidy A, B a C; parvovirus, papilomavirus a lidský polyomavirus BK (Fishman et al., 2007; Alangaden et al., 2006; Fabrizi et al., 2008). 2.2.3.1

Imunitní odpověď na virovou infekci

Hlavními prostředky vrozené imunity proti virovým infekcím jsou indukce interferonů I. typu (IFN-α, IFN-β) a aktivace NK (natural killer) buněk. Při navázání virové nukleové kyseliny produkované při virovém replikačním cyklu na intracelulární Toll-like receptory TLR3 (rozpoznává dsRNA), TLR7 (ssRNA) nebo TLR9 (nemetylovanou deoxyribonukleovou kyselinu) dochází k aktivaci exprese interferonů I. typu - IFN-α a IFN-ß. Tyto cytokiny jsou produkovány především makrofágy, dendritickými buňkami, monocyty a fibroblasty a indukují odpověď proti virovému agens navázáním na IFNα/ß receptor, který aktivuje signální dráhu JAK-STAT indukující transkripci několika genů. Jedním z nich je i gen pro enzym 2'-5'-oligo-adenylát syntetázu, která aktivuje ribonukleázu degradující virovou RNA (RNáza L). Dalšími geny aktivovanými navázáním IFN-α/ß na receptor jsou geny přispívající k inhibici virové replikace, a to například zastavením syntézy proteinů. K indukci tvorby interferonů I. typu můţe dojít i aktivací nezávislou na TLR například rozpoznáním RNA helikázy cytoplazmatickým proteinem RIG-I (retinoidinducible gene-I) nebo virové RNA cytoplazmatickým proteinem MDA-5 (melanoma differentiation-associated protein-5). Stránka | 15

Vazba IFN-α a ß na receptory NK buněk zvyšuje jejich cytotoxický potenciál, zprostředkováním exocytózy granulí obsahujících perforin a granzymy. Dochází ke spuštění apoptózy infikovaných buněk - moţných rezervoárů infekce. Tato aktivita je u NK buněk zesílena IL-12 (Interleukin 12), který je produkován v raných stádiích odpovědi na infekci makrofágy. NK buňky rozpoznávají buňky s nízkou expresí MHC (Major Histocompatibility Complex) molekul I.třídy na povrchu, tedy stresované a/nebo infikované buňky. Mezi další mechanismy identifikace infikovaných buněk NK buňkami patří rozpoznání molekul podobných proteinům MHC I.třídy, které jsou přítomny na povrchu virových a nádorových buněk receptorem NKG2D, nebo aktivací přes receptory CD16, CD94 nebo receptory z rodiny KIR (Killer-cell immunoglobulin-like receptors). Dalším obranným mechanismem proti virům jsou protilátky namířené proti jejich povrchovým antigenům. Tyto obranné protilátky mají především neutralizační charakter - mohou se vázat na povrchové antigeny virů a brání jejich přichycení na buněčném povrchu a vstupu do hostitelských buněk. Významná je úloha sekretovaných protilátek třídy IgA, které tímto mechanismem brání přichycení některých virů na mukózu respiračního a gastrointestinálního traktu. Méně významnou funkcí protilátek v obraně proti virové infekci je i opsonizace a aktivace komplementové kaskády. Úplné odstranění viru z organismu, po jeho vniknutí do hostitelské buňky a vstupu do latentní fáze, je závislé na imunitní odpovědi zprostředkované buňkami, kde hlavní úlohu hrají CD8+ Tc-lymfocyty a CD4+ Th-lymfocyty. Fyziologickou funkcí cytotoxických lymfocytů je ochrana organismu před virovou infekcí a maligním bujením. Tyto lymfocyty rozeznávají proteiny syntetizované buňkou – vlastní nebo virové - v komplexu s MHC molekulami I. třídy na jejím povrchu. K plné diferenciaci

Stránka | 16

funkčního cytotoxického lymfocytu z CD8+ T-lymfocytu je kromě rozpoznání antigenu nutné určité cytokinové prostředí (významnou úlohu hraje cytokin IL-12) a účast CD4+ Th-lymfocytů nebo APC. Specifická T-buněčná odpověď na přítomnost viru se objevuje 3 aţ 4 dny po primoinfekci a kulminuje 7. aţ 10. den. 2.2.3.2

Virová onemocnění a jejich možné komplikace u pacientů po transplantaci

Vedlejší projevy virových infekcí mohou být variabilní a mohou zahrnovat přímé i nepřímé ovlivnění transplantovaného orgánu i pacienta. Některé viry mohou narušit schopnost imunitní obrany hostitele, coţ můţe vést ke zvýšenému riziku dalších sekundárních infekcí. Virové infekce jsou povaţovány za kofaktor akutních a chronických rejekcí (Patel et al., 1997, Sagedal et al., 2002).

Herpetické viry (čeleď Herpesviridae) Podle délky replikačního cyklu, míst latence a vlastností virových částic se tato čeleď

rozděluje

do

tří

podčeledí:

Alphaherpesvirinae,

Betaherpesvirinae

a Gammaherpesvirinae (viz Tab. č. 2). Podčeleď

Název druhu lidský herpesvirus 1 (HHV-1)

Alphaherpesvirinae

lidský herpesvirus 2 (HHV-2) lidský herpesvirus 3 (varicella zoster virus - VZV) lidský herpesvirus 5 (CMV)

Betaherpesvirinae

lidský herpesvirus 6 (HHV-6) lidský herpesvirus 7 (HHV-7)

Gammaherpesvirinae

lidský herpesvirus 4 (EBV) lidský herpesvirus 8 (HHV-8)

Tab. č. 2 Klasifikace běţných lidských herpesvirů.

Stránka | 17

Viry této čeledi způsobují široké spektrum nemocí u lidí i zvířat. Patří mezi ně šest důleţitých lidských patogenů: lidský herpesvirus 1 a 2, virus varicella zoster, cytomegalovirus, EBV a lidský herpesvirus 8. Tyto obalené viry s lineární dvouřetězcovou deoxyribonukleovou kyselinou (ds DNA) mají lipoproteinový obal získaný pučením z jaderné membrány. Jejich velikost se pohybuje mezi 120 a 200 nm. Herpetické viry mají schopnost způsobovat latentní infekce, kdy virus po akutní infekci přechází do stavu bez symptomatických příznaků – takzvané latentní fáze. Pokud je pacient vystaven spouštěcím agens, které oslabí imunitní systém, můţe dojít k reaktivaci viru a obnovení jeho replikace. Je známo, ţe některé herpetické viry jsou asociovány s konkrétními maligními onemocněními – EBV s Burkittovým lymfomem, lidský herpesvirus 8 s Kaposiho sarkomem.

Virus Epsteina-Barrové (EBV) EBV je nejběţnějším lidským virem, který infikuje především B-lymfocyty. Protilátky v séru prokazující proběhlou infekci EBV jsou přítomny u 95% dospělé populace. Klinické projevy onemocnění způsobeného EBV jsou variabilní: od infekční mononukleózy, přes nasofaryngeální karcinom aţ po B-buněčné lymfomy. Pro diagnostické účely jsou nejdůleţitější protilátky proti jeho povrchovým antigenům: virovému kapsidovému antigenu (VCA), časnému antigenu (EA) a nukleárnímu antigenu (EBNA).

Cytomegalovirus (CMV) CMV je ţivočišný obalený virus s lineární dsDNA (viz Obr. č. 2). Jedná se o nejčastějšího oportunního patogena, jeţ ohroţuje pacienty po transplantaci. Udává Stránka | 18

se, ţe infekce způsobená virem CMV se objevuje u 20-60% z nich (Weikert et al., 2008). Séroprevalence v běţné populaci je závislá na věku a pohybuje se v české populaci okolo 70-80% (Viklický et al., 2008). K přenosu dochází tělesnými tekutinami – slinami, krví, mateřským mlékem, močí, slzami, transplantovaným orgánem od séropozitivní osoby a pravděpodobně i spermatem (Cannon et al., 2011; Ho et al., 1990).

nukleokapsid tegument genom membrána glykoproteinový komplex I glykoproteinový komplex III

Obr. č. 2 Schéma stavby viru CMV (http://www.virology.net/big_virology/bvdnaherpes.html).

Po primární akutní infekci přechází virová infekce do asymptomatické fáze – latence. V tomto stádiu je virová DNA přítomna ve formě extrachromozomálních epizomů v buňkách endotelií, hladkého svalstva stěn arterií a mononukleárních leukocytů bez aktivní replikace viru. Přítomnost viru byla detekována v játrech, ledvinách, slezině a slinivce břišní (Hendrix et al., 1997). K reaktivaci viru z latentního stavu CMV-séropozitivního hostitele dochází například po vysokých dávkách imunosupresiv (Rubin et al., 1990), zejména pak po léčbě ATG (anti-tymocytární gamaglobulin), dále pak po jiných infekcích způsobujících oslabení imunitního systému (Badley et al., 1996; Paya et al.,1993). Superinfekce nebo reinfekce

Stránka | 19

se můţe objevit u CMV-séropozitivního příjemce orgánu či buněk obsahujících latentní cytomegalovirus jiného kmene. CMV má několik obranných mechanismů, kterými se snaţí vyhnout imunitní odpovědi namířené proti infikovaným hostitelským buňkám. Jedním z nich je postupné sníţení aţ vymizení exprese MHC I. třídy pomocí unikátních krátkých segmentů (US), které způsobují degradaci molekul MHC I. třídy (US2), inhibují translokaci tohoto peptidu do endoplazmatického retikula (US6) a brání transportu MHC I. třídy na buněčný povrch (US3, US11) (Loenen et al., 2001; Ahn et al., 1996). Tyto procesy by měly vést k likvidaci infikovaných buněk NK buňkami, které rozeznávají buňky se sníţenou expresí MHC I. třídy. CMV ale tento obranný mechanismus imunitního systému hostitele obchází, a to zřejmě syntézou homologů MHC I. třídy (UL18), který interaguje s inhibičními receptory NK buněk (Reyburn et al., 1997). Mezi dalšími mechanismy, kterými virus uniká imunitnímu systému hostitele, patří: blokování apoptózy spuštěné TNF-α (Tumor Necrosis Factor–α) (produkty genů IE1 a IE2), inhibice aktivity proteinu p53, sníţení exprese MHC II. třídy nebo tvorba Fc receptorů vázajících imunoglobuliny třídy G (Froberg et al., 2004). Cytomegalovirová primoinfekce u imunokompetentní osoby můţe být odstupňována od asymptomatické infekce aţ k syndromu podobnému infekční mononukleóze. Bylo statisticky prokázáno, ţe závaţnost infekce CMV souvisí s velikostí virové náloţe (Razonable et al., 2003; Emery et al., 2000). V praxi se však vyskytují pacienti, u kterých počet infikovaných buněk tkáně nemusí odráţet závaţnost onemocnění. U pacientů s asymptomatickou infekcí můţe být přítomno vysoké mnoţství buněk konkrétní tkáně infikovaných CMV, zatímco u pacientů s velmi závaţným stupněm onemocnění můţe být infikován pouze malý počet

Stránka | 20

infikovaných buněk (The et al., 1994). U jedinců s oslabenou imunitou můţe být infekce CMV nebezpečná - můţe dojít k invazi do konkrétních tkání a vzniku hepatitidy, pneumonie, encefalitidy, retinitidy nebo gastritidy. Mírnější formou mohou být symptomy podobné chřipce nebo mononukleóze doprovázené neutropenií. Neţ dojde k mobilizaci imunitního systému oslabeného jedince, můţe dojít k rozsáhlé replikaci viru a ohroţení symptomatickou CMV nemocí. Mezi nepřímé účinky cytomegalovirové infekce patří: vyvolání akutní rejekce, srdečních komplikací, diabetu, dalších oportunních infekcí, aterosklerózy nebo vznik tumorů (Razonable et al., 2008; Razonable et al., 2004; Samanta et al., 2003). K propuknutí akutní infekce bez profylaktické léčby dochází obvykle 1-3 měsíce po transplantaci, kdy je imunosuprese intenzivní a imunitní systém je velmi oslaben. V případě profylaktického podání antivirotik se doba nástupu infekce CMV většinou oddaluje do doby po jejím ukončení (délka léčby je obvykle 90 dní) a to v průběhu prvního roku po transplantaci. Jak jiţ bylo výše zmíněno, infekce CMV zvyšuje citlivost k dalším oportunním infekcím – například Pneumocystis jiroveci, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Nocardia sp., HHV-6 a HHV-7, zvyšuje i pravděpodobnost rekurence viru hepatitidy C u pacientů po transplantaci jater z tohoto důvodu (Rubin et al., 1990; Paya et al., 1993; Peleg et al. 2007; Mendez et al. 2001; Dockrell et al. 1997; Humar et al., 2007). CMV infekce je také spojována s vysokým rizikem mortality v prvním roce po transplantaci (Limaye et al., 2006). Výskyt symptomatické CMV infekce se u pacientů po transplantaci ledviny pohybuje mezi 8 aţ 32%, u příjemců jater mezi 18 - 29%, přičemţ se nejčastěji jedná o CMV primoinfekci (Patel et al., 1997; Razonable et al., 2008). O primoinfekci mluvíme v případě, ţe dárce transplantovaného orgánu anti-CMV protilátky ve třídě

Stránka | 21

IgG v séru přítomny má/měl, zatímco příjemce orgánu v séru přítomny anti-CMV protilátky ve třídě IgG nemá (D+/R- pacient). O reinfekci nebo superinfekci mluvíme v případě, ţe příjemce orgánu, stejně jako dárce, předtransplantačně anti-CMV protilátky ve třídě IgG v séru přítomny měl (D+/R+ pacient). Dostupné zdroje uvádějí, ţe bez podání profylaktické léčby dojde k rozvoji CMV nemoci ve 44-65% případů u pacientů CMV D+/R- a u 8-19% CMV D+/R+ pacientů s transplantovanými játry, při zahájení profylaktické léčby u 12-30%, respektive <10% pacientů (Razonable et al., 2008). U pacientů, kterým je podávána profylaktická léčba, typicky trvající 3 měsíce, existuje zvýšené riziko pozdního nástupu CMV infekce po jejím ukončení (Akalin et al., 2003). K podezření na CMV infekci mohou vést klinické příznaky, jako jsou: horečka, leukopenie a relativní lymfocytóza. K detekci CMV je vyuţívána řada laboratorních metod (viz další kapitola), z nichţ ţádná nedosahuje 100% senzitivity a specificity a sama o sobě není dostatečná ke stanovení diagnózy cytomegalovirové infekce. Je proto vhodné vyuţívat k detekci CMV více laboratorních metod, aby byla sníţena pravděpodobnost falešné negativity či pozitivity. Pravděpodobnost propuknutí CMV nemoci je zvýšena v případě transplantace orgánu pacientovi D+/R-, dále při vysokých dávkách imunosupresiv (obzvláště v případě podání anti-tymocytárních gamaglobulinů), při vrozené poruše imunity nebo při jiném bakteriálním či plísňovém onemocnění (Sarmiento et al., 2000; Kijpittayarit et al., 2007). Dochází také k oboustrannému ovlivnění CMV infekce a rejekce štěpu (Razonable et al., 2005; Hooks et al., 1992; Hartmann et al., 2006), přičemţ značnou komplikaci při diagnostice můţe způsobovat fakt, ţe symptomy, kterými se CMV infekce manifestuje, mohou být podobné akutní rejekci štěpu (Paya et al., 1989).

Stránka | 22

Léčba CMV infekce u transplantovaných pacientů

Nejrozšířenějšími léky pouţívanými u transplantovaných pacientů s diagnózou cytomegalovirové infekce nebo při její prevenci jsou intravenózně podávaný ganciklovir a orálně podávaný valganciklovir. Méně pouţívanými léčivy jsou foskarnet, cidofovir a intravenózně podané CMV imunoglobuliny. Ganciklovir

je

analogem

2'-deoxy-guanosinu,

který

je

fosforylován

na deoxyguanosintrifosfátový (dGTP) analog a kompetitivně inhibuje inkorporaci dGTP virovou DNA polymerázou při replikaci virové DNA. Připojení tohoto analogu zastaví elongaci replikovaného virového řetězce (Crumpacker et al., 1996). Valganciklovir je esterem gancikloviru a po orálním podání je intestinálními a jaterními esterázami konvertován na ganciklovir. Foskarnet je pyrofosfátový analog inhibující DNA polymerázu viru CMV. Léčba foskarnetem je asociována s neurotoxickými a nefrotoxickými vedlejšími účinky, proto je jeho vyuţití minimalizováno na pacienty s prokázanou CMV infekcí s ganciklovirovou rezistencí nebo s CMV asociovanou leukopenií či neutropenií (Biron et al., 2006). Cidofovir je nukleotidový analog cytidinu, jehoţ širšímu vyuţití brání nízká biologická dostupnost a značná nefrotoxicita. Jako antivirotikum bylo vyuţíváno zejména při CMV retinitidě pacientů s HIV infekcí. Dříve byla vyuţívána antivirová léčba CMV hyperimunními imunoglobuliny, které se připravují z lidského séra a obsahují vysoký titr anti-CMV protilátek (Biron et al., 2006). Spolu s podáváním antivirotik je doporučováno sníţení dávek imunosupresivní léčby. V literatuře se udává, ţe při nízkých virových náloţích, či hraničních

Stránka | 23

výsledcích diagnostických testů, absenci klinických příznaků a dobrém průběhu potransplantační rekonvalescence je pacientům sniţována imunosupresivní léčba bez zahájení léčby antivirotiky. Předpokládá se, ţe je tak imunitnímu systému umoţněna přirozená odpověď na CMV infekci (Razonable et al., 2004; Kotton et al., 2010).

Přístupy k pacientům v riziku CMV infekce V klinické praxi se setkáváme s dvěma přístupy – profylaktickým a preemptivním. Profylaktický přístup je dnes aplikován u vysoce rizikových pacientů, mezi něţ patří pacienti ohroţení primoinfekcí a pacienti, kterým byl z důvodu přítomnosti vysokého procenta panel-reaktivních protilátek podán ATG. Antivirotika jsou podávána po dobu tří měsíců od transplantace orgánu. Typickými

antivirotiky

pouţívanými

pro

tento

účel

jsou

ganciklovir

a valganciklovir (valaciklovir). Cílem preemptivního přístupu je zahájení léčby antivirotiky pouze v případě pozitivity laboratorních testů či prvních příznaků nastupující infekce. Tento přístup vyţaduje pravidelná laboratorní a ambulantní vyšetření. Můţe však oddálit vznik nebo dokonce sníţit výskyt rezistentních kmenů CMV k pouţívaným antivirotikům (Limaye et al., 2002). Nejčastěji podávaným antivirotikem je valganciklovir, a to standardně po dobu 3 měsíců.

V současné době je v literatuře veden spor mezi zastánci obou přístupů, protoţe oba mají určité výhody a nevýhody. Většina meta-analýz obou přístupů ukazuje, ţe jsou ve sníţení rizika a výskytu CMV nemoci a výskytu rejekce srovnatelné (Kalil et al., 2005; Snydman et al., 2005; Small et al., 2006, Reischig et al. 2008). Téměř

Stránka | 24

jednoznačná je výhoda profylaktického přístupu u pacientů CMV D+/R- (Opelz et al., 2004; Gane et al., 1997). Byly však publikovány i práce, které prokazovaly statisticky niţší procento výskytu CMV nemoci u příjemců R+ s profylaktickou léčbou CMV (Gavalda et al. 1997; Saliba et al., 1993; Gane et al., 1997). Jiné studie vypovídaly o výhodě preemptivního přístupu R- příjemců orgánu (Singh et al., 1994). Který z přístupů je ekonomicky výhodnější není úplně jednoznačné (Mauskopf et al., 2000; Geddes et al., 2003). Moţnými negativními důsledky profylaktického přístupu k prevenci pacientů po transplantaci solidních orgánů před CMV nemocí jsou značné nefrotoxické vedlejší účinky léčby, moţný vznik rezistentních kmenů, opoţděná odpověď specifických T-lymfocytů a riziko pozdního nástupu infekce s atypickým průběhem (Singh et al., 2005; Slifkin et al., 2001; Shibolet et al., 2003, Limaye et al., 2002). Podle některých analýz není zatím rezistence CMV k antivirotikům u pacientů po transplantaci ledviny či jater významným problémem – (u transplantací jater i ledvin <2%) (Limaye et al., 2002), byly ale publikovány i práce, kde byl prokázán výskyt rezistentních kmenů u 8% všech pacientů s transplantovanými játry D+/R(Razonable et al., 2008). Tyto rezistentní kmeny jsou nejčastěji nositeli mutace v genu pro kinázu (gen UL97) (nebo mutace v genu pro CMV DNA polymerázu (gen UL54) (Limaye et al., 2002; Limaye et al., 2002). K pozdnímu nástupu CMV nemoci dochází po ukončení 3-měsíčního profylaktického podávání antivirotik u více neţ 25% pacientů (26% - Jain et al., 2005; 29% - Arthurs et al., 2007). Opoţděná CMV infekce bývá klinicky méně závaţná, ale i přesto má významný vliv na mortalitu pacientů (Limaye et al., 2006).

Stránka | 25

Metody detekce CMV

Snahy o detekci a kvantifikaci virové náloţe CMV lze datovat jiţ do 70. let minulého století (Wentworth et al., 1970). Tyto první metody byly velice časově náročné, měly velice nízkou reproducibilitu a nízkou senzitivitu (Wenthworth et al., 1970). K výraznému zlepšení moţností kvalitativního a kvantitativního stanovení CMV vedl vývoj molekulárních metod. Nejčastějšími materiály zasílanými k vyšetření CMV infekce je periferní krev, bioptický vzorek tkáně, moč a bronchoalveolární laváţ. Metody dnes nejčastěji vyuţívané k detekci viru CMV:

1.

Stanovení protilátek anti-CMV ve třídě IgG a IgM v séru Stanovení protilátek anti-CMV ve třídách IgG a IgM v séru periferní krve

ELISA testem je metodou vyuţívanou ke stanovení imunitního statusu příjemce a dárce transplantovaného orgánu. Podle přítomnosti různých tříd anti-CMV protilátek v séru dárce orgánu pro pacienta D+/R- lze soudit na latentní infekci (přítomny jen protilátky ve třídě IgG) nebo akutní infekční stádium (přítomny i protilátky anti-CMV ve třídě IgM) dárce. V obou případech je příjemnce D+/Rohroţen primární infekcí CMV a bývá proto zahájena profylaktická léčba příjemce orgánu antivirotiky. Hlavním významem sledování titru protilátek anti-CMV ve třídách IgG a IgM v potransplantačním období je zachycení moţné sérokonverze, která je průvodním jevem CMV primoinfekce. V případě reinfekce nebo přechodu viru z latentní fáze můţe docházet ke značnému zvýšení titrů protilátek v obou třídách.

Stránka | 26

2.

Histologické vyšetření bioptovaného vzorku Cytomegalovirová infekce můţe vést k typickému histologickému nálezu

buněk s obrovskými jádry s intranukleárními inkluzemi („owl-like inclusions“) (viz Obr. č. 3). Tato metoda detekce viru je velmi cenná v případě, ţe jde o CMV infekci lokalizovanou do konkrétní tkáně, kdy v periferní krvi nemusí dojít ke zvýšení počtu kopií CMV DNA nad hladinu CMV DNAémie ani zvýšení titru protilátek anti-CMV.

Obr. č. 3 Typické CMV inkluze v histologickém řezu plíce (http://www.asm.org/Division/c/viruses.htm).

3.

Kultivace viru U klasické plakové metody je vzorek nanesen na vrstvu fibroblastů a poté

převrstven polotekutým médiem. Pokud je virus přítomen, šíří se z buňky na buňku, coţ vede ke vzniku lokalizovaných plaků, jejichţ počet je odečítán pod mikroskopem (viz Obr. č. 4). Jde o metodu nenáročnou na laboratorní vybavení, je zde ale vysoké riziko kontaminace a kultivace je časově náročná, trvá 2-4 týdny. Další metodou zaloţenou na kultivačních technikách je metoda TCID50 (50% tissue culture infective dose), kterou je stanovován titr viru, kterým je moţno ještě dosáhnou cytopatického efektu u 50% buněk.

Stránka | 27

Obr. č. 4 Kultivace cytomegaloviru na vrstvě fibroblastů. Nalevo negativní nález, napravo plak vzniklý dělením viru z pozitivního vzorku (http://www.medscape.org/viewarticle/416519_3).

Dva zmíněné typy kultivačních metod byly postupem času nahrazeny metodou „shell-vial“, kdy je na vrstvu buněk (například lidské embryonální plicní buňky) inokulován vstupní materiál pacienta (například periferní krev, moč, atd.) pomocí centrifugace, která zvyšuje účinnost vniknutí viru do buněk (schéma metody viz Obr. č. 5). Metodou nepřímé fluorescence (vyuţívá se monoklonální protilátky proti CMV antigenu p72) je následně stanoven počet buněk napadených CMV. Výsledky testu je moţno získat za 18-48 hodin.

Obr. č. 5 Ukázka kultivace viru metodou „shell-vial“, vzorek barven monoklonální protilátkou proti raným proteinům CMV (http://www.virology.org/sbpgphoto1.html).

Stránka | 28

4.

Stanovení antigenémie Stanovení antigenémie CMV spočívá v přímé detekci buněk infikovaných

CMV. Na povrch podloţního sklíčka je fixován definovaný počet separovaných leukocytů pacienta a pomocí monoklonální protilátky namířené proti matrixovému cytomegalovirovému proteinu pp65 je odečítán obvykle počet infikovaných buněk na 2x105 periferních leukocytů (viz Obr. č. 6). Protoţe tato metoda nevyţaduje kultivaci, je výsledek moţno získat jiţ po pěti hodinách. Nevýhodou je nutnost zpracování vzorku bezprostředně po odběru, časově a technicky náročné jednotlivé kroky metody a moţný vliv subjektivního hodnocení.

David Ferguson, Yale New Haven Hospital

Obr. č. 6 Obrázek stanovení CMV antigenémie v leukocytech periferní krve vyšetřovaného pacienta. Je stanovován počet buněk napadených virem, které jsou detekovány pomocí monoklonální protilátky namířené proti pozdnímu matrixovému proteinu pp65 (http://www.virology.org/hpphoto4.html).

5.

PCR (polymerázová řetězová reakce) Moţnost amplifikace specifického úseku DNA metodou PCR, vyvinuté v roce

1983 Kary Mullisem, výrazně posunula moţnosti detekce v klinické mikrobiologii. Pro tuto metodu je primárním vstupním materiálem pacientova DNA izolovaná z nesráţlivé periferní krve s EDTA (ethylendiamintetraoctová kyselina) nebo citrátem sodným (dalšími materiály mohou být také bronchoalveolární laváţ, mozkomíšní mok

Stránka | 29

či moč). Podle pouţité varianty PCR a moţnosti kvantifikace uvádím dvě moţnosti stanovení počtu kopií CMV DNA.

Semikvantitativní PCR Po amplifikaci cílového úseku virové DNA (v jednotlivých laboratořích mohlo jít o úseky různých genů – například gen pro protein pp65 (Pumannova et al., 2006), různé pozdější rané a pozdní geny (Yaghobi et al., 2005), nebo gen pro HCMV DNA polymerázu (Lengerke et al., 2006)), jsou vzorky elektroforeticky analyzovány na 2% agarózovém gelu. Po obarvení (například pomocí ethidium bromidu) jsou odečteny denzity jednotlivých prouţků a kvantifikována přibliţná náloţ viru podle kalibrační křivky (viz Obr. č. 7).

Obr. č. 7 Snímek agarózového gelu, na němţ je semikvantitativně stanovena velikost virové náloţe CMV. Vzorky jsou namnoţeny pomocí PCR, naneseny na gel a po proběhnutí elektroforézy je měřena denzita prouţků produktů (označeny šipkou) proti kalibrační křivce sestavené pomocí vzorků se známým počtem kopií virové DNA (vzorky 12-17)(Cunha et al., 2002).

Kvantitativní real-time PCR Nástupcem semikvantitativního stanovování virové náloţe se stala metoda vyuţívající real-time PCR, která je charakteristická velice dobrou reproducibilitou a rychlostí provedení. Amplifikovaným úsekem virové DNA je nejčastěji část genu

Stránka | 30

pro matrixový protein pp65. Se vzrůstajícím počtem kopií produktu se zvyšuje fluorescence z navázaných sond (například TaqMan®) či interkalačního barviva (například SYBR® Green) aţ do vyčerpání dostupných sloţek reakce. Nárůst kopií je sledován v reálném čase, křivky jsou srovnávány s křivkami standardů se známým počtem kopií genu vstupujících do reakce (viz Obr. č. 8).

Obr. č. 8 Stanovení počtu kopií virové DNA CMV pomocí metody real-time PCR pomocí přístroje Rotor-Gene 3000™ thermocycler. Černé šipky označují křivky kalibrace, červená šipka ukazuje křivku negativní kontroly. Na ose X jsou počty proběhlých cyklů reakce, osa Y popisuje intenzitu fluorescence. Poskytnuto Genetickou laboratoří Centra kardiovaskulární a transplantační chirurgie.

6.

Sledování exprese molekuly CD38 na povrchu CD3+CD8+ T-lymfocytů

ZÁKLADNÍ VLASTNOSTI MOLEKULY CD38 CD38

je

transmembránovým

glykoproteinem

II.

třídy

s

krátkým

cytoplazmatickým koncem. Skládá se ze tří domén: intracelulární (tvoří ji 20 aminokyselin),

transmembránové

(23

aminokyselin)

a

extracelulární

(257

aminokyselin). Gen CD38 o velikosti 72 kbp se nalézá na krátkém raménku chromozomu 4 (4p15) a jeho fylogenetické studium ukazuje, ţe je vysoce konzervován.

Stránka | 31

Molekula CD38 má u člověka enzymatickou i receptorovou funkci (ektoenzym) (Malavasi et al., 1994) (viz Obr. č. 9). Její enzymatické schopnosti ji řadí do skupiny enzymů, které katalyzují NAD-glykohydrolázové a ADP-ribosylcyklázové reakce. Molekula CD38 katalyzuje vznik tří produktů – cyklické adenosindifosfátribózy (cADPR),

adenosindifosfátribózy

(ADPR)

a

adenindinukleotidfosfát

kyseliny

nikotinové (NAADH) (Lee et al., 1997), které působí v signalizaci pomocí vápenatých iontů. Jako receptor se chová molekula CD38 při interakci s jeho ligandem - zatím jediným identifikovaným je molekula CD31 (PECAM-1 – platelet endothelial cell adhesion molecule – 1) (Deaglio et al., 1996; Deaglio et al., 1998). Po navázání tohoto ligandu dochází ke změně struktury molekuly CD38, změně její lokalizace

Obr. č. 9 Receptorová a enzymatická funkce molekuly CD38. Schéma převzato a upraveno z publikace Deaglio et al., 2008. Molekula CD38 se chová jako ektoenzym (a) i receptor interagující s molekulou CD31 (b). ADPR, adenosindifosfátribóza; cADPR, cyklická adenosindifosfátribóza;NA, kyselina nikotinová; NAADP, adenindinukleotidfosfát kyseliny nikotinové; NAD, nikotinamidadenindinukleotid; NADP, nikotinamidadenindinukleotidfosfát.

v lipidových mikrodoménách a interakci s dalšími molekulami (Umar et al., 1996; Munoz et al., 2003; Malavasi et al., 2006). Výslednými ději v buňce po stimulaci molekuly CD38 je spuštění signálních drah vedoucích ke zvýšení koncentrace

Stránka | 32

intracelulárních Ca2+ iontů a aktivace molekul typických pro aktivaci antigenních receptorů (Deaglio et al., 2007; da Silva et al., 1998). Bylo prokázáno, ţe interakce molekuly CD38 s ligandem CD31 na povrchu endoteliálních buněk vede ke zvýšení exprese integrinů, a je tedy zřejmá její úloha v buněčné adhezi (Deaglio et al., 1998). Molekula CD38 hraje roli zřejmě i v regulaci vrozené a adaptivní imunity – na myším modelu byl prokázán její vliv na regulaci chemotaxe u neutrofilů a dendritických buněk, mechanismus ale není zatím znám (Randolph et al., 2005; Partida-Sanchez et al., 2001). Byla zjištěna i pravděpodobná účast v sekreci inzulinu, kontraktilitě myometria, kontraktilitě hladkých svalů dýchacích cest a aktivitě osteoklastů (Malavasi et al., 2006; Deaglio et al., 2008). Molekula CD38 je důleţitá při přenosu signálů, signalizaci pomocí vápenatých iontů, při buněčné adhezi a migraci a její výsledný účinek závisí na interakci s dalšími ektoenzymy či signálními molekulami.

EXPRESE MOLEKULY CD38

Molekula CD38 je v lidském těle exprimována celou řadou buněk, mezi něţ patří například: buňky glomerulů, rohovky, epiteliální buňky prostaty, Purkyňovy buňky, krevní destičky. (Malavasi et al., 2006). Hlavní zájem o tuto molekulu je upřen ke sledování její exprese na povrchu hematopoetických buněk a na povrchu aktivovaných T-lymfocytů, B-lymfocytů, NK buněk a dendritických buněk (Funaro et al., 1990; Deaglio et al., 2006). Exprese CD38 na cirkulujících lymfocytech se mění s věkem a například u dětí do dvou let jsou T-lymfocyty v periferní krvi téměř výlučně CD38+ (Jennings et al., 1994). S věkem exprese znaku CD38 na periferních T-lymfocytech klesá.

Stránka | 33

U novorozenců (ve věku 2 - 4dny) je znak CD38 přítomný na povrchu CD4+ (98%) i CD8+ (93%) T-lymfocytů, u dětí ve věku 1 roku pak na 94% CD4+ a 83% CD8+ subpopulace T-lymfocytů v periferní krvi. U dospělých nese znak CD38 průměrně 13% CD8+ lymfocytů (de Vries et al., 2000; McCloskey et al., 1997; Litzman et al., 2006).

K nárůstu

procenta

CD8+CD38+HLA-DR+

buněk

dochází

v průběhu

těhotenství s nejvyššími hodnotami v třetím trimestru (Mikyas et al., 1997). Za fyziologických podmínek je exprese znaku CD38 velice nízká nebo ţádná na CD4+CD45RO+ a CD8+CD45RO+ paměťových T-lymfocytech, heterogenní je jeho exprese

na

T-lymfocytárních

subpopulacích

CD45RA+CD4+,

CD45RA+CD8+

(McCloskey et al., 1997). Předpokládá se, ţe molekula CD38 hraje významnou úlohu v regulaci aktivace a proliferace T-lymfocytů a její vysoká exprese je raným aktivačním znakem doprovázející virové infekce jako je například: infekce virem Epsteina-Barrové, cytomegalovirem, virem varicella zoster a virem chřipky (Bofill et al., 2000; BellesIsles et al., 1998).

Exprese znaku CD38 za patologických okolností CD38 a virová onemocnění U akutních virových infekcí způsobených EBV, CMV, virem varicella zoster nebo virem chřipky dochází ke zvýšení absolutního počtu CD8+ T-lymfocytů v periferní

krvi,

kdy

převaţujícím

fenotypem

expandovaných

lymfocytů

je

CD45RO+CD25+ s vysokou expresí znaku CD38 (Akbar et al., 1993; Židovec Lepej et al., 2003). Jiţ dříve byla publikována studie (Belles-Isles et al., 1998), která vyuţívala monitorování počtu CD8+38high ke sledování imunitní odpovědi na CMV infekci usnadňující diagnózu CMV v rané fázi infekce spolu s počtem kopií DNA viru

Stránka | 34

určeným pomocí kvantitativní real-time PCR. U pacientů s akutní EBV infekcí dochází k velmi vysoké expresi znaku CD38 na CD3+CD8+ lymfocytech (Židovec Lepej et al., 2003). V průběhu infekce hepatitidy B nedochází k ovlivnění exprese molekuly CD38 u CD8+ T-lymfocytů, u hepatitidy C dochází pouze k lehkému zvýšení. U pacientů s chronickým virovým onemocněním hepatitidou B či C nebyly pozorovány významné rozdíly od hodnot pozorovaných u kontrolních pacientů (Sing et al., 1998). Při HIV infekci dochází k expresi znaku CD38 na rozdíl od jiných virových infekcí také na povrchu B-lymfocytů, naivních CD4+ i CD8+ T-lymfocytů, kde vysoká exprese přetrvává po celou dobu chronické fáze onemocnění (Benito et al., 1997; Bofill et al., 2000; Rooos et al., 1994). Není však pravda, ţe by všechny z těchto buněk nesoucích znak CD38 byly aktivované, protoţe neexprimují další aktivační znaky jako CD25 a HLA-DR (Kestens et al., 1992). V literatuře se uvádí, ţe procento CD8+CD38+ negativně koreluje s počtem CD4+ T-lymfocytů, pozitivně koreluje s virovou náloţí a intenzita exprese znaku CD38 na povrchu CD8+ T-lymfocytů je prognostickým znakem pro progresi HIV infekce a odráţí reakci pacienta na retrovirovou terapii (Bofill et al., 1996; Liu et al., 1997; Sherman et al., 2002; Benito et al., 2005).

CD38 a autoimunitní onemocnění U pacientů s autoimunitními chorobami bylo pozorováno zvýšené procento CD8+CD38+ T-lymfocytů u nemocných s lupus erythematosus (72±16% ve srovnání s deseti kontrolami 45±21%). Nebyl však například nalezen statisticky významný rozdíl v procentuálním zastoupení subpopulace CD8+CD38+ mezi pacienty s Guillain-

Stránka | 35

Barré syndromem a zdravými kontrolními jedinci (Erkeller-Yuksel et al., 1997; Sindern et al., 1997).

CD38 a maligní bujení Exprese CD38 na povrchu B-lymfocytů je znakem nepříznivé prognózy chronické lymfatické leukémie, který koreluje s dalšími negativními prognostickými znaky: expresí ZAP-70, cytogenetickými abnormalitami, hladinou solubilního CD23 (sCD23), hladinou sérového beta-2 mikroglobulinu (ß2m), funkcí p53 a velikostí buněk (Shanafelt et al., 2004; Deaglio et al., 2008).

Stránka | 36

3. Cíle práce 1. Retrospektivní

i

prospektivmní

analýza

souboru

dat

pacientů

Centra

kardiovaskulární a transplantační chirurgie v Brně po transplantaci ledvin a jater, kteří byli na Ústavu klinické imunologie a alergologie LF MU v Brně imunologicky sledování v době jejich hospitalizace a v těsném potransplantačním období. 2. Analýza naměřených dat pro procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů ve vztahu k cytomegalovirové infekci. 3. Stanovení senzitivity, specificity, negativní a pozitivní prediktivní hodnoty sledování procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů jako metody pro detekci CMV infekce. 4. Srovnání metody sledování procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů jako metody pro detekci CMV infekce s metodou stanovení počtu CMV DNA kopií v periferní krve pomocí real-time PCR. 5. Korelace procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů s dalšími imunologickými a laboratorními parametry.

Stránka | 37

4. Materiál a metody Práce se zabývala studiem exprese molekuly CD38 na povrchu lymfocytů v souvislosti s CMV infekcí u dvou skupin pacientů: nemocných po transplantaci ledviny a pacientů po transplantaci jater. Všichni byli transplantováni v Centru kardiovaskulární a transplantační chirurgie v Brně. Studie byla schválena etickou komisí Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně.

4.1

Pacienti

V období mezi červnem 2003 a prosincem 2009 bylo transplantováno 269 pacientů s terminálním onemocněním ledvin a 162 s terminálním onemocněním jater. Základní charakteristika obou skupin pacientů je uvedena v Tabulkách č. 3 a 4.

Pacienti po transplantaci ledviny

Muži

Ženy

Muži + ženy

Počet pacientů

173 (64,3%)

96 (35,7%)

269 (100%)

Průměrný věk ± SD

48,4 ± 12,0

49,6 ± 11,2

48,8 ± 11,7

Medián věku (5%;95% percentil)

50 (27,6; 67,0)

49,5 (29,75; 68,0)

50 (29,0; 67,0)

Tab. č. 3 Charakterizace souboru pacientů s transplantovanou ledvinou.

Pacienti s transplantovanými játry

Muži

Ženy

Muži + ženy

Počet pacientů

76 (46,9%)

86 (53,1%)

162 (100%)

Průměrný věk ± SD

48,9 ± 10,5

48,4 ± 12,5

48,6 ± 11,6

51,5 (27,0; 62,0)

50 (24,0; 63,75)

51 (25,05; 63,0)

Medián věku (5%;95% percentil)

Tab. č. 4 Charakterizace souboru pacientů s transplantovanými játry.

Stránka | 38

4.2

Imunosupresivní terapie

Pacientům byla podávána trojkombinace: glukokortikoidy, kalcineurinové inhibitory (takrolimus nebo cyklosporin A) a mykofenolát mofetil (standardní dávkovací schéma v Tab. č. 5 a 6). Všichni pacienti podstoupili indukční imunosupresivní léčbu: 1g mykofenolátu mofetilu, dále pak 0,1 mg/kg takrolimu nebo 10 mg/kg cyklosporinu. V průběhu transplantace bylo pacientům intravenózně podáno 500mg metylprednisolonu. Takrolimus

Cyklosporin A Mykofenolát mofetil

Den

(hladina v plazmě

(C2 hladina v plazmě (počet dávek;g)

ng/ml)

µg/ml)

0-21

10-20

2x 1,0

1200-1500

22-30

10-15

2x 0,5

1200-1500

31-41

5-10

2x 0,5

1000-1300

42-90

5-10

2x 0,5

1000-1300

Tab. č. 5 Standardně pouţívaná imunosupresívní léčba po transplantaci jater a ledvin pro takrolimus a mykofenolát mofetil (případně u některých pacientů je pouţíván místo takrolimu cyklosporin A).

Den

Kortikoid

Dávka (mg)

0

Metylprednisolon

500

1

Metylprednisolon

125

2-14

Prednison

20

15-28

Prednison

15

29-42

Prednison

10

43-91

Prednison

5

Tab. č. 6 Standardní schéma pro dávkování glukokortikoidů pro pacienty po transplantaci ledvin a jater.

Udrţovací

imunosupresivní

terapii

po

transplantaci

tvořil:

prednison

5-20 mg/den, mykofenolát mofetil - obvykle v dávkách 1-2 g/den, hladiny takrolimu Stránka | 39

byly udrţovány mezi 10-20 ng/ml, hladiny cyklosporinu A na hladině C2 v plazmě mezi 1000-1500 µg/ml. Dávky léků byly upravovány podle klinického stavu pacienta, laboratorních a bioptických nálezů. Příjemci orgánu s předtransplantačně vysokými hladinami panel-reaktivních protilátek podstoupili před transplantací plazmaferézu a byl jim aplikován intravenózně lidský nespecifický imunoglobulin v supresivní dávce 0,5 g/kg a anti-tymocytární gamaglobulin. Příjemci ledviny bez přítomnosti anti-CMV protilátek ve třídě IgG v séru od dárce orgánu s anti-CMV protilátkami ve třídě IgG v séru (39 pacientů; 14,5%) obdrţeli profylaktickou antivirovou léčbu valganciklovirem nebo ganciklovirem 900 mg denně 90-100 dní po transplantaci; dávka byla upravována dle renálních funkcí. Pokud pacient podstoupil léčbu ATG, byl mu podáván valganciklovir v dávce popsané výše nebo aciklovir v dávce 600 mg/den. Vyšetření periferní krve pomocí průtokové cytometrie bylo prováděno u všech pacientů před chirurgickým výkonem a pak 1., 3., 5., 7., 10., 14., 17., 21., a pak kaţdý sedmý den po transplantaci do propuštění pacienta, nebo dle klinického stavu pacienta v případě podezření na CMV infekci. U jednotlivých pacientů bylo vyšetřeno mezi deseti a devatenácti vzorky periferní krve. Intervaly mezi odebráním vzorků byly 1-7 dní. Kromě biochemických, hematologických, mikrobiologických a imunologických vyšetření – včetně sledování procenta CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů, byla sledována i virová náloţ kopií CMV DNA na 1 ml periferní krve.

Stránka | 40

4.3

Diagnostika CMV infekce

Podezření na CMV infekci (primoinfekce i reaktivace) bylo zaloţeno na přítomnosti nespecifických příznaků jako je horečka, leukopenie (počet lymfocytů niţší neţ 4,0*109 /l) a relativní lymfocytóza (>55% lymfocytů). Diagnóza CMV infekce byla potvrzena alespoň jedním z následujících kritérií: detekce viru v bioptickém vzorku, virová náloţ větší neţ 1000 kopií/ml periferní krve, izolace CMV v moči, nebo sérokonverze

(detekce

IgM

anti-CMV

protilátek

v séru

pacienta).

Pacienti

s diagnózou CMV infekce byli léčeni ganciklovirem nebo valganciklovirem obvykle v dávce 900 mg/den po dobu 90-100 dní. Dávky mohly být redukovány na základě špatné renální funkce.

4.4

CMV PCR

Počet kopií DNA CMV v periferní krvi byl stanovován pomocí kvantitativní real-time polymerázové řetězové reakce (real-time PCR) v Genetické laboratoři Centra kardiovaskulární a transplantační chirurgie. Z 500µl periferní nesráţlivé krve v EDTA byla pomocí soupravy QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Německo) izolována DNA. Ke kvantitativnímu stanovení počtu kopií byl pouţit přístroj Rotor-Gene 3000™ thermocycler s programem pro analýzu real-time PCR reakcí (Corbett Research, Sydney, Austrálie) a souprava ARTUS CMV PCR Kit CE (Qiagen, Hilden, Německo). Vzorky ke stanovování počtu kopií DNA CMV byly odebírány jednou týdně nebo dle klinického stavu pacienta. Za CMV DNAémii byla povaţována virová náloţ ≥1000 kopií/ml periferní krve (Hernando et al., 2005).

Stránka | 41

4.5

CMV serologie

Titr protilátek proti CMV ve třídě IgG i IgM byl v séru stanovován metodou ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) soupravami EIA CMV IgG and EIA CMV IgM (Test-Line, Brno, Česká republika) na Mikrobiologickém ústavu Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně. Sérum pacienta bylo naředěno 1:100 ředícím roztokem a inkubováno 30 min při 37°C. Po promytí desky byl dávkován konjugát namířený proti lidskému imunoglobulinu třídy IgG (popř. IgM). Po 30 min inkubaci byla deska opět promyta a byl dávkován substrát 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB). Reakce byla zastavena pomocí 1M kyseliny sírové (H2SO4). Zabarvení bylo měřeno spektrofotometrem Anthos Reader 2001 (Anthos Labtec Instruments, Wals, Austria) při vlnové délce 450 nm.

4.6

Stanovení T-lymfocytárních subpopulací

Odběr

krve

k vyšetření

byl

proveden

před

podáním

ranní

dávky

imunosupresivní léčby. Z heparinizovaného vzorku periferní krve bylo pouţito 45µl k barvení pomocí konjugátu fluorescein isothiokyanát (FITC) s anti-CD38 (od firmy Immunotech, Marseille, Francie), konjugátu R-Phycoerythrin-Cyanine 5 (PE/Cy5) s anti-CD3 a konjugátu phycoerytrin (PE) s anti-CD8 (obě od firmy Dako A/S, Glostrup, Dánsko). Kromě procenta CD38high z CD3+CD8+ T- lymfocytů bylo sledováno ještě procento všech lymfocytů, procento CD3+, CD3+CD4+ a CD3+CD8+ lymfocytů a procento aktivovaných lymfocytů CD3+HLA-DR+. Další dvě zkumavky s 45µl heparinizované krve byly tedy barveny kombinací konjugátů: první zkumavka R-Phycoerythrin-Cyanine 5 (PE/Cy5) s anti-CD3 (Dako Stránka | 42

A/S, Glostrup, Dánsko), fluorescein isothiokyanát (FITC) s anti-CD4 (Dako A/S, Glostrup, Dánsko) a phycoerytrin (PE) s anti-CD8 (Dako A/S, Glostrup, Dánsko);

Obr. č. 10 Gatovací strategie pro stanovení procenta CD3+CD4+, CD3+CD8+ lymfocytů a procenta aktivovaných lymfocytů CD3+HLA-DR+ pomocí průtokové cytometrie.

Stránka | 43

druhá zkumavka pak kombinací: konjugát fluorescein isothiokyanát (FITC) s anti-CD3 (Dako A/S, Glostrup, Dánsko) a konjugát phycoerytrin (PE) s anti-DR (Becton Dickinson, San José, Kalifornie, USA). Po 45 minutové inkubaci vzorků s monoklonálními protilátkami ve tmě při pokojové teplotě byly vzorky lyzovány, stabilizovány a fixovány pomocí přístroje COULTER®-MULTI-Q-PREP workstation (Beckman

Coulter,

Miami,

Florida,

USA).

Strategie

gatování

sledovaných

subpopulací je uvedena na Obrázku č. 10 a č. 11. Výsledky pro procento CD38high z CD3+CD8+ z T-lymfocytů byly udávány jako procento

CD3+CD8+CD38high

lymfocytů

z

CD3+CD8+

lymfocytů

(CD38high

z CD3+CD8+). Pro stanovení tohoto procenta bylo pouţito nejméně 500 CD3+CD8+ lymfocytů. K určení pozitivity procenta CD38high z CD3+CD8+ byl pouţit arbitrární limit >20% CD38high z CD3+CD8+ (Belles-Isles et al., 1998). Fenotypizace lymfocytárních subpopulací byla provedena na čtyřbarevném

CD38high z CD3+CD8+ 1,25%

CD38 (FITC)

počet buněk (*103)

počet buněk (*103)

průtokovém cytometru Epics MCL (Beckman Coulter).

CD38high z CD3+CD8+ 34,3%

CD38 (FITC)

Obr. č. 11 Strategie pro stanovení procenta CD38high z CD3+CD8+ pomocí průtokové cytometrie. Procento CD38high z CD3+CD8+ je stanovováno z lymfocytární subpopulace CD3+CD8+ buněk. A) Pacient s procentem CD38high z CD3+CD8+ pod arbitrární hranici 20%. B) Pacient s procentem CD38high z CD3+CD8+ nad arbitrární hranici. Stránka | 44

4.7

Další sledované parametry

Kromě výše zmíněných subpopulací lymfocytů byl rutinně sledován i počet leukocytů pomocí hematologického analyzátoru Mythic 18 (C2 Diagnostics, Montpellier, Francie). U pacientů po transplantaci ledvin bylo na Oddělení klinické biochemie Fakultní nemocnice u sv. Anny stanovováno mnoţství urey a kreatininu v séru; u pacientů po transplantaci jater hladiny enzymů AST (aspartátaminotransferáza) a ALT (alaninaminotransferáza) v séru.

4.8

Statistická analýza

Výsledky uvedeny jako medián s 5% a 95% percentilem nebo jako průměr ± směrodatná odchylka (SD). Pro stanovení statistického rozdílu mezi skupinami pacientů byl pouţit Mann-Whitney test. Získané P hodnoty niţší neţ 0,05 byly povaţovány za statisticky významné. Statistické vyhodnocení bylo provedeno pomocí programu Statistica verze 8 (StatSoft, Inc.; Tulsa, Oklahoma, USA).

Stránka | 45

5. Výsledky Výsledky I. – pacienti po transplantaci ledvin

Tato část výsledků byla shrnuta v publikaci „Monitoring of CD38high expression in peripheral blood CD8+ lymphocytes in patients after kidney transplantation as a marker of cytomegalovirus infection” autorů Tichá Olga, Štouračová Martina, Kuman Milan, Studeník Pavel, Freiberger Tomáš, Litzman Jiří. Transplant Immunology 2010 Oct;24(1):50-6.

Dvanácti pacientům (9 muţů, 3 ţeny) z celkových 269, kteří podstoupili transplantaci ledviny, byla v průběhu pooperační hospitalizace (1-3 měsíce) diagnostikována cytomegalovirová infekce (viz Tab. č. 7). U jedenácti z nich šlo o virovou reaktivaci (šlo o anti-CMV IgG pozitivní příjemce štěpu od anti-CMV IgG

Pacienti

po

transplantaci

ledviny

s diagnózou CMV infekce Počet (%) Průměrný věk ± SD Medián věku (5%; 95% percentil)

Muži

Ženy

Muži + ženy

8 (66,7%)

4 (33,3%)

12 (100%)

45,8 ± 12,2

49,0 ± 2,7

46,8 ± 10,0

48 (29,2; 57,95)

50 (45,75; 50,85)

50 (31,6;57,35)

Tab. č. 7 Charakterizace souboru pacientů s transplantovanou ledvinou a pacientů s diagnózou CMV infekce.

pozitivních nebo negativních dárců), dvanáctý pacient prodělal primoinfekci (anti-CMV IgG negativní příjemce od anti-CMV IgG pozitivního příjemce) (viz Tab. č. 8). Podrobná charakteristika těchto dvanácti pacientů je uvedena v Tabulce č. 9. Stránka | 46

Serologický Serologický status status

Počet

Číslo

příjemce dárce (anti- pacientů pacienta (anti-CMV CMV IgG) IgG) -

+

1

#9

+

-

2

#8, #3

+

+

9

ostatní

Tab. č. 8 Přítomnost protilátek anti-CMV ve třídě IgG u příjemců transplantované ledviny s diagnostikovanou CMV infekcí a dárců orgánu.

Pacientům byla diagnostikována CMV infekce mezi 31. a 63. dnem po transplantaci (medián 43,9). Vývoj procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů u uvedených 12 pacientů v průběhu jejich monitorování je uveden na Obrázku č. 13. U pacientů s diagnózou CMV infekce byl v průběhu monitorování pozorován nárůst procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů nad arbitrární hranici 20%. U devíti z nich zvýšení tohoto znaku předcházelo diagnóze (den 0) akutní CMV infekce o 3-32 dní (průměr: 10,0 dní; medián: 4,5 dne). U dvou pacientů bylo zvýšeno procento CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů nad arbitrární hranici poprvé v den, kdy byla zahájena antivirová léčba. U jednoho z pacientů došlo ke zvýšení dva dny po stanovení diagnózy CMV infekce. Hodnoty CD38high z CD3+CD8+ T–lymfocytů u pacientů s diagnózou CMV infekce se v den zahájení antivirové léčby nebo v den, kdy byl pacient naposledy vyšetřován před stanovením diagnózy, pohybovaly v rozsahu 16 aţ 69%.

Stránka | 47

Sérologický status anti-CMV IgG (dárce/příjemce)

Den od transplantace, kdy byla diagnostikována CMV infekce

Den prvního zvýšení procenta CD38high z CD3+CD8+ nad arbitrární limit

Sérokonverze před diagnózou CMV infekce

Maximální virová náloţ (kopie/ml)

Osobní maximum procenta CD38high z CD3+CD8+ (%)

14

ano

305000

64

38/M Chronická renální insuficience - chronická glomerulonefritida

+/+

50

52

ne

<1000

31

3

45/F

+/-

57

25

ano

9990

47

4

55/M Chronická renální insuficience - chronická glomerulonefritida a IgA nefropatie

+/+

48

21

ano

12600

53

5


+/+

38

34

ano

<1000

61

6

37/M Chronická renální insuficience – Alportův syndrom

+/+

47

44

ano

6700

57

7

50/F

+/+

63

58

ano

1710

28

8

59/M

+/-

35

28

ne

9381

33

Věk/pohlaví

46

Pacient č.

+/+

1

50/F

2

Diagnóza, jeţ vedla k transplantaci ledviny

Chronická renální insuficience – membranoproliferativní glomerulonefritida

Retransplantace, multiorgánové selhání

Chronická renální insuficience - polycystická degradace ledvin a jater Chronická renální insuficience – ischemická nefropatie,kombinová transplantace ledviny a srdce

9

41/M Chronická renální insuficience - chronická glomerulopatie

-/+

31

31

ne

11044

84

10

55/M Chronická renální insuficience – polycystická degradace ledvin a jater

+/+

39

39

ano

<1000

62

11

53/M Chronická renální insuficience - chronická tubulární nefropatie

+/+

32

13

ano

<1000

73

12


+/+

41

36

ne

6052

46

Tab. č. 9 Podrobná charakteristika pacientů, kterým byla nasazena antivirová léčba pro diagnózu CMV infekce. Stránka | 48

90

pac#1 pac#2

80

pac#3 pac#4

70

CD38high z CD3+CD8+ (%)

pac#5

60

pac#6 pac#7

50

pac#8 pac#9

40

pac#10 pac#11

30

pac#12

20

10 0 -70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

Den vzhledem ke dni, kdy byla zahájena antivirotická léčba

Obr. č. 13 Procento CD38high z CD3+CD8+ u pacientů s diagnózou CMV infekce. Den 0 je dnem, kdy byla zahájena léčba antivirotiky. Zvýšení nad hranici arbitrárního limitu 20% (tečkovaná čára v grafu) bylo v rámci této studie povaţováno za flow-cytometrický znak CMV infekce.

Časová souslednost parametrů vyuţívaných v diagnostice CMV infekce – počet CMV DNA kopií/ml periferní krve nad 1000 kopií; procento CD38high z CD3+CD8+; přítomnost protilátek anti-CMV IgM, u pacientů s diagnózou CMV infekce je souhrnně zobrazena na Obrázku č. 14. Při hodnocení vývoje procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů v čase vzhledem k vývoji počtu kopií CMV DNA v periferní krvi lze říci, ţe u 50% pacientů byla kinetika těchto dvou parametrů podobná (pacienti č. 3, 6, 7, 8, 9 a 12) (viz Obr. č. 15). U dvou pacientů nebylo moţno pozorovat ţádnou souvislost obou sledovaných parametrů. U čtyř nelze průběh těchto parametrů porovnávat, protoţe virová náloţ v krvi nepřesáhla diagnosticky významnou hranici 1000 kopií/ml Stránka | 49

A) % CD38high

délka hospitalizace

+

přítomnost

+

CMV DNA kopie z CD3 CD8 >20%

anti-CMV IgM protilátek

podávání antivirotik

≥1000 kopií/ml

B) #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 0

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80

Dny od transplantace Obr. č. 14 Průběh sledovaných parametrů u 12 pacientů po transplantaci ledviny s diagnózou CMV infekce. A) Legenda ke schématu. B) Schéma nástupu CMV DNAémie (≥1000 kopií/ml periferní krve), zvýšení počtu CD38high z CD3+CD8+ nad 20%, přítomnosti anti-CMV IgM protilátek a zahájení léčby antivirotiky. Za symbolem “#” je uvedeno číslo pacienta.

v době jejich monitorování a diagnóza CMV infekce byla zaloţena na detekci virových deposit v biopsii štěpu (pacient č. 5), na základě nespecifických klinických příznaků (horečka, leukopenie a relativní lymfocytóza) v přítomnosti zvýšeného titru protilátek anti-CMV ve třídě IgM (pacient č. 2 a 10) a na detekci viru v moči (pacient č.11).

Stránka | 50

Ve sledovaném souboru pacientů nebyl přítomen ţádný pacient s diagnózou CMV infekce, u kterého by v průběhu monitorování nedošlo ke zvýšení procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů nad arbitrární limit 20%. U 23 pacientů bez klinických symptomů či příznaků CMV infekce bylo pozorováno zvýšené procento CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů nad arbitrární hranici 20%. U šestnácti z nich šlo pouze o mírné zvýšení mezi 21 a 36%, u sedmi bylo zaznamenáno vysoké osobní maximum procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů mezi 56 a 89%. U těchto pacientů byla vyloučena CMV i EBV infekce a nebyly pozorovány další klinické nebo laboratorní příznaky ţádné běţné virové infekce. Velmi zajímavý je fakt, ţe 8 z pacientů se zvýšeným procentem CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů bez dokumentované CMV infekce podstoupilo léčbu ATG (anti-tymocytární gamaglobulin) z důvodu rejekční epizody nebo v důsledku nálezu zvýšených panel-reaktivních protilátek před transplantací. U čtyř dalších pacientů, jeţ podstoupili léčbu ATG, byla v průběhu hospitalizace diagnostikována CMV infekce (pacient #3, #5, #9 a #11). Statisticky byla srovnána osobní maxima procent CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů u těchto skupin pacientů (viz Obr. č. 16): A) pacienti s transplantovanou ledvinou bez rejekčních komplikací, kterým nebyla diagnostikována CMV infekce; B) skupina

pacientů

s rejekční

epizodou,

kteří

byli

léčení

pulzní

dávkou

metylprednisolonu; C) pacienti, jimţ bylo podáno ATG z důvodu váţných rejekčních komplikací nebo z důvodu přítomnosti panel-reaktivních protilátek; D) pacienti s diagnózou CMV infekce. Jako statisticky významné byly potvrzeny rozdíly v osobních maximech u skupiny pacientů s diagnózou CMV infekce (D) a skupinami pacientů s transplantovanou ledvinou bez rejekčních komplikací bez CMV infekce (A)

Stránka | 51

50000 40000 30000 20000

25000 30

20000 15000

20

10000 10

25000 30

10000

DNA

3500 3000

40

2500 30

2000 1500

20

1000

0 -63 -62 -59 -57 -55 -52 -49 -44 -37 -30 -25 -15 -5

0

3

6

8 10 13 17 36

Den vzhledem ke dni, kdy byla diagnostikována CMV infekce

24

5

12

-1

-1 1

-1 8

10000 0

70000 60000

60

35000 30000 25000 20000 15000

20

10000

10

5000

0

0 -31 -29 -26 -22 -19 -18 -15 -13 -11 -8 -6 -4 -1 1 3

7 10


50000

50

40000

40

30000

30

20000

20

10000

0

0 -31 -30 -28 -26 -23 -21 -19 -16 -14 -12 -7

0

5

14


40000

30

80000

pacient #9

10

70

45000

40

12

DNA

50000

50

7

70

5 12 19

60

3

CD38

0

DNA

0 -39 -38 -37 -34 -32 -30 -27 -23 -18 0

20000

80

10000

70

10000

0

30000

20

0

20000

CD38

20000

10

-2 4

20

pacient #11

30000

20

40000 30

90

30000

80

40000 30

-2 8

30

90

50000

40

50000

70000

40000

70000

60000

40


60000

50

DNA 50

80000

50000

80000

70000

CD38


60000

40

-35 -34 -32 -30 -28 -26 -23 -21 -19 -16 -12 -7 -2

CD38high z CD3+8+ (%)

DNA

CD38

0

CMV DNA (kopie/ml)

CD38

pacient #8 DNA

6 10

80000

pacient #6

-47 -46 -44 -42 -39 -37 -32 -30 -28 -21 -15 -3

50


pacient #10

0

10

500

0

0

10

5000

-3 5

-3 8

4000


60 CMV DNA (kopie/ml)


70

4500

CD38

5000


5000

pacient #7

10


15000

0

6 10 16

50

60

20000

20


70

30000

40

10

0 -48 -47 -44 -42 -37 -33 -28 -23 -19 -12 -9 -7 -5 -1 3

60

35000

5000

0

70

40000

DNA

10000

60


40

70

45000

50

15000

Den vzhledem ke dni, kdy byla diagnostikována CMV infekce 50000

CD38

20000

20

-57 -55 -53 -50 -48 -46 -43 -41 -39 -36 -34 -32 -28 -20 0


30000

CMV DNA (kopie/ml)

35000


50

25000

0

9

pacient #5

60

40000

DNA CD38high z CD3+8+ (%)

70

45000

CD38

5

30000

30


50000

pacient #4

0 2

35000

40

10

5000 -50 -49 -47 -44 -42 -40 -36 -33 -26 -19 -14 -9 0


60

10000

0

0 -46 -45 -43 -42 -41 -39 -36 -32 -29-22 -15 -8 -1 3 21 24 27 31

70

15000

20 10

10000

0

20000

10000

pacient #12

9000

CD38

60 CD38high z CD3+8+ (%)

10

30

CMV DNA (kopie/ml)

20

25000

CMV DNA (kopie/ml)

30

40

40000

DNA

50

CMV DNA (kopie/ml)

60000

40

30000

45000

CD38

CMV DNA (kopie/ml)

70000

35000

50000

pacient #3

60

40000

DNA

50

70

45000

CD38

CMV DNA (kopie/ml)

80000

DNA 50

50000

pacient #2

8000

DNA 50

7000 6000

40

5000 30

4000 3000

20

CMV DNA (kopie/ml)

60


70

90000

CMV DNA (kopie/ml)

100000

CMV DNA (kopie/ml)

CD38



60

pacient #1

CMV DNA (kopie/ml)

70

2000 10

1000

0

0 -41

-39

-36

-34

-32

-27

-22

-18

-10

-5

0


Obr. č. 15 Grafy ukazující vztah mezi procentem CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů a mnoţstvím CMV DNA kopií v periferní krvi. V grafech jsou uvedena data všech měření, která byla pacientům s diagnózou CMV infekce provedena. Na ose X jsou zobrazeny dny vzhledem ke dni zahájení antivirové léčby, kdy byla pacientům nasazena antivirová léčba; levá osa Y zobrazuje procento CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů; pravá osa Y virovou náloţ pacienta (počet CMV DNA kopií/ml periferní krve).

a skupinou pacientů s rejekční epizodou, kteří byli léčeni metylprednisolonem (B). K vyhodnocení byl pouţit Mann-Whitney test a v obou případech bylo P<0,0001. Statisticky nebyl hodnocen rozdíl ve skupinách pacientů s diagnózou CMV infekce a skupinou pacientů, kteří podstoupili léčbu ATG, protoţe 4 pacienti jsou vzhledem ke kritériím zahrnuti v obou skupinách.

Stránka | 52

P < 0,0001

100

Osobní maxima CD38high z CD3+ CD8+ (%)

P < 0,0001

80

60

40

20

0

A n = 193

B n = 48

C

D

n = 16

n = 12

Obr. č. 16 Distribuce a mediány osobních maxim pacientů rozdělených do čtyř skupin. A) pacienti s transplantovanou ledvinou bez rejekčních komplikací, kterým nebyla diagnostikována CMV infekce; B) skupina pacientů s rejekční epizodou, jeţ byli léčení pulzní dávkou metylprednisolonu; C) pacienti, jimţ bylo podáno ATG z důvodu váţných rejekčních komplikací nebo z důvodu přítomnosti panelreaktivních protilátek; D) pacienti s diagnózou CMV infekce. Horizontální nepřerušené úsečky reprezentují medián procenta CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů u jednotlivých skupin, přerušovaná čára označuje úroveň arbitrárního limitu (20%). Symbol prázdného trojúhelníku symbolizuje pacienty ze skupiny s diagnostikovanou CMV infekcí, kterým bylo podáno ATG.

U sedmi z celkových 269 pacientů s transplantovanou ledvinou, kteří podstoupili antirejekční léčbu, nebyly pozorovány symptomy ani příznaky CMV infekce, přestoţe jim byla v krvi stanovena virová náloţ mezi 1 218 aţ 300 000 kopiemi/ml periferní krve (medián 9 435 kopií). Osobní maxima procent CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů u těchto pacientů se pohybovala v rozmezí od 5 do 18% (medián 6,0%) a nikdy nepřekročila arbitrární limit 20% (viz Obr. č. 17). Tito pacienti

Stránka | 53

nebyli po dobu hospitalizace léčeni pro CMV infekci a byli po 30 dnech od pozitivního nálezu CMV kopií v krvi propuštěni bez symptomatických komplikací CMV infekce.

60


50

40

30

20

10

-50

0 -40 -30 -20 -10 0 10 20 Dny vzhledem ke dni, kdy byla pacientům stanovena m axim ální virová nálož

30

Obr. č. 17 Vývoj procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů u 7 pacientů s virovou náloţí ≥1000 kopií/ml periferní krve bez diagnózy CMV infekce léčené antivirotiky. Přerušovaná čára reprezentuje arbitrární limit pozitivity (20% CD38high z CD3+CD8+).

U zbylých 234 pacientů v průběhu jejich hospitalizace osobní maximum procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů nikdy nepřesáhlo hodnotu arbitrárního limitu 20%. Při pouţití klinického rozhodnutí o přítomnosti CMV infekce jako referenční hodnoty byla stanovena senzitivita našeho testu – stanovení procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů jako znak probíhající akutní CMV infekce – na 100%. Specificita byla analýzou stanovena na 91%. Negativní prediktivní hodnota sledování procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů v našem souboru pacientů byla 100%, relativně nízká byla pozitivní prediktivní hodnota – 34%, protoţe pouze u 12 z 35 pacientů s procentem CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů přesahujícím arbitrární Stránka | 54

hladinu 20% byla na základě všech dostupných klinických i laboratorních ukazatelů diagnostikována akutní CMV infekce léčená antivirotiky (viz Tab. č. 10). CD38

high

+

+

z CD3 CD8 ≤ 20%

CD38

high

+

+

z CD3 CD8 > 20%

Celkem

CMV diagnóza-

234

23

257

CMV diagnóza+

0

12

12

CMV PCR DNA -

227

27

254

CMV PCR DNA +

7

8

15

234

35

269

Celkem

Tab. č. 10 Srovnání mezi CD38high z CD3+CD8+, CMV diagnózou a výsledkem real-time PCR CMV DNA.

Pro srovnání byla stanovena stejnými statistickými prostředky také senzitivita a specificita pro metodu stanovení kopií CMV DNA v periferní krvi – 66,6% a 97,3% u námi sledovaného souboru pacientů. Pozitivní prediktivní hodnota pro tento test měla hodnotu pro soubor pacientů po transplantaci ledvin 53,3% a negativní prediktivní hodnota 98,4%. Při srovnání dvou metod vyuţívaných v diagnostice CMV infekce u pacientů po transplantaci ledviny (stanovení počtu CMV DNA kopií v periferní krvi pomocí real-time PCR a stanovení procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů pomocí průtokové cytometrie) lze říci, ţe u 235 pacientů (87,36%) byly oba tyto testy ve shodě - z toho u 227 (84%) pacientů byly oba tyto testy negativní (pro riziko CMV infekce), u 8 (3,0%) pacientů byly oba tyto testy pozitivní. U 34 (12,6%) pacientů měly testy odlišný závěr: U sedmi (2,6%) pacientů nebylo při DNAémii v periferní krvi pozorováno zvýšené procento CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů nad arbitrární limit, u 27 (10,0%) bylo nalezeno zvýšené procento CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů při virové náloţi v krvi, která nedosáhla hranice CMV DNAémie - 1000 kopií/ml periferní krve. Viz Obrázek č. 18. V celém souboru pacientů po transplantaci ledvin bylo zaznamenáno Stránka | 55

Pacienti po transplantaci ledviny 27 pacientů; 10%

8 pacientů 3% 34 pacientů 13%

7 pacientů; 3%

227 pacientů 84%

shoda - obě negativní shoda - obě pozitivní neshoda - pozitivni genetika neshoda - CD38high >20%

Obr. č. 18 Shoda dvou metod sledování vyuţívaných v diagnostice CMV infekce: procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů pomocí průtokové cytometrie a přítomnost CMV DNAémie (≥1000 kopií/ml periferní krve) vyhodnocené pomocí real-time PCR. V grafu je vţdy uveden počet pacientů a přepočet na procenta. Pacienti s CD38high z CD3+CD8+>20%

ostatní 9 pacientů; 26%

rejekce léčená MP 6 pacientů; 17%

ATG 8 pacientů; 23%

CMV diagnóza 12 pacientů; 34%

Obr. č. 19 Pacienti po transplantaci ledviny, jejichţ procento CD38

high

z CD3+CD8+ přesáhlo arbitrární limit 20%. MP – metylprednisolon.

35 pacientů se zvýšeným procentem CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů nad arbitrární hranici. Z tohoto počtu tvořili pacienti s diagnózou CMV 34% (12 pacientů), 23% pacientů podstoupilo léčbu ATG (8), 17% pacientů mělo během hospitalizace kortikoidy léčenou rejekční epizodu (6), ostatní pacienti tvořili 26% (9) (viz Obr. č. 19).

Stránka | 56

70000

Spearman P = 0,162 r = 0,1351

40

Spearman P < 0,0001 r = 0,7632

30

CD3+DR+ (%)

50000

40000

30000

20

20000 10

10000

0

0

20

40 high

CD38

60 +

80

0

100

20

40

60

80

100

CD38high z CD3+ CD8+ (%)

Spearman P < 0,0001 r = -0,3983

80

60

Spearman P < 0,0001 r = 0,3310

60

CD8+ z CD3+ (%)

CD4+ z CD3+ (%)

0

+

z CD3 CD8 (%)

80

40

20

40

20

0 0

20

40 high

CD38

10

60

80

+

0

100

0

20

+

40

60

80

100

CD38high z CD3 + CD8+ (%)

z CD3 CD8 (%)

25

Spearman P < 0,0001 r = -0,4354

Spearman P < 0,0001 r = -0,4381

20

počet leukocytů (10 6/ml)

8

poměr CD4/CD8

DNA CMV kopie (kopie/ml)

60000

6

4

15

10

5

2

0

0 0

20

40

CD38

high

60 +

80 +

z CD3 CD8 (%)

100

0

20

40

60

80

100

CD38high z CD3+ CD8+ (%)

Stránka | 57

60

1000

Spearman P = 0,0359 r = -0,1553

Spearman P = 0,3360 r = 0,0715

800

urea (mmol/l)

kreatinin ( mol/ml)

40

20

600

400

200

0

0

20

40

60

CD38 high z CD3 + CD8 + (%)

80

100

0 0

20

40

60

80

100

CD38 high z CD3 + CD8+ (%)

Obr. č. 20 Grafické zobrazení korelace procenta CD38high z CD3+CD8+ s počtem CMV DNA kopií v periferní krvi, procentem CD3+HLA-DR+ T-lymfocytů, procentem CD4+ T-lymfocytů, procentem CD8+ T-lymfocytů, poměrem CD4+/CD8+, s počtem leukocytů v periferní krvi a hladinami kreatininu a urey v séru periferní krve u pacientů po transplantaci ledviny s diagnózou CMV infekce. V jednotlivých grafech jsou uvedeny vypočítané hodnoty Spearmanova korelačního koeficientu a hodnota P.

Hodnoty jednotlivých laboratorních vyšetření počtu CMV DNA kopií v periferní krvi, procenta CD3+HLA-DR+ T-lymfocytů, procenta CD4+ T-lymfocytů z lymfocytů, procenta CD8+ T-lymfocytů z lymfocytů, poměru CD4+/CD8+, počtu leukocytů v periferní krvi a hodnoty urey a kreatininu v séru periferní krve u pacientů po transplantaci ledvin s diagnózou CMV infekce byly korelovány s výší procent CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů (viz Obr. č. 20). Ke statistickému vyhodnocení korelací byl pouţit Spearmanův korelační koeficient. Silná korelace byla nalezena mezi procenty CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů a procentem CD3+HLA-DR+, dále pak s relativním počtem lymfocytů CD4+ a CD8+ z lymfocytů periferní krve, poměrem CD4/CD8 lymfocytů a počtem lymfocytů. Nebyla nalezena korelace poměru CD38high z CD3+CD8+ s počtem kopií CMV DNA v periferní krvi a s hodnotou kreatininu v séru periferní krve, ale jako statisticky významná byla vypočítána korelace s hladinou urey.

Stránka | 58

Výsledky II. – pacienti po transplantaci jater

V období červen 2004 – prosinec 2009 byla v Centru kardiovaskulární a transplantační chirurgie v Brně 162 pacientům provedena ortotopická transplantace jater. Charakteristika souboru pacientů je uvedena v Tabulce č.11. V době jejich hospitalizace byla u 10 z nich (6 muţů, 4 ţeny) zahájena léčba antivirotiky na základě diagnózy cytomegalovirové infekce. Pouze v jednom případě šlo o primární infekci

pravděpodobně

přenesenou

transplantovaným

orgánem

od

dárce

s pozitivními protilátkami anti-CMV ve třídě IgG. Zbylých 9 pacientů prodělalo reinfekci nebo reaktivaci CMV infekce (viz Tab. č. 12).

Pacienti

po

transplantaci

jater

s diagnózou CMV infekce Počet (%) Průměrný věk ± SD Medián věku (5%; 95% percentil)

Muži

Ženy

Muži+ženy

6 (60,0%)

4 (40,0%)

10 (100%)

46,5 ± 14,2

48,75 ± 10,7

47,4 ± 12,3

50,5 (27,0; 60,5)

53 (35,85; 55,7)

53 (28,05; 56,0)

Tab. č. 11 Charakterizace skupiny pacientů s transplantovanými játry, kterým byla diagnostikována CMV infekce.

Serologický

Serologický

status příjemce

status dárce

Počet

Číslo

(anti-CMV IgG)

(anti-CMV IgG)

pacientů

pacienta

-

+

1

#3

+

-

5

#1,#2,#5,#7,#8

+

+

4

#4,#6,#9,#10

Tab. č. 12 Sérologické staty anti-CMV IgG protilátek u příjemců transplantovaných jater, kterým byla v době hospitalizace diagnostikována CMV infekce.

Stránka | 59

Na základě klinických příznaků a laboratorních výsledků (výběr v Tab. č. 13.) byla u těchto pacientů stanovena diagnóza CMV infekce a zahájena léčba antivirotiky mezi 9. a 52. dnem po transplantaci (medián 25,0). Průběţné hodnoty procenta CD38high lymfocytů z CD3+CD8+ této skupiny pacientů v době pooperačního monitorování jsou znázorněny na Obrázku č. 21. Ke zvýšení procenta CD38high lymfocytů z CD3+CD8+ nad arbitrární hranici 20% došlo u všech transplantovaných pacientů s CMV infekcí, a to v osmi případech v rozmezí 2-33 dní před stanovením této diagnózy (průměr: 10,1 dní; medián: 4,5 dní). U dvou pacientů došlo ke zvýšení nad 20% v den, kdy byla zahájena antivirová léčba. Při zahájení léčby (nebo při posledním měření před jejím zahájením) se hodnoty CD38high lymfocytů z CD3+CD8+ u všech 12 pacientů pohybovaly mezi hodnotami 19 aţ 79%. Kromě procenta CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů byly sledovány i přítomnost protilátek anti-CMV ve třídě IgM a počet kopií CMV DNA v periferní krvi. Jejich přítomnost u pacientů s diagnózou CMV infekce a doba, po kterou byla podávána antivirotika před ukončením hospitalizace, jsou znázorněny na Obrázku č. 22. U 4/10 pacientů došlo k překročení hraničního limitu pro CMV DNAémii v periferní krvi (≥1000 kopií/ml). U 6/10 pacientů byla pozorována dlouhodobá přítomnost IgM anti-CMV protilátek.

Stránka | 60

54/M

jaterní cirhóza toxonutritivní etiologie

+/-

17

14

Ne

<1000

37

3

33/F

akutní nebo subakutní selhání jater neznámé etiologie

-/+

28

9

ne

13800

32

4

36/M

akutní nebo subakutní selhání jater - poúrazová ischemie jater

+/+

39

6

ne

91000

76

5

62/M


+/-

37

35

ano

<1000

51

6

22/M

primární sklerotizující cholangoitida

+/+

46

40

ano

<1000

57

7

56/M

metastázy karcinoidu do jater

+/-

52

38

ano

2300

65

8

54/F

jaterní cirhóza s moţnou autoimunitní etiologií

+/-

21

18

ano

<1000

58

9

52/F


+/+

22

1

ano

9000

79

10

56/F

jaterní cirhóza, kryptogenní (poléková)

+/+

9

9

ne

<1000

21

CD3+CD8+ (%)

Osobní maximum procenta CD38high z

2

infekce

30

Sérokonverze před diagnózou CMV

<1000

z CD3+CD8+ nad arbitrární limit

Maximální virová nálož (kopie/ml)

Den prvního zvýšení procenta CD38high

Ano

diagnostikována CMV infekce

15

Den od tranplantace, kdy byla 15

(dárce/příjemce) +/-

Serologický status anti-CMV IgG


Věk/pohlaví 47/M

Pacient č. 1

Diagnóza jež vedla k tranplantaci jater

Tab. č. 13 Podrobná charakteristika pacientů po transplantaci jater, kterým byla nasazena antivirová léčba na základě diagnózy CMV infekce. Stránka | 61

90

pac#1 pac#2

80

pac#3 pac#4

70


pac#5 pac#6

60

pac#7 pac#8

50

pac#9 40

pac#10

30 20 10 0 -60

-40

-20

0

20

40

60

Den vzhledem ke dni, kdy byla nasazena antivirotika

Obr. č. 21 Vývoj procenta subpopulace CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů u pacientů s transplantovanými játry. Den 0 je dnem, kdy byla diagnostikována CMV infekce a byla zahájena léčba antivirotiky. Tečkovaná čára symbolizuje arbitrární mez 20%, jejíţ překročení bylo v této studii povaţováno za znak CMV infekce.

U 6/10 pacientů s CMV infekcí nebyl v periferii zachycen počet CMV DNA kopií přesahující hraniční hodnotu 1000 kopií/ml a není proto moţné hodnotit vzájemný vztah s vývojem počtu procenta CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů. Ve čtyřech případech, kdy kopie v periferní krvi byly zachyceny, byl ve stejné době zachycen nárůst počtu procenta CD38high buněk (Obr. č. 23). Jejich diagnóza CMV

Stránka | 62

A) % CD38high

délka hospitalizace

+

+

podávání

CMV DNA kopie z CD3 CD8 >20% ≥1000 kopií/ml

přítomnost

antivirotik

anti-CMV IgM protilátek

B) #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 0

5

10 15

20 25 30

35 40 45 50

55 60 65 70 75 80 85

90 95 100

Dny od transplantace Obr. č. 22 Přítomnost pozitivity laboratorních nálezů v parametrech pouţívaných v diagnostice CMV infekce u pacientů po transplantaci jater s diagnózou CMV infekce. A) Legenda ke schématu. B) Schéma nástupu CMV DNAémie (≥1000 kopií/ml periferní krve), zvýšení počtu CD38high z CD3+CD8+ > 20%, přítomnosti anti-CMV IgM protilátek a zahájení léčby antivirotiky.

infekce byla zaloţena na následujících klinických nebo laboratorních příznacích: u pacientů #1 a #2 na nespecifických klinických příznacích, u pacientů #5 a #8 na nespecifických klinických příznacích a významném vzrůstu titru protilátek anti-CMV IgM, u pacienta #6 byla nalezena CMV DNA v sekretu z dutiny břišní a byla zaznamenána sérokonverze anti-CMV IgM protilátek, u pacienta #10 byly v biopsii

Stránka | 63

jaterní tkáně nalezeny změny konzistentní s diagnózou CMV infekce, ale bez typických virových inkluzí. Všichni z deseti pacientů s diagnózou CMV infekce vykazovali zvýšené procento CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů nad arbitrární mez 20%.

2500 30

2000 1500

20

3500 3000

40

2500 30

2000 1500

20 10

500

0 7

12

19

26

31

40

0 -17

47

CMV DNA

60000 50000

40

40000

30

30000

20

20000

10

10000

-5

-3

0

4

9

60 4000 3500 3000

40

2500 30

2000 1500

20

70

-5 -2

0

2

6

2000 1500

20

CMV DNA (kopie/ml)

2500 30

-6

-1

1

6

15

22

5000

pacient #6 CD38

4500

CMV DNA

4000 3500 3000

40

2500 30

2000 1500

20

500

0

4500

CMV DNA

4000

50

3500 3000

40

2500 30

2000 1500

20

90 80

0 -5

-3

-1

3

6

12 19 25 32 39

pacient #10


13 20 29

10000

CD38

9000

CMV DNA

8000

70

7000

60

6000

50

5000

40

4000

30

3000

20

2000 1000 0 -7

-2

0

3

7

12

17


5000

CD38

4500

CMV DNA

60

6

pacient #9

-22 -21 -18 -16 -14 -11


70

1

0

0 -21 -20 -19 -17 -15 -12 -10 -8

14

-3

10

500


0 -46 -45 -43 -41 -38 -36 -34 -29 -22 -15 -10 -6

5000

CD38

10

0 0

-11

1000

1000

500

0

-15


1000 10

-19

50

9 15 23 28 30

pacient #8

60 CD38high z CD3+8+ (%)

3000

-22

10

0

4000

40

-52 -51 -49 -47 -45 -43 -41 -38 -35 -33 -30 -28 -26 -23 -19 -14 -7

70

4500

0

3500

-25

500

4500

50

0 -27


1000

5000

CMV DNA

2000

-28


CD38

6000

0

5000

-37 -35 -33 -30 -27 -23 -20 -16 -12 -9

pacient #7

8000

20

16

50

52

33

25

2

11

-1 0

-1 9

-2 4

-2 9

-3 3

-3 7

-7

CMV DNA



-10

10

0

-3 9

0

CMV DNA (kopie/ml)

70000

50

60

-12

CD38

80000

60

70

-14

pacient #5

60



90000

CD38

70

70

100000

pacient #4

80

10000



90

-16

CMV DNA (kopie/ml)

3


0


-4

12000

30

4000

CMV DNA (kopie/ml)

-7

14000

40

4000

50

3500 3000

40

2500 30

2000 1500

20

CMV DNA (kopie/ml)

-9

16000

50

10

500

0

0 -15 -14 -11

18000

CMV DNA

1000

1000 10

CD38

CMV DNA (kopie/ml)

3000

40

4000

50

20000

pacient #3

60

CMV DNA (kopie/ml)

CMV DNA

CMV DNA (kopie/ml)

3500

70

4500

CD38

4000

50

5000

pacient #2

60

CMV DNA (kopie/ml)

CMV DNA


70

4500

CD38

CMV DNA (kopie/ml)


5000

pacient #1

60


70

1000

10

500

0

0 -12

-10

-7

-5

-3

0

2

4

9

14


Obr. č. 23 Grafy ukazující vztah mezi procentem CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů a mnoţstvím CMV DNA kopií v periferní krvi pacientů s diagnózou CMV infekce. V grafech jsou uvedeny hodnoty všech měření, která byla provedena. Bod 0 na ose X reprezentuje den, kdy byla započata antivirová léčba; na levé ose Y je procento CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů; na pravé ose Y je virová náloţ v periferní krvi pacienta (počet CMV DNA kopií/ml).

U 79 pacientů (z celkových 162) bylo nalezeno zvýšené procento CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů nad arbitrární limit, přestoţe nevykazovali ţádné další znaky

Stránka | 64

či příznaky CMV infekce a ta jim nebyla v průběhu hospitalizace diagnostikována (viz Obr. č. 24). Mezi těmito pacienty byli 4 nemocní, kteří podstoupili léčbu ATG a 10 pacientů po antirejekční kúře metylprenisolonem. Procento CD38high lymfocytů se pohybovalo v rozmezí 21 a 96% s průměrnou hodnotou 45,1% (SD = 19,8%) a mediánem 41,0 (5% percentil 21,0; 95% percentil 83,6%).

CMV diagnóza; 10 pacientů; 11% ostatní; 65 pacientů; 74%

rejekce léčená MP; 10 pacientů; 11% ATG; 4 pacienti; 4%

Obr. č. 24 Pacienti po transplantaci jater, jejichţ procento CD38

high

z CD3+CD8+ přesáhlo arbitrární limit pozitivity (20%). MP – metylprednisolon.

V souboru pacientů po transplantaci jater jsme zaznamenali 8 pacientů se signifikatní virovou náloţí nad hranici 1000 CMV DNA kopií v rozmezí 1 000 – 611 000 kopií/ml periferní krve (medián: 14 800 kopií/ml), kteří nebyli léčeni pro diagnózu CMV infekce (viz Obr. č. 25). U sedmi z nich překročilo personální maximum arbitrární hranici pro procento CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů (v rozsahu 41 – 96%) (viz Tab. č. 14). U 6 pacientů byly přítomny anti-CMV IgM protilátky. U 4 (50%) pacientů (pacienti #1, #4, #6, #8) s pozitivitou počtu CMV DNA kopií (≥1000/ml) bylo reagováno na laboratorní nález sníţením intenzity imunosupresivní terapie.

Stránka | 65


pac DNA #1 pac DNA #2 pac DNA #3 pac DNA #4 pac DNA #5 pac DNA #6 pac DNA #7 pac DNA #8

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

-55

-45

-35

-25

-15

-5

5

15

25

35

Dny vzhledem ke dni, kdy byla pacientům stanovena maximální virová nálož

Obr. č. 25 Vývoj procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů u 8 pacientů s virovou náloţí ≥1000 kopií/ml periferní krve, kterým nebyla diagnostikována CMV infekce. Přerušovaná čára reprezentuje arbitrární limit 20% CD38high z CD3+CD8+.

Max.

Max.

Snížení dávky

CD38high

virová

Přítomnost

Podání

imunosupresiv v reakci

Pacient

z CD3+CD8+

nálož

IgM

Thymoglobulinu

na laboratorní nález

Pacient #1

41

16800

ano

ne

ano

Pacient #2

96

96000

ano

ano

ne

Pacient #3

53

19400

ano

ne

ne

Pacient #4

41

1000

ano

ano

ano

Pacient #5

81

10700

ano

ne

ne

Pacient #6

79

12800

ano

ne

ano

Pacient #7

18

2800

ne

ne

ne

Pacient #8

86

611000

ne

ne

ano

Tab. č. 14 Charakteristika pacientů s počtem kopií CMV DNA v periferii ≥1000 kopií bez diagnózy CMV infekce.

Stránka | 66

Pacienti po transplantaci jater byli rozděleni do skupin: A) pacienti bez rejekčních komplikací, kterým nebyla diagnostikována CMV infekce; B) skupina pacientů s rejekční epizodou léčení pulzní dávkou metylprednisolonu; C) pacienti, jimţ bylo podáno ATG z důvodu váţných rejekčních komplikací nebo z důvodu přítomnosti panel-reaktivních protilátek; D) pacienti s diagnózou CMV infekce.

Osobní maxima procenta CD38high z CD3+ CD8+ (%)

P = 0,01

100

P = 0,008

P = 0,0001

80

60

40

20

0 A

B

C

n = 113

n = 34

n=5

D n = 10

Obr. č. 26 Distribuce a mediány osobních maxim pacientů rozdělených do skupin.: A) pacienti s transplantovanými játry bez rejekčních komplikací, kterým nebyla diagnostikována CMV infekce; B) skupina pacientů s rejekční epizodou, kteří byli léčení pulzní dávkou metylprednisolonu; C) pacienti jimţ bylo podáno ATG z důvodu váţných rejekčních komplikací nebo z důvodu přítomnosti panel-reaktivních protilátek; D) pacienti s diagnózou CMV infekce. Horizontální nepřerušené úsečky reprezentují medián procenta CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů u jednotlivých skupin, přerušovaná čára označuje úroveň arbitrárního limitu (20%). Symbol prázdného trojúhelníku symbolizuje pacienta ze skupiny s diagnostikovanou CMV infekcí, kterému bylo podáno ATG.

Stránka | 67

Při statistickém srovnání byly mezi těmito skupinami pacientů nalezeny statisticky významné rozdíly v osobních maximech procent CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů (viz Obr. č. 26). Pro toto srovnání byl vyuţit neparametrický Man-Whitney test. S pravděpodobností P = 0,01 byly jako signifikantně rozdílné nalezeny osobní maxima skupiny pacientů s diagnózou CMV infekce (D) proti skupině pacientů bez rejekčních

komplikací,

kterým

nebyla

diagnostikována

CMV

infekce

(A).

S pravděpodobností P = 0,0001 pak byly nalezeny statisticky významné rozdíl mezi osobními maximy procent CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů skupiny pacientů s rejekční epizodou, jeţ byli léčeni pulzní dávkou metylprednisolonu (B) a skupinou pacientů s diagnózou CMV infekce (D). Jako statisticky významné byly shledány i rozdíly v osobních maximech u souboru pacientů bez rejekčních komplikací, kterým nebyla diagnostikována CMV infekce (A) vzhledem k souboru pacientů s rejekční epizodou,

jeţ

byli

léčeni

pulzní

dávkou

metylprednisolonu

(B)

a to s pravděpodobností P = 0,008.

Stránka | 68

50

Spearman P < 0,0001 r = 0,4280

40

60000

30

CD3+DR+ (%)

80000

40000

0

20

40 high

CD38

80

60 +

80

0

100

20

+

40

CD38

z CD3 CD8 (%)

high

60 +

80

100

+

z CD3 CD8 (%)

80

Spearman P = 0,0078 r = -0,2096

Spearman P < 0,0001 r = 0,4107

60

CD8+ z CD3+ (%)

60

CD4+ z CD3+ (%)

20

0

0

40

20

0

Spearman P < 0,0001 r = 0,7537

10

20000

40

20

0

20

40

CD38

high

8

60 +

80

0

100

0

20

+

40

60

80

100

CD38 high z CD3 + CD8+ (%)

z CD3 CD8 (%)

30

Spearman P < 0,0001 r = -0,3599

Spearman P = 0,0072 r = -0,2118

počet leukocytů (10 6/ml)

6

poměr CD4/CD8

DNA CMV kopie (kopie/ml)

100000

4

20

10

2

0

0

20

40

60


80

100

0

0

20

40

60

80

100


Stránka | 69

90

70

Spearman P = 0,0108 r = -0,2082

80

Spearman P = 0,0010 r = -0,2670

60

70 50

ALT ( kat/l)

AST ( kat/l)

60 50 40

40

30

30 20 20 10

10 0

0

20

40

CD38

high

60 +

80

0

100

0

+

20

40

60

80

100

CD38high z CD3 + CD8 + (%)

z CD3 CD8 (%)

Obr. č. 27 Grafické zobrazení korelace CD38high z CD3+CD8+ u pacientů s diagnózou CMV infekce pro všechna provedená měření s počtem CMV DNA kopií v periferní krvi, procentem CD3+HLA-DR+ T-lymfocytů, procentem CD4+ T-lymfocytů, procentem CD8+ T-lymfocytů, poměrem CD4+/CD8+, s počtem leukocytů v periferní krvi a hladinami aspartátaminotransferázy (AST) a alanintransaminázy (ALT) v séru periferní krve pacientů po transplantaci jater s diagnózou CMV infekce. V jednotlivých grafech jsou uvedeny hodnoty Spearmanova korelačního koeficientu.

U pacientů po transplantaci jater s diagnostikovanou CMV infekcí byla stanovena míra korelace procenta CD38high T-lymfocytů z CD3+CD8+ v kaţdém měření v průběhu monitorování se stanoveným počtem CMV DNA kopií v periferní krvi (nad 1000 kopií/ml periferní krve), procentem CD3+HLA-DR+ T-lymfocytů, procentem

CD4+

T-lymfocytů,

procentem

CD8+

T-lymfocytů,

poměrem

CD4+/CD8+, počtem leukocytů v periferní krvi a hodnotami aspartátaminotransferáza (AST) a alanintransaminázy (ALT) (viz Obr. č. 27). Ke statistickému vyhodnocení korelace byl pouţit Spearmanův korelační koeficient. Silná korelace byla nalezena mezi procenty CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů a procentem CD3+HLA-DR+, počtem kopií CMV DNA v krvi, dále pak s relativním počtem lymfocytů CD4+ a CD8+ z lymfocytů periferní krve, poměrem CD4/CD8 lymfocytů a počtem lymfocytů (viz Obr. č. 27). Byla nalezena korelace i mezi procentem CD38high a hladinou ALT a AST v séru periferní krve. Stránka | 70

S vyuţitím diagnózy CMV infekce jako referenčního parametru byla pro pacienty po transplantaci jater stanovena senzitivita metody sledování CD38high T-lymfocytů z CD3+CD8+ T-lymfocytů na 100%, vzhledem k velkému počtu pacientů s falešně pozitivními výsledky byla specificita testu v našem souboru pacientů 48%. Pozitivní prediktivní hodnota překročení 20% arbitrárního limitu u subpopulace CD38high T-lymfocytů z CD3+CD8+ byla 11%, negativní prediktivní hodnota byla stejně jako v souboru pacientů po transplantaci ledvin 100%. Stejným postupem byly stanoveny hodnoty senzitivity a specificity metody real-time PCR CMV DNA k určení počtu kopií CMV DNA v periferní krvi (pozitivitou je CMV DNAémie, kdy počet kopií přesáhne hodnotu 1000 kopií/ml) - 40% a 94,7%. Pozitivní prediktivní hodnota testu stanovení kopií v periferní krvi v tomto souboru pacientů nabyla hodnoty 66,6%, negativní prediktivní hodnota byla 96%. V Tabulce č.15 je uvedeno srovnání pozitivit metod pouţívaných k predikci a stanovení diagnózy CMV infekce: pozitivity procenta CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů a stanovení počtu kopií CMV DNA v periferní krvi pomocí real-time PCR.

CD38

high

+

+

z CD3 CD8 ≤ 20%

CD38

high

+

+

z CD3 CD8 > 20%

Celkem

CMV diagnóza-

78

74

152

CMV diagnóza+

0

10

10

CMV PCR DNA -

77

73

150

CMV PCR DNA +

1

11

12

Celkem

78

84

162

Tab. č. 15 Srovnání výsledků sledování procenta CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů, CMV diagnózy a výsledku real-time PCR pro stanovení počtu kopií CMV DNA (CMV PCR DNA).

Celkově lze o srovnání těchto dvou laboratorních metod vyuţívaných při sledování

pacientů

v období

po

transplantaci

solidních

orgánů

v Centru

kardiovaskulární a transplantační chirurgie v Brně říci, ţe z celkového počtu Stránka | 71

162 pacientů po transplantaci jater vykazovalo 73 (45%) z nich negativitu v obou testech. U jedenácti (7%) došlo ke shodě v pozitivitách v obou metodách. Při srovnání procenta CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů s počtem kopií CMV DNA v periferní krvi byl u 77 transplantovaných (47%) překročen arbitrární limit, přestoţe stanovený počet kopií nebyl větší neţ signifikantních 1000 kopií/ml periferní krve. Pouze u jednoho pacienta (1%) nebylo v přítomnosti CMV DNAémie pozorováno zvýšení procenta CD38high z CD3+CD8+ nad arbitrární mez (viz Obr. č. 27).

Pacienti po transplantaci jater 11 pacientů 7%

77 pacientů 47% 78 pacientů 47%

73 pacientů 45%

shoda - obě negativní shoda - obě pozitivní neshoda - pozitivni genetika neshoda - CD38high >20%

1 pacient

1%

Obr. č. 27 Procentuální shoda mezi metodou sledování počtu procenta CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů a přítomností CMV DNAémie (≥1000 kopií/ml periferní krve) hodnocené pomocí real-time PCR.

Stránka | 72

6. Diskuze Transplantace solidních orgánů je spojena s vysokým výskytem komplikací, jakými jsou především rejekce transplantovaného orgánu a infekce. Mezi typické oportunní patogeny ohroţující zdraví a ţivot pacienta po transplantaci solidního orgánu patří i cytomegalovirus. Zahájení včasné antivirové léčby znamená pro pacienty po transplantaci solidních orgánů výrazné sníţení rizika CMV nemoci s jejími moţnými ţivot ohroţujícími komplikacemi jako je útlum kostní dřeně, pneumonie, myokarditida, hepatitida, nefritida, cystitida, retinitida, enteritida, nebo pankreatitida (Fishman et al., 1998). Nepřímo můţe mít CMV infekce vliv na zvýšený výskyt akutních a chronických rejekcí, sekundárních bakteriálních, virových a plísňových onemocnění, rozvoj potransplantační lymfoproliferativní nemoci asociované s EBV infekcí a sníţení doby přeţívání štěpů a pacientů s transplantovaným orgánem (Fishman et al., 1998; Snydman et al. 1999; Härmä et al., 2006). V našem souboru pacientů jsme zaznamenali výskyt CMV infekce u 4,5 % pacientů po transplantaci ledviny a u 6,2% pacientů po transplantaci jater, coţ je výrazně niţší procento neţ je udáváno v literatuře, kde je udáváno procento pacientů s CMV infekcí u transplantace ledvin 8-29,8% a u transplantace jater 29-50%, (Corona-Nakamura et.al, 2009; Siu et al., 2000; Sola et al., 2003; Ho et al, 1994; Lautenschlager et al., 2005; Müller et al., 2012). Tato diskrepance můţe být zapříčiněna faktem, ţe pacienty jsme měli moţnost pravidelně sledovat pouze v době jejich hospitalizace po dobu 1-2 měsíců, přičemţ nástup CMV infekce je typický v prvním aţ čtvrtém měsíci od transplantace (Fisman et al.; 1998; Kute et al., 2012). Stránka | 73

V současné době je pro diagnostiku CMV infekce v laboratořích dostupná široká nabídka diagnostických testů. Ideální test pro akutní CMV infekci by měl být specifický a senzitivní a měl by mít vysokou negativní a pozitivní prediktivní hodnotu. Za celosvětový standard s těmito vlastnostmi je k dnešnímu dni povaţována moţnost detekce a kvantifikace viru CMV pomocí real-time PCR. Tato metoda je široce vyuţívaná, protoţe není časově příliš náročná (řádově hodiny), má vysoký stupeň reproducibilty a je v dnešní době ekonomicky i přístrojově dostupná. Počet kopií CMV DNA koreluje s průběhem CMV infekce a můţe predikovat infekci s pozdním nástupem (Sia et al., 2000a; Li et al., 2003). Omezením této metody je, ţe pokud je CMV infekce lokalizovaná do konkrétní tkáně (gastridita, esofagitida, enteritida, colitida, retinitida), nemusí být v periferní krvi detekovatelná ţádná nebo jen nízká virová náloţ (Arthurs et al., 2007; Eid et al., 2008; Razonable et al., 2008; Drew et al., 2007; Ljungman et al., 2002; Ruell et al., 2007). Ve shodě s těmito publikacemi nebylo detekováno mnoţství CMV DNA v periferní krvi přesahující hranici 1000 kopií/ml periferní krve u čtyř z dvanácti pacientů s diagnostikovanou CMV infekcí z naší kohorty pacientů po transplantaci ledviny a u šesti z deseti pacientů s transplantovanými játry, u nichţ probíhala pouze lokalizovaná orgánová infekce. Diagnóza CMV infekce u těchto pacientů byla zaloţena na základě biopticky prokázané lokalizovaná CMV infekce – potvrzená přítomnost CMV inkluzí, výskytu CMV v moči, sérokonverze pacienta či na kombinaci více nespecifických příznaků po vyloučení jiných moţných diagnóz. Těmto pacientům nebyly detekovány kopie CMV DNA v počtu přesahujícím limit CMV DNAémie ani následujících 10 aţ 30 dní po zahájení antivirové léčby, byla však nelezena vysoká procenta CD38high z CD3+CD8+ T–lymfocytů, coţ podporovalo diagnózu CMV infekce. U pacientů s diagnostikovanou CMV infekcí, kteří přesáhli v době hospitalizace počet 1000

Stránka | 74

kopií/ml periferní krve, kopíroval trend vývoje procenta subpopulace CD38high z CD3+CD8+ buněk počet kopií CMV DNA v periferní krvi u 6/8 pacientů po transplantaci ledviny a u 3/4 pacientů po transplantaci jater. Lze tedy říci, ţe pokud pacienti netrpěli infekcí lokalizovanou do konkrétní tkáně či orgánu, byla vidět velmi podobná kinetika obou sledovaných parametrů. U pacientů s transplantovanými játry s diagnózou CMV infekce byla téţ nalezena statisticky významná pozitivní korelace procenta CD38high z CD3+CD8+ T–lymfocytů s počtem kopií CMV DNA/ml periferní krve.

To,

ţe

nebyla

nalezena

statisticky

významná

korelace

u

pacientů

po transplantaci ledvin, můţe být dáno nízkým počtem pacientů s diagnózou CMV infekce a malým počtem vyšetření v době, kdy byl počet CMV DNA kopií v periferní krvi nad limit CMV DNAémie. Při analýze korelace sledovaného procenta CD38high z CD3+8+ T–lymfocytů s dalšími v naší laboratoři rutinně sledovanými imunologickými parametry byly u skupin pacientů s transplantovanou ledvinou i s transplantovanými játry nalezeny statisticky významné pozitivní korelace mezi sledovaným procentem CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů a procentem HLA-DR+ z CD3+ a procentem CD8+ z CD3+ lymfocytů. Statisticky významná negativní korelace procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů byla nalezena s procentem CD4+ z CD3+ lymfocytů, poměrem CD3+CD4+ a CD3+CD8+ lymfocytů a absolutním počtem leukocytů v krvi. Všechna tato sledovaná procenta a počty buněk: procento HLA-DR+ z CD3+, procento CD8+ z CD3+ lymfocytů, procento CD4+ z CD3+ lymfocytů, poměr CD3+CD4+ a CD3+CD8+ lymfocytů a absolutní počet leukocytů v krvi, jsou typickými sledovanými průvodními laboratorními znaky virové infekce (Nordoy et al., 1999; Sun et al., 2005; Wang et al., 2004, Corona-Nakamura et al., 2009, Rentenaar et al., 2001). Korelace s nimi tak

Stránka | 75

podporuje význam sledování znaku CD38high jako pomocného laboratorního znaku virové infekce. Zdá se, ţe v některých případech je metoda monitorování CD38high z CD3+CD8+ u pacientů po transplantaci ledvin citlivější, protoţe k překročení arbitrární hranice 20% došlo u 9 z 12 pacientů (75%) dříve neţ k nárůstu kopií CMV DNA nad hranici CMV DNAémie, a to o 3-32 dní. U pacientů po transplantaci jater došlo k překročení arbitrárního limitu CD38high z CD3+CD8+ nad 20% u 8 z 10 (80%) pacientů 2-33 dní před diagnózou, u zbylých dvou pak v den diagnózy CMV infekce. Při srovnávání statisticky významných rozdílů mezi osobními maximy CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů u pacientů bez diagnózy CMV infekce, osobními maximy pacientů s rejekčními komplikacemi a osobními maximy pacientů s rejekční epizodou léčenou kortikoidy a pacienty s diagnózou CMV infekce byly nalezeny sníţené hodnoty

u

prvních

dvou

skupin

ve

srovnání

s

třetí

a

to

u

pacientů

s transplantovanými játry i ledvinami. Metoda se tedy nezdá být falešně pozitivně ovlivňována antirejekční léčbou kortikoidy. Zajímavý je fakt, ţe významný podíl pacientů, kterým byla podána antitymocytární gamaglobulinová terapie (z důvodu kortikorezistentní rejekce nebo profylakticky v přítomnosti vysokého procenta panel-reaktivních protilátek), dosáhl v průběhu sledování vysokých hodnot CD38high z CD3+CD8+ přesahujících arbitrární limit 20%. Je známo, ţe podání ATG pacientům po transplantaci solidních orgánů zvyšuje riziko CMV infekce i nemoci (Taherimahmoudi et al., 2009; Siu et al., 2000). Celkově byl ATG podán 20 pacientům a dvanáct z nich mělo zvýšeno procento CD38high z CD3+CD8+ nad arbitrární mez - u čtyř (4/20; 20%) byla diagnostikována CMV infekce, u zbylých osmi (8/20; 40%) neukazoval ţádný z laboratorních nálezů ani klinické symptomy na CMV infekci, nelze však vyloučit asymptomatickou CMV

Stránka | 76

infekci. Je zde nutno připomenout, ţe pacienti po léčbě ATG jsou léčení profylakticky antivirotiky. Přesto jsou ale transplantovaní pacienti po podání ATG velice silně imunokompromitováni a bylo publikováno, ţe v případě jeho podání se riziko CMV infekce u pacientů po transplantaci ledviny zvyšuje více neţ třikrát (Siu et al., 2000). Je ale velmi pravděpodobné, ţe by v případě zvýšeného počtu CD38high lymfocytů z důvodu rozvíjející se infekce došlo i k rozvoji dalších symptomů cytomegalovirové infekce či byla detekována sérokonverze nebo DNAémie. Lze tak spekulovat o tom, ţe nárůst procenta CD38high T-lymfocytů můţe být způsoben změnou produkce cytokinů - takzvanou „cytokinovou bouří“, ke které dochází po léčbě ATG (BeirasFernandez et al., 2009; Stauch et al., 2009), která by mohla vést k aktivaci a/nebo proliferaci této CD8+ subpopulace T-lymfocytů. Nelze téţ vyloučit, ţe po podání ATG jsou do periferie vyplavovány nezralé formy T-lymfocytů, které za fyziologických podmínek u dospělých ztrácí znak CD38 ze svého povrchu před opuštěním tymu (Terstappen et al., 1992;Tenca et al., 2003; McCloskey et al., 1997). V literatuře je udáváno široké rozmezí charakteristik popisujících metodu stanovení počtu kopií CMV DNA pomocí real-time PCR: senzitivita 20-100% a specificita 35-91% (Sia et al., 2000b; Drew et al., 2007; Hernando 2005). Rozdíly senzitivit a specificit v publikovaných výsledcích jsou ovlivněny tím, ţe metoda není dosud zcela standardizována napříč laboratořemi: je pouţíváno více různých souprav a detekčních systémů (AMPLICOR CMV test; COBAS AMPLICOR CMV Monitor; Q-CMV Real Time System); jako vstupní materiál jsou pouţívány různé sloţky krve, a to jak plná krev, tak sérum/plazma nebo pouze izolované leukocyty; velmi rozdílná je arbitrární mez klinicky významné pozitivity počtů CMV DNA kopií 600-3000 kopií/ml periferní krve (Sia et al., 2000b, Drew et al., 2007; CoronaNakamura et al., 2009; Hernando et al., 2005; Atabani et al., 2012).

Stránka | 77

Pro naše skupiny pacientů po transplantaci solidních orgánů, s hranicí pozitivity CMV DNAémie >1000 CMV DNA kopií na ml periferní krve, byla stanovena senzitivita a specificita metody stanovení počtu CMV DNA kopií v periferní krvi pomocí real-time PCR soupravou ARTUS CMV PCR Kit CE s vyuţitím diagnózy CMV infekce jako referenčního parametru. V souboru pacientů po transplantaci ledvin dosáhla senzitivita hodnoty 66,6% a specificita 97,3%. U skupiny pacientů po transplantaci jater byla vypočítána senzitivita 40% a specificita 94,7% pro metodu stanovení počtu CMV DNA kopií v periferní krvi pomocí real-time PCR. Metoda byla tedy velmi dobře schopná odlišit pacienty po transplantaci ledvin či jater, u nichţ CMV infekce nebyla v době hospitalizace diagnostikována. Jedním z faktorů, které se promítají v nízké senzitivitě metody je v literatuře uváděná skutečnost, ţe pokud pacient trpí CMV infekcí lokalizovanou do orgánu či konkrétní tkáně, nemusí počet kopií v periferní krvi překročit hranici pozitivity nebo detekovatelnosti (Drew et al., 2007; Eid 2007; Ljungman et al., 2002; Ruel et al., 2007). Pro metodu stanovení procenta CD38high z CD3+CD8+ v námi sledovaných souborech pacientů byla senzitivita metody po transplantaci jater a ledvin 100% pro oba soubory pacientů po transplantaci. Pro soubor pacientů po transplantaci ledviny byla specificita testu stanovena 91% procent, u transplantace jater však pouze 48%. V úvodu zmíněné další detekční metody -„shell vial assay“ a „antigenemia assay“, které nejsou v diagnostice CMV pro pacienty po transplantaci ledvin a jater v Centru transplantační a kardiovaskulární chirurgie rutinně vyuţívány, mají v literatuře udávánu senzitivitu a specificitu: shell vial – senzitivita 8-63%, specificita 86-88%; antigenemia – senzitivita 50-89%, specificita 71-83% (Sia et al., 2000b; Guirado et al., 2002; Martin-Davila et al., 2005). Nedá se tedy říct, ţe by tyto metody výrazně převyšovaly svými charakteristikami metodu stanovení počtu CMV DNA

Stránka | 78

kopií v periferní krvi pomocí real-time PCR nebo metodu stanovení procenta CD38high z CD3+CD8+. Naopak nevýhodou obou výše zmíněných těchto metod je čas potřebný ke zpracování, doba inkubace vzorků a jejich vyhodnocení. Metoda stanovení procenta CD38high z CD3+CD8+ vykazuje vysokou negativní prediktivní hodnotu, která svědčí pro význam tohoto testu při sledování rizika cytomegalovirové infekce, zejména pro pacienty po transplantaci ledviny. Ve skupině pacientů po transplantaci jater byl sledován vysoký počet pacientů, kteří měli procento CD38high z CD3+CD8+ zvýšené nad arbitrární limit, přestoţe jim v době hospitalizace nebyla diagnostikována cytomegalovirová infekce. Je moţné, ţe u části z nich mohlo jít o asymptomatickou infekci v jejím počátku, a přestoţe pacienti netrpěli klinickými obtíţemi, byla díky zvýšenému počtu CD38high CD3+CD8+ lymfocytů detegována reakce imunitního systému. Protoţe nedošlo k rozvoji symptomatické infekce je moţno usuzovat, ţe i suprimovaný imunitní systém dokázal CMV eliminovat. Pro tuto moţnost hovoří skutečnost, ţe mezi 79 pacienty po transplantaci jater se zvýšeným procentem CD38high z CD3+CD8+ nad arbitrární limit bez diagnostikované CMV infekce bylo 10 pacientů (12,7%) po léčbě antirejekční komplikace metylprednisolonem a devět pacientů (11,3%), kteří měli v periferní krvi přítomny protilátky anti-CMV ve třídě IgM po celou dobu hospitalizace. U sedmi pacientů (8,8%) byly v periferní krvi přítomny kopie CMV DNA v mnoţství ≥1000 kopií/ml, léčebnou odpovědí bylo u více neţ poloviny (4 pacienti) sníţením dávky imunosupresiv, coţ mohlo vést k umoţnění přirozené reakce imunitního systému na počínající virovou infekci. Imunitní systém pacientů po transplantaci jater je citlivější k dalším virovým infekcím ohroţujícím organismus v době, kdy jsou podávány vysoké dávky imunosupresiv. U 5 pacientů (7,7%) po transplantaci jater byl detekován v periferní

Stránka | 79

krvi zvýšený počet kopií EBV DNA, ten vyvolává zvýšení exprese CD38high na lymfocytech CD3+CD8+ a můţe tedy falešně zvyšovat počet pozitivních pacientů pro test CD38high z CD3+CD8+ jako nástroje pro detekci CMV infekce. Ke zvyšování počtu falešně pozitivních pacientů v procentu CD38high z CD3+CD8+ by u pacientů po transplantaci jater také mohlo docházet v důsledku pozorovaného fenoménu, kdy zároveň s CMV infekcí byla v 84% případů pozorována i infekce virem HHV-6 a v 79% s infekcí HHV-7 (Härmä et al. 2005; Härmä et al., 2006). Mezi sledovanými pacienty obou našich souborů bylo 7 (2,6%) pacientů po transplantaci ledvin a 8 (4,9%) pacientů po transplantaci jater, kterým v periferní krvi byly detekovány CMV DNA kopie nad hranici 1000 kopií/ml periferní krve bez dalších symptomů a diagnózy CMV infekce. Corona-Nakamura et al. (2009), kteří sledovali pacienty po transplantaci ledviny 6 měsíců po transplantaci, měli ve svém souboru 45% pacientů s počtem kopií nad hranici jimi stanovené CMV DNAémie (600 kopií/ml) bez dalších symptomů CMV infekce. Toto vysoké procento vysvětlují časnou pozitivitou tohoto diagnostického testu, který předchází 12-21 dnů klinické projevy. Ţe je na tomto poli ještě stále místo k zavedení a zdokonalení nových metod dokládá i fakt, ţe jsou stále vyvíjeny další metody, které se snaţí doplnit zatím běţně rozšířené diagnostické testy. Jsou jimi například: Quantiferonový test (Lochmanova et al., 2010), který je zaloţen na měření produkce IFN-γ T-lymfocyty po stimulaci CMV antigenem; dále například detekce lymfocytů pozitivních na antigen pp65 pomocí průtokového cytometru (dobrá korelace s kvantitativni PCR a „shell vial assay“ (Poirier-Toulemonde et al., 2000) nebo metody „Digene CMV DNA hybrid capture“, kdy je virová DNA denaturována a hybridizována s RNA sondou, takto vzniklý komplex je detekován protilátkou s navázanou alkalickou fosfatázou, která

Stránka | 80

štěpí substrát za vzniku chemiluminiscence měřené luminometrem (Caliendo et al., 2007), nebo „NucliSens CMV pp67 nucleic acid sequence-based ampliﬁcation assay“, jeţ je zaloţena na extrakci a amplifikaci mRNA kódující pp67, která je kvantifikována

pomocí

elektrochemiluminiscencenčního

detekčního

systému

(Mengoli et al., 2004). Procenta CD38high z CD3+CD8+ v naší studii nesouhlasila vţdy s nálezy metod běţně vyuţívaných pro detekci CMV infekce - stanovením počtu CMV DNA kopií v periferní krvi a sérokonverzí protilátek anti-CMV ve třídě IgM. Ţádná laboratorní diagnostická metoda není sama o sobě povaţována za dostatečnou pro stanovení diagnózy CMV infekce a síla různých přístupů leţí hlavně v jejich doplňujícím se charakteru. Je proto doporučováno pouţívat více neţ jeden z dostupných testů pro diagnostiku symptomatické i asymptomatické CMV infekce v časném stádiu (Drew et al., 2007; Ljungman et al., 2002; Abecassis et al., 1997; Emery et al., 2000; Sola

et

al.,

2005).

U

sedmi

pacientů

s transplantovanou

ledvinou

a

detekovanou CMV DNAémií, u kterých procenta CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů nepřesáhla za dobu hospitalizace arbitrární mez, bylo podpořeno rozhodnutí nezahájit antivirovou léčbu. U těchto pacientů nedošlo k rozvoji symptomatické CMV infekce v řádu týdnů po tomto laboratorním nálezu a byli ušetřeni léčby s významnými vedlejšími účinky, jako jsou například nefrotoxicita nebo leukopenie. Monitorování tohoto znaku u pacientů po transplantaci ledviny by mohlo zvýšit význam preemptivního přístupu léčby CMV infekce. U pacientů s transplantovanými játry byla situace rozdílná, protoţe u 7 z 8 pacientů s virovou náloţí nad limit CMV DNAémie a bez diagnózy CMV infekce bylo naměřeno i zvýšené procento CD38high z CD3+CD8+ (osobní maxima dosáhly hodnot v rozsahu 41-96%).

Stránka | 81

Přestoţe není zatím vyuţití sledování procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů uznávanou metodou pro sledování výskytu či vývoje CMV infekce u pacientů po transplantacích solidních orgánů, ukazuje tato retrospektivní analýza, ţe jeho sledování by mohlo být uţitečným znakem CMV infekce u pacientů po transplantaci solidních orgánů, zejména po transplantaci ledvin. Nárůst procenta této subpopulace nad arbitrární mez často předchází nárůstu kopií CMV DNA v periferní krvi nad signifikantní mez před propuknutím CMV infekce. Monitorování procenta CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů pomocí průtokové cytometrie je tedy rychlá, levná a jednoduchá metoda s vysokou reprodukovatelností a jeví se, vzhledem ke svému komplementárnímu charakteru, vhodnou k doplnění jiţ konvenčních a rutinně vyuţívaných imunologických a virologických metod.

Stránka | 82

7. Závěr Pacienti po transplantaci solidních orgánů jsou vystaveni moţným ţivot ohroţujícím komplikacím, mezi které, mimo jiné, patří i riziko infekce. V důsledku uţívání imunosupresivní léčby a komplikovanému chirurgickému výkonu se s infekční komplikací setkává více neţ polovina z nich. Jedním z virových patogenů, které mohou znamenat po pacienty po transplantaci nebezpečí, je i cytomegalovirus. Cílem mé práce bylo stanovení klinického významu metody sledování procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů jako nástroje pro detekci CMV infekce a její srovnání s dnes nejpouţívanější metodou sledování počtu kopií CMV DNA v periferní krvi pomocí real-time PCR. Analýza byla provedena na souboru pacientů po transplantaci ledvin (n = 269) a transplantaci jater (n = 162). Výsledky práce ukázaly, ţe metoda sledování procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů jako nástroje pro detekci CMV infekce, se svými charakteristikami (senzitivita, specificita, negativní a pozitivní prediktivní hodnota) významně neliší od pouţívaných metod k detekci CMV – antigenemie, „shell vial assay“, počet kopií CMV DNA v periferní krvi pomocí real-time PCR. Nevýhodou jiných metody je moţná falešná negativita v případě infekce lokalizované do konkrétního orgánu či tkáně, dlouhá doba nutná k provedení testu. U obou souborů pacientů byla nalezena statisticky významná korelace mezi sledovaným procentem CD38high z CD3+CD8+ lymfocytů a procentem HLA-DR+ z CD3+, procentem CD8+ z CD3+ lymfocytů, procentem CD4+ z CD3+ lymfocytů, poměrem CD3+CD4+/CD3+CD8+ lymfocytů a absolutním počtem leukocytů v krvi. Tyto imunologickýmé parametry jsou typickými imunologickými ukazateli virové

Stránka | 83

infekce a je tedy podpořena relevance vyuţití sledování procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů pro diagnostiku CMV infekce. Metoda sledování procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů ukázala na nebezpečí CMV infekce ve více neţ 70% případů (v 75% případů u pacientů po transplantaci ledvin; v 80% případů u pacientů po transplantaci jater) dříve neţ metoda stanovení počtu kopií CMV DNA v periferní krvi pomocí real-time PCR. Retrospektivní analýza dat ukázala, ţe metoda sledování procenta CD38high z CD3+CD8+ T-lymfocytů, můţe být uţitečnou doplňkovou metodou pro detekci CMV infekce, a to zejména pokud jsou pacienti v riziku invaze CMV do orgánu či konkrétní tkáně, kdy počet kopií CMV DNA v periferní krvi můţe zůstat pod hranicí pozitivity.

Stránka | 84

8. Seznam zkratek ADPR

adenosindifosfátribóza

ALT

alaninaminotransferáza

AST

aspartátaminotransferáza

ATG

anti-tymocytární gamaglobulin

ß2m

beta-2 mikroglobulinu

cADPR

cyklická adenosindifosfátribóza

CD

cluster designation

CD95

receptor Fas

CD95L

Fas-ligand

CMV

cytomegalovirus

dGTP

deoxyguanosintrifosfát

DNA

deoxyribonukleová kyselina

ds DNA

dvouřetězcová DNA

EA

časný antigen

EBNA

nukleární antigen

EBV

virus Epsteina-Barrové

EDTA

ethylendiamintetraoctová kyselina

FITC

fluorescein isothiokyanát

HHV

lidský herpes virus

HLA

human leukocytes antigens

IFN

interferon

Ig

imunoglobulin

IL

interleukin

KIR

killer-cell immunoglobulin-like receptors Stránka | 85

MDA-5

melanoma differentiation-associated

MHC

major histocompatibility complex protein-5

NA

kyselina nikotinová

NAADH

adenindinukleotidfosfát kyseliny

NAADP

adenindinukleotidfosfát kyseliny nikotinové

NAD

nikotinamidadenindinukleotid nikotinové

NADP

nikotinamidadenindinukleotidfosfát

NK

natural killer

P

pravděpodobnost

PCR

polymerázová řetězová reakce

PE

phycoerytrin

PECAM-1 platelet endothelial cell adhesion PE/Cy5

R-Phycoerythrin-Cyanine 5 molecule – 1

RIG-I

retinoid-inducible gene-I

RNáza L

ribonukleáza degradující virovou RNA

sCD23

solubilní CD23

SD

směrodatná odchylka

TCID50

50% tissue culture infective dose

TLR

toll-like receptor

TMB

3,3',5,5'-tetramethylbenzidin

TNF

tumor necrosis factor

US

unikátní krátké segmenty

VCA

virový kapsidový antigen

VZV

varicella zoster virus

WHO

Světová zdravotnická organizace

Stránka | 86

9. Seznam použité literatury 1. Abecassis M, Koffron A, Buckingham M, Kaufman D, Fryer J, Stuart J, Stuart F. Role of PCR in the diagnosis and management of CMV in solid organ recipients: what is the predictive value for development of disease and should PCR be used to guide antiviral therapy? Transplant Proc 1997; 29:800-1. 2. Ahn K, Angulo A, Ghazal P, Peterson PA, Yang Y, Früh K. Human cytomegalovirus inhibits antigen presentation by a sequential multistep process. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93:10990-5. 3. Akalin E, Sehgal V, Ames S, Hossain S, Daly L, Barbara M, Bromberg JS. Cytomegalovirus disease in high-risk transplant recipients despite ganciclovir or valganciclovir prophylaxis. Am J Transplant 2003; 3:731-5. 4. Akbar AN, Borthwick N, Salmon M, Gombert W, Bofill M, Shamsadeen N, Pilling D, Pett S, Grundy JE, Janossy G. The significance of low bcl-2 expression by CD45RO T cells in normal individuals and patients with acute viral infections. The role of apoptosis in T cell memory. J Exp Med 1993; 178:427-38. 5. Alangaden GJ, Thyagarajan R, Gruber SA, Morawski K, Garnick J, El-Amm JM, West MS, Sillix DH, Chandrasekar PH, Haririan A. Infectious complications after kidney transplantation: current epidemiology and associated risk factors. Clin Transplant 2006; 20:401-9. 6. Arthurs SK, Eid AJ, Pedersen RA, Dierkhising RA, Kremers WK, Patel R, Razonable RR. Delayed-onset primary cytomegalovirus disease after liver transplantation. Liver Transpl 2007; 13:1703-9. 7. Atabani SF, Smith C, Atkinson C, Aldridge RW, Rodriguez-Perálvarez M, Rolando N, Harber M, Jones G, O'Riordan A, Burroughs AK, Thorburn D, Stránka | 87

O'Beirne J, Milne RS, Emery VC, Griffiths PD. Cytomegalovirus Replication Kinetics in Solid Organ Transplant Recipients Managed by Preemptive Therapy. Am J Transplant 2012. 8. Badley AD, Patel R, Portela DF, Harmsen WS, Smith TF, Ilstrup DM, Steers JL, Wiesner RH, Paya CV. Prognostic significance and risk factors of untreated cytomegalovirus viremia in liver transplant recipients. J Infect Dis 1996; 173:4469. 9. Beiras-Fernandez A, Chappell D, Hammer C, Beiras A, Reichart B, Thein E. Impact of polyclonal anti-thymocyte globulins on the expression of adhesion and inflammation molecules after ischemia-reperfusion injury. Transpl Immunol 2009; 20:224-8. 10. Belles-Isles M, Houde I, Lachance J, Noël R, Kingma I, Roy R. Monitoring of cytomegalovirus infections by the CD8+CD38+ T-cell subset in kidney transplant recipients. Transplantation 1998; 65:279-82. 11. Benito JM, López M, Lozano S, Ballesteros C, Martinez P, González-Lahoz J, Soriano V. Differential upregulation of CD38 on different T-cell subsets may influence the ability to reconstitute CD4+ T cells under successful highly active antiretroviral therapy. J Acquir Immune Defic Syndr 2005; 38:373-81. 12. Benito JM, Zabay JM, Gil J, Bermejo M, Escudero A, Sánchez E, FernándezCruz E. Quantitative alterations of the functionally distinct subsets of CD4 and CD8 T lymphocytes in asymptomatic HIV infection: changes in the expression of CD45RO, CD45RA, CD11b, CD38, HLA-DR, and CD25 antigens. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 1997; 14:128-35. 13. Biron KK. Antiviral drugs for cytomegalovirus diseases. Antiviral Res 2006; 71:154-63.

Stránka | 88

14. Bofill M, Borthwick NJ. CD38 in health and disease. Chem Immunol 2000; 75:218-34. 15. Bofill M, Mocroft A, Lipman M, Medina E, Borthwick NJ, Sabin CA, Timms A, Winter M, Baptista L, Johnson MA, Lee CA, Phillips AN, Janossy G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS 1996; 10:827-34. 16. Caliendo AM, Ingersoll J, Fox-Canale AM, Pargman S, Bythwood T, Hayden MK, Bremer JW, Lurain NS. Evaluation of real-time PCR laboratory-developed tests using analyte-specific reagents for cytomegalovirus quantification. J Clin Microbiol 2007; 45:1723-7. 17. Cannon MJ, Hyde TB, Schmid DS. Review of cytomegalovirus shedding in bodily fluids and relevance to congenital cytomegalovirus infection. Rev Med Virol 2011; 21:240-55. 18. Corona-Nakamura AL, Monteón-Ramos FJ, Troyo-Sanromán R, Arias-Merino MJ, Anaya-Prado R. Incidence and predictive factors for cytomegalovirus infection in renal transplant recipients. Transplant Proc 2009; 41:2412-5. 19. Crumpacker CS. Ganciclovir. N Engl J Med 1996; 335:721-9. 20. da Silva CP, Schweitzer K, Heyer P, Malavasi F, Mayr GW, Guse AH. Ectocellular CD38-catalyzed synthesis and intracellular Ca2+-signalling activity of cyclic ADP-ribose in T-lymphocytes are not functionally related. FEBS Lett 1998; 439:291-6. 21. de Vries E, de Bruin-Versteeg S, Comans-Bitter WM, de Groot R, Hop WC, Boerma GJ, Lotgering FK, van Dongen JJ. Longitudinal survey of lymphocyte subpopulations in the first year of life. Pediatr Res 2000; 47:528-37. 22. Deaglio S, Aydin S, Vaisitti T, Bergui L, Malavasi F. CD38 at the junction

Stránka | 89

between prognostic marker and therapeutic target. Trends Mol Med 2008; 14:210-8. 23. Deaglio S, Dianzani U, Horenstein AL, Fernández JE, van Kooten C, Bragardo M, Funaro A, Garbarino G, Di Virgilio F, Banchereau J, Malavasi F. Human CD38 ligand. A 120-KDA protein predominantly expressed on endothelial cells. J Immunol 1996; 156:727-34. 24. Deaglio S, Malavasi F. The CD38/CD157 mammalian gene family: An evolutionary paradigm for other leukocyte surface enzymes. Purinergic Signal 2006; 2:431-41. 25. Deaglio S, Morra M, Mallone R, Ausiello CM, Prager E, Garbarino G, Dianzani U, Stockinger H, Malavasi F. Human CD38 (ADP-ribosyl cyclase) is a counterreceptor of CD31, an Ig superfamily member. J Immunol 1998; 160:395-402. 26. Deaglio S, Vaisitti T, Aydin S, Bergui L, D'Arena G, Bonello L, Omedé P, Scatolini M, Jaksic O, Chiorino G, Efremov D, Malavasi F. CD38 and ZAP-70 are functionally linked and mark CLL cells with high migratory potential. Blood 2007; 110:4012-21. 27. del Pozo JL. Update and actual trends on bacterial infections following liver transplantation. World J Gastroenterol 2008; 14:4977-83. 28. Dockrell DH, Prada J, Jones MF, Patel R, Badley AD, Harmsen WS, Ilstrup DM, Wiesner RH, Krom RA, Smith TF, Paya CV. Seroconversion to human herpesvirus 6 following liver transplantation is a marker of cytomegalovirus disease. J Infect Dis 1997; 176:1135-40. 29. Drew WL. Laboratory diagnosis of cytomegalovirus infection and disease in immunocompromised patients. Curr Opin Infect Dis 2007; 20:408-11. 30. Eid AJ, Bakri SJ, Kijpittayarit S, Razonable RR. Clinical features and outcomes of

Stránka | 90

cytomegalovirus retinitis after transplantation. Transpl Infect Dis 2008; 10:13-8. 31. Emery VC, Sabin CA, Cope AV, Gor D, Hassan-Walker AF, Griffiths PD. Application of viral-load kinetics to identify patients who develop cytomegalovirus disease after transplantation. Lancet 2000; 355:2032-6. 32. Erkeller-Yuksel FM, Lydyard PM, Isenberg DA. Lack of NK cells in lupus patients with renal involvement. Lupus 1997; 6:708-12. 33. Fabrizi F, Messa P, Martin P, Takkouche B. Hepatitis C virus infection and posttransplant diabetes mellitus among renal transplant patients: a meta-analysis. Int J Artif Organs 2008; 31:675-82. 34. Fishman JA, Rubin RH. Infection in organ-transplant recipients. N Engl J Med 1998; 338:1741-51. 35. Fishman JA. Infection in solid-organ transplant recipients. N Engl J Med 2007; 357:2601-14. 36. Froberg MK. Review: CMV escapes! Ann Clin Lab Sci 2004; 34:123-30. 37. Funaro A, Spagnoli GC, Ausiello CM, Alessio M, Roggero S, Delia D, Zaccolo M, Malavasi F. Involvement of the multilineage CD38 molecule in a unique pathway of cell activation and proliferation. J Immunol 1990; 145:2390-6. 38. Gane E, Saliba F, Valdecasas GJ, O'Grady J, Pescovitz MD, Lyman S, Robinson CA. Randomised trial of efficacy and safety of oral ganciclovir in the prevention of cytomegalovirus disease in liver-transplant recipients. The Oral Ganciclovir International Transplantation Study Group [corrected]. Lancet 1997; 350:172933. 39. Gavaldà J, de Otero J, Murio E, Vargas V, Rosselló J, Calicó I, Margarit C, Pahissa A. Two grams daily of oral acyclovir reduces the incidence of cytomegalovirus disease in CMV-seropositive liver transplant recipients. Transpl

Stránka | 91

Int 1997; 10:462-5. 40. Geddes CC, Church CC, Collidge T, McCruden EA, Gillespie G, Matthews E, Hainmueller A, Briggs JD. Management of cytomegalovirus infection by weekly surveillance after renal transplant: analysis of cost, rejection and renal function. Nephrol Dial Transplant 2003; 18:1891-8. 41. Härmä M, Loginov R, Piiparinen H, Halme L, Höckerstedt K, Lautenschlager I. HHV-6-DNAemia related to CMV-DNAemia after liver transplantation. Transplant Proc 2005; 37:1230-2. 42. Härmä M, Höckerstedt K, Lyytikäinen O, Lautenschlager I. HHV-6 and HHV-7 antigenemia related to CMV infection after liver transplantation. J Med Virol 2006; 78:800-5. 43. Hartmann A, Sagedal S, Hjelmesaeth J. The natural course of cytomegalovirus infection and disease in renal transplant recipients. Transplantation 2006; 82:S15-7. 44. Hendrix RM, Wagenaar M, Slobbe RL, Bruggeman CA. Widespread presence of cytomegalovirus DNA in tissues of healthy trauma victims. J Clin Pathol 1997; 50:59-63. 45. Hernando S, Folgueira L, Lumbreras C, San Juan R, Maldonado S, Prieto C, Babiano MJ, Delgado J, Andres A, Moreno E, Aguado JM, Otero JR. Comparison of cytomegalovirus viral load measure by real-time PCR with pp65 antigenemia for the diagnosis of cytomegalovirus disease in solid organ transplant patients. Transplant Proc 2005; 37:4094-6. 46. Ho M. Epidemiology of cytomegalovirus infections. Rev Infect Dis 1990; 12 Suppl 7:S701-10. 47. Ho M. Advances in understanding cytomegalovirus infection after transplantation.

Stránka | 92

Transplant Proc 1994; 26:7-11. 48. Hooks MA, Perlino CA, Henderson JM, Millikan WJ, Kutner MH. Prevalence of invasive cytomegalovirus disease with administration of muromonab CD-3 in patients undergoing orthotopic liver transplantation. Ann Pharmacother 1992; 26:617-20. 49. Humar A, Washburn K, Freeman R, Paya CV, Mouas H, Alecock E, Razonable RR, Group PS. An assessment of interactions between hepatitis C virus and herpesvirus

reactivation

in

liver

transplant

recipients

using

molecular

surveillance. Liver Transpl 2007; 13:1422-7. 50. Chinen J, Buckley RH. Transplantation immunology: solid organ and bone marrow. J Allergy Clin Immunol 2010; 125:S324-35. 51. Chiu LM, Domagala BM, Park JM. Management of opportunistic infections in solid-organ transplantation. Prog Transplant 2004; 14:114-29. 52. Jain A, Orloff M, Kashyap R, Lansing K, Betts R, Mohanka R, Menegus M, Ryan C, Bozorgzadeh A. Does valganciclovir hydrochloride (valcyte) provide effective prophylaxis against cytomegalovirus infection in liver transplant recipients? Transplant Proc 2005; 37:3182-6. 53. Jennings C, Rich K, Siegel JN, Landay A. A phenotypic study of CD8+ lymphocyte subsets in infants using three-color flow cytometry. Clin Immunol Immunopathol 1994; 71:8-13. 54. Kalil A, Levitsky J, Lyden E, Stoner J, Freifeld A. Meta-analysis: the efficacy of strategies to prevent organ disease by cytomegalovirus in solid organ transplant recipients. Ann Intern Med 2005; 143:870-80. 55. Kestens L, Vanham G, Gigase P, Young G, Hannet I, Vanlangendonck F, Hulstaert F, Bach BA. Expression of activation antigens, HLA-DR and CD38, on

Stránka | 93

CD8 lymphocytes during HIV-1 infection. AIDS 1992; 6:793-7. 56. Kijpittayarit S, Eid AJ, Brown RA, Paya CV, Razonable RR. Relationship between Toll-like receptor 2 polymorphism and cytomegalovirus disease after liver transplantation. Clin Infect Dis 2007; 44:1315-20. 57. Kotton CN, Kumar D, Caliendo AM, Asberg A, Chou S, Snydman DR, Allen U, Humar A, Group TSICC. International consensus guidelines on the management of cytomegalovirus in solid organ transplantation. Transplantation 2010; 89:77995. 58. Kute VB, Vanikar AV, Shah PR, Gumber MR, Patel HV, Godara SM, Munjappa BC, Sainaresh VV, Engineer DP, Jain SH, Modi PR, Shah VR, Trivedi VB, Trivedi HL. Post-renal transplant cytomegalovirus infection: study of risk factors. Transplant Proc 2012; 44:706-9. 59. Lautenschlager I, Halme L, Höckerstedt K, Krogerus L, Taskinen E. Cytomegalovirus infection of the liver transplant: virological, histological, immunological, and clinical observations. Transpl Infect Dis 2006; 8:21-30. 60. Lee HC. Mechanisms of calcium signaling by cyclic ADP-ribose and NAADP. Physiol Rev 1997; 77:1133-64. 61. Lengerke C, Ljubicic T, Meisner C, Loeffler J, Sinzger C, Einsele H, Hebart H. Evaluation of the COBAS Amplicor HCMV Monitor for early detection and monitoring of human cytomegalovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant 2006; 38:53-60. 62. Li H, Dummer JS, Estes WR, Meng S, Wright PF, Tang YW. Measurement of human cytomegalovirus loads by quantitative real-time PCR for monitoring clinical intervention in transplant recipients. J Clin Microbiol 2003; 41:187-91. 63. Limaye AP. Ganciclovir-resistant cytomegalovirus in organ transplant recipients.

Stránka | 94

Clin Infect Dis 2002; 35:866-72. 64. Limaye AP, Bakthavatsalam R, Kim HW, Randolph SE, Halldorson JB, Healey PJ, Kuhr CS, Levy AE, Perkins JD, Reyes JD, Boeckh M. Impact of cytomegalovirus in organ transplant recipients in the era of antiviral prophylaxis. Transplantation 2006; 81:1645-52. 65. Litzman J, Vlková M, Pikulová Z, Stikarovská D, Lokaj J. T and B lymphocyte subpopulations and activation/differentiation markers in patients with selective IgA deficiency. Clin Exp Immunol 2007; 147:249-54. 66. Liu Z, Cumberland WG, Hultin LE, Prince HE, Detels R, Giorgi JV. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 1997; 16:83-92. 67. Ljungman P, Griffiths P, Paya C. Definitions of cytomegalovirus infection and disease in transplant recipients. Clin Infect Dis 2002; 34:1094-7. 68. Loenen WA, Bruggeman CA, Wiertz EJ. Immune evasion by human cytomegalovirus: lessons in immunology and cell biology. Semin Immunol 2001; 13:41-9. 69. Lochmanova A, Lochman I, Tomaskova H, Marsalkova P, Raszka J, Mrazek J, Dedochova J, Martinek A, Brozmanova H, Grundmann M. Quantiferon-CMV test in prediction of cytomegalovirus infection after kidney transplantation. Transplant Proc 2010; 42:3574-7. 70. Malavasi F, Deaglio S, Ferrero E, Funaro A, Sancho J, Ausiello CM, Ortolan E, Vaisitti T, Zubiaur M, Fedele G, Aydin S, Tibaldi EV, Durelli I, Lusso R, Cozno F,

Stránka | 95

Horenstein AL. CD38 and CD157 as receptors of the immune system: a bridge between innate and adaptive immunity. Mol Med 2006; 12:334-41. 71. Malavasi F, Funaro A, Roggero S, Horenstein A, Calosso L, Mehta K. Human CD38: a glycoprotein in search of a function. Immunol Today 1994; 15:95-7. 72. Martín-Dávila P, Fortún J, Gutiérrez C, Martí-Belda P, Candelas A, Honrubia A, Barcena R, Martínez A, Puente A, de Vicente E, Moreno S. Analysis of a quantitative PCR assay for CMV infection in liver transplant recipients: an intent to find the optimal cut-off value. J Clin Virol 2005; 33:138-44. 73. Mauskopf JA, Richter A, Annemans L, Maclaine G. Cost-effectiveness model of cytomegalovirus management strategies in renal transplantation. Comparing valaciclovir prophylaxis with current practice. Pharmacoeconomics 2000; 18:23951. 74. McCloskey TW, Cavaliere T, Bakshi S, Harper R, Fagin J, Kohn N, Pahwa S. Immunophenotyping of T lymphocytes by three-color flow cytometry in healthy newborns, children, and adults. Clin Immunol Immunopathol 1997; 84:46-55. 75. Mendez JC, Dockrell DH, Espy MJ, Smith TF, Wilson JA, Harmsen WS, Ilstrup D, Paya CV. Human beta-herpesvirus interactions in solid organ transplant recipients. J Infect Dis 2001; 183:179-84. 76. Mengoli C, Cusinato R, Biasolo MA, Cesaro S, Parolin C, Palù G. Assessment of CMV load in solid organ transplant recipients by pp65 antigenemia and real-time quantitative DNA PCR assay: correlation with pp67 RNA detection. J Med Virol 2004; 74:78-84. 77. Mikyas Y, Aziz N, Harawa N, Gorre M, Neagos N, Nogueira M, Wafer D, Dillon M, Boyer PJ, Bryson YJ, Plaeger S. Immunologic activation during pregnancy: serial measurement of lymphocyte phenotype and serum activation molecules in

Stránka | 96

HIV-infected and uninfected women. J Reprod Immunol 1997; 33:157-70. 78. Müller V, Perrakis A, Meyer J, Förtsch T, Korn K, Croner RS, Yedibela S, Hohenberger W, Schellerer VS. The Value of Pre-emptive Therapy for Cytomegalovirus after Liver Transplantation. Transplant Proc 2012; 44:1357-61. 79. Muñoz P, Navarro MD, Pavón EJ, Salmerón J, Malavasi F, Sancho J, Zubiaur M. CD38 signaling in T cells is initiated within a subset of membrane rafts containing Lck and the CD3-zeta subunit of the T cell antigen receptor. J Biol Chem 2003; 278:50791-802. 80. Nordøy I, Müller F, Nordal KP, Rollag H, Lien E, Aukrust P, Frøland SS. Immunologic parameters as predictive factors of cytomegalovirus disease in renal allograft recipients. J Infect Dis 1999; 180:195-8. 81. Opelz G, Döhler B, Ruhenstroth A. Cytomegalovirus prophylaxis and graft outcome in solid organ transplantation: a collaborative transplant study report. Am J Transplant 2004; 4:928-36. 82. Partida-Sánchez S, Cockayne DA, Monard S, Jacobson EL, Oppenheimer N, Garvy B, Kusser K, Goodrich S, Howard M, Harmsen A, Randall TD, Lund FE. Cyclic ADP-ribose production by CD38 regulates intracellular calcium release, extracellular calcium influx and chemotaxis in neutrophils and is required for bacterial clearance in vivo. Nat Med 2001; 7:1209-16. 83. Patel R, Paya C. Infections in solid-organ transplant recipients. Clin Microbiol Rev 1997; 10:86-124. 84. Paya CV. Prevention of fungal infection in transplantation. Transpl Infect Dis 2002; 4 Suppl 3:46-51. 85. Paya CV, Hermans PE, Wiesner RH, Ludwig J, Smith TF, Rakela J, Krom RA. Cytomegalovirus hepatitis in liver transplantation: prospective analysis of 93

Stránka | 97

consecutive orthotopic liver transplantations. J Infect Dis 1989; 160:752-8. 86. Paya CV, Wiesner RH, Hermans PE, Larson-Keller JJ, Ilstrup DM, Krom RA, Rettke S, Smith TF. Risk factors for cytomegalovirus and severe bacterial infections following liver transplantation: a prospective multivariate timedependent analysis. J Hepatol 1993; 18:185-95. 87. Peleg AY, Husain S, Qureshi ZA, Silveira FP, Sarumi M, Shutt KA, Kwak EJ, Paterson DL. Risk factors, clinical characteristics, and outcome of Nocardia infection in organ transplant recipients: a matched case-control study. Clin Infect Dis 2007; 44:1307-14. 88. Poirier-Toulemonde AS, Milpied N, Cantarovich D, Morcet JF, Billaudel S, ImbertMarcille BM. Clinical relevance of direct quantification of pp65 antigenemia using flow cytometry in solid organ and stem cell transplant recipients. J Clin Microbiol 2000; 38:3143-9. 89. Pumannova M, Roubalova K, Vitek A, Sajdova J. Comparison of quantitative competitive polymerase chain reaction-enzyme-linked immunosorbent assay with LightCycler-based polymerase chain reaction for measuring cytomegalovirus DNA in patients after hematopoietic stem cell transplantation. Diagn Microbiol Infect Dis 2006; 54:115-20. 90. Randolph GJ, Sanchez-Schmitz G, Angeli V. Factors and signals that govern the migration of dendritic cells via lymphatics: recent advances. Springer Semin Immunopathol 2005; 26:273-87. 91. Razonable RR. Cytomegalovirus infection after liver transplantation: current concepts and challenges. World J Gastroenterol 2008; 14:4849-60. 92. Razonable RR, Emery VC. Management of CMV infection and disease in transplant patients. 27-29 February 2004. Herpes 2004; 11:77-86.

Stránka | 98

93. Razonable RR, Paya CV. Infections and allograft rejection - intertwined complications of organ transplantation. Swiss Med Wkly 2005; 135:571-3. 94. Razonable RR, van Cruijsen H, Brown RA, Wilson JA, Harmsen WS, Wiesner RH, Smith TF, Paya CV. Dynamics of cytomegalovirus replication during preemptive therapy with oral ganciclovir. J Infect Dis 2003; 187:1801-8. 95. Reischig T, Jindra P, Hes O, Svecová M, Klaboch J, Treska V. Valacyclovir prophylaxis versus preemptive valganciclovir therapy to prevent cytomegalovirus disease after renal transplantation. Am J Transplant 2008; 8:69-77. 96. Rentenaar RJ, Gamadia LE, van der Hoek N, van Diepen FN, Boom R, Weel JF, van Lier RA, ten Berge IJ. CD4(+) T-cell dynamics in primary cytomegalovirus infection. Transplant Proc 2001; 33:2313-4. 97. Reyburn HT, Mandelboim O, Valés-Gómez M, Davis DM, Pazmany L, Strominger JL. The class I MHC homologue of human cytomegalovirus inhibits attack by natural killer cells. Nature 1997; 386:514-7. 98. Roos MT, de Leeuw NA, Claessen FA, Huisman HG, Kootstra NA, Meyaard L, Schellekens PT, Schuitemaker H, Miedema F. Viro-immunological studies in acute HIV-1 infection. AIDS 1994; 8:1533-8. 99. Rubin RH. Impact of cytomegalovirus infection on organ transplant recipients. Rev Infect Dis 1990; 12 Suppl 7:S754-66. 100.

Ruell J, Barnes C, Mutton K, Foulkes B, Chang J, Cavet J, Guiver M, Menasce L, Dougal M, Chopra R. Active CMV disease does not always correlate with viral load detection. Bone Marrow Transplant 2007; 40:55-61.

101.

Sagedal S, Nordal K, Hartmann A, Sund S, Scott H, Degré M, Foss A, Leivestad T, Osnes K, Fauchald P, Rollag H. The impact of cytomegalovirus infection and disease on rejection episodes in renal allograft recipients. Am J

Stránka | 99

Transplant 2002; 2:850-6. 102.

Saliba F, Eyraud D, Samuel D, David MF, Arulnaden JL, Dussaix E, Mathieu D, Bismuth H. Randomized controlled trial of acyclovir for the prevention of cytomegalovirus infection and disease in liver transplant recipients. Transplant Proc 1993; 25:1444-5.

103.

Samanta M, Harkins L, Klemm K, Britt WJ, Cobbs CS. High prevalence of human cytomegalovirus in prostatic intraepithelial neoplasia and prostatic carcinoma. J Urol 2003; 170:998-1002.

104.

Sarmiento JM, Dockrell DH, Schwab TR, Munn SR, Paya CV. Mycophenolate mofetil increases cytomegalovirus invasive organ disease in renal transplant patients. Clin Transplant 2000; 14:136-8.

105.

Shanafelt TD, Geyer SM, Kay NE. Prognosis at diagnosis: integrating molecular biologic insights into clinical practice for patients with CLL. Blood 2004; 103:1202-10.

106.

Sherman GG, Scott LE, Galpin JS, Kuhn L, Tiemessen CT, Simmank K, Meddows-Taylor S, Meyers TM. CD38 expression on CD8(+) T cells as a prognostic marker in vertically HIV-infected pediatric patients. Pediatr Res 2002; 51:740-5.

107.

Shibolet O, Ilan Y, Kalish Y, Safadi R, Ashur Y, Eid A, Shouval D, Wolf D. Late cytomegalovirus infection occurring two or more years following liver transplantation: a report of seven cases and review of the literature. Transplant Proc 2003; 35:663-4.

108.

Sia IG, Wilson JA, Groettum CM, Espy MJ, Smith TF, Paya CV. Cytomegalovirus (CMV) DNA load predicts relapsing CMV infection after solid organ transplantation. J Infect Dis 2000a; 181:717-20.

Stránka | 100

109.

Sia IG, Patel R. New strategies for prevention and therapy of cytomegalovirus infection and disease in solid-organ transplant recipients. Clin Microbiol Rev 2000b; 13:83-121, table of contents.

110.

Sindern E, Oreja-Guevara C, Raulf-Heimsoth M, Baur X, Malin JP. A longitudinal study of circulating lymphocyte subsets in the peripheral blood during the acute stage of Guillain-Barré syndrome. J Neurol Sci 1997; 151:2934.

111.

Sing G, Butterworth L, Chen X, Bryant A, Cooksley G. Composition of peripheral blood lymphocyte populations during different stages of chronic infection with hepatitis B virus. J Viral Hepat 1998; 5:83-93.

112.

Singh N, Yu VL, Mieles L, Wagener MM, Miner RC, Gayowski T. High-dose acyclovir compared with short-course preemptive ganciclovir therapy to prevent cytomegalovirus disease in liver transplant recipients. A randomized trial. Ann Intern Med 1994; 120:375-81.

113.

Singh N. Fungal infections in the recipients of solid organ transplantation. Infect Dis Clin North Am 2003; 17:113-34, viii.

114.

Singh N. Late-onset cytomegalovirus disease as a significant complication in solid organ transplant recipients receiving antiviral prophylaxis: a call to heed the mounting evidence. Clin Infect Dis 2005; 40:704-8.

115.

Siu CW, Chan TM, Li FK, Choy BY, Lui SL, Lo CY, Tang S, Lo WK, Lai KN. Association between anti-thymocyte globulin administration and cytomegalic virus infection and/or CMV disease in cadaveric renal allograft recipients. Transplant Proc 2000; 32:1932-4.

116.

Slifkin M, Tempesti P, Poutsiaka DD, Snydman DR. Late and atypical cytomegalovirus disease in solid-organ transplant recipients. Clin Infect Dis

Stránka | 101

2001; 33:E62-8. 117.

Small L, Lau J, Snydman D. Preventing post-organ transplantation cytomegalovirus

disease with

ganciclovir:

a meta-analysis

comparing

prophylactic and preemptive therapies. Clin Infect Dis 2006; 43:869-80. 118.

Snydman DR. Infection in solid organ transplantation. Transpl Infect Dis 1999; 1:21-8.

119.

Snydman DR. Counterpoint: prevention of cytomegalovirus (CMV) infection and CMV disease in recipients of solid organ transplants: the case for prophylaxis. Clin Infect Dis 2005; 40:709-12.

120.

Solà R, Díaz JM, Guirado L, Ravella N, Vila L, Sainz Z, Gich I, Picazo M, García R, Abreu E, Ortiz F, Alcaraz A. Significance of cytomegalovirus infection in renal transplantation. Transplant Proc 2003; 35:1753-5.

121.

Solà R, Rabella N, Guirado LL, Díaz JM, Facundo C, García R. Relation between pp65 antigenemia, RT-PCR and viruria for cytomegalovirus detection in kidney transplant recipients. Transplant Proc 2005; 37:3768-9.

122.

Stauch D, Dernier A, Sarmiento Marchese E, Kunert K, Volk HD, Pratschke J, Kotsch K. Targeting of natural killer cells by rabbit antithymocyte globulin and campath-1H: similar effects independent of specificity. PLoS One 2009; 4:e4709.

123.

Sun Q, Li L, Ji S, Chen J, Yin G, Tang Z, Liu Z. Variation of CD4+ and CD8+ T lymphocytes as predictor of outcome in renal allograft recipients who developed acute respiratory distress syndrome caused by cytomegalovirus pneumonia. Transplant Proc 2005; 37:2118-21.

124.

Taherimahmoudi M, Ahmadi H, Baradaran N, Montaser-Kouhsari L, Salem S, Mehrsai A, Kalantar E, Jahani Y, Pourmand G. Cytomegalovirus infection and

Stránka | 102

disease following renal transplantation: preliminary report of incidence and potential risk factors. Transplant Proc 2009; 41:2841-4. 125.

Tenca C, Merlo A, Zarcone D, Saverino D, Bruno S, De Santanna A, Ramarli D, Fabbi M, Pesce C, Deaglio S, Ciccone E, Malavasi F, Grossi CE. Death of T cell precursors in the human thymus: a role for CD38. Int Immunol 2003; 15:1105-16.

126.

Terstappen LW, Huang S, Picker LJ. Flow cytometric assessment of human Tcell differentiation in thymus and bone marrow. Blood 1992; 79:666-77.

127.

The TH, Grefte JM, van der Bij W, van Son WJ, van den Berg AP. CMV infection after organ transplantation: immunopathological and clinical aspects. Neth J Med 1994; 45:309-18.

128.

Tolkoff-Rubin NE, Rubin RH. Recent advances in the diagnosis and management of infection in the organ transplant recipient. Semin Nephrol 2000; 20:148-63.

129.

Umar S, Malavasi F, Mehta K. Post-translational modification of CD38 protein into a high molecular weight form alters its catalytic properties. J Biol Chem 1996; 271:15922-7.

130.

Viklicky O. Imunosuprese po transplantaci ledviny. Praktické lékárenství 2010;6:

131.

Wang YL, Zhang YY, Zhou YL, Zhu ZJ, Tang ZQ, Jiang Y, Peng L, Li G, Zhang XH. T-helper and T-cytotoxic cell subsets monitoring during active cytomegalovirus infection in liver transplantation. Transplant Proc 2004; 36:1498-9.

132.

Weikert BC, Blumberg EA. Viral infection after renal transplantation: surveillance and management. Clin J Am Soc Nephrol 2008; 3 Suppl 2:S76-

Stránka | 103

86. 133.

Wenthworth B, French L. Plaque assay of cytomegalovirus strains of human origin. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 1990; 135: 253-259.

134.

Yaghobi R, Behzad-Behbahani A, Sabahi F, Roustaee MH, Alborzi A, Ramzi M, Nourani H. Comparative analysis of a double primer PCR assay with plasma, leukocytes and antigenemia for diagnosis of active human cytomegalovirus infection in bone marrow transplant patients. Bone Marrow Transplant 2005; 35:595-9.

135.

Zidovec Lepej S, Vince A, Dakovic Rode O, Remenar A, Jeren T. Increased numbers of CD38 molecules on bright CD8+ T lymphocytes in infectious mononucleosis caused by Epstein-Barr virus infection. Clin Exp Immunol 2003; 133:384-90.

Stránka | 104

10.

Vlastní publikační činnost

PUBLIKACE SOUVISEJÍCÍ S TÉMATEM DIZERTAČNÍ PRÁCE Ticha O, Stouračová M, Kuman M, Studeník P, Freiberger T, Litzman J: Monitoring of CD38high expression in peripheral blood CD8+ lymphocytes in patients after kidney transplantation as a marker of cytomegalovirus infection. Transplant Immunology 2010 Oct;24(1):50-6.

OSTATNÍ PUBLIKACE Litzman, J; Nechvatalova, J; Xu, J; Ticha, O; Vlkova, M; Hel, Z: Chronic immune activation in common variable immunodeficiency (CVID) is associated with elevated serum levels of soluble CD14 and CD25 but not endotoxemia. Clinical and Experimental Immunology. In press.

Pivonkova H, Sebest P, Pecinka P, Ticha O, Nemcová K, Brazdova M, Jagelska EB, Brazda V, Fojta M. Selective binding of tumor suppressor p53 protein to topologically constrained DNA: Modulation by intercalative drugs. Biochem Biophys Res Commun. 2010 Mar 19;393(4):894-9.

KONFERENCE A PREZENTACE Tichá O, Štouračová M, Litzman J: Význam vyšetření znaku CD38 na cytotoxických lymfocytech u pacientů po transplantaci ledviny. (XXV. sjezd českých a slovenských alergologů a klinických imunologů, XII. Kongres českých a slovenských imunologů, Praha 29. 10. 2008 –01. 11. 2008).

Stránka | 105

Tichá O, Štouračová M, Litzman J: Sledování exprese znaku CD38 na Tclymfocytech u pacientů po transplantaci ledviny s diagnózou cytomegalovirové infekce. (XXVI. kongres slovenských a českých alergológov a klinických imunológov, Ţilina 14. 10. 2009 – 17. 10. 2009).

Tichá

O,

Štouračová

M:

Exprese

CD38

na

lymfocytech

u

pacientů

s transplantovanou ledvinou. (XVI. Ročník Konference mladých lékařů, Brno, 24. 06. 2009).

Tichá O, Nechvátalová J, Vlková M, Litzman J: B-lymfocytární subpopulace u pacientů se selektivním deficitem IgA. (XXVIII. kongres slovenských a českých alergológov a klinických imunológov, Košice, 19.-22.10.2011).

Litzman J, Nechvátalová J, Xu Y, Tichá O, Vlková M, Hel Z: Solubilní CD14 v séru pacientů s běţným variabilním imunodeficitem (CVID) nebo se selektivním deficitem IgA. (XXVIII. kongres slovenských a českých alergológov a klinických imunológov, Košice, 19.-22.10.2011).

ZAHRANIČNÍ STÁŽE 1. 3. 2011 - 31. 5. 2011 Ruprecht-Karls-University, Heidelberg, Department of Infectious Diseases, Medical Microbiology and Hygiene, Spolková republika Německo.

Stránka | 106

11.

Přílohy

Ticha O, Stouračová M, Kuman M, Studeník P, Freiberger T, Litzman J: Monitoring of CD38high expression in peripheral blood CD8+ lymphocytes in patients after kidney transplantation as a marker of cytomegalovirus infection. Transplant Immunology 2010 Oct;24(1):50-6.

Stránka | 107

SLEDOVÁNÍ EXPRESE ZNAKU CD38 CYTOMEGALOVIROVÉ INFEKCE U PACIENTŮ PO ORGÁNOVÉ TRANSPLANTACI

Recommend Documents