SKRINING DAN UJI AKTIVITAS LIPOLITIK MIKROBA HIDROKARBONOKLASTIK
Elga Renjana, Dr. Ni’matuzahroh, dan Dr Sri Sumarsih, M.Si. Prodi S-1 Biologi, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya
ABSTRACT This study aimed to screen and test the lipolytic activity of hydrocarbonoclastic microbial from collection of Microbiology Laboratory of FST Airlangga University. Screening of hydrocarbonoclastic microbial was performed using rhodamine-B agar which contained cooking oil 1%. Microbes which had lipolytic activity were marked with orange flourescent zone around the colony. Hydrocarbonoclastic microbial which had the highest lipolytic activity index was Actinobacillus sp. The lipase enzyme of Actinobacillus sp. was produced in Bushnell Haas liquid medium which added cooking oil 1%. Lipolytic activity of Actinobacillus sp. was measured using a spectrophotometer UV –vis (λ = 410 nm) with p-nitrophenyl palmitat as substrat on phosphat buffer pH 7.0, 37 ºC. Lipolytic activity from crude lipase enzyme extract of Actinobacillus sp. was 1,36 U/ml at 24 hours incubation time. Characterization of the enzyme was done by determining the optimum pH and temperature at optimum incubation time. Maximum lipolytic activity of Actinobacillus sp. was 1,55 U/ml at pH 7.0, 60 ºC. Keywords: lipolytic activity, Actinobacillus sp., rhodamine-B agar
suatu
PENDAHULUAN Enzim
merupakan
molekul
biopolimer protein yang tersusun dari serangkaian
asam
amino
dalam
komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim berfungsi sebagai biokimia terhadap
aktivator dan
dalam
bersifat
substrat,
mempermudah
proses
reaksi
rantai
(Syamsudin
kompleks dkk.,
2008).
tertentu Lipase
merupakan enzim yang dapat larut dalam
air
dan
secara
alami
mengkatalis hidrolisis ikatan ester dalam substrat lipid yang tidak larut air (Miller et al., 2010).
spesifik
Saat ini aktivitas pengeboran
sehingga
minyak bumi di Indonesia dan
pemutusan
penggunaan derivat-derivatnya mulai
mengalami peningkatan. Peningkatan
suatu senyawa berupa enzim lipase.
aktivitas
Aktivitas
tersebut
mengakibatkan
mikroba
dalam
kenaikan tingkat pencemaran tanah
mendegradasi
oleh hidrokarbon karena kandungan
menggunakan lipase disebut aktivitas
senyawa hidrokarbon dalam minyak
lipolitik.
bumi sangatlah besar. Menurut Via (2009),
kandungan
hidrokarbon
Laboratorium
Mikrobiologi
senyawa
Departemen Biologi FST Universitas
hidrokarbon murni dalam minyak
Airlangga memiliki koleksi 11 isolat
bumi sebesar 90-99%. Salah satu
mikroba
upaya pemulihan lahan tercemar
potensial yang berhasil diisolasi oleh
minyak yang saat ini sudah mulai
Ni’matuzahroh dkk. (2009). Namun
dikembangkan di Indonesia adalah
selama ini belum dilakukan skrining
bioremediasi (Ni’matuzahroh dkk.,
kemampuan lipolitik dari mikroba
2009).
merupakan
hidrokarbonoklastik tersebut. Oleh
menghilangkan
karena itu, perlu dilakukan skrining
pengaruh kontaminan (zat pencemar)
dan uji aktivitas lipolitik mikroba
dengan
menggunakan
hidrokarbonoklastik, sehingga dapat
mikroorganisme, sehingga substansi
menjadi sumber alternatif dalam
kontaminan
perolehan enzim lipase yang dapat
Bioremediasi
upaya
untuk
tersebut
berkurang
(Arsyad dan Rustiadi, 2008). Mikroba
digunakan
hidrokarbonoklastik
merupakan mikroba yang mampu mendegradasi keperluan
hidrokarbon
untuk
metabolisme
dan
perkembangbiakannya.
Senyawa
hidrokarbon dalam minyak bumi merupakan mikroba
sumber
hidrokarbonoklastik
karbon
bagi
hidrokarbonoklastik
untuk
mendegradasi
hidrokarbon pada lahan tercemar minyak. METODE PENELITIAN a. Bahan penelitian Bahan yang digunakan sebagai sumber mikroba merupakan koleksi mikroba
hidrokarbonoklastik
(Nugroho, 2006). Pada mekanisme
Laboratorium
degadrasi
Departemen Biologi FST Universitas
tersebut,
hidrokarbonoklastik
mikroba menghasilkan
Airlangga
yang
Mikrobiologi
diisolasi
oleh
Ni’matuzahroh dkk. (2009), yaitu
20 ml medium Bushnell Haas cair,
Candida
Pseudomonas
0,6 ml (3%) minyak goreng dan 0,04
aeruginosa, P. putida hasil isolasi
ml rhodamin-B 0,1% dalam H2O.
dari Depo PERTAMINA Surabaya,
Selanjutnya
Acinetobacter
hidrokarbonoklastik
famata,
faecalis
tipe
II,
mikroba diinokulasi
Actinobacillus sp., C. parapsilopsis,
sebagai spot kecil ke medium uji dan
P. cepacea, P. flourescens-25, P.
diinkubasi pada suhu 37 ºC selama
pseudomallei,
Rhodotorulla
48 jam. Aktivitas lipolitik ditandai
isolasi
dengan munculnya zona pendaran
mucilaginosa
hasil
dari
pengeboran minyak Desa Wonocolo,
berwarna
Bojonegoro, dan Bacillus subtilis
sekitar koloni mikroba di bawah
3Kp hasil isolasi dari perairan Kali
sinar UV pada λ = 312 nm.
Donan
Cilacap,
Jawa
Tengah.
Bahan-bahan yang digunakan untuk pembuatan media dan uji adalah Nutrient Agar Dextrose
(NA),
Agar
(SDA),
Sabouraud Nutrient
Broth (NB), minyak goreng, powder
oranye
kemerahan
di
2. Uji aktivitas enzim terhadap pnitrofenil palmitat Penentuan aktivitas enzim lipase dilakukan dengan metode PereiraMeirelles
et
al.
(1997)
dalam
Sumarsih (2005) yang dimodifikasi.
agar, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3,
Aktivitas enzim ditentukan dengan
MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, FeCl3,
metode
NaCl, p-nitrofenil palmitat (p-NPP), rhodamin-B, buffer fosfat pH 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, alkohol 70%, air fisiologis, spiritus, dan akuades.
spektrofotometrik
dengan
substrat p-nitrofenil palmitat (pNPP). Pada tabung Eppendorf yang diisi 700 µl larutan p-NPP 0,503 mM dalam
buffer
fosfat
Kemudian
1. Skrining mikroba hidrokarbonoklastik penghasil lipase
supernatan yang mengandung enzim
Skrining dengan
mikroba
pembuatan
dilakukan
medium
uji
(rhodamin-B agar) dengan komposisi
ekstraseluler.
300
7.0.
b. Prosedur penelitian
lipase
ditambahkan
pH
µl
Campuran
diinkubasi dalam waterbath
pada
suhu 37º C selama 30 menit. Setelah diinkubasi, campuran ditambahkan 100 µl larutan Na2CO3 0,2 M. p-
nitrofenol yang terbentuk ditandai
bahwa
dengan warna kuning, kemudian
aktivitas lipolitik dimana ditandai
diukur dengan spektrofotometer UV-
dengan pendaran berwarna oranye di
Vis pada λ = 410 nm.
sekitar koloni mikroba. Kesebelas
c. Karakterisasi enzim lipase Karakterisasi dilakukan
enzim
dengan
semua
spesies
memiliki
spesies tersebut adalah Acinetobacter faecalis tipe II, Actinobacillus sp.,
lipase
Bacillus
memproduksi
famata,
subtilis
3Kp,
C.
Candida
parapsilopsis,
enzim lipase pada inkubasi optimal
Pseudomonas
aeruginosa,
P.
yang
cepacea,
flourescens-25,
P.
selanjutnya
dilakukan
P.
penentuan aktivitas lipolitik pada
pseudomallei,
suhu dan pH optimal enzim lipase
Rhodotorulla mucilaginosa. Adanya
tersebut.
aktivitas
Penentuan
pH
optimal
P.
putida,
lipolitik
dan
dikarenakan
aktivitas enzim lipase dilakukan
mikroba menghasilkan enzim lipase
dengan melarutkan substrat p-NPP
yang
pada buffer fosfat dengan variasi pH
menghidrolisis
5.0, 6.0, 7.0, dan 8.0. Sedangkan
minyak goreng menjadi gliserol dan
penentuan suhu optimal aktivitas
asam lemak. Pendaran berwarna
enzim lipase dilakukan pada pH
oranye yang ada di sekitar koloni
optimal dengan variasi suhu inkubasi
mikroba
hidrokarbonoklastik
,yakni 30, 40, 50, 60, dan 70 ºC.
terbentuk
karena
digunakan
untuk
trigliserida
dalam
terjadi
pembentukan dimer kompleks antara
HASIL DAN PEMBAHASAN a. Aktivitas Lipolitik Mikroba Hidrokarbonoklastik Koleksi Laboratorium Mikrobiologi FST Universitas Airlangga
rhodamin-B dengan asam lemak dan monogliserida
atau
digliserida
(Wirawan, 2009).
koleksi
b. Indeks Aktivitas Lipolitik Mikroba Hidrokarbonoklatik Koleksi Laboratorium Mikrobiologi FST Universitas Airlangga
FST
Hasil penelitian menunjukkan
Universitas Airlangga menunjukkan
bahwa bakteri Actinobacillus sp.
Hasil skrining aktivitas lipolitik pada
11
spesies
mikroba
hidrokarbonoklastik Laboratorium
Mikrobiologi
memiliki indeks aktivitas lipolitik
pendaran yang dihasilkan. Hasil
tertinggi di antara spesies mikroba
analisis statistik juga menunjukkan
hidrokarbonoklastik lainnya dengan
bahwa
nilai 3,50 (Gambar 1). Tingginya
bakteri Actinobacillus sp. mayoritas
indeks
berbeda
aktivitas
lipolitik
Actinobacillus
aktivitas
nyata
dengan
lipolitik
mikroba
dikarenakan
lainnya (Tabel 1). Dengan demikian,
diameter zona pendarannya paling
Actinobacillus sp. dipilih sebagai
besar.
isolat
Hal
sp.
bakteri
indeks
ini
sesuai
dengan
uji
yang
akan
pernyataan Hou and Johnston (1992)
kemampuan
bahwa bakteri penghasil lipase yang
dan dikarakterisasi enzim lipase yang
baik dapat dilihat dari kekuatan
dihasilkan.
pendaran
dan
diameter
aktivitas
diukur
lipolitiknya
zona
3,50
1,39
0,88 0,15
1,29
1,62 1,75
0,23 0,33 0,16 0,22
Gambar 1. Indeks aktivitas lipolitik mikroba hidrokarbonoklastik koleksi Laboratorium Mikrobiologi FST Universitas Airlangga Tabel 1. Indeks aktivitas lipolitik mikroba hidrokarbonoklastik dan uji statistiknya
No
Spesies Mikroba
1 2 3 4 5
Acinetobacter faecalis tipe II Actinobacillus sp. Bacillus subtilis 3Kp Candida famata C. parapsilopsis
Indeks Aktivitas Lipolitik pada Ulangan ke1 2 3 0,08 0,18 0,18 3,31 3,67 3,51 0,25 0,22 0,23 0,51 0,24 0,25 0,22 0,07 0,16
Rata-rata 0,15a ± 0,06 3,50b ± 0,18 0,23ac ± 0,02 0,33a ± 0,15 0,08a ± 0,08
6 7 8 9 10 11
Pseudomonas aeruginosa P. cepacea P. flourescens-25 P. pseudomallei P. putida Rhodotorulla mucilaginosa
0,31 1,51 1,15 1,47 1,28 2,56
c. Kemampuan Bakteri Actinobacillus sp. dalam Menghasilkan Lipase Berdasarkan
hasil
penelitian
(Gambar 2) bahwa aktivitas lipolitik mulai mengalami peningkatan pada jam ke-4 sampai jam ke-24 dimana bakteri
berada
pada
fase
log
(eksponensial). Namun pada jam ke28
sampai
lipolitik sehingga
jam
ke-40
mengalami
aktivitas
penurunan,
mengakibatkan
pertumbuhan bakteri melambat atau memasuki fase stasioner. Naiknya aktivitas enzim antara jam ke-4 sampai jam ke-24 dan menurunnya aktivitas enzim antara jam ke-28 sampai jam ke-48 disebabkan adanya perbedaan waktu yang dibutuhkan enzim dan peningkatan jumlah enzim yang bereaksi dengan substrat.
0,22 1,22 0,83 1,10 1,86 0,56
0,22a ± 0,09 1,39d ± 0,15 0,88ad ± 0,24 1,29cd ± 0,19 0,62ad ± 0,30 1,73ad ± 1,50
0,14 1,43 0,67 1,30 1,71 2,13
Selain itu, menurunnya aktivitas enzim juga disebabkan berkurangnya jumlah substrat atau jumlah produk enzim
menghambat
kompleks
pembentukan
enzim
substrat
(Hasnunidah dan Sumardi, 2009). Menurut Wirawan (2009), penurunan aktivitas
lipolitik
diduga
karena
adanya hambatan dari metabolit yang dikeluarkan bersamaan dengan lipase oleh bakteri pada media produksinya. Berdasarkan hasil penelitian dapat diketahui bahwa waktu inkubasi optimal
yang diperlukan bakteri
Actinobacillus
sp.
dalam
memproduksi enzim lipase adalah pada jam ke-24. Aktivitas lipolitik pada waktu inkubasi optimal adalah sebesar 1,36 U/ml.
1,25
Aktivitas lipase (U/ml)
16,00
1,36
11,50
1,00
12,11
13,55 1,15
9,83 0,97
0,75
13,34
13,21
13,08 13,04 1,09
13,14 1,09
1,09
0,96
14,00
13,27
13,07
13,01
12,00
1,07
10,00
0,97 0,89
0,93
8,00
8,01
6,00
0,58
0,50 0,45
4,00
0,25
2,00
0,00
0,00 0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
Log jumlah sel bakteri (CFU/ml)
1,50
52
Waktu inkubasi (jam) aktivitas enzim
kurva pertumbuhan bakteri
Gambar 2. Pertumbuhan dan aktivitas lipolitik bakteri Actinobacillus sp. pada media Busnell Haas + minyak goreng 1%
d. Karakterisasi Enzim Lipase Bakteri Actnobacillus sp.
residu asam amino (Sofia, 2000
Berdasarkan Gambar 3 diketahui
2009). Di samping itu, tiap enzim
dalam Hasnunidah dan Sumardi,
bahwa pada pH 5.0 hingga 7.0
memiliki
aktivitas
berbeda-beda,
lipolitik
mengalami
struktur
molekul
dimana
ada
yang yang
peningkatan. Akan tetapi, aktivitas
memiliki rantai samping basa, netral,
lipolitik mengalami penurunan pada
atau
pH 8.0. Penurunan aktivitas lipolitik
mengakibatkan suatu enzim secara
ini dikarenakan enzim mengalami
keseluruhan dapat bermuatan positif
denaturasi atau struktur sekunder dan
atau negatif pada pH tertentu (Dewi,
tersiernya berubah. Perubahan nilai
2009). Dengan demikian diketahui
pH akan menyebabkan struktur dan
bahwa pH optimal aktivitas lipolitik
aktivitas
dari bakteri Actinobacillus sp. adalah
enzim
berubah
dan
mengakibatkan perubahan muatan
asam.
pada pH 7.0.
Hal
tersebut
Aktivitas lipase (U/ml)
1,50 1,19
1,25 0,99
1,09
1,00 0,91
0,75 4
5
6
7
8
9
pH
Aktivitas lipase (U/ml)
Gambar 3. Aktivitas lipolitik bakteri Actinobacillus sp. pada berbagai pH dengan suhu 37º C 2,00 1,75
1,55
1,50
1,46
1,12
1,25 1,00
1,16
1,06
0,75
20
30
40
50
60
70
80
Suhu (ºC)
Gambar 4. Aktivitas lipolitik bakteri Actinobacillus sp. pada berbagai suhu dalam kondisi pH optimal (pH 7.0) Berdasarkan Gambar 4 diketahui
optimal lipase untuk mengkatalisis
pada suhu 30º hingga 60º C terjadi
reaksi adalah antara 20º – 60º C. Dari
peningkatkan
lipolitik.
hasil penelitian aktivitas lipolitik
Namun pada suhu 70º C terjadi
bakteri Actinobacillus sp. pada pH
penurunan aktivitas lipolitik karena
dan suhu optimal adalah sebesar 1,55
enzim mengalami denaturasi protein.
U/ml.
aktivitas
Dengan demikian diketahui bahwa
Aktivitas
lipolitik
bakteri
suhu optimal aktivitas lipolitik dari
Actinobacillus sp. ini lebih besar bila
bakteri Actinobacillus sp. adalah
dibandingkan dengan hasil penelitian
pada suhu 60º C. Hasil ini didukung
Liu et al. (2006) yang menggunakan
oleh Reetz et al. (2006) yang
isolat uji Aeromonas sp. dengan
menyatakan bahwa kisaran suhu
aktivitas lipolitik sebesar 0,70 U/ml.
Selain itu, nilai aktivitas lipolitik
bahwa
bakteri Actinobacillus sp. juga lebih
hidrokarbonoklastik
besar bila dibandingkan dengan hasil
Laboratorium
penelitian Guzman et al. (2008) yang
Universitas Airlangga yang memiliki
menggunakan isolat uji
aktivitas
Bacillus
spesies
mikroba koleksi
Mikrobiologi
lipolitik
FST
adalah
pumilus dengan aktivitas lipolitik
Acinetobacter
sebesar
Actinobacillus sp., Bacillus subtilis
0,079
aktivitas
U/ml.
Tingginya
lipolitik
Actinobacillus
sp.
bakteri menunjukkan
3Kp,
faecalis
Candida
tipe
famata,
parapsilopsis,
II,
C.
Pseudomonas
bahwa bakteri ini berpotensi dalam
aeruginosa, P. putida, P. cepacea,
menghasilkan
Di
P. flourescens-25, P. pseudomallei,
samping itu, enzim lipase bakteri
Rhodotorulla mucilaginosa dimana
Actinobacillus sp. optimal pada suhu
mikroba
60º C. Oleh karena itu, enzim lipase
aktivitas lipolitik tertinggi adalah
ini dapat diaplikasikan untuk industri
Actinobacillus sp. Actinobacillus sp.
yang melakukan proses produksi
memiliki kemampuan menghasilkan
pada suhu tinggi, seperti industri
enzim lipase sebesar 1,36 U/ml pada
makanan dan kosmetik.
waktu inkubasi optimal 24 jam.
enzim
lipase.
yang
Karakteristik KESIMPULAN Berdasarkan pembahasan
dapat
memiliki
enzim
lipase
indeks
dari
Actinobacillus sp. adalah memiliki dan
optimal pada suhu 60 ºC dan pH 7.0
disimpulkan
dengan aktivitas lipolitik sebesar
hasil
1,55 U/ml. DAFTAR PUSTAKA Arsyad, S. dan Rustiadi, E. 2008. Penyelamatan Tanah, Air, dan Lingkungan. Edisi Pertama. Crestpent Press dan Yayasan Obor Indonesia. Dewi, G.D.F. 2009. Isolasi dan Karakterisasi Ekstrak Kasar Enzim Laktase dari
Fungi Pelapuk. Skripsi. Departemen Kimia, FSAINTEK, Universitas Airlangga. Guzman, M.N., Vargas, V.A., Antezana, H., and Svoboda, M. 2008. Lipolytic Enzyme Production by Halophilic/Halotolerant Microorganisms Isolated
from Laguna Verde, Bolivia. J. Revista Boliviana De Quimica, 25.
Nugroho, A. 2006. Bioremediasi Hidrokarbon Minyak Bumi. Yogyakarta: Graha Ilmu.
Hasnunidah, N. dan Sumardi. 2009. Isolasi Bacillus sp. Penghasil Lipase dari Saluran Pencernaan Ayam Kampung. Jurusan Biologi. FMIPA. Unila.
Reetz, M.T., Carballeira, J.D., Vogel, A. 2006. Iterative Saturation Mutagenesis on the Basis of B Factors as a Strategy for Increasing Protein Thermostability. Angew. Chem. Int. Ed., 45, 7745-7751.
Hou, C.T. and Johnston, T.M. 1992. Screening of Lipase Activities with Culture from The Agricultural Research Culture Collection. J. Am. Oil. Chem. Soc., 69, 1088-1097. Liu, C.H., Chen, W.M., and Chang, J.S. 2006. Methods for Rapid Screening and Isolation of Bacteria Producing Acidic Lipase: Feasibility Studies and Novel Activity Assay Protocols. J. Microb Biotechnol., 23, 633-640. Miller, F.P., Vandome, A.F., and McBrewster, J. 2010. Lipase. Alphascript Publishing. USA.
Sumarsih, S. 2005. Skrining Bakteri Penghasil Lipase Termostabil dari Reaktor pada Pabrik Minyak Goreng. Laporan Penelitian Dipa Penerimaan Bukan Pajak Tahun Anggaran 2005. FMIPA. Universitas Airlangga. Syamsudin, Sri Purwanti, dan Andri Taufick R. 2008. Efektivitas Enzim dalam Sistem Lumpur Aktif pada Pengolahan Air Limbah Pulp dan Kertas. Berita Selulosa Vol. 43 (2), hal 8392. Via.
Ni’matuzahroh, Supriyanto, A., Affandi, M. dan Fatimah. 2009. Bioremediasi Tanah Tercemar Minyak Menggunakan Konsorsium Mikroba. Laporan Hibah Penelitian Strategis Nasional Tahun Anggaran 2009. Universitas Airlangga.
2009. Minyak Bumi. http://kimiakoloid.com/blog/? cat=13. Diakses tanggal 18 Januari 2011.
Wirawan, B. 2009. Potensi Bakteri Endofit Tanaman Obat sebagai Penghasil Senyawa Antihiperlipidemia melalui Aktivitas Lipase. Skripsi. Departemen Biologi. FMIPA. IPB. Bogor.
