Sipos Ferenc Új PNS oligomerek és P-királis mononukleotidok szintézise és szerkezetvizsgálata Doktori (Ph.D.) értekezés
Témavezető: Sági Gyula, C.Sc.
MTA Kémiai Kutatóközpont, Biomolekuláris Kémiai Intézet
ELTE-TTK Kémia Doktori Iskola Vezető: Inzelt György, D.Sc.
Szintetikus kémia, anyagtudomány, biomolekuláris kémia program Programvezető: Horváth István Tamás, D.Sc.
2009
Köszönetnyilvánítás
Doktori értekezésemet az MTA Kémiai Kutatóközpont, Biomolekuláris Kémiai Intézetben készítettem el. Témavezetőm Dr. Sági Gyula volt. Köszönöm az értékes segítségét, melyet a kémiai munkám során, valamint a publikációs, pályázati dokumentumok elkészítésében nyújtott. Köszönöm továbbá türelmét, amivel munkámat mindvégig támogatta.
Köszönöm Dr. Pálinkás Gábornak az MTA Kémiai Kutatóközpont főigazgatójának és Dr. Hajós Györgynek a Biomolekuláris Kémiai Intézet Igazgatójának, hogy a Magyar Tudományos Akadémia Kémiai Kutatóközpontjában készíthettem el doktori munkámat.
A műszeres mérésekért Dr. Gács-Baitz Eszternek, Lejtoviczné Dr. Egyed Orsolyának, Dr. Tőke Orsolyának, Dr. Szabó Pálnak és Dr. Pollreisz Ferencnek tartozom köszönettel.
Köszönöm az alábbi szervezeteknek, hogy anyagi támogatásukkal lehetőséget teremtettek eredményeim bemutatására nemzetközi konferenciákon: Alapítvány a Magyar Peptid és Fehérjekutatásért Richter Gedeon Centenáriumi Alapítvány NKFP MediChem2 (1/A/005/04) Center of Excellence (QLK2-CT-2002-90436)
Köszönettel tartozom a következő személyeknek a szeretetükért és segítségükért, amellyel körülvettek és a munkám eredményességéhez hozzájárultak: Sendula Róbert, Baraczka Balázsné, Braun Andrásné, Sipos Szabolcs, Jablonkai István, Kőhalmy Krisztina, Szabó Bernadett.
Szeretném megköszönni volt általános iskolai, középiskolai és egyetemi tanáraimnak, hogy munkájukkal megalapozták bennem a kémia iránti szeretetet.
Köszönöm továbbá szüleimnek és az egész családomnak, hogy végig biztosították a nyugodt hátteret a munka sikeres elvégzéséhez és a disszertáció megírásához.
2
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények Gacs-Baitz, E.; Sipos, F.; Egyed, E.; Sagi G.: „Synthesis and structural study of variously oxidized
diastereomeric
5’-dimethoxytrityl-thymidine-3’-O-[O-(2-cyanoethyl)-N,N-
diisopropyl]-phosphoramidite derivatives. Comparison of the effects of the P=O, P=S, and P=Se Functions on the NMR spectral and Chromatographic Properties” Chirality 2008, 21(7). 663-685.
Sipos, F.; Sagi, G.: „Synthesis of new, base-modified PNA monomers” Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 2007, 26 (6-7), 681-685.
Sipos, F.; Sagi, G.: „Synthesis of 5-substituted-uracil PNA monomers by Pd-catalyzed cross-couplings” Journal of Peptide Science 12: 137-137 Suppl. S 2006
Egyéb közlemények Gunduz, O.; Sipos, F.; Spagnolo, B.; Kocsis, L.; Magyar, A.; Orosz, G.; Borsodi, A.; Calo, G.; Benyhe, S.: "In vitro binding and functional studies of Ac-RYYRIKol and its derivatives, novel partial agonists of the nociceptin/orphanin F/Q receptor" Neurosignals 2006, 15, 91-101.
3
Rövidítések jegyzéke A szövegben leggyakrabban alkalmazott rövidítések az alábbiak voltak:
Boc
terc-butiloxikarbonil
BSA
N,O-bisz-trimetilszilil-acetamid
CAN
cérium(IV) ammónium nitrát
DCC
N,N’-diciklohexilkarbodiimid
DCE
diklóretán
DCM
diklórmetán
DIC
N,N’-diizopropilkarbodiimid
DIEA
N,N-diizopropil-etil-amin
DMAP
4-dimetilamino-piridin
DME
dimetoxi-etán
DMF
N,N-dimetilformamid
DMSO
dimetilszulfoxid
DMT
dimetoxi-tritil
DNS
dezoxiribonukleinsav
EDA
etilén-diamin
EDTA
etiléndiamin-tetraecetsav
EtOAc
etilacetát
HOBt
benzotriazol-1-ol-hidrát
HPLC
nagy hatékonyságú folyadék kromatográfia
MBHA
metilbenzhidrilamin-gyanta
mRNS
messenger RNS
MS
tömegspektrometria
NMP
N-metil-pirrolidon
NMR
mágneses magrezonancia spektroszkópia
ODN
oligodezoxinukleotid
OSu
O-szukcinimidil
PCR
polimeráz láncreakció
PNS
peptid-nukleinsav
PMB
para-metoxi-benzil
RNS
ribonukleinsav 4
RP
fordított fázis
TBTU
O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametilurónium tetrafluoroborát
T-CED
5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diisopropil]foszforamidit
TEA
trietil-amin
TEAA
trietilammónium acetá
TFA
trifluorecetsav
TFMSA
trifluorometánszulfonsav
TMS
trimetilszilil
VRK
vékonyréteg kromatográfia
Z
benziloxikarbonil
5
Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás .............................................................................................................. 2 Az értekezés alapjául szolgáló közlemények ........................................................................ 3 Rövidítések jegyzéke............................................................................................................. 4 Tartalomjegyzék .................................................................................................................... 6 1. Bevezetés ......................................................................................................................... 10 1.1. DNS bázis-módosítások ........................................................................................... 10 1.2. A peptid-nukleinsavak.............................................................................................. 11 1.3. Keresztkapcsolási reakciók ...................................................................................... 14 1.4. Szilárd fázisú peptidszintézis.................................................................................... 15 1.4.1 A Boc és az Fmoc technika ................................................................................ 16 1.4.2. A szilárdfázisú PNS szintézis ............................................................................ 17 1.5. A P-királis mononukleotidok szintézise és NMR analízise...................................... 18 2. Célkitűzések .................................................................................................................... 20 3. Eredmények ..................................................................................................................... 22 3.1. Boc-gerinc szintézise................................................................................................ 22 3.2. 5-jód-uracil PNS monomer szintézise ...................................................................... 23 3.3. Stille kapcsolások ..................................................................................................... 25 3.4. A 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer szintézise ..................................................... 28 3.5. Sonogashira kapcsolások.......................................................................................... 29 3.6. Suzuki kapcsolások .................................................................................................. 31 3.6.1. Suzuki kapcsolások in situ laktám védelem melett ............................................... 33 3.7. PNS T monomer előállítása...................................................................................... 35 3.8. PNS C monomer szintézise ...................................................................................... 36 3.9. Oligomer szintézis .................................................................................................... 37 3.9.1. PNS oligomer szintézise.................................................................................... 37 3.9.2. A komplementer DNS oligomer szintézise ....................................................... 38 3.10. Stabilitás vizsgálatok .............................................................................................. 40 3.11. P-királis mononukleotidok szintézise......................................................................... 42 3.11.1. Szintézis........................................................................................................... 43 3.11.2. NMR vizsgálatok............................................................................................. 45 3.11.3. HPLC analízisek .............................................................................................. 49 4. Összefoglalás ................................................................................................................... 51 6
5. Kísérleti rész .................................................................................................................... 55 5.1. Vékonyréteg-kromatográfia...................................................................................... 55 5.1.1. Előhívó reagensek: ............................................................................................ 55 5.1.1.1. Klór-tolidin ................................................................................................. 55 5.1.1.2. Ninhidrin..................................................................................................... 55 5.2. HPLC vizsgálat......................................................................................................... 55 5.3. A gyanta kapacitásának meghatározása ................................................................... 56 5.3.1. Kvantitatív pikrinsavas teszt.............................................................................. 56 5.3.2. Kaiser (ninhidrin) teszt ...................................................................................... 57 5.4. Boc-gerinc szintézis.................................................................................................. 58 5.4.1. Boc-etilén-diamin előállítása............................................................................. 58 5.4.2. N-(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilészter (Boc-gerinc) szintézise.......................... 59 5.5. 5-jód-uracil PNS monomer szintézis........................................................................ 60 5.5.1. (5-jód-uracil-1-il)-ecetsav terc-butil észter előállítása ...................................... 60 5.5.2. (5-jód-uracil-1-il)-ecetsav előállítása ................................................................ 61 5.5.3. N-(5-jód-uracil-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter (5-jód-uracil PNS monomer) szintézise............................................................................................ 61 5.6. Stille-kapcsolások..................................................................................................... 63 5.6.1.
N-[5-(2-furanil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter
szintézise...................................................................................................................... 63 5.6.2.
N-[5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter
előállítása ..................................................................................................................... 64 5.6.3. N-(5-fenil-uracil-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise 65 5.6.4. N-[5-(2-furanil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin szintézise ...... 66 5.6.5.
N-[5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter
előállítása ..................................................................................................................... 67 5.6.6.
N-[5-(2-fenil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter
szintézise...................................................................................................................... 68 5.7. 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer szintézise......................................................... 69 5.7.1. [3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-ecetsav terc-butil észter előállítása....... 69 5.7.2. [3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-ecetsav előállítása................................. 70 5.7.3.
N-[3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-glicin-
etilészter (3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer) szintézise.......................................... 71 5.8. Sonogashira-kapcsolások.......................................................................................... 72
7
5.8.1.
N-[3-(4-metoxibenzil)-5-feniletinil-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-
glicin-etilészter szintézise............................................................................................ 72 5.8.2. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(hex-1-inil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)glicin-etilészter előállítása ........................................................................................... 73 5.8.3. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(prop-1-inil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)glicin-etilészter szintézise............................................................................................ 74 5.9. Suzuki-kapcsolások .................................................................................................. 75 5.9.1.
N-[3-(4-metoxibenzil)-
5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-
glicin-etilészter előállítása ........................................................................................... 75 5.9.2. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(bifenil-4-il)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)glicin-etilészter szintézise............................................................................................ 76 5.9.3.
N-[3-(4-metoxibenzil)-
5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-
aminoetil)-glicin-etilészter előállítása ......................................................................... 77 5.9.4. N-[3-(4-metoxibenzil)- (5-(4-dimetilamino)fenil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Bocaminoetil)-glicin-etilészter szintézise.......................................................................... 78 5.10. In situ szilezés Suzuki kapcsolás során .................................................................. 79 5.10.1. [5-(2-tienil)-uracil-1-il]-ecetsav terc-butil észter előállítása ........................... 79 5.10.2. [5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]ecetsav t-butil észter................................ 81 5.10.3.
N-[5-(2-tienil)-uracil-1-il]acetil-N-[2-(Boc-amino)etil]-glicin-etilészter
előállítása ..................................................................................................................... 82 5.10.4.
N-[5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]acetil-N-[2-(Boc-amino)etil]-glicin
etilészter....................................................................................................................... 83 5.11. Timin PNS monomer szintézise ............................................................................. 84 5.11.1. timin-1-il-ecetsav............................................................................................. 84 5.11.2. N-(timin-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise .......... 85 5.11.3. N-(timin-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin (Timin PNS monomer) előállítása ..................................................................................................................... 86 5.12. Citozin PNS monomer szintézise ........................................................................... 87 5.12.1. Uracil-1-il-ecetsav terc-butil észter előállítása................................................ 87 5.12.2. (2-Oxo-4-[1,2,4]triazol-1-il-2H-pirimidin-1-il)-ecetsav-terc.butil észter ....... 88 5.12.3. Citozin-1-il-ecetsav-terc.butil észter előállítása .............................................. 89 5.12.4. (4-Z-citozin-1-il)-ecetsav-terc.butil észter szintézise...................................... 90 5.12.5. (4-Z-citozin-1-il)-ecetsav előállítása ............................................................... 90 5.12.6. N-(4-Z-citozin-1-il)-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise .. 92 8
5.12.7. N-(4-Z-citozin-1-il)-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-glicin előállítása ................. 93 5.13. Oligomer szintézisek .............................................................................................. 94 5.13.1. A PNS oligomerek szintézise .......................................................................... 94 5.13.2. A komplementer ODN szintézise.................................................................... 94 5.14.
5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diizopropil]-foszforamidit
származékok szintézise.................................................................................................... 95 5.14.1. A DP-(RP)- és az LP-(SP)-5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,Ndiizopropil]-foszforamidit szintézise........................................................................... 95 5.14.2. A DP-(SP)- és az LP-(RP)-5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,Ndiizopropil]-foszforamidát előállítása ......................................................................... 96 5.14.3. A DP-(SP)- és az LP-(RP)-5’-O-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)N,N-diizopropil]-foszforamidotioát szintézise ............................................................ 98 5.14.4. A DP-(SP)- és az LP-(RP)-5’-O-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)N,N-diizopropil]-foszforamidoszelenoát előállítása.................................................... 99 6. Irodalomjegyzék ............................................................................................................ 101 Összefoglalás ..................................................................................................................... 105 Summary............................................................................................................................ 106
9
1. Bevezetés 1.1. DNS bázis-módosítások Minden természetes nukleotid három összetevőből áll: egy heterociklusos bázisból, (pirimidin- vagy purin-bázis); egy cukorból (ribóz vagy 2’-dezoxiribóz) és végül egy foszfátcsoportból. Ebből következik, hogy a DNS módosítások lehetséges helyei: a cukorrész, a foszfát-csoport és a bázis, illetve lehetőség van extra részek beépítésére (interkaláció) és a cukor-foszfát gerinc részleges vagy teljes átalakítására (peptidnukleinsav) is. A módosítások célja leggyakrabban az olvadáspont (Tm), a DNáz rezisztencia vagy a sejtpenetráció növelése.
1. Tm pont meghatározása
A DNS elméleti olvadáspontja alatt a hőmérséklet növekedés és a fényelnyelés mértéke által alkotott görbe inflexiós pontját (1. ábra) értjük. Ez a jelenség csak analóg folyamat, de közel sem azonos az olvadással. A Tm függ a G és C bázispárok arányától, ugyanis ezeket a bázisokat három hidrogénkötés kapcsolja össze, így a G és C bázispárok százalékos arányának növelésével nő a duplex olvadáspontja. Rövid oligodezoxinukleotid modellvegyületeken végzett korábbi tanulmányok
1 2
szerint
az uracil bázis 5-heteroaril ill. alkinil szubsztitúciója ∆Tm/módosítás = +0,3 - +2,2 °C mértékben növeli a 3’-végen 5 módosított bázist tartalmazó 15-mer ODN-RNS duplexek stabilitását. A pirimidin bázis és a különböző aromás gyűrűk π elektronjainak delokalizációja folytán a nukleozidok UV spektrumaiban ∆λmax = +35 - +58 nm-es 10
vöröseltolódás észlelhető a timidinhez viszonyítva ( λmax = 262 nm), ami ugyancsak a pirimidin és a megfelelő heteroaromás gyűrűk koplanáris orientációjára utal. A stacking ezzel együtt a ∆Tm még nagyobb mértékben növelhető, ha a pirimidin bázis 4,5 azaz [d] helyzetben benzoxazin ill. benzotiazin kondenzált gyűrűket tartalmaz. Az így kapott triciklusos fenoxazin ill. fenotiazin módosított bázisok beépítése a DNS-be ∆Tm/módosítás = +4 - +5 °C-kal növeli a megfelelő DNS-RNS duplexek stabilitását amennyiben a szóban forgó módosított egységek egymás mellett helyezkednek el. 3
1.2. A peptid-nukleinsavak A peptid-nukleinsav (PNS) molekula egy szintetikus nukleotid analóg 4,5, melyet a génterápiás eljárásokban és a molekuláris diagnosztikában alkalmaznak.
2.
A DNS és PNS szerkezete
A PNS molekulában két funkcionális egységet különítünk el: a cukorfoszfát gerincet kiváltó, poli[N-(2-aminoetil)glicin] vázat, melyben az építőelemek peptidkötéssel kapcsolódnak egymáshoz , valamint a nukleobázisokat tartalmazó oldalláncokat. A nukleobázisok egy-egy acetilcsoporton keresztül kapcsolódnak a vázhoz. (2. ábra) A peptid-nukleinsavak, annak ellenére, hogy akirális és semleges vázat tartalmaznak, rendelkeznek a natív nukleinsavak bázispárosodási képességével 6. A PNS:DNS és különösen a PNS:RNS duplexek jóval stabilabbak, mint a megfelelő DNS hasonmások 7. Ezenkívül a PNS teljesen rezisztens peptidázokkal és proteázokkal szemben.
3. A PNS és a királis PNS szerkezete
11
A peptid-nukleinsav akirális tulajdonsága miatt a PNS oligomerek egyaránt képezhetnek jobb és bal menetes hélixet 8. A preferált irányultság kialakulását elősegíti az oligomer C terminálisához kötődő királis aminosav (pl L- vagy D-lizin) 9. Királis információ bevitelére egy másik lehetőség az ha a PNS monomerben a glicint különböző L- ill. D-aminosavakkal helyettesítjük (3. ábra), amely azonban az aminosav oldalláncok sztérikus gátló hatása miatt duplex destabilizációhoz vezet
10
. Ugyanakkor a hidrofób
(leucin, valin stb.) és különösen az oldalláncban negatív töltést hordozó (glutaminsav) aminosavaktól eltérően a lizin egységek láncvégi aminocsoportja ionos kötést tud kialakítani a komplementer DNS vagy RNS foszfátcsoportjaival ezáltal optimális esetben duplex stabilizáló hatást fejt ki
11
. Az említett két ellentétes hatás eredője kismértékben
ugyan de pozitív és többek között függ a két lánc orientációjától is. Három szeparált Dlizin tartalmú PNS egység beépítése a megfelelő antiparallel PNS-DNS duplexet, míg az ugyanilyen L-lizines egységek beépítése a parallel duplexet stabilizálja ~∆Tm/módosítás = +1°C mértékben. Ugyanakkor, ha ugyanez a 3 D-lizin-PNS egység a szekvencia közepén egy blokkban
12
helyezkedik el akkor ez 7 °C-os Tm csökkenést eredményez
(∆Tm/módosítás = -2.3 °C) a megfelelő akirális (glicin-PNS egységeket tartalmazó) PNSDNS duplex Tm-jéhez viszonyítva
13
. Másfelől viszont rendkívül figyelemreméltó az
említett királis blokk mismatch felismerő tulajdonsága. Amennyiben a target DNS-ben a téves bázis (mismatch) a királis blokk középső D-lizin-PNS-t egységével szemben helyezkedik el akkor ez teljesen destabilizálja a duplexet, míg ha a mismatch a királis blokk valamelyik szélső egységével szemben áll ez is jelentős (∆Tm = -12-(-22) °C) Tm csökkenéshez vezet 13. Mivel a PNS-DNS de különösen a PNS-RNS duplexek stabilitása nagyobb, mint a megfelelő DNS hasonmásoké így a DNS-ben már kipróbált valamint a még ismeretlen hatású 5-heteroaril ill. alkinil szubsztituensek beépítése homogén PNS-be várhatólag hasonló vagy még nagyobb mértékű Tm növekedést eredményezhet. A PNS-t terápiás felhasználásra a duplexképző tulajdonságai teszik különösen alkalmassá. Antigénként és antiszenszként is egyaránt felhasználható. Az előbbi esetén a különböző kórokozók homopurin DNS szakaszaival komplementer PNS-ek a stabil inváziós triplex képzés alapján gátolják a transzkripciót. Erre a célra PNS-peptid ill. más, a sejtmagba történő bejutást megkönnyítő, konjugátumokat kell alkalmazni. Utóbbi során a kórokozók megfelelően kiválasztott, hozzáférhető szakaszait célzó PNS-ek gátolják a
12
transzlációt. A jobb sejtpenetráció biztosítása céljából itt is különböző kimérákat ill. konjugátumokat célszerű alkalmazni. A diagnosztikai alkalmazások közül legjelentősebbek a PNS fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH) próbák, a polimeráz láncreakció (PCR) blokkolása PNS-el és PNS mikrochipek. A FISH során a fluoreszcens festékkel jelzett nukleinsav elegyből a keresett DNS vagy RNS ismert szekvenciájú szakasza nagy affinitással és szelektivitással kötődik a vele komplementer, immobilizált PNS-hez. A nem kötődő nukleinsavak lemosása után a fluoreszcencia intenzitás mérése alapján meghatározható a megkötött target nukleinsav mennyisége. Főbb alkalmazások: rák-diagnosztika a telomer próbák alapján, baktériumok kimutatása a rájuk jellemző riboszomális RNS hibridizációja alapján, kromoszóma hibák kimutatása. Mivel az alapvető szerkezeti különbségek miatt a PNS nem használható PCR primerként így alkalmas arra, hogy egy primer kötőhelyre célzott PNS egy vad típusú vagy mutáns gén nem kívánt amplifikációját megakadályozza. Ez a módszer lehetővé teszi a viszonylag kis mennyiségben előforduló génmutációk kimutatását is. A PNS mikrochipek szilárd hordozóhoz kötött PNS oligomerek, amelyek a nagyon erős és szelektív hibridizáció alapján megkötik a velük komplementer, többnyire fluoreszcens jelzett DNS vagy RNS szekvenciákat, ami a DNS és RNS szekvenálását is lehetővé teszi.
13
1.3. Keresztkapcsolási reakciók A σ-kötésű átmenetifém-organikus vegyületek legelterjedtebb alkalmazásai az új szén-szén kötés kialakításával járó keresztkapcsolási reakciókban való részvételükre épülnek. A reakciót általában palládium(0) vagy nikkel(0) katalizálja. A folyamat lépéseit a 4. ábra mutatja be. RX R-R' MLn
oxidativ addició
reduktiv elimináció
RMX Ln
RMLn R'
izomerizáció
R'M' transzmetallálás RMR' Ln
M'X
MLn : Pd(0), Pd(II), Ni(0) X : I, Br, Cl, M' : B(OH)2 , SnR3 , Cu, ZnX, MgX 4. A keresztkapcsolási reakciók általános mechanizmusa
Az első lépés egy szerves halogén tartalmú vegyület oxidatív addíciója az alacsony oxidációs állapotú átmenetifémre, azaz az átmeneti fém beékelődik egy szén-heteroatom kötésbe. Az átmeneti fémek közül a palládium és a nikkel emelkedik ki, illetve a telítetlen szerves halogenidek az elsődleges reagensek. Alkilhalogenidek alkalmazását befolyásolja, hogy a képződő alkil-átmenetifém-halogenid könnyen elbomlik β-eliminációval. A szerves halogenidek reaktivitása I>Br>>Cl sorrendben változik. Gyakorlati szempontból az olcsó és stabil klórvegyületek alkalmazása lenne a leginkább megfelelő, azonban az oxidatív addiciós készségük olyan csekély, hogy csak ritkán alkalmazhatóak. A keresztkapcsolási reakció második lépése a transzmetallálás, amely során a kapcsolni kívánt másik szerves molekularészlet kerül az átmenetifémre. Ennek az egyensúlyi folyamatnak a hajtóereje általában az újonnan kialakuló fém-halogén kötés termodinamikai stabilitása. A szerves részlethez kapcsolódó átmenetifém elektronokban gazdagabbá válik a folyamat során. Általában ez a lépés a ciklusban a sebességmeghatározó.
14
A következő lépésben az átmenetifém körüli átrendeződés történik meg, azaz a transz elhelyezkedésű csoportok egy gyors izomerizációs lépés eredményeképp cisz-helyzetbe kerülnek. A záró reduktív eliminációs lépés eredményeképp leszakad a kapcsolt termék és a
katalitikus
ciklus
bezárul
az
alacsonyabb
oxidációs
állapotú
átmenetifém
újraképződésével. Az alkalmazott átmenetifém általában komplex formában jelenlévő nikkel(0) vagy palládium(0), ligandumként leggyakrabban a trifenilfoszfin származékok jöhetnek szóba. A kapcsoló partner, amely a transzmetallálással kerül az átmeneti fémre valamilyen fémorganikus reagens. A palládium által katalizált keresztkapcsolási reakciók előnye, hogy olyan kevéssé poláris elemorganikus vegyületek is kiválóan használhatóak (boronsavak, ón-, réz, és szilícium reagensek) melyek számos funkciós csoport jelenlétét tolerálják a molekulában. A keresztkapcsolási reakciókat az alkalmazott fémorganikus reagensek típusától függően különböző néven szokás említeni. A boronsavakat alkalmazó palládium katalizálta
reakciókat
Suzuki
kapcsolásnak,
az
ón-reagenseket
használót
Stille
kapcsolásnak nevezzük. A Negishi-reakcióban cinkorganikus vegyületet, a Karaschreakcióban Grinard reagenst, míg a Sonogashira kapcsolásokban rézorganikus reakció partnert alkalmaznak.
1.4. Szilárd fázisú peptidszintézis A szilárd fázisú szintéziseket gyakran alkalmazzák nagyobb molekulák előállítása során. A különböző oligomerek (peptid, DNS, PNS) szintézise ezen a módon sokkal egyszerűbb és hatékonyabb, mint folyadékfázisban. Ezt a módszert Merrifield 1963-ban publikálta, segítségével egy tetrapeptidet állított elő 14 15. Később néhány apróbb technikai fejlesztés után a peptidkémikusok rutinszerűen alkalmazták az eljárást 16.
15
5. A szilárdfázisú peptidszintézis
A módszer elve igen egyszerű: az első aminosavat a szilárd hordozóhoz kötjük, és ezt építjük tovább ciklusosan, olyan módon, hogy a peptidlánc és a gyanta közötti kovalens kötés stabil maradjon (5. ábra). A reagensek nagy feleslegben alkalmazhatóak, a felesleget többszöri mosással és szűréssel könnyen eltávolíthatjuk. Ezáltal az egyes reakciólépések kitermelése közel 100 % és így jó minőségű nyerstermék állítható elő. A kapcsolások sikerét kvalitatív és kvantitatív módon is vizsgálhatjuk
17
. A szintézis végén a kész
terméket lehasítjuk a gyantáról és HPLC-vel tisztíthatjuk. Az ismétlődő lépések miatt a módszer automatizálható.
1.4.1 A Boc és az Fmoc technika A peptidek felépítésében az aminosavak -amino- és -karboxilcsoportjai vesznek részt. A peptidlánc a C terminálistól az N terminális felé haladva épül fel a szilárd fázisú szintézis során. Ebből adódik, hogy a beépülő aminosavban a karboxilcsoport mindig szabad, és az aminocsoportot ideiglenes védelemmel látják el, mely a kapcsolás után minden ciklusban könnyen lehasítható. A standard Merrifield módszer a N-tercbutiloxikarbonil (Boc) amino-védőcsoportot használja, mely szerves (pl. TFA) és szervetlen (pl. HCl) savakra hasad
18
. Atherton és Sheppard dolgozta ki a N-9-
fluorenilmetiloxikarbonil (Fmoc) védőcsoporton alapuló technikát
19
. Az aminocsoport
védelmére szolgáló Fmoc csoport szerves, szekunder aminokkal hasítható.
16
1.4.2. A szilárdfázisú PNS szintézis A peptidnukleinsav oligomerek szintézise is megvalósítható szilárd fázison, a peptid szintézis protokolljának kisebb változtatásával. A Boc-
20
és az Fmoc-
21
technika
egyaránt alkalmazható. A szilárdfázisú szintézis során alkalmazott pirimidin bázisokat tartalmazó védett PNS monomerek szerkezetét a 6. és a 7. ábra szemlélteti.
6. Boc-timin és a Boc/Z-citozin PNS momomer
7. Fmoc-védett timin és citozin PNS monomer
Az Fmoc-stratégia előnye, hogy az egyes kapcsolások hozama spektrofotometriásan mérhető. Nagy hátránya viszont az N3→N6 acilvándorlás és az N-terminális egység eliminációjával járó két mellékreakció (8. ábra). A Boc/Z módszer előnye, hogy a védőcsoport eltávolítása után az N terminális protonált formában nem képes nukleofil támadásra, így nincsenek mellékreakciók. A hasítás során alkalmazott TFA gátolja a növekvõ láncok intermolekuláris aggregációját is. A szilárd fázisú szintézis manuális úton is biztonsággal végezhető.
17
8.
Mellékreakciók az Fmoc-csoport hasítása során
1.5. A P-királis mononukleotidok szintézise és NMR analízise Lankhorst és mtsai. természetes dinukleotidok NMR adatainak analízise során többek között megállapították, hogy a C3’-O3’ kötés körüli konformációs egyensúly jól jellemezhető a 3J (P, C4’) és a 3J (P, C2’) vicinális csatolási állandókkal
22
. Ebből
kiindulva az MTA Kémiai Kutatóközpont NMR és Nukleotidkémiai Kutatócsoportjai közötti együttműködés eredményeként számos új P-sztereokémiailag egységes P-királis mono- és dinukleotid szintézisére és hasonló NMR vizsgálatára került sor 23 24 25 26 27 28 29 30 31
. Ennek során kiderült, hogy a P-izomerek esetében az említett csatolási állandók
különbsége nevezetesen a ∆J = 3J (P, C4’) – 3J (P, C2’) érték egyértelműen korrelál a transz vagy a gauche konformerek dominanciájával az adott konformációs egyensúlyi elegyben. A pozitív ∆J értékek az εt (transz) míg a negatív értékek az ε- (gauche-) konformer túlsúlyát jelzik. Ezenfelül a P-diasztereomerek ∆J értékei minden vizsgált esetben jellemzőek voltak az abszolút P-konfigurációra is, amelyet NOE mérések is alátámasztottak. Az előállított vegyületek NMR paramétereinek elemzéséből több fontos következtetés vonható le így pl.: 1, Az N-glikozidos kötés körüli konformációra vonatkozólag megállapítható, hogy a torziós szögek valamint a H1’ és a H6 protonok nagyon hasonló kémiai eltolódásai minden izomer pár esetében a nukleobázisnak a cukorhoz viszonyított anti konformációját igazolják. 2, A C3’-O3’ kötés körüli konformációs egyensúlyt, ezáltal a ∆J értékeket több funkciós csoport is befolyásolja, így pl. az 5’-ODMT védőcsoport
27
valamint a foszfátrészen lévő ugyancsak nagy térkitöltésű
izopropil vagy terc-butil csoportok
29
jelenléte növeli a P-diasztereomerek ∆J értékei
közötti különbséget. 3, Az 5’-ODMT védett nukleozidok esetében a hőmérséklet
18
növelésével nő az εt (transz) konformer aránya az egyensúlyi elegyben
28 29
. 4, Ugyanez
tapasztalható akkor is, ha a spektrumokat CDCl3 helyett C6H6-ban vesszük fel. Ez utóbbi jelenség az aromás gyűrű és a nukleobázisok között valószínűleg létrejövő stacking kölcsönhatással magyarázható, amely ezek szerint ugyancsak hatással van a konformációs egyensúlyra 25 28 29 30.
19
2. Célkitűzések Az MTA Kémiai Kutatóközpont Nukleotidkémiai Laboratóriumában folyó szintetikus kémiai kutatásokba 2003-ban kapcsolódtam be. Doktori kutatásaim során új, 5szubsztituált uracil bázisokat tartalmazó, PNS monomerek szintézisét tűztem ki célul (9. ábra). Az alkinil és aril analógok szintézisét palládium katalizálta keresztkapcsolási reakciókkal kívántam megvalósítani.
9. Tervezett PNS monomerek
A bevezetésben idézett irodalmi adatok alapján nagyrészt olyan 5-aril ill. 5-alkinil szubsztituensek beépítését terveztem, amelyek eddig még DNS módosításként sem fordultak elő. Ugyanakkor néhány már ismert, DNS-ben kipróbált, és eltérő Tm növelő hatással rendelkező analóg (5-(1-propinil)-, 5-(2-tienil)-uracil) beépítése is indokolt a korábbi DNS próbákkal történő összehasonlítás miatt annak kiderítése céljából, hogy ezek a PNS-ben is hasonló mértékű vagy esetleg eltérő ∆Tm/módosítás értékeket adnak-e. A propinil és feniletinil szubsztitúciók hatásának összehasonlítása ugyancsak informatív lehet a hármas kötésen keresztül kapcsolódó aromás gyűrű konjugációját és esetleges extra stabilizáló hatását illetően. Az említett módosított PNS monomereket a PNS szintézisre optimalizált Boc protokoll alkalmazásával a H-t c c c t t t c t t t-D-Lys-NH2 11-mer modell szekvenciába terveztem
20
beépíteni az aláhúzott 3 középső t egység helyére. A komplementer DNS szál szintézisét követően vizsgálni kívántam a PNS:DNS duplexek stabilitását. A PNS oligomer szintéziséhez szükséges timin és citozin monomerek előállításának irodalomból ismert körülményeit is optimalizálni kívántam.
Munkám során P-királis mononukleotidok szintézisébe is bekapcsolódtam. A bevezetésben említett korábbi munkák folytatásaként és kiterjesztéseként az NMR vizsgálatok célja az volt, hogy megvizsgáljuk különböző, a P-atomhoz kettős kötéssel kapcsolódó heteroatomok (O, S, és Se) (10. ábra) hatását a konformációs egyensúlyra. Mivel az említett heteroatomok mérete és elektronegativitása jelentős mértékben különbözik, ez várhatólag befolyásolja az egyes izomerek ∆J értékei közötti különbséget is. Az említett NMR paraméterek tanulmányozásán kívül a P-izomerek kromatográfiás (normál és reverz fázisú HPLC) tulajdonságait is vizsgáltam az abszolút P-konfiguráció és a tR értékek közötti esetleges korreláció megállapítása céljából.
10. Tervezett oxidált timidin foszforamidit (T-CED) származékok
21
3. Eredmények 3.1. Boc-gerinc szintézise A peptidnukleinsav monomerek két szerkezeti egységből épülnek fel: az N-(2aminoetil)-glicin gerincből és a hozzá karboxi-metilén linkeren keresztül kapcsolódó bázisból. A védett PNS monomer retroszintetikus analízissel így két kisebb részre bontható (11. ábra). Az etil N-(2-(terc-butoxikarbonilamino)etil glicinát (Boc-gerinc) és az alkilezett bázis a peptidkémiában közismert módon kapcsolható.
11. Timin PNS monomer retroszintetikus analízise
A Boc-gerinc első szintézisét Dueholm és munkatársai írták le 1993-ban 32. A 3-amino1,2-propándiol aminocsoportját Boc-védőcsoporttal látták el, és oxidáció során Bocaminoacetaldehidet állítottak elő, melyet glicin-észterrel reduktív aminálásnak vetettek alá és végül katalitikus hidrogénezéssel jutottak a védett gerinchez 46 %-os bruttó termeléssel. Hudson kutatócsoportja Boc-etilén-diaminból (Boc-EDA) etil-glioxilát hidráttal állította elő a megfelelő imint, az utolsó lépés ebben az esetben is katalitikus hidrogénezés volt 33. Az irodalomban ismert az aminoacetonitrilből kiinduló háromlépéses szintézis út is
34
.
Ezek az eljárások alacsony termeléssel eredményezik a Boc-gerincet és olyan módszereket is alkalmaznak, melyek nem minden laboratóriumban hozzáférhetőek (pl. katalitikus hidrogénezés).
12. Boc-gerinc szintézise
22
A Boc-gerinc szintézisére új módszert dolgoztam ki (12. ábra) amely során első lépésben az etilén-diamint (EDA) (1) di-t-butil-dikarbonáttal reagáltattam diklórmetánban, az EDA felesleget vizes extrakcióval eltávolítottam, majd a Boc-etilén-diamint (Boc-EDA) (2) izolálás nélkül bróm-ecetsav-etilészterrel alkileztem trietilamin jelenlétében. Ilyen körülmények között a védett Boc-gerincet (3) elfogadható termeléssel (60 %) állítottam elő,
azonban
a
melléktermékek
(di-Boc-EDA
és
dialkil
származék)
jelenléte
megnehezítette a tisztítást és rontotta a reakció hozamát. A tiszta Boc-gerinc csak oszlopkromatográfia alkalmazásával nyerhető ki. Ezt az eljárást módosítottam az oldószer megváltoztatásával és a Boc-etilén-diamin izolálásával
35 20 36
. Az első lépést dioxánban
végeztem, és nagy felesleg etilén-diamint használtam. Ezáltal főleg Boc-EDA keletkezik. A dioxán bepárlása után a maradékot vízben oldottam és ekkor a minimálisan keletkező diBoc-etilén-diamin csapadékként, szűréssel eltávolítható. Diklórmetánnal extrahálva a termék a szerves fázisba vihető, míg az etilén-diamin feleslege a vizes fázisban marad. A nyersterméket végül vákuumdesztilláltam. A tiszta Boc-EDA-t vízmentes DMF-ben alkileztem bróm-ecetsav-etilészterrel trietilamin jelenlétében. A dialkil származék képződését az által szorítottam vissza, hogy a bróm-ecetsav-etilésztert minimális feleslegben és lassan adagoltam a reakcióelegyhez. Az oldószer eltávolítása után a maradékot DCM-ben oldottam, majd az elegy vizes mosását és szárítását követően bepárlással jutottam a nyerstermékhez, melyet oszlopkromatográfiával tisztítottam. A megfelelő frakciók bepárlása után sűrű áttetsző olajként sikerült a Boc-gerincet előállítanom. A Boc-EDA izolálása és az ezáltal kevesebb szennyezést tartalmazó reakcióelegy kromatográfiás tisztítása sokkal egyszerűbb volt és a két lépés bruttó termelése is növekedett (75 %). Ezen az úton a Boc-gerinc egyszerűbben és hatékonyabban állítható elő, mint az irodalomban leírt eljárásokban.
3.2. 5-jód-uracil PNS monomer szintézise Az 5-szubsztituált uracil származékok szintézise során azt a koncepciót terveztem, hogy az analogonokat keresztkapcsolási reakciók (Stille, Suzuki, Sonogashira, stb…) alkalmazásával állítom elő. Ehhez szükséges volt az 5-jód-uracil PNS monomer szintézise, melyet három lépésben valósítottam meg az irodalomból ismert reakcióút módosításával 37. Az eredeti recept két lépésben írja le a monomer szintézisét. Az első az 5-jód-uracil káliumhidroxiddal történő deprotonálását követő alkilezés klórecetsavval, majd ezt követi a karbonsav Boc-gerinchez kapcsolása. Utóbbi reakció a peptidkémiában általánosan 23
elfogadott módszerrel történt, azonban az alkalmazott kapcsolószer (DCC) erősen allergén hatású, ezért ennek kiváltása ajánlott. Említést érdemel, hogy mindkét lépés csak közepes hozammal eredményezi a terméket, így a bruttó termelés elég alacsonynak mondható. Ezen okok miatt szükséges volt a reakcióút módosítása, optimalizálása.
13. 5-jód-uracil PNS monomer szintézise
A szintézis során először az 5-jód uracilt (4) brómecetsav-terc-butilészterrel alkileztem kálium-karbonát jelenlétében. A reakció során főleg N1-alkil uracil származék keletkezik, de kismértékben az N3-alkil és az N1,N3-dialkil vegyületek is képződnek. Utóbbi képződése kis feleslegben alkalmazott és lassan adagolt alkilező reagens felhasználásával visszaszorítható. A termék átkristályosítással könnyen és jó termeléssel tisztítható, az anyalúgból oszlopkromatográfia alkalmazásával minimális mennyiség izolálható. A második lépésben az észtert (5) diklórmetánban TFA-val hasítottam. A reakció 4 óra alatt végbemegy. Az oldószert bepároltam, a maradékot metanolban szuszpendáltam és szűrtem. A karbonsav (6) kvantitatív hozammal nyerhető ki. Végeztem olyan kísérletet, amely során az első lépésben brómecetsav-etilészterrel alkileztem az 5-jód-uracilt, majd az észtert lúggal hidrolizáltam. Ez esetben azonban bizonyos mértékű dejódozódás figyelhető meg, ugyanis a szén-jód kötés ilyen körülmények között nem stabil. Ez alapján az észter savas közegben történő hasítása a megfelelő módszer és így előnyösebb a brómecetsav-t-butilészter alkalmazása. Harmadik lépésben a karbonsavat a védett Boc-gerinchez kötöttem egy, a peptidkémiában megszokott kapcsolási módszer alkalmazásával. A karbonsavat egy benzotriazol származékkal (TBTU) aktiváltam, majd a Boc-gerinc vízmentes DMF-es oldatához adtam, végül trietilamint adagoltam az elegyhez. A reakció szobahőmérsékleten három óra alatt végbemegy. A termék oszlopkromatográfiával tisztítható. Ezáltal az irodalomból ismertnél jobb bruttó hozammal (78 %) állítottam elő az 5-jód-uracil PNS monomert (7) (13. ábra) amely a keresztkapcsolási reakciók kiindulási vegyülete.
24
3.3. Stille kapcsolások A keresztkapcsolási eljárások egyik legelterjedtebb képviselője a Stille nevével fémjelzett reakció
38
. A folyamatban a transzmetallálás ónorganikus reagensről történik a
palládiumra. A különböző szerves csoportok átvitele az ónról palládiumra jelentősen eltérő sebességgel történik, a leggyakrabban a megfelelő tributil-ón származékokat használják. Az ón bórhoz viszonyított kisebb elekronegativítása, és ezáltal erősebb fémes karaktere miatt az aril-trialkil-sztanánnok jobb aril-csoport donorok, mint a megfelelő arilboronsavak. Az irodalomban több olyan szintézisút ismert, mely során trialkil-vegyületek alkalmazásával állítottak elő nukleotid származékokat. Yamamoto és munkatársai ariltributil-sztannán reagensekkel Pd(0) katalizátor jelenlétében
10
B jelzett nukleozidokat
szintetizáltak 39. Az 5-(2-tienil)-uridin származékok antivirális hatással is rendelkeznek 40. Farina és kutatócsoportja számos 5-szubsztituált uracil és uridin analóg szintézisét írta le 41
. Crisp és munkatársai számos uridin és 2’-dezoxiuridin származékot állítottak elő Stille
kapcsolás alkalmazásával 42 43 44 45. Az 5-jód-uracil PNS monomer és a kereskedelmi forgalomban kapható ónvegyületek (2-tienil-tributilsztannán,
2-furanil-tributilsztannán
és
fenil-tributilsztannán)
felhasználásával végeztem el a Stille-reakciókat. A reakció során vízmentes dioxánt és argon védőgázt alkalmaztam. 1,50 ekvivalens ónvegyület és 2-5 % Pd(PPh3)4 katalizátor hozzáadásával 90 oC-on a reakció 5-8 óra alatt végbemegy. A termékek (8 a-c) oszlopkromatográfiával tisztán, jó termeléssel (60-73 %) izolálhatók. Az 5-fenil-uracil PNS monomer (8c) és az 5-jód-uracil vegyület nagyon hasonló kromatográfiás tulajdonságokkal rendelkezik, azaz a termék és a kiindulási anyag nem választható el. Ebben az esetben szükséges volt a maradék kiindulási anyag uracil származékká történő redukciója. A nyersterméket vízmentes etilalkoholban oldottam és cink por jelenlétében 3 órán keresztül forraltam az elegyet. Ezt követően az uracil PNS monomer és az 5-fenil származék már könnyen elválasztható oszlopkromatográfiával. Az észtereket dioxán és 1 N NaOH oldat elegyében lúgosan hidrolizáltam 4 órán keresztül. A dioxán eltávolítása után a nyersterméket etil-acetátban oldottam, és 1 M NaHSO4 oldattal extraháltam, majd az oldószer bepárlása után etilalkoholban szuszpendáltam, végül kiszűrtem és megszárítottam. Ezáltal jó termeléssel állítottam elő az 5-(2-tienil), az 5-(2-furanil) és az 5-fenil analogonokat (9 a-c) (14. ábra), melyek a szilárd fázisú oligomer szintézisben felhasználhatóak.
25
14. Stille-kapcsolások az 5-jód uracil PNS monomeren,
Lehetséges reakció út az ún. „inverz”-Stille kapcsolás
46
, mely során az uracil PNS
monomer trialkil sztannán származékát terveztem előállítani, majd ezt a vegyületet kapcsolási reakcióba vinni különböző aromás halogén vegyületekkel. (15. ábra).
15. Az „Inverz”-Stille kapcsolás alkalmazása
Az első lépés a trialkil-sztannil csoport kialakítása. Az 5-jód-uracil PNS monomert hexabutil- és hexametil-disztannánnal reagáltattam Pd(PPh3)4 katalizátor jelenlétében dioxánban 80 oC-on, argon védőgáz alkalmazása mellett. Terméket (10) csupán az utóbbi esetben izoláltam 16 órás reakcióidő után oszlopkromatográfiával, mindössze 35 %-os hozammal. Ezt a vegyületet dioxánban palládium katalizátor hozzáadásával 2-brómtiofénnel és 2-bróm-1,3-tiazollal reagáltattam 80 oC-on. A várt termékeket (11 a-b) mindkét esetben sikerült izolálni, de nagyon alacsony (28 és 19 %) hozammal. A két lépés bruttó termelése messze elmarad a Stille kapcsolások hozamától. Egy másik lehetőség az 5-szubsztituált uracil PNS monomerek előállítására az ún. dupla Stille kapcsolás
47
. A „one pot” reakció során az 5-jód-uracil PNS monomer és
aromás halogenidek kapcsolása valósítható meg hexabutil-disztannán alkalmazásával. Először a brómvegyületet (2-bróm-tiofén és 2-bróm-1,3-tiazol) reagáltattam az ónreagennsel Pd(0) katalizátor jelenlétében vízmentes dioxánban 80 oC-on. Miután
26
képződött a tributil-sztannil származék (12) hozzáadtam az elegyhez az 5-jód-uracil PNS monomert (7) és folytattam a reagáltatást 4 órán keresztül. Az 5-(2-tienil)-uracil PNS monomer (8 a) 56 %-os hozammal izolálható a kromatográfiás tisztítás után. (16. ábra)
Sn
Sn
Pd(PPh3)4 Sn dioxán
S
Br S 12
O
O I
HN 12
+
O
Pd(PPh3)4 N
O O
Boc HN
N
S
HN N
dioxán
O O
O Boc HN
7
N
O O
8a 16. A „dupla” Stille kapcsolás alkalmazása
A másik reakció során azonban a várt termék helyett az 1,3-tiazol dimerje keletkezett (17. ábra). Az első lépésben keletkező aril-tributil-sztannil vegyület (13) a még jelenlevő el nem reagált brómvegyülettel is reakcióba lép amennyiben az ónvegyület képződése nem elég gyors, és ezáltal homodimer (14) keletkezik.
17. Homodimer képződés „dupla” Stille kapcsolás során
27
Megállapítható, hogy ez a kapcsolási módszer nem vezet feltétlenül a várt termékhez és sikeres reakció esetén is elmarad a termelés a „normál” Stille kapcsolással elérhető hozamtól. Mivel egyrészt kevés aril-trialkilsztannán reagens kapható a kereskedelemben és ezen vegyületek mérgezőek is, másrészt a hexaalkil-disztannán alkalmazhatósága erősen korlátolt, így a további 5-aril-uracil PNS monomerek előállítását Suzuki kapcsolással terveztem megvalósítani.
3.4. A 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer szintézise Az uracil származékok laktám funkciója bizonyos esetekben mellékreakciókat eredményezhet. A Sonogashira kapcsolások során furano[2,3-d]-pirimidin gyűrűs vegyületek is képződnek az alkinil származékok mellett
48
. Ezzel a problémával
szembesültem a terminális alkinok és az 5-jód-uracil PNS monomer palládium katalizált kapcsolása során. A Suzuki kapcsolásokkal folytatott kísérleteim is eredménytelennek bizonyultak a laktám csoport deprotonálódása miatt. Szükségessé vált egy N3-védőcsoport bevezetése, mely az 5-jód-uracil PNS monomer keresztkapcsolási reakciója után szelektíven távolítható el. Az irodalomban gyakran átmeneti védelemmel látják el a laktámcsoportot. Uridin származékok esetén gyakori a p-metoxi-benzil (PMB) védőcsoportként történő alkalmazása
49 50 51 52 53 54 55
. A védelem kialakítására több lehetőség áll rendelkezésre. A
p-metoxi-benzil-bromid, -klorid és az -alkohol is alkalmas reagens valamilyen bázis jelenléte mellett. Az eltávolítása oxidatív módon, cérium(IV)-ammónium nitráttal vagy aluminíum-kloriddal valósítható meg. Mivel a Suzuki kapcsolás körülményei között stabil, így első látásra ortogonális védőcsoportnak volt tekinthető. Ezen ismeretek alapján a PMB védőcsoport kialakítása az 5-jód-uracil PNS monomeren megvalósíthatónak tűnt. Az 5-jód-uracil PNS monomer benzilezését NaH jelenlétében p-metoxibenzilbromiddal kíséreltem meg, azonban a reakció több terméket eredményezett és a termék nehezen, alacsony hozammal volt izolálható. Ezután az N3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer szintézisére új eljárást dolgoztam ki (18. ábra).
28
18. 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer szintézise
Korábban az 5-jód-uracil PNS monomer szintézise során első lépésben az 5-jód uracilt alkileztem brómecetsav-t-butilészterrel. Ezen a vegyület laktámcsoportját sikeresen benzileztem. Az uracil származékot (5) DMF-ben oldottam és nátrium-hidriddel deprotonáltam a laktám-csoportot, majd p-metoxi-benzil-bromidot adtam az elegyhez. A 3PMB-5-jód-uracil származék (15) a kromatográfiás tisztítás után megfelelő hozammal fehér kristályos formában izolálható. A következő 2 lépés megegyezik az 5-jód-uracil PNS monomer esetében alkalmazottakkal. Az észtert TFA-val hasítottam diklórmetánban, majd az oldószer bepárlása után a maradékot metil-alkoholban szuszpendáltam és szűrtem. Így kvantitatív hozammal izolálható a karbonsav (16), melyet ezt követően TBTU aktiválószer és trietil-amin bázis jelenlétében a Boc-gerinchez (3) kapcsoltam. A reakció szobahőmérsékleten 3 óra leforgása alatt teljes mértékben lezajlik, és a termék oszlopkromatográfia alkalmazásával tisztítható. Ezen az úton N3-PMB-5-jód-uracil PNS monomert (17) állítottam elő, melyet sikeresen alkalmaztam a keresztkapcsolási reakciókban. A négy lépés bruttó termelése 58 %.
3.5. Sonogashira kapcsolások A rézorganikus reagensek szintézise és alkalmazása a szerves szintézisben hosszú múltra tekint vissza. Bár reakcióik elektrofilekkel általában spontán is lejátszódnak, több esetben palládium jelenléte gyorsítja a folyamatot. Sonogashira nevéhez fűződik az a felismerés, hogy in situ előállított alkinilréz reagensek palládium jelenlétében kapcsolási reakcióba vihetőek aril- és alkenil-halogenidekkel
56
. A folyamat rézre nézve is
katalitikussá tehető ekvivalens mennyiségű bázis (általában trietil-amin) alkalmazásával. A folyamat során a réz(I) só és az alkin a bázis hatására a rézorganikus vegyületet adja, amely transzmetallál az aril- vagy alkenil-palládium-halogenidre. A tarnszmetallálás során újra felszabadul a réz(I)só, ezért lehet katalitikus mennyiségben alkalmazni.
29
Az irodalomban számos uridin származék szintézise során alkalmazták már a Sonogashira kapcsolást. Robins és munkatársai 5-szubsztituált uracil és 2’-dezoxiuridin analógokat állítottak elő sikeresen terminális alkinok palládium katalizált kapcsolásával. 48. Sharma és Ma kutatócsoportja 5-etinil-pirimidin nukleozidok szintézisét és biológiai aktivitásuk vizsgálatát végezte el 57 58. Hasimoto az ikerionos DNS szintézise során szintén alkalmazta ezt a módszert szintézise is
37
59
. Ismert az irodalomban 5-alkinil-uracil PNS monomerek
. Hudson és munkatársai az 5-jód-uracil PNS monomert vitték kapcsolási
reakciókba alkinokkal és közepes termeléssel izoláltak új analógokat, melyeket sikeresen építettek be oligomerekbe. Az 5-jód-uracil PNS monomerrel sikeres Stille kapcsolásokat hajtottam végre és a Sonogashira kapcsolás számára is megfelelő kulcsvegyületnek tűnt. A kapcsolási reakciók során a jódvegyületet 5 % (PPh3)2PdCl2, 5 % CuI és 2,0 ekvivalens trietil-amin jelenlétében terminális alkinekkel reagáltattam szobahőmérsékleten, argon védőgáz alkalmazása mellett. Oldószerként vízmentes DMF-et használtam. A kapcsolás pár óra alatt végbement. A DMF eltávolítása után a maradékot DCM-ben oldottam, a réz nyomoktól extrakcióval szabadultam meg 5 %-os EDTA oldat felhasználásával. A termék oszlopkromatográfiával izolálható közepes termeléssel. Ennek oka, hogy jelentős mértékben (30-40 %) gyűrűzárt melléktermék is képződik (19. ábra). A gyűrűzárást szintén a réz(I)só katalizálja.
19. A gyűrűzárt melléktermék szerkezete
Ezen tapasztalatok után szükségessé vált az uracil laktám-csoportjának védelme. A 3PMB-5-jód uracil PNS monomert (17) alkalmazva, a fenti körülmények mellett a védett 5(1-propinil)-, 5-feniletinil- és 5-(1-hexin-1-il)-uracil PNS monomereket (18 a-c) állítottam elő közel kvantitatív termeléssel (20. ábra). A termékek kromatográfiás tisztítását nagymértékben megkönnyítette a kezelhetőbb szennyezésprofil.
30
R
O I
N O
N
N
O
O
N
R: Me, Ph, Bu
N
O
DMF
O Boc HN
R
O
(PPh3)2PdCl2 CuI, TEA
O
COOEt
N
Boc HN
17
COOEt
18 a-c
20. Sonogashira kapcsolások a 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomeren
3.6. Suzuki kapcsolások Az aril-boronsavak és aril- vagy alkenil-halogenidek palládium(0) által katalizált keresztkapcsolási reakciója, az ún. Suzuki-reakció rendkívüli népszerűségre tett szert az elmúlt évtizedekben 60. A folyamat során a halogenidből kialakuló σ-kötésű átmenetifémorganikus vegyület a bórvegyülettel transzmetallálási reakcióban a diorganopalládiumszármazékot adja, amelynek reduktív eliminációjával jutunk a kívánt termékhez. A transzmetallálási lépésben, más keresztkapcsolási reakcióktól eltérően egy ekvivalens bázis jelenlétére van szükség. A szerves bórszármazékok nukleofil jellege nem elég erős, így az organopalládium-halogenid-komplexet kell elektrofilebbé tenni a halogenidet alkoxi- vagy karbonátionra cserélve. A Suzuki kapcsolás nukleotidkémiai alkalmazására több példa található az irodalomban. Casalnuovo és munkatársai az 5-jód-2’-dezoxiuridinnel és az 5-jód-2’dezoxicitidinnel egyaránt sikeres kapcsolást hajtottak végre reakcióit pirénszármazékokkal Amann
62
61
. Az 5-jód-2’-dezoxiuridin
, fenilboronsavakkal pedig Western
63
írta le,
utóbbi vízoldékony palládium katalizátort alkalmazott a szintézis során. Az irodalmi ismeretek alapján az 5-jód-uracil PNS monomert arilboronsavakkal reagáltattam. Többféle palládium katalizátort, (Pd(PPh3)4, (PPh2)Cl2, Pd(OAc)2 + dppf) különböző bázisokat (K2CO3, Cs2CO3, KOtBu, NaOEt) és oldószereket (DMF, 1,2dimetoxietán, EtOH) kipróbáltam, de szinte egyáltalán nem tapasztaltam termékképződést (1. táblázat). Ennek oka valószínűleg az, hogy bázikus közegben az uracil laktám csoportja deprotonálódik és a közeli negatív töltés hatására a palládium elekrofil jellege csökken, amely a transzmetallálást nagymértékben gátolja (21. ábra). Minden esetben vízmentes oldószert és argon védőgázt alkalmaztam a reakció során az etilészter hidrolízisének kiküszöbölése céljából.
31
katalizátor
bázis
boronsav
oldószer
Pd(PPh3)4
Cs2CO3 / K2CO3
2-tienil-
DMF
eredmény ~ 50 % konverzió
Pd(PPh3)4
Cs2CO3
2-tienil-
DMF
~ 50 % konverzió
(PPh3)2PdCl2
Cs2CO3 / K2CO3
2-tienil-
DMF
nincs termék
Pd(OAc)2 + dppf
K2CO3
2-tienil-
DMF
nincs termék
Pd(PPh3)4
Cs2CO3 / KOtBu
2-tienil-
DME
kis konverzió
Pd(PPh3)4
Cs2CO3 / K2CO3 /
2-tienil-
EtOH
kis konverzió
NaOEt
hidrolizis
Pd(PPh3)4
Cs2CO3
2-naftil-
Pd(PPh3)4
K2CO3
2-tienil-
DME DMF
kis konverzió > 50 % konverzió
1. táblázat Suzuki kapcsolások körülményei
21. Laktim-laktám tautoméria
Az N3 védőcsoport alkalmazása, azaz a laktám funkció védelme ez esetben feltétlenül szükséges a sikeres kapcsolási reakció eléréséhez. Ezen elképzelés alapján a 3-PMB-5-jóduracil PNS monomert alkalmaztam a további kísérletekben. Az 5-jód-uracil PNS monomeren végzett kapcsolások során szerzett tapasztalatokat figyelembe véve oldószerként vízmentes DMF-et, bázisként kálium-karbonátot használtam. A Pd(PPh3)4 katalizátor mennyiségét sikerült 2 %-ra csökkenteni. A kapcsolásokat 100 oC-on végeztem 5 órán keresztül. Hosszabb reakcióidő alkalmazása esetén a mellékreakciók miatt az izolálható termék hozama csökken valamint a preparálása is nehézkesebb. Mivel a kiindulási jódvegyület és a képződő aril származékok kromatográfiás tulajdonságai nagyon hasonlóak mind a reakció követése, mind a termék izolálása kissé nehézkes és az oszlopkromatográfia során a nem megfelelő elválasztás a hozam csökkenését eredményezi. Ez utóbbi probléma a Stille kapcsolással előállított 5-fenil-uracil PNS monomer tisztítása során alkalmazott szén-jód kötés redukciójával orvosolható.
32
Különböző boronsavak felhasználásával sikeres Suzuki-reakciókat hajtottam végre, előállítottam az N3-PMB-védett 5-(2-tienil)-, 5-(4-bifenil)-, 5-(benzo[b]tiofén-2-il)- és az 5-(4-dimetilaminofenil)-uracil PNS monomereket (19 a-d) (22. ábra). A reakciók termelése 37-85 % közötti, amelyek kissé elmaradnak a Stille reakciók hozamaitól, de mivel a boronsavak könnyen hozzáférhetőek ezzel a módszerrel számos új analóg előállítható. A boronsavak helyett boronsav-pinakolésztereket alkalmazva a konverzió kb. 10 %-kal növelhető.
22. Suzuki kapcsolások a 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomeren
3.6.1. Suzuki kapcsolások in situ laktám védelem melett A PMB védőcsoport szelektív eltávolítása nem problémamentes, mivel a CAN vizes oldata erősen savas kémhatású, ezáltal a Boc-csoport is lehasad a PMB-vel együtt. Ebből adódóan az uracil laktám csoportját más csoporttal próbáltam védeni a kapcsolási reakciók során. A szililezett természetes nukleobázisoktól eltérően az 5 és 7 kiindulási anyagok 4OSiMe3 (TMS) származékai a várható igen magas forrpont miatt nem tisztíthatók desztillációval másrészt a TMS csoport extra érzékeny minden protikus oldószerre így a kromatográfiás tisztítás sem jöhet szóba. Ezért a laktám funkciót in situ kellett szilileznem feltételezve, hogy a szililezőszer feleslege nem gátolja a kapcsolási reakciót. Erre a célra a Vorbrüggen féle nukleozid szintézisekben is általánosan alkalmazott N,O-bisztrimetilszilil-acetamid (BSA), mint igen hatékony szilil donor reagens, tűnt a legjobb választásnak. Előkisérleteim során azt találtam, hogy a diklóretánban (DCE) rosszul oldódó 5 2 ekv. BSA-val 1-1,5 órán át keveretetve teljesen oldatba megy, amely jelzi, hogy a reakció lejátszódott. Mivel a tervezett Suzuki kapcsolásokhoz a dioxán több ok miatt is alkalmasabb oldószer, mint a DCE ezért a szililezéseket eleve ebben végeztem. Boronsav reakciópartnerekként a 2-tienil- és a tianaftén-2-il-boronsavakat választottam, mivel a 33
termékek mindkét esetben fluoreszkálnak, így a reakciók, az 5 és a termékek közötti viszonylag kis Rf különbség ellenére is, jól követhetők UV-ben 360 nm-en detektálva. Katalizátorként a Pd(PPh3)4 mellett a (Ph3P)2PdCl2-t is kipróbáltam, de a fluoreszcens termékek aránya az elegyekben minden esetben kisebb volt, mint a Pd(0) katalizált reakciókban azonos körülmények között.
1
23. In situ laktám védett N -alkil-5-jód-uracil Suzuki kapcsolása
24. In situ laktám védett 5-jód-uracil PNS monomer Suzuki kapcsolása
Kisérleteim azt mutatták, hogy az 5 kapcsolásai mindkét boronsavval jobb termeléssel (42,2 ill. 51,1%) játszódnak le mint a PNS gerincet is tartalmazó 7 reakciói (22,8 ill. 40,4%) annak ellenére, hogy az utóbbi esetekben nagyobb boronsav felesleget és kétszer annyi katalizátort használtunk. Ennek oka a PNS monomerek kisebb kémiai stabilitása, a Boc és/vagy az Et észter védőcsoportok részleges lehasadása az adott körülmények között. Erre utal az is, hogy a 7 reakcióinál hosszabb ideig (5-6 óra) tartó melegítés után poláros melléktermékek jelennek meg az elegyekben a főtermékek rovására ezért az optimális reakcióidő itt 2-2,5 óra. Ezzel szemben az 5 kapcsolásainál még 15 óra után sem láttam hasonló bomlástermékeket. 34
Mindebből az a következtetés vonható le, hogy az 5-aril-uracil bázisokat tartalmazó PNS monomerek szintézisét célszerűbb a kémiailag ellenállóbb 5 Suzuki kapcsolásával kezdeni mivel így magasabb bruttó hozam érhető el figyelembe véve, hogy t-Bu észter acidolízise majd a gerinchez kapcsolás csaknem kvantitatív reakciók. Ezenfelül a kapott 5aril-uracil-1-il-ecetsavak mind a Boc- mind az Fmoc-védett PNS monomerek szintéziséhez felhasználhatók. A kapcsolások hozamának növelése céljából a jövőben további Pd katalizátorok kipróbálását is tervezzük.
3.7. PNS T monomer előállítása Az új 5-szubsztituált uracil PNS monomereket egy H–t c c c t t t c t t t-D-Lys-NH2 11mer szekvenciában kívántam beépíteni a középső 3 egység helyére. A szilárd fázisú oligomer szintézishez szükséges volt a megfelelően védett timin és citozin monomerek előállítására. Az irodalomban több módszer ismert a timin PNS monomer előállítására. Dueholm és munkatársai egy négylépéses szintézisutat írtak le 64. Elsőként a timint brómecetsav-metilészterrel alkilezték kálium-karbonát jelenlétében, majd az észtert lúgos közegben hidrolizálták, az így előállított karbonsavat DCC-vel kapcsolták a Boc-gerinchez, végül az etilésztert hidrolizálták. A négy lépés bruttó termelése alacsonynak mondható és az alkalmazott DCC allergén jellegű, melyek miatt új eljárás fejlesztése volt szükséges. Ugyanez a kutatócsoport fejlesztette ki a Boc-védett timin PNS monomer pentafluorfenilésztert, melyet oligomer szintézis során sikeresen alkalmaztak 5. A timin nukleobázis kálium-hidroxid vizes oldatában deprotonálható és klórecetsavval is alkilezhető
65
, azaz a
Duelholm-féle reakcióút lerövidíthető. Ezt az eljárást sikeresen reprodukáltam. A timint (24) brómecetsavval alkileztem, de a reakció hozama csak közepesnek tekinthető (46%). Az uracil alkilezése során szerzett tapasztalatok alapján megállapítható, hogy a brómecetsav-tercbutilészterrel történő alkilezés és ezt követően az észter hasítása TFA-val hatékonyabb eljárás lehet, mint a brómecetsavval vagy brómecetsav-etilészterrel történő alkilezés. Az így előállított karbonsavat (25) az uracil származékokhoz hasonló módon, kapcsoltam a Boc-gerinchez (3) DMF-ben. Az allergén DCC helyett TBTU aktiválószert és trietil-amin bázist alkalmaztam. A terméket oszlopkromatográfiával izoláltam jó termeléssel. Végül az etilészter (26) lúgos hidrolizisével az N-terminálison Boc-csoporttal védett, a C-terminálison szabad karbonsav funkcióval rendelkező timin PNS monomerhez 35
jutottam (27), amely felhasználható a szilárdfázisú PNS oligomer szintézisében (25. ábra). A korszerű kapcsolási módszernek köszönhetően a háromlépéses szintézisút bruttó hozama is elfogadhatónak tekinthető.
25. A PNS timin monomer szintézise
3.8. PNS C monomer szintézise A citozin PNS monomer szintézisére a timin monomer esetében alkalmazott út nehezen járható, melynek oka a citozin rossz oldhatósága. A probléma kiküszöbölésére új eljárást dolgoztam ki (26. ábra). Irodalomból ismert, hogy az uracil triazolil-vegyületen keresztül citozinná alakítható 66 67 68 69 70 71.
26. Védett citozin PNS monomer szintézise
36
Az uracilt kálium-karbonát jelenlétében brómecetsav-terc.butil-észterrel alkileztem, vízmentes DMF-ben. Minimális reagens felesleg és lassú adagolás alkalmazásával csak elhanyagolható mennyiségű melléktermék (N3- és N1, N3-dialkil származék) keletkezik. A termék kristályosítással könnyen tisztítható és jó termeléssel állítható elő (28). Következő lépésben az alkil-uracilt vízmentes piridinben oldottam és 1,2,4-triazollal reagáltattam foszfor-oxiklorid jelenlétében. Az N1-alkil-uracil triazolil-származéka izolálható (29), extrakcióval és oszlopkromatográfiával tisztítható. Az ammonolízis során a triazolilvegyületet dioxánban oldottam, majd 25 %-os ammónia oldatot adtam az elegyhez. A reakció során 12 óra alatt kvantitatív termeléssel alkilezett citozinhoz jutottam, melyet dietiléterrel szuszpendálva tisztítottam (30). A három lépés bruttó hozama 51 %, amely azonban elmarad a citozin közvetlen alkilezésével elérhető termeléstől (64 %) 72 Az amino-csoportot benziloxi-karbonil (Z) védelemmel láttam el. A védőcsoport bevitelére több módszert is kipróbáltam. Z-OSu alkalmazásával sem piridinben, sem vízacetonitril elegyben TEA jelenlétében nem tapasztaltam termékképződést. Ennek feltehetően az az oka, hogy a Z-OSu nem elég aktív. Az irodalomból ismert úton, Z-Cl reagenssel piridinben sikeresen megoldható a citozin amino-csoportjának védelme, de több melléktermék is keletkezik
64 5 73 74
. 1,00 ekvivalens DMAP hozzáadásával a reakció
DCM-ben jó termeléssel megvalósítható
72 21
. A reakció során először a DMAP-t és a Z-
Cl-ot reagáltattam -15 oC-on, majd hozzáadtam a citozin származékot ugyanezen a hőmérsékleten. Hagytam felmelegedni és 12 órán át reagáltattam. Extrakcióval és kromatográfiával tisztítottam és közel kvantitatív termeléssel izoláltam a Z-védett alkilcitozint (31). Az észtert dioxán és 1 M NaOH oldat elegyében hidrolizáltam, majd az így kapott karbonsav (32) Boc-gerinchez kötését, illetve az etil-észter hasítását az 5-jód-uracil származékok és timin monomer esetében már alkalmazott körülmények mellett hajtottam végre. Végül a Boc/Z védett PNS C monomert kaptam (34), mely a szilárd fázisú szintézis során felhasználható.
3.9. Oligomer szintézis 3.9.1. PNS oligomer szintézise A módosított PNS monomereket a PNS szintézisre optimalizált Boc/Z peptidszintézis protokoll
75
alkalmazásával a H–t c c c t t t c t t t-D-Lys-NH2 11-mer
modell szekvenciába építettem be az aláhúzott 3 középső egység helyére. A szekvenciát a
37
következő szempontok alapján terveztük: 1. Csak pirimidinbázisokat tartalmaz így nemcsak a PNS:DNS illetve PNS:RNS duplexek, de a megfelelő 2 PNS láncot tartalmazó, tripla hélixek stabilitása is tanulmányozható. 2. A szekvencia nem szimmetrikus, így a megfelelő antiparalell DNS ill. RNS targetekkel csakis egyféle, a jóval stabilabb antiparalell duplexek képződhetnek. 3. Mind a C-terminális végen mind pedig középen 3 egymást követő, így blokkot képező, t vagy t-analóg egységet tartalmaz, amely lehetővé teszi a módosítások hatásának a hely függvényében történő tanulmányozását is. 4. A szekvencia hossza (11-mer) alapján a Tm értékek várhatólag a mérési tartomány közepébe (45-65 °C) esnek, így a Tm görbe közel vízszintes szakaszai is jól kimérhetők lesznek.
27. A 4-metil-benzhidril-amin gyanta
A szintézist manuálisan MBHA gyantán (27.ábra), a peptidkémiában megszokottól alacsonyabb kapacitás alkalmazásával hajtottam végre. A D-lizin kapcsolása után kvantitatív pikrinsavas tesztet végeztem, míg a PNS monomerek kapcsolásának hatékonyságát Kaiser teszttel ellenőriztem. A szintézis végén az oligomert lehasítottam a gyantáról és HPLC-vel tisztítottam. Az így előállított PNS oligomerek: H–t c c c t t t c t t t-D-Lys-NH2 (I a.) referencia, középen 3 timin egység H–t c c c tPr tPr tPr c t t t-D-Lys-NH2, (I b.) középen 5-propinil-uracil egységek H–t c c c tPh tPh tPh c t t t-D-Lys-NH2, (I c.) középen 5-fenil-uracil egységek H–t c c c tPhE tPhE tPhE c t t t-D-Lys-NH2,, (I d.) középen 5-feniletinil-uracil egységek H–t c c c tTie tTie tTie c t t t-D-Lys-NH2, (I e)középen 5-(2-tienil)-uracil egységek.
3.9.2. A komplementer DNS oligomer szintézise A target d(5’-AAA GAA AGG GA-3’) ( II. )oligodezoxinukleotidot standard szilárd-fázisú
foszforamidit
szintézis
protokoll
(28.
ábra)
MilliGen/Biosearch 8700 DNS szintetizátor segítségével állítottuk elő.
38
alkalmazásával
28. Szilárd-fázisú oligonukleotid szintézis foszforamidit módszerrel
A szintézis egy többször ismétlődő ciklus. A láncvégi dimetoxi-tritil-csoportot (DMT) híg klórecetsav oldattal hasítottam le (detritilezés), a következő monomer lánchoz kapcsolását tetrazol jelenlétében végeztem, az oxidációs lépésben jód oldatot alkalmaztam. Ezt követően az el nem reagált láncvégi OH-csoportokat ecetsavanhidriddel acetileztem (keppelés), majd a detritilezéssel indul a következő ciklus. A szintézis során derivatizált hordozót alkalmaztam, azaz az első nukleotid egység már a szilárd fázisra volt kötve, ezért ennek detritilezésével indult a ciklus. A szintézis végén az oligomert tömény ammónia oldattal hasítottam le a hordozóról és egyúttal a védőcsoportokat is eltávolítottam a láncvégi DMT kivételével. Ennek az a jelentősége, hogy az előtisztítás során a szilárd fázisú extrakcióval a rövidebb oligomerektől a kartridzson egyszerű mosással megtisztíthatjuk a terméket. A DMT védett oligomer a szilárd fázishoz kötődve marad a mosás során, majd a védőcsoport hasítása után ez is eluálható. A nyersterméket RP-HPLCvel tisztítottam, a csúcsfrakciókat összegyűjtöttem és liofilizáltam.
39
3.10. Stabilitás vizsgálatok A DNS: PNS duplexek termikus stabilitását Beckman DU 7400 spektrofotométerrel vizsgáltam. A komplexet alkotó oligomerekből 1mg / ml koncentrációjú oldatot készítettem nátrium-kloridra és magnézium-kloridra nézve 0,01 M-os Tris-pufferben (pH: 7,4), majd az oldatokat 150-szeresére higítottam. A DNS: PNS oldatokat páronként 1:1 térfogatarányban összemértem, a kapott elegyet forrásig melegítettem, majd lassan hagytam szobahőmérsékletre hűlni. Az abszorbanciát 260 nm-en mértem a hőmérséklet függvényében. A fűtés sebessége 1 oC / perc volt. A II.: I a: komplex, azaz a módosításokat nem tartalamó PNS esetén meglepően magas (65 oC) Tm pontot mértem (29. ábra).
1,30
o
Rel. Absz = Absz (T) / Absz (25 C
1,35
1,25 1,20 1,15 o
Tm = 65 C 1,10 1,05
1,00 10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
o
Hõmérséklet / C
29. A refencia DNS: PNS duplex Tm pont mérése
Az 5-fenil- és az 5-(2-tienil)-uracilt tarlmazó PNS oligomerek (I c és I e) DNS komplexeinek vizsgálata során a mért tartományban nem alakul ki a telítődés (30. ábra). A görbék deriváltjából kapott inflexiós pont helye (58,0 és 63,8 oC ) nem tér el jelntősen a referencia duplexétől, tehát a módosított duplexek termikus stabilitása hasonló a módosítást nem tartalmazó duplexéhez. Ennél pontosabb eredményekhez, optimalizált körülmények között, a teljes telítésbe menő görbét fel kell venni. Az 5-(1-propinil)- és 5feniletinil-uracil
származékok
(I
b
és I d) esetén 40
az
abszorbancia lineáris
hőmérsékletfüggést mutatott, ami arra utal, hogy nem alakult ki a duplex a komplementer DNS szál és az PNS között. Ezek alapján megállapítható, hogy az aril módosítások a duplexképződést és a duplex termikus stabilitását jelentősen nem befolyásolták, ezzel szemben az alkinok beépítése nem kedvezett a DNS: PNS komplexek kialakulásának jelen mérési körülmények között. A refencia vegyület vizsgálata során mért magas Tm pont és módosított analógok esetében tapasztalt eredmények alapján a mérési körülmények (só koncentráció, ionerősség, pH, és felfűtési sebesség) optimalizálása szükséges a pontosabb értékeléshez. 1,25
o
Rel. Absz = Absz (T) / Absz (25 C
1,20
1,15
1,10
1,05
1,00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
o
Hõmérséklet / C
30. Az 5-(2-tienil)-uracil tartamazó PNS komplexének termikus vizsgálata
41
3.11. P-királis mononukleotidok szintézise Kísérleteinkhez modellvegyületekként az 5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2cianoetil)-N,N-diizopropil]foszforamiditet (T-CED) és ennek oxidált származékait választottam. Mivel az oxidációs reakciók sztereokémiáját is tanulmányozni kívántam ezért az izomerkeverék T-CED-ből szilikagél kromatográfiával preparáltam a tiszta RP és SP diasztereomereket és az oxidációs reakciókat ezekből kiindulva hajtottam végre (31. és 32. ábra).
31. A T-CED Rp diasztereomerjének oxidációi
A különböző P(III) származékok (foszfit triészterek, foszforamiditek, stb.) oxidációja a megfelelő P(V) vegyületekké igen sokféle oxidálószer alkalmazásával változatos módon valósítható meg
76 77 78 79 80
és ez alapvetően meghatározza a szóban
forgó reakciók sztereokémiáját is. Célvegyületeinket nevezetesen a T-CED oxidált tiooxidált
82
81
,
és szelenooxidált83 származékait mint P-diasztereomer keverékeket korábban
már mások is leírták de közülük csak a foszforotioát analóg izomerjeit szeparálta és jellemzte kutatócsoportunk egy régebbi munkája során 29. A kiindulási T-CED, akárcsak a többi védett természetes nukleozid, 3’-foszforamiditjeinek tiszta RP- és SP- izomerjeit elsőként Pfleiderer és mtsai. izolálták közepes nyomású szilikagél kromatográfiával 84.
42
32. A T-CED Sp diasztereomerjének oxidációi
A disszertációban a P-konfiguráció hagyományos Cahn-Ingold-Prelog (CIP)konvenció szerinti RP/ SP jelölése mellett az utóbbi időben Sobkowski és mtsai
85 86
által
javasolt és bevezetett új LP/DP P-sztereokémiai nomenklatúrát is alkalmazom mivel ez utóbbi minden esetben korrelációban van a központi foszforatomhoz kapcsolódó megfelelő szubsztituensek térállásával, míg a rendszámokon alapuló CIP prioritási sorrend miatt a hagyományos RP/ SP jelölés sok esetben (pl. egy Me→SMe csere esetén) a szubsztituensek azonos térállása ellenére is különböző.
3.11.1. Szintézis Annak ellenére, hogy a szintézis kiindulási anyagát a T-CED tiszta P-izomerjeit 35a és 35b korábban közepes ill. kis nyomású kromatográfiával szeparálták korábbi tapasztalataink és irodalmi adatok
84 87
, saját
88 89
alapján is a savérzékeny nukleozid-3’-
foszforamiditek gravitációs szilikagél kromatográfiával is bomlás nélkül tisztíthatók és elválaszthatók amennyiben az eluens néhány % bázist (általában TEA-t) tartalmaz, amely elegendő a szilikagél savasságának közömbösítésére. Jelen esetben az izomerkeverék TCED-et kb. ~10 g-os mennyiségben kromatografáltam és az első elválasztás után ~30%-os bruttó termeléssel izoláltam a tiszta diasztereomereket míg az anyag ~60%-át keverék formában nyertem vissza.
43
A 35a–ból és 35b–ből kiindulva a lehető legegyszerűbb módon egyszerű reagensek (pl. elemi kén és szelén) alkalmazásával sztereospecifikus oxidációkat terveztem végrehajtani, hogy elkerüljem a melléktermékek képződését ezáltal a végtermék kromatográfiás tisztítását is. A reakciókat szobahőmérsékleten végeztem mindhárom esetben 4-szeres mólfelesleg oxidálószer alkalmazásával, ami lehetővé teszi a reakcióidők és a módszerek hatékonyságának összehasonlítását. A foszforamidát diasztereomerek 36a és 36b szintézisére az acetonitril, mint oldószer és H2O2 oldat, mint oxidálószer alkalmazása tűnt a legjobb megoldásnak ami igen rövid idő alatt kvantitatív termeléssel szolgáltatta a kívánt DP-(SP)- és LP-(RP)-izomereket. Mivel a reakció másik terméke a víz így az elegyek bepárlásával közvetlenül a tiszta termékeket kaptam. A reakció a kromatográfiás analízisek szerint kemo- és sztereospecifikus volt, amely a H2O2 –ot alkalmassá teszi más P(III) vegyületek szelektív oxidációjára is. Itt kell megjegyeznem, hogy a foszfit triészterek szilárd fázisú oxidációjára általánosan használt reagens (I2/THF-piridin-víz)
90
az én esetemben a P-amidit funkció
érzékenysége miatt nem alkalmazható, másrészt ez a módszer nem sztereospecifikus 76. A tiszta foszforamidotioát diasztereomerek 37a és 37b szintézisére korábbi munkánk során is elemi ként használtunk
29
de az egyszerűbb feldolgozás kedvéért a
toluol-2,6-lutidin keverék helyett ezúttal CH2Cl2–t használtam oldószerként, amelyben a kén ugyancsak homogén oldatot ad a szükséges viszonylag alacsony koncentrációban. A reakcióelegy bepárlását követően a maradék EtOAc-os digerálásával majd szűrésével a kénfelesleg nagy része eltávolítható, de nem tökéletesen, ezért a teljesen kénmentes végtermékek csak egy végső szilikagél kromatográfiás tisztítás után izolálhatók. Mivel a kénezéshez hasonlóan a P(III) vegyületek szelenooxidációja is megoldható elemi szelénnel
91 92
így ez a módszer tűnt a legésszerűbbnek a foszforamidoszelenoát
izomerek 38a és 38b előállítására. Mivel a szelén jóval rosszabbul oldódik CH2Cl2–ban, mint a kén, ezért a reakcióelegy itt szuszpenzió és a reakcióidő is hosszabb (~5 óra) de a szelén felesleg ezesetben tökéletesen eltávolítható szűréssel. Itt jegyzem meg, hogy egy új, szerves
oldószerekben
jól
oldódó,
szelén
transzfer
reagens
((iPrC5H4)2TiSe3)
alkalmazásával a 38a és 38b, mint diasztereomer keverék szintézisét korábban már leírták 83
.
A leírtakat a 31. és a 32 ábra szemlélteti.
44
3.11.2. NMR vizsgálatok Az egymáshoz nagyon hasonló 35, 36, 37 és 38 vegyületek szerkezetvizsgálata a 1
H, 13C és 31P kémiai eltolódások és bizonyos csatolási állandók összehasonlításán alapul.
Az említett izomerpárok közös tulajdonsága, hogy a 35b, 36b, 37b és 38b izomereknél a 3J (P,C) csatolási állandók a C4’ szénatom esetében mindig nagyobbak, mint a C2’-nél, míg a tendencia a 35a, 36a, 37a és 38a izomereknél éppen fordított. Következésképpen a 35b, 36b, 37b és 38b diasztereomerek pozitív ∆J (= 3J (P,C4’) – 3J (P,C2’)) értékei az εt konformáció dominanciáját jelzik míg a 35a, 36a, 37a és 38a izomerek negatív ∆J értékei az ε- konformer túlsúlyára utalnak. A 36a, 37a és 38a izomereknél a H2’β proton és a foszfor közötti négy kötéses csatolási állandók (1,5, 1,4 és 1,3 Hz) ugyancsak összhangban vannak az ε- konformáció dominanciájával
93
, míg a 36b, 37b és 38b vegyületeknél ezek a
csatolások (<0,5 Hz) nem voltak detektálhatók (lásd a 2. táblázatot). A C3’-O3’ kötés körüli preferált konformációk ismeretében a P-atom abszolút konfigurációjára nézve az N-izopropil-metil csoportok és a megfelelő cukor protonok közötti NOE korrelációkból is információkat kapunk. A foszforotioát analógnál (37b (RP) és 37a (SP)) talált korábbi adatokkal
29
összhangban, a 35b, 36b és 38b izomereknél
jelentős NOE korreláció van az izopropil metil protonok és a H4’ és C5’-2H protonok között míg a 35a, 36a és 38a izomerek esetében hasonló NOE effektus van a szóban forgó i
Pr-metil és a H2’α protonok között. Ezenkívül az izopropil csoport metil dubletjei a
„lassú” b izomerek esetében határozottan elkülönülnek míg a „gyors” a izomereknél gyakorlatilag teljesen egybeesnek. Ez valószínűleg annak tulajdonítható, hogy az előbbi esetben a két Me csoport közül az egyik közelebb van a furanóz gyűrű O-atomjához míg az a izomereknél az iPr csoport távolabb van a cukortól ezért a két Me csoport protonjai csaknem ekvivalensnek tekinthetők. Korábban ennek alapján tettek javaslatot a 35a és 35b diasztereomerek abszolút konfigurációjára is
84
. A 27. és a 28. ábrán a hagyományos
(RP/SP) jelölésen kívül minden vegyület esetében alkalmaztuk az új (DP/LP) nomenklatúrát 85 86
is. Ez utóbbi látható módon korrelál a megfelelő szubsztituensek térállásával, egyúttal
az izomerek kromatográfiás mozgékonyságával is. Eszerint a gyors 35a, 36a, 37a és 38a izomerek DP, míg a lassú 35b, 36b, 37b és 38b diasztereomerek LP abszolút konfigurációval rendelkeznek. A transz és a gauche konformerek preferenciáján és az NOE effektusokon kívül az LP és DP sorozatokon belül bizonyos protonok kémiai eltolódásaiban is találunk analógiákat. Így pl. a DP konfigurációjú a izomereknél a H4’ proton valamivel nagyobb 45
eltolódású, mint az LP sorozat megfelelő vegyületeinél, miközben a H2’α protonok kémiai eltolódásaiban pontosan az ellenkező tendencia figyelhető meg. Miközben az említett két proton eltolódásaiban jellemző különbség van az izomerek között ezek az értékek függetlenek a P=X kötés természetétől, vagyis a 36a, 37a és 38a ill. a 36b, 37b és 38b sorozatokon belül gyakorlatilag azonosak. Ez arra utal, hogy a C3’-O3’-P kötések körüli konformációk az adott sorozaton belül nagyon hasonlóak vagyis ezeket a heteroatom minősége, a P=X kötés polaritása nem befolyásolja. Ugyanakkor más spektrális paraméterek, mint pl. a H3’ és az izopropil metin protonok valamint a C3’ és az izopropil metin
szénatomok
kémiai
eltolódásai
egyértelműen
nőnek
elektronegativitásának csökkenésével. Ugyanez figyelhető meg a
31
az
X
heteroatom
P kémiai eltolódások
esetében is, itt azonban az oxidációs szám csökkenése (+5-ről +3-ra) okoz igazán jelentős növekedést. A 2J(P,C3’), 2J(P,OCH2) és 2J(P,CHN) csatolási állandók szisztematikus csökkenése ugyancsak jól korrelál az X heteroatom csökkenő elektronegativitásával ugyanakkor a
31
P kémiai eltolódásokhoz hasonlóan ezek a paraméterek is kiugróan
magasak a P(III) vegyületek 35a és 35b esetében. A sztérikus és elektronikus hatások együttes eredményeképpen a 36b és 36a oxovegyületek ∆J értékei (+3,6 és -1,9) határozottan különböznek a 37b, 38b és a 37a, 38a analógok megfelelő értékeitől (+2,2; +2,4 és -2,6; -2,4). Mivel az a és b sorozatokon belül a C4’, C2’, H4’ és H2’α kémiai eltolódások a C3’-O3’ kötés körüli nagyon hasonló konformációt jeleznek ezért az említett különbség ez esetben is az O atomnak a kénhez és szelénhez
viszonyított
jóval
nagyobb
elektronegativitására vezethető
vissza.
A
trikoordinált P-atommal rendelkező 35a és 35b esetében a szóban forgó különbségek abszolút értékben (-0,5 és +2,0) kisebbek, mint a P(V) analógoknál, de a ∆J-k előjelei itt is azonosak az oxidált származékok megfelelő izomerjeinél találtakkal, ami előrevetíti a ∆J alkalmazhatóságát más P(III) vegyületek abszolút konfigurációjának meghatározására is. A vegyületek szerkezetének oldószerfüggését is tanulmányozni kívántuk ezért a spektrumokat deuterobenzolban is felvettük, ami a 3J(P,C4’) és 3J(P,C2’) csatolási állandók vonatkozásában határozott különbséget mutatott a CDCl3-hoz viszonyítva, míg a többi C-P csatolásra az oldószercsere nem volt hatással. A C6D6-ban mért nagyobb ∆J–k az εt konfomerek nagyobb populációját jelzik, ami a hőmérséklet növelésével (a 17°C - 65°C tartományban) tovább nő. Az aromás oldószer ezen hatása alapvetően a benzol és a nukleobázis (timin) közötti stacking kölcsönhatásnak tulajdonítható, de ebben valószínűleg az 5’-dimetoxitritil csoport aromás gyűrűi is közreműködnek.
46
A várakozástól eltérően a 31P kémiai eltolódások nem korrelálnak szigorúan a DP/LP sztereokémiával az összes izomerpáron belül. Az egyes izomerek egyértelmű asszignációja céljából a felvételekhez mind a négy esetben a/b = 2/1 mólarányú keverékeket alkalmaztunk mivel az izomerek közötti kémiai eltolódás különbség minden izomerpárnál igen kicsi. Meglepetésre azt találtuk, hogy a 35 és 36 vegyületeknél a gyors DP izomerek jelei magasabb frekvenciánál jelentkeznek a lassú LP diasztereomerekéhez viszonyítva, míg a 37 és 38 analógok esetében a tendencia éppen fordított. A vegyületek fontosabb kémiai eltolódás és csatolási állandó értékeit a 2. táblázatban foglaltuk össze.
47
35a
35b
36a
36b
37a
37b
38a
38b
δ(ppm)a H4’
4.18
4.14
4.32
4.28
4.33
4.29
4.34
4.30
H2’α
2.49
2.53
2.58
2.67
2.57
2.66
2.58
2.65
H3’
4.66
4.66
5.05
5.06
5.28
5.33
5.36
5.42
NCH
3.55
3.56
3.43
3.40
3.73
3.72
3.85
3.84
H5’A
3.32
3.31
3.41
3.37
3.43
3.41
3.47
3.41
H5’B
3.54
3.48
3.53
3.50
3.43
3.48
3.48
3.53
H5’B-H5’A
0.22
0.17
0.12
0.13
0
0.07
0.01
0.12
NCHCH3
1.16
1.06
1.21
1.13
1.29
1.22
1.31
1.24
1.17
1.16
1.23
1.22
1.29
1.28
1.32
1.28
C4’
85.91
85.61
84.97
84.98
85.02
84.78
85.01
84.97
C2’
40.26
40.28
39.58
39.62
39.41
39.26
39.52
39.42
C3’
73.72
74.16
77.13
77.50
77.61
77.82
78.54
79.33
NCH
43.51
43.45
46.57
46.52
47.42
47.39
48.15
48.18
P
149.54
149.12
8.50
8.17
71.26
71.45
74.29
74.89
J(Hz) 3
J(P,H3’)a
9.5
9.2
7.5
7.2
11.3
10.5
12.1
11.5
J(P,H2’ß)
-
-
1.5
c
1.4
c
1.3
c
J(P,C3’)
16.6
17.0
5.4
5.7
5.1
5.4
4.6
5.0
J(P,OCH2)a
19.0
18.6
5.1
5.2
4.2
4.4
3.8
3.7
2
J(P,CHN)a
12.2
12.6
5.1
5.2
4.6
4.9
4.8
4.9
J(P,CH2CN)a
6.8
7.1
7.5
7.3
9.0
8.5
9.2
9.0
3.9
5.5
3.9
7.1
3.5
6.4
3.5
6.4
4
2
a
2
3
3
J(P,C4’)a
3
J(P,C2’)a
4.4
3.5
5.8
3.5
6.1
4.2
5.9
4.0
b
-
-
4.5
6.9
4.0
6.8
3.9
6.6
J(P,C2’)b
-
-
5.4
2.3
5.9
3.9
6.2
3.8
∆Ja
-0.5
+2.0
-1.9
+3.6
-2.6
+2.2
-2.4
+2.4
∆Jb
-
-
-0.9
+4.6
-1.9
+2.9
-2.3
+2.8
3
J(P,C4’)
3
2. Táblázat A diasztereomerek (35-38 a,b) kémiai eltolódásai és csatolási állandói a
CDCl3-ban, szobahőmérsékleten, b C6D6-ban, 17 °C-on, c kevesebb, mint 0.5 Hz
48
3.11.3. HPLC analízisek Míg a T-CED izomerek 35a és 35b oxidációja a megfelelő foszforamidátokká 36a és 36b, a nagy Rf különbségek miatt jól követhető VRK-n, addig a kénezési és szelénezési reakciók termékei (37a, 37b és 38a, 38b) több oldószerelegyben sem különböznek jelentősen a kiindulási anyagoktól. Az utóbbi reakciók előrehaladásának követése másrészt a heteroatomok kromatográfiás viselkedésre gyakorolt hatásának vizsgálata céljából célszerűnek tűnt a normál és reverz fázisú HPLC alkalmazása. A normál fázisú oszlopon a gyors 37a és 38a vegyületek retenciós idői (tR) gyakorlatilag azonosak voltak, míg a 37b és 38b lassú izomereknél a különbség (~9 sec.) már detektálható volt. Meglepetésre a foszforotioát analógok 37a és 37b bár csak kicsivel, de valamivel mégis mozgékonyabbak voltak, mint a megfelelő szeleno izomerek 38a és 38b, ami nem korrelál a szelénnek a kénhez viszonyított nagyobb méretével és hidrofóbicitásával. A VRK-val összhangban a 36a és 36b oxo izomerek bizonyultak a legkevésbé mozgékonynak ráadásul a DP és LP izomerek közötti tR különbség (~7 min.) messze itt volt a legnagyobb az összes izomerpár közül. Összegezve elmondható, hogy a normál fázisú HPLC profilok alapján a ligandumok függvényében a következő mobilitási sorrend állapítható meg: nemkötő elektronpár > P=S ≥ P=Se >> P=O. A reverz fázisú oszlopon a várakozásnak megfelelően a legkevésbé poláros T-CED izomerek 35a és 35b rendelkeztek a legnagyobb, míg a messze legpolárosabb 36a és 36b a legkisebb tR értékekkel. A hidrofób csoportok (5’-ODMT és Ni-Pr2) jelenléte miatt az összes vegyület erősen kötődött a C18 töltethez ezért az eluensnek viszonylag sok (80%) acetonitrilt kellett tartalmaznia, hogy a retenciós idők ne legyenek túl hosszúak. A normál fázison talált anomáliától eltérően a reverz fázison érvényesült a szelén kénhez viszonyított nagyobb hidrofóbicitása így a 38a és 38b tR értékei nagyobbak voltak, mint a megfelelő foszforotioát izomereké 37a és 37b. Ennek megfelelően a reverz fázisú oszlopon talált mobillitási sorrend a következő volt: 36 (P=O) > 37 (P=S) > 38 (P=Se) > 35 (nemkötő elektronpár). Meglepő módon az egyes izomerpárokon belüli mobilitási sorrend mindkét fázison azonos volt vagyis a gyors a izomerek az oszloptöltet polaritásától függetlenül kisebb tR értékeket mutattak mint a lassú b izomerek, ami egyúttal megegyezik a VRK-s sorrenddel is. A leírtakat a 3. táblázatban foglaltuk össze.
49
Retenciós idő (perc) Normál fázis
Fordított fázis
35a
4.18
6.40
35b
5.11
7.18
36a
8.83
3.86
36b
15.81
4.13
37a
4.47
5.77
37b
5.92
6.50
38a
4.50
5.88
38b
6.06
6.83
3. Táblázat A diasztereomerek (35-38 a,b) HPLC-s retenciós idői
50
4. Összefoglalás Doktori kutatásaim során új 5-szubsztituált pirimidin bázisokat tartalmazó peptidnukleinsav monomer származékok szintézisével, valamint P-királis mononukleotidok szintézisével és vizsgálatával foglalkoztam.
Munkám során az elért új tudományos eredmények a következők: 1. A peptid-nukleinsavak szintézisének kulcsintermedierje az etil N-(2- Bocaminoetil)-glicinát (Boc-gerinc). Ennek szintézisére az irodalomból ismertnél jobb és hatékonyabb eljárást dolgoztam ki. A Boc-etilén-diamin köztiterméket rutinszerűen végezhető módszerekkel (szűrés, extrakció, desztillálás) tisztán izoláltam. Ezáltal a végtermék kromatográfiás tisztítása sokkal kényelmesebb és a reakció hozama is növelhető.
2. 5-jód-uracilból kiindulva három lépésben előállítottam az 5-jód-uracil PNS monomert,
amely
palládium-katalizált
keresztkapcsolási
reakciókban
felhasználható és az etilészter csoport hidrolízise után a módosított monomer alkalmas a szilárdfázisú oligomerizációra Megállapítottam, hogy az uracil alkilezésére a brómecetsav-t-butilészter a legalkalmasabb, figyelembe véve, hogy a savas hasítás kvantitatívan eredményezi a várt karbonsavat, mellékreakció nélkül. A monomer két alkotóelemét modern kapcsolási körülményeket alkalmazva kötöttem össze.
3. Aril-tributil-sztannán vegyületeket kapcsoltam Stille reakcióval az 5-jód-uracil PNS monomerhez. Az etilészert lúgos közegben hidrolizáltam. Így az 5-(2-tienil)-, az 5-(2-furanil)- és az 5-fenil-uracil PNS monomereket állítottam elő. Megállapítottam, hogy a kapcsolt termékek és a jódvegyület kromatográfiás tulajdonságai nagyon hasonlítanak, ezért bizonyos esetekben az el nem reagált kiindulási vegyület reduktív dejódozása nagymértékben megkönnyíti a termék izolálását. Végeztem kísérleteket „inverz” és „dupla” Stille kapcsolások megvalósítására is. Az első esetben az uracil monomeren alakítottam ki a trialkilsztannil-csoportot, majd ezt az ónvegyületet reagáltattam aromás-halogenidekkel. A másik alkalmazás
esetén „one pot” reakciót kíséreltem meg, mely során az aril-halogenidet hexaalkil-diónnal kapcsolva aril-trialkil-sztannán keletkezik és ez izolálás nélkül reagáltatható az 5-jód-uracil PNS monomerrel. Ezek a kapcsolási módszerek azonban nem minden esetben eredményezik a várt terméket és hatékonyságuk sem közelíti meg a „normál” Stille kapcsolásét.
4. Az 5-jód-uracil PNS monomer Suzuki és Sonogashira kapcsolásokban történő felhasználása során problémák merültek fel. Az aromás boronsavak palládium katalizálta reakciói szinte egyáltalán nem vezettek eredményre, a terminális alkinek kapcsolásai során pedig nem elhanyagolható mértékben furano[2,3-d]-pirimidin gyűrűs melléktermékek is képződnek. A probléma kiküszöbölésére laktám-védett jódvegyületet terveztem, amely a Pd-katalizált kapcsolások körülményei között stabil. Az N1-alkil 5-jód-uracilt N3 helyzetben p-metoxi-benzilcsoporttal védtem. Ezt követően a t-Bu észter hasítása majd a gerichez kapcsolás űtján uzoláltam a 3PMB-5-jód-uracil PNS monomert . Ez a védőcsoport oxidatív módon távolítható el, azonban ezt a lépést még optimalizálni szükséges.
5. Sonogashira kapcsolások során különböző 5-alkinil-uracil PNS monomereket állítottam elő. Az 5-jód-uracil PNS monomerrel történt kapcsolások csak elfogadható hozammal eredményezték a kívánt termékeket a furano[2,3-d]pirimidin gyűrűs melléktermékek képződése miatt. A 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer, mint kiindulási anyag, alkalmazásakor viszont a kapcsolások közel kvantitatív hozammal valósíthatók meg. Előállítottam a védett 5-(1-propinil)-, 5feniletinil- és 5-(1-hexin-1-il)-uracil PNS monomereket.
6. A boronsavak könnyű hozzáférhetősége és nagy tárháza miatt a Suzuki kapcsolás kiválóan alkalmas nagyszámú aril-analógok szintézisére. Az 5-jód-uracil PNS monomeren végzett keresztkapcsolási reakciók során azt tapasztaltam, hogy vízmentes közegben a Suzuki kapcsolás nem valósítható meg. Ennek oka valószínűleg az, hogy bázikus közegben az uracil laktám csoportja deprotonálódik és a közeli negatív töltés hatására a palládium elektrofil jellege csökken, amely a transzmetallálást nagy mértékben gátolja. Azaz szükséges a laktám csoport átmeneti védelme. 52
Ezt az elképzelést alátámasztják az eredményeim, mivel a 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomeren sikeresen kapcsolási reakciókat hajtottam végre különböző arilboronsavakkal és így N3-PMB-védett 5-(2-tienil)-, 5-(4-bifenil)-, 5-(benzo[b]tiofén2-il)- és az 5-(4-dimetilaminofenil)-uracil PNS monomereket állítottam elő. A boronsavak helyett boronsav-pinakolésztereket alkalmazva a konverzió kb. 10 %kal növelhető.
7. Az uracil laktám funkciója könnyen trimetilszililezhető és a TMS csoport könnyen eltávolítható. Ugyanakkor extra érzékenysége miatt az ilyen jellegű származékok nem izolálhatóak. Ezek alapján in situ szililezéssel dolgoztam ki módszert az 5-jód uracil származékok Suzuki kapcsolására. A TMS csoport bevitelét BSA-val hajtottam végre, az eltávolítása a rekcióelegy vizes feldolgozása során végbement. Az N1-alkil-5-jód- uracilon végrehajtott reakciók hozama jónak mondható, az 5jód-uracil PNS monomer esetén ez alacsonyabb a mellékreakciók miatt. Elmondható, hogy az in situ szilil védelem melletti Suzuki kapcsolások az N1-alkil5-jód- uracillal elfogadható termeléssekkel hajthatók végre és a PMB-től eltérően a 4-OSiMe3 védőcsoport eltávolítása kombatibilis a gerinc védőcsoportokkal. 8. Az irodalomból ismert szintézisek optimalizálásával, korszerűbb módszerek és új reagensek alkalmazásával előállítottam a timin PNS monomert.
9. A citozin PNS monomer előállítására új eljárást dolgoztam ki. A szakirodalomban leírt triazolil származékon keresztüli uridin – citidin átalakítást alkilezett uracilon is sikerrel alkalmaztam. Az előállított N1-alkil citozinból az 5-jód-uracil és timin monomerek esetén is alkalmazott modern módszereket felhasználva Boc/Z védett citozin PNS monomert állítottam elő.
10. Az
5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diizopropil]foszforamidit
(T-CED) tiszta DP,RP- és LP,SP-diasztereomerjeit H2O2-dal, elemi kénnel ill. szelénnel oxidálva gyakorlatilag kvantitatív hozamokkal izoláltam a megfelelő P(V) vegyületeket. Az NMR és kromatográfiás analízisek szerint a reakciók minden esetben kemo- és sztereospecifikusak voltak és a P-konfiguráció retenciójával
játszódtak
le.
A
termékek 53
közül
a
foszforamidátokat
és
foszforamidoszelenoátokat korábban csak P-diasztereomer keverék formában írták le az irodalomban.
11. A P-királis mono- és dinukleotidokkal kapcsolatos korábbi NMR vizsgálatainkkal összhangban megállapítottam, hogy a ∆J (= 3J (P,C4’) – 3J (P,C2’)) értékek a preparált új analógok esetében is jellemzőek a P-konfigurációra. Eszerint a negatív ∆J –k az LP míg a pozitív értékek a DP abszolút konfigurációval rendelkező izomerekre jellemzőek. Külön érdekesség, hogy az említett korrelációt korábban csak a kettős kötésű heteroatomot tartalmazó P(V) vegyületeknél vizsgálták. Jelen adatok szerint ez a hozzárendelés a P(III) vegyületekre is érvényesnek bizonyult ami NOE mérésekkel megerősítve a jövőben alkalmas módszer lehet más királis foszfitok abszolút P-konfigurációjának meghatározására is.
12. A normál és különösen a reverz fázisú HPLC analízisek alapján megállapítottam, hogy
a
foszforatomhoz
kettős
kötéssel
kapcsolódó
heteroatomok
elektronegativitása és a retenciós idők között egyértelmű összefüggés áll fenn. Az RP-HPLC-vel talált mobilitási sorrend: (P=O) > (P=S) > (P=Se) > (nemkötő elektronpár) megfelel a várakozásnak. Az egyes izomerpárokon belül, a ∆J értékekhez hasonlóan, a HPLC profilok alapján is egyértelmű korreláció van a retenciós idők és az abszolút P-konfiguráció között. Érdekes módon a „gyors” DP izomerek mindkét fázison mozgékonyabbak voltak, mint a „lassú” LP hasonmások.
54
5. Kísérleti rész 5.1. Vékonyréteg-kromatográfia Az előállított vegyületek tisztaságát első lépésben mindenkor vékonyréteg-kromatográfia segítségével ellenőriztem, DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 (Merck) típusú lemezen. Alkalmazott eluensek (v/v): (1) EtOAc: hexán 2:1; (2) EtOAc: hexán 1:1; (3) Kloroform: metanol 9:1; (4) Kloroform: metanol 19:1; (5) n-butanol: ecetsav: víz 3:1:1; (6) Kloroform: metanol 2:1; (7) EtOAc: hexán 1:2.; (8) EtOAc: metanol 9:1; (9) EtOAc; (10) Kloroform: metanol: ecetsav 90:8:2; (11) EtOAc: n-butanol: ecetsav: víz 3:1:1:1; Klorofrom: metenol 92:8
5.1.1. Előhívó reagensek:
5.1.1.1. Klór-tolidin
33. Az o-tolidin szerkezete
Az oldat készítése: 80 mg o-tolidint (33. ábra), 15 ml ecetsavat és 0,5 g KI-ot elegyítünk, majd vízzel 250 ml-re egészítjük ki. A megfuttatott vékonyréteg-lapot klórgázzal telített kádba helyezzük egy percre, majd a felesleges klórt hideg levegő lemezre fúvásával eltávolítjuk, végül a lemezt a tolidines oldatba mártjuk. A kialakuló N-klór vegyületek oxidálják a tolidint, ekkor zöldeskék színűvé oxidált vegyületek keletkeznek.
5.1.1.2. Ninhidrin 0,2 g ninhidrint 99,8 ml acetonban oldunk. A lemezt az oldatba mártás után, néhány percig 100°C-ra hevítjük, ekkor a szabad aminocsoportot tartalmazó vegyületek kékes-lila, esetleg sárga elszíneződést mutatnak
5.2. HPLC vizsgálat Az előállított PNS és DNS oligomerek vizsgálatára és tisztítására nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) módszereket is felhasználtam. Az 5’-dimetoxitritil-
timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diizopropil]-foszforamidit
származékokat
szintén
HPLC-vel jellemeztem. Az alkalmazott Merck típusú rendszerben (LaChrom 7100 pumpa és Lambda 1010 UV-VIS detektor) Hypersil 5 ODS (250 mm × 4 mm) C18-csoporttal módosított reverz fázisú és Hypersil 5 (250 mm × 4 mm) normál fázisú oszlopot alkalmaztam. A detektálást 220 és 260 nm-en végeztem. A teljes áramlási sebesség minden esetben 1ml/perc volt. Az alkalmazott eluensek és gradiensek az alábbiak voltak: I.
(PNS oligemerek)
A eluens: nagytisztaságú víz, 0,045%(v/v) TFA B eluens: HPLC minőségű acetonitril, 0,036%(v/v) TFA gradiens: 5% B-től 95% B-ig 30 perc alatt II.
(DNS oligomer)
A eluens: 0,1 M TEAA oldat: HPLC minőségű acetonitril 95: 5 B eluens: 0,1 M TEAA oldat: HPLC minőségű acetonitril 1: 1 gradiens: 0% B-től 100% B-ig 40 perc alatt III.
(Foszforamidit származékok, reverz fázis)
A eluens: 0,1M TEAA oldat B eluens: HPLC minőségű acetonitril gradiens: A: B = 1: 4 izokratikus elúció, 20 perc alatt IV.
(Foszforamidit származékok, normál fázis)
A eluens: HPLC minőségű EtOAc, 2 % TEA B eluens: HPLC minőségű hexán, 2% TEA gradiens: A: B = 3: 1 izokratikus elúció, 20 perc alatt
5.3. A gyanta kapacitásának meghatározása 5.3.1. Kvantitatív pikrinsavas teszt A felhasznált oldatok: Pikrinsav 0,1 M-os diklórmetános oldata (Reagens 1.) Diizopropil-etil-amin 5 térfogat %-os diklórmetános oldata (Reagens 2.) A vizsgált gyantát diklórmetánban duzzasztjuk, majd a Reagens 2-vel kétszer 1 percig semlegesítjük, az esetlegesen rajta lévő savas vegyületektől. A DIEA teljes eltávolítására ötször mossuk a gyantát diklórmetánnal, majd a gyantát kétszer 1 percig kezeljük a Reagens 1-gyel. Ezt követően a reagens feleslegének eltávolításához a gyantát ötször 56
mossuk diklórmetánnal. A minta oldat elkészítéséhez a gyantához kötött pikrátot kétszer 1 percig eluáljuk a Reagens 2-vel, a két oldatot egyesítjük, majd 96%-os etanollal hígítjuk, úgy hogy a végső oldatban a DCM mennyisége kevesebb legyen, mint 20%. A kiértékeléshez a képződött DIEA-pikrát abszorbanciáját határozzuk meg 358 nm-en. 10-5 M-os oldat abszorbanciája 0,145 (a hígításokat érdemes úgy végezni, hogy a megadott abszorbancia körüli értéket mérjünk, mert itt a legkisebb a módszer hibája. A kapott eredményből és az elvégzett hígításokból, valamint a vizsgált gyanta mennyiségéből aránypárokkal kapjuk meg a gyanta kapacitásértékét.
5.3.2. Kaiser (ninhidrin) teszt Szilárdfázisú szintézis során ha a szabad –NH2-terminálisú oligomerhez védett aminocsoportot tartalmazó peptid-nukleinsavat kapcsolunk, a reakció teljességét, sikerességét a Kaiser-teszttel vizsgáljuk. A teszthez négy oldatot használunk: 1. 3,3 mg KCN-ot oldunk 5 ml vízben, ennek 0,2 ml-es részletét piridinnel 10 ml-re egészítjük ki 2. 500 mg ninhidrint 10 ml n-butanolban oldunk 3. 40 g fenolt 10 ml n-butanolban oldunk 4. jégecet A gyanta kis részletét alaposan mossuk, majd az 1, 2, 3. oldatokból két-két cseppet adunk hozzá, és a 4. oldatból egy cseppet. (Ekkor sárga színű oldatot kapunk.) 5 percre 100°C-os szárítószekrénybe tesszük. A kék szín pozitív teszteredményt jelez (szabad aminocsoport még jelen van), a sárga szín negatívat (nincs jelen szabad aminocsoport).
57
5.4. Boc-gerinc szintézis 5.4.1. Boc-etilén-diamin előállítása H2N
O
O
O
O
NH 2 O
O
O
N H
NH 2
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,382 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns
Etilén-diamin (1) Di-tert-butil dikarbonát Oldószerek: Név Dioxán
Összegképlet Limitáló Mt
Mól Bemért Vol Sűrűség (mmol) tömeg (ml) (g/ml) (g) 60,10 8,000 1833 110 124 0,89 218,25 1,000 229 50
C2H8N2 C10H18O5
Ekv
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) BocC7H16N2O2 28,69 EDA (2)
Térfogat (ml) 600
Preparált Termelés Mt Ekv mol (%) (mmol) 179 78 160,21 1,000
Elm. mol (mmol) 229
Elm. tömeg (g) 36,7
Az etiléndiamint dioxánban oldottam és 3 óra alatt hozzácsepegtettem a di-tercbutildikarbonát dioxános oldatát, majd a reakcióelegyet 16 órán át utókevertettem. A dioxánt bepároltam és a maradékhoz 300 ml desztillált vizet adtam. Kevés, fehér szilárd csapadék vált le (Boc-NHCH2CH2NH-Boc) amelyet kiszűrtem. Az anyalúgot 3x150 ml DCM-mel mostam. Az egyesített szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem és bepároltam. A visszamaradó sárga olajat vákuumdesztilláltam. A főpárlat 0,4 Hgmm nyomáson 130-132 oC-on desztillált. Rf (3): 0,85; (4). 0,36 MS m/z számolt: 160,12, mért: 161,0 [M+H]+ 1 H NMR (DMSO) δ = 1,38 (s, 9H), 2,76 (t, 2H ), 3,42 (t, 2H) 13 C NMR (DMSO) d = 28,9, 42,3, 44,3, 78,0, 156,3
58
5.4.2. N-(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilészter (Boc-gerinc) szintézise O O
O
O N H
NH 2
Br
N O
O
N H
H N
O O
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,608 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Boc-EDA (2) Brómecetsavetilészter TEA Oldószerek: Név DMF
Összegképlet Limitáló Mt
Ekv
C7H16N2O2 C4H7BrO2
Mól Bemért Vol Sűrűség (mmol) tömeg (g) (ml) (g/ml) 14,6 160,21 1,000 91 16,74 11,09 1,51 167,00 1,100 100
C6H15N
101,19 2,000 182
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) BocC11H22N2O4 20,41 gerinc (3)
18,44
25,6 0,72
Térfogat (ml) 150
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 83 91 246,30 1,000 91
Elm. tömeg (g) 22,45
A Boc-EDA-t DMF-ben oldottam és hozzáadtam a TEA-t. Keverés közben 3 óra alatt hozzácsepegtettem a brómecetsav-etilésztert, majd 4 órán át kevertettem. Éjszaka állni hagytam. Az elegyet leszűrtem és bepároltam. A maradékot 250 ml DCM-ben oldottam és 3x100 ml telített NaHCO3-oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem és bepároltam. Kromatográfiával tisztítottam (Kloroform - kloroform : metanol 99:1 gradiens elúció). Sűrű sárga olajszerű anyagot kaptam. Rf (3): 0,45 (4): 0,15 MS m/z számolt: 246,16; mért: 247,0 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,29 (t, 3H), 1,38 (s, 9H), 1,79 (s, 1H) 2,63 (t, 2H) 3,18 (t, 2H ), 3,36 (s, 2H,) 4,13 (m, 2H) 7,95 (s, 1H) 13 C NMR (CDCl3) d = 14,4; 28,6; 40,3; 48,9; 50,6; 60,9; 78,2; 156,3; 172,6
59
5.5. 5-jód-uracil PNS monomer szintézis 5.5.1. (5-jód-uracil-1-il)-ecetsav terc-butil észter előállítása O
I
HN O
K2CO3
O Br
N H
O
N O
O O
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet Reaktánsok: Reaktáns
0,429 M 20-25 °C
Összegképlet
5-jód-uracil (4) Brómecetsav-tercbutilészter Kálium-karbonát
C4H3IN2O2 C6H11BrO2
Mól Bemért Vol Sűrűség (mmol) tömeg (ml) (g/ml) (g) 237,98 1,000 150 35,7 195,05 1,105 166 32,3 24,5 1,32
CK2O3
138,21 0,598 90
Oldószerek: Név DMF
Limitáló Mt
Ekv
Arány
Termékek: Termék Összegképlet
5
I
HN
O
12,4
Térfogat (ml) 350
Preparált Preparált Termelés Mt Ekv tömeg mol (%) (g) (mmol) 46,46 132 88 352,13 1,000
C10H13IN2O4
Elm. Elm. tömeg mol (mmol) (g) 150 52,8
Az 5-jód-uracilt DMF-ben oldottam. Hozzáadtam a kálium-karbonátot és 1 órán át szobahőmérsékleten kevertettem. Keverés közben hozzácsepegtettem a brómecetsavtercbutilésztert, 5 órán át utókevertettem, majd éjszakára állni hagytam. A káliumbromidot kiszűrtem, a DMF-et bepároltam. A maradékot 400 ml klorformban oldottam és 3x70 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem és bepároltam.
Sárgás
színű
szilárd
anyagot
kaptam,
amelyet
EtOAc-hexánból
átkristályosítottam. Fehér kristályos anyagot kaptam. Kiszűrtem, az anyalúgot bepároltam és kloroform – metanol 19-1 eluens alkalmazásával kromatográfiásan tisztítottam. Rf (1): 0,73, (3): 0,73, op.: 185-187 oC MS m/z számolt: 352,13; mért: 352,7 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,45 (s, 9 H), 4,45 (s, 2 H), 8,06 (s, 1 H), 11,78 (s, 1 H) 13 C NMR (CDCl3) d = 27,8; 49,1; 67,7; 82,4; 149,7; 150,7; 161,0; 166,6 60
5.5.2. (5-jód-uracil-1-il)-ecetsav előállítása O
O
I
HN
F O
N
F O
F
I
HN
OH
N
O
O
O
O
OH
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet Reaktánsok: Reaktáns
0,170 M 20-25 °C
Összegképlet Limitáló Mt
Mól Bemért (mmol) tömeg (g) 352,13 1,000 51,1 18 114,02 25,4 1298 148
5 C10H13IN2O44 Trifluorecetsav C2HF3O2 Oldószerek: Név DCM
Arány
Termékek: Termék Összegképlet
6
Ekv
Vol Sűrűség (ml) (g/ml) 100 1,48
Térfogat (ml) 300
Preparált Preparált Termelés Mt Ekv tömeg mol (%) (g) (mmol) 15,05 50,8 99 296,02 1,000
C6H5IN2O4
Elm. Elm. tömeg mol (mmol) (g) 51,1 15,13
Az (5-jód-uracil-1-il)-ecetsav terc-butil észtert 300 ml DCM-ben szuszpendáltam és hozzáadtam 100 ml TFA-t. 4 órán át szobahőmérsékleten kevertettem. Az elegyet bepároltam és a maradékot 150 ml MeOH-al szuszpendáltam. Szűrtem és szárítottam. Fehér kristályos anyagot kaptam. Rf (5):0,56; (11):0,62; op.: 230-234 oC MS m/z számolt: 295,93; mért: 295,0 [M-H]1 H NMR (CDCl3) δ = 7,20 (s, 1 H), 7,84 (s, 1 H), 9,07 ( s, 2 H), 10,96 (s, 1 H) 13 C NMR (CDCl3) d = 49,1; 67,7; 149,7; 150,7; 161,4; 169,6
5.5.3. N-(5-jód-uracil-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter (5jód-uracil PNS monomer) szintézise O
O
O
N
I
HN
O N
O O
N
N H
H N
N
O O
N O
O
N
O
61
N O
O
N
OH
I
HN
BF4
N H
N
O O
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet
0,209 M 20-25 °C
Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet
Bocgerinc (3) 6 TBTU TEA
C6H5IN2O4
Mól Bemért Vol Sűrűség (mmol) tömeg (ml) (g/ml) (g) 9,91 296,02 1,000 33,5
C11H22N2O4 C11H16BF4N5O C6H15N
246,30 1,102 36,9 321,08 1,050 35,2 101,19 3,200 107
Oldószerek: Név DMF Termékek: Termék
5-jód-uracil PNS monomer (7)
Limitáló Mt
Ekv
Arány
Összegképlet Preparált tömeg (g) C17H25IN4O7 15,79
9,09 11,29 10,84
15,06 0,72
Térfogat (ml) 160
Preparált Termelés Mt Ekv mol (%) (mmol) 30,1 90 524,31 1,000
Elm. mol (mmol) 33,5
Elm. tömeg (g) 17,55
A Boc-gerincet DMF-ben oldottam, majd hozzáadtam az (5-jód-uracil-1-il)-ecetsavat, a TBTU-t és a TEA-t. Szobahőmérsékleten kevertettem 3 órán keresztül, majd az oldószert bepárlással eltávolítottam. Sűrű sárga olaj maradt vissza, melyet 250 ml DCM-ben oldottam és 3x60 ml telített NaHCO3 oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (elunens: CHCl3 : MeOH 19:1). Halványsárga kristályos anyaghoz jutottam. Rf (6): 0,86, Rf (3): 0,49 és Rf (4): 0,25, Rf (9): 0.68, op.: 138-140 oC MS m/z számolt: 524,08; mért: 547,0 [M+Na]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,29 (t, 3H), 1,46 (s, 9 H), 3,33 (t, 2H), 3,53 (t, 2H) 4,06 (s, 2H), 4,21 (m, 2H), 4,62 (s 2H), 5,52 (s, 1H), 7,88 (s, 1H), 8,90 (s, 1H) 13 C NMR (CDCl3) d = 14,2; 28,5; 38,5; 48,0; 48,7; 50,2; 61,4; 68,1; 79,5; 149,7; 151,0; 156,3; 161,3; 167,2; 169,2
62
5.6. Stille-kapcsolások 5.6.1. N-[5-(2-furanil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicinetilészter szintézise O HN O
O
HN Pd(PPh3 )4
N O
Boc
O
I
N H
N
O
Sn
O
N O
O Boc
O
N H
O
N
O
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,131 M Hőmérséklet 90 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt
1
2
3
5-jódC17H25IN4O7 uracil-PNA monomer (7) tributilC16H30OSn furán-2-ilsztannán Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd
Oldószerek: Név 1 Dioxán
Ekv
524,31
Mól Bemért Vol Sűrűség % Wt (mmol) tömeg (ml) (g/ml) (%) (g) 0,987 6,48 3,40
357,12
1,500 9,86
1155,56 0,020 0,130
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 8a C21H28N4O8 2,15
3,63
3,2
1,134
97
0,15
Térfogat (ml) 50
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 4,63 70,4 464,47 1,000 6,57
Elm. tömeg (g) 3,05
Az 5-jód-uracil-PNS monomert dioxánban oldottam. Hozzáadtam a Pd(PPh3)4 katalizátort, a tributil-furán-2-il-sztannánt és 90 oC-on 5 órán keresztül kevertettem. Az oldószert eltávolítottam és a maradékot 200 ml DCM-ban oldottam, 3x50 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és szárítottam. Oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc : hexán 1:1 - EtOAc : hexán 9:1) és sárgás barna szilárd anyaghoz jutottam. Rf (9): 0,71; (12): 0,48; op.:185-188 oC 63
MS m/z számolt: 464,19; mért: 465,3 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,27 (t, 3H), 1,46 (s, 9 H), 3,38 (t, 2H), 3,57 (t, 2H), 4,25 (m, 2H), 4,59 (s 2H), 4,74 (s, 2H), 5,52 (s, 1H), 6,35 (s, 1H), 6,40 (s, 1H), 7,00 (s, 1H), 7,88 (s, 1H) 10,4 (s, 1H) 13 C NMR (CDCl3) d = 14,1; 28,4; 38,3; 47,8; 48,2; 49,9; 61,1; 79,1; 106,2; 108,4; 111,6; 128,5; 139,4; 146,3; 150,2; 156,2; 160,9; 167,5; 169,1
5.6.2. N-[5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicinetilészter előállítása O
O I
HN O
Pd(PPh 3)4
N O
Boc
N H
N
S
3
Boc
O
N H
N
O O
0,100 M 90 °C
5-jódC17H25IN4O7 uracilPNA monomer (7) tributilC16H30SSn tiofén-2-ilsztannán Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd
Oldószerek: Név 1 Dioxán
N O
Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt
2
O
Sn
O
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet
1
S
HN
Ekv
524,31
Mól Bemért Vol Sűrűség % (mmol) tömeg (ml) (g/ml) Wt (%) (g) 1,000 1,000 0,524
373,18
1,500 1,500
0,589
1155,56 0,050 0,050
0,058
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 8b C21H28N4O7S 0,35
0,501 1,175
95
Térfogat (ml) 10
Preparált Termelés Mt Ekv mol (%) (mmol) 0,728 72,8 480,53 1,000
Elm. mol (mmol) 1,000
Elm. tömeg (g) 0,481
Az 5-jód-uracil-PNS monomert dioxánban oldottam. Hozzáadtam a Pd(PPh3)4 katalizátort, a tributil-tiofén-2-il-sztannánt és 90 oC-on 6 órán keresztül kevertettem. Az oldószert eltávolítottam és a maradékot 50 ml DCM-ban oldottam, 3x30 ml desztillált vízzel
64
mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és szárítottam. Oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc: hexán 1:1 - EtOAc: hexán 9:1) és sárgás barna szilárd anyaghoz jutottam. Rf (3): 0,55; (9): 0,69; op.: 176-178 oC MS m/z számolt: 480,17; mért: 481,3 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,27 (t, 3H), 1,43 (s, 9 H), 3,37 (t, 2H), 3,55 (t, 2H), 4,25 (m, 2H), 4,59 (s 2H), 4,74 (s, 2H), 5,52 (s, 1H), 7,00 (s, 1H), 7,25 (s, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,68 (s, 1H) 10,4 (s, 1H) 13 C NMR (CDCl3) d = 14,1; 28,4; 38,4; 48,1; 48,5; 61,2; 61,8; 79,2; 109,1; 123,5; 125,1; 126,5; 133,8; 140,8; 150,3; 156,2; 162,2; 167,3; 169,1
5.6.3. N-(5-fenil-uracil-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise O
O I
HN O
HN Pd(PPh 3) 4
N O
Boc
N H
N
O
Sn
O
O Boc
O
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet
2
3 Oldószerek: Név 1 Dioxán
N H
N
O O
0,100 M 90 °C
Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt
1
N
Mól Bemért Vol Sűrűség % (mmol) tömeg (ml) (g/ml) Wt (g) (%) 524,31 1,000 4,01 2,10
5-jódC17H25IN4O7 uracilPNA monomer (7) tributil- C18H32Sn fenilsztannán Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd
367,16 1,500 6,01
2,251
1155,56 0,030 0,120
0,139
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 8c C23H30N4O7 1,140
Ekv
2,001 1,125
Térfogat (ml) 40
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 2,403 60 474,51 1,000 4,01
65
Elm. tömeg (g) 1,901
98
Az 5-jód-uracil-PNS monomert dioxánban oldottam. Hozzáadtam a Pd(PPh3)4 katalizátort, a tributil-fenil-sztannánt és 90
o
C-on 8 órán keresztül kevertettem. Az oldószert
eltávolítottam és a maradékot 200 ml DCM-ban oldottam, 3x50 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és szárítottam. 30 ml etil-alkoholban oldottam és 1,3 g Zn port adtam hozzá. 2 órán keresztül refluxoltattam. Oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: K-M 19:1). Termékként fehér kristályos anyagot kaptam. Rf (3): 0,53; (9): 0,65; op.: 192-195 oC MS m/z számolt: 474,21, mért: 475,2 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,24 (t, 3H), 1,46 (s, 9 H), 3,25 (t, 2H), 3,56 (t, 2H), 4,05 (m, 2H), 4,16 (s 2H), 4,66 (s, 2H), 5,58 (s, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,28-7,53 (m, 5H) 9,10 (s, 1H)
5.6.4. N-[5-(2-furanil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin szintézise O
O O
HN O
N O
Boc
N H
N
N O
Boc
O
N H
N
O OH
0,093 M 20-25 °C
Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló
Mt
Mól Bemért (mmol) tömeg (g) 464,47 1,000 4,63 2,15 40,00 3,25 15,04
8a C21H28N4O8 Nátrium- NaOH hidroxid
Oldószerek: Név 1 Dioxán
O
O
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet
1 2
O
HN NaOH
Ekv
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 9a C19H24N4O8 1,455
Vol (ml)
Molaritás (molar)
15,04 1
Térfogat (ml) 50
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 3,33 72 436,42 1,000 4,63
Elm. tömeg (g) 2,020
Az N-[5-(2-furanil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilésztert dioxánban oldottam és hozzáadtam a NaOH oldatot. Szobahőmérsékleten kevertettem 4 órán 66
keresztül Az elegyet bepároltam. A maradékot 50 ml EtOAc és 50 ml víz elegyében oldottam. A vizes fázist pH 2-re savanyítottam NaHSO4-oldattal. A szerves fázist az elválasztás után Na2SO4-on szárítottam majd bepároltam. 10 ml etil-alkoholban szuszpendáltam, szűrtem és szárítottam. Rf (5): 0,73; (11): 0,77; op.: 240-244oC MS m/z számolt: 436,16, mért: 437,2 [M+H]+ 1 H NMR (DMSO) δ = 1,46 (s, 9 H), 3,18 (t, 2H), 3,50 (t, 2H), 3,93 (m, 2H), 4,65 (s 2H), 6,41 (s, 1H), 6,55 (s, 1H), 6,93 (s, 1H), 7,40 (s,1H), 7,76 (s, 1H) 11,40 (s, 1H)
5.6.5. N-[5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicinetilészter előállítása O
O
O
NaOH
N O
Boc
N H
N
S
HN
S
HN
O
N O
O Boc O
N H
O
N
OH
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,093 M Hőmérséklet
20-25 °C
Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló 1 2
Mól Bemért (mmol) tömeg (g) 480,53 1,000 4,66 2,24 40,00 8,58 40,0
8b C21H28N4O7S Nátrium- NaOH hidroxid
Oldószerek: Név 1 Dioxán
Ekv
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 9b C19H24N4O7S 1,645
Az
Mt
Vol Molaritás (ml) (molar) 40
1
Térfogat (ml) 50
Preparált Termelés Mt Ekv mol (%) (mmol) 3,64 78 452,48 1,000
Elm. mol (mmol) 4,66
N-[5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilésztert
Elm. tömeg (g) 2,109
dioxánban
oldottam és hozzáadtam a NaOH oldatot. Szobahőmérsékleten kevertettem 4 órán keresztül Az elegyet bepároltam. A maradékot 50 ml EtOAc és 50 ml víz elegyében oldottam. A vizes fázist pH 3-ra savanyítottam NaHSO4-oldattal. A szerves fázist az 67
elválasztás után Na2SO4-on szárítottam majd bepároltam. 10 ml etil-alkoholban szuszpendáltam, szűrtem és szárítottam. Rf (5): 0,70; (11): 0,72; op.: 225-226oC MS m/z számolt: 452,14, mért: 453,2 [M+H]+ 1 H NMR (DMSO) δ = 1,41 (s, 9 H), 3,21 (t, 2H), 3,46 (t, 2H), 4,05 (m, 2H), 4,58 (s 2H), 6,91 (s, 1H), 7,18 (d, 1H), 7,48 (m, 1H), 7,54 (m,1H), 7,65 (m, 1H) 11,40 (s, 1H)
5.6.6. N-[5-(2-fenil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicinetilészter szintézise
O
O
HN
HN NaOH
O
O
N O
Boc
N H
N
N O
O Boc
O
N H
N
O OH
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,038 M Hőmérséklet
20-25 °C
Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló 1 2
Mól Bemért (mmol) tömeg (g) 474,51 1,000 1,138 0,54 40,00 13,18 15,00
8c C23H30N4O7 Nátrium- NaOH hidroxid
Oldószerek: Név 1 Dioxán
Ekv
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 9c C21H26N4O7 0,351
Az
Mt
Vol Molaritás (ml) (molar) 15
1
Térfogat (ml) 30
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 0,785 69 446,45 1,000 1,138
N-[5-(2-fenil-uracil-1-il]-acetil-N-(2-(Boc-amino)etil)-glicin-etilésztert
Elm. tömeg (g) 0,508
dioxánban
oldottam és hozzáadtam a NaOH oldatot. Szobahőmérsékleten kevertettem 4 órán keresztül Az elegyet bepároltam. A maradékot 20 ml EtOAc és 20 ml víz elegyében oldottam. A vizes fázist pH 3-ra savanyítottam NaHSO4-oldattal. A szerves fázist az
68
elválasztás után Na2SO4-on szárítottam majd bepároltam. 10 ml etil-alkoholban szuszpendáltam, szűrtem és szárítottam. Rf (5): 0,65; (11): 0,69; op.: 214-218oC MS m/z számolt: 446,18, mért: 447,2 [M+H]+ 1 H NMR (DMSO) δ = 1,46 (s, 9 H), 3,25 (t, 2H), 3,50 (t, 2H), 4,02 (m, 2H), 4,70 (s 2H), 5,22 (s, 1H), 5,75 (s, 1H), 7,25-7,40 (m, 5H), 7,35 (s, 1H), 9,80 (s, 1H)
5.7. 3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer szintézise 5.7.1. [3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-ecetsav terc-butil észter előállítása O
O I
HN O
NaH
Br
N O
I
N O
O
O
N O
O
O
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet
0,235 M 20-25 °C
Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet 1 2 3
5 PMB-Br NaH
Limitáló
C10H13IN2O4 C8H9BrO HNa
Oldószerek: Név 1 DMF
(5-jód-uracil-1-il)-ecetsav
Ekv
352,13 201,06 24,00
1,000 1,000 1,25
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 15 C18H21IN2O5 20,96
Az
Mt
Mól (mmol) 58,6 58,6 73,3
Bemért tömeg (g) 20,65 11,79 2,93
% Wt (%)
60
Térfogat (ml) 250
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol Elm. mol (%) (mmol) tömeg (mmol) (g) 44,4 76 472,27 1,000 58,6 27,7
terc-butil
észtert
DMF-ben
oldottam.
Argont
buborékoltattam át ez elegyen és 0 oC-ra hűtöttem. Hozzáadtam a NaH-t majd 1 órán át szobahőmérsékleten kevertettem. Hozzácsepegtettem a PMB-Br-ot és 4 órán át kevertettem. 150 ml NaHCO3 oldatot adtam az elegyhez és 4x200 ml EtOAc-tal mostam. Az egyesített szerves fázist 150 ml telített NaCl oldattal mostam, Na2SO4-on szárítottam,
69
szűrtem és bepároltam. Oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc:hexán 1:4 -1:2 ). A csúcsfrakciók bepárlásával fehér kristályos anyaghoz jutottam. Rf (2): 0,76; (7):0,30 ; op,: 135-136 oC MS m/z számolt: 472,05; mért: 472,7 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,42 (s, 9 H), 3,78 (s, 3H), 4,35 (s, 2H), 5,09 (s, 2H), 6,80 (d, 2H), 7,43 (d, 2H), 7,55 (s, 1H) 13 C NMR (CDCl3) d = 28,2; 45,8; 50,8; 55,5, 68,4; 83,9; 113,9; 128,7; 131,1; 147,2; 151,3; 159,5; 160,2; 166,3
5.7.2. [3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-ecetsav előállítása
O
O
O
O
I
N
F
N O
F F
I
N
OH O
O
O
N O
O
OH
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,148 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló 1 2
15 TFA
Oldószerek: Név 1 DCM
Mól (mmol) 472,27 1,000 44,3 114,02 21,97 973
C18H21IN2O5 C2HF3O2
Ekv
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 16 C14H13IN2O5 18,05
A
Mt
Bemért tömeg (g) 20,93 111
Vol Sűrűség (ml) (g/ml) 75
1,48
Térfogat (ml) 300
Ekv Elm. mol Elm. Preparált Termelés Mt mol (%) (mmol) tömeg (mmol) (g) 43,4 98 416,17 1,000 44,3 18,44
[3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-ecetsav
terc-butil
észtert
DCM-ben
szuszpendáltam és hozzáadtam a TFA-t. 4 órán át szobahőmérsékleten kevertettem. Az elegyet bepároltam és a maradékot 75 ml metanolban szuszpendáltam. Szűrtem, szárítottam. Fehér kristályos anyagot preparáltam. Rf (5): 0,76; (11):0,84 ; op,: 216-220 oC MS m/z számolt: 416,17; mért: 415,0 [M-H]-
70
1
H NMR (CDCl3) δ = 3,71 (s, 3H), 4,39 (s, 2H), 5,05 (s, 2H), 6,76 (d, 2H), 7,38 (d, 2H), 7,59 (s, 1H) 13 C NMR (CDCl3) d = 45,7; 50,0; 55,4; 113,9; 128,7; 131,0; 147,5; 151,4; 159,4; 160,3; 169,4
5.7.3. N-[3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)glicin-etilészter (3-PMB-5-jód-uracil PNS monomer) szintézise O
H N
O I
N O
O
O
N H
O
O N O
O
N O OH
I
N
O
N O
O
N
BF4
N N O
O
N
N H
N
O O
N
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0;128 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet 1 2 3 4
16 Bocgerinc TEA TBTU
Oldószerek: Név 1 DMF
Limitáló
Mt
Ekv
Bemért tömeg (g) 16,00 10,42
Vol (ml)
C14H13IN2O5 C11H22N2O4
Mól (mmol) 416,17 1,000 38,4 246,30 1,100 42,3
C6H15N C11H16BF4N5O
101,19 3,000 115 321,08 1,030 39,6
11,67 12,71
16,21 0,72
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 17 C25H33IN4O8 21,93
Sűrűség (g/ml)
Térfogat (ml) 300
Preparált Termelés Mt Ekv mol (%) (mmol) 34,0 89 644,46 1,000
Elm. mol (mmol) 38,4
Elm. tömeg (g) 24,78
A Boc-gerincet DMF-ben oldottam, majd hozzáadtam az [3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil1-il]-ecetsavat, a TBTU-t és a TEA-t. Szobahőmérsékleten kevertettem 3 órán keresztül, majd az oldószert bepárlással eltávolítottam. Sűrű sárga olaj maradt vissza, melyet 300 ml DCM-ben oldottam és 3x70 ml telített NaHCO3 oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4on szárítottam, szűrtem, bepároltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc: hexán 1:4 - 1:1). Fehér kristályos terméket kaptam. Rf (1): 0,29; (2): 0,16; (9): 0.82, op.: 148-149 oC MS m/z számolt: 644,46, mért: 645,1 [M+H]+
71
1
H NMR (CDCl3) δ = 1,27 (t, 3H), 1,46 (s, 9 H), 3,33 (t, 2H), 3,52 (t, 2H), 3,73 (s, 3H), 4,02 (s 2H), 4,21 (m, 2H), 4,62 (s, 2H), 5,05 (s, 2H), 5,50 (s, 1H), 6,80 (d, 2H), 7,41 (d, 1H) 7,53 (s, 1H) 13 C NMR (CDCl3) d = 14,3; 28,7; 38,9; 45,8; 49,2; 48,5; 55,4; 62,0; 68,3; 80,4; 114,0; 128,7; 131,0; 147,7; 151,5; 156,2; 159,4; 160,3; 167,6; 169,8
5.8. Sonogashira-kapcsolások 5.8.1. N-[3-(4-metoxibenzil)-5-feniletinil-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Bocaminoetil)-glicin-etilészter szintézise O I
N O
O
N N O
O O
O
N
N H
N
O O
O
(PPh3)2PdCl2
N O
O
O
O
CuI
N H
N
O O
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0;055 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns
Összegképlet
1 2
17 TEA
C25H33IN4O8 C6H15N
644,46 1,000 101,19 2,000
3
Fenilacetilén
C8H6
102,13 1,200
4
Pd(PPh3)2Cl2
701,90 0,050
5
Réz(I)-jodid
C36H30Cl2P2P d CuI
Oldószerek: Név 1 DMF
Limitál Mt ó
Bemért Vol Sűrűsé Mól (mmol) tömeg (g) (ml) g (g/ml) 0,388 250 0,776 79 0,10 0,72 9 0,466 47,5 0,05 0,94 1 0,019 13,61
190,45 0,050 0,019
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 18a C33H38N4O8 205
Ekv
3,69
Térfogat (ml) 7
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 0,331 85 618,68 1,000 0,388
Elm. tömeg (g) 240
A 3-PMB-5-jód-uracil-PNS monomert DMF-ben oldottam. Hozzáadtam a fenilacetilént, a Pd(II) katalizátort, a CuI-t és a TEA-t. Szobahőmérsékleten kevertettem 1 órán át. Az elegyet bepároltam, a maradékot 50 DCM-ben oldottam. 4x20 ml 5 %-os EDTA oldattal és 72
2x20 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc: hexán 1:3 - 1:1). Sárgásfehér kristályos anyagként állt elő a termék. Rf (1): 0,55; (2): 0,23; op.: 100-105 oC MS m/z számolt: 618,27, mért: 619,3 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,27 (t, 3H), 1,44 (s, 9 H), 3,25 (t, 2H), 3,49 (t, 2H), 3,77 (s, 3H), 4,04 (s, 2H) 4,20 (m, 2H), 4,64 (s, 2H), 5,08 (s, 2H), 5,59 (s, 1H), 6,80 (m, 2H), 7,30 (s, 1H), 7,40-7,50 (m, 5H), 7,43 (m, 2H) 13 C NMR (CDCl3) d = 14,2; 28,6; 38,8; 44,8; 49,2 ; 49,4; 49,5; 62,0; 80,3; 80,8; 93,6; 100,2; 113,9; 122,9; 128,6; 128,7; 131,0; 131,8; 145,5; 150,9; 156,1; 159,3; 161,6; 167,1; 169,4
5.8.2. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(hex-1-inil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Bocaminoetil)-glicin-etilészter előállítása O
N
I
N
O N
O
O
N O
O O
N H
N
O O
O
(PPh 3)2 PdCl2
N O
O
O
O
CuI
N H
N
O O
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0;055 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns
Összegképlet
1 2 3 4 5
C25H33IN4O8 C6H15N C6H10 C36H30Cl2P2Pd CuI
17 TEA 1-hexin Pd(PPh3)2Cl2 Réz(I)-jodid
Oldószerek: Név 1 DMF
Limitáló Mt
644,46 1,000 101,19 2,000 82,14 1,200 701,90 0,050 190,45 0,050
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 18b C31H42N4O8 167
Ekv
Mól Bemért (mmol) tömeg (g) 0,388 250 0,776 79 0,466 38,2 0,019 13,61 0,019 3,69
Vol Sűrűség (ml) (g/ml)
0,109 0,72 0,052 0,73
Térfogat (ml) 7
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 0,279 72 598,69 1,000 0,388
Elm. tömeg (g) 232
A 3-PMB-5-jód-uracil-PNS monomert DMF-ben oldottam. Hozzáadtam az 1-hexint, a Pd(II) katalizátort, a CuI-t és a TEA-t. Szobahőmérsékleten kevertettem 3 órán át. Az 73
elegyet bepároltam, a maradékot 50 ml DCM-ban oldottam. 4x20 ml 5 %-os EDTA oldattal és 2x20 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc: hexán 1:3 1:1). A csúcsfrakciók bepárlása után sárgásfehér kristályos anyag maradt vissza. Rf (1): 0,25; (2): 0,14; (9): 0.78, op.: 152-158 oC MS m/z számolt: 598,69, mért: 599,5 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 0,90 (t, 2H), 1,30 (t, 3H), 1,25 (m, 2H), 1,46 (s, 9 H), 1,60 (m, 2H), 2,40 (t, 2H), 3,24 (t, 2H), 3,48 (t, 2H), 3,76 (s, 3H), 4,03 (s, 2H) 4,20 (s, 2H), 4,60 (s, 2H), 4,86 (s, 1H), 5,08 (s, 2H), 6,80 (m, 2H), 7,28 (s, 1H), 7,42 (m, 2H), 13 C NMR (CDCl3) d = 13,8; 14,3; 19,4; 22,2; 28,5; 30,8; 38,8; 44,7; 49,1; 49,3; 49,5; 55,4; 62,0; 71,6; 80,3; 95,0; 100,7; 113,9; 128,9; 131,0; 144,9; 150,9; 156,1; 159,3; 162,1; 167,1; 169,4
5.8.3. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(prop-1-inil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Bocaminoetil)-glicin-etilészter szintézise O I
N
O
N N
O
O
N O
O O
N H
O
O O
N
(PPh3) 2PdCl2 O
O
O O
CuI
N
N H
N
O O
Reakció körülmények: Reakció 0,055 M molaritás Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns
Összegképlet
1 2 3 4 5
C25H33IN4O8 C3H4 C6H15N C36H30Cl2P2Pd CuI
17 Propin TEA Pd(PPh3)2Cl2 Réz(I)-jodid
Oldószerek: Név 1 DMF
Limitáló Mt
644,46 1,000 40,06 10,000 101,19 2,000 701,90 0,050 190,45 0,050
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 18c C28H36N4O8 177
Ekv
Mól Bemért Vol Sűrűség (mmol) tömeg (ml) (g/ml) (g) 0,388 250 3,88 155 0,776 79 0,109 0,72 0,019 13,61 0,019 3,69
Térfogat (ml) 7
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 0,318 82 556,61 1,000 0,388
74
Elm. tömeg (g) 216
A 3-PMB-5-jód-uracil-PNS monomert DMF-ben oldottam. Hozzáadtam a Pd(II) katalizátort, a CuI-t és a TEA-t. Szobahőmérsékleten propint vezettem az elegybe és kevertettem 3 órán át. Az elegyet bepároltam, a maradékot 50 ml DCM-ben oldottam. 4x20 ml 5 %-os EDTA oldattal és 2x20 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4on szárítottam, szűrtem, bepároltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc: hexán 1:3 - 1:1). Fehér kristályos anyaghoz jutottam. Rf (1): 0,22; (2): 0,14; (9): 0.75, op.: 175-179 oC MS m/z számolt: 555,61; mért: 556,5 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,29 (m, 2H), 1,44 (s, 9 H), 1,80 (s, 3H), 3,42 (t, 2H), 3,48 (t, 2H), 3,76 (s, 3H), 4,13 (m, 2H), 4,60 (s, 2H), 4,86 (s, 1H), 5,12 (s, 2H), 6,85 (m, 2H), 7,25 (s, 2H), 7.30 (s, 1H), 8,08 (bs, 1H)
5.9. Suzuki-kapcsolások 5.9.1. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Bocaminoetil)-glicin-etilészter előállítása
O
O I
N O
O
N O
O O
N H
N
OH B OH
S O
S
N
Pd(PPh3)4 O
O
N O
O
K2CO3
O
O
N H
N
O O
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,055 M Hőmérséklet 100 °C Reaktánsok: Reaktáns
Összegképlet Limitáló Mt
1 2 3 4
C25H33IN4O8 C4H5BO2S C72H60P4Pd K2CO3
17 2-tienil-boronsav Pd(PPh3)4 Kálium-karbonát
Oldószerek: Név 1 DMF
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 19a C29H36N4O8S 198
Ekv
Mól (mmol)
Bemért tömeg (g) 644,46 1,000 0,388 mmol 250 127,96 1,100 0,427 mmol 54,6 1155,56 0,020 7,76 µmol 8,97 138,21 2,200 0,853 mmol 118
Térfogat (ml) 7
Preparált Termelés Mt Ekv mol (%) (mmol) 0,330 85 600,68 1,000
75
Elm. mol (mmol) 0,388
Elm. tömeg (g) 233
A 3-PMB-5-jód-uracil-PNS monomert DMF-ben oldottam. Hozzáadtam a 2-tienilboronsavat, a Pd(0)-katalizátort és a kálium-karbonátot. 100 oC-on kevertettem 5 órán át. Az elegyet bepároltam, a maradékot 50 ml DCM-ban oldottam. és 3x30 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (elunens: EtOAc: hexán 1:3 - 1:1). Fehér kristályos anyag keletkezett. Rf (1): 0,50; (2): 0,25; (9): 0.85, op.: 140-142 oC MS m/z számolt: 600,68, mért: 623,4 [M+Na]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,24 (t, 3H), 1,43 (s, 9 H), 3,35 (t, 2H), 3,53 (t, 2H), 3,77 (s, 3H), 4,02 (d, 2H), 4,12 (m, 2H), 4,61 (s, 2H), 5,08 (s, 2H), 6,82 (m, 2H), 7,41 (m, 2H), 7,59 (m, 1H), 8,88 (m, 2H) 9,27 (s, 1H) 13 C NMR (CDCl3) d = 14,3; 28,7; 38,9; 44,8; 45,9; 49,5; 55,4; 62,0; 68,3; 80,4; 114,0; 124,4; 126,9; 128,7; 130,9; 131,0; 138,7; 147,6; 151,5; 156,2; 159,4; 160,3; 167,1; 167,6; 169,8
5.9.2. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(bifenil-4-il)-uracil-1-il]-acetil-N-(2-Bocaminoetil)-glicin-etilészter szintézise O
O I
N O
O
N
O O
N H
N
OH
O
O
O
B O
N
Pd(PPh 3) 4
OH
N O
O
K2CO3
O
O
N H
N
O O
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,055 M Hőmérséklet 100 °C Reaktánsok: Reaktáns
Összegképlet Limitáló Mt
1 2 3 4
C25H33IN4O8 C12H11BO2 C72H60P4Pd K2CO3
17 Bifenil-boronsav Pd(PPh3)4 Kálium-karbonát
Oldószerek: Név 1 DMF
Bemért tömeg (g) 644,46 1,000 0,388 mmol 250 198,03 1,300 0,504 mmol 100 1155,56 0,020 7,76 µmol 8,97 138,21 2,200 0,853 mmol 118
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g)
Ekv
Mól (mmol)
Térfogat (ml) 7
Preparált Termelés Mt mol (%) (mmol)
76
Ekv
Elm. mol Elm. (mmol) tömeg (g)
Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 19b C37H42N4O8 117
1
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 0,175 45 670,75 1,000 0,388
Elm. tömeg (g) 260
A 3-PMB-5-jód-uracil-PNS monomert DMF-ben oldottam. Hozzáadtam a bifenilboronsavat, a Pd(0)-katalizátort és a kálium-karbonátot. 100 oC-on kevertettem 5 órán át. Az elegyet bepároltam, a maradékot 50 ml DCM-ban oldottam és 3x30 ml desztillált vízzel mostam.
A
szerves
fázist
Na2SO4-on
szárítottam,
szűrtem,
bepároltam
és
oszlopkromatográfiával tisztítottam (elunens: EtOAc: hexán 1:2 - 2:1). A reakció eredményeként fehér kristályos anyag keletkezett. Rf (1): 0,45(2): 0,21 (9): 0,78 op.: 155-158 oC MS m/z számolt: 670.75, mért: 693,4 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,27 (t, 3H), 1,40 (s, 9 H), 3,38 (t, 2H), 3,51 (t, 2H), 3,78 (s, 3H), 4,09 (dd, 2H), 4,18 (m, 2H), 4,57 (s, 2H), 5,01 (s, 2H), 5,18 (s, 2H) 6,84 (m, 2H), 7.25 (m, 2H), 7,40 (m, 2H), 7,5 (m, 4H), 7.59 (m, 2H), 8,88 (m, 2H) 9,27 (s, 1H)
5.9.3. N-[3-(4-metoxibenzil)- 5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]-acetil-N(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilészter előállítása O
O I
N O
O
N O
O O
N H
S O
N
OH B OH
S
N
Pd(PPh 3) 4 O
O
N O
O
K2CO3 O
O
N H
N
O O
Reakció körülmények: Reakció 0,055 M molaritás Hőmérséklet 100 °C Reaktánsok: Reaktáns
1 2 3 4
17 benzo[b]tiofén-2-il boronsav Pd(PPh3)4 Kálium-karbonát
Oldószerek: Név 1 DMF
Összegképlet Limitáló Mt
C25H33IN4O8 - C8H7BO2S C72H60P4Pd K2CO3
Arány
Ekv
Mól (mmol)
Bemért tömeg (g) 644,46 1,000 0,388 mmol 250 178,02 1,300 0,504 mmol 90 1155,56 0,020 7,76 µmol 8,97 138,21 2,200 0,853 mmol 118
Térfogat (ml) 7
Termékek:
77
Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 19c C33H38N4O8S 159
1
Preparált Termelés Mt Ekv mol (%) (mmol) 0,244 63 650,74 1,000
Elm. mol (mmol) 0,388
Elm. tömeg (g) 252
A 3-PMB-5-jód-uracil-PNS monomert DMF-ben oldottam. Hozzáadtam a boronsavat, a Pd(0)-katalizátort és a kálium-karbonátot. 100 oC-on kevertettem 5 órán át. Az elegyet bepároltam, a maradékot 50 ml DCM-ban oldottam és 3x30 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (elunens: EtOAc: hexán 1:2 - 2:1). Fehér kristályos anyaghoz jutottam. Rf (1): 0,48; (2): 0,23 (9): 0,81 op.: 181-183 oC MS m/z számolt: 650,74, mért: 651,6 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,29 (t, 3H), 1,41 (s, 9 H), 3,42 (t, 2H), 3,48 (t, 2H), 3,81 (s, 3H), 4,12 (dd, 2H), 4,38 (m, 2H), 4,77 (s, 2H), 5,18 (s, 2H) 6,82 (m, 2H), 7.23 (m, 2H), 7,50 (m, 2H), 7,61 (m, 1H), 7.79 (m, 1H), 7.96 (m,1H), 8.03 (bs, 1H), 9,28 (s, 1H)
5.9.4. N-[3-(4-metoxibenzil)- (5-(4-dimetilamino)fenil)-uracil-1-il]-acetilN-(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise O N O
O
N O
O
N H
N
B
O
OH
O
N
Pd(PPh3) 4
OH
N
O
N
O
I
O
K2CO3
N O
O
O
O
N H
N
O O
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,055 M Hőmérséklet 100 °C Reaktánsok: Reaktáns
Összegképlet Limitáló Mt
1 2
C25H33IN4O8 C8H12BNO2
Bemért tömeg (mg) 644,46 1,000 0,388 mmol 250 165,00 1,300 0,504 mmol 83
C72H60P4Pd K2CO3
1155,56 0,020 7,76 µmol 8,97 138,21 2,200 0,853 mmol 118
3 4
17 Dimetilaminofenilboronsav Pd(PPh3)4 Kálium-karbonát
Oldószerek: Név 1 DMF
Arány
Ekv
Mól (mmol)
Térfogat (ml) 7
Termékek:
78
1
Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 19d C33H43N5O8 92
A
3-PMB-5-jód-uracil-PNS
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 0,144 37 637,72 1,000 0,388
monomert
DMF-ben
oldottam.
Elm. tömeg (mg) 247
Hozzáadtam
a
4-
dimetilaminofenil-boronsavat, a Pd(0)-katalizátort és a kálium-karbonátot. 100 oC-on kevertettem 5 órán át. Az elegyet bepároltam, a maradékot 50 ml DCM-ban oldottam és 3x30 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és oszlopkromatográfiával tisztítottam (elunens: EtOAc: hexán 1:2 - 2:1). Termékként fehér kristályos anyagot preparáltam. Rf (1): 0,54; (2): 0,27, (9): 0,85 op.: 156-158 oC MS m/z számolt: 637,72, mért: 638,6[M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,28 (t, 3H), 1,43 (s, 9H), 2,94 (s, 6H), 3,34 (d, 2H), 3,55 (d, 2H), 3,76 (s, 3H), 4,05 (s, 2H), 4,20 (m, 2H), 4,62 (s, 2H), 5,10 (s, 2H), 6,70 (d, 2H), 6,81 (d, 2H), 7,15 (s, 1H), 7,21 (s, 1H), 7,37 (d, 2H), 7,46 (m, 2H)
5.10. In situ szilezés Suzuki kapcsolás során 5.10.1. [5-(2-tienil)-uracil-1-il]-ecetsav terc-butil észter előállítása
O O I
HN O
OH
Si
B S
OH O
N Si
S
HN
Na 2CO3
O
N
N O
O Pd(PPh3)4
O
O
Reakció körülmények: 0,100 M Reakció molaritás 95 °C Hőmérséklet
Reaktánsok: Reaktáns 1 2 3
Összegképlet
Limitáló
2-tienilC4H5BO2S boronsav 5 C10H13IN2O4 BSA C8H21NOSi2
79
Mt
Ekv 0,750
Mól (mmol) 1,500
Bemért tömeg (g) 0,192
127,96 352,13 203,43
1,000 2,000
2,00 4,00
0,704 0,814
Reaktáns 4 5
Összegképlet
Nátrium- CNa2O3 karbonát Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd
Oldószerek: Név 1
Limitáló
Mt
Ekv 1,000
Mól (mmol) 2,000
Bemért tömeg (g) 0,212
105,99 1155,56
0,025
0,05
0,058
Arány
Térfogat (ml)
Dioxán
20
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 C14H16N2O4S 0,130
Preparált Termelés Mt Ekv mol (%) (mmol) 0,422 42,2 308,35 0,500
Elm. mol (mmol) 1,000
Elm. tömeg (g) 0,308
Az 5-jód-uracil-1-il)ecetsav-terc.butil-észtert absz. dioxánban oldottam és ehhez N,Obisz-trimetilszilil-acetamidot
(BSA) adtam.
Az
elegyet
2
órán
át
kevertettem
szobahőmérsékleten majd az így kapott szilil vegyület oldatát két egyenlő részre osztottam. Az egyik feléhez argon alatt Na2CO3-ot, 2-tienil-boronsavat és végül Pd(PPh3)4-t adtam. Az elegyet 95 oC-on 15 órán át kevertettem, majd oldatlan részt kiszűrtem és a szűrletet bepároltam. A maradékot 30 ml CHCl3-ban oldottam és 15 ml telített NaHCO3 oldattal majd ugyanennyi telített NaCl oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-tal szárítottam szűrtem és bepároltam. Az így kapott szilárd maradékot oszloponkromatográfiával, hexánEtOAc 6:1→1:1 lineáris gradienssel eluálva tisztítottam. A csúcs frakciók egyesítése és bepárlása után fehér szilárd anyagot izoláltam Rf (2): 0,32 ESI MS m/z számolt: 308,3 mért:309,1 [M+H]+ 1 H NMR (DMSO-d6) δ = 1,40 (s, 9H); 4,45 (s, 2H), 7,04 (dd, 1H); 7,37 (dd, 1H); 7,43 (dd, 1H); 8,27 (s, 1H); 11,7 (bs, 1H) 13 C NMR (DMSO-d6) d = 28,1; 49,6; 82,5; 108,1; 123,2; 126,1; 127,0; 134,1; 141,9; 151,1; 162,2; 167,4
80
5.10.2. [5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]ecetsav t-butil észter OH O O I
HN O
Si
B S
OH O
N Si
S
HN
Na2CO3
O
N
N O
O Pd(PPh3)4
O
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet Reaktánsok: Reaktáns 1
2 3 4 5
0,100 M 95 °C
Összegképlet
Limitáló
C8H7BO2S 2benzo[b]tiofénboronsav 5 C10H13IN2O4 BSA C8H21NOSi2 NátriumCNa2O3 karbonát Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd
Oldószerek: Név 1 Dioxán
O
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 C14H16N2O4S 0,183
Mt
Ekv
178,02
0,750
Mól Bemért (mmol) tömeg (g) 1,500 0,267
352,13 203,43 105,99
1,000 2,000 1,000
2,00 4,00 2,000
0,704 0,814 0,212
1155,56
0,025
0,05
0,058
Térfogat (ml) 20
Preparált Termelés Mt Ekv mol (%) (mmol) 0,511 51,1 358,41 0,500
Elm. mol (mmol) 1,000
Elm. tömeg (g) 0,358
Az előzőekben leírt szililvegyület oldatának másik feléhez argon atm.-ban Na2CO3-ot, 2benzo[b]tiofén-boronsavat és végül Pd(PPh3)4-t adtam Az elegyet 15 órán át kevertettem 95 oC-on, majd oldatlan részt kiszűrtem és a szűrletet bepároltam. A maradékot 30 ml CHCl3-ban oldottam és 15 ml telített NaHCO3 oldattal majd ugyanennyi telített NaCl oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-tal szárítottam szűrtem és bepároltam. Az így kapott szilárd maradékot oszloponkromatográfiával, hexán- EtOAc 6:1→1:1 lineáris gradienssel eluálva tisztítottam. A csúcs frakciók egyesítése és bepárlása után enyhén drapp színű szilárd anyagot izoláltam. Rf (2): 0,37 81
ESI MS m/z számolt: 358,3 mért: 359,1 [M+H]+ 1 H NMR (DMSO-d6) δ = 1,40 (s,9H); 4,51 (s,2H), 7,27 (t,1H); 7,32 (t, 1H); 7,76 (d, 1H); 7,77 (s,1H); 7,88 (d, 1H); 8,41 (m, 1H); 11,8 (bs,1H) 13 C NMR (DMSO-d6) d = 28,1; 50,0; 82,5; 107,7; 119,9; 122,4; 123,5; 124,6; 124,9; 135,2; 139,1; 139,5; 143,7; 150,3; 162,2; 167,4
5.10.3. N-[5-(2-tienil)-uracil-1-il]acetil-N-[2-(Boc-amino)etil]-glicinetilészter előállítása O
O
I
N H
N
Pd(PPh3)4
1
Boc
O
N H
N
O O
0,050 M 95 °C
1 2 3
Oldószerek: Név
N O
Összegképlet
7 BSA 2-tienilboronsav Nátriumkarbonát Pd(PPh3)4
S
HN
Na2 CO3
O
Reaktánsok: Reaktáns
5
O
O
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet
4
OH B OH
N O
Boc
S
N Si
O HN
Si
Limitáló
Mt
Ekv
C17H25IN4O7 C8H21NOSi2 C4H5BO2S
524,31 203,43 127,96
CNa2O3 C72H60P4Pd
Arány
Bemért tömeg (mg) 0,524 0,407 0,128
105,99
1,500
1,500
0,159
1155,56
0,050
0,050
0,058
Térfogat (ml)
Dioxán
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 C21H28N4O7S 0,055
1,000 2,000 1,000
Mól (mmol) 1,000 2,000 1,000
20
Preparált Termelés Mt Ekv mol (%) (mmol) 0,114 22,89 480,53 0,500
Elm. mol (mmol) 0,500
Elm. tömeg (mg) 0,240
Az N-(5-jód-uracil-1-il)acetil-N-[2-(Boc-amino)etil]-glicin etilésztert absz. dioxánban oldottam és ehhez BSA-t adtam és az elegyet 2 órán át kevertettem szobahőmérsékleten. Az így kapott szilil vegyület oldatát 2 egyenlő részre osztottam. Az egyik feléhez argon atm.-ban Na2CO3-ot, 2-tienil-boronsavat és végül Pd(PPh3)4-t adtam. Az elegyet 95 oC-on
82
2,5 órán át kevertettem, majd az oldatlan részt nuccson szűrtem és a szűrletet bepároltam. A maradékot 30 ml CHCl3-ban oldottam és 15 ml telített NaHCO3 oldattal majd ugyanennyi telített NaCl oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-tal szárítottam, szűrtem és bepároltam. A sárga szilárd maradékot szilikagél oszlopon CHCl3 → CHCl3-MeOH (5%) lineáris gradienssel eluálva kromatografáltam. A terméket a csúcsfrakciók egyesítése és bepárlása után izoláltam fehér szilárd anyag formában. Rf (12): 0,46 ESI MS m/z számolt: 480,49; mért: 481,3 [M+H]+ 1 H NMR (DMSO-d6) δ = 1,14 és 1,22 (2t, 3H); 1,35 (s, 9H); 3,16 (t, 2H); 3,40 (m, 2H), 4,02 és 4,29 (2s, 2H); 4,05 és 4,16 (2q, 2H); 4,77 és 4,60 (2s, 2H); 7,03 (dd, 1H); 7,36 (dd, 1H); 7,42 (dd, 1H); 8,10 és 8,06 (2s, 1H); 11,7 (bs, 1H) 13 C NMR (DMSO-d6 d = 14,4; 28,6; 38,8; 47,4; 48,4; 48,6; 61,0; 78,5; 107,9; 123,0; 126,0; 126,9; 134,2; 142,3; 150,4; 156,2; 162,2; 167,6; 169,4
5.10.4. N-[5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]acetil-N-[2-(Boc-amino)etil]glicin etilészter O
N Si
O I
HN O
N H
N
Reaktánsok: Reaktáns
4 5
O
N O
O
Pd(PPh3)4
Boc
O
N H
N
O O
0,050 M 95 °C
Összegképlet
Limitáló
7 C17H25IN4O7 BSA C8H21NOSi2 2C8H7BO2S benzo[b]tiofénboronsav NátriumCNa2O3 karbonát Pd(PPh3)4 C72H60P4Pd
Oldószerek: Név 1 Dioxán
S
HN O
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet
1 2 3
S
OH B OH Na2 CO3
N O
Boc
Si
Arány
Mt
Ekv 1,000 2,000 1,000
Mól (mmol) 1,000 2,000 1,000
Bemért tömeg (mg) 0,524 0,407 0,178
524,31 203,43 178,02
105,99
1,500
1,500
0,159
1155,56
0,050
0,050
0,058
Térfogat (ml) 20
83
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 C21H28N4O7S 0,107
Preparált Termelés Mt Ekv mol (%) (mmol) 0,202 40,3 530,59 0,500
Elm. mol (mmol) 0,500
Elm. tömeg (mg) 0,265
Az előzőekben leírt szililvegyület oldatának másik feléhez argon atm.-ban 1,5 mmól = 160 mg Na2CO3-ot, 1,0 mmól = 178 mg tianaftén-2-boronsavat végül 0,05 mmól = 58 mg Pd(PPh3)4-t adtam. Az elegyet 95 oC-on 2,5 órán át kevertettem, majd az oldatlan részt nuccson szűrtem és a szűrletet bepároltam. A maradékot 30 ml CHCl3-ban oldottam és 15 ml telített NaHCO3 oldattal majd ugyanennyi telített NaCl oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-tal szárítottam, szűrtem és bepároltam. A sárga szilárd maradékot szilikagél oszlopon CHCl3 → CHCl3-MeOH (5%) lineáris gradienssel eluálva kromatografáltam. A terméket a csúcsfrakciók egyesítése és bepárlása után fehér szilárd formában izoláltam. Rf (12): 0,49 ESI MS m/z számolt: 530,55 mért: 553,2 [M+Na]+ 1 H NMR (DMSO-d6) δ = 1,14 és 1,22 (2t, 3H); 1,33 (s, 9H); 3,19 (t, 2H); 3,40 (m, 2H); 4,03 és 4,31 (2s, 2H); 4,04 és 4,16 (2q, 2H); 4,83 és 4,65 (2s, 2H); 7,27 (t, 1H); 7,32 (t, 1H); 7,76 (d, 1H); 7,77 (s, 1H), 7,88 (d, 1H); 8,25 és 8,20 (2s, 1H); 11,8 (bs, 1H) 13 C NMR (DMSO-d6) d = 14,4; 28,6; 38,0; 47,6; 48,4; 48,7; 61,0; 78,5; 107,5; 119,0; 122,4; 123,5; 124,5; 124,9; 135,3; 139,0; 139,5 144,0; 150,3; 156,3; 162,2; 167,8; 169,4
5.11. Timin PNS monomer szintézise 5.11.1. timin-1-il-ecetsav O
O
KOH HN
HN O
N H
O
OH
Br
N OH
O O
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet
1,586 M 40 °C
Reaktánsok: Reaktáns
Összegképlet Limitáló
Mt
Ekv
1 2 3
C5H6N2O2 KOH C2H3BrO2
126,11 56,11 138,95
1,000 3,84 1,503
Timin KOH BrCH2COOH
Oldószerek: Név
Arány
Mól (mmol) 39,6 152 59,6
Térfogat (ml)
84
Bemért tömeg (g) 5,00 8,55 8,28
1
Név víz
Arány
Termékek: Termék Összegképlet
1
Térfogat (ml) 25
Preparált Preparált Termelés Mt Ekv tömeg mol (%) (g) (mmol) 3,36 18,25 46,0 184,15 1,000
C7H8N2O4
Elm. Elm. tömeg mol (mmol) (g) 39,6 7,30
A kálium-hidroxidot vízben oldottam majd hozzáadtam a timint. Az elegyet 40 oC-ra melegítettem és hozzáadtam a brómecetsav 15 ml vízzel készített oldatát. 6 órán keresztül kevertettem majd 0 oC-ra hűtöttem és pH 2-re savanyítottam 1 N HCl oldattal. A fehér csapadékot kiszűrtem, majd 20 ml metil-alkoholban szuszpendáltam és ismét kiszűrtem. Fehér kristályos anyagot izoláltam. Rf (5): 0,43; op.: 261-265 oC ESI MS m/z számolt: 184,15 mért: 185,2 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 2,43 (s, 3H), 4,40 (s, 2H), 7,05 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 9,8 (s, 1H)
5.11.2. N-(timin-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise O O
O
H N
N H
O
O O
HN
N
O
HN O
N O
O
O
N N N O
OH
N
BF4
O
N
N H
N
O O
N Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet
0,182 M 20-25 °C
Reaktánsok: Reaktáns
Összegképlet
1
C7H8N2O4
Mól Bemért (mmol) tömeg (g) 184,15 1,000 18,18 3,35
C11H22N2O4 C6H15N C11H16BF4N5O
246,30 1,100 20,00 101,19 3,000 54,5 321,08 1,100 20,00
2 3 4
T-CH2COOH Boc-gerinc TEA TBTU
Oldószerek: Név 1 DMF
Limitáló Mt
Arány
Ekv
4,93 5,52 6,42
Térfogat (ml) 100
85
Vol Sűrűség (ml) (g/ml)
7,67 0,72
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 C18H28N4O7 6,85
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol Elm. mol (%) (mmol) tömeg (g) (mmol) 16,61 91 412,44 1,000 18,18 7,50
A Boc-gerincet DMF-ben oldottam, hozzáadtam a timin-1-il-ecetsavat , a TBTU-t és a TEA-t. Szobahőmérsékleten kevertettem 3 órán keresztül, majd az oldószert bepárlással eltávolítottam. Sűrű sárga olaj maradt vissza, melyet 250 ml DCM-ban oldottam és 3x60 ml telített NaHCO3 oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és a maradékot oszlopkromatográfiával tisztítottam (elunens: CHCl3 : MeOH 19:1). Fehér kristályos anyaghoz jutottam. Rf (3): 0,43; op.: 112-115 oC ESI MS m/z számolt: 184,15 mért: 185,2 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,29 (t, 3H), 1,44 (s, 9 H), 1,82 (s, 3H ), 3,30 (d, 2H), 3,56 (s, 2H), 4,13 (m, 2H), 4,20 (s, 2H), 4,40 (s, 2H), 5,78 (s, 1H), 7,05 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 9,8 (s, 1H)
5.11.3.
N-(timin-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin
(Timin
PNS
monomer) előállítása O
O
HN O
N
O O
O O
N H
N
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet
O
NaOH
Oldószerek: Név 1 Dioxán
N O
O O
O
N H
O
N
OH
0,158 M 20-25 °C
Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló 1 2
HN
NaOH
Mt
Mól Bemért (mmol) tömeg (g) 412,44 1,000 15,76 6,5 40,00 2,54 40,0
C18H28N4O7 NaOH
Ekv
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 C16H24N4O7 5,31
Vol Molaritás (ml) (M) 40
1
Térfogat (ml) 100
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 13,81 88 384,38 1,000 15,76
86
Elm. tömeg (g) 6,06
A N-(timin-1-il)-acetil-N-(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilésztert dioxán és 1 M NaOH oldat elegyében oldottam. 2 órán keresztül szoba hőmérsékleten kevertettem, majd pH 2,5 –re savanyítottam 1 M NaHSO4 – oldattal. Bepároltam és a maradékhoz 300 ml EtOAc-ot és 100 ml desztillált vizet adtam. Elválasztás után a vizes fázis pH-ját ismét 2,5 – re állítottam és 4x50 ml EtOAc-al mostam. Az egyesített szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és szárítottam. Fehér kristályos anyaghoz jutottam. Rf (5): 0,57, (11): 0,62; op.: 112-115 oC MS m/z számolt: 384,16, mért: 385,2 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,44 (s, 9 H), 1,82 (s, 3H ), 3,30 (d, 2H), 3,56 (s, 2H), 4,20 (s, 2H), 4,40 (s, 2H), 5,78 (s, 1H), 7,05 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 9,8 (s, 1H)
5.12. Citozin PNS monomer szintézise 5.12.1. Uracil-1-il-ecetsav terc-butil észter előállítása O O O
HN O
HN Br
K 2CO 3
O
N
O
N H
O O
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,500 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns
Összegképlet Limitáló Mt
1 2
C4H4N2O2 C6H11BrO2
Mól Bemért Vol Sűrűség (mmol) tömeg (ml) (g/ml) (g) 112,09 1,000 100 11,20 195,05 1,100 110 21,44 16,24 1,32
K2CO3
138,21 0,600 60,0
3
Uracil Brómecetsavtercbutilészter Kálium-karbonát
Oldószerek: Név 1 DMF
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 C10H14N2O4 18,01
Ekv
8,29
Térfogat (ml) 200
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 80 80 226,23 1,000 100
Elm. tömeg (g) 22,61
Az uracilt DMF-ben oldottam, hozzáadtam a kálium-karbonátot és 1 órán át kevertettem. 1 óra alatt hozzácsepegtettem a brómecetsav-tercbutilésztert és 5 órát utóreagáltattam 87
szobahőmérsékleten. A KBr-ot kiszűrtem, az anyalúgot bepároltam. A maradékot 300 ml kloroformban oldottam és 3x50 ml desztillált vízzel mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam. Sárga színű kristályos anyaghoz jutottam, melyet 50 ml dietiléterben szuszpendáltam, majd EtOAc-hexán elegyből átkristályosítottam. Fehér, pelyhes kristályos anyag keletkezett. Rf (1): 0,26; op.: 176-178 oC MS m/z számolt: 226,23, mért: 227,0 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,44 (s, 9H), 4,37 (s, 2H), 5,72 (d, 1H), 7,09 (s, 1H), 9,57 (s, 1H) 13 C NMR (CDCl3) d = 28,2, 49,6, 83,8, 102,7, 144,8, 151,1, 163,9, 166,6
5.12.2.
(2-Oxo-4-[1,2,4]triazol-1-il-2H-pirimidin-1-il)-ecetsav-terc.butil
észter N
Cl Cl P O Cl
O HN
N
N
N O
N
N O O
N H
O
N
N O O
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet
0,181 M 0 °C
Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló 1 2 3
POCl3
Mt
Mól (mmol) 226,23 1,000 81 153,33 3,500 285 69,07 10,500 855
C10H14N2O4 Cl3OP C2H3N3
Oldószerek: Név 1 Piridin
Ekv
Arány
Bemért tömeg (g) 18,43 43,7 59,1
Vol Sűrűség (ml) (g/ml) 26,6 1,65
Térfogat (ml) 450
Termékek: Termék Összegképlet
1
C12H15N5O3
Preparált tömeg (g) 15,18
Preparált Termelés Mt Ekv mol (%) (mmol) 54,7 67,2 277,28 1,000
Elm. mol (mmol) 81
Elm. tömeg (g) 22,59
Az 1,2,4-triazolt piridinben oldottam és jeges vízes hűtés és keverés mellett hozzácsepegtettem a foszfor-oxi-trikloridot. A kivált piridinium-hidrokloridot kiszűrtem. Jeges-vizes hűtés közben becsepegtettem az uracil-1-il-ecetsav-tercbutilészter piridines
88
oldatát. 6 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertettem. 120 ml (856,5 mmol) trietilamint adtam hozzá, leszűrtem és az elegyet bepároltam. A maradékot 500 ml diklórmetánban vettem fel és 3x150 ml telített NaHCO3 oldattal mostam. Na2SO4-on szárítottam, szűrtem és bepároltam. Oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc : MeOH 19:1). Rf (1): 0,35; MS m/z számolt: 277,28, mért: 278,0 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,44 (s, 9 H), 4,60 (s, 2H), 7,04 (s, 1H), 7,81 (s, 1H), 8,12 (s, 1H), 9,14 (s, 1H) 13 C NMR (CDCl3) d = 28,2, 52,2, 84,2, 95,1, 143,5, 151,4, 154,3, 155,2, 160,0, 166,0
5.12.3. Citozin-1-il-ecetsav-terc.butil észter előállítása N N
NH 2
N N
NH3
N
O O
N
N
O O O O
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,213 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló Mt 1 2 Oldószerek: Név 1 Dioxán
Mól Bemért (mmol) tömeg (g) 14,76 277,28 1,000 53,2 17,03 68,9 3670 250
C12H15N5O3 H3N
Ekv
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 C10H15N3O3 11,42
Vol Sűrűség % Wt (ml) (g/ml) (%) 250 1
25
Térfogat (ml) 250
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 50,7 95 225,24 1,000 53,2
Elm. tömeg (g) 11,99
A (2-Oxo-4-[1,2,4]triazol-1-il-2H-pirimidin-1-il)-ecetsav-terc.butil észtert oldottam dioxán és 25%-os ammónia-oldat elegyében. Egy éjszakán át kevertettem. Az elegyet bepároltam, a maradékot dietiléterben szuszpendáltam. Rf (3): 0,35; MS m/z számolt: 225,24, mért: 226,1 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,40 (s, 9 H), 4,48 (s, 2H), 6,65 (s, 2H), 7,24 (d, 1H), 7,65 (s, 1H) 89
5.12.4. (4-Z-citozin-1-il)-ecetsav-terc.butil észter szintézise O
NH2
O
N O
O
O
Cl
N
N O
O O
NH
N O
N
N
O
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,420 M Hőmérséklet -15 °C Reaktánsok: Reaktáns
Összegképlet Limitáló Mt
1 2 3
C10H15N3O3 C8H7ClO2 C7H10N2
Z-Cl DMAP
Oldószerek: Név 1 DCM
Ekv
Mól Bemért (mmol) tömeg (g) 225,24 1,000 42,0 9,46 14,33 170,59 2,000 84 10,26 122,17 2,000 84
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 C18H21N3O5 13,95
Vol Sűrűség (ml) (g/ml) 11,99 1,20
Térfogat (ml) 100
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 38,8 92 359,38 1,000 42,0
Elm. tömeg (g) 15,09
A Z-Cl-ot -15 oC-os DCM-ben oldottam és hozzáadtam a DMAP-t. 15 percig -15 oC-on kevertettem. Hozzáadtam a citozin-1-il-ecetsav-terc.butil észtert. 15 percig -15 oC-on majd egy éjszakán át szobahőmérsékleten kevertettem. 30 ml MeOH-t adtam hozzá, és 20 percig kevertettem. Bepároltam majd a maradékot 400 ml kloroformban felvettem és 3x150 ml telített NaHCO3 oldattal mostam. Na2SO4-on szárítottam, szűrtem és bepároltam, végül oszlopkromatográfiával tisztítottam (eluens: EtOAc : MeOH 19:1). Sárgásfehér kristályos termékhez jutottam. Rf (1): 0,30; MS m/z számolt: 359,38, mért: 360,0 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,47 (s, 9 H), 4,51 (s, 2H), 5,21 (s, 2H), 7,24 (d, 1H), 7,33 (m, 5H), 7,53 (d, 2H), 7,64 (s, 1H)
5.12.5. (4-Z-citozin-1-il)-ecetsav előállítása
90
O O
O NH
O
N O
NaOH
N
N
O
O
N O
O
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet
NH
OH
0,219 M 20-25 °C
Reaktánsok: Reaktáns
Összegképlet Limitáló Mt
1 2
C18H21N3O5 NaOH
Nátrium-hidroxid
Oldószerek: Név 1 Dioxane
Mól Bemért (mmol) tömeg (g) 359,38 1,000 17,53 6,3 40,00 4,56 80
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 C14H13N3O5 4,72
Ekv
Vol Molaritás (ml) (M)
80
1
Térfogat (ml) 80
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 15,56 89 303,27 1,000 17,53
Elm. tömeg (g) 5,32
A (4-Z-citozin-1-il)-ecetsav-terc.butil észtert dioxán és NaOH oldat elegyében oldottam. 2 órán át szobahőmérsékleten kevertettem, majd pH 2,5-re savanyítottam 1 M NaHSO4 oldattal. Bepároltam és a maradékhoz 100 ml EtOAc-ot és 80 ml desztillált vizet adtam. Elválasztás után a vizes fázis pH-ját ismét 2,5- re állítottam és 4x40 ml EtOAc-tal mostam. Az egyesített szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és szárítottam. A várt terméket fehér kristályos anyagként preparáltam. Rf (5): 0,57; (11): 0,64; MS m/z számolt: 303,09, mért: 304,2 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 4,53 (s, 2H), 5,18 (s, 2H), 7,03 (d, 1H), 7,35 (m, 5H), 7,85 (d, 1H)
91
5.12.6. N-(4-Z-citozin-1-il)-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise O
O O
O
NH
O
H N
N H
O O
O
N
N
N O
NH
O
N N N O
N O OH
BF4
N O
O
N O N
N H
N
O O
Reakció körülmények: Reakció 0,187 M molaritás Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns 1 2 3 4
Összegképlet
Limitáló Mt
C14H13N3O5 Boc-gerinc C11H22N2O4 TEA C6H15N TBTU C11H16BF4N5O
Oldószerek: Név 1 DMF
303,27 246,30 101,19 321,08
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 C25H33N5O8 6,60
Ekv 1,000 1,100 3,000 1,100
Mól Bemért (mmol) tömeg (g) 14,94 4,53 16,44 4,05 44,8 4,54 16,44 5,28
Vol Sűrűség (ml) (g/ml)
6,30 0,72
Térfogat (ml) 80
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 12,42 83 531,56 1,000 14,94
Elm. tömeg (g) 7,94
A Boc-gerincet DMF-ben oldottam, majd hozzáadtam a (4-Z-citozin-1-il)-ecetsavat, a TBTU-t és a trietilamint. Szobahőmérsékleten kevertettem 1 órán keresztül, majd az oldószert bepárlással eltávolítottam. Sűrű sárga olaj maradt vissza, melyet 200 ml DCMban oldottam és 3x 60 ml telített NaHCO3 oldattal mostam. A szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és szárítottam. Halványsárga kristályos anyaghoz jutottam. Rf (1): 0,45; MS m/z számolt: 531,23, mért: 532,2 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,26 (t, 3H), 1,42 (s, 9 H), 3,18 (d, 2H), 3,60 (d, 2H), 4,06 (s, 2H), 4,20 (d, 2H), 4,60 (s, 2H), 5,20 (s, 2H), 5,75 (s, 1H), 7,03 (d, 1H), 7,25 (m, 5H), 7,69 (d, 1H), 9,65 (s, 1H)
92
5.12.7. N-(4-Z-citozin-1-il)-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-glicin előállítása
O O
O NH
O NaOH
N O
O
O O
N H
N
N O
O
N
NH
N O
O O
O
N H
N
O OH
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,153 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns
Összegképlet Limitáló Mt
1 2
C25H33N5O8 NaOH
Nátrium-hidroxid
Oldószerek: Név 1 Dioxán
Mól Bemért Vol Molaritás (mmol) tömeg (ml) (M) (g) 531,56 1,000 12,23 6,50 40,00 3,27 40,0 40 1
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 1 C23H29N5O8 5,38
Ekv
Térfogat (ml) 80
Preparált Termelés Mt Ekv Elm. mol mol (%) (mmol) (mmol) 10,69 87 503,51 1,000 12,23
Elm. tömeg (g) 6,16
Az N-(4-Z-citozin-1-il)-acetil-N-(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilésztert dioxán és NaOH oldat elegyében oldottam. 1 órán át szobahőmérsékleten kevertettem, majd pH 2,5-re savanyítottam 1 M NaHSO4 oldattal. Bepároltam és a maradékhoz 100 ml EtOAc-ot és 80 ml desztillált vizet adtam. Elválasztás után a vizes fázis pH-ját ismét 2,5- re állítottam és 4x40 ml EtOAc-al mostam. Az egyesített szerves fázist Na2SO4-on szárítottam, szűrtem, bepároltam és szárítottam. Halványsárga kristályos anyaghoz jutottam. Rf (5): 0,72; (11): 0,79 MS m/z számolt: 503,20, mért: 504,0 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3) δ = 1,38 (s, 9 H), 3,04 (d, 2H), 3,45 (d, 2H), 3,98 (s, 2H), 4,80 (s, 2H), 5,18 (s, 2H), 6,65 (s, 1H), 6,80 (s, 1H), 7,03 (d, 1H), 7,38 (m, 5H), 7,81 (s, 1H)
93
5.13. Oligomer szintézisek 5.13.1. A PNS oligomerek szintézise A módosított PNS monomereket tartalmazó 11-mer oligomereket, és a módosítást nem tartalmazó refencia szálat manuálisan MBHA gyantán állítottam elő. A gyanta duzzasztása és előkészítése után a Boc-D-Lys(ClZ)-OH-t DIC és HOBt jelenlétében kapcsoltam a hordozóhoz, majd a szabad amino-csoportokat ecetsavanhidriddel keppeltem. A Boccsoport hasítása után pikrinsavas teszttel meghatároztam a kapacítást. A peptidnukleinsav egységek beépítése során az alábbi kapcsolási és hasítási körülményeket használtam: Boc-védett PNS monomer: HBTU: DIEA = 2,00: 1,90: 5,00 ekv. Kapcsolási idő: 60 perc. Hasítás: 40 % TFA / DCM. Hasítási idő: 20 perc. Az egyes kapcsolások eredményességét Kaiser teszttel ellenőriztem, pozitív eredmény esetén a kapcsolást megismételtem. A szintézis végén először a védőcsoportokat távolítottam el. TFA: dimetilszulfid: m-krezol = 1: 3: 1 és TFA: TFMSA = 9: 1 elegyek 1: 1 arányú alkalmazásával. A hasítás ideje 1 óra volt, melynek végén a reakcióelegyet eltávolítottam és TFA-val mostam a gyantát. Az oligomert TFMSA: TFA: m-krezol = 2: 8: 1 elegyével hasítottam le a hordozóról 1,5 óra alatt. A reakcióidő végén TFA-val mostam a gyantát és az összegyűjtött oldatból dietiléterrel csaptam ki a nyersterméket, melyet centrifugálással izoláltam. RP-HPLC-vel tisztítottam, és liofilizáltam. Szekvencia
RT
M
M
(számolt)
(mért)
5,70
3012,24
3014
H–t c c c t t t c t t t-D-Lys-NH2
6,49
3084,24
3086
H–t c c c tPh tPh tPh c t t t-D-Lys-NH2
8,12
3198,29
3200
H–t c c c tPhE tPhE tPhE c t t t-D-Lys-NH2
7,26
3270,29
3272
H–t c c c tTie tTie tTie c t t t-D-Lys-NH2,
7,39
3216,16
3218
H–t c c c t t t c t t t-D-Lys-NH2 Pr Pr Pr
5.13.2. A komplementer ODN szintézise A target d(5’-AAA GAA AGG GA-3’) oligodezoxinukleotidot MilliGen/Biosearch 8700 DNS szintetizátor segítségével állítottam elő. A szintézishez szükséges N6-benzoil-5’-Odimetoxitritil-2’-dezoxiadenozin-3’-O-(2-cianoetil-N,N-diizopropil)-foszforamidit és az N2-izobutiril-5’-O-dimetoxitritil-2’-dezoxiguanozin-3’-O-(2-cianoetil-N,N-diizopropil)94
foszfor- amidit valamint a szilárd hordozó dA-SynBaseTM CPG-t (kapacitás: 32 µmól/g) a Link Technologies Ltd-től (Bellshill, Skócia) származott. A szintézisméret 4,0 µmól volt. Izolált hozam: 6,0 mg = 1,74 µmól (43,5 %); RP-HPLC tisztaság: 98,35%; ESI MS negatív ion mód (m/z): Számított: C110H133N55O57P10–re 3447,19 Da, mért: [(M3H)/3]3- = 1148,2 M = 3447,6 Da
5.14. 5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diizopropil]foszforamidit származékok szintézise 5.14.1. A DP-(RP)- és az LP-(SP)-5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2cianoetil)-N,N-diizopropil]-foszforamidit szintézise O O
O
O
O
O NH
NH
NH N N
O
O
N
O
O
O
N
O
O
O
N
O
O
P N O
O OH
O
O
P
O
N
N
O
N
P O
N
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,414 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns
Összegképlet
1 2 3
C31H32N2O7 C15H32N3OP C7H15N5
Oldószerek: Név 1 DCM
Limitáló
Mt
Ekv
544,60 301,41 169,13
1,000 1,500 0,750
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 35a DP-(RP) C40H49N4O8P 3,02 35b LP-(SP) C40H49N4O8P 1,90
Mól (mmol) 20,71 31,06 15,53
Bemért tömeg (g) 11,28 9,36 2,63
Térfogat (ml) 50
Preparált mol (mmol) 4,05 2,55
Termelés Mt (%) 19,58 12,32
Ekv
Elm. mol (mmol) 744,81 1,000 20,71 744,81 1,000 20,71
Elm. tömeg (g) 15,43 15,43
Az 5’-Dimetoxitritil-timidint .N,N,N’,N’-tetraizopropil-O-(2-cianoetil)-foszforodiamidittel reagáltattam
diizopropilammónium
tetrazolid
jelenlétében
94
.
A
nyerterméket
oszlopkromatográfiával tisztítottam EtOAc-hexán-TEA 49:49:2 - EtOAc-TEA 98:2
95
gradiens alkalmazásával. A tiszta frakciókat egyesítettem, az elegyeket bepároltam, és szilárd fehér habokhoz jutottam melyeket vákuumban szárítottam. 35a, Rf (9): 0.59 ESI MS m/z számolt: 744,74, mért : 745,3 [M+H]+, 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,17 (dd, 2×6H,), 1,42 (d, 3H); 2,32 (ddd, 1H), 2,40 (t, 2H,), 2,49 (ddd, 1H), 3,32 (dd, 1H); 3,54 (dd, 1H), 3,55 – 3,68 (m, 4H), 4,18 (ddd, 1H), 4,66 (m, 1H), 6,40 (dd, 1H, ), 7,62 (q, 1H), 8,3 (s, 1H,); 13 C NMR (CDCl3) d = 11,95; 20,42; 24,75; 24,83; 40,26; 43,51; 58,38; 63,30; 73,72; 87,13; 85,91; 111,44; 117,57; 135,83; 150,38; 163,76; 31 P NMR (CDCl3): δ = 149,54; 35b, Rf (9): 0.55 ESI MS m/z számolt: 744,74, mért: 745,2 [M+H]+ 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,16 (dd, 2×6H,); 1,45 (d, 3H); 2,32 (ddd, 1H), 2,53 (ddd, 1H); 2,61 (t, 2H); 3,31 (dd, 1H); 3,48 (dd, 1H), 3,56 (m, 2H), 3,76 + 3,82 (m, 2H), 4,14(ddd, 1H), 4,66 (m, 1H), 6,40 (dd, 1H), 7,58 (q, 1H), 8,34 (s, 1H), 13 C NMR (CDCl3): d = 11,94; 20,62; 24,76; 40,28; 43,45; 58,52; 63,50; 74,16; 85,61; 87,14; 111,47; 117,71; 135,85; 150,45; 163,75 31 P NMR (CDCl3): δ =149,12;
5.14.2.
A
DP-(SP)-
és
az
LP-(RP)-5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-
cianoetil)-N,N-diizopropil]-foszforamidát előállítása O
O
O
O NH
NH N
O
O
N H 2O 2
O O
O O
O O N
P
O N N
O
Reakció körülmények: Reakció molaritás Hőmérséklet
0,050 M 20-25 °C
Reaktánsok:
96
O
P O
N
O
Reaktáns
Összegképlet
Limitáló
DP-(RP) és LP- C40H49N4O8P (SP) H2O2 Oldószerek: Név 1 Acetonitril Termékek: Termék
36a DP-(SP) 36b LP-(RP)
Mt
Ekv
Mól (mmol) 744,81 1,000 0,250
Bemért Vol tömeg (g) (ml) 186
34,01
4,00
34,0
Arány
Összegképlet Preparált tömeg (g) C40H49N4O9P 190 C40H49N4O9P 190
1,000
0,10
Térfogat (ml) 5
Preparált mol (mmol) 0,250 0,250
Termelés Mt (%) 100 100
Ekv
Elm. mol (mmol) 760,81 1,000 0,250 760,81 1,000 0,250
Elm. tömeg (g) 190 190
A DP-(RP)- és az LP-(SP)-5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diizopropil]foszforamiditet acetonitrilben oldottam és hozzáadtam a H2O2-ot. A reakcióelegyeket 3 percig kevertettem majd szárazra pároltam és vákuumban szárítottam. Fehér szilárd anyagokhoz jutottam 36a, Rf (9): 0,29; op, 98-101 °C ESI MS m/z számolt: 760,74, mért: 783,3 [M+Na]+ 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,21 + 1,23 (2 x d, 2×6H), 1,39 (d, 3H), 2,43 (dddd, 1H), 2,58 (ddd, 1H), 2,50 + 2,60 (2 x ddd, 2×1H), 3,41 (dd, 1H), 3,43 (m, 2H), 3,53 (dd, 1H), 4,00 + 4,04 (2 x ddd, 2×1H), 4,32 (ddd, 1H), 5,05 (m, 1H), 6,45 (dd, 1H), 7,62 (q, 1H), 8,91 (bs, 1H) 13 C NMR, (CDCl3): δ = 11,82; 19,81; 22,67; 39,58; 46,57; 60,61; 63,65; 77,13; 84,97; 87,36; 111,81; 116,74; 135,33; 150,57; 163,93 31 P NMR (CDCl3): δ = 8,31. 36b, Rf (9): 0.20, mp:85-89 °C; ESI MS m/z számolt: 760.74, számolt: 783.1 [M+Na]+ 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,13 + 1,22 (2 x d, 2×6H,), 1,38 (d, 3H), 2,43 (ddd, 1H), 2,67 (ddd, 1H), 2,72 (t, 2H), 3,37 (dd, 1H), 3,40 (m, 2H), 3,50 (dd, 1H), 4,09 + 4,17 (2 x ddd, 2×1H), 4,28 (ddd, 1H), 5,06 (m, 1H), 6,44 (dd, 1H), 7,58 (q, 1H), 8,82 (bs, 1H) 13 C NMR (CDCl3): δ = 11,81; 20,03; 22,63; 39,62; 46,52; 60,55; 63,64; 77,50; 84,98; 87,40; 111,89; 117,01; 135,30; 150,66; 164,02 31 P NMR (CDCl3): δ = 7,95;
97
5.14.3. A DP-(SP)- és az LP-(RP)-5’-O-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2cianoetil)-N,N-diizopropil]-foszforamidotioát szintézise O
O
O
O NH
NH N
N
O
S
O
O O
O O
O O N
P
O
O N
S
N
O
N
O
P
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,050 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns 1 2
Összegképlet
Limitáló
DP-(RP) és C40H49N4O8P LP-(SP) S
Oldószerek: Név 1 DCM
Mt
Ekv 1,000
Mól (mmol) 0,250
Bemért tömeg (g) 186
744,81 32,07
4,00
1,000
32,1
Arány
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 37a DP-(SP) C40H49N4O9P 185 37b LP-(RP) C40H49N4O9P 183
Térfogat (ml) 5
Preparált mol (mmol) 0,238 0,235
Termelés Mt (%) 95 94
Ekv
Elm. mol (mmol) 776,88 1,000 0,250 776,88 1,000 0,250
Elm. tömeg (g) 194 194
A DP-(RP)- és az LP-(SP)-5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diizopropil]foszforamiditet DCM-ben oldottam és kénport adtam az elegyekhez. A gyorsan homogénné váló oldatokat 1 órán át kevertettem szobahőmérsékleten, majd bepároltam őket. A nyerstermékeket oszlopkromatográfiával tisztítottam EtOAc-hexán 1:1 eluens alkalmazásával. Fehér szilárd terméket izoláltam. 37a, Rf (9): 0,54, mp: 88-91 °C; ESI MS m/z számolt: 776,81, mért: 799,3 [M+Na]+
98
1
H NMR (CDCl3): δ = 1,29 (2xd, 2×6H), 1,43 (d, 3H), 2,42 (dddd, 1H), 2,57 (ddd, 1H), 2,47 + 2,57 (2xddd, 2×1H), 3,43 (dd, 1H), 3,73 (m, 2H), 3,53 (dd, 1H), 3,97 + 4,02 (2xddd, 2×1H), 4,33 (ddd, 1H), 5,28 (m, 1H), 6,43 (dd, 1H), 7,62 (q, 1H), 8,37 (bs, 1H); 13 C NMR, (CDCl3): δ = 11,72; 19,35; 22,63 + 22,66; 39,41; 47,42; 60,05; 63,54; 76,71; 85,02; 87,19 ; 111,56; 116,64; 135,34; 150,20; 163,41; 31 P NMR (CDCl3): δ = 71,26 37b. Rf (9): 0,51, mp: 78-81 °C; ESI MS m/z számolt: 776,81, mért: 799,0 [M+Na]+ 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,22 + 1,28 (2xd, 2×6H), 1,42 (d, 3H), 2,41 (ddd, 1H), 2,66 (ddd, 1H), 2,73 + 2,79 (t, 2H), 3,41 (dd, 1H), 3,41 (m, 2H), 3,48 (dd, 1H), 4,07 + 4,22 (2xddd, 2×1H), 4,29 (ddd, 1H), 5,33 (m, 1H), 6,42 (dd, 1H), 7,57 (q, 1H), 8,60 (bs, 1H); 13 C NMR (CDCl3): d = 11,63; 19,56; 22,46 + 22,60; 39,26; 47,39; 60,74; 63,42; 77,82; 84,79; 87,15; 111,51; 116,77; 135,34; 150,28; 163,48; 31 P NMR (CDCl3): δ = 71,45
5.14.4. A DP-(SP)- és az LP-(RP)-5’-O-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2cianoetil)-N,N-diizopropil]-foszforamidoszelenoát előállítása O
O
O
O NH
NH N
N
O
Se
O
O
O O
O O N
P
O
O
O N
Se
N
O
P
N
O
Reakció körülmények: Reakció molaritás 0,050 M Hőmérséklet 20-25 °C Reaktánsok: Reaktáns Összegképlet Limitáló 1
2
DP-(RP) C40H49N4O8P és L P(SP) Se
Oldószerek: Név 1 DCM
Mt
Ekv
Mól Bemért (mmol) tömeg (g) 744,81 1,000 0,250 186
Vol (ml)
78,96
4,00
0,071 1,11
Arány
1,000
79
Térfogat (ml) 5
99
Sűrűség (g/ml)
Termékek: Termék Összegképlet Preparált tömeg (g) 38a DP-(SP) C40H49N4O9P 194 38b LP-(RP) C40H49N4O9P 194
Preparált mol (mmol) 0,236 0,236
Termelés Mt (%) 94 94
Ekv
Elm. mol (mmol) 823,77 1,000 0,250 823,77 1,000 0,250
Elm. tömeg (g) 206 206
A DP-(RP)- és az LP-(SP)-5’-dimetoxitritil-timidin-3’-O-[O-(2-cianoetil)-N,N-diizopropil]foszforamiditet DCM-ben oldottam és mindkét elegyhez szelén port adtam. A szuszpenziókat 1 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertettem. Az elegyeket papírszűrőn engedtem át és 5-5 ml DCM-mel mostam őket. A szűrletek bepárlása után fehér szilárd termékekhez jutottam. 38a, Rf (A): 0,55, op: 86-89 °C; ESI MS m/z számolt: 823,70, mért: 847,1 [M+Na]+, 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,31 + 1,32 (2×d , 2×6H), 1,43 (d, 3H), 2,44 (dddd, 1H), 2,58 (ddd, 1H), 2,46 + 2,57 (2 x ddd, 2×1H), 3,47 (dd, 1H), 3,48 (dd, 1H), 3,85 (m, 2H), 3,97 + 4,02 (2 x ddd, 2×1H), 4,34 (ddd, 1H), 5,36 (m, 1H), 6,43 (dd, 1H), 7,61 (q, 1H), 8,78 (bs, 1H); 13 C NMR (CDCl3): δ = 11,94; 19,35; 22,95; 39,52; 48,15; 61,62; 63,75; 78,54; 85,01; 87,43; 111,81; 116,83; 135,37; 150,55; 163,84; 31 P NMR (CDCl3): δ = 74,43; 38b, Rf (A): 0,48, mp: 87-91 °C; ESI MS m/z számolt: 823,70, mért: 847,0 [M+Na]+, 1 H NMR (CDCl3): δ = 1,24 + 1,28 (2 x d, 2×6H), 1,42 (d, 3H), 2,44 (ddd, 1H), 2,65 (ddd, 1H), 2,74 + 2,81 (2 x ddd, 2×1H), 3,41 (dd, 1H), 3,53 (dd, 1H), 3,84 (m, 2H), 4,07 + 4,25 (2 x ddd, 2×1H), 4,30 (ddd, 1H), 5,42 (m, 1H), 6,42 (dd, 1H), 7,59 (q, 1H), 8,84 (bs, 1H); 13 C NMR (CDCl3): δ = 11,88; 19,63; 22,88; 39,42; 48,18; 61,81; 63,65; 79,33; 84,97; 87,43; 111,79; 116,99; 135,36; 150,62; 163,88; 31 P NMR (CDCl3): δ = 75,00;
100
6. Irodalomjegyzék (1) (2) (3)
Gutierrez, A. J.; Terhorst, T. J.; Matteucci, M. D.; Froehler, B. C. Journal of the American Chemical Society 1994, 116, 5540-5544. Gutierrez, A. J.; Froehler, B. C. Tetrahedron Letters 1996, 37, 3959-3962. Lin, K.-Y.; Jones, R. J.; Matteucci, M. Journal of the American Chemical Society 1995, 117, 3873-3874.
(4) (5) (6) (7)
(8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21)
(22) (23) (24)
Nielsen, P.; Egholm, M.; Berg, R.; Buchardt, O. Science 1991, 254, 14971500. Egholm, M.; Buchardt, O.; Nielsen, P. E.; Berg, R. H. Journal of the American Chemical Society 1992, 114, 1895-1897. Eriksson, M.; Nielsen, P. E. Quart. Rev. Biophysics 1996, 29, 369-394. Egholm, M.; Buchardt, O.; Christensen, L.; Behrens, C.; Freier, S. M.; Driver, D. A.; Berg, R. H.; Kim, S. K.; Norden, B.; Nielsen, P. E. 1993, 365, 566-568. Wittung, P.; Nielsen, P. E.; Buchardt, O.; Egholm, M.; Norde[acute]n, B. 1994, 368, 561-563. Wittung, P.; Eriksson, M.; Lyng, R.; Nielsen, P. E.; Norden, B. Journal of the American Chemical Society 1995, 117, 10167-10173. Püschl, A.; Sforza, S.; Haaima, G.; Dahl, O.; Nielsen, P. E. Tetrahedron Letters 1998, 39, 4707-4710. Sforza, S.; Haaima, G.; Marchelli, R.; Nielsen, P. E. European Journal of Organic Chemistry 1999, 1999, 197-204. Nielsen, P. E.; Haaima, G.; Lohse, A.; Buchardt, O. Angewandte Chemie International Edition in English 1996, 35, 1939-1942. Sforza, S.; Corradini, R.; Ghirardi, S.; Dossena, A.; Marchelli, R. European Journal of Organic Chemistry 2000, 2000, 2905-2913. Merrifield, R. B. Journal of the American Chemical Society 1963, 85, 21492154. Merrifield, R. B. Journal of the American Chemical Society 1964, 86, 304305. Merrifield, R. B. Biochemistry 1964, 3, 1385-1390. Kaiser, E.; Colescott, R. L.; Bossinger, C. D.; Cook, P. I. Analytical Biochemistry 1970, 34, 595-598. Bárány, G.; Merrifield, R. B. Academic Press: New York. 1979, 2, 1-248. Atherton, E.; Fox, H.; Harkiss, D.; Logan, C.; Sheppard, R.; Williams, B. J. Chem. Soc. Chem. Commun 1978, 537-539. Kofoed, T.; Hansen, H. F.; Řrum, H.; Koch, T. Journal of Peptide Science 2001, 7, 402-412. Thomson, S. A.; Josey, J. A.; Cadilla, R.; Gaul, M. D.; Hassman, C. F.; Luzzio, M. J.; Pipe, A. J.; Reed, K. L.; Ricca, D. J.; Wiethe, R. W.; Noble, S. A. Tetrahedron 1995, 51, 6179-6194. Lankhorst, P.; Haasnoot, C.; Erkelens, C.; Westernik, H.; Marel, G.; Boom, J.; Altona, C. Nucleic Acids Res 1985, 13, 927-942. Tömösközi, I.; Gács-Baitz, E.; Ötvös, L. Tetrahedron 1995, 51, 6797-6804. Gács-Baitz, E.; Tömösközi, I.; Kajtár-Peredy, M. Tetrahedron Assymetry 1996, 7, 2447-2452. 101
(25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36)
(37) (38) (39) (40) (41) (42) (43) (44) (45)
(46)
(47) (48) (49) (50)
Machytka, D.; Gács-Baitz, E.; Tegyey, Z. Nucleosides & Nucleotides 1998, 17, 2311-2322. Gács-Baitz, E.; Wozniak, L.; Kajtár-Peredy, M. Chirality 2000, 12, 675680. Machytka, D.; Sági, G.; Kajtár-Peredy, M.; Gács-Baitz, E. Nucleosides & Nucleotides 2000, 19, 903-915. Kajtár-Peredy, M.; Tömösközi, I.; Gács-Baitz, E. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 2001, 20, 1615-1623. Gács-Baitz, E.; Kajtár-Peredy, M. Chirality 2002, 14, 814-818. Gács-Baitz, E.; Kajtár-Peredy, M.; Sági, G. Anal Bioanal Chem 2004, 379, 56-59. Gács-Baitz, E.; Sági, G.; Kajtár-Peredy, M. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids 2005, 24, 247-257. Dueholm, K. L.; Egholm, M.; Buchardt, O. Organic Preparations and Procedures International 1993, 25, 457-462. Viirre, R. D.; Hudson, R. H. E. The Journal of Organic Chemistry 2003, 68, 1630-1632. Meltzer, P. C.; Liang, A. Y.; Matsudaira, P. The Journal of Organic Chemistry 1995, 60, 4305-4308. Kim, I.-H.; Morisseau, C.; Watanabe, T.; Hammock, B. D. Journal of Medicinal Chemistry 2004, 47, 2110-2122. Krapcho, A. P.; Kuell, C. S. Synthetic Communications: An International Journal for Rapid Communication of Synthetic Organic Chemistry 1990, 20, 2559 - 2564. Hudson, R. H. E.; Lia, G.; Tse, J. Tetrahedron Letters 2002, 43, 1381-1386. Stille, J. K. Pure and Applied Chemistry 1985, 57, 1771-1780. Yamamoto, Y.; Seko, T.; Nemoto, H. The Journal of Organic Chemistry 1989, 54, 4734-4736. Wigerinck, P.; Pannecouque, C.; Snoeck, R.; Claes, P.; De Clercq, E.; Herdewijn, P. Journal of Medicinal Chemistry 1991, 34, 2383-2389. Farina, V.; Hauck, S. I. Synlett 1991, 1991, 157-159. Flynn, B. L.; Macolino, V.; Crisp, G. T. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 1991, 10, 763 - 779. Crisp, G. T. Synthetic Communications: An International Journal for Rapid Communication of Synthetic Organic Chemistry 1989, 19, 2117 - 2123. Crisp, G. T.; Flynn, B. L. Tetrahedron Letters 1990, 31, 1347-1350. Crisp, G. T.; Macolino, V. Synthetic Communications: An International Journal for Rapid Communication of Synthetic Organic Chemistry 1990, 20, 413 - 422. Wigerinck, P.; Kerremans, L.; Claes, P.; Snoeck, R.; Maudgal, P.; De Clercq, E.; Herdewijn, P. Journal of Medicinal Chemistry 1993, 36, 538543. Beletskaya, I. P. Pure and Applied Chemistry 1997, 69, 471-476. Robins, M. J.; Barr, P. J. The Journal of Organic Chemistry 1983, 48, 18541862. Yamaura, M.; Suzuki, T.; Hashimoto, H.; Yoshimura, J.; Okamoto, T.; Shin, C.-g. Bulletin of the Chemical Society of Japan 1985, 58, 1413-1420. Danishefsky, S. J.; DeNinno, S. L.; Chen, S. H.; Boisvert, L.; Barbachyn, M. Journal of the American Chemical Society 1989, 111, 5810-5818.
102
(51) (52) (53) (54) (55) (56) (57) (58)
(59) (60) (61) (62) (63) (64)
(65) (66)
(68) (69) (70)
(71)
(72)
(73) (74) (75)
Akiyama, T.; Nishimoto, H.; Ozaki, S. Bulletin of the Chemical Society of Japan 1990, 63, 3356-3357. Aeroschot, A. V.; Jie, L.; Herdewijn, P. Tetrahedron Letters 1991, 32, 1905-1908. Myers, A. G.; Gin, D. Y.; Rogers, D. H. Journal of the American Chemical Society 1994, 116, 4697-4718. Caplar, V.; Zinic, M. Tetrahedron Letters 1995, 36, 4455-4458. Savya, P.; Benhida, R.; Fourreya, J.-L.; Maurisseb, R.; Sunb, J.-S. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2000, 10, 2287-2289. Sonogashira, K.; Tohda, Y.; Hagihara, N. Tetrahedron Letters 1975, 16, 4467-4470. Sharma, R. A.; Kavai, I.; Hughes, R. G.; Bobek, M. Journal of Medicinal Chemistry 1984, 27, 410-412. Ma, T.; Pai, S. B.; Zhu, Y. L.; Lin, J. S.; Shanmuganathan, K.; Du, J.; Wang, C.; Kim, H.; Newton, M. G.; Cheng, Y. C.; Chu, C. K. Journal of Medicinal Chemistry 1996, 39, 2835-2843. Hashimoto, H.; Nelson, M. G.; Switzer, C. Journal of the American Chemical Society 1993, 115, 7128-7134. Miyaura, N.; Suzuki, A. Chemical Reviews 1995, 95, 2457-2483. Casalnuovo, A. L.; Calabrese, J. C. Journal of the American Chemical Society 1990, 112, 4324-4330. Amann, N.; Pandurski, E.; Fiebig, T.; Wagenknecht, H.-A. Angewandte Chemie International Edition 2002, 41, 2978-2980. Western, E. C.; Daft, J. R.; Johnson, E. M.; Gannett, P. M.; Shaughnessy, K. H. The Journal of Organic Chemistry 2003, 68, 6767-6774. Dueholm, K. L.; Egholm, M.; Behrens, C.; Christensen, L.; Hansen, H. F.; Vulpius, T.; Petersen, K. H.; Berg, R. H.; Nielsen, P. E.; Buchardt, O. The Journal of Organic Chemistry 1994, 59, 5767-5773. Rabinowitz, J. L.; Gurin, S. Journal of the American Chemical Society 1953, 75, 5758-5759. Reese, C. B.; Ubasawa, A. Tetrahedron Letters 1980, 21, 2265-2268. (67) Sung, W. L. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications 1981, 1089a. Sung, W. L. Nucl. Acids Res. 1981, 9, 6139-6152. Sung, W. L. The Journal of Organic Chemistry 1982, 47, 3623-3628. Lin, T. S.; Luo, M. Z.; Liu, M. C.; Clarke-Katzenburg, R. H.; Cheng, Y. C.; Prusoff, W. H.; Mancini, W. R.; Birnbaum, G. I.; Gabe, E. J.; Giziewicz, J. Journal of Medicinal Chemistry 1991, 34, 2607-2615. Hattori, K.; Kohchi, Y.; Oikawa, N.; Suda, H.; Ura, M.; Ishikawa, T.; Miwa, M.; Endoh, M.; Eda, H.; Tanimura, H.; Kawashima, A.; Horii, I.; Ishitsuka, H.; Shimma, N. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2003, 13, 867872. Schwergolda, C.; Depeckera, G.; Giorgioa, C. D.; Patinoa, N.; Jossinetb, F.; Ehresmannb, B.; Terreuxc, R.; Cabrol-Bassc, D.; Condom, R. Tetrahedron 2002, 58, 5675-5687. Howarth, N. M.; Wakelin, L. P. G. The Journal of Organic Chemistry 1997, 62, 5441-5450. Wu, Y.; Xu, J.-C.; Liu, J.; Jin, Y.-X. Tetrahedron 2001, 57, 3373-3381. Koch, T.; Hansen, H. F.; Andersen, P.; Larsen, T.; Batz, H. G.; Otteson, K.; Orum, H. Journal of Peptide Research 1997, 49, 80-88. 103
(76) (77) (78) (79) (80) (81) (82) (83) (84) (85) (86) (87) (88) (89) (90) (91) (92) (93) (94)
Seela, F.; Kretschmer, U. J. Chem. Soc. Chem. Commun 1990, 1154-1159. Seela, F.; Kretschmer, U. The Journal of Organic Chemistry 1991, 56, 3861-3869. Kataoka, M.; Hattori, A.; Okino, S.; Hyodo, M.; Asano, M.; Kawai, R.; Hayakawa, Y. Organic Letters 2001, 3, 815-818. Wyrzykiewicz, T. K.; Ravikumar, V. T. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1994, 4, 1519-1522. Baraniak, J.; Korczynski, D.; Kaczmarek, R.; Stec, W. J. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 1999, 18, 2147 - 2154. Scozzari, A. N.; Krotz, A. H. In WO2004113553; Isis Pharmaceuticals Inc: 2004. Caruthers, M. H.; Brill, W. K.-D.; Yau, E.; Ma, M.; Nielsen, J. In US5750666; Competitve Technologies, Inc.: 1998. Holloway, G. A.; Pavot, C.; Scaringe, S. A.; Lu, Y.; Rauchfuss, T. B. ChemBioChem 2002, 3, 1061-1065. Stengele, K.-P.; Pfleiderer, W. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 1990, 9, 423 - 427. Sobkowski, M.; Stawinski, J.; Kraszewski, A. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 2005, 24, 1301 - 1307. Sobkowski, M.; Stawinski, J.; Kraszewski, A. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 2006, 25, 1377 - 1389. Charubala, R.; Stengele, K. P.; Pfleiderer, W. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids 1989, 8, 1007 - 1010. Ono, A.; Matsuda, A.; Zhao, J.; Santi, D. V. Nucl. Acids Res. 1995, 23, 4677-4682. Gmeiner, W. H.; Sahasrabudhe, P.; Pon, R. T. The Journal of Organic Chemistry 1994, 59, 5779-5783. Letsinger, R. L.; Lunsford, W. B. Journal of the American Chemical Society 1976, 98, 3655-3661. Lindh, I.; Stawinski, J. The Journal of Organic Chemistry 1989, 54, 13381342. Wozniak, L. A.; Wieczorek, M.; Pyzowski, J.; Majzner, W.; Stec, W. J. The Journal of Organic Chemistry 1998, 63, 5395-5402. Blommers, M. J. J.; Nanz, D.; Zerbe, O. Journal of Biomolecular NMR 1994, 4, 595-601. Beaucage, S. In Protocols for Oligonucleotide Conjugates: Synthesis and Analytical Techniques; S., A., Ed.; Humana Press Inc.: Totowa, 1993; Vol. 26, p 44.
104
Összefoglalás Az oligodezoxinukleotidokba (ODN) C5-alkinil- vagy C5-heteroaril-analóg egységek beépítése, növeli az ODN:DNS illetve ODN:RNS duplexek stabilitását. A peptid-nukleinsavak (PNS) a természetes DNS cukor-foszfát gerince helyett N-(2aminoetil)-glicin gerincet tartalmaznak. A PNS:DNS duplexek jóval stabilabbak, mint a megfelelő DNS hasonmások. Erre alapozva különböző 5-aril- és 5-alkinil-pirimidin bázisokat tartalmazó PNS-analogonok szintézisét terveztem, amelyek várhatólag még stabilabb komplexeket képeznek a természetes nukleinsavakkal. 5-jód-uracilból kiindulva több lépésben előállítottam az 5-jód-uracil és a N3-PMB5-jód-uracil PNS monomereket, melyek a keresztkapcsolási reakciók kiindulási vegyületei. Stille kapcsolások során, Pd(0) katalizátor jelenlétében jó termeléssel állítottam elő új 5aril analogonokat. A Sonogashira kapcsolások esetében Pd(II), CuI és trietil-amin jelenlétében N3-PMB-5-alkinil-uracil PNS monomereket szintetizáltam közel kvantitatív termeléssel. A PMB védőcsoport alkalmazása nélkül a termelés jóval szerényebb ugyanis jelentős mértékben gyűrűzárt melléktermékek is képződnek. Suzuki kapcsolások alkalmazásával új N3-PMB-5-aril-uracil számazékokat sikerült előállítanom. A laktám csoport védelme nélkül szinte egyáltalán nem tapasztaltam termékképződést. A PMB csoport eltávolítása nem problémamentes, ezért eljárást dolgoztam ki a Suzuki kapcsolásokra in situ szililezéssel. A módosított PNS monomereket a PNS szintézisre optimalizált Boc/Z peptidszintézis protokoll alkalmazásával a H–t c c c t t t c t t t-D-Lys-NH2 11-mer modell szekvenciába építettem be az aláhúzott 3 középső egység helyére, majd. vizsgáltam a DNS: PNS duplexek termikus stabilitását. P-királis mononukleotidok szintézise sorám a T-CED tiszta DP,RP- és LP,SPdiasztereomerjeit oxidálva izoláltam a megfelelő P(V) vegyületeket. Az NMR és kromatográfiás analízisek szerint a reakciók minden esetben kemo- és sztereospecifikusak voltak és a P-konfiguráció retenciójával játszódtak le. A P-királis mono- és dinukleotidokkal
kapcsolatos
korábbi
NMR
vizsgálatainkkal
összhangban
megállapítottam, hogy a ∆J (= 3J (P,C4’) – 3J (P,C2’)) értékek a preparált új analógok esetében is jellemzőek a P-konfigurációra. A normál és különösen a reverz fázisú HPLC analízisek alapján megállapítottam, hogy a foszforatomhoz kettős kötéssel kapcsolódó heteroatomok elektronegativitása és a retenciós idők között egyértelmű összefüggés áll fenn. 105
Summary Incorporation
of
different
5-heteroaryl-uracil
moieties
into
short
oligodeoxynucleotides results in enhanced thermal stability of the modified DNA:RNA duplexes compared to that of the thymine-containing counterpart. Similar incorporation of 5-aryl- and 5-alkynyl-uracils into PNA-s is also expected to increase the stability of PNA:DNA complexes. A number of protected PNA monomers containing 5-alkynyl- and 5-aryl-uracil bases have been synthesized using different Pd-catalyzed cross-coupling reactions. Coupling of the base-unprotected 5-I-U PNA monomer with some aryl-tributylstannanes (Stille couplings) afforded the 5-aryl analogues in good yields. Copper (I) and palladium catalysed cross-couplings (Sonogashira couplings) were implemented from 5-I-U PNA monomer only with acceptable overall yields, due to formation of ring-closured, unrequired by-products
However, starting from the N3-PMB-protected monomer, the
required 5-alkynyl derivatives were isolated by nearly quantitative yields From acceptable to good yields were attained in the couplings of the N3-PMB-protected monomer with more aryl-boronic acids (Suzuki couplings)., Unfortunately, the use of the baseunprotected 5-I-U monomer ,as starting material did not give any coupled product in the 4 cases investigated. RP- and SP- diastereomers of 5’-dimethoxytrityl-thymidine-3’-O-[O-(2-cyanoethyl)N,N-diisopropyl]-phosphoramidite were separated by silica gel chromatography. Oxidation of both isomers resulted in the corresponding oxidized analogues by nearly quantitative yields. All reactions were found to proceed with retention of P-configuration. This was confirmed by thorough NMR analysis which, in addition, aimed to study the spectral properties of the diastereomers with a special respect to differences in the heteroatom effect of the O, S and Se atoms, double-bonded to the phosphorus, on the vicinal carbonphosphorus couplings. It was found that the changes in the ∆J (=3J (P,C4’) – 3J (P,C2’)) values were basically induced by the electronegativity of the heteroatoms, rather than differences in the rotational preferences about the C3’-O3’ bond. The behaviour of the compounds was also investigated by chromatography. The reverse phase HPLC profiles unambiguous correlation was found between the electronegativity of the heteroatoms and the chromatographic mobility of the analogues.
106
