COOH
CH3 O N
NH H3C
OCH3
O H2C
O NH
CH3 CH3
NH
Sinice v ČR
NH
H3C
CH3
O NH
NH
O
CH3
COOH O
O
Brněnská přehrada
CH3
NH HN
NH2
SINICE
O
O N
N H
-
+
Nádrž Nové mlýny
O
O
H 2N O
H HN
H N +
NH2 H 2N
+
N H
N
OH OH
H
O3SO H3 C
SINICE – Mušov 2007
SINICE
H
N H
NH NH
OH O NH
NH O
SINICE – Mušov 2007
Zdroj živin pro sinice ???
Eutrofizace
• Staré 3 miliardy let-prvotní atmosféra, vždy tu byly • 150 rodů, 2000 druhů • >80 % nádrží v ČR sinice eutrofizace • Celosvětový problém – Výskyt i na Antarktidě !
III. Stupeň čištění vod – často u ČOVek chybí
1
Skupinový úkol (1)
Occurrence of cyanobacteria
Vyjmenujte problémy, které se vám vybaví v souvislostmi ze sinicemi s ohledem jak na životní prostředí tak ve vztahu k člověku?
AUSTRÁLIE
7
Jak jsou toxické sinicové toxiny ? BIOTOXINY
1. Která toxikologická veličina hodnotí toxicitu ? 2. Seřaďte následující toxiny podle LD50:
• botulotoxin (Clostridium botulinum) • jed štíra • jed kobry • toxin sinice (microcystin) • toxin mochomůrky (falloidin) • toxin ryby „fugu“ – (tetradotoxin) 9
Toxin
Producent
Skupina
LD50 (µg/kg)
aphantoxin (saxitoxin)
Aphanizomenon flos-aquae
sinice
10
anatoxin-a(S)
Anabaena flos-aquae
sinice
20
microcystin-LR
Microcystis aeruginosa
sinice
50
nodularin
Nodularia spumigena
sinice
botulin
Clostridium botulinum
bakterie
0,001
tetanový toxin
Clostridium tetani
bakterie
0,002
tetrodotoxin
Tetraodon fahaka aj. (čtverzubec - „fugu“)
ryba
akonitin
Aconitum napellus (oměj šalamounek)
vyšší rostlina
100
jed kobry
Naja naja (kobra indická)
plaz
315
jed štíra
Centruroides suffusus
členovec
430
tubokurarin (kurare)
Chondrodendron tomentosum
vyšší rostlina
500
strychnin
Strychnos nux-vomica
vyšší rostlina
falloidin
Amanita phalloides (muchomůrka zelená)
houba
2000
aflatoxin
Aspergillus flavus
houba
9500
50
C Y A N O T O X I N Y
8
980
Hodnoty LD50 různých toxinů v testech na myších. LD50 je střední smrtelná dávka (v μg/kg živé váhy), tj. množství toxinu, které způsobí smrt poloviny pokusných jedinců. Čím nižší je hodnota LD50, tím vyšší je toxicita látky.
CYANOTOXINY
Toxiny sinic (cyanotoxiny) - nejvýznamnější (cyanotoxiny) jsou: microcystiny a nodulariny
! LIDSKÉ AKTIVITY !
nárůst koncentrace CO2 v atmosféře, nárůst UV radiace
anatoxiny saxitoxiny cylindrospermopsin
sinice (cyanobaktérie)
spalování
eutrofizace vodních ekosystémů
zemědělství, odpadní vody
Microcystin LR
- nejvýznamnější rody produkující cyanotoxiny (dosud identifikováno cca 50 druhů produkujících tyto látky): Anabaena (microcystiny, anatoxiny, anatoxin-a(S), saxitoxiny, cylindrospermopsin) Microcystis Aphanizomenon (anatoxiny, saxitoxiny, cylindrospermopsin) sp. Microcystis, Nodularia (microcystiny a nodulariny) Planktothrix/Oscillatoria (microcystiny, anatoxiny, saxitoxiny) Cylindrospermopsis (cylindrospermopsin, saxitoxiny)
masový rozvoj sinic (vodní květy) COOH
CH3 O N
NH OCH3
H3C
O H2C
O NH
CH3 CH3
O NH
CH3
NH
CH3
COOH O
O
GLOBÁLNÍ ENVIRONMENTÁLNÍ PROBLÉM
NH
H3C
CH3 NH
O
NH HN
toxicitu vykazují také sinicové lipopolysacharidy – součást buněčných stěn všech sinic
NH2
CYANOTOXINY H
O 3S O H 3C
H
N H
NH NH
OH O NH
NH O
H2N
O H
O
O NH
C H3
NH +H2N
NH NH2+
N
NH OH OH
2
Microcystiny (MCs)– peptidy sinic
Sinice v životním prostředí
- producenti : Microcystis, Planktothrix, Anabaena, Anabaenopsis, Nostoc, Hapalosiphon - cyklické heptapeptidy - syntéza MCs neribozomální cestou - zřejmě nejrozšířenější cyanotoxiny - 90 strukturních variant - relativně stabilní a odolné vůči rozkladu - mohou tvořit až 1% suché váhy WHO: Tolerovaný denní příjem 0,04 0 04 μg/kg těl těl.váhy váhy člověka ČR: vyhláška MZd č. 252/2004 Sb., kterou se stanoví hygienické požadavky na pitnou vodu – limit 1 µg /L
Eutrofizace vodních ekosystémů Masivní rozvoj vodního květu sinic Aphanizomenon flos-aquae
-
LPS
alkaloidy
peptidy
Primární toxicita: Hepatotoxicita u obratlovců - inhibice PP1 a 2A - promotor karcinogeneze (IARC – 2B) - inhibice ATP-syntázy, indukce oxidativního stresu, genotoxicita
Planktothrix agardhii
Peptidy sinic
Situace v ČR 2004 - 2008 Koncetrace MCs v biomase (ug/g sušiny) -průměr 549 ug/g;
Aeruginosiny
Cyanopeptoliny
Microgininy
Microviridiny
(MAX 3312 ug/g)
Anabaenopeptiny
Cyclamidy
Microcystiny (MCs)
Welker, M., and von Dohren, H. (2006). Cyanobacterial peptides - Nature's own combinatorial biosynthesis. Fems Microbiology Reviews 30, 530-563.
Situace v ČR 2004 - 2008 Koncetrace MCs ve vodach (ug/L) -Prumer 0,55 ug/L (MAX. 17,27)
Hodnocení rizika ?Skupinový úkol? Scénář pro 1 den v životě tohoto člověka (37 let, 65 kg): Denní spotřeba: - Vypije 2L vody s obsahem 0,55 ug MCs / L vody - Sní 300g ryby s obsahem 30 ng MCs/ g tkáně Vystavuje se tím riziku podle WHO ? WHO: Tolerovaný denní příjem microcystinů 0,04 μg/kg těl.váhy člověka EDI = ((2*0,55) + (300*0,03)) / 65 kg = 0,155 ug / kg váhy člověka
HI = 0,155 / 0,04 = 3,9 18
3
Hodnocení rizika Scénář pro 1 den v životě tohoto člověka (37 let, 65 kg):
Immunomodulatory potencies of toxic cyanobacteria (2013 2015 RECETOX) (2013-2015,
20
Immunomodulatory potencies of toxic cyanobacteria
Introduction of the tested cell line (macrophages)– RAW 264.7 ~ 2 ug MC-LR,-RR, -YR / L
Duration of the „postdoc“ project: 2013-2015
Chen, J., 2009.. Toxicological Sciences, 108(1): 81-9.
Cooperation: RECETOX, BFÚ
People involved in the project at RECETOX: Ondřej Adamovský, prof. Luděk Bláha -2 Ph.D. students : Zdena Moosová, Amrita Basu (supervisor, P.Babica) Cell line: RAW 264.7 (Abelson murine leukemia virus-induced tumor) Growth media: DMEM & 10% fetal bovine serum
Institute of Biophysics of the ASCR, v. v. i.
De/activation of specific pathways -> modulation of natural macrophage function->cytokine production (IL-6, TNF- α), production NO…
+/- microcystins +/- LPS
21
Mode of action ?
Immunomodulatory effect of cyanobacterial peptides - mode of action
24 hrs, 1-1000 nM, microcystin-LR exposure microcystin-RR microcystin-YR auruginosin-865
OATPs ras
200
IL-6
180
- Looking for other coumpounds / fractions with immunomodulatory potential in the biomass of cyanobacterial strains Aphanisomenon, Microcystis, Planktothrix.
raf
140 120
IRAK4, TRAF6
100 80
MEK
60 16
MCs
14 12 10
PP1 2A PP1,2A MAPK ERK ½, p38, JNK
8 LPS 10 ng/ml
MC-LR 1 ug/L
MC-LR 10 ug/L
MC-LR 100 ug/L
MC-LR 1000 ug/L
MC-LR 100 ug/L
MC-LR 1000 ug/L
control
MC-LR 1 ug/L
MC-LR 10 ug/L
6
+ LPS 10 ng/mL
3000
2100
760
1800
720
NO
…………….
X
160
LPS 10 ng/ml
MC-LR 1 ug/L
MC-LR 10 ug/L
MC-LR 100 ug/L
MC-LR 1000 ug/L
MC-LR 100 ug/L
80 MC-LR 1000 ug/L
MC-LR 10 ug/L
MC-LR 100 ug/L
100
MC-LR 1000 ug/L
100 LPS 10 ng/ml
120
MC-LR 1 ug/L
140
MC-LR 10 ug/L
2
Characterization of responsible compound
180
control
% control
640
150
MC-LR 1 ug/L
250 200
MC-LR 10 ug/L
300
MC-LR 100 ug/L
Polarity, size…etc 1
IϰBα
NF-ϰB
680
1500
MC-LR 1000 ug/L
% control
NF-ϰB Responsible genes
800
2400
control
fractionization
sub-fractions
TNFα
2700
MC-LR 1 ug/L
% negative control (LPS)
160
..next part of the research
23
24
+ LPS 10 ng/mL
4
Ongoing projects - Biologically active cyanobacterial secondary metabolites
Děkuji za pozornost GAČR “cyano”projects on RECETOX - Tumor promotional mechanisms of cyanobacterial metabolites ( L.Bláha) – completed - Endocrine disruptive potential of cyanobacterial metabolites (K. Hilscherová) – ongoing -“Cyanobacterial teratogenic retinoic compounds” (M.Smutná) – ongoing - Immunomodulatory potencies of toxic cyanobacteria (O.Adamovský) – ongoing - Tumor promotion and cyanobacteria ( P. Babica) – ongoing
25
5
