MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie
SEKUNDÁRNÍ METABOLITY ROSTLIN – PŘÍNOS PRO ROSTLINU I ČLOVĚKA Bakalářská práce
Marie Štefková
VEDOUCÍ PRÁCE: Doc. RNDr. Jana Řepková, CSc.
Brno 2014
Bibliografický záznam Autor:
Marie Štefková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie
Název práce:
Sekundární metabolity rostlin – přínos pro rostlinu i člověka
Studijní program:
Experimentální biologie
Studijní obor:
Molekulární biologie a genetika
Vedoucí práce:
Doc. RNDr. Jana Řepková, CSc.
Akademický rok:
2014
Počet stran:
48
Klíčová slova:
Biosyntéza; Bobovité; Genové inženýrství; Sekundární metabolity
Bibliographic Entry Author:
Marie Štefková Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology
Title of Thesis:
Plant secondary metabolites – benefit for a plant and humen
Degree Programme: Experimental Biology Field of Study:
Molecular Biology and Genetics
Supervisor:
Doc. RNDr. Jana Řepková, CSc.
Academic Year:
2014
Number of Pages:
48
Keywords:
Biosynthesis; Fabaceae; Genetic engineering; Secondary metabolites
Abstrakt Tato bakalářská práce shrnuje poznatky o hlavních skupinách sekundárních metabolitů rostlin a jejich biosyntéze u širšího spektra druhů, zabývá se možnostmi jejich biotechnologické produkce na základě identifikace genů pro klíčové enzymy. Blíže se věnuje čeledi bobovité a jejímu významu pro člověka z hlediska využití sekundárních metabolitů.
Abstract This work summarizes the knowledge about the main groups of plant secondary metabolites and their biosynthesis in wider range of plant species, deals with the possibility of their biotechnological production based on the identification of genes for key enzymes. It provides a closer look at the Fabaceae family and its importance for humans in terms of utilization of secondary metabolites.
Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala své školitelce Doc. RNDr. Janě Řepkové, CSc. za odborné vedení, cenné rady, ochotu a čas, který mi věnovala při řešení zadané problematiky.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 5. května 2014
………………………. Marie Štefková
Obsah: 1.
Úvod.......................................................................................................................11
2.
Sekundární metabolity ........................................................................................12
3.
4.
5.
6.
2.1.
Primární a sekundární metabolismus .......................................................12
2.2.
Význam pro rostlinu a člověka ................................................................12
Terpenoidy ............................................................................................................14 3.1.
Biosyntéza ................................................................................................15
3.2.
Identifikace genů ......................................................................................16
3.3.
Studium funkcí genů a biotechnologie ....................................................17
Alkaloidy ...............................................................................................................19 4.1.
Biosyntéza ................................................................................................20
4.2.
Studium funkcí genů a biotechnologie ....................................................21
Fenylpropanoidy a fenolické látky .....................................................................22 5.1.
Biosyntéza ................................................................................................23
5.2.
Identifikace genů ......................................................................................24
5.3.
Studium funkcí genů a biotechnologie ....................................................25
Bobovité (Fabaceae) .............................................................................................27 6.1.
Studium funkcí genů a biotechnologie ....................................................28
7.
Závěr......................................................................................................................31
8.
Literatura ..............................................................................................................33
Příloha ............................................................................................................................42
Seznam použitých zkratek ABA
abscisic acid (kyselina abscisová)
ACAT
acetyl-coenzyme A acetyltransferase (acetoacetyl-koenzym A transferáza)
AK
aminokyselina
BIA
benzyilisoquinoline alkaloid (benzylisochinolinový alkaloid)
cDNA
complementary DNA (komplementární DNA)
DFR
dihydroflavonol 4-reductase (dihydroflavonol-4-reduktáza)
DXS
1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (1-deoxy-D-xylulózo-5-fosfátsyntáza)
DXR
1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (1-deoxy-D-xylulózo-5-fosfátreduktoisomeráza)
ER
endoplazmatické retikulum
F3H
flavanone 3-hydroxylase (flavanon-3-hydroxyláza)
F35H
flavonoid 3,5-hydroxylase (flavonoid-3,5-hydroxyláza)
FPP
farnesyl diphosphate (farnesyldifosfát)
GGPP
geranylgeranyl diphosphate (geranylgeranyldifosfát)
GPP
geranyl diphosphate (geranyldifosfát)
HMG-CoA
3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (3-hydroxy-3-methylglutaryl-koenzym A)
IFS
isoflavone synthase (isoflavonsyntáza)
IPP
isopentenyl diphosphate (isopentenyldifosfát)
LCY-b
lycopene β-cyclase (lykopen β-cykláza)
MEP
methylerythritol phosphate (methylerythritolfosfát)
MIA
monoterpenoid indole alkaloid (monoterpenoidní indolový alkaloid)
MVA
mevalonic acid (kyselina mevalonová)
MVD
mevalonate 5-pyrophosphate decarboxylase (mevalonát-5-pyrofosfátdekarboxyláza)
MVK
mevalonate kinase (mevalonátkináza)
NPAA
non-proteinogenic amino acid (neproteinogenní aminokyselina)
ODPA
β-oxalyl αβ-diamino propionic acid (α-amino-β-oxalylamino propionová kyselina)
PAL
phenylalanine ammonia-lyase (fenylalanin amonium lyáza)
PDS
phytoene desaturase (fytoendesaturáza)
PMK
phosphomevalonate kinase (fosfomevalonátkináza)
PSY
phytoene synthase (fytoensyntáza)
RNAi
RNA interference
SM
sekundární metabolity
TAL
tyrosine ammonia-lyase (tyrosin amonium lyáza)
TXS
taxadiene synthase (taxadiensyntáza)
1. Úvod Sekundární metabolity byly využívány již dávno v lidské historii, ale teprve v posledních desetiletích se věda začala podrobněji zabývat touto skupinou látek. V rostlinné říši se ukrývá velké biochemické bohatství a nemalou část tvoří právě sekundární metabolity. Pro rostlinu samotnou jsou tyto látky otázkou přežití, protože zprostředkovávají důležité interakce s životním prostředím. Pro člověka se postupně staly rovněž nenahraditelnými a to v mnoha odvětvích – ve farmacii, v potravinářství, zemědělství i průmyslu. Čeleď bobovité (Fabaceae) zahrnuje mnoho důležitých zemědělských plodin, pícnin a zdrojů významných sekundárních metabolitů. Je tedy častým cílem výzkumu právě v této oblasti. V této bakalářské práci se zaměřím na chemickou klasifikaci sekundárních metabolitů obecně u širšího spektra druhů a zmíním nejdůležitější funkce, které tyto látky plní v rostlinách, i jejich význam pro člověka. Budou popsány známé biosyntetické dráhy hlavních skupin sekundárních metabolitů spolu s identifikací genů, které kódují nejdůležitější enzymy těchto drah. S těmito poznatky souvisí jejich další aplikace v různých biotechnologických postupech a experimentech. Na závěr se budu podrobněji věnovat biochemické charakteristice čeledi bobovité a shrnu nejdůležitější oblasti výzkumu v rámci této čeledi z hlediska využití hlavních druhů sekundárních metabolitů.
11
2. Sekundární metabolity 2.1. Primární a sekundární metabolismus Při pohledu na dva typy metabolismů rostlin, primární a sekundární, nacházíme mnoho rozdílů, ale i podobností. Hlavním rozdílem je využití jejich produktů rostlinou. Všechny látky, které jsou nezbytné pro růst a vývoj rostliny a zajištění životně důležitých procesů, jsou výsledkem metabolismu primárního, a ten je vlastní všem rostlinám a druhům. Látky, které se na základních procesech nepodílejí, řadíme do metabolismu sekundárního a často jsou specifické jen pro určitý taxon rostlin. Jsou výsledkem adaptace rostliny, zprostředkovávají interakce s prostředím jako je ochrana proti býložravcům, patogenům, nepříznivým podmínkám; pro rostlinu je důležitá i atraktivnost pro opylovače nebo schopnost kompetice vůči ostatním rostlinám. Společné rysy obou metabolismů plynou z jejich společného původu. Za nejpravděpodobnější způsob evoluce genů, které exprimují produkty pro sekundární metabolismus se považuje duplikace genů primárního metabolismu a jejich následná diversifikace (Pichersky a Gang, 2000). Tyto geny se často vyskytují ve formě tandemových repeticí, a pokud jsou zahrnuty ve stejné metabolické dráze, jsou organizovány ve formě tzv. klastrů.
2.2. Význam pro rostliny a člověka Přestože se sekundární metabolity (SM) nepodílejí na základním fungování rostliny, o jejich důležitosti není pochyb. Jsou přítomny ve všech vyšších rostlinách a jsou spojovány s vysokou diferenciací, tj. tvorbou specializovaných pletiv pro jejich ukládání (květy, listy, cibule, oddenky, hlízy, kořeny, plody, semena, pletiva kůry a dřeva). Obvykle v daném taxonu dominuje vždy jedna skupina chemicky příbuzných látek, jejíž složení se mění v závislosti na stupni vývoje rostliny a životních podmínkách. SM plní v rostlinách velmi různorodé funkce, nejčastěji jde však o ochranu rostliny proti škůdcům (mikroorganismy, hmyz) a býložravým zvířatům, dále je to atraktivnost pro opylovače a konzumenty plodů (důležité pro šíření semen), což zajišťuje barva i vůně květů a plodů. Velmi rozšířenými SM jsou lignin a suberin, které v rostlině fungují jako stavební a ochranné komponenty. Z těch méně častých funkcí bych chtěla zmínit inhibici klíčení semen jiných druhů rostlin, ochranu proti UV záření, signální molekuly, chutě a esence (vanilin, kapsaicin, myristicin, gingerol, epikatechin aj.). 12
Pro člověka mají SM význam především jako léčiva a potravinové doplňky. Některé z nich byly dokonce užívány už ve starověku – šlo především o alkaloidy obsažené v rostlinných extraktech (atropin, morfin, koniin aj.) a měly široké využití jako sedativa, projímadla, léky proti kašli, horečce, hadímu kousnutí či byly dokonce používány k léčbě šílenství. V současném farmaceutickém průmyslu představují SM nezastupitelný podíl léčiv a stále je co objevovat. Některé ze SM známe pro jejich biologické účinky i v negativním smyslu – drogy heroin, kokain, nikotin a tetrahydrokanabinoidy, které způsobují závislost. Některé ze SM nacházejí uplatnění v potravinářském průmyslu jako ochucovadla a esence a nemohu opomenout využití esencí v parfumerii. Mají velký význam v zemědělství, kde se usiluje o co nejlepší užitkovost a zdraví prospěšnost pícnin a plodin v souvislosti s obsahem SM. Plní také funkci pesticidů nebo jsou cílem šlechtění, protože ovlivňují barvu květů či jiné fenotypové projevy závislé na produkci SM. S pokračujícím výzkumem v této oblasti význam SM pro člověka narůstá a objevují se nové možnosti jejich využití. To vede ke snahám o pozměnění sekundárního metabolismu rostlin prostřednictvím introdukce genů, což může vést ke zlepšení kvality zemědělských plodin, či dokonce k využití rostlin jako „bioreaktorů“ produkujících potřebné látky. SM můžeme rozdělit do skupin podle mnoha kritérií, zde zvolím klasifikaci podle jejich biosyntetického původu. V následujících kapitolách se tedy budu zabývat třemi základními skupinami: Terpenoidy, alkaloidy a fenylpropanoidy s příbuznými fenolickými látkami.
13
3. Terpenoidy Terpenoidy jsou asi strukturně nejvariabilnější skupinou SM. Obecně vznikají opakovaným sloučením pětiuhlíkatých izoprenových jednotek. Jednotky se nejčastěji spojují za sebou (head-to-tail) nebo také proti sobě (head-to-head). Od počtu těchto jednotek se odvíjí názvy jednotlivých skupin terpenoidů – hemiterpeny (1), monoterpeny (2), seskviterpeny (3), diterpeny (4), triterpeny (6), tetraterpeny (8), polyterpeny (více než 8), meroterpeny (částečné deriváty terpenoidů). Monoterpeny jsou především různé esence z květin a esenciální oleje bylin a koření. Mají široké využití jako parfémy a příchutě (např. deriváty limonenu mentol a karvon). U rostlin plní funkci lákadla pro opylovače (linalool, eukalyptol). Kafr je známou látkou užívanou v lékařství, má však také insekticidní účinky a zbraňuje klíčení semen jiných druhů rostlin. Patří sem také pyrethriny, komerčně využívané jako přírodní insekticidy. Seskviterpeny také nacházíme v esenciálních olejích. Některé z těchto sloučenin fungují jako fytoalexiny, což jsou nízkomolekulární látky, poskytující rostlinám antimikrobiální ochranu. Jejich syntézu indukuje napadení škůdci a způsobují rezistenci vůči danému patogenu (např. kapsidiol a lubimin, shrnuto v Smith, 1996; Ahuja et al., 2012; Jeandet et al., 2013). Některé fungují jako ochrana rostliny proti býložravcům (gossypol). Řadíme zde i artemisinin, který se užívá jako antimalarikum. Diterpeny zahrnují rostlinné hormony gibereliny, pryskyřičné kyseliny (kyselina abietová), fytoalexiny a řadu farmaceuticky významných látek např. cytostatikum a protirakovinnou látku taxol. Mezi triterpeny řadíme brassinosteroidy, fytoalexiny, toxiny a součásti povrchových vosků. Jejich modifikacemi vznikají fytoekdysony (analogy hormonů hmyzu), saponiny (detergenty, ochrana proti býložravým zvířatům), kardenolidy (toxiny) či digitoxin (součást léčiv). Nejdůležitější z tetraterpenů jsou karotenoidní barviva, která hrají zásadní roli při fotosyntéze a pro člověka jsou nezbytné – zejména β-karoten jako prekurzor vitaminu A. Polyterpeny zahrnují chinonové přenašeče a látky s velmi dlouhými řetězci, které jsou např. součástí latexu, a poslední skupinou jsou meroterpeny, což jsou různorodé deriváty terpenů, často látky obsahující vedlejší terpenoidní řetězec (cytokininy, fenylpropanoidy, některé alkaloidy).
14
3.1. Biosyntéza Produkce, akumulace a sekrece terpenoidů většinou souvisí se specializovanými pletivy a strukturami rostliny (glandulární trichomy, glandulární epitely okvětních lístků, pryskyřičné kanálky, různě specializovaná epidermis atp.), což slouží především k izolaci tohoto metabolismu od ostatních a zabraňuje autotoxicitě. Metabolismus je rozdělen i v rámci jedné buňky – seskviterpeny, triterpeny a polyterpeny jsou pravděpodobně produkovány v cytosolu a endoplasmatickém retikulu (ER), zatímco monoterpeny, diterpeny, tetraterpeny aj. jsou tvořeny v plastidech (McGarvey a Croteau, 1995). Biosyntézu všech terpenoidů můžeme shrnout do čtyř obecných kroků:
syntéza prekurzoru isopentenyldifosfátu (IPP)
opakované adice IPP a tímto vznik sérií homologů prenyldifosfátu (prekurzory různých skupin terpenoidů)
tvorba základních terpenoidních koster
sekundární enzymatické modifikace (výsledkem je velká variabilita produktů)
Syntéza IPP se odehrává dvěma cestami a to acetát-mevalonátovou (MVA) v cytosolu a ER nebo glyceraldehyd fosfát-pyruvátovou (methylerythritolfosfátovou, MEP) v plastidech, jak vidíme na schématu (Příloha, obr. 1; Croteau et al., 2000). IPP je dále využito v sérii elongačních reakcí a vznikají homology prenyldifosfátu, což jsou prekurzory různých skupin terpenoidů (Příloha, obr. 2). Tyto sloučeniny mohou být připojeny jako boční řetězce k různým neterpenoidním sloučeninám, např. k proteinům, nebo podstupují další reakce především cyklizace (většina terpenoidů je cyklických), dále oxidace, redukce, isomerizace, konjugace aj. Tyto reakce jsou katalyzované terpenovými syntázami a vzniká široké spektrum terpenoidních produktů. Limonen syntáza je modelovým enzymem pro tvorbu monoterpenoidů (limonen, linalool, α- a β-pinen aj.). Ionizací geranyldifosfátu (GPP) vzniká isomer linalyldifosfát, který je při vazbě na enzym schopen cyklizace. Vzniká šestičetný cyklický karbokation, který podstupuje další úpravy, dokud není reakce ukončena deprotonizací či vazbou na nukleofil (např. vodu). Tato
jednoduchá
reakce
se
v drobných
obměnách
využívá
při
syntéze
většiny
monoterpenoidů. Nejznámější syntázou seskviterpenů je epi-aristolochensyntáza z tabáku. Cykluje farnesyldifosfát (FPP) a katalyzuje přesun methylu, čímž vzniká olefinový prekurzor fytoalexinu kapsidiolu. Vetispiradiensyntáza z bramboru poskytuje olefinový prekurzor fytoalexinu lubiminu a δ-kadiensyntáza olefinový prekurzor gossypolu. Některé syntázy, 15
které se podílí na tvorbě pryskyřice jehličnanů, jsou dokonce schopny samostatné produkce až 25 různých olefinů. U diterpenů se setkáváme se dvěma typy reakcí s geranylgeranyldifosfátem (GGPP). První je cyklizace zahrnující ionizaci esteru difosfátu a vzniklý karbokation napadá dvojnou vazbu substrátu. Takto působí např. kasbensyntáza, která katalyzuje vznik fytoalexinu kasbenu ve skočci. Taxadiensyntáza využívá podobného byť o něco složitějšího mechanismu k produkci olefinového prekurzoru pro taxol. Druhým typem cyklizace, kterou využívá např. abietadiensyntáza, je protonace koncové dvojné vazby za vzniku karboniového iontu, který zahajuje první cyklizaci. Ionizace esteru difosfátu zajistí druhou cyklizaci a vzniká olefin abietadien. Oxidací methylové skupiny vzniká kyselina abietová, která je jednou z nejběžnějších látek v pryskyřici jehličnanů a je důležitá pro hojení jejich ran. Před cyklizací u triterpenů nejprve dochází ke spojení dvou molekul FPP proti sobě a vzniká skvalen (katalýza skvalensyntázou). Oxidací vzniká oxidoskvalen, který je pak cyklizován na cykloartenol – prekurzor fytosterolů a brassinosteroidů. Syntéza tetraterpenů začíná analogicky spojením dvou molekul GGPP proti sobě a vzniká fytoen (katalýza fytoensyntázou). Série desaturací způsobí cyklizaci v šestičetné kruhy na konci řetězce – takto vzniká např. β-karoten z lykopenu (Příloha, obr. 3; Diretto et al., 2006). Konečným krokem syntézy jsou nejrůznější modifikace terpenoidních koster (oxidace, redukce, isomerizace a konjugace) a také připojování různých postranních řetězců a funkčních skupin, které zajišťují variabilitu struktur a tím také rozmanitost funkcí terpenoidů.
3.2. Identifikace genů Sekvence genů, které kódují enzymy biosyntetických drah, byly identifikovány opakovaně a to u mnoha druhů rostlin. V této i dalších kapitolách uvedu pouze příklady úspěšného klonování a popisu těchto genů. Doposud bylo identifikováno mnoho genů kódujících enzymy mevalonátové dráhy syntézy IPP. První cDNA kódující rostlinnou HMG-CoA-syntázu byla izolována z Arabidopsis thaliana (Montamat et al., 1995). HMG-CoA-reduktáza je u vyšších rostlin kódována genovou rodinou v jaderné DNA (Lichtenthaler et al., 1997) a počty genů se liší v závislosti na druhu rostliny, např. u bavlny tato rodina představuje dva geny (Loguercio et al., 1999) a u rajčete dva i více genů (Narita a Gruissem, 1989), tři kopie byly nalezeny u rýže (Ha et al., 2001) a čtyři geny u kaučukovníku (Sando et al., 2008). U kaučukovníku byly např. identifikovány i geny zbývajících enzymů této dráhy (ACAT, MVK, PMK a MVD). 16
Jsou známy sekvence genů, kódujících i některé enzymy dráhy MEP – DXS a DXR (Zhang et al., 2009; Yan et al., 2009). Enzym DXS je lokalizován v plastidech a bylo prokázáno, že je limitujícím enzymem pro syntézu karotenoidů (Lois et al., 2000). Je tedy, spolu s enzymem fytoensyntázou (PSY), důležitým regulačním faktorem této dráhy. Sekvence genů kódujících IPP isomerázu byly charakterizovány u několika rostlinných druhů (Campbell et al., 1997; Oh et al., 2000). Geny kódující GPP-syntázu, FPPsyntázu a GGPP-syntázu jsou známy např. u tolice vojtěšky (Sun et al., 2013), z nichž gen pro FPP-syntázu je zřejmě klíčový při regulaci syntézy saponinů a má také vliv na regulaci růstu. Počty genů kódujících tyto enzymy se liší u různých druhů rostlin. Byly popsány geny pro některé z dříve zmíněných terpenových syntáz, jako jsou limonen syntáza z máty (Colby et al. 1993) a taxadiensyntáza z tisu (TXS; Kai et al. 2005). Exprese genu pro TXS je zřejmě řízena koncentrací methyljasmonátu, což je rostlinný stresový hormon. Dále byly popsány geny pro skvalensyntázu (Arabidopsis thaliana; Nakashima et al., 1995) či PSY (tomel; Zhao et al., 2011), která je klíčovou pro syntézu karotenoidů. Tato dráha patří mezi nejlépe popsané, co se týče enzymů a jejich genů.
3.3. Studium funkcí genů a biotechnologie Genové modifikace u rostlin za účelem úpravy sekundárního metabolismu byly provedeny jak u buněčných a orgánových kultur, tak u celých rostlin. Obecně jde o změny metabolických cest za použití genů pro biosyntetické enzymy a pro regulační proteiny. Také bylo využito blokování kompetitivních metabolických cest pomocí „antisense“ (protismyslových) sekvencí genů. Hlavní překážkou pro tento způsob biotechnologie je nedostatečná znalost všech sekundárních metabolických cest v rostlinách a také nedostatek identifikovaných genů, které jsou s nimi spojeny (shrnuto v Verpoorte a Memelink, 2002). Ačkoli se mnoho pokusů již setkalo s úspěchem, stále neumíme dokonale porozumět různým úrovním exprese transgenů u různých transformantů. Dalším problémem jsou mezidruhové rozdíly. V některých případech vedla nadměrná exprese k produkci neočekávaných metabolitů, což poukazuje na komplexnost metabolických cest a na nedostatek znalostí, které máme o nich a jejich regulaci. V této kapitole bych chtěla zmínit některé z úspěšných experimentů, které se zabývaly SM ze skupiny terpenoidů. Pozornost například přitáhla skupina monoterpenů, které jsou hlavní složkou esenciálního oleje z máty peprné (Mintha piperita). Máta byla transformována homologní sekvencí cDNA genu kódujícího enzym DXR, což vedlo ke zvýšené produkci esenciálního oleje o 50 % (bez změny jeho složení; Mahmoud a Croteau, 2001). Rostliny 17
transformované protismyslovou sekvencí cDNA pro mentofuransyntázu se vyznačovaly sníženou produkcí mentofuranu a pulegonu, které jsou považovány za nežádoucí složky tohoto esenciálního oleje. Velmi zajímavým cílem pro genové inženýrství je produkce karotenoidů. Jsou důležitými antioxidanty a β-karoten je prekurzorem pro vitamin A. Nedostatek vitaminu A je v populaci velmi rozšířen a zavedení genu pro syntézu β-karotenu do základní potraviny, jako je rýže, by mohlo tento problém vyřešit (projekt „zlatá rýže“). Semena rýže (Oryza sativa) ve svém endospermu neobsahují žádný β-karoten ani jeho C40 prekurzor, byla však zjištěna přítomnost GGPP (Burkhardt et al., 1997). Klíčová tedy byla introdukce genu pro PSY, konkrétně z narcisu (Narcissus pseudonarcissus), čímž bylo dosaženo produkce fytoenu. V následujícím pokusu byl navíc introdukován gen crtI z bakterie Erwinia uredovora pro fytoendesaturázu (PDS) a gen pro lykopen β-cyklázu (LCY-b) opět z narcisu (Ye et al., 2000). Množství karotenoidů v endospermu tohoto transformanta bylo odhadnuto na 1,6 µg na gram rýže. Záměnou genu z narcisu za gen pro PSY z kukuřice (Zea mays) bylo dosaženo ještě větší produkce, až 37 µg na gram rýže (Paine et al., 2005).
18
4. Alkaloidy Alkaloidy jsou dusíkaté sloučeniny syntetizované z aminokyselin (AK). Zpravidla mají v rostlinách obranné funkce a mají velmi široké spektrum účinků na živočišné organismy. Alkaloidy byly užívány jako léčiva a drogy už dávno v lidské historii. Asi 20 % rostlinných druhů produkuje alkaloidy (De Luca a Laflamme, 2001) a každý z nich se vyznačuje unikátním a definovaným spektrem těchto látek. Ochota rostlin investovat cenný dusík do těchto sloučenin napovídá o jejich důležitosti. Doposud bylo izolováno více než 12 000 různých alkaloidů. Indolové alkaloidy jsou odvozeny od AK tryptofanu a často obsahují terpenoidní řetězce, např. monoterpenoidní indolové alkaloidy (asi 3000 známých struktur). Mezi indolovými alkaloidy najdeme vinblastin, vinkristin a kamptotecin (cytostatika), chinin (antimalarikum),
strychnin
(jed
na
krysy),
ajmalin
(antiarytmikum)
či
johimbin
(afrodiziakum). V rostlinách jim bývá přiřazena funkce ochrany proti škůdcům a patogenům. Pyrolizidinové, tropanové a pyrolidinové alkaloidy jsou odvozeny od AK ornithinu a najdeme zde hyoscyamin, atropin a skopolamin (parasympatolytika) či kokain. Biosynteticky příbuzným se skupinou tropanových alkaloidů je také nikotin (odvozen z kyseliny nikotinové), který v rostlinách funguje jako přirozený insekticid. Pyrolizidinové alkaloidy (kmen Senecionae) se projevují jako savčí protoxiny. Po transformaci cytochromem P450 v játrech se stávají vysoce toxické a jsou zodpovědné za otravy dobytka. Piperidinové a chinolizidinové alkaloidy (výskyt zejména v čeledi Fabaceae) jsou odvozeny od AK lysinu. Jako příklad mohu uvést koniin (jed z bolehlavu), piperin (obsažen v černém pepři), lobelin (analeptikum) a lupinin (jed z vlčího bobu). Tyto alkaloidy (především chinolizidinové) mají často toxické účinky na býložravá zvířata. Mezi
alkaloidy
odvozené
od
fenylalaninu
a
tyrosinu
patří
především
benzylisochinolinové alkaloidy (asi 2500 struktur) jako jsou papaverin (relaxace hladkého svalstva), berberin a sanguinarin (antimikrobiální látky), morfin a kodein (analgetika). Dále sem řadíme alkaloidy kolchicin (vřeténkový jed), kapsaicin (pálivost chilli papriček), efedrin (léčba astmatu, droga), meskalin (psychotropní látka) či chloramfenikol (antibiotikum). Díky svým účinkům na živočichy slouží rostlině často jako ochrana proti býložravcům a patogenům. Purinové alkaloidy jsou v rostlinách velmi rozšířené a patří sem kofein (přirozený insekticid), theofylin a theobromin (alkaloid z kakaovníku). 19
4.1. Biosyntéza Různé strukturní skupiny alkaloidů jsou na rozdíl od jiných SM mnohdy biosynteticky i fylogeneticky nepříbuzné, což znesnadňuje objevení jejich metabolických drah. Produkty se mohou hromadit na místě své syntézy, velmi často jsou ale transportovány a uloženy jinde, než je jejich původní místo syntézy, či syntéza intermediátů pokračuje v jiných částech rostliny (Facchini a St-Pierre, 2005). Studie odhalily, že chemické transformace alkaloidů jsou katalyzovány enzymy, které jsou vysoce substrátově specifické a často se vyskytují pouze v určitých druzích rostlin (Croteau et al., 2000). Syntéza většiny alkaloidů začíná dekarboxylací aminokyseliny (např. ornithin, lysin, tyrosin, tryptofan či histidin) a vzniká příslušný amin, nebo na počátku stojí kyselina nikotinová či kyselina 2-aminobenzoová (De Luca a Laflamme, 2001). Následuje párování těchto aminů a vznikají základní intermediáty (univerzální kostry), ze kterých je dále syntetizováno široké spektrum konečných produktů. Příkladem takovýchto intermediátů jsou striktosidin,
norkoklaurin,
1,3-dihydroxy-N-methylakridon
a
homospermidin,
které
předcházejí tvorbě monoterpenoidních indolových, isochinolinových, akridinových a pyrolizidinových alkaloidů, přičemž první dva zmíněné intermediáty jsou univerzálními zdroji dokonce pro více než 50 % všech popsaných alkaloidů. Kompletní syntetické dráhy nejsou u většiny látek zdaleka známy, ale bylo dosaženo určitého pokroku. Doposud byly částečně popsány biosyntetické dráhy čtyř podskupin alkaloidů – benzylisochinolinové alkaloidy (BIA; Příloha, obr. 4), monoterpenoidní indolové alkaloidy (MIA; Příloha, obr. 4), tropanové alkaloidy a purinové alkaloidy (Příloha, obr. 5; shrnuto v Leonard et al., 2009). Modelovými rostlinami pro studium metabolismu alkaloidů se staly mák setý (Papaver somniferum) a barvínek růžový (Catharanthus roseus), a to díky množství cDNA, kódujících enzymy metabolismu a regulační proteiny, které byly u těchto rostlin doposud popsány (shrnuto v Facchini a De Luca, 2008). V rostlině máku najdeme především alkaloidy ze skupiny BIA. Doposud bylo izolováno alespoň 20 sekvencí kódujících enzymy jejich biosyntézy. Barvínek je cennou léčivou rostlinou a produkuje především alkaloidy ze skupiny MIA. Je jediným zdrojem protirakovinných látek vinblastinu a vinkristinu.
20
4.2. Studium funkcí genů a biotechnologie Zatímco se výzkum zaměřuje na kompletní odhalení metabolických drah alkaloidů, známé enzymatické kroky již byly využity v genovém inženýrství, a to pro zvýšení produkce některých alkaloidů či pro jejich eliminaci. Příkladem může být experiment, kdy byl v rostlině kávy umlčen gen pro theobrominsyntázu pomocí RNA interference (Ogita et al., 2003). Výsledkem bylo snížení obsahu kofeinu v těchto rostlinách až o 70 %. Ještě větší úspěch mělo umlčení genu pro N-methyltransferázu, což snížilo obsah kofeinu až na 3,8 % oproti kontrole (Kumar et al., 2005). V současnosti se vědci snaží o umlčení metabolismu kofeinu pouze v semenech tak, aby ve vegetativních částech rostliny zůstal naopak zachován. Zvýšená produkce farmaceuticky významných alkaloidů je asi nejčastějším cílem genových inženýrů u této skupiny látek. Například byl vytvořen transgenní rulík zlomocný (Atropa belladona), který produkuje skopolamin (Yun et al., 1992). Tato rostlina běžně produkuje pouze hyoscyamin, ale byl do ní vložen gen z blínu černého (Hyoscyamus niger) pro enzym hyoscyamin-6β-hydroxylázu, která katalyzuje přeměnu hyoscyaminu ve skopolamin. K získání hojně se vyskytujících alkaloidů stačí extrakce z rostlin, ale pro zisk těch vzácnějších je zřejmě nutné vyvinout alternativní způsoby produkce (Leonard et al., 2009). Jedním z nich jsou kultury nediferencovaných rostlinných buněk, které mají schopnost produkovat stejné SM jako mateřská rostlina. Produkce mnoha alkaloidů však souvisí s konkrétním druhem pletiva a stadiem vývoje rostliny, v tomto případě jsou tedy využívány spíše kultury rostlinných pletiv (např. kořenové kultury). Dalším způsobem je produkce alkaloidů pomocí mikroorganismů, jako jsou Escherichia coli či Streptomyces cerevisiae.
21
5. Fenylpropanoidy a fenolické látky Fenylpropanoidy a fenolické látky mají pro rostliny nepostradatelný význam. Mnoho z nich plní strukturní a ochrannou funkci v buněčných stěnách (lignin, suberin), a tedy sehrály důležitou roli při přechodu rostlin z vodního prostředí na souš. Suberin ochraňuje pletiva především před ztrátou vody a zabraňuje invazi patogenů. Lignin je základní složkou dřeva a zajišťuje odolnost v tlaku. Do této skupiny patří také široké spektrum látek s různorodými funkcemi jako ochrana rostliny (např. lignan pinoresinol, dále podofylotoxin a sezamin), odolnost dřevnatých částí, barva květů, chutě a vůně (flavonoidy, vanilin, kyselina chlorogenová z kávy, cinnamylaldehyd ze skořice, gingeroly ze zázvoru, chavikol a eugenol z hřebíčku, safrol a myristicin
z muškátového
oříšku,
fenylethyl
alkohol
z orchideje,
epikatechin
a
epigallokatechin z čaje). Fenolické látky také představují většinu sloučenin ze skupiny fytoalexinů, z nichž mohu vyjmenovat např. daidzein a genistein (isoflavony), medikarpin a pisatin (pterokarpany z rostlin čeledi Fabaceae), resveratrol (stilben) či skopoletin (kumarin). Nejširší skupinou z výše uvedených jsou flavonoidy (asi 4500 sloučenin), které se nacházejí ve většině rostlinných pletiv. Patří sem antokyany (barviva pelargonidin, kyanidin, delfinidin), kondenzované taniny neboli proantokyanidiny (ochrana proti býložravcům, ochrana dřeva), hydrolyzovatelné taniny (ochrana proti býložravcům), isoflavonoidy (ochranné látky a signální molekuly, např. luteolin a apigenin), kumariny, furanokumariny a stilbeny (ochrana proti bakteriálním a houbovým patogenům, inhibice klíčení semen), tetrahydrocannabinol (psychoaktivní látka) a kaempferol (ochrana proti UV-B záření). Mnoho z těchto látek je využíváno v lékařství jako modulátory imunitních a zánětlivých reakcí, protirakovinné a protivirové látky, antioxidanty a hepatoprotektivní látky. Kumariny (benzpyrany) jsou velkou skupinou látek, které nalézáme především v plodech a květech. Pravděpodobně se také podílejí na obraně rostliny. Po požití mohou způsobovat vnitřní krvácení u savců (vynález rodenticidu Warfarinu). Další z obranných látek – psoralen – způsobuje fotofytodermitidu při styku s kůží v kombinaci s expozicí UV-A záření. Dnes se využívá pro léčbu různých kožních onemocnění (ekzém, lupénka). Kumarin (+)-calanolid A je novinkou v boji proti viru HIV (inhibitor reverzní transkriptázy) a v současnosti podstupuje klinické testy (Cragg a Newman, 2003). Stilbeny hrají roli při ochraně dřeva před napadením houbami a dokáží inhibovat růst jiných rostlin. Z lékařsky významných látek sem patří kombretastatin (protirakovinná látka) a resveratrol (obsažen v červeném víně, protirakovinná látka). 22
5.1. Biosyntéza Většina fenylpropanoidů a fenolických
látek je původem z fenylpropanoidové a
fenylpropanoid-acetátové dráhy, jsou tedy derivovány z fenylalaninu a tyrosinu (Croteau et al., 2000). Některé fenolické látky jsou však produkovány alternativními drahami, například hydrolyzovatelné taniny jsou kopolymery sacharidů s kyselinou gallovou a elagovou. Prvním a asi nejstudovanějším enzymem této dráhy je fenylalanin amonium lyáza (PAL), která konvertuje fenylalanin na kyselinu skořicovou. Tyrosin amonium lyáza (TAL) zase konvertuje tyrosin na kyselinu p-kumarovou. Uvolněný amonný kation je recyklován pomocí glutaminsyntetázy a glutamátsyntetázy. Váže se na glutamát, který aminoskupinu přesouvá na prefenát a vzniká arogenát, který je prekurzorem fenylalaninu a tyrosinu. Tím je zajištěn stálý přísun těchto aromatických aminokyselin pro syntézu fenolických látek. V následujícím
schématu
(Příloha,
obr.
6)
je
znázorněn
metabolismus
fenylpropanoidů, který vede k produkci monolignolů (prekurzor lignanů a ligninů, představují asi 30 % organického uhlíku v biosféře), p-kumaryl-, koniferyl- a sinapylalkoholu a dalších podskupin fenolických látek. Přeměna kyseliny p-kumarové na její estery je znázorněna jako síť, protože rostliny pravděpodobně neužívají pouze jedinou cestu syntézy. Lignany jsou tvořeny přednostně z koniferylalkoholu, kdy dochází k přísně stereoselektivnímu párování dvou těchto molekul. Tato reakce, objevena poprvé u druhu Forsythia, začíná jednoelektronovou oxidací za pomoci enzymu lakázy (nebo podobného enzymu) a vznikají volné radikály. Jejich párování kontroluje tzv. řídící protein, který tyto molekuly spojí pouze vazbou 8-8‘ a nedochází tak k náhodnému spojování. Vzniká intermediát (+)-pinoresinol či (-)-pinoresinol (opticky aktivní látky), což se může lišit i v rámci těla jedné rostliny. Pinoresinol pak může podstoupit různé modifikace, které se liší v závislosti na druhu rostliny, např. konverze na matairesinol, který je prekurzorem kyseliny plikatové a podofylotoxinu, z pinoresinolu je syntetizován např. také sezamin. Syntéza lignanů je podobná syntéze ligninů. Ligniny však jako stavební prvky užívají směs stavebních molekul, u nahosemenných je to koniferylalkohol a v menším rozsahu p-kumarylalkohol, u krytosemenných je to srovnatelné množství koniferylalkoholu a sinapylalkoholu. Syntéza flavonoidů probíhá zpočátku tak, jak můžeme vidět na schématu (Příloha, obr. 6). Za naringeninem se nachází jedno z nejdůležitějších rozcestí tohoto metabolismu – první cestou je syntéza flavanonů, která začíná migrací arylu C-2 na C-3 a hydroxylací (enzym isoflavonsyntáza, IFS), dostaneme 2-hydroxyisoflavanon, následuje dehydratace 23
enzymem isoflavanondehydratázou a vznikají isoflavony genistein a daidzein. Isoflavony mohou být dále metabolizovány, což se týká především čeledi Fabaceae, a tvoří fytoalexiny (např. medikarpin z Medicago sativa) nebo rotenoidy (tropické druhy). Druhou cestou je dehydratace naringeninu na pozici C-2/C-3 (enzym flavonsyntáza) a vznik flavonů jako je apigenin a třetí cestou je stereospecifická 3-hydroxylace naringeninu (enzym flavanon-3hydroxyláza) a vznik dihydroflavonolů (např. dihydrokaepferol). Z dihydroflavonolů dále mohou vznikat barviva antokyany a proantokyanidiny.
5.2. Identifikace genů Sekvence kódující enzym PAL byly popsány již u velkého množství rostlinných druhů např. u rýže, šalvěje, lékořice a ořešáku (Minami et al., 1989; Song a Wang, 2008; Jiang et al., 2010; Xu et al., 2012). Tento enzym je kódován malou genovou rodinou a jeho expresi spouští mnoho (především stresových) faktorů jako např. světlo, zranění či napadení patogenem. Vliv na expresi PAL má také kyselina abscisová (ABA, fytohormon) a to jak pozitivní (Jiang a Joyce, 2003) tak negativní (Mohr a Cahill, 2007). Podobné regulaci podléhají i ostatní enzymy této dráhy jako např. cinnamát-4-hydroxyláza, jejíž gen byl rovněž identifikován (Mizutani et al., 1993; Huang et al., 2008; Tuan et al., 2010). Byly také popsány sekvence genů pro chalkonsyntázu (Arioli et al., 1994; Pang et al., 2005). Tyto geny patří do malé genové rodiny a jejich sekvence jsou v různých rostlinných druzích strukturně konzervované, díky čemuž slouží jako model pro studium evolučních vztahů. Chalkonizomeráza je také kódována genovou rodinou a nalezneme ji ve formě dvou typů isoenzymů, které se mírně liší substrátovou specifitou (Shimada et al., 2003). První typ je běžně rozšířený, druhý typ je naopak typický pro čeleď Fabaceae. Byly také popsány sekvence genové rodiny kódující stilbensyntázu např. u révy (Vannozzi et al., 2012), kde tuto rodinu představuje až 48 členů. Tento enzym je klíčový pro syntézu resveratrolu a jiných stilbenů, které fungují jako fytoalexiny, a tedy není překvapivé, že stresové faktory zvyšují expresi některých z těchto genů. IFS je enzym přítomný téměř výhradně v rostlinách čeledi Fabaceae. V roce 1999 byla poprvé naklonována cDNA kódující enzym IFS z lékořice (Akashi et al., 1999a) a sójového bobu (Steele et al., 1999). Dále byly popsány cDNA kódující dva typy flavonsyntázy (Akashi et al., 1999b; Martens et al., 2001) a také sekvence genů pro enzym flavanon-3-hydroxylázu (Shen et al., 2006; Shen et al., 2010). Byly popsány také některé klíčové geny kódující enzymy syntézy antokyanů a proantokyanidinů např. u ostružiny (Chen 24
et al., 2012), jako jsou dihydroflavonolreduktáza, antokyanidinsyntáza, glykosyltrasferáza, leukoantokyanidinreduktáza, antokyanidinreduktáza a také jeden gen pro transkripční faktor z rodiny MYB. Již bylo získáno několik důkazů, že tyto transkripční faktory regulují biosyntetickou dráhu antokyanů (Espley et al., 2009; Chiu et al., 2010).
5.3. Studium funkcí genů a biotechnologie Pro zemědělství jsou velmi přínosnou oblastí výzkumu možnosti zvýšení rezistence plodin vůči patogenům. Toho je možné dosáhnout ovlivněním metabolismu fytoalexinů, z nichž mnoho řadíme právě do skupiny fenolických látek. Prvním úspěšným pokusem byla transformace rostliny tabáku (Nicotiana tabacum) geny pro stilbensyntázu z révy vinné (Vitis vinifera). V transformantech byla tímto indukována syntéza fytoalexinu resveratrolu a byla prokázána zvýšená rezistence k houbovému patogenu Botrytis cinerea (Hain et al., 1993). Od té doby bylo již provedeno mnoho dalších úspěšných i neúspěšných pokusů; z těch úspěšných to byla transformace genomu rýže stejným genem z révy, přičemž se zvýšila odolnost rostlin rýže k houbovému patogenu Piricularia oryzae (Stark-Lorenzen et al., 1997). Stejná transformace byla provedena u rajčete (Lycopersicon esculentum) a akumulace resveratrolu poskytla lepší odolnost vůči houbě Phytophthora infestans (Thomzik et al., 1997). Další podobné experimenty byly provedeny u ječmene a pšenice (Leckband a Lörz, 1998). U tolice vojtěšky (Medicago sativa) byl použit gen pro resveratrolsyntázu z podzemnice olejné (Arachis hypogaea) a produkovaný fytoalexin zvýšil odolnost rostliny k houbovému patogenu Phoma medicaginis (Hipskind a Paiva, 2000). Zajímavé jsou experimenty s metabolismem antokyanů, které jsou prováděny jak z důvodu estetického (změna barvy květů) tak pro pozitivní účinky antokyanů na lidské zdraví (produkce antokyanů v různých druzích ovoce a zeleniny). Jedním z pokusů o změnu barvy květů byl experiment, jehož výsledkem mělo být vytvoření modré odrůdy růže. V genomu růže (Rosa hybrida) byl exprimován gen pro flavonoid-3,5-hydroxylázu (F35H) z violky (Viola sp.), byl regulován vlastní gen pro dihydroflavonol-4-reduktázu (DFR) a navíc byl vložen a exprimován gen pro DFR z kosatce (Iris×hollandica; Katsumoto et al., 2007). Výsledkem byly do modra tónované květy (Obr. 1), což bylo způsobeno nově syntetizovaným barvivem delfinidinem. Takto modifikované rostliny byly navíc schopny přenést tuto vlastnost i do další generace. Tento experiment navazoval na obdobný úspěšný pokus, který byl proveden u karafiátu s bílými květy (Dianthus caryophyllus; Holton, 1996). V jeho
25
genomu byly ale exprimovány geny pro DFR a F35H z petúnie (Petunia hybrida). Květy transformantů měly fialový odstín.
Obrázek 1: Srovnání barvy květů růže (Rosa hybrida; Katsumoto et al., 2007) původního růžového kultivaru Lavande (vlevo) a po transformaci (vpravo). Některé z trasformovaných růží měly květy s menším obsahem antokyanů (uprostřed).
Vědci již provedli také mnoho pokusů např. na rajčatech, kdy se snažili o zvýšení obsahu antokyanů v plodech. Chtěla bych zmínit jeden obzvláště úspěšný experiment, kdy byly do rajčete (Solanum lycopersicum) vloženy geny z hledíku většího (Antirrhinum majus), konkrétně Ros1, který kóduje transkripční faktor typu helix-loop-helix, a Del, který kóduje transkripční faktor z rodiny MYB (Butelli et al., 2008). Zralé plody takto transformovaných rajčat byly tmavě fialové v celém objemu (Obr. 2) a obsahovaly množství antokyanů srovnatelné např. s ostružinami či borůvkami. Myši s „knockoutem“ Trp53–/–, které jsou náchylné k rakovině, byly následně krmeny stravou obohacenou o produkt připravený z plodů těchto rajčat. Takto krmené myši přežívaly výrazně delší dobu než kontrolní, kterým byla podávána strava s produktem z běžných rajčat.
Obrázek 2: Srovnání fenotypu zralých plodů rajčete (Solanum lycopersicum; Butelli et al., 2008; upraveno) standardního typu (nahoře) a trasformované linie Del/Ros1N (dole).
26
6. Bobovité (Fabaceae) Fabaceae je třetí největší čeledí kvetoucích rostlin. Patří sem přibližně 20 000 druhů zařazených do asi 750 rodů. Jsou ekologicky velmi významné díky své schopnosti vázat vzdušný dusík do sloučenin, které jsou využitelné i pro ostatní živé organismy. Toto je umožněno symbiotickým vztahem rostliny čeledě Fabaceae a bakterie rodu Rhizobium. V této čeledi najdeme mnoho průmyslově i zemědělsky významných plodin. Mezi nejznámější patří např. hrách setý, fazol obecný, sója luštinatá, podzemnice olejná, tolice vojtěška či jetel. Fabaceae je fytochemicky poměrně dobře zdokumentovanou čeledí a díky její velikosti zde nalezneme rody a druhy s širokou škálou sekundárních metabolitů (Obr. 3). Odlišností této čeledi je především větší schopnost tvorby látek s obsahem dusíku jako jsou alkaloidy, aminy, neproteinogenní aminokyseliny (NPAA) aj., naopak produkují méně mono-, seskvi- a diterpenů než jiné skupiny rostlin (Wink, 2013). Z alkaloidů mohu zmínit chinolizidin, dipiperidin, pyrrolizidin, β-karbolin, fenylethylamin a indolové alkaloidy, dále některé NPAA jako jsou kanavanin, kyselina pipekolová, kyselina djenkolová (Dixon a Sumner, 2003) a ODPA (Obr. 3). Tyto látky jsou často vysoce toxické a způsobují např. latyrismus, což je neurologické onemocnění (lidí i zvířat) spojené se zvýšenou konzumací semen hrachoru (Lathyrus). Důležitými sekundárními metabolity jsou isoflavony, které jsou díky svým účinkům populární jako potravinové doplňky. Velmi často zmiňovaný je genistein a daidzein, které najdeme hlavně v semenech sóji a bývají označovány jako tzv. fytoestrogeny. Mezi fytoestrogeny patří také látky formononetin či biochanin A. Epidemiologické studie dokumentují souvislost mezi konzumací sójových isoflavonů a sníženým rizikem rakoviny prsu a prostaty (Setchell a Cassidy 1999; Lamartiniere et al., 2002; Kim et al., 2008). Mohou sloužit také jako prevence osteoporózy u žen v období perimenopauzy (Alekel et al., 2000) a mimo jiné byl prokázán pozitivní vliv na paměť (File et al., 2001). Isoflavony také slouží jako fytoalexiny a signální molekuly při nodulaci bobovitých – proces utváření symbiotického vztahu s bakteriemi rodu Rhizobium. V čeledi Fabaceae byly nalezeny všechny třídy terpenoidů, z nichž bych chtěla zmínit triterpenické saponiny. Pro rostliny mají význam jako obranné látky proti škůdcům (Golawska et al., 2006). Jsou také užívané ve farmacii, často pro snížení hladiny cholesterolu nebo jako adjuvancia (Dixon a Sumner, 2003). Například lékořice je jednou z nejstarších
27
užívaných rostlin čínské medicíny. Saponiny a flavonoidy z jejích kořenů mají protizánětlivé, protirakovinné a antioxidační účinky (Wang a Nixon, 2001).
Obrázek 3: Ukázka biochemické diverzity bobovitých (Dixon a Sumner, 2003). Proanthokyanidin z tolice vojtěšky (Medicago sativa, 1), formononetin malonyl glykosid z Medicago sativa a Medicago truncatula (2), genistein ze sójového bobu (Glycine max, 3), avicin D (saponin) z Acacia victorieae (4), isolikviritigenin z lékořice (Glycyrrhiza galbra, 5), glycirrhizin (saponin) z lékořice (6), glykosid kyseliny medicagové (saponin) z Medicago sativa a Medicago truncatula (7), medikarpin z Medicago sativa a Medicago truncatula (fytoalexin, 8), lupinol A (isoflavon) z lupiny (Lupinus, 9), lupanin (alkaloid) z lupiny (10), α-amino-β-oxalylamino propionová kyselina (ODPA) z hrachoru setého (Lathyrus sativus, 11), biochanin A (isoflavon) z cizrny beraní (Cicer arietinum, 12).
6.1. Studium funkcí genů a biotechnologie Jako důležité pícniny a potraviny jsou bobovité pochopitelně cílem snah genových inženýrů o snížení či zvýšení produkce různých sekundárních metabolitů, či o introdukci klíčových genů biosyntetických drah významných sekundárních metabolitů z této čeledi do jiných zemědělsky významných plodin či mikroorganismů. V úpravě produkce významných SM 28
nezaostávají ani klasické šlechtitelské postupy. Tyto biotechnologie slouží mimo jiné také k samotnému studiu biosyntetických drah a enzymů, které se na nich podílejí, což může usnadnit cestu k úspěšným výsledkům i v budoucnu. Jedním z častých cílů genového inženýrství v rámci čeledi Fabaceae je produkce isoflavonů (genistein, daidzein) díky jejich pozitivnímu vlivu na zdraví člověka. Příkladem tohoto snažení je experiment, který provedli Yu et al. (2003). Do sóji byly vloženy geny pro transkripční faktory C1 a R z kukuřice, které aktivují geny syntézy fenylpropanoidů. Byl detekován zvýšený obsah daidzeinu v semenech sóji, zatímco celkový obsah genisteinu se snížil. Zvýšila se ale i transkripce genu pro flavanon-3-hydroxylázu (F3H), která konkuruje biosyntéze isoflavonů. Proto byl dodatečně introdukován gen, který napomáhá supresi tohoto enzymu a spojením těchto modifikací došlo až ke čtyřnásobnému zvýšení produkce isoflavonů. Umlčení genu pro F3H a také genu pro flavon syntázu (také konkurenční enzym) se zdařilo i v dalším experimentu (Jiang et al., 2014), kde k tomu byla využita RNA interference. Po introdukci RNAi vektorů do buněk kořenové kultury sóji se produkce isoflavonů zvýšila dvojnásobně oproti kontrolním kulturám. Výzkum se zaměřil také na produkci genisteinu v rostlinách mimo tuto čeleď a to s využitím genů především ze sóji (Liu et al., 2006). Do rostlin tabáku, salátu a petúnie byl vložen gen pro IFS ze sóji, čímž byla vyvolána produkce genisteinu v okvětních lístcích tabáku a petúnie a v listech petúnie a salátu. Mírné zvýšení produkce genisteinu bylo pak ještě dosaženo umlčením genu pro F3H pomocí protismyslové sekvence DNA. Takto zvýšená produkce však stále nedostačuje ve smyslu prevence onemocnění konzumací takto upravených rostlin. Doposud nejvyšší produkce genisteinu dosáhli Pandey et al. (2014), když využili exprese genu pro IFS ze sóji spolu s expresí transkripčního faktoru MYB z Arabidopsis thaliana v rostlinách tabáku. Extrakt z listů transgenních rostlin tabáku byl následně podáván myším a byl prokázán významný osteoprotektivní účinek a zvýšení množství antioxidantů v séru oproti myším, které byly krmeny divokým typem tabáku. Vysoký obsah některých isoflavonů, především formononetinu, je však v pícninách nežádoucí. Jejich fytoestrogenní charakter negativně ovlivňuje zabřezávání krav či ovcí, které je konzumují. Tento efekt byl poprvé popsán ve 40. letech v Austrálii u ovcí, které se pásly na jetelu lučním (Trifolium pratense) a od té doby bylo dokumentováno mnoho dalších případů v souvislosti s tímto druhem jetele (Beck et al., 2005). Jetel luční je velmi oblíbenou pícninou, avšak obsahuje výrazně více isoflavonů ve srovnání s jinými druhy jetele (Vetter, 1995). Byly proto vyvíjeny snahy o vyšlechtění nových odrůd jetele lučního s nízkým obsahem formononetinu (např. odrůda Start) a obsah fytoestrogenů se v jeteli bedlivě sleduje 29
během růstu, skladování i silážování (Sivesind a Seguin, 2005; Řepková et al., 2014). Studie ukázaly, že obsah isoflavonů je možné ovlivnit různými agronomickými faktory. Příliš nízký obsah formononetinu a dalších isoflavonů má ale negativní efekt na rostlinu samotnou, která tyto látky využívá při obraně proti škůdcům (Cook et al., 1995; Gerard et al. 2005). Dalším častým cílem výzkumu je zlepšení kvality pícnin, jako jsou tolice vojtěška (Medicago sativa), jetel plazivý (Trifolium repens) a hrachor setý (Lathyrus sativus), ve smyslu jejich výživové hodnoty a lepší stravitelnosti. Jedním z faktorů může být množství a složení ligninu v buněčných stěnách např. tolice vojtěšky. Mnoho studií se zabývalo ovlivněním podílu obsahu syringylu ke guaiacylu (S/G) v ligninu. Celkem úspěšné byly pokusy se snížením aktivity 3-O-methyltrasferáz kyseliny kávové a caffeoyl-CoA (Marita et al.,
2003;
Guo
et
al.,
2001),
jiné
studie
se
zase
soustředily
na
regulaci
cinnamylalkoholdehydrogenázy (Baucher et al., 1999). Dalšími faktory jsou obsah saponinů a kondenzovaných taninů (proantokyanidinů). Saponiny obsažené v pícninách zhoršují stravitelnost a pro některá býložravá zvířata mohou být i toxické, je tedy zájem na tom vytvořit pícniny s co nejnižším obsahem těchto látek. Proantokyanidiny naopak zabraňují nadýmání u dobytka, které souvisí se spásáním luštěnin, protože se váží na trávené proteiny a snižují jejich degradaci (a to i během silážování), a zároveň zlepšují příjem dusíku z těchto pícnin. O biosyntéze těchto látek sice víme stále velmi málo, ale výsledky některých experimentů již naznačují, že bude možné tyto rostliny geneticky upravit pro akumulaci proantokyanidinů (shrnuto v Dixon a Sumner, 2003; Dixon et al., 2013). Posledním problémem, který bych chtěla zmínit, je obsah neurotoxinu ODPA v hrachoru setém. Tato plodina je ideální pro pěstování v suchých oblastech a toleruje i velmi zamokřené a slané půdy, navíc je poměrně odolná vůči škůdcům a chorobám (Kumar et al., 2011). Díky vysokému obsahu proteinů a důležitých aminokyselin poskytuje vyváženou stravu lidem v chudých oblastech světa. Přílišná konzumace této plodiny ale způsobuje nevratnou chorobu neurolatyrismus, kvůli čemuž se od pěstování této plodiny začalo upouštět. Je tedy vyvíjena snaha o vyšlechtění takových odrůd, které budou mít obsah ODPA co nejnižší.
30
7. Závěr Ačkoli bylo objeveno již mnoho z biochemické diverzity rostlinné říše, stále rozhodně nejsou odhaleny všechny sekundární metabolity, které rostliny produkují. U mnoha látek ještě nebyly popsány všechny biologické účinky nebo doposud nebyly odhaleny možnosti jejich využití člověkem. V některých případech dokonce nevíme, jakou funkci tyto látky plní v rostlině samotné. Rostliny jsou tedy potenciálním zdrojem látek, které by mohly doplnit stávající léčiva či pomoci při léčbě zákeřných chorob, jako jsou rakovina či AIDS. V současnosti je stále snadnější odhalit a identifikovat nové přírodní látky, a to díky moderním detekčním a analytickým metodám, které mají výborné rozlišovací schopnosti. Genové
inženýrství
poskytuje
téměř
neomezené
možnosti
při
manipulaci
s metabolismem sekundárních metabolitů u různých rostlinných druhů. Hlavním omezením širšího využití je právě neznalost dané metabolické dráhy a genů, které se podílejí na expresi klíčových enzymů nebo složitých regulačních mechanismů. Při dodržení nezbytných pravidel jsou výsledky těchto experimentů poměrně dobře předvídatelné a kontrolovatelné. Velkou výhodou je také rychlost, kterou kýžených výsledků můžeme dosáhnout. Tato metoda by mohla doplnit a významně zkrátit některé klasické zdlouhavé šlechtitelské postupy a jiné významně zefektivnit. Je však považována za velmi kontroverzní a není řadou států v Evropské unii akceptována. Důvodem je především strach, který pramení z nedostatečné informovanosti či je založen na mylných představách a špatně interpretovaných informacích v médiích. Druhým důvodem je odmítání této biotechnologie jakožto zásahu do přirozených přírodních procesů. Genové inženýrství je spojeno s určitými riziky, která je nutné eliminovat, ale pozitiva zdaleka převažují. Mimo jiné představuje velký potenciál pro zvýšení produkce potřebných léčiv a snížení nákladů s tím spojených. Také by mohlo pomoci při řešení problémů s výživou a nedostatkem kvalitních potravin (především v rozvojových zemích). Je také důležitým nástrojem studia v oborech molekulární biologie, biochemie a genetiky. Zatímco
genové
inženýrství
slavilo
úspěchy
v oblasti
produkce
některých
sekundárních metabolitů, vznikla poptávka po nových látkách s biologickými účinky, které v přírodě nenalezneme. Odpovědí na tuto poptávku může být tzv. syntetická biologie, která se zabývá navrhováním a konstrukcí nových biologických komponent, jako jsou enzymy, genetické obvody či buňky, nebo se zaměřuje na přetváření již existujících biologických systémů (Keasling, 2008). Tato definice napovídá, že syntetická biologie je úzce spjata s genovým inženýrstvím. Výsledkem může být produkce nově navržených či pozměněných sekundárních metabolitů (např. léčiv) a enzymů s vylepšenou chemickou strukturou, které 31
budou mít lepší či zcela jiné biologické účinky. Další z budoucích vizí je konstrukce mikroorganismů „na míru“ pro produkci konkrétní látky z konkrétního počátečního materiálu, což by mohlo minimalizovat náklady na produkci a purifikaci této látky. Ještě extrémnějším příkladem je tvorba de novo syntetických genomů a komponent, které se chovají obdobně, jako jejich přírodní analogy, což by umožnilo konstrukci umělých živých systémů. Společným cílem syntetické biologie je tedy tvorba takových systémů, kterým můžeme plně porozumět a přetvářet je tak, aby splňovaly stanovená výkonnostní kritéria, a tím umožnily řešení konkrétních problémů. Jednou z možností tvorby takovýchto systémů je také tzv. nebuněčná biologie (cell-free biology), která poskytuje mnoho výhod, jako je nepřítomnost fyzických bariér, možnost přímého ovlivňování reakčních podmínek a eliminace nároků na životaschopnost, což je omezením právě u buněčných systémů (Harris a Jewett, 2012). Toto by vedlo k celkovému zjednodušení systému a k maximalizaci jeho využití.
32
8. Literatura Ahuja I., Kissen R., Bones A. M. 2012. Phytoalexins in defence against pathogens. Trends Plant Sci. 17(2): 73-90. Akashi T., Aoki T., Ayabe S. 1999a. Cloning and functional expression of a cytochrome P450 cDNA encoding 2-hydroxyisoflavanone synthase involved in biosynthesis of the isoflavonoid skeleton in licorice. Plant Physiol. 121: 821-828. Akashi T., Fukuchi-Mizutani M., Aoki T., Ueyama Y., Yonekura-Sakakibara K., Tanaka Y., Kusumi T., Ayabe S. 1999b. Molecular cloning and biochemical characterization of a novel cytochrome P450, flavone synthase II, that catalyzes direct conversion of flavanones to flavones. Plant Cell Physiol. 40(11): 1182-1186. Alekel D. L., St Germain A., Peterson C. T., Hanson K. B., Stewart J. W., Toda T. 2000. Isoflavone-rich soy protein isolate attenuates bone loss in the lumbar spine of perimenopausal women. Am. J. Clin. Nutr. 72: 844-852. Arioli T., Howles P. A., Weinman J. J., Rolfe B. G. 1994. In Trifolium subterraneum, chalcone synthase is encoded by a multigene family. Gene 138: 79-86. Baucher M., Bernard-Vailhé M. A., Chabbert B., Besle J., Opsomer C., Van Montagu M., Botterman J. 1999. Down-regulation of cinnamyl alcohol dehydrogenase in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.) and the effect on lignin composition and digestibility. Plant Mol. Biol. 39: 437-447. Beck V., Rohr U., Jungbauer A. 2005. Phytoestrogens derived from red clover: An alternative to estrogen replacement therapy? J. Steroid Biochem. 94: 499-518. Burkhardt P. K., Beyer P., Wünn J., Klöti A., Armstrong G. A., Schledz M., Lintig J. von, Potrykus I. 1997. Transgenic rice (Oryza sativa) endosperm expressing daffodil (Narcissus pseudonarcissus) phytoene synthase accumulates phytoene, a key intermediate of provitamin A biosynthesis. Plant J. 11(5): 1071-1078. Butelli E., Titta L., Giorgio M., Mock H., Matros A., Peterek S., Schijlen E. G. W. M., Hall R. D., Bovy A. G., Luo J., Martin C. 2008. Enrichment of tomato fruit with health-promoting anthocyanins by expression of select transcription factors. Nat. Biotechnol. 26(11): 13011308. Campbell M., Hahn F. M., Poulter C. D., Leustek T. 1997. Analysis of the isopentenyl diphophate isomerase gene family from Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 36: 323-328.
33
Colby S. M., Alonso W. R., Katahira E. J., McGarvey D. J., Croteau R. 1993. 4S-limonene synthase from the oil glands of spearmint (Mentha spicata). J. Biol. Chem. 268(31): 2301623024. Chen Q., Yu H., Tang H., Wang X. 2012. Identification and expression analysis of genes involved in anthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis in the fruit of blackberry. Sci. Hortic. 141: 61-68. Chiu L. W., Zhou X., Burke S., Wu X., Prior R. L., Li L. 2010. The purple cauliflower arises from activation of a MYB transcription factor. Plant Physiol. 154: 1470-1480. Cook R., Tiller A., Mizen K. A., Edwards R. 1995. Isoflavonoid metabolism in resistant and susceptible cultivars of white clover infected with the stem nematode Ditylenchus dipsaci. J. Plant Physiol. 146: 348-354. Cragg G. M., Newman D. J. 2003. Plants as a source of anti-cancer and anti-HIV agents. Ann. Appl. Biol. 143: 127-133. Croteau R., Kutchan T. M., Lewis N. G. 2000. Natural products (secondary metabolites). In: Buchanan B. B., Gruissem W., Jones R. L., (eds). Biochemistry & Molecular Biology of Plants. Rockville, MD, USA: American Society of Plant Physiologists. 1250-1318. De Luca V., Laflamme V. 2001. The expanding universe of alkaloid biosynthesis. Curr. Opin. Plant Biol. 4: 225-233. Dirreto G., Tavazza R., Welsch R., Pizzichini D., Mourgues F., Papacchioli V., Beyer P., Giuliano G. 2006. Metabolic engineering of potato tuber carotenoids through tuber-specific silencing of lycopene epsilon cyclase. BMC Plant. Biol. 6:13 [online]. DOI:10.1186/14712229-6-13. Dixon R. A., Liu C., Jun J. H. 2013. Metabolic engineering of anthocyanins and condensed tannins in plants. Curr. Opin. Biotech. 24: 329-335. Dixon R. A., Sumner L. W. 2003. Legume natural products: understanding and manipulating complex pathways for human and animal health. Plant Physiol. 131: 878-885. Espley R. V., Brendolise C., Chagné D., Kutty-Amma S., Green S., Volz R., Putterill J., Schouten H. J., Gardiner S. E., Hellens R. P., Allan A. C. 2009. Multiple repeats of a promoter segment causes transcription factor autoregulation in red apples. Plant Cell 21: 168183. Facchini P. J., De Luca V. 2008. Opium poppy and Madagascar periwinkle: model non-model systems to investigate alkaloid biosynthesis in plants. Plant J. 54: 763-784. 34
Facchini P. J., St Pierre B. 2005. Synthesis and trafficking of alkaloid biosynthetic enzymes. Curr Opin. Plant Biol. 8: 657-666. File S. E., Jarret N., Fluck E., Duffy R., Casey K., Wiseman H. 2001. Eating soya improves human memory. Psychopharmacology 157: 430-436. Gerard P. J., Crush J. R., Hackell D. L. 2005. Interaction between Sitona lepidus and red clover lines selected for formononetin content. Ann. Appl. Biol. 147: 173-181. Golawska S., Leszczynski B., Oleszek W. 2006. Effect of low and high-saponin lines of alfalfa on pea aphid. J. Insect Physiol. 52: 737-743. Guo D., Chen F., Inoue K., Blount J. W., Dixon R. A. 2001. Downregulation of caffeic acid 3-O-methyltrasferase and caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase in transgenic alfalfa: impacts on lignin structure and implications for the biosynthesis of G and S lignin. Plant Cell 13: 7388. Ha S. W., Lee S. W., Kim Y. M., Hwang Y. S. 2001. Molecular characterization of hmg2 gene encoding a 3-hydroxy-methylglutaryl-CoA reductase in rice. Mol. Cells 11(3): 295-302 Hain R., Reif H., Krause E., Langebartels R., Kindl H., Vornam B., Wiese W., Schmelzer E., Schreier P. H., Stöcker R. H., Stenzel K. 1993. Desiase resistance results from foreign phytoalexin expression in a novel plant. Nature 361(6408): 153 -156. Harris D. C., Jewett M. C. 2012. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Curr. Opin. Biotech. 23: 672-678. Hipskind J. D., Paiva N. L. 2000. Constitutive accumulation of a resveratrol-glucoside in transgenic alfalfa increases resistance to Phoma medicaginis. Mol. Plant Microbe In. 13(5): 551-562. Holton T. A., 1996. Transgenic plants exhibiting altered flower colour and methods for producing same. WO/1996/036716 Huang B., Duan Y., Yi B., Sun L., Lu B., Yu X., Sun H., Zhang H., Chen W. 2008. Characterization and expression profiling of cinnamate 4-hydroxylase gene from Salvia miltiorrhiza in rosmarinic acid biosynthesis pathway. Russ. J. Plant Physl. 55(3): 390-399. Jeandet P., Clément C., Courot E., Cordelier S. 2013. Modulation of phytoalexin biosynthesis in engineered plants for desease resistence. Int. J. Mol. Sci. 14: 14136-14170 Jiang Y., Hu Y., Wang B., Wu T. 2014. Bivalent RNA interference to increase isoflavone biosynthesis in soybean (Glycine max). Braz. Arch. Biol. Techn. 57(2): 163-170.
35
Jiang Y., Joyce D. C. 2003. ABA effects on ethylene production, PAL activity, anthocyanin and phenolic contents of strawberry fruit. Plant Growth Regul. 39: 171-174. Jiang Y., Xia N., Li X., Shen W., Liang L., Wang C., Wang R., Peng F., Xia B. 2011. Molecular cloning and characterization of a phenylalanine ammonia-lyase gene (LrPAL) from Lycoris radiata. Mol. Biol. Rep. 38: 1935-1940. Kai G., Zhao L., Li Z., Guo B., Zhao D., Sun X., Miao Z., Tang K. 2005. Characterization and expression profile analysis of a new cDNA encoding taxadiene synthase from Taxus media. J. Biochem. Mol. Biol. 38(6): 668-675. Katsumoto Y., Fukuchi-Mizutani M., Fukui Y., Brugliera F., Holton T. A., Karan M., Nakamura N., Yonekura-Sakakibara K., Togami J., Pigeaire A., Tao G. Q., Nehra N. S., Lu C. Y., Dyson B. K., Tsuda S., Ashikari T., Kusumi T., Mason J. G., Tanaka Y. 2007. Engineering of the rose flavonoid biosynthetic pathway successfully generated blue-hued flowers accumulating delphinidin. Plant Cell Physiol. 48(11): 1589-1600. Keasling J. D. 2007. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem. Biol. 3(1): 64-76. Kim M. K., Kim J. H., Nam S. J., Ryu S., Kong G. 2008. Dietary intake of soy protein and tofu in association with breast cancer risk based on a case-control study. Nutr. Cancer 60(5): 568-576. Kumar S., Bejiga G., Ahmed S., Nakkoul H., Sarker A. 2011. Genetic improovement of grass pea for low neurotoxin (β-ODAP) content. Food Chem. Toxicol. 49: 589-600. Kumar V., Satyanarayana K. V., Itty S. S., Giridhar P., Chandrashekar A., Ravishankar G. A. 2005. Post transcriptional gene silencing for down regulating caffeine biosynthesis in Coffea canephora P. ex Fr. In: ASIC 2004. 20th International Conference on Coffee Science, Bangalore, India, 11-15 October 2004. The Association Scientifique Internationale du Café, 769–774. In: Kumar V., Ravishankar G. A. 2009. Current trends in producing low levels of caffeine in coffee berry and processed coffee powder. Food Rev. Int. 25: 175-197. Lamartiniere C. A. 2000. Protection against breast cancer with genistein: a component of soy. Am. J. Clin. Nutr. 71: 1705S-1707S. Leckband G., Lörz H. 1998. Transformation and expression of a stilbene synthase gene of Vitis vinifera L., in barley and wheat for increased fungal resistance. Theor. Appl. Genet. 96: 1004-1012. Leonard E., Runguphan W., O’Connor S., Prather K. J. 2009. Opportunities in metabolic engineering to facilitate scalable alkaloid production. Nat. Chem. Biol. 5(5): 292-300. 36
Lichtenthaler H. K., Rohmer M., Schwender J. 1997. Two independent biochemical pathways for isopentenyl diphosphate and isoprenoid biosynthesis in higher plants. Physiol. Plantarum 101: 643-652. Liu R., Hu Y., Li J., Lin Z. Production of soybean isoflavone genistein in non-legume plants via genetically modified secondary metabolism pathway. Metab. Eng. 9: 1-7. Loguercio L. L., Scott H. C., Trolinder N. L., Wilkins T. A. 1999. Hmg-coA reductase gene family in cotton (Gossypium hirsutum L.): unique structural features and differential expression of hmg2 potentially associated with synthesis of specific isoprenoids in developing embryos. Plant Cell Physiol. 40(7): 750-761. Lois L. M., Rodríguez-Concepción M., Gallego F., Campos N., Boronat A. 2000. Carotenoid biosynthesis during tomato fruit development: regulatory role of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase. Plant J. 22(6): 503-513. Mahmoud S. S., Croteau R. B. 2001. Metabolic engineering of essential oil yield and composition in mint by altering expression of deoxyxylulose phosphate reductoisomerase and menthofuran synthase. P. Natl. A. Sci. 98(15): 8915-8920. Marita J. M., Ralph J., Hatfield R. D., Guo D., Chen F., Dixon R. A. 2003. Structural and compositional modifications in lignin of transgenic alfalfa down-regulated in caffeic acid 3-Omethyltransferase and caffeoyl coenzyme A 3-O-methyltransferase. Phytochemistry 62: 5365. Martens S., Forkmann G., Matern U., Lukačin R. 2001. Cloning of parsley flavone synthase I. Phytochemistry 58: 43-46. McGarvey D. J., Croteau R. 1995. Terpenoid metabolism. Plant Cell 7(7): 1015-1026. Minami E., Ozeki Y., Matsuoka M., Koizuka N., Tanaka Y. 1989. Structure and some characterization of the gene for phenylalanine ammonia-lyase from rice plants. Eur. J. Biochem. 185: 19-25. Mizutani M., Ward E., DiMaio J., Ohta D., Ryals J., Sato R. 1993. Molecular cloning and sequencing of a cDNA encoding mung bean cytochrome P450 (P450C4H) possessing cinnamate 4-hydroxylase activity. Biochem. Bioph. Res. Co. 190(3): 875-880. Mohr P. G., Cahill D. M. 2007. Suppression by ABA of sylicylic acid and lignin accumulation and the expression of multiple genes in Arabidopsis infected with Pseudomonas syringae pv. tomato. Funct. Integr. Genomics 7: 181-191.
37
Montamat F., Guilloton M., Karst F., Delrot S. 1995. Isolation and characterization of a cDNA encoding Arabisopsis thaliana 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase. Gene 167: 197-201. Nakashima T., Inoue T., Oka A., Nishino T., Osumi T., Hata S. 1995. Cloning, expression and characterization of cDNAs encoding Arabidopsis thaliana squalene synthase. P. Natl. Acad. Sci USA 92: 2328-2332. Narita J. O., Gruissem W. 1989. Tomato hydroxymethylglutaryl-CoA reductase is required early in fruit development but not during ripening. Plant Cell 1(2): 181-190. Ogita S., Uefuji H., Yamaguchi Y., Koizumi N., Sano H. 2003. RNA interference: producing decaffeinated coffee plants. Nature 423(6942): 823-823. Oh S. K., Kang H., Shin D. H., Yang J., Han K. H. 2000. Molecular cloning and characterization of a functional cDNA clone encoding isopentenyl diphosphate isomerase from Hevea brasiliensis. J. Plant Physiol. 157: 549-557. Paine J. A., Shipton C. A., Chaggar S., Howells R. M., Kennedy M. J., Vernon G., Wright S. Y., Hinchliffe E., Adams J. L., Silverstone A. L., Drake R. 2005. Improoving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content. Nat. Biotechnol. 23(4): 482487. Pandey A., Misra P., Khan M. P., Swarnkar G., Tewari M. C., Bhambhani S., Trivedi R., Cattopadhyay N., Trivedi P. K. 2014. Co-expression of Arabidopsis transcription factor, AtMYB12, and soybean isoflavone synthase, GmIFS1, genes in tobacco leads to enhanced biosynthesis of isoflavones and flavonols resulting in osteoprotective activity. Plant Biotechnol. J. 12: 69-80. Pang Y., Shen G., Wu W. Liu X., Lin J., Tan F., Sun X., Tang K. 2005. Characterization and expression of chalcone synthase gene from Ginkgo biloba. Plant Sci. 168: 1525-1531. Pichersky E., Gang D. R. 2000. Genetics and biochemistry of secondary metabolites in plants: an evolutionary perspective. Trends Plant Sci. 5(10): 439-445. Řepková J., Nedělník J., Krtková V., Schulzová V., Novotná H., Hajšlová J., Jakešová H. 2014. Phytoestrogen content in clover (Trifolium spp.) and in grass stands depending on treatment and storage. Grassland Sci. Eur. 19 (in press) Sando T., Takaoka C., Mukai Y., Yamashita A., Hattori M, Ogasawara N., Fukusaki E., Kobayashi A. 2008. Cloning and characterization of mevalonate pathway genes in a natural rubber producing plant, Hevea brasiliensis. Biosci. Biotech. Bioch. 72(8): 2049-2060. 38
Setchell K. D. R., Cassidy A. 1999. Dietary isoflavones: biological effects and relevance to human health. J. Nutr. 129(3): 758S-767S. Shen G., Pang Y., Wu W., Deng Z., Zhao L., Cao Y., Sun X., Tang K. 2006. Cloning and characterization of a flavanone 3-hydroxylase gene from Ginkgo biloba. Bioscience Rep. 26: 19-29. Shen X., Martens S., Chen M., Li D., Dong J., Wang T. 2010. Cloning and chracterization of a functional flavanone-3β-hydroxylase gene from Medicago truncatula. Mol. Biol. Rep. 37: 3283-3289. Shimada N., Aoki T. Sato S., Nakamura Y., Tabata S. Ayabe S. 2003. A cluster of genes encodes the two types of chalcone isomerase involved in he biosynthesis of general flavonoids and legume-specific 5-deoxy(iso)flavonoids in Lotus japonicus. Plant Physiol. 131: 941-951. Sivesind E., Seguin P. 2005. Effects of the enviroment, cultivar, maturity, and preservation method on red clover isoflavone concentration. J. Agr. Food Chem. 53: 6397-6402. Smith C. J. 1996. Tansley Review No. 86 Accumulation of phytoalexins: defence mechanism and stimulus response system. New Phytol. 132(1): 1-45. Song J., Wang Z. 2009. Molecular cloning, expression and characterization of a phenylalanine ammonia-lyase gene (SmPAL1) from Salvia miltiorrhiza. Mol. Biol. Rep. 36: 939-952. Stark-Lorenzen P., Nelke B., Hänßler G., Mühlbach H. P., Thomzik J. E. 1997. Transfer of a grapevine stilbene synthase gene to rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Rep. 16: 668-673. Steele C. L., Gijzen M., Qutob D., Dixon R. A. 1999. Molecular characterization of the enzyme catalyzing the aryl migration reaction of flavonoid biosynthesis in soybean. Arch. Biochem. Biophys. 367(1): 146-150. Sun Y., Long R., Kang J., Zhang T., Zhang Z., Zhou H., Yang Q. 2013. Molecular cloning and characterization of three isoprenyl diphosphate synthase genes from alfalfa. Mol. Biol. Rep. 40: 2035-2044. Thomzik J. E., Stenzel K., Stöcker R., Schreier P. H., Hain R., Stahl D. J. 1997. Synthesis of a grapevine phytoalexin in transgenic tomatoes (Lycopersicon esculentum Mill.) condition resistance against Phytophora infestans. Physiol. Mol. Plant P. 51: 265-278. Tuan P. A., Park N. I., Li X., Xu H., Kim H. H., Park S. U. 2010. Molecular cloning and characterization of phenylalanine ammonia-lyase and cinnamate 4-hydroxylase in the
39
phenylpropanoid biosynthesis pathway in garlic (Allium sativum). J. Agr. Food Chem. 58: 10911-10917. Vannozzi A., Dry I. B., Fasoli M., Zenoni S., Lucchin M. 2012. Genome-wide analysis of the grapevine stilbene synthase multigenic family: genomic organization and expression profiles upon biotic and abiotic stresses. BMC Plant Biol. 12: 130 [online]. DOI:10.1186/1471-222912-130. Verpoorte R., Memelink J. 2002. Engineering secondary metabolite production in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 13: 181-187. Vetter J. 1995. Isoflavones in different parts of common Trifolium species. J. Agr. Food Chem. 43: 106-108. Wang Z. Y., Nixon D. W. 2001. Licorice and Cancer. Nutr. Cancer 39(1): 1-11. Wink M. 2013. Evolution of secondary metabolites in legumes (Fabaceae). S. Afr. J. Bot. 89: 164-175. Xu F., Deng G., Cheng S., Zhang W., Huang X., Li L., Cheng H., Rong X., Li J. 2012. Molecular cloning, characterization and expression of the phenylalanine ammonia-lyase gene from Juglans regia. Molecules 17: 7810-7823. Yan X., Zhang L., Wang J., Liao P., Zhang Y., Zhang R., Kai G. 2009. Molecular chracterization and expression of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) gene from Salvia miltiorrhiza. Acta Physiol. Plant. 31: 1015-1022. Ye X., Al-Babili S., Klöti A., Zhang J., Lucca P., Beyer P., Potrykus I. 2000. Engineering the provitamin A (β-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm. Science 287(5451): 303-305. Yu O., Shi J., Hession A. O., Maxwell C. A., McGonigle B., Odell J. T. 2003. Metabolic engineering to increase isoflavone biosynthesis in soybean seed. Phytochemistry 63: 753-763. Yun D. J., Hashimoto T., Yamada Y. 1992. Metabolic engineering of medicinal plants: transgenic Atropa belladona with an improved alkaloid composition. P. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11799-11803. Zhang M., Li K., Zhang C., Gai J., Yu D. 2009. Identification and characterization of class 1 DXS gene encoding 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, the first committed enzyme of the MEP pathway from soybean. Mol. Biol. Rep. 36: 879-887.
40
Zhao D., Zhou C., Sheng Y., Liang G., Tao J. 2011. Molecular cloning and expression of phytoene synthase, lycopene beta-cyclase, and beta-carotene hydroxylase genes in persimmon (Diospyros kaki L.) fruits. Plant Mol. Biol. Rep. 29: 345-351.
41
Příloha
Obrázek 1: Syntéza isopentenyldifosfátu (Croteau et al., 2000; upraveno). Známé enzymy jsou vypsány zeleně. DXS – 1-deoxy-D-xylulózo-5-fosfátsyntáza, DXR – 1-deoxy-Dxylulózo-5-fosfátreduktoisomeráza, CMS – 4-difosfocytidyl-2C-methyl-D-erythritolsyntáza, CMK – 4-difosfocytidyl-2C-methyl-D-erythritolkináza, MECPS – 2C-methyl-D-erythritol2,4-cyklodifosfátsyntáza, ACAT – acetoacetyl-CoA transferáza, MVK – mevalonátkináza, PMK - fosfomevalonátkináza, MVD – mevalonát-5-pyrofosfátdekarboxyláza.
Obrázek 2: Syntéza prekurzorů skupin terpenoidů (Croteau et al., 2000; upraveno). Tyto reakce jsou katalyzovány enzymy IPP-isomerázou, GPP-syntázou, FPP-syntázou, GGPPsyntázou, skvalensyntázou a fytoensyntázou.
Obrázek 3: Biosyntéza karotenoidů (Diretto et al., 2006; upraveno). Nejdůležitějšími enzymy jsou fytoensyntáza (PSY), fytoendesaturáza (PDS), ζ-karotendesaturáza (ZDS), lykopen ε-cykláza (LCY-e) a lykopen β-cykláza (LCY-b).
Obrázek 4: Schéma biosyntézy BIA a MIA (Leonard et al., 2009; upraveno). NCS – nokroklaurinsyntáza, TDC – tryptofandekarboxyláza, STR – striktosidinsyntáza.
Obrázek 5: Schéma biosyntézy tropanových a purinových alkaloidů (Leonard et al., 2009; upraveno). ODC – ornithindekarboxyláza, PMT – putrescin-N-methyltransferáza, XMT – xanthosin-N-methyltransferáza,
XN
7-methylxanthin-N-methyltransferáza
–
7-methylxanthosinnukleotidáza, (theobrominsyntáza),
dimethylxanthin-N-methyltransferáza (kofeinsyntáza).
MXMT
DXMT
– –
Obrázek 6: Metabolismus fenylpropanoidů (Croteau et al., 2000; upraveno). Enzymy (a kofaktory) jsou následovně: 1. PAL; 2. TAL; 3. Cinnamát-4-hydroxyláza (O2, cytochrom P450, NADPH); 4. Hydroxylázy (O2, cytochrom P450, NADPH); 5. CoA-ligázy – ligace AMP a CoA (CoASH, ATP); 6. O-methyltransferázy (SAM); 7. Cinnamoyl-CoA:NADPH oxidoreduktázy (NADPH); 8. Cinnamylalkoholdehydrogenázy (NADPH); 9. Chalkonsyntáza; 10. Chalkonisomeráza; 11. Stilbensyntáza; 12. Styrylpyronsyntáza.
