Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum, 2004 USU Repository 2006

Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006

RINGKASAN

Cacat celah langit-langit mulut (cleft palate/CP) adalah salah satu jenis cacat bawaan yang sering dijumpai dalam masyarakat. Angka insidensinya -- umumnya dihitung bersama-sama dengan bibir sumbing (cleft lip and palate) -- adalah tertinggi di dunia dari antara seluruh jenis cacat bawaan yang dikenal, yakni sekitar 1 per 700 kelahiran. Melalui percobaan-percobaan pada hewan-hewan mamalia telah dikenali sejumlah agensia toksik yang memiliki kemampuan menginduksi cleft palate, yaitu fenitoin don diazepam (obat-obatan antikonfulsi), alkohol, glukokortikoid, retinol, hadacidin, dioksin, nikotin dan pelarut-pelarut organik yang biasa digunakan untuk industri. Hampir seluruh agensia penginduksi cleft palate tersebut tergolong pada senyawa-senyawa yang aktif di sistem saraf (memiliki aktivitas neurofarmaka), akan tetapi sejauh ini belum diketahui apa yang mendasari kepekaan jaringan palatum embrio terhadap senyawa-senyawa neurofarmaka. Menarik untuk diteliti kemungkinan adanya sel-sel khusus non-saraf di jaringan palatum yang memiliki kemampuan merespon senyawa-senyawa neurofarmaka penginduksi cleft palate. Dalam penelitian ini dikaji secara imunohistokimiawi pola ekpresi calcium binding protein S-100 di jaringan palatum embrio mencit sepanjang masa palatogenesis, sebagai molekul yang diduga turut berperan dalam rangkaian respon jaringan palatum terhadap senyawa-senyawa neurofarmaka penginduksi cleft palate. Delapan ekor mencit (Mus musculus, L) bunting dipelihara pada kondisi eksperimental don dikorbankan berturut-turut sejak hari ke-12 hingga hari ke-15 kebuntingan, kemudian diproses struktur craniofacialnya melalui metode parafin dan dibuat irisan penampang

iii Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006

palatum (coronol section) setebal 6μ. Irisan-irisan yang diperoleh diproses secara imunohistokimia dan selanjutnya diamati dengan mikroskop cahaya untuk memperoleh gambaran pola ekspresi protein S-100 secara spatiotemporal. Hasil imunohistokimia menunjukkan bahwa terdapat ekspresi protein S-100 di jaringan palatum embrio mencit selama proses palatogenesis berlangsung. Pada awal palatogenesis ekspresi cenderung berderajat sedang dan terdistribusi merata di seluruh bagian palatum, ekspresi meningkat pada saat pertumbuhan horizontal bilah terutama di jaringan mesenkim dan cenderung tetap tinggi hingga pasca fusi dengan pola distribusi memusat di mesenkim sepanjang poros bilah. Pola spesifik ekspresi S-100 di palatum embrio mengindikasikan keterlibatannya dalam proses penutupan langit-langit mulut. Senyawa-senyawa aktif neurofarmakologis yang kerjanya melalui mobilisasi calcium binding protein (CaBP) untuk fungsi eksositosis neurotransmitter dapat menggangu ketersediaan protein CaBP S-100 untuk fungsi regulasi ekspresi protein. Mekanisme tersebut menjelaskan kenyataan bahwa kebanyakan agensia penginduksi cleft palate adalah senyawa aktif neurofarmakologis.

iv Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006

SUMMARY Cleft palate syndromes are among the most common congenital malformation in human, together with cleft lip (cleft lip and palate) occur in approximately 1 in 700 live births. In mammalian experimentation, cleft palate has been associated with numerous environmental toxic substances, known as cleft palate inducer such as phenytoin and diazepam (anticonvulsant dugs), alcohol, glucocorticoid, retinol, hadacidin, dioxin, tobacco smokes, and industrial organic solvent. Interestingly, most of the cleft palate inducer posses neuropharmacologic activity in adult. The mechanism that lead to sensitivity of non-neuronal palatal tissue to those substances still unclear. The aim of the present study was to investigate immunohistochemically the presence and the pattern of distribution of calcium binding protein (CaBP) S-100 in mouse (Mus musculus, L) palatal shelves during palatogenesis, to get the information about the functional roles of this protein on palatal tissue sensitivity to neuropharmacologic substances. Eight pregnant dams were maintained under experimental condition, and on days 12, 13, 14, and 15 of gestation (plug day = 0 day) 2 dams each were sacrificed for collecting the fetuses.

Coronal

paraffin

section

(6μ)

of

craniofacial

structure

were

stained

immunohistochemically for S-100 protein expression. The result showed that, spatiotemporally there is a specific pattern of S-100 protein expression in palatal tissue during palatogenesis. They were found and distributed evenly in palatal tissue at the beginning of palatogenesis (GD12), but following the developmental progress they

v Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006

localise most intensely in the messenchyme rather than epithelia (GD13). After palatal fusion (GD14 and GD 15), the expression remained high in the middle of palate, forming a thick line in the area of mesenchyme across the 2 fused palatal shelves. The pattern indicate that S-100 protein may play a role in mesenchymal cell migration and concilidation, probably through regulation function of S-100 protein on microtubula and other contractil protein, so facilitating palatal shelves horizontal growth and subsequent palatal closure. Protein S-100 may also play a central role in cleft palate phenomenon, since most of the known cleft palate inducer have neuropharmacological activity with the potential to disturb pattern of CaBP S-100 expression in developing palate.

vi Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006

DAFTAR ISI Hlm LEMBAR IDENTITAS DAN PENGESAHAN ................................................. ii RINGKASAN ..................................................................................................... iii SUMMARY .........................................................................................................v PRAKATA ......................................................................................................... vii DAFTAR ISI ...................................................................................................... viii DAFTAR TABEL ............................................................................................... ix DAFTAR GAMBAR . ..........................................................................................x I. PENDAHULUAN .............................................................................................1 II. TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................4 III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN .................................................9 IV. METODE PENELITIAN ..............................................................................9 V. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................14 VI. KESIMPULAN .............................................................................................19 DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................20

viii Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006

DAFTAR TABEL Hlm Tabel 1.

Bagan alir prosedur kerja imunohistokimia untuk protein S-100

Tabel 2.

....... . 13

Pola ekspresi spatiotemporal protein S-100 di jaringan palatum embrio mencit (Mus musculus, L) .

....... . 14

ix Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006

DAFTAR GAMBAR Hlm Gambar 1.

Pola ekspresi protein S-100 di jaringan palatum pada tingkat perkembangan hari hari ke-13 ....................................... 15 kebuntingan.

Gambarl 2.

Pola ekspresi protein S-100 di jaringan palatum……………………...17 pada tingkat perkembangan hari hari ke-14 kebuntingan.

x Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006

I. PENDAHULUAN Cacat celah langit-langit mulut (cleft palate) adalah salah satu jenis cacat bawaan yang sering dijumpai dalam masyarakat. Angka insidensinya, dihitung bersama-soma dengan bibir sumbing (cleft lip and palate), adalah tertinggi di dunia dari antara seluruh jenis cacat bawaan yang dikenal, yakni sekitar 1 per 700 kelahiran (Kerrigan, dkk., 2000). Di Indonesia cleft lip and palate adalah salah satu dari 4 jenis cacat bawaan yang paling sering dijumpai (Kadri dkk., 1995). Penanganan cleft palate sampai soot ini dilakukan melalui tindakan operasi yang membutuhkan biaya besar (Tsukada don Taniguchi, 1993). Menurut Czeizel (2001) pilihan paling rasional penanganan masalah ini adalah pencarian upaya-upaya preventif yang ditujukan pada penekanan angka insidensi cacat yang tinggi. Akan tetapi hal tersebut belum dapat dilakukan karena pengembangannya masih menunggu informasi-informasi dasar yang berkaitan dengan seluk-beluk proses embriologis perkembangan palatum (palatogenesis) don mekanisme kerjo agensia-agensia penginduksi cleft palate yang sangat beragam. Induksi cleft palate bersifat multifaktor. Selain faktor predisposisi genetik, faktor paparan terhadap agensia toksik dari lingkungan selama masa kehamilan juga memegang peranan besar. Beberapa diantar agensia toksik penginduksi cleft palate telah dikenali, yaitu fenitoin don diazepam (obat-obatan antikonfulsi), alkohol, glukokortikoid, retinol, hadacidin, dioksin, nikotin don pelarut-pelarut organik yang biasa digunakan untuk industri. Masing-masing agensia bekerja dengan mekanisme berbeda mengganggu tahap spesifik proses palatogenesis embrio (Wyzynski don Beaty, 1996).

1 Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006

Beragamnya faktor penginduksi cleft palate mengakibatkan pengembangan upaya pencegahan menjadi sangat kompleks karena menuntut dikembangkannya sejumlah upaya yang spesifik terhadap tiap-tiap faktor penginduksi. Oleh karena itu salah satu strategi yang akan besar manfaatnya bagi pengembangan upaya pencegahan cleft palate di masa mendatang adalah mencari kesamaan dalam mekanisme kerja di antara seluruh atau sebagian besar faktor penginduksi sehingga kompleksitas permasalahan dapat disederhanakan. Dalam kaitan itu salah satu faktor yang menarik untuk dikaji adalah terdapatnya kesamaan aktivitas pada agensia-agensia penginduksi cleft palate. Hampir seluruh agensia penginduksi cleft palate memiliki aktivitas neurofarmakologi (Zimmerman dan Wee, 1984). Berdasarkan kenyataan tersebut Zimmerman dan Wee (1984) mengemukakan dugaan bahwa induksi cleft palate mungkin melibatkan gangguan sekresi neurotransmitter dan transduksi signal di jaringan saraf, mengingat target organ aksi senyawa neurofarmokologik adalah pada sel-sel neuron di otak. Akan tetapi pada percobaan kultur organ palatum in vitro induksi cleft palate ternyata dapat berlangsung meskipun jaringan sudah terpisah dari sistem saraf pusat. Dengan demikian induksi cleft palate tidak mensyaratkan keterlibatan sistem saraf pusat dan itu berarti kemungkinan terdapat sel-sel khusus non-saraf di jaringan palatum sendiri yang memiliki kemampuan merespon senyawa-senyawa neurofarmakologik penginduksi cleft palate. Respon sel terhadap senyawa neurofarmokologik adalah terutama berupa osilasi kadar ion kalsium (Ca2+) di dalam sel yang mempengaruhi sekresi neurotransmitter (Thayer dkk., 2002). Tetapi pada sisi lain, influx Ca2+, pada sel-sel tertentu dapat mengaktifkan Calcium-


Binding Protein (CaBP). CaBP teraktivasi, dalam bentuk kompleks senyawa dengan ion Ca2+ memiliki kemampuan meregulasi mitosis dan mempengaruhi ekpresi sejumlah gen (Swanson dkk., 1997; Tamascovic dkk., 2003) . Protein S-100 adalah calcium-binding protein yang diekpresikan terutama di otak tetapi juga di beberapa jaringan lain turunan krista neuralis. Protein S-100 meregulasi ekspresi gen-gen yang mengkode protein vimentin, keratin, annexin, myosin, tropomyosin, serta proteinprotein mikrotubula. Oleh karena protein-prptein target regulasi S-100 tersebut bekerja menentukan migrasi, adhesi, dan diferensial sel, maka protein S-100 diperkirakan penting peranannya dalam morfogenesis (Ikura dkk., 2002). Pola ekpresi S-100 di jaringan palatum sejauh ini belum diketahui. Mengingat secara embriologis sebagian struktur palatum adalah turunan krista neuralis (D'Amico-Martel dkk dalam Zimmerman dan Wee, 1984), diduga terdapat kelompokan sel di jaringan fersebut yang mengekpresikan protein S-100. Sel-sel seperti itu diperkirakan berfanggungjawab merespon influx Ca2+ akibat aksi senyawa neurofarmakologik di jaringan palatum, oukan dalam bentuk sekresi neurotransmitter melainkan dalam bentuk perubahan ekpresi gen-gen yang penting dalam palatogenesis. Dalam penelitian ini akan dikaji secara imunohistokimiawi ekpresi gen S-100 pada tingkat protein di jaringan palatum embrio mencit sepanjang masa palatogenesis untuk mengetahui apakah ferdapaf pola ekpresi spesifik yang bersesuaian dengan tahap-tahap genting proses penutupan palatum embrio. Hasil penelitian diharapkan dapat menjelaskan dasar kerja senyawa-senyawa neurofarmakologik menginduksi cleft palate.


II. TINJAUAN PUSTAKA

1. Perkembangan Palatum Embrio (Palatogenesis) Pai'atum pada mamalia adalah struktur langit-langit mulut yang membatasi rongga nasofaring dengan rongga mulut. Secara anatomi palatum dibedakan antara palatum keras (palatum durum) yang menempati wilayah anterior don pal.atum lunak (palatum mole) yang menempati wilayah posterior langit-langit mulut. Sedangkan dari sudut perkembangannya palatum dibedakan antara palatum pertama (primary palate) dengan palatum kedua (secondary palate) (Ferguson, 1988). Dalam penelitian ini yang dimaksudkan sebagai perkembangan palatum (palatogenesis) adalah proses pembentukan palatum kedua. Agar diperoleh struktur langit-langit mulut yang menutup sempurna, palatogenesis harus berhasil melampaui 4 tahapan perkembangan. Keempat tahapan itu Ddalah: pertumbuhan awal bilah palatum (initial palatal shelves growth), pertumbuhan seperti mendaki (shelves elevation), pertumbuhan (horizontal shelves growth), don fusi (palatal fusion) (Ferguson, 1988). Pertumbuhan awal palatum dimulai dari terbentuknya tonjolan bilateral dari sisi dalam dinding maksila. Pada awalnya pertumbuhan bilah terjadi secara vertikal dengan kedua ujung bilah mengarah ke dasar mulut. Pada tahap berikutnya ujung-ujung bilah palatum akan tumbuh menaik seperti mendaki hingga menempatkan diri di atas punggung lidah yang sedang berkembang. Faktor kunci keberhasilan tahap ini adalah sintesis don distribusi spesifik matriks ekstrasel hialuronan di jaringan palatum yang diregulasi oleh protein EGF don TGF-β1. Pertumbuhan mendaki hanya membutuhkan waktu yang singkat yaitu beberapa menit hingga jam. Setelah itu bilah palatum yang kini sudah menempati posisi di atas lidah akan tumbuh soling mendekat secara horizontal dari kedua arah hingga terjadi kontak


antara kedua ujungnya. Horizontal growth mensyaratkan keajegan proses mitosis di jaringan palatum yang melibatkan ekpresi proteinprotein pembelahan dari keluarga cyclin. Kontak antara 2 ujung bilah palatum pada tahap akhir palatogenesis memicu serangkaian proses yang diarahkan pada keberhasilan fusi membentuk struktur sinambung yang kokoh menutup sempurna langit-langit mulut. Sebelum kontak terjadi bilah palatum telah memiliki struktur histologi yang khas, yaitu jaringan mesenkim sebagai struktur tubuh bilah palatum don jaringan epitel melapisi sisi luarnya. Kontak terjadi antara epitel aspek medial (Medial Edge Epithelium/MEE) dari kedua bilah palatum yang berhadapan (Ferguson, 1998; Kerringan dkk., 2000). Setelah kontak, sebagian epitel mengalami kematian sel selektif (Shapiro don Sweney dalam Kerrigan dkk., 2000), sebagian bermigrasi ke aspek oral don nasal bilah (Bittencourt don Bolognese, 2000), don sisanya bertransdiferensiasi menjadi mesenkim (Kaartinen, dkk., 1997), sehingga pertemuan antar kedua ujung bilah yang tadinya diperantarai oleh sel epitel berubah menjadi hubungan antar mesenkim yang lebih kokoh. Pada manusia seluruh kejadian tersebut berlangsung antara minggu ke-7 hingga ke-12 kehamilan, sedangkan pada mencit percobaan sekitar hari ke-10 hingga ke-14 kebuntingan (Kerrigan dkk., 2000). Selama palatogenesis, pembelahan, diferensiasi don kematian sel, adhesi don migrasi sel, gerakan morfogenesis, don sintesis senyawa matriks berlangsung silih berganti. Runtutan proses harus berlangsung tahap demi tahap dengan pengaturan yang ketat oleh ekpresi gengen secara selektif. Gangguan ekspresi gen, demikian juga gangguan oleh agensia toksis pada salah satu tahapan perkembangan dapat menyebabkan hambatan penutupan palatum sehingga muncul cacat cleft palate. (Kerrigan dkk., 2000).


2. Cacat Celah Langit-langit Mulut (Cleff Palate) Cacat celah langit-langit (cleft palate) termasuk salah satu jenis cacat bawa lahir yang sering dijumpai di masyarakat. Berdasarkan data yang dikumpulkan oleh Kadri dkk. (1995) sejak tahun 1991 hingga 1994 dari 14 Rumah Sakit di 11 propinsi di Indonesia cacat celah langitlangit dan celah bibir (cleft palate and lip) ditempatkan sebagai salah satu dari 4 jenis cacat bawaan yang paling sering dijumpai dari seluruh kejadian kecacatan yang ditemukan. Bahkan menurut Kerrigan dkk. (2000) cleft palate and lip menempati urutan tertinggi dari seluruh jenis cacat bawa lahir yang dikenal pada penduduk dunia dengan angka rata-rata 1 kejadian per 700 kelahiran. Cleft palate adalah manifestasi dari gangguan yang terjadi di salah satu titik sepanjang proses palatogenesis. Kerrigan dkk. (2000) menyatakan bahwa walaupun gangguan perkembangan dapat menimpa palatogenesis pada sebarang tahap, tetapi tahap paling genting adalah shelves elevation dan palatal fusion. Penanganan cleft palate yang dilakukan saat ini umumnya adalah melalui tindakan operasi. Tsukada dan Taniguchi (1993) menggambarkan prosedur operasi untuk koreksi cleft palate sebagai operasi yang mungkin mahal dan lama, karena tergantung pada derajat keparahannya, seringkali operasi harus dilakukan bertahap (multiple sureries) antara lain untuk mengoreksi kelainan anatomi palatum dan faring, mengupayakan agar penutupan langit-langit sempurna tidak hanya sebagai pemisah fisik antara rongga mulut dengan nasofaring tetapi juga sebagai tempat artikulasi lidah untuk mencapai kemampuan berbicara yang baik, mencegah gangguan pertumbuhan maksila, memperbaiki fungsi pendengaran dan memperbaiki posisi pertumbuhan geligi. Dalam keadaan seperti itu permasalahan morfologis dan fungsional organ pasca operasi masih


sering muncul, karena perkembangan struktur-struktur tersebut pada umumnya sudah mencapai tingkat kedewasaan organ. Oleh karena itu upaya preventif menjadi pilihan tindakan paling rasional dalam menekan angka kejadian cacat bawa lahir. Upaya preventif seperti itu membutuhkan informasi tentang agensia potensial penginduksi cacat don mekanisme induksi cacat (Czeizel, 2001). Agensia potensial penginduksi cleft palate sangat beragam jenisnya. Pada manusia telah dipastikan obat-obatan antikonfulsi fenitoin don diazepam, kelebihan vitamin A, konsumsi alkohol, rokok don paparan selama kehamilan terhadap pelarut-pelarut organik don bahan-bahan kimia pertanian sebagai agensia potensial (Wyzynski dan Beaty, 1996). Selain itu, pada mamalia coba di laboratorium glukokortikoid, dioksin, hadacidin, dan beberapa senyawa pencemar lainnya telah terbukti sebagai agensia potensial penginduksi cleft palate (Shah dkk., 1991; Abbott, dkk., 1994; 1998a; 1998b; Bennet dkk., 1997) . Walaupun beragam jenisnya, terdapat juga kesamaan di antara agensia-agensia penginduksi cleft palate. Hampir seluruh agensia penginduksi cleft palate yang dikenal memiliki aktivitas biologis utama di otak (neurofarmakologis). Mekanisme kerja senyawa-senyawa neurofarmakologis menimbulkan efek di luar sistem saraf, dalam hal ini di jaringan palatum, belum sepenuhnya dapat dijelaskan. Zimmermann don Wee (1984) menduga kemungkinan adanya sel-sel non-neuronal tetapi memiliki aktivitas seperti sel neuron mensintesis don mensekresikan neurotransmitter di jaringan palatum. Dikatakan, sebagaimana

sel

neuron

maka

sel-sel

non-neuron

di

palatum

juga

merespon

senyawa-senyawa neurofarmakologik, dan induksi cleft palate berkaitan dengan perubahan yang ditimbulkan oleh aksi neurotransmitter hasil sekresi sel non-neural yang terpicu di palatum.


Dugaan tersebut diperkuat oleh Hagiwara dkk. (2003) dengan menunjukkan adanya ekpresi GABA di sel-sel non-neuron di palatum.

3. Calcium-Binding Protein S-100 Senyawa neurofarmakologik pada umumnya bekerja melalui interaksinya dengan protein selaput sel yang bekerja sebagai gerbang kaslium. Interaksi tersebut mempengaruhi konformasi protein gerbang sehingga influx Ca2+ ke dalam sel berubah menyebabkan keseimbangan kadar Ca2+ intra dan ekstrasel juga berubah. Perubahan kadar Ca2+ mendorong pelepasan vesikuli berisi senyawa neurotransmitter secara eksositosis sebagai efek utama senyawasenyawa neurofarmakologik (Thayer dkk., 2002). Pada sisi lain, tergantung pada ada tidaknya calcium-binding protein (CaBP) spesifik di dalam sel, perubahan dari Ca2+ dapat mengaktivasi CaBP untuk meregulasi ekspresi gen-gen yang berada di bawah pengaruhnya (Ikura dkk., 2002). Pada sistem yang sedang dalam proses perkembangan, seperti pada sel-sel embrio, aktivasi CaBP dapat mengubah ekspresi gen-gen kunci dalam mitosis dan diferensiasi sehingga mempengaruhi morfogenesis secara keseluruhan (Swanson dkk., 1997). Protein S-100 adalah CaBP dari subfamili EF-hand yang ekspresinya terutama adalah di otak dan di struktur-struktur lain turunan krista neuralis (Maki dkk., 2002; Ulfig, 2002, Daub, dkk., 2003). Hingga saat ini telah dikenali 20 tipe protein S-100 dengan target kerja yang beragam, meliputi transduksi signal, diferensiasi sel, progresi sel tumor, dan regulasi motilitas sel, tetapi secara keseluruhan bekerja dengan dasar mekanisme yang sama meregulasi ekspresi gen spesifik setelah diaktivasi perubahan kadar Ca2+ di sitosol. Sejumlah protein yang penting dalam morfogenesis telah diketahui sebagai target regulasi S-


100 seperti vimentin, tubulin, annexin, keratin, tropomyosin, dan proteinprotein mikrotubula. Protein-protein tersebut aktif dalam proses morfogenesis (Ikura dkk., 2002).

III. TUJUAN DAN MANFAAT Terdapat dua tujuan yang ingin dicapai melalui penelitian ini : 1. Menentukan ekspresi calcium-binding protein S-100 di jaringan palatum embrio mencit. 2. Memperoleh gambaran polo ekspresi calcium-binding protein S100 secara spatiotemporal di jaringan palatum dan kaitannya dengan tahapan genting penutupan langit-langit mulut selama palatogenesis. Sedangkan manfaat yang diperoleh dari penelitian ini berkaitan dengan pencarian upaya menekan angka insidensi cleft palate masih memerlukan informasi tentang seluk-beluk proses palatogenesis dan kerentanannya terhadap berbagai agensia. Kontribusi penelitian ini adalah dalam memberi data mikroanatomis tentang pola ekpresi calcium-binding protein S-100 di jaringan palatum yang diperkirakan mendasari respon jaringan terhadap agensia-agensia neurofarmakologik penginduksi cleft palate.

IV. METODE PENELITIAN 1. Sampel Embrio Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit (Mus musculus). Mencit bunting diperoleh dengan cara menempatkan 3 ekor mencit betina dara estrus dalam satu kandang dengan seekor mencit jantan fertil semalaman. Apabila pada keesokan harinya


dijumpai sumbat vagina maka had itu ditetapkan sebagai hari ke-0 kebuntingan. Delapan ekor hewan bunting yang diperoleh dengan cara tersebut dipelihara di dalam kandang pemeliharaan dan diberikan pakan dan air minum secara ad libitum. Berturut-turut sejak hari ke-12 hingga hari ke-15 kebuntingan, masing-masing 2 induk dikorbankan. Induk mencit dibedah dan embrio diangkat dan ditempatkan di dalam larutan fisiologis lalu sebanyak 2 embrio dari masing-masing induk diambil secara acak sebagai sampel. Dengan cara ini diperoleh embrio sampel sebanyak 16 dari 4 tingkat usia perkembangan yang berbeda (kebuntingan hari ke-12, 13, 14, dan ke-15). Selanjutnya struktur craniofactial dari masing-masing embdo sampel diisolasi don difiksasi di dalam formalin 10%.

2. Pembuatan Irisan Berparafin Pekerjaan dilakukan mengikuti Drury don Wallington (1976). Setelah fiksasi palatum embrio sampel dicuci di dalam larutan alkohol 70% berkali-kali lalu didehidrasi dengan cara merendam berturut-turut di dalam alkohol 80, 90, 95% don akhirnya di dalam alkohol absolut. Alkohol dilepas dengan cara merendam organ di dalam toluol. Infiltrasi parafin ke dalam organ dilakukan di dalam oven. Organ dipindah berturut-turut dari campuran toluol dan parafin (3 : 1, lalu 1 : 1 dana akhirnya 2 kali di dalam parafin murni). Setelah itu parafin cair dituang ke dalam kotak cetakan dari kertas dan organ ditanam dengan posisi berdiri dengan bagian anterior berada di bagian dasar kotak. Irisan penampang palatum (coronal section) dibuat menggunakan mikrotom dengan ketebalan 6μ dan selanjutnya palatum direkatkan di atas kaca benda.

3. Imunohistokimia Protein S-100 Untuk memperoleh data pola ekpresi protein S-100 di jaringan palatum dilakukan pekerjaan imunohistokimia. Pekerjaan dilakukan


mengikuti petunjuk pada kit imunohistokimia dari perusahaan (SIGMA). Komponen yang tersedia pada kit adalah: antibodi sekunder (anti rabbit IgG berkonjugat Horse Radish Preroxidase / HRP), reagen peroksidase, buffer substrat, kromogen AEC (3-amono-9ethylcarbazole), don H202. Antibodi primer (rabbit anti-mouse S-100) dipesan terpisah (SIGMA). Dua slide (irisan jaringan) palatum dari masing-masing embrio sampel dihilangkan parafinnya dengan cara merendam slide di larutan xilol (2 kali, masing-masing 15 menit). Setelah itu jaringan dihidrasi dengan cara mencelup-celupkan slide ke dalam seri larutan-larutan alkohol dengan konsentrasi menurun (100, 95, 80, 70, 50, 30%), untuk selanjutnya direndam di dalam akuades selama 2 menit. Kemungkinan adanya gangguan peroksidase endogenous jaringan dihilangkan dengan cara diinaktivasi menggunakan H202 3% (selama 10 menit). Selanjutnya slide dicuci dengan akuades berkali-kali dan kemudian ditetesi blocking agent dan dibiarkan selama 20 menit. Sebagai blocking agent digunakan Bovine Serum Albumin (BSA) 5 %. Setelah itu sisa BSA di slide dibuang dan tanpa dicuci jaringan langsung ditetesi dengan antibodi terhadap protein S-100 (antibodi primer) don diinkubasikan semalaman di dalam wadah yang dibuat lembab dengan uap air (humidified chamber) yang disimpan di dalam lemari pendingin dengan suhu 8 OC. Keesokan harinya slide dicuci beberapa kali dan selanjutnya ditetesi dengan antibodi sekunder berkonjugat HRP, dan diinkubasikan selama 30 menit di dalam humidified chamber. Setelah itu slide dicuci beberapa kali dengan akuades lalu ditetesi dengan substrat peroksidase dan diinkubasikan selama 15 menit. Pada saat inkubasi ini reagen substrat dicampurkan (terdiri dari akuades + buffer substrat + kromogen AEC + H202). Setelah inkubasi 15 menit di substrat peroksidase berlalu, slide dicuci dan ditetesi dengan reagen


substrat yang baru dicampurkan tadi dan dibiarkan selama 10 menit. Selanjutnya slide dicuci lagi beberapa kali dengan akuades lalu diberi pewarna Hematoksilin Meyer. Caranya adalah dengan merendam slide di dalam larutan pewarna selama 1 menit dan selanjutnya mencuci slide tersebut di air mengalir selama 20 menit. Pencucian di air mengalir (air PAM, bukan akuades) perlu dilakukan untuk memunculkan warna biru pada jaringan. Setelah itu slide ditempatkan sesaat di antara 2 lembar kertas saring untuk menghilangkan kelebihan air yang ada pada jaringan, untuk selanjutnya ditetesi dengan mounting medium dan ditutup dengan gelas penutup. Untuk mounting medium tidak digunakan bahan berbasis minyak (balsam kanada atau entellan), tetapi gliserol-gelatin yang berbasis air untuk menghindari pelunturan warna kromogen AEC. Jaringan selanjutnya diamati di bawah mikroskop, penilaian tingkat ekpresi ditentukan secara semikuantitatif melalui perbedaan intensitas warna yang timbul. Pola ekpresi S-100 diamati secara spatiotemporal di daerah mesenkim dan di daerah epitel wilayah oral, medial dan nasal palatum. Derajat kepositipan ditentukan sebagai: tidak dijumpai ekspresi (-), ekspresi rendah (+), ekspresi sedang (++), dan ekspresi tinggi (+++). Pada saat optimasi dilakukan, ekspresi S-100 yang diperoleh sangat lemah, diperkirakan antigen terselubungi akibat penggunaan fiksatif formalin. Untuk itu teknik Antigen Retrieval menggunakan microwave oven diterapkan (Shan-Rong Shi, dkk., 2001). Caranya adalah dengan menempatkan slide yang sudah dideparafinasi dan dihidrasi ke dalam larutan natrium sitrat (pH 6,0) dan dididihkan di dalam microwave oven selam 20 menit.



V. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil imunohistokimia menunjukkan bahwa terdapat ekspresi protein S-100 di jaringan palatum embrio mencit selama proses palatogenesis berlangsung. Data semikuantitatif polo ekspresi yang diamati di sejumlah wilayah anatomis palatum pada 4 tingkat perkembangan yang berbeda dirangkumkan di dalam Tabel 2. Rinciannya adalah sebagai berikut. Pada palatum embrio tingkat perkembangan hari ke-12 kebuntingan, ekspresi protein S-100 telah dijumpai merata di seluruh bagian palatum dengan derajat kepositipan sedang (++). Tabe12. Pola ekspresi spatiotemporal protein S-100 di jaringan palatum embrio mencit (Mus musculus, L). Wilayah anatomis palatum yang diamati Epitel palatum

Aspek nasal Aspek medial Aspek oral

Mesenkim paltum

Sisi luar aspek oral Sisi luar aspek oral Poros Ujung bilah Pangkal aspek nasal Pangkal aspek oral

Keterangan:

(-): tidak dijumpai ekspresi; (++); ekspresi sedang;

Tingkat Perkembangan embrio (kebuntingan hari ke-) 12 13 14 15 ++ + ++ + fusi fusi ++ + + + ++ ++ ++ ++ ++ ++

++ ++ ++ ++ +++ +

++ + +++ Fusi +++ +

++ + +++ Fusi +++ +

(+); ekspresi rendah; (+++): ekspresi tinggi .

Posisi kedua bilah palatum pada tingkat perkembangan ini telah melampaui proses tumbuh menaik (shelves elevation) dan mulai tumbuh horizontal. Ekspresi protein S-100 berderajat sedang yang dijumpai di palatum sejak masa awal perkembangannya bersesuaian dengan asal-usul jaringan palatum sebagai turunan sel-sel krista neuralis 14 Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum…, 2004 USU Repository©2006

yang bermigrasi pada tahap dini perkembangan embrio (D'Amico Martel dkk dalam Zimmerman dan Wee, 1984). Peran khusus protein S100 yang bersifat keruangan tidak teramati pada tingkat perkembangan ini karena ekspresi terdistribusi secara merata di seluruh bagian palatum. Pada palatum embrio tingkat perkembangan hari ke-13 kebuntingan, dijumpai perubahan pola ekspresi. Ekspresi di jaringan epitel, yang diamati di aspek oral, media, dan nasal palatum, cenderung berkurang (+) sedangkan di jaringan mesenkim tetap

Gambar 1. Pola ekspresi protein S-100 di jaringan palatum pada fngkat perkembangan hari-hari ke-13 kebuntingan. Lokasi ekspresi warna merah) spesifik di bilah palatum (b p) ; (l) = lidah; (+++) - ekspresi yang tinggi di mesenkim pangkal palatum aspek nasal. pada tingkat sedang hingga tinggi (++ hingga +++). Ekspresi yang tinggi terutama dijumpai di bagian pangkal bilah aspek nasal. Pada


tingkat perkembangan ini bilah palatum telah menyelesaikan sebagian besar proses pertumbuhan horizontalnya sehingga kedua ujung bilah sudah berada dalam posisi berdekatan untuk berfusi. Dari pola ekspresi seperti ini diperkirakan bahwa, baik sel-sel yang mengekspresikan maupun sel-sel sasaran kerja utama protein S-100 di palatum adalah komponen jaringan mesenkim. Tumbuh horizontal bilah palatum adalah salah satu proses genting palatogenesis yang harus berlangsung dengan laju tumbuh tertentu agar dicapai ukuran panjang yang cukup untuk mempertemukan kedua ujung bilah pada saat masa untuk berfusii tiba. Proses tumbuh ini membutuhkan sinkronisasi proliferasi don migrasi sel, sintesis senyawa matriks ekstrasel, don pengaturan arah tumbuh (Ferguson, 1988). Dalam hal ini kerja protein S-100 diperkirakan berkaitan dengan perannya sebagai faktor mitogenik don sebagai faktor peregulasi ekspresi protein-protein kontraktil seperti tubulin, tropomyosin, myosin, vimentin, don sitokeratin (Ikura, dkk., 2002). Khusus untuk ekspresi tinggi yang ditemukan di pangkal bilah aspek nasal, diperkirakan berkaitan dengan kontrol arah tumbuh bilah melalui kerja protein-protein kontraktil. Kontrol arah tumbuh bilah ini sangat perlu mengingat kedua bilah palatum tumbuh menjulur di dalam rongga dengan ujung-ujung bebas dan hanya ditopang oleh struktur bagian pangkalnya. Pengamatan histologis menunjukkan sel-sel mesenkim di daerah pangkal bilah aspek nasal tersusun rapi dengan arah sejajar dengan sumbu bilah. Pada palatum embrio tingkat perkembangan hari ke-14 kebuntingan, perubahan polo ekspresi terus berlanjut. Di jaringan epitel ekspresi yang rendah (+) masih terlihat di epitel bilah aspek oral, sedangkan di aspek nasal tanda-tanda adanya ekspresi sudah tidak dijumpai sama sekali. Sementara itu epitel medial (Mid Edge Epithelium /MEE) tidak dapat lagi diamati karena bilah-bilah telah berfusi.


Sementara itu, perubahan pola ekspresi yang lebih tegas terlihat di jaringan mesenkim. Ada kecenderungan peningkatan (+++) dan pemusatan ekspresi di mesenkim yang membangun tubuh bilah

Gambar 2.

Pola ekspresi protein S-100 di jaringan palatum pada tingkat perkembangan hari-hari ke-14 kebuntingan. Lokasi ekspresi tinggi memusat di mesenkim membentuk garis merah sepanjang poros palatum (Æ); (l) = lidah; nf = rongga nasofaring; of = rongga orofaring.

palatum, sehingga terlihat sebagai garis tebal horizontal di sepanjang poros bilah yang sudah berfusi. Sebaliknya, tingkat ekspresi di mesenkim sisi luar bilah aspek oral cenderung menurun (+). Pola ekspresi yang dijumpai pada embrio tingkat perkembangan hari ke-14


kebuntingan ini terlihat tidak berubah lagi pada embrio tingkat perkembangan hari ke-15 kebuntingan. Pada perkembangan hari hari ke- 14 dan hari ke-15 kebuntingan fusi telah berlangsung, kedua ujung bilah telah menyatu dan lapisan epitel medial sebagian mengalami kematian (Kerrigan, dkk., 2000) dan sebagian lagi telah bertransdiferensiasi menjadi mesenkim (Kaartinen, dkk., 1997) sehingga padanya tidak mungkin lagi dilakukan pengamatan adanya ekspresi. Meskipun ujung-ujung bilah palatum telah berfusi masih tetap diperlukan kondisi spesifik untuk mempertuhankan fusi agar tetap sinambung dan tidak terlepas kembali akibat tenaga regangan yang timbul ketika struktur-struktur kepala tumbuh membesar. Diperkirakan kondisi seperti ini memerlukan kerja protein-protein kontraktil, mikrotubula, protein-protein tautan sel seperti desmin yang dibangun oleh regulasi protein S-100 pasca fusi yang ditunjukkan oleh pola khas ekspresinya yang cenderung meningkat dan memusat di sepanjang poros palatum. Ekspresi protein S-100 yang dijumpai spesifik di jaringan palatum dan berfluktuasi secara spatiotemporal mengisyaratkan bahwa, pada hewan mencit protein S-100 turut berperan dalam proses palatogenesis yang bermuara pada keberhasilan penutupan langit-langit mulut embrio. Dengan demikian segala macam faktor yang dapat mengubah pola ekspresi tersebut dapat menggangu keberhasilan palatogenesis dan berpotensi menginduksi cleft palate. Dalam kaitan itulah penjelasan tentang faktor penentu apa yang berada di balik kenyataan bahwa sebagian besar agensia penginduksi cleft palate tergolong senyawa aktif neurofarmakologis dapat diberikan. Pada palatogenesis normal, terdapat pola ekspresi protein S100 dengan derajat dan sebaran yang berfluktuasi bersesuaian dengan perkembangan palatum. Gangguan terhadap pola ekspresi ini dapat


mempengaruhi keberhasilan pertumbuhan bilah palatum dan akhimya mempengaruhi keberhasilan

penutupan

langit-langit

mulut.

Berbagai

macam

senyawa

aktif

neurofarmakologis yang mekanisme kerjanya berlangsung melalui osilasi kalsium, diperkirakan dapat mengubah derajat don pola ekspresi protein CaBP S-100 di palatum, kemungkinan

melalui

pengalihan

sebagian

daripadanya

untuk

fungsi

eksositosis

neurotransmitter sehingga mengganggu fungsi regulasi ekspresi gen (Swanson, dkk., 1997). Jika pengaruh senyawa-senyawa tersebut memasuki palatum pada saat-saat genting dari perkembangannya maka induksi cleft palate dapat terjadi.

VI. KESIMPULAN 1. Protein S-100 telah diekspresikan di jaringan palatum mencit (Mus musculus, L) pada masa awal palatogenesis dengan kecenderungan ekspresi berderajat sedang dan terdistribusi merata di seluruh bagian palatum, ekspresi meningkat pada soot pertumbuhan horizontal bilah terutama di jaringan mesenkim dan cenderung tetap tinggi hingga pasca fusi dengan pola distribusi memusat di mesenkim sepanjang poros bilah. 2. Pola spesifik ekspresi S-100 di palatum embrio mengindikasikan keterlibatannya dalam proses penutupan langit-langit mulut. 3. Senyawa-senyawa aktif neurofarmakologis yang kerjanya melalui mobilisasi calcium binding protein (CaBP) untuk fungsi eksositosis neurotransmitter dapat menggangu ketersediaan protein CaBP S-100 untuk fungsi regulasi ekspresi protein. Mekanisme tersebut menjelaskan kenyataan bahwa kebanyakan agensia penginduksi cleft palate adalah senyawa aktif neurofarmakologis.


DAFTAR PUSTAKA Abbott, B.D., T.R. Longsdon, T.S. Wilke. 1994. Effects of Methanol on Embryonic Mouse Palate in Serum-Free Organ Culture. Teratology 49 : 122 - 134. Abbot, B.D., M.R. Probst, G.H. Perdew, A.R. Buckalew. 1998x. Ah Receptor, ARNT, Glucocorticoid Receptor, EGF Receptor, EGF, TGF-a, TGF-ail, TGF-(i2, TGF-(33, Expression

in

Human

Embryonic

Palate

and

Effect

of

2,

3,

7,

8-

Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TODD). Teratology 58: 30-43. Abbott, B.D., C.D. Adamson, R.M. Pratt. 1998b. Retinoic Acid Alters EGF Receptor Expression During Palatogenesis. Development 102: 833 - 867. Bennet, G.D., F. Lou, J.A. Calvin, R.H. Finnel. 1997. Phenytoin-Induced Teratogenesis: A Molecular Basis for The Observed Developmental Delay During Neurulation. Epilepsia 38: 415 - 423. Bittencourt, M.A.V., A.M. Bolognese. 2000. Epithelial alterations of secondary palate formation. Braz DentJ. 11(2): 117- 126. Czeizel, A.E. 2001. Primary Prevention of Congenital Abnormalities. Cong Anom, 41: 124 125. Daub, B.M. Schroeter, G. Pfitzer, V. Ganikevich. 2003. Expression of members of the S-100 Ca2+- binding protein family in guinea-pig smooth muscle. Cell Calcium 33(1): 1 - 10. Drury, R.A.B., E.A. Wallington. 1976. Charleton's Histological Technique. Oxford Univ. Press. Ferguson, M.W.J. 1988. Palate Development. Development 103 (Suppl): 41 - 60. Hagiwara N, Katarova Z, Siracusa LD, Brilliant MH. 2003. Nonneuronal expression of the GABA (A) beta 3 subunit gene is required for normal palate development in mice. Dev Biol 2003 Feb 1; 254 (1): 93- 101.


ikura, M., M. Osawa, J.B. Ames. 2002. The role of calcium binding protein in the control of transcription: structure to function. Bioessays 24 (7) : 625 - 636. Kaartinern, V., Xiao-Mei Cui, N. Heisterkamp, J. Goffen, dan C.F. Shuler. 1997. Transforming Growth Factor-~3 Regulates Transdifferentiation of Medial Edge Epihelium during Palatal Fusion and Associated Degradation of the Basement Membrane. Developmental Dynamics 2009: 255 - 260. Kadri, N., S. Ismael, N. raid, A. Surjono, A. Harianto, I. Mustajab. 1995. Congenital Malformations and Deformations in Provincial Hospitals in Indonesia. Cong-Anom. 35: 411 - 423. Kerrigan, J.J., J.P. Mansell, A. Sengupta, N, Brown, J.R. Sandy. 2000. Palatogenesis and potential mechanism for clefting. J.R. Coll. Surg. Edinb., 45: 351 - 353. Maki, M., Y. Kitaura, H. Satih, S. Ohkouchi, H. Shibata. 2003. Structure, function and molecular evolution of the penta-EF-hand Ca2+ -binding protein. Biochim Biophys Acta 4; 1600 (1-2): 51 - 60. Marti nez-Alvarez, C., C. Tudeta, J. Perez Miguelsanz, S. O'Kane, J. Puerta, M.W. Ferguson. 2000. Medial edge epithelial cell fate during palatal fusion. Dev Biol 220 (2): 343 357. Shah,

R.M., R. Shuing, G. Benkhaial, A.V. Young, D. Burdett. 1991 b. Genesis of Hadacidine-Induced Cleft Palate in Hamster: Morphogenesis, Electron Microscopy, and Determination of DNA Synthesis, CAMP, and Enzyme Acid Phosphatase. The American Journal of Anatomy 192: 55 - 68.

Swanson, A.G., A.P. Arkin, J. Ross. 1997. An endogenous calcium oscillator may control early embryonic division. PNAS USA 94: 1 194 - 1 199. Tamascovic, R. S.J. Bischel, H. Rogniayx, M.R. Stegert, B.A. Hemmings. 2003, Mechanism of Ca2+ -mediated regulation of NDR protein kinase through autophosphorilation and phosphorilation by an upstream kinase. J Biol Chem 278 (9): 6710- 6718. Thayer, S.A., Y.M. Usachev, W.J. Pottorf. 2002. Modulation Ca2+ clearence from neurons. Front Biosci 7: d1255- 1279.


Tsukada, S., W. Tanaguchi. 1993. Clinical Aspects of Cleft Lip and Palate Patient Treated at Kanazawa Medical University Hospital from 1974 to 1993. Cong Anom. 33: 345 355. Ulfig, N. 2002. Calcium-binding protein in the human brain development. Adv Anat Embryol Cell Biol 165: 111-IX, 1 - 92. Wyzinsky, D.F., dan T.H. Beaty. 1996. Review of the Role of Potensial Teratogens in the Origin of Human Non-Syndromic Oral Clefts. Teratology 53: 309 - 317. Zimmerman, E.F., E.L. Wee. 1984. Role of neurotransmitter in palate development. In: Current topics in developmental biology, vol 19, ed. By: Zimmerman, E.F. ACAdemic press, Orlando Florida. Pp. 37 - 63.


Salomo Hutahean: Pola Ekspresi Calcium-Binding Protein (CaBP) S-100 di Jaringan Palatum, 2004 USU Repository 2006

Recommend Documents