SACHARIDY A JEJICH KONJUGÁTY Jitka Moravcová Ústav chemie přírodních látek, VŠCHT Praha, Technická 5, 166 28 Praha 6, e-mail:
[email protected] Obsah: Úvod ........................................................................................................................................ 1 Typy interakcí sacharidů s proteiny ........................................................................................ 3 Glykolipidy.............................................................................................................................. 4 Glykoproteiny, proteoglykany a peptidoglykan ...................................................................... 9 Glykoproteiny.............................................................................................................................. 9 Proteoglykany............................................................................................................................ 12 Peptidoglykan ............................................................................................................................ 13 Biologická role sacharidů v glykoproteinech ............................................................................ 14 5. Interakce sacharidových epitopů s lektiny ............................................................................ 15 6. Taktika hledání analogů sacharidových epitopů ................................................................... 18 7. Závěr...................................................................................................................................... 20 8. Seznam použité literatury ...................................................................................................... 20 1. 2. 3. 4.
1. Úvod Před zhruba 20 lety se zdálo, že téma sacharidy je vyčerpané a hlavní pozornost poutaly nukleové kyseliny a proteiny. Nastala éra genetického inženýrství, klonování a sekvencování genomů. Postupem času se zjistilo, že buněčné rozpoznávání a adhezi buněk nelze vysvětlit jen pomocí těchto dvou kategorií sloučenin. Aby totiž skupina látek mohla zastávat funkci informačního systému v živém organismu, musí splňovat několik požadavků: a) možnost specifického kódování (informace musí být jednoznačná a musí být i dešifrovatelná s nízkou pravděpodobností špatné interpretace); b) šifrovací aktivní sekce biomolekuly musí mít malou velikost proto, aby její synthesa nebyla energeticky náročná; c) aktivní sekce musí být dobře prostorově přístupná; d) typ kódovací sloučeniny musí mít dostatečný potenciál pro rychlé strukturální změny. Všechny tyto znaky efektivně pracujícího kódovacího systému vykazují sacharidy. Jednoduché sacharidy jsou prakticky nevyčerpatelnou zásobárnou rozmanitých struktur, neboť kupříkladu každá hexosa nabízí pět hydroxylových skupin jiné molekule sacharidu ke tvorbě glykosidové vazby. Tak by 20 hexos mohlo teoreticky poskytnout 6,4 . 10 15 hexamerů, zatímco 20 aminokyselin pouze 1,4 . 107. Sacharidy jsou dále konformačně flexibilní, důležitá je zejména volná rotace kolem glykosidové vazby, přitom ale jednotlivé konformery mohou mít různou afinitu k vazebnému místu receptoru-dekodéru. Kromě lineárních oligomerů mohou tvořit i rozvětvené struktury, což je vlastnost v biologickém systému zcela unikátní. Sacharidy jsou tedy téměř ideální sloučeniny pro generování kompaktních jednotek s explicitními informačními 1
vlastnostmi. Za tímto účelem jsou v organismu vázány kovalentní vazbou na lipidy a proteiny nebo peptidy a studiu těchto biookonjugátů se věnuje posledních dvacet let obrovská pozornost. Sacharidy tvoří jen asi 1 % hmotnosti člověka, zatímco proteiny zhruba 15 % stejně jako lipidy, 5 % je anorganických solí a zbytek je voda. Nepočítáme-li D-ribosu a 2-deoxy-D-ribosu, je základních monosacharidů v lidském těle deset (Obr. 1), z nich kyselina neuraminová, glukosamin a
D-galaktosamin
HO OH
OH
se vyskytují ve formě svých N-acetylderivátů. Kyselina
HO HO
O
O
O OH
OH
OH D-glukosa (Glc)
OH D-galaktosa (Gal)
HO
HO HO
O OH HO
OH NHAc
N-acetyl-D-glukosamin (GlcNAc)
R9
O HO
OH
OH HO
HO
D-
OH
HO
OH D-xylosa (Xyl)
OH L-fukosa (Fuc)
COOH O OH
OH
HO
N-acetyl-D-galaktosamin (GalNAc)
O R8 OH 6 7 9 8 4 O 2 COOH R5 NH 1 5 O 3 R4 O R7
OH
OH
NHAc
O
O COOH OH
O
OH
HO OH
OH
D-glukuronová
D-idouronová
kyselina (GluA)
kyselina (IdoA)
sialové kyseliny 7-O-acetyl 4-O-acetyl N-glykolyl 8-O-acetyl 9-O-laktyl 8-O-methyl 8-O-sulfát 9-O-acetyl 9-O-fosfát R4,R5,R7,R8,R9 = H kyselina neuraminová kyselina N-acetylneuraminová N-acetyl (NeuAc, Neu5Ac, NANA)
Obr. 1 Struktury základních monosacharidů lidského těla
neuraminová tvoří celou řadu dalších derivátů, které se nazývají společným názvem kyseliny sialové a které ale u savců nejsou přítomny. Biosynthesa glykokonjugátů probíhá krok za krokem v endoplasmatickém retikulu a Golgiho aparátu (Obr. 2). Exogenní monosacharidy penetrují do buňky a jsou přeměněny do stavebních bloků, typicky do podoby glykosylnukleotidů, které jsou dále transformovány na oligosacharidy a navázány na lipidickou nebo proteinovou kostru. Těchto transformací se účastní celá řada glykosidas a glykosyltransferas. Jakmile se glykokonjugáty dostanou na povrch buňky, slouží jako ligandy pro receptory jiných buněk nebo pathogenů.
2
2. Typy interakcí sacharidů s proteiny Jako receptory se pro interakce se sacharidy uplatňují především proteiny a to prostřednictvím nevazebných interakcí, které mohou být typu vodíková vazba, asociace s kovy, nepolární a nebo iontová interakce. Důležité je, že při
této
interakci
nedochází
k žádné
chemické
transformaci
sacharidu,
a
proto
se
netýká enzymů. Obecně jsou
tyto
interakce
s monosacharidy slabé (Ka 103 až 104 M-1), pokud má receptor
multifunkční
afinitu, může být interakce s oligosacharidem silnější (např.
tzv.
cluster
glycoside
effect,
který
projevují lektiny). Vodíkové můstky. Téměř nikdy se nejedná o jeden isolovaný vodíkový můstek, ale vždy o celou Obr. 2 Biosynthesa glykokonjugátů
síť interakcí bidentálního charakteru
s obecným
motivem NH…OH…O=C, které se účastní pobočné řetězce aminokyselin, jako jsou Asn, Asp, Glu, Gln, Arg nebo His, a sacharidové hydroxylové skupiny i kyslík pyranosové kruhu (Obr. 3a). Účast molekul vody je zcela obvyklá. Asociace s kovy. Interakci nejčastěji zprostředkovává vápník a dále mangan (Obr. 3b). V případě C-lektinů byla asociace s kovy přímo pozorována. Komplementární kontakt nepolárních ploch. I když jsou sacharidy především polárními sloučeninami, jsou schopny i nepolárních interakcí, neboť jedna ze stran molekuly sacharidu bývá více hydrofobní než druhá v případě D-galaktosy je to strana B (jako strana A se označuje ta strana, kde se atomy uhlíku počítají od nižšího k vyššímu ve směru pohybu hodinových ručiček), která je například hydrofobnější než odpovídající B strana D-glukosy nebo D-mannosy, 3
protože konfigurace na atomu C-4 je L a hydroxylová skupina směřuje nahoru do strany A (Obr. 3c). Z toho důvodu je D-galaktosa skoro vždycky v nepolární interakci s aromatickým kruhem vhodné aminokyseliny. Tento fakt ukazuje na důležitost interakce -elektronů s elektrony vazby C-H. V případě oligosacharidů nastává dokonce interakce se dvěma pyranosovými kruhy a molekula sacharidu je tak uzavřen mezi dvě plochy. Iontová interakce. Uplatňuje se u nabitých sacharidů, tj. těch, které obsahují aminoskupinu, glukuronovou nebo idouronovou kyselinu či kyseliny sialové, přičemž karboxylová skupina je skoro vždy asociována s argininem. Tento typ interakce zodpovídá za afinitu aminoglykosidových antibiotik.
HO HO Glu 193
Arg 151 Asn 232
HO OH O H
O OH
Ca2+
H O O H
OH O OH
OH
HH O HO OH H
OH
OH
a)
b)
Asn 187
c)
Obr. 3 Příklady interakcí monosacharidů s proteiny: a) vodíkové můstky, b) asociace s kovem, c) hydrofobní interakce
3. Glykolipidy Jsou součástí buněčných membrán a vyskytují se ve všech organismech. Po chemické stránce je to heterogenní skupina amfifilních molekul, které mají jednu nebo více molekul monosacharidů vázaných jako glykosidy na hydrofobní kostru acylglycerolu nebo ceramidu. Jejich úkolem je přispívat ke stabilizaci a vyšší pevnosti membrán a rovněž se uplatňují v buněčné komunikaci, při modulaci receptorů a nebo signální transdukci, diferenciaci, proliferaci a onkogenezi.
4
Mezi glykolipidy prokaryotů se řadí hopanoidy, mykoláty, lipoteichové kyseliny, lipoglykany,
lipopolysacharidy
a
sfingoglykolipidy.
Hopanoidy
jsou
glykosidy
s
rigidními pentacyklickými OH OH
O
OH
OH R OH O
v membráně
pravděpodobně
vážou
cholesterol, a tím ji zpevňují
R = CH2OH, CH2NH2, COOH
HO OX O OX OOX O O PO ( O P O) O P O n O O O O OH X = H, glykosyl HO OH
a
aglykony
OH
(Obr. 4). Mykoláty jsou součástí obálky
mykobakterií,
kde
fungují jako efektivní bariéra O
O OH
proti
pronikání
antibiotik
a
O OH
chemotherapeutik. Po chemické OR1 OR2 stránce jsou mykoláty estery
Obr. 4 Struktura hopanoidů a lipoteichových kyselin
peptidoglykanu
HO
(arabinogalaktanu)
s tzv.
mykolovými kyselinami (substituované -alkyl--hydroxymastné kyseliny). Lipoteichové kyseliny v cytoplasmatické membráně grampozitivních bakterií obsahují charakteristický alditol(glycerol)-fosfátový řetězec (Obr. 4). Lipoglykany jsou lineární nebo rozvětvené polysacharidy vázané na glycerol a rovněž jsou fosforylovány. Protože se lipoteichové kyseliny a lipoglykany nevyskytují současmě v jedné a téže baktérii, předpokládá se, že jejich funkce jsou zaměnitelné. Lipopolysacharidy (LPS) jsou sloučeniny specifické pro gramnegativní bakterie, kde
tvoří
vnější
povrch
vnější
membrány (Obr.
5).
Lipopolysacharidy (Obr.
obsahují lipidickou část (lipid A), která je obecně tvořena acylovaným
6)
-(16)-
aminodisacharidem, který může být fosforylován v poloze O-1 a O-4´. Lipid A je dále v poloze O-6´glykosylován polysacharidem, který se skládá z tzv. heterooligosacharidu jádra a Ospecifického polysacharidu (S-forma LPS) nebo O-antigen chybí (R-forma LPS). Zatímco struktura jádra je víceméně rigidní, je struktura O-antigenu variabilní a specifická. LPS jsou endotoxiny, které vyvolávají u lidí a vyšších organismů septický šok. V USA se ročně vyskytne 500 000 případů sepse ročně, z nich 20 – 50% je smrtelných pokud se ovšem rozvine septický šok, je úmrtnost 90 %.
5
O-antigen
lipopolysacharid
KDO
periplasmatický prostor peptidoglykan
lipid A
plasmatická membrána
Obr. 5 Buněčná obálka gramnegativní baktérie a struktura lipopolysacharidu Sepse je černou můrou lékařů, neboť o ní platí beze zbytku sarkastické pořekadlo, že operace se zdařila a pacient zemřel. Uvádí se, že úmrtí na sepsi v průběhu první světové války bylo hojnější než úmrtí vyvolaná bezprostředně zraněním. Nositelem toxicity je lipid A, který stimuluje hostitelskou buňku k nadprodukci endogenních mediátorů, např. cytokinů, které v malém množství aktivují imunitní systém hostitele, ale ve velkém vyvolají horečku, AbeOAc Glc GlcNAc Man( Rha Gal Glc Gal )Gal n Glc Hep
O
HO HO
2-
HO HO
Hep-OPO3
Hep KDO KDO O O O O P O O O NH O O
tachykardii, vysoký tlak a následně O
KDO O HO O O O
HO O OH
O O
HN
O O O P OO O
O OH
HO HO HO HO
OH O Hep
HO
OH COOH
OH
O HOOH Abe
smrt
díky
nefunkčnosti všech orgánů spojených
s krevním
oběhem. Pravděpodobnost úmrtí
jasně
koreluje
s hladinou LPS v krevním séru, např. pro Neisseria meningitidis
koncentrace
800 ng/ml dává 50% naději na přežití, zatímco hladina vyšší než 10 000 ng/ml je 100%
smrtelná.
Některé
lipidy A jsou toxické méně Obr. 6 Struktura LPS baktérie Sallmonela typhimurium
6
a slouží jako inspirativní matrice pro návrh nových
léčiv. Celkem účinným zásahem do struktury
OMe O
-O O P O O -O
O HO O
O HO O
NH
HO
O
O HN O O
O - lipidu A je náhrada esterových vazeb za O nehydrolyzovatelné vazby etherové a lipid O P OE5531 prochází klinickými zkouškami jako antagonista lipidu A. Glykosfingolipidy
gramnegativních
bakterií jsou formálně podobné LPS, neboť jsou složeny z ceramidu (sfinganin acylovaný
E5531
mastnou
-glykosylovaného
kyselinou)
negativně nabitou pyranosou (Obr. 7). Pak tři molekuly strukturální
jednotku
odpovídající
lipidu
A.
Sfingolipidy vykazují i podobnou biologickou aktivitu
jako
lipid
O HO HO
O
monomery
biologicky
neaktivní.
HO O
Ukazuje se, že pravděpodobně existuje jakási
HO
jsou
představují
OH
ačkoliv
glykosfingolipidů
A,
glykosfingolipidů
H N HO
O
supramolekulární struktura glykosfingolipidů, která je zodpovědná za jejich biologické a fyzikálně-
14 14
18
chemické vlastnosti. Povrch buněk eukaryotů je potažen sacharidovou vrstvou
a
tato
tzv.
z glykolipidů,
glukokalix
se
skládá
glykoproteinů
a
Obr. 7 Primární struktura glykosfingolipidu Sphingomonas paucimobilis
O
galaktosyl HO HO
O OH
O
mastná kyselina
HN OH
sfingosin (sfinganin)
OH Obr. 8 Struktura neutrálního galaktosylceramidu
glykosylaminglykanů.
Prominentní
základní
živočišných
strukturou
glykolipidů
je
ceramid,
jehož
aminoskupina je acylována mastnou kyselinou
a
hydroxylová
skupina
glykosylována. Tento typ sloučenin se
nazývá glykosfingolipidy (Obr. 8) a objeveny byly ve 2. polovině 19. století. Podle struktury se dělí na neutrální a kyselé, kterým negativní náboj dodávají sialové nebo uronové kyseliny a dále sulfáty, fosfáty a fosfonáty mono- a oligosacharidů. Nacházejí se v nervovém systému a mozku, příkladem je galaktosylceramid (Obr. 8) z mozku savců. Více glykosylované glykosfingolipidy jsou ve všech tkáních a nazývají se podle oligosacharidového řetězce, např.: ganglio (-D-Gal-(17
3)--D-GalNAc-(1-4)--D-Gal-(1-4)-D-Glc-), neolakto (-D-Gal-(1-4)--D-GalNAc-(1-3)--DGal-(1-4)-D-Glc-), isoglobo (-D-GalNAc-(1-3)--D-Gal-(1-3)--D-Gal-(1-4)-D-Glc-) a další. gangliosid GM2 gangliosid GM3
OH OH OH OH O O O HO O OH OH NHAc OH O HO OH HOOC O O O O OH HN OH O ( ) HO ( )16 12 O OH HO AcNH OH ceramid NeuAc glukosylceramid Obr. 9 Struktura gangliosidu GM1, který je receptorem toxinu střevní cholery
Gangliosidy jsou kyselé glykosfingolipidy, které obsahují jednu nebo více sialových kyselin v poloze O-3 nebo O-6 D-galaktosy nebo GalNAc kódovacího oligosacharidu (Obr. 9). Řada z nich jsou antigeny krevních skupin, mohou vyvolat autoimunitní poruchu, modifikují aktivitu funkčně naprosto rozdílných receptorů, např. gangliosid GM1 aktivuje nervový růstový faktor. Gangliosidy se účastní adhezních procesů, kde představují vazebná místa pro toxiny, viry OH OH OH OH O O O HO O OH NHAc HOOC O X O HO OH HO AcNH OH
a bakterie, kdy se cukerná část glykosfingolipidu váže na lektinový receptor pathogenu.
Studie vztahu
COOtBu struktura-aktivita vedly k objevení řady COOtBu látek použitelných jako léčiva, např.
látka X je účinným antagonistou právě gangliosidu
GM1.
v metabolismu
gangliosidů
Poruchy mají
obvykle fatální důsledky. Např. nedostatečná funkce hexosaminidasy A, která katalysuje biodegradaci gangliosidů, vede ke genetickému onemocnění nazvanému Tay-Sachsova nemoc. Nebezpečně vysoká koncentrace gangliosidu GM2 v nervových buňkách mozku pak způsobí nevratné změny mentálních i fyzických schopností a dítě, které se zpočátku vyvíjí normálně, je postiženo slepotou, hluchotou, později dochází k atrofii a paralýze veškerého svalstva. Postižené dítě umírá obvykle kolem pátého roku věku. Sfingolipidy jsou nezbytné pro správnou funkci lidské kůže, kde přispívají ke vzniku permeační bariéry pro přenos vody. Tato bariéra je tvořena tenkou vrstvou tzv. keratinocytů, což je vysoce organizovaná lipidová matrice volných mastných kyselin, cholesterolu a ceramidů. 8
Hlavním a charakteristickým ceramidem je fytosfingosin (D-ribo-4-hydroxysfingamin), který tvoří až 40 % z obsahu ceramidů a má v poloze 4 ceramidu další hydroxylovou skupinu, jejímž úkolem je pravděpodobně tvořit vodíkovou vazbu s molekulou vody, a tím ji ve struktuře kůže zadržovat. Mezi intenzivně studované glykolipidy patří glykosfingolipidy parazitů. Odhaduje se, že 1/3 světové populace trpí střevními parazity. Zvláštností je to, jak se parazit adaptuje na přežití, neboť musí procházet během životního cyklu dramatickými změnami teploty, iontové síly, pH a rovněž různými imunitními systémy. Zdá se, že glykolipidy jako integrální součást povrchu parazita hrají důležitou roli v různých mechanismech nutných pro přežití. Hlísty využívají molekulární mimikry, aby zabránily imunogennímu rozpoznání, a jsou-li poznány, snaží se obejít svoje zničení tím, že se aktivně účastní imunoregulačního mechanismu. V prvé řadě napodobují strukturu glykosfingolipidů hostitelského organismu, protože ty odpovídají za adhezi buněk. 4. Glykoproteiny, proteoglykany a peptidoglykan Jejich základní charakteristikou je kovalentní vazba sacharidů na peptid nebo protein. Glykoproteiny Jsou přítomny ve všech organismech a to jak v intracelulárním tak extracelulárním prostoru i v buněčných membránách (enzymy, antibody, receptory, hormony, cytokiny, strukturální proteiny). Jejich bohatým zdrojem je krevní sérum, které obsahuje více než 100 proteinů většinou glykosylovaných s výjimkou sérového albuminu. Glykoproteiny jsou polymorfní, což je svázáno se strukturou sacharidů: protein může nést různé oligosacharidy na stejném glykosylačním místě. Nejdříve převládal názor, že jde o náhodnou chybu při jejich synthese, teď se ale prokázalo, že za srovnávacích podmínek je populace glykoforem reprodukovatelná a regulovaná. Sacharidy v proteinech nemají jednotnou, unifikovanou funkci. Obsah sacharidů je v nich různý pohybuje se od 1 hm% v kolagenu až po 99 hm% v glykogenu. Škála struktur vázaných sacharidů je pestrá a pokrývá mono, di, lineární i rozvětvené oligo a polysacharidy a jejich deriváty, a to i ve formě sulfátů nebo fosfátů. Nejčastěji jsou sacharidy vázány jako O- a N-glykosidy, ojediněle rovněž jako C-glykosidy, a nebo přes ethanolaminfosfát. Vazebným místem pro tvorbu N-glykosidů je asparagin a z jednoduchých sacharidů se váže nejčastěji Glu, Rha nebo GalNAc. Pro vznik O-glykosidů jsou využívány hydroxylové skupiny zejména serinu a threoninu, dále pak tyrosinu, hydroxyprolinu nebo hydroxylysinu. Obvyklým vazebným místem je sekvence serin/threonin/prolin, které se říká mucinová doména. Z jednoduchých sacharidů jsou obvykle navázány GalNAc, GlcNAc, Fuc, Xyl, Glu, Gal, Man nebo Ara. Vazba přes ethanolaminfosfát využívá C-koncové aminokyseliny 9
proteinu a dává stabilní, orientované připojení sacharidů na membránu obvykle na extracelulárním povrchu buňky. Toto spojení se nazývá glykosylfosfatidylinositolová (GPI) kotva (Obr. 10). O H2N
protein
NH O -O P O HO HO HO HO
O OH O OH O O
HO HO
GalNAc
Man ethanolaminfosfát O OH O O HO
Gal-Gal-Gal Gal
OH O OHOH H2N O O O O P O R1 O-
diacylglyceroly R2 ceramid alkylacylglyceroly
mastné kyseliny OH
Obr. 10 Minimální struktura GPI kotvy a některé strukturální variace
Daleko častěji než monosacharidy jsou na glykoproteiny vázány oligosacharidy a to v těch nejrozmanitějších strukturách, jaké si dovedeme představit. Souborně se označují jako glykany. N-Glykany Obecným motivem struktury N-glykanů je stálý pentasacharid jádra, který je připojen na asparagin (Obr. 11). Neskutečná diversita struktur N-glykanů má původ v tzv. tykadlových („antennae“) oligosacharidech, které mohou být lineární i rozvětvené a připojené k jádru až v počtu pěti řetězců. Podle jejich struktury a způsobu připojení se rozeznávají čtyři základní skupiny tykadel: oligomannosa, komplexní, hybridní a nejnovější typ obsahující D-xylosu.
Asn
Man(1-6)[Man(1-3)]Man(1-4)GlcNAc(1-4)GlcNAc(1-N) pentasacharid jádra O
O
O
O tykadlové oligosacharidy O O O O
O O
pentasacharid jádra
O O O O
Obr. 11 Schematická struktura N-glykanů 10
Asn
První typ obsahuje buď od dvou do šesti -D-mannopyranosylových jednotek, nebo více jednotek (až devět) v kombinaci s N-acetylglukosaminem a nebo až 100 – 200 jednotek jako v případě kvasinek. Komplexní N-glykany neobsahují žádnou
D-mannosu
kromě té vázané
Skupina 1
Skupina 3
Gal(1-4)GlcNAc1
NeuNAc(2-3)Gal(1-3)GlcNAc1
Skupina 2 NeuNAc(2-6)Gal(1-4)GlcNAc1 NeuNAc(2-3)Gal(1-4)GlcNAc1 Gal(-3)Gal(1-4)GlcNAc1 Fuc(-2)Gal(1-4)GlcNAc1 Skupina 4 R- Gal(1-4)GlcNAc(1-3) Gal(1-4)GlcNAc1 n R-Gal(1-4)GlcNAc(1-6)Gal(1-4)GlcNAc1
NeuNAc(2-6)0,1 Gal(1-3)GlcNAc1 Fuc(-4) NeuNAc(2-3)Gal(1-3)GlcNAc1 Fuc(-4) Gal(1-4)GlcNAc1 Fuc(-3) NeuNAc(2-3)Gal(1-4)GlcNAc1
R- Gal(1-4)GlcNAc(1-3) n NeuNAc(2-8) NeuNAc(2-3)Gal(1-4)GlcNAc1 n Skupina 5 SO3-(3 nebo 4)Gal(1-4)GlcNAc1 NeuNAc(2-3)Gal(1-4)GlcNAc1
Fuc(-3)
Obr. 12 Nejčastější struktury komplexních N-glykanů. Šipka naznačuje připojení na pentasacharid jádra.
v jádře. Obě
D-mannosy
jádra jsou glykosylovány až na pěti místech disacharidem Gal(1-
4)GlcNAc (N-acetyllaktosamin) s výhradně -vazbou. Velice často je laktosaminová jednotka dále substituována přes sialové kyseliny nebo přímo (Obr. 12). Oligosacharidy hybridních Nglykanů spojují základní charakteristiky obou předchozích skupin Man(1-6) jádra nese další jednu nebo dvě molekuly D-mannosy a Man(1-3) má připojené jedno nebo dvě tykadlo typu, která se objevují v komplexních glykanech. Poslední skupina obsahuje charakteristicky D-xylosu vázanou na -D-mannosu jádra vazbou 1-2 a často má ještě (1-3)-vázanou L-fukosu na GlcNAc(1-N). Struktura N-glykanového cukerného epitopu je specifická pro buňku a je označována jako antigenní determinant. Jsou ve specifických cukerných epitopech jako např. antigeny krevních skupin H, A a B, které jsou složkami sfingolipidů na povrchu erythrocytů. Mají jen velmi malé rozdíly v určující struktuře tykadel, které ale mají dalekosáhlé důsledky. Sérum jedinců s krevní skupinou A obsahuje protilátky anti-B, zatímco krevní skupina B má protilátky anti-A. Skupina AB nemá protilátky žádné, neboť její erythrocyty nesou oba antigeny A i B. Lidé s krevní skupinou O mají obě protilátky a jejich buňky neobsahují antigeny žádné. Antigen H je prekurzorem oligosacharidů A a B a je přítomen na povrchu buněk krevní skupiny O. Struktura sacharidových epitopů jednotlivých krevních skupin je následující: H:
Fuc(1-2)Gal(1-3 nebo 4)GlcNAc; A:
4)GlcNAc; B:
11
GalNAc(1-3)[Fuc(1-2)]Gal(1-3 nebo
Gal(1-3)[Fuc(1-2)]Gal(1-3 nebo 4)GlcNAc.
O-Glykany Tvoří rovněž velmi pestrou škálu cukerných motivů, které jsou navázány na hydroxylovou skupinu serinu nebo threoninu. Dělí se na dvě základní skupiny: O-glykany mucinového a nemucinového typu. První typ se nazývá mucinový proto, že byl poprvé identifikován v hlenu, a obsahuje až dvacet monosacharidů vázaných prostřednictvím Nacetylgalaktosaminu. Formálně se O-glykany mucinového typu dělí na osm skupin podle
NeuNAc(2-6) NeuNAc(2-3)
GalNAc(1-O)-Ser/Thr
0,1
Gal(1-3)
0,1
Gal(1-4)GlcNAc(1-3)Gal(1-3)GalNAc(1-O) -Ser/Thr vazba na další oligosacharidy za vzniku antigenových determinantů sLex, Lex, Ley
Obr. 13 Struktury některých O-glykanů generovaných z Tn antigenu. monosacharidů jádra (Gal, GalNAc, GlcNAc), na kterých jsou připojeny další tykadlové sacharidy (nejčastěji Fuc a NeuNAc). Základní struktura, GalNAc(1-O)Ser/Thr, se nazývá Tn antigen a od něho se odvozuje řada O-glykanů (Obr. 13). Obvykle tvoří klastry na krátkém úseku peptidové sekvence Ser-Thr-Pro, které se taká říká mucinová doména. Důvodem je vyšší polarita mucinové domény a snadnější sterický přístup. O-Glykany nemucinového typu zahrnují větší výběr sacharidů jádra a místem glykosylace proteinu je opět hydroxylová skupina serinu nebo threoninu. Struktura jádra může být např.: Fuc(1-O)Ser/Thr, Glc(1-O)Ser, GlcNAc((1O)Ser/Thr, naopak Mann(1-O)Ser/Thr není u savců běžná. Rovněž O-glykany jsou pro organismus a jeho zdravotní stav velice důležité, neboť nesou antigeny krevních skupin, ale i antigeny rakovinných buněk a jsou rozpoznávací doménou pro buněčné interakce.Proteoglykany Na proteiny jsou v nich vázány tzv. mukopolysacharidy, což jsou lineární glykosaminoglykanové polymery, které mají v řetězci 15 až několik set základních disacharidových jednotek. Vždy nesou záporný náboj a jejich základními jednotkami jsou Nsulfátovaný D-glukosamin (GlcNS), GlcNAc a GalNAc, které se střídají s Gal, D-glukuronovou (GluA) nebo L-idouronovou (IdoA) kyselinou. Jsou zejména v pojivových tkáních, neboť tyto mukopolysacharidy jsou vysoce hydratované molekuly. Asi nejznámější je heparin, který se používá více než 60 let proti srážení krve, dále kyselina hyaluronová je součástí synoviální tekutiny očního sklivce nebo dermatan-sulfát přítomný v kůži (Obr. 14). Řada onemocnění jako je atherosklerosa, některé druhy rakoviny či Alzheimerova choroba se dávají do souvislosti s abnormalitami v biosynthese a opracování proteoglykanu. 12
GlcA(1-3)GlcNAc(1-4) OH
COO *
IdoA(1-3)GalNAc(1-4) O3 SO OH O O O O n* * HO NHAc -OH COO dermatan-sulfát
O O HO O O n* NHAc OH hyaluronová kyselina
HO
OR
O HO
*
IdoA(1-4)GlcNAc(1-4) heparin (R = H) a heparin-sulfát (R = SO3-)
O
O HO OR COO
HN SO3- O
n
*
Obr. 14 Opakující se disacharidová jednotka některých mukopolysacharidů
Peptidoglykan Je základním polymerem buněčných stěn gramnegativních i grampozitivních bakterií a dříve se označoval jako GlcNAc
NHAc HO O
O
O
OH H3C
OH O O O
NHAc
O NHAc
HO O
O
OH H3C
Ala
murein. Jeho struktura má
MurNAc
tři
OH O O O
charakteristické
O NHAc
D-Ala
Xaa
D-Ala
D-Ala
Xaa
D-Ala
D-Glu
Ala
O
pentapeptidový
pobočný
D-Glu
D-Ala
řetězec a mezipeptidové
Xaa
D-Ala
můstky
D-Ala
Xaa
D-Ala
D-Glu
Všechny
15).
peptidoglykany
vázaný CH3
O
(Obr.
obsahují střídavě (1-4)-
Ala CH3
O
složky:
polysacharidovou matrici,
Ala
D-Glu
základní
O
N-
acetylglukosamin
a
N-
acetylmuramovou kyselinu (MurNAc) a to
Obr. 15 Struktura peptidoglykanu grampozitivních a gramnegativních bakterií
v počtu 5 – 45 jednotek.
Struktura pentapeptidu je částečně proměnlivá, má obecnou sekvenci Ala--D-Glu-Xaa-D-Ala-DAla, kde Xaa je Lys pro grampozitivní nebo meso-diaminopimelová kyselina pro gramnegativní bakterie.
13
Biologická role sacharidů v glykoproteinech Asi je příhodné si znovu zopakovat, že žádná unifikovaná funkce sacharidů navázaných na proteiny a peptidy není. Naopak mají řadu rozmanitých úkolů, z nichž některé jistě ani nejsou ještě známy.
Vysoký obsah sacharidů v některých proteinech modeluje jejich fyzikálně-chemické vlastnosti. Sialylace a sulfatace glykanů zvyšuje
HO
OH O
HO O
HO OH
rozpustnost proteinů ve vodě. Proteoglykany se
OH O
nacházejí v hlenovitých sekretech epitheliálních buněk; chrání jejich povrch tím, že zadržují vodu
AcNH O
a fungují jako lubrikanty. V mimobuněčném
Thr
prostoru způsobují elesticitu a zlepšují adhezi
Ala
buněk. Krásným příkladem změn fyzikálních
Ala n
vlastností
Obr. 16 Struktura protimrazového proteinu
jsou
protimrazové
glykoproteiny
antarktických ryb, které žijí stále ve vodě s teplotou 0 oC (Obr. 16). Ukázalo se, že tento
glykoprotein způsobuje změnu tvaru ledových krystalků, které se vylučují jako malé drobné jehličky.
Mají ochrannou a stabilizační funkci, dodávají proteinům vyšší tepelnou stabilitu.
V současné době se poněkud pochybuje o významu glykanů jako ochranné vrstvičce proti rozpoznáváním proteasami nebo antibody. Mohou modulovat biologickou aktivitu a řada glykosylovaných enzymů je aktivnější. Mohou mít vliv i na sekundární strukturu peptidů.
Nejdůležitější funkcí je jejich účast v řadě fyziologických a pathologických procesů, kde
slouží jako rozpoznávací markery. Tak se účastní adheze infekčních buněk na buňku hostitelskou, zrání a směrování leukocytů, interakcí imunitního systému nebo tvorby a diferenciace rakovinných buněk a jejich metastáz a dalších životně důležitých pochodů. Porozumění tomu, jakými mechanismy sacharidy při těchto dějích vystupují, je velice důležité, protože rozpoznávání je vždy první fázi onemocnění a cíleně zasáhnout v tomto okamžiku je samozřejmě žádoucí. Obecně hledání inhibitorů tohoto děje sleduje dva základní motivy: aktivitu proti biosynthese glykokonjugátů a nebo interferenci s glykokonjugáty v procesu rozpoznávání. Přes obrovské úsilí vědců jsou zatím pokroky v hledání léčiv a vakcín na bázi sacharidů poněkud problematické. Důvodů je několik. Prozatím chybí metodika porovnatelná se synthesou peptidů na pevném nosiči, modifikace polyfunkčních molekul jsou vždy obtížné a drahé a sacharidy obecně mají dosti nevhodné vlastnosti pro použití jako léčiva: jejich afinita k proteinům je nízká a podávané orálně jsou inaktivní, protože jsou hydrolyzovány snadno enzymy in vivo. Mohou být proto podávány pouze injekčně pro léčbu akutních symptomů, ale i tak mohou podléhat 14
ataku glykosidas např. v séru. Afinitu k proteinům zvyšují do jisté míry polyfunkční interakce. Z uvedených důvodů je často výhodné nahradit sacharidy látkami, které napodobují jejich strukturu a funkci v procesu rozpoznávání, ale které mají lepší stabilitu, specificitu, afinitu a synthetickou dostupnost (viz dále). Porozumění procesu rozpoznávání a definování role sacharidů je proto velice důležité. Protože se na rozluštění sacharidového kódu účastní proteiny pomocí nevazebných interakcí, je přirozeně studium těchto interakcí sacharidů s proteiny prvním nezbytným krokem. Výjimečné místo patří v tomto směru interakcím s lektiny. 5. Interakce sacharidových epitopů s lektiny Lektiny jsou proteiny, které vážou mono- a oligosacharidy reverzibilně a s vysokou specifitou, ale současně nevykazují žádnou katalytickou aktivitu a narozdíl od antibodů nejsou ani produktem imunitní reakce organismu. Každý lektin obsahuje typicky dvě nebo více domén rozpoznávající sacharidy (tzv. carbohydrate recognition domain, CRD), jinými slovy jsou di- až polyvalentní. Proto také, když reagují s buňkami, např. erythrocyty, nejenže vážou sacharidy na jejich povrchu, ale vyvolávají i zesíťování buněk a jejich následné srážení, které se nazývá aglutinace. Tato vlastnost je charakteristická a základní pro všechny lektiny. Lektiny mohou stejným způsobem srážet polysacharidy nebo proteiny. Oba děje, aglutinace a srážení, jsou inhibovány sacharidovými ligandy, pro které jsou lektiny specifické. Lektiny, resp. receptory lektinového typu, jsou ve všech organismech, od virů a bakterií přes rostliny až k živočichům a savcům. Tvoří heterogenní skupinu oligomerních proteinů, které se liší velikostí, strukturou i stereochemií svých CRD domén, ale lze vystopovat jisté podobnosti v sekvencích aminokyselin. Lektiny byly poprvé isolovány z rostlin, a to v roce 1919 z fazolí a dnes známe v luštěninách již více než 100 zástupců. Velice známý a klasický je konkavalin A z Canavalia ensiformis nebo toxin ricin z Ricinus communis. Je prakticky neuvěřitelné, že role lektinů v rostlinách je dodnes prakticky neznámá. Základními metodikami studia interakcí sacharidů s lektiny jsou NMR-spektrometrie, krystalografie, hmotnostní spektrometrie, mikrokalorimetrie, počítačová chemie a zcela nová metodika surface plasmon resonance. V dalším textu bude uveden základní přehled o lektinech z hlediska jejich specifity k sacharidovým epitopům a funkce v živém organismu. Lektiny se formálně člení na jednoduché a mozaikové. Jednoduché mají molekulovou hmotnost pod 40 kDa a vedle CRD mohou obsahovat další domény. Patří sem všechny rostlinné a z živočišných lektinů jen galektiny (dříve zvané S-lektiny). Mozaikové lektiny obsahují několik druhů vazebných míst, z nichž jenom jedno má vlastnosti SRD. Patří sem virové hemoaglutininy na jedné straně a živočišné C-, P- a Ilektiny na straně druhé.
15
Galektiny Tato rodina lektinů specifická pro -D-galaktosidy se obvykle nachází uvnitř buňky v cytoplasmě a buněčném jádru, někdy ale jsou přítomny i na buněčném povrchu a v extracelulárním prostoru. Galektiny mají afinitu i vůči -D-glukosidům a laktose. Předpokládá se, že mají rozhodující roli při normálním rozvoji a dělení buněk. Zvýšená koncentrace galektinu-3 přítomného na povrchu rakovinných buněk může být odpovědná za adhezi těchto buněk v cílových orgánech, kroku nezbytném pro tvorbu metastáz. Inhibitory tohoto procesu mohou mít účinky protimetastázové. Byly objeveny i protilátky proti galalektinům; např. sérum pacientů s Hodgkinsovým sarkomem obsahovalo v 50 % případů protilátku proti galektinu-9, zatímco sérum zdravých osob či osob postižených jiným nádorovým onemocněním žádné takové protilátky neobsahovalo. Zdá se, že se otevírají nové therapeutické a diagnostické cesty i pro galektiny. C-Lektiny Tato rodina lektinů vyžaduje pro interakci se sacharidy přítomnost vápenatého kationtu. Dělí se na několik dalších podskupin. Endocytické lektiny jsou receptory vázané v buněčné membráně např. v játrech, a mají různou specifitu (Gal, GalNAc, Man, Fuc). V tradičním pojetí se považovaly za regulátory sérových glykoproteinů, ale dnes je jisté, že jejich funkce je mnohem komplexnější. Např. povrch makrofágů obsahuje lektinový receptor specifický pro D-mannosu a na něj se váže na Dmannosu bohatý glykan z povrchu bakterie, kterou makrofág usmrtí tzv. lektinofagocytosou. Tento typ obrany, která není závislá na tvorbě protilátek, je znám jako součást vrozené imunity. Selektiny zprostředkovávají adhezi cirkulujících leukocytů na výstelku cévních stěn, což je první krok pro přenos leukocytů z cirkulačního systému a pro jejich další migraci do tkáně. Rozpoznávacím epitopem je terminální tetrasacharid, sialyl-LewisX (sLex). L-selektin je pověstný jako naváděcí receptor, je přítomen na všech leukocytech a zabezpečuje recirkulaci lymfocytů tím, že je směruje do obvodových lymfatických uzlin. E- a P-selektiny jsou vytvářeny na povrchu výstelky cévních stěn jen tehdy, jsou-li tyto buňky aktivovány mediátory (např. interleukin-2) uvolňovanými ze tkáně jako odpověď na poranění, ischémii nebo infekci. Afinita sLex je k různým selektinům různá, jak vyjadřují následující disociační konstanty (mM): Eselektin, 0,7; P-selektin, 8; L-selektin, 4. P-Lektiny Tyto lektiny jsou specifické pro rozpoznávání
D-mannosa-6-fosfátu
a slouží pro
nasměrování lysosomálních enzymů na místo určení. Pokud nemá enzym tento sacharidový epitop, pak není P-lektiny rozpoznán a je vyloučen do mimobuněčného prostoru.
16
I-Lektiny Rodina I-lektinů je poměrně úzká a rozpoznává sialovou kyselinu při nejrůznějších interakcích buněk. Sialoadhesin a lektin CD22 jsou součástí imunitního systému. Jiné lektiny V poslední době byl objeveno několik intracelulárních lektinů, které se účastní biosynthesy glykoproteinů, jejich roztřídění a transportu na povrch buňky. Z nich lektin zvaný kalnexin je v endoplasmatickém retikulu, kde se váže na terminální D-glukosu nově tvořeného glykoproteinu a kontroluje tak správnost sestavení glykanu. Jeho úlohou je být jakousi gardedámou glykoproteinu. Příklady interakce sacharidů s lektiny Interakce sacharidů s lektiny řídí například adhezi virů a bakterií při infekcích. Zajímavým příkladem je úloha lektinu (někdy se tento typ nazývá obecně adhesiny) baktérie Escherechia coli K99. Tento organismus se váže na glykolipid nesoucí N-glykolylneuraminovou kyselinu. Zatímco střevní stěna nově narozených selátek obsahuje glykolipid s navázanou Nglykolylneuraminovou kyselinou a je pro ně tato infekce často smrtelná, dospělá prasata už tento sacharidový epitop nemají, a tudíž neonemocní. Patogenní baktérie Helicobacter pylori, která způsobuje u člověka gastroduodenální vředy a pravděpodobně i rakovinu žaludku, rozpoznává na hostitelské buňce celou řadu sacharidů včetně 3´-sialyllaktosy a oligosacharidu Lewis b. Nedávno bylo prokázáno v klinickém testu, že orální podání NeuNAc(2-3)laktosy pacientům postiženým masivní infekcí touto bakterií, vyvolalo výrazný pokles počtu kolonií baktérie v trávicím traktu. Dalším příkladem specificky druhové interakce sacharidového epitopu s receptorem lektinového typu je oplodnění vajíčka savců, tedy i člověka. Ovšem než oplodnění nastane, probíhají i jiné interakce. Spermie, která se ocitne v samičím reprodukčním ústrojí, je nejprve pomocí adhezinů přichycena na epitel např. vejcovodu,
čímž
se
spustí
kaskáda
dějů
nazvaných kapacitace. Dochází k redistribuci membránových proteinů, snižuje se obsah cholesterolu v membráně, vytváří se vazebná lektinová doména a aktivuje se motilita spermie. Vajíčko má na svém extracelulárním povrchu Obr. 17 Interakce vajíčka a spermie
vrstvu glykoproteinů obsahující O- i N-glykany zvanou zóna pelucida (ZP), která představuje
primární vazebné místo pro spermii, po navázání iniciuje děj zvaný akrosomální a posléze zabrání jiné spermii se na vajíčko zachytit. Hlavní složkou ZP jsou tři glykoproteiny označované 17
jako ZP-1, ZP-2 a ZP-3, z nichž ten poslední odpovídá se druhovou specifitu interakce. Po interakci jeho O-glykanového epitopu na lektinový receptor spermie za účasti sekundárního vazebného místa dojde k uvolnění vápenatých kationtů, které následně spustí akrosomální děj ve spermii (Obr. 17). Tento děj umožňuje spermii proniknout ZP a následně i membránou vajíčka. 6. Taktika hledání analogů sacharidových epitopů Jak už bylo naznačeno v kapitole 4, komplexní sacharidy nemusejí být až tak ideálními kandidáty pro vývoj nových léčiv, proto hledání jejich mimetik, která budou stabilnější, aktivnější a strukturně jednodušší, je atraktivní předmět současného výzkumu. Obecně lze taktiku jejich hledání rozdělit do několika základních kroků:
definování struktury přirozeného sacharidového epitopu a identifikace příslušného proteinu,
studium orientace sacharidu ve vazebné doméně proteinu,
definování základních strukturních znaků sacharidu nezbytných pro jeho přirozenou biologickou funkci,
synthesa analogu a ověření jeho afinity k vazebnému místu proteinu. Často studovaným případem pro therapeutickou intervenci je interakce oligosacharidu
sialyl-Lex (sLex, Obr. 18) s E-selektinem a lze na něm dobře demonstrovat zásady uvedené výše. Interakce nastává hned zpočátku reakce organismu na poškození a představuje jeden z iniciačních kroků tvorby a směrování bílých krvinek, jehož sacharidovým epitopem je právě sLex. Chyba v tvorbě a nadprodukce leukocytů mohou mít pro organismus fatální následky. Mnohá zánětlivá onemocnění a to jak akutní (septický šok) tak chronická (asthma, arthritida) by
OH OH H3C Gal HOOC HO
OH
OH O
O
O
OH HO NeuAc OH AcNH
OH
mohla být léčena antagonisty této
Fuc
interakce. Dalším polem působnosti je chemotherapie
OH
O
nádorových
onemocnění, protože je známo, že právě
O
NHAc tato interakce je odpovědná za vysokou OH tendenci některých tumorů vytvářet O
O OH
GlcNAc
Obr. 18 Struktura oligosacharidu sLex
metastáze.
Na
základě
známé
konformace sLex vázané na E- a Pselektiny odvozené z NMR měření doplněné výsledky krystalografických studií lektinových vazebných domén
byly definovány důležité funkční skupiny v molekule, které jsou nezbytné pro vznik vazby na lektiny. Pro rozpoznání E-selektinem jsou rozhodující všechny tři hydroxylové skupiny na L18
fukose, z nichž ty v poloze C-3 a C-4 koordinují vápenatý kation stejným způsobem jako Dmannosa v doméně proteinů vázajících D-mannosu. Skutečně náhrada L-fukosy za D-mannosu nevede v tomto případě ke ztrátě vazebných schopností. Stejně důležitá je přítomnost volných hydroxylových skupin v poloze C-4 a C-6 D-galaktosy a karboxylová skupina sialové kyseliny. Molekula GlcNAc nepřispívá k interakcím žádnou svojí funkční skupinou a může být principiálně nahrazena řadou bifunkčních spojovacích členů. Strana B
D-galaktosy
i sialové
kyseliny jsou pravděpodobně v kontaktu s nepolárními plochami vazebné domény E-selektinu a skutečně částečné nahrazení sacharidů aromatickými či jinými hydrofóbními jednotkami vedlo ke zvýšení afinity k E-selektinu. Takovým způsobem byly připraveny antagonisté sLex s velice dobrou aktivitou k E-selektinu (Obr. 19). OH OH O 10x
O
Aktivita sLex = 1 OH OH HO
H 3C -OOC
O
OH OH O OH N
OOC ( ) O 3
CH3 OH OH O
OH OH O -OOC O O OH
5x
OH
-
O
CONH
COOEt
O
BnO
O 1,1x
OH OH O OH HO -
OH
OOC
10x
OH OH
OH OH O
OOC ( ) CONH 3
CON
OH 20x CONH(CH2)13CH3
Obr. 19 Analogy sLex a jejich relativní aktivity vůči E-selektinu
Jiným a rovněž velmi účinným přístupem k novým perspektivním strukturám je napodobovat polyvalentní charakter leukocytů tím, že se buď sLex nebo odvozená struktura zabuduje do liposomů nebo lineárních polymerů. Hlavně liposomy jsou v centru pozornosti díky své schopnosti doručit léčebné agens cíleně přímo do tkáně. Látky těchto (Obr. 20) a podobných struktur mají více než stonásobně vyšší afinitu k E-selektinu než má sLex, a proto jsou velice perspektivní skupinou potenciálních farmak. Jejich nevýhodou je samozřejmě v tomto okamžiku cena, ale i to, že často působí nespecificky.
19
OH HOOC HO
O
OH HO OH AcNH
O
OH O OH
OO
O OH OH O
spojka
OH O NH
OH
O
O
OH O OH
spojka
H N( O
S
OH
)
42-48
O O P O -O
OC17H35 OC17H35
O O
O O
OEt
N H
Obr. 20 Polyvalentní analog sLex
7. Závěr Přehled glykokonjugátů a příklady v tomto textu uváděné jsou jen letmým pohledem na obsáhlou a neustále se vyvíjející oblast bádání a naznačují pouze směry, kterými se vývoj ubírá. Každá kapitola by si zasloužila samostatné pojednání a dokonce jsou témata, o kterých není ani zmínka, jako např. glykosidová antibiotika. Glykobiologie je bezesporu dnes vědním oborem na výsluní zájmu a nejlepším dokladem toho, jak je užitečné učit se od moudré matky přírody. 8. Seznam použité literatury 1. Bertozzi C. R., Kiessling L. L.: Chemical Glycobiology. Science 2001, 291, 2357-2363. 2. Danishefsky S. J., Allen J. R.: From the Laboratory to the Clinic: A Retrospective on Fully Synthetic Carbohydrate-Based Anticancer Vaccines. Angew. Chem. Int. Ed., 2000, 39, 836863. 3. Davis A. P., Wareham R. S.: Carbohydrate Recognition through Noncovalent Interactions: A Challenge for Biomimetic and Supramolecular Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed., 1999, 38, 2978-2996. 4. Fulton D. A., Stoddart J. F.: Neoglycoconjugates Based on Cyclodextrins and Calixarenes. Bioconjugate Chemistry 2001, 12, 655-672. 5. Gabius H.-J.: Glycohistochemistry: The Why and How of Detection and Localization of Endogenous Lectins. Anat. Histol. Embryol., 2001, 30, 3-31. 6. Kolter T., Sandhoff K.: Sphingolipids-Their Metabolic Pathway and the Pathobiochemistry of Neurodegenerative Diseases. Angew. Chem. Int. Ed., 1999, 38, 1532-1568. 7. Leffler H.: Introduction to Galectins, Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 1997, 9, 9-19.
20
8. Lis H., Sharon N.: Lectins: Carbohydrate-Specific Proteins That Mediate Cellular Recognition. Chem. Rev., 1998, 98, 637-674. 9. Ritter T. K., Wong C.-H.: Carbohydrate-Based Antibiotics: A New Approach to Tackling the Problem of Resistance. Angew. Chem. Int. Ed., 2001, 40, 3508-3533. 10. Wassarman P. M., Jovine L., Litscher E. S.: A Profile of Fertilization in Mammals. Nat. Cell Biology, 2001, 3, E59-E64. 11. Wassarman P.M., Litscher E. S.: Towards the Molecular Basis of Sperm and Egg Interaction during Mammalian Fertilization. Cells Tissues Organs, 2001, 168, 36-45. 12. Wong C.-H., Sears P.: Carbohydrate Mimetics: A New Strategy for Tackling the Problem of Carbohydrate-Mediated Biological Recognition. Angew. Chem. Int. Ed., 1999, 38, 23002324. 13. Wong C.-H., Sears P.: Intervention of Carbohydrate Recognition by Proteins and Nucleic Acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 12086-12093. 14. Zara J., Naz R. K.: The Role of Carbohydrate in Mammalian Sperm-Egg Interactions: How Important Are Carbohydrate Epitopes? Frontiers in Bioscience, 1998, 3, 1028-1038.
21
