Růst a vývoj rostlin - praktikum MB130C78 Blok 3
Role aktinového cytoskeletu v morfogenezi rostlinných buněk - analýza fenotypu
Úlohy: 1. Kvantifikace počtu zkroucených a správně tvarovaných trichomů u prvních pravých listů jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka komplexu Arp2/3) a formin FH1. 2. Stanovení permeability povrchu listů pomocí barvení rutheniovou červení u jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka komplexu Arp2/3) a formin FH1. 3. Stanovení délek hlavního kořene a hypokotylu u jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka komplexu Arp2/3) a formin FH1. 4. Analýza a porovnání fenotypů jednoduchých a dvojitých mutantů z úloh 1.-3. Tvorba vlastní hypotézy o rolích jednotlivých aktinových nukleátorů v rostlině.
Čím je ovlivňována morfogeneze u rostlin? Vnější a vnitřní faktory Mezi vnitřní faktory ovlivňující morfogenezi rostlin patří: • • • • • • •
směrované buněčné dělení směrovaný buněčný růst signalizace fytohormony reorganizace buněčných stěn turgor vakuolárního systému směrovaný endomembránový transport reorganizace cytoskeletu
Morfogeneze rostlinných orgánů Příklady změněné morfogeneze listu u mutací v transkripčních faktorech z rodin YABBY a KNOX
(Chan Man Ha et al., 2010)
Morfogeneze rostlinných orgánů Příklady změněné morfogeneze kořene reagujících na rostlinné hormony v médiu a změnu světelných podmínek růstu
Kořeny rostoucí na světle
Kořeny rostoucí ve tmě
Příklady změněné morfogeneze kořenového systému u mutací v proteinech spojených s nukleací aktinového cytoskeletu
WT
arp3
Benito lab http://www.cbgp.upm.es/lateral_root.php
Morfogeneze rostlinných buněk Difúzní a vrcholový tip růstu buněk
(Guerroero et al., 2015)
Morfogeneze trichomů Dobře studovatelné buňky listové pokožky na kterých je popisována buněčná morfogeneze
Mutanti (A) etr2-3 (B) gl3 (C) etr2-3 gl3 (D) spy-5 (E) etr2-3 spy-5 (F) gl2 (G) etr2-3 gl2 (H) fas1 (I) etr2-3 fas1 (J) try (K) try etr2-3 (L) try fas1-1
(Plett et al., 2009)
Cytoskelet v rostlinné buňce Rostlinný cytoskelet je tvořen vysoce dynamickou trojrozměrnou sítí proteinů, která je základní složkou všech eukaryotických buněk a u rostlin sestává se vzájemně propojených sítí mikrotubulů a aktinových filament.
light-sheet mikroskopie – pokožkové buňky děložního listu A.t
mikrotubulární cytoskelet -TUA5-mCherry
aktinový cytoskelet - FABD2-GFP
spojení obrázků - porovnání
(Ovečka et al., 2015)
Role cytoskeletu v morfogenezi buněk
(Mathur a Hulskamp 2002)
Role cytoskeletu v morfogenezi pokožkových buněk listu mikrotubuly
aktin
(Panteris et al., 2005)
Role cytoskeletu v morfogenezi trichomů
aktinová síť v trichomu
(Hulskamp 2004)
(Mathur a Hulskamp 2002)
Role cytoskeletu v prodlužování kořene a hypokotylu Aktinový cytoskelet v elongujících buňkách kořene A.t. (Reusche, M., Teichmann/Friml lab)
Buňky hypokotylu rostoucího ve tmě s označeným cytoskeletem (Sampathkumar et al., 2011)
aktin
mikrotubuly
merged
Aktinový cytoskelet (zeleně) v elongujících buňkách hypokotylu A.t. (Daher, FB, Sainsbury lab), buněčné stěny označeny PI (červeně).
Nukleace aktinového cytoskeletu
Rostliny mají 2 nukleátory aktinu:
Arp2/3 komplex a forminy
Nukleace aktinu ARP2/3 komplexem ARP2/3 komplex tvoří sedm podjednotek (ARP2, ARP3 A ARPC1-ARPC5) Komplex ARP2/3 rozvětvuje síť stávajících aktinových filament
Actin Filament Initiation: Arp2/3 complex. Manual of Cellular and Molecular Function, The National University of Singapore, Republic of Singapore, 2009. Illustrators: Pham Thi Phuong Thao a Theng Tze Yin Meryl
Nukleace aktinu forminy Forminy nukleující aktin tvoří dimery a katalyzují vznik přímých (nevětvících se) aktinových vláken
(Gould et al., 2011)
Actin filaments: Formin-mediated nucleation. Manual of Cellular and Molecular Function, The National University of Singapore, Republic of Singapore, 2009 Illustrator: Theng Tze Yin Meryl.
Nuklelátory aktinu v živočišné buňce Mutace ve forminech či u podjednotek ARP2/3 komplexu je ve většině případech pro živočišné buňky letální. (Shrnuto v: Pollard 2007)
Porovnání nukleace aktinových filament pomocí ARP2/3 komplexu a forminů
V živočišných buňkách je 10x méně forminů než Arp2/3 komplexu. Profilin - váže se na globulární aktin, reguluje rovnováhu nukleátorů aktinu upřednostňováním forminů před Arp2/3 komplexem při nukleaci nových aktinových vláken.
(Suarez et al., 2014)
Rostliny mutantní ve forminech souhrn fenotypů Forminy se u různých organismů účastní polarizovaného buněčného růstu a sekrece (Cvrčková 2012). U rostlin jsou proto často cílem výzkumu forminů kořenové vlásky, pylové láčky, epidermální buňky a trichomy. Nadprodukce forminu 1 způsobuje deformace při růstu pylové láčky tabáku. Vzhledem k velikosti rodiny proteinů s formin-like sekvencí, která je rozmanitější než u živočišných buněk, byla zatím fenotypicky charakterizována jen malá část forminů.
Pokožkové buňky děložních listů u mutanta ve forminu 1 mají prohloubenou laločnatost buněk (Rosero et al., 2016)
Rostliny mutantní v Arp2/3 komplexu souhrn fenotypů Obecně se fenotypové projevy při mutacích v genech pro podjednotky ARP2/3 komplexu týkají především těch buněk a pletiv, které mají komplexnější tvary (trichomy, buňky epidermis) a jejichž morfogeneze a růst tedy vyžadují dobrou koordinaci vnitrobuněčných procesů a modelování a růst buněčné stěny (Shrnuto v Mathur et al., 2005) WT
arpc4
Pokožkové buňky děložního listu se značeným aktinem (FABD2GFP) mají méně výraznou laločnatost.
(Mathur et al., 2005)
PRAKTIKUM - ÚLOHY
Úlohy: 1. Kvantifikace počtu zkroucených a správně tvarovaných trichomů u prvních pravých listů jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka komplexu Arp2/3) a formin FH1. 2. Stanovení permeability povrchu listů pomocí barvení rutheniovou červení u jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka komplexu Arp2/3) a formin FH1. 3. Stanovení délek hlavního kořene a hypokotylu u jednoduchých a dvojitých mutantů Arabidopsis thaliana s nefunkčními geny pro nukleátory aktinu ARPC5 (podjednotka komplexu Arp2/3) a formin FH1. 4. Analýza a porovnání fenotypů jednoduchých a dvojitých mutantů z úloh 1.-3. Tvorba vlastní hypotézy o rolích jednotlivých aktinových nukleátorů v rostlině.
ÚLOHA 1 fenotyp zkroucených trichomů
ÚLOHA 2 fenotyp permeability listu
ÚLOHA 3 fenotyp délky kořene a hypokotylu
ÚLOHA 4 Tvorba vlastní hypotézy o rolích jednotlivých aktinových nukleátorů v rostlině Projev mutace Průměrný počet trichomů na list (číslo) Zkroucené trichomy (ano/ne) Permeabilita listů (ano/ne) Průměrná délka hypokotylu (číslo) Průměrná délka kořene (číslo) Tab. 1: Příklad tabulky fenotypů.
wt
arpc5
fh1-1
fh1-1/arpc5
