MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE
Rozklad biomasy hub v lesní půdě a identifikace struktury a funkce společenstva rozkladačů Diplomová práce
Monika Nováková
Vedoucí diplomové práce: RNDr. Petr Baldrian, Ph.D.
Brno 2013
Bibliografický záznam Autor:
Bc. Monika Nováková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie a molekulární biotechnologie
Název práce:
Rozklad biomasy hub v lesní půdě a identifikace struktury a funkce společenstva rozkladačů
Studijní program:
Experimentální biologie
Studijní obor:
Speciální biologie, směr Mikrobiologie a molekulární biotechnologie
Vedoucí práce:
RNDr. Petr Baldrian, Ph.D.
Akademický rok:
2012/2013
Počet stran:
129
Klíčová slova:
Rozklad, houby, bakterie, společenstva, diverzita, půdní organická hmota, opadová vrstva, organický horizont, 454pyrosekvenace
Bibliographic Entry Author:
Bc. Monika Nováková Faculty of Science, Masaryk University Institute of experimental biology, Department of microbiology and Molecular Biology
Title of Thesis:
Decomposition of fungal biomass in the forest soil and the identification of the structure and function of decomposer community
Degree Programme:
Experimental Biology
Field of Study:
Special Biology, Microbiology and Molecular Biotechnology
Supervisor:
RNDr. Petr Baldrian, Ph.D.
Academic Year:
2012/2013
Number of Pages:
129
Keywords:
Decomposition, fungi, bacteria, community, diversity, soil organic
matter,
pyrosequencing
litter
layer,
organic
horizon,
454-
Abstrakt Houby hrají důležitou roli v lesním ekosystému. Nejen že jsou hlavními rozkladači obtížně rozložitelného organického materiálu v půdě a důležitými symbionty lesních dřevin, ale také svým množstvím významně přispívají do tvorby půdní organické hmoty. Půdní organická hmota představuje největší zásobárnu uhlíku v terestriálních ekosystémech a její dekompozice je jedním z klíčových faktorů, ovlivňujících koloběh živin v celém ekosystému. O rozkladu mycelií hub in situ máme zatím pouze málo informací, stejně tak jako o mikroorganismech, které se tohoto rozkladu účastní. Tato práce je zaměřena na komplexní popis rozkladu biomasy hub v půdě listnatého lesa a identifikaci struktury a funkce mikrobiálních rozkladačů. Práce se skládá ze dvou experimentů, které byly vyhodnoceny pomocí klasických i nejnovějších molekulárně-biologických metod. V prvním experimentu byl stanoven úbytek suché hmotnosti biomasy dvou druhů hub během osmitýdenní inkubace v půdě. Byly pozorovány chemické změny mycelií během rozkladu, enzymová aktivita na myceliu a v okolní půdě a rozdíly ve složení mikrobiálních společenstev na myceliích a v okolní půdě. Druhý experiment byl zaměřen především na detailní taxonomickou a funkční charakteristiku bakteriálního společenstva při rozkladu mycelia druhu Tylopilus felleus ve dvou půdních vrstvách během jednadvacetitýdenní inkubace v půdě. Rozklad houbových mycelií probíhal v porovnání s jinými organickými materiály (například listovým opadem) velmi rychle. Rozklad mycelií pod opadovou vrstvou byl pomalejší než pod organickým horizontem. Poměr C/N byl na myceliích nižší ve srovnání s půdou. Rozklad houbové biomasy byl provázen vysokou aktivitou extracelulárních enzymů. Složení mikrobiálního společenstva mycelií bylo rozdílné od složení společenstva v okolní půdě. Během celého experimentu byl na myceliích přítomen vysoký počet bakterií. Kultivací a následnou sekvenací bakteriálních izolátů byly identifikovány bakterie, kolonizující rozkládající se mycelia. Nejčastějším izolátem byl rod Pseudomonas. U některých izolátů byla stanovena jejich chitinázová aktivita. Největší chitinázovu aktivitu měl rod Renibacterium. 454-pyrosekvenací byly identifikovány nejčastější rody a kmeny bakterií v organickém horizontu půdy, opadu a na rozkládajících se myceliích. Sledována byla také sukcese bakterií na myceliích během rozkladu. V organickém horizontu byl nejčastěji přítomen rod Telmatobacter, v opadu rod Mucilaginibacter a na rozkládajících se myceliích rod Pedobacter. Zástupci kmene Acidobacteria byly nejhojnější v organickém horizontu, v opadu dominoval kmen Bacteroidetes. Na rozkládajících se myceliích byly nejpočetnější skupinou zástupci kmene Bacteroidetes a třídy Gammaproteobacteria, kteří tvořili 86 % z celkového množství bakterií. V organickém horizontu byla stanovena vyšší diverzita bakterií než v opadu a na myceliu. Sukcesní změny ve složení a četnosti bakteriálních rodů a kmenů probíhaly v průběhu celého procesu rozkladu mycelií.
Abstract Fungi play an important role in the forest ecosystem. They are not only the main decomposers of recalcitrant organic material in soil and important symbionts of trees, but they also significantly contribute to the formation of the soil organic matter. Soil organic matter represents the largest pool of organic carbon in terrestrial ecosystems and its degradation is one of the key factors influencing nutrient cycling in the whole ecosystem. We have still only little information about the decomposition of fungal mycelia in situ or about microorganisms which participate in this process. This thesis is focused on the comprehensive description of the decomposition of the fungal biomass in the deciduous forest soil and the identification of the structure and function of decomposer community. The thesis consist of two experiments which were evaluated using both classical and molecular-biological methods. In the first experiment, the loss of dry mass of the biomass of two fungal species during eight-week incubation in the soil was determined. Chemical properties, enzymatic activities and differences in the composition of microbial communities in mycelia and surrounding soil were observed. The second experiment was mainly focused on detailed taxonomic and functional characterization of bacterial communities during decomposition of Tylopilus felleus in two soil horizons during twenty-one-week incubation in the soil. The decomposition of fungal mycelia was much faster compared to other organic materials (such as leaf litter). The decomposition of mycelia under litter was slower than under soil organic horizon. C/N ratio was low and it continued to decrease during the experiment. The decomposition was accompanied by high activities of extracellular enzymes. Microbial community composition in mycelium differed from the soil and litter. High bacterial numbers were associated with decomposing fungal mycelia during the whole experiment. Cultivation and subsequent sequencing of the bacterial isolates identified bacteria colonizing decomposing mycelia. The genus Pseudomonas was the most common isolate. Chitinase activity was determined for some isolates. Among them, the genus Renibacter had the highest chitinase activity. 454-pyrosequencing identified the most common bacterial taxa in the soil organic horizon, litter and in mycelia. The succession of bacteria was observed during the whole process of decomposition of fungal mycelia. Telmatobacter was the most common genus in the soil organic horizon, Mucilaginibacter in the litter and Pedobacter in the decaying mycelia. The phylum Acidobacteria was the most abundant in the soil organic horizon, the phylum Bacteroidetes dominated in the litter. The phylum Bacteroidetes and the class Gammaproteobacteria were the most common in decaying mycelia, where they represented 86 % of the community. Higher bacterial diversity was determined in the soil organic horizon and in the litter than on decomposing mycelia. Succession changes took place during the whole decomposition process.
Poděkování Především bych chtěla poděkovat svému školiteli RNDr. Petru Baldrianovi, Ph.d., za odborné vedení, cenné rady a pomoc při vypracování mé diplomové práce. Velké poděkování patří také RNDr. Vendule Brabcové, Ph.d. za pomoc a možnost podílet se na jejím projektu. Dále bych poděkovala Mgr. Anně Davidové za pomoc při práci v laboratoři a všem členům Laboratoře enviromentální mikrobiologie za ochotu kdykoliv pomoci.
Tato diplomová práce vznikla s podporou Grantové agentury České repuliky (projekt č. P504/12/P107).
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 20. září 2013
….............................. jméno příjmení
Obsah Seznam zkratek ....................................................................................................................... 4 1 Úvod .................................................................................................................................... 6 2 Literární přehled .................................................................................................................. 8 2.1 Houby v lesní půdě ....................................................................................................... 8 2.2 Dekompozice v lesní půdě............................................................................................ 9 2.2.1 Dekompozice půdní organické hmoty ................................................................. 10 2.2.2 Dekompozice houbového mycelia....................................................................... 11 2.3 Bakterie v lesní půdě .................................................................................................. 15 2.3.1 Bakterie na opadu ................................................................................................ 17 2.3.2 Bakterie v půdě .................................................................................................... 18 2.4 Bakteriální dekompozice ............................................................................................ 20 2.4.1 Jednoduché substráty: kořenové a houbové exsudáty ......................................... 21 2.4.2 Komplexní substráty: celulóza, lignin a chitin .................................................... 22 2.5 Bakterie asociované s houbami .................................................................................. 23 2.5.1 Ektomykorhizní koberce...................................................................................... 24 2.5.2 Pomocné bakterie ................................................................................................ 26 2.5.3 Bakterie na dřevě ................................................................................................. 28 2.6 Mykofágní bakterie..................................................................................................... 30 2.6.1 Extracelulární nekrotrofní bakterie ...................................................................... 32 2.6.2 Extracelulární biotrofní bakterie .......................................................................... 33 2.6.3 Endocelulární biotrofní bakterie .......................................................................... 33 2.7 Chitinolytické bakterie ............................................................................................... 35 2.7.1 Bakteriální chitinázy ............................................................................................ 36 2.7.2 Přehled chitinolytických bakterií ......................................................................... 37 3 Cíle práce ........................................................................................................................... 40 1
4 Materiál a metody .............................................................................................................. 41 4.1 Popis lokality a vzorkování ........................................................................................ 41 4.2 Kultivace bakterií ....................................................................................................... 42 4.3 Fyziologické a biochemické metody .......................................................................... 43 4.3.1 Stanovení úbytku substrátu a elementární analýza .............................................. 43 4.3.2 Stanovení enzymové aktivity............................................................................... 43 4.3.3 Stanovení chitinázové aktivity............................................................................. 45 4.4 Molekulární metody ................................................................................................... 45 4.4.1 Izolace DNA ........................................................................................................ 45 4.4.2 Terminální polymorfismus délky restrikčních fragmentů („Terminal restriction fragment length polymorphism“, T-RFLP) .................................................................. 47 4.4.3 Kvantitativní PCR (qPCR) .................................................................................. 48 4.4.4 Sekvenace bakteriálních izolátů .......................................................................... 50 4.4.5 454-pyrosekvenace bakterií ................................................................................. 51 4.4.6 Statistické vyhodnocení výsledků ....................................................................... 56 4.5 Speciální chemikálie ................................................................................................... 57 5 Výsledky ............................................................................................................................ 59 5.1 Xaverov 1 ................................................................................................................... 59 5.1.1 Rychlost rozkladu mycelia hub v půdě................................................................ 59 5.1.2 Elementární analýza prvkového složení .............................................................. 60 5.1.3 Enzymová aktivita ............................................................................................... 61 5.1.4 Analýza diverzity mikrobiálního společenstva .................................................... 64 5.2 Xaverov 2 ................................................................................................................... 65 5.2.1 Rychlost rozkladu mycelia hub v půdě................................................................ 65 5.2.2 Elementární analýza prvkového složení .............................................................. 66 5.2.3 Enzymová aktivita ............................................................................................... 67 5.2.4 Kvantifikace počtu bakterií ................................................................................. 69 5.2.5 Identifikace bakteriálních izolátů ........................................................................ 71 2
5.2.6 Chitinázová aktivita izolátů ................................................................................. 76 5.2.7 454-pyrosekvenace bakterií ................................................................................. 77 6 Diskuze .............................................................................................................................. 94 6.1 Xaverov 1 ................................................................................................................... 94 6.2 Xaverov 2 ................................................................................................................... 96 7 Závěr ................................................................................................................................ 101 8 Seznam použité literatury ................................................................................................ 103
3
Seznam zkratek ADP
Adenosindifosfát
AMC
7-amidomethyl-4-kumarin
AMCA
L-alanin-7-amido-4-methylkumarin
AMCL
L-leucin-7-amido-4-methylkumarin
AMP
Adenosinmonofosfát
ANOVA
Analysis of variance, analýza rozptylu
APS
Peroxydisulfát amonný
ATP
Adenosintrifosfát
BSA
Bovinní sérový albumin
CFU
Kolonie tvořící jednotky
CTAB
Cetyl trimethylamonium bromid
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Deoxyribonukleová kyselina
EDTA
2, 2, 2, 2-(ethan-1,2-diyldinitrylo)tetraoctová kyselina
HEPES
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonová kyselina
MUF
Methylumbellyferol
MUFaG
4-methylumbellyferyl-α-D-glukopyranosid
MUFC
4-methylumbellyferyl-N-celobiosid
MUFG
4-methylumbellyferyl-β-D-glukopyranosid
MUFL
4-methylumbellyferyl-β-D-galaktopyranosid
MUFM
4-methylumbellyferyl-β-D-manopyranosid
MUFN
4-methylumbellyferyl-N-acetylglukozaminid
MUFP
4-methylumbellyferyl-fosfát
MUFX
4-methylumbellyferyl-β-D-xylopyranosid
MUFY
4-methylumbellyferyl-β-D oktanoát
NCBI
National Center for Biotechnology Information
OTU
Operační taxonomická jednotka
PCR
Polymerázová řetězová reakce 4
rDNA
Ribosomální deoxyribonukleová kyselina
RNA
Ribonukleová kyselina
SDS
Dodecylsulfát sodný
TAE
Tris-acetát-EDTA
TE pufr
Tris-EDTA
Tris
2-amino-2-hydroxymethylpropan-1,3-diol
5
1 Úvod Lesní půda je domovem pro komplexní společenstvo organismů, jehož činnost ovlivňuje zásadním způsobem koloběh živin v ekosystému. Půdní organická hmota představuje největší zásobárnu uhlíku v terestriálních ekosystémech, přičemž největší podíl na jejím rozkladu mají mikroorganismy (Koide a Malcolm 2009). Uhlík, obsažený v půdní organické hmotě a opadu, je po rozkladu začleněn do mikrobiální biomasy (Miltner a kol. 2012). Bylo odhadnuto, že až 80% organického uhlíku v půdě je uloženo ve formě mikrobiální nekromasy (Liang a Balser 2011), z čehož největší část tvoří houbová mycelia (Six a kol. 2006). Houby tedy nehrají pouze roli hlavních rozkladačů organického materiálu v půdě, ale jsou také významným zdrojem živin pro jiné organismy. Rozkládající se houbové hyfy významně přispívají k tvorbě půdní organické hmoty a rychlost jejich dekompozice ovlivňuje koloběh uhlíku a jiných prvků v celém lesním ekosystému (Drigo a kol. 2012, Paul 2007). Rychlost rozkladu houbových mycelií ani faktory, které se na rozkladu podílí, nejsou ale stále dostatečně prostudovány. Houbové mycelium se svým složením liší od rostlinného opadu. Proto lze předpokládat, že i rychlost rozkladu bude u obou těchto substrátů odlišná. Významnou vlastností půdy je její prostorová heterogenita, která se projevuje například tvorbou vertikálních vrstev neboli horizontů. Vytvořené horizonty tvoří půdní profil (Obr. 1). Půdy mírných a severských lesů obsahují vysoké množství uhlíku uloženého na povrchu ve formě rostlinného opadu. V půdě se pak uhlík hromadí v důsledku rozkladu organického materiálu a ukládání na uhlík bohatých produktů rostlinné fotosyntézy (Baldrian a kol. 2013).
opadová vrstva
organický horizont
minerální horizont
Obr. 1: Půdní profil listnatého lesa (Voříšková 2009)
6
Většina půdních organismů obývá svrchní vrstvy půdy, které jsou bohatší na živiny a obsahují více využitelného organického materiálu (Rajchard a kol. 2002). Bakterie a hlavně houby jsou často spojeny s určitým půdním horizontem. Například v opadové vrstvě smrkového lesa je dominantnější biomasa hub, zatímco v humusovém horizontu je příspěvek houbové a bakteriální biomasy srovnatelný. Diverzita bakteriálních populací je vyšší než populací hub, protože ve společenstvech hub často převažuje několik dominantních druhů. Zatímco hlavní bakteriální druhy jsou většinou v půdě rovnoměrně rozloženy, dominantní druhy hub jsou často omezeny pouze na určitou lokalitu (Baldrian a kol. 2012). Po dlouhou dobu byla analýza mikrobiálních společenstev založena pouze na kultivačních technikách, které nejsou pro většinu půdních mikroorganismů zcela vhodné. Během posledních dvou desetiletí umožnily techniky založené na izolaci DNA, mezi něž patří denaturační gradientová gelová elektroforéza (DGGE), terminální analýza polymorfismu délky restrikčních fragmentů (T-RFLP) nebo klonovací-sekvenční techniky, komplexnější pohled do struktury půdních mikrobiálních společenstev (Valášková a Baldrian 2009). Poměrně nedávno se podařilo překonat problém s nákladným klonováním a následným sekvenováním mikroorganismů, které bylo navíc zatíženo rozsáhlou chybou v důsledku omezeného počtu sekvencí získaných ze vzorku. Vývoj metod sekvenování nové generace umožnil méně nákladné a detailnější studie složení mikrobiálního společenstva (Roesch a kol. 2007). Navíc použití RNA na místo DNA nebo použití metody stabilních izotopů (SIP) může poskytnout identifikaci aktivní části mikrobiálních komunit (Baldrian a kol. 2012).
7
2 Literární přehled 2.1 Houby v lesní půdě Houby jsou hlavními rozkladači organického materiálu v lesní půdě především díky produkci enzymů, které dovedou rozkládat komplexní polymery. Houby jsou obzvláště důležité při rozkladu celulózy, která představuje okolo 40% rostlinného materiálu buněčných stěn (de Boer a kol. 2005). Saprotrofní houby rozkládají opad a půdní organickou hmotu, naopak mykorhizní houby žijí ve spojení s kořeny rostlin, od nichž odebírají cukry a rostlinu pak zásobují minerálními látkami. Zároveň mají také vliv na její fyziologii a chrání ji před škodlivými vlivy vnějšího prostředí (Högberg a Högberg 2002, Linderman 1988). První z nich převažují v opadu, kde je dostatek hydrolyzovatelných látek podporujících rychlý rozklad a následnou mineralizaci uhlíku. Rozklad složitějších látek ve svrchních částech půdy je většinou zprostředkován saprotrofními bazidiomycety, které jsou vybaveny pro degradaci komplexních látek různými enzymatickými systémy. Ektomykorhizní houby jsou dominantní v hlubších vrstvách půdy, kde získávají dusík z anorganických zdrojů a zpřístupňují ho k využití svým hostitelským rostlinám (Baldrian a Valášková 2008, Lindahl a kol. 2007, Wallander a kol. 2004). Jejich biomasa ale ubývá se zvyšující se hloubkou (Högberg a Högberg 2002, Wallander a kol. 2004). Nicméně u některých mykorhizních hub lze předpokládat i jejich saprotrofní růst (Cullings a Courty 2009, Drigo a kol. 2012, Ekblad a kol. 2013, Gryndler a kol. 2004). Díky širokému spektru funkcí hub může biomasa jejich mycelia v lesní půdě nabývat značných hodnot. Množství houbové biomasy v lesním opadu je přitom vyšší, než v lesní půdě (Baldrian a kol. 2013). Ekblad a kol. (2013) stanovili produkci mimokořenového mycelia ve svrchních deseti centimetrech půdy na hodnotu kolem 160 kg ha-1 rok-1 a je odhadováno, že v celém půdním profilu je tato hodnota minimálně dvojnásobná. Högberg a Högberg (2002) určili, že se na jednom hektaru lesní půdy vytvoří až 800 kg mycelia rok-1. Na základě výsledků s použitím půdní kultivační techniky vypočítali Wallander a kol. (2004) celkovou životnost biomasy mimokořenového mycelia v horních 70 cm půdy a odhadli tak hodnoty okolo 5000 kg ha-1, což je o řád vyšší než při pokusech s vrůstovými sáčky (Ekblad a kol. 2013). Množství biomasy mimokořenového mycelia přitom ubývalo směrem od povrchu do hlubších vrstev půdy (Wallander a kol. 2004). Množství mycelia naměřeného v půdě závisí
8
na mnoha faktorech, například na místě a hloubce odběru, ročním období a použité metodě (Ekblad a kol. 2013). Mnoho těchto studií se zaměřovalo především na ektomykorhizní houby. Předpokládá se, že ektomykorhizní houby zaujímají 47-84% z celkové půdní biomasy hub (Bååth a kol. 2004) a podílejí se z více než 25% na půdním toku CO2 (Heinemeyer a kol. 2007). Mimokořenová mycelia tvoří významný podíl z celkové mikrobiální biomasy v lesní půdě (Wallander a kol. 2001). Některé houby tvoří relativně malé mimokořenové mycelium, zatímco jiné produkují tlusté, široce rozvětvené rhizomorfy. Mimokořenové mycelium se tak stává významným zdrojem uhlíku využitelného půdními mikroorganismy nebo součástí půdní organické hmoty (Drigo a kol. 2012).
2.2 Dekompozice v lesní půdě Rozklad odumřelé organické hmoty je základním procesem ve všech ekosystémech. Rozklad tvoří opak primární produkce, protože navrací uhlík z organických zbytků zpátky do prostředí. Rovněž má za následek transformaci organických forem dusíku, fosforu a síry do látek využitelných kořeny rostlin (Attiwill a Adams 1993). Ačkoliv lesy neustále recyklují uhlík pomocí fotosyntézy a rozkladu, více než dvě třetiny uhlíku obsaženého v lesních ekosystémech je uloženo v půdě (Dixon a kol. 1994). Na rozkladu jednoduchých substrátů se podílejí houby i bakterie, však houby dokáží na rozdíl od většiny bakterií degradovat komplexní polymery (de Boer a kol. 2005). Velikost polymerních substrátů (například ligninu nebo celulózy) způsobuje, že depolymerizace probíhá extracelulárně a pouze konečné jednoduché produkty jsou využívány intracelulárně (Paul 2007). Rostlinný materiál je velmi komplexní a potřebuje ke svému rozkladu penetraci půdními rozkladači. A právě myceliální růst je velkou výhodou hub oproti bakteriím. Zatímco bakteriální pohyblivost je v půdě omezena, mycelium dává houbám schopnost přemisťovat živiny (Jennings 1987), a tím je také zvýhodňuje v nutričně chudých prostředích nebo v místech s nerovnoměrným rozmístěním organické hmoty. Tato imobilita bakterií může být překonána například transportem po houbových hyfách, což je typické zejména pro bakterie žijící v kontaktu s rostlinami. Také někteří z bakteriálních rozkladačů mají schopnost tvořit hyfy, například askomycety (de Boer a kol. 2005). Pokud je půda chudá na živiny, pak je rozklad zpomalen a všechny uvolněné živiny jsou zabudovány do těl rozkladačů, čímž dochází k imobilizaci živin v půdě (Dixon a kol. 9
1994). Půdní vlhkost a teplota jsou hlavní klimatické faktory ovlivňující půdní biologickou aktivitu. Tyto změny nastávají prostřednictvím enzymatických katalytických reakcí. Zásadní je pro mikrobiální aktivitu dostupnost vody. Pokud není voda limitujícím faktorem, potom biologická aktivita závisí hlavně na teplotě. Tyto vlivy neovlivňují mikrobiální aktivitu lineárním způsobem, ale vykazují komplexní, nelineární, vzájemně spojené účinky, které odpovídají jednotlivým reakcím mikroorganismů a jejich enzymatickým systémům (Paul 2007).
2.2.1 Dekompozice půdní organické hmoty Rozklad půdní organické hmoty v lesním ekosystému je důležitý ze dvou důvodů. Za prvé je půdní organická hmota největší zásobárnou uhlíku v terestriálních ekosystémech a za druhé je rychlost rozkladu organické hmoty hlavním procesem regulujícím zásobování živin rostlinami (Koide a Malcolm 2009). Původní materiál určuje chemické složení půdní organické hmoty (Miltner a kol. 2012). Ta obsahuje cukry a další jednoduché látky, které se rozkládají poměrně rychle podle složení a aktivity půdních rozkladačů (Treseder a Allen 2000). Poté, co jsou tyto látky rozloženy, rozklad se zpomalí a postupně dochází k přeměně hůře rozložitelné celulózy a hemicelulóz. Nejpomaleji se rozkládají lignin a fenolické látky. Rozkládané rostlinné zbytky se částečně mineralizují na CO2, částečně jsou zabudovány do mikrobiálních těl a metabolitů. Půdní organický hmota je na rozdíl od rostlinných zbytků tvořena převážně aromatickými látkami a alifatickými uhlovodíky s dlouhým řetězcem, hlavně huminovými kyseliny a fulvokyselinami (Rajchard a kol. 2002), což jsou agregáty celé řady organických sloučenin různého původu (Miltner a kol. 2012). Nedávná analýza Schmidt a kol. (2011) zpochybnila význam složení a chemické stavby materiálu, tvořícího půdní organickou hmotu, pro její rozklad. Špatná rozložitelnost organického materiálu v půdě je podle této teorie způsobena převážně komplexními interakcemi s prostředím, jako je například sorpce látek na minerální částice nebo uzavření v agregátech (Schmidt a kol. 2011, von Lützow a kol. 2008). Uložení uhlíku v půdě ve formě organické hmoty představuje potenciální cestu ke zmírnění rostoucí koncentrace atmosférického CO2 (Batjes 1998). Ne všechny mikroorganismy mají pozitivní vliv na ukládání uhlíku v půdě. Saprotrofní mikroorganismy vyloučí po rozkladu půdní organické hmoty většinu uhlíku do atmosféry ve formě CO2 (Koide a Malcolm 2009). Opačný účinek mají ektomykorhizní houby, které dokáží zpomalit rozklad organické hmoty inhibicí aktivity saprotrofních mikroorganismů, například produkcí růz-
10
ných antibiotických látek do prostředí, nebo prostřednictvím efektivního příjmu dusíku a fosforu, čímž se omezí dostupnost těchto živin v půdě. Tento mechanismus může mít i alternativní vysvětlení, které je založeno na snížení dostupnosti vody (Ekblad a kol. 2013, FreyKlett a kol. 2005b, Koide a Wu 2003). V některých případech může ale přítomnost ektomykorhizních hub teoreticky zvýšit rychlost rozkladu složitých organických látek. Houby mohou stimulovat metabolismus saprotrofních mikroorganismů produkcí nízkomolekulárních látek, které mohou sloužit pro saprotrofy jako zdroje živin (Ekblad a kol. 2013, Kuzyakov a kol. 2000). Růst celulolytických hub a hub využívajících jednoduché substráty je obecně rychlejší než růst specializovaných ligninolytických hub. Askomycety jsou častěji nalézány v čerstvém opadu než bazidiomycety, nicméně během rozkladu substrátu dochází ke snižování jejich počtu (Osono 2007). To je způsobeno faktem, že je rozklad ligninu z velké části omezen na aktivitu určitých rodů bazidiomycet, nazývaných také jako houby bílé hniloby (Leonowicz a kol. 1999, Tuomela a kol. 2000). Například houba bílé hniloby Phanerochaete chrysosporium je schopná rozkládat lignocelulózu s využitím komplexní směsi celuláz, hemiceluláz a lignin-degradujících enzymů. K rozkladu celulózy a hemicelulózy dochází v primárním metabolismu, zatímco rozklad ligninu probíhá jako součást sekundárního metabolismu a je vyvolán nedostatkem dusíku, uhlíku nebo síry. Degradace ligninu je doprovázena růstem hyf, které dovolují penetraci substrátu a koordinovaný výdej extracelulárních enzymů s následnou absorpcí enzymatických produktů (Broda a kol. 1996, Lynd a kol. 2002). Jelikož různé houby jsou přizpůsobeny k degradaci různých typů polymerů, rostou často saprotrofní houby v komplexních společenstvech odrážejících jejich různé enzymatické schopnosti (Deacon 2006). Přesto některé studie naznačují, že struktura mikrobiálního společenstva není řízena výhradně kvalitou dostupného substrátu (Griffiths a kol. 1998). Mnoho článků se do současnosti věnovalo rozkladu půdní organické hmoty nebo opadu, ale o rozkladu houbové biomasy je toho známo poměrně málo (Ekblad a kol. 2013, Fernandez a Koide 2011).
2.2.2 Dekompozice houbového mycelia Buněčná stěna hub je dynamická struktura, která chrání buňky před změnami osmotického tlaku a jinými environmentálními stresy, zatímco umožňuje povrchu buněk kontakt s okolním prostředím. Svým složením se výrazně liší od buněčné stěny rostlin, která obsahuje 11
větší množství celulózy. Buněčné stěny hub jsou zpravidla složeny z polysacharidů a glykoproteinů. Hlavní polysacharidy buněčné stěny jsou rozdílné mezi jednotlivými skupinami hub a mohou se také lišit v závislosti na podmínkách prostředí nebo fázi růstu. Mezi nejvýznamnější patří chitin, glukany a mannany. Tyto komponenty tvoří spolu s glykoproteiny komplexní struktury určující architekturu buněčné stěny. Narušení této struktury má hluboký dopad na růst a morfologické vlastnosti hub a často činí buňky citlivější k lýze a předčasné smrti (Bowman a Free 2006). Málo je zatím známo o dynamice specifických chemických složek mycelia hub (Drigo a kol. 2012). Různé části mycelia jsou rozkládány různou rychlostí. Rychlost rozkladu houbových složek klesá v pořadí: cytoplasma, buněčná stěna, melanin (Malik a Hader 1982, Sollins a kol. 1996). Ektomykorhizní a arbuskulárně mykorhizní houby obsahují relativně špatně rozložitelné sloučeniny chitin a glomalin, jejichž rozklad může trvat až několik desetiletí (Godbold a kol. 2006, Treseder a Allen 2000). Dalšími důležitými polymery hub jsou melaniny, které houby chrání před environmentálním stresem (Henson a kol. 1999) a hydrofobiny, což jsou proteiny vylučované na povrch buněčných stěn, poskytující buňce hydrofobní obal a umožňující přilnutí na hydrofóbní povrchy (Wessels 1996). Rozklad glykogenu, obsaženého ve tkáních hub jako výtěžek ektomykorhizní symbiózy, probíhá velmi rychle (Drigo a kol. 2012). Tkáně hub, obsahující vysoké koncentrace pigmentů jako je například melanin, jsou odolnější vůči rozkladu (Butler a Day 1998). Předpoklad, že buněčné stěny hub jsou rezistentnější k rozkladu, než buněčné stěny rostlin, je založen na srovnání rychlosti rozkladu těchto tkání (Ekblad a kol. 2013, Godbold a kol. 2006, Langley a kol. 2006). Tento závěr je ale zpochybněn několika současnými studiemi (Fernandez a Koide 2011, Koide a kol. 2011). Mimokořenové mycelium, které je tvořeno převážně ektomykorhizními houbami žijícími ve spojení s kořeny stromů, hraje důležitou roli při příjmu živin, v cyklech uhlíku a dusíku, při minerálním zvětrávání, při vývoji samenáčků a ve složení rostlinných společenstev. Zbytky mimokořenového mycelia mohou významně přispívat k vytvoření půdní organické hmoty a aktivita mykorhizních kořenů a mimokořenového mycelia může ovlivnit rozklad organického materiálu v půdě (Ekblad a kol. 2013, Godbold a kol. 2006). Ekblad a kol. (2013) navrhli tři mechanismy rozkladu mimokořenového mycelia: 1) Rozklad autolýzou mycelia 2) Rozklad aktivitou saprotrofních hub a bakterií 3) Rozklad aktivitou půdní mikrofauny 12
Relativní podíl těchto mechanismů na rozkladu houbového mycelia je zatím neznámý, a také produkty rozkladu mohou mít různou kvalitu. Autolýzou a aktivitou saprotrofních organismů vznikají látky chudé na dusík a další jejich rozklad je pravděpodobně pomalý. Naopak látky vzniklé aktivitou půdních bezobratlých jsou bohaté na živiny a rychle se rozkládají (Ekblad a kol. 2013). Zdá se ale, že důležitost mimokořenového mycelia jako snadno dostupného zdroje potravy pro půdní potravní řetězec je menší, než se původně předpokládalo (Setälä 2000). Kvůli produkci sekundárních metabolitů houbami pouze několik druhů půdních živočichů upřednostňuje ektomykorhizní houby jako svou potravu (Ekblad a kol. 2013, Stadler a Sterner 1998). Nepřímý vliv půdní mikrofauny na obrat mimokořenového mycelia je ale pravděpodobně důležitý. Přítomnost fungivorů, stejně jako jiných půdních organismů, může potenciálně ovlivnit růst, setrvání a rozklad mimokořenového mycelia v půdě. Experimenty v laboratorních mikrokosmech prokázaly, že růst mimokořenového mycelia může být snížen, zvýšen, nebo neovlivněn přítomností bezobratlých živočichů (Ekblad a kol. 2013). Příkladem je například vysoká aktivita žížal v půdě nebo rytí divočáků, které může urychlit rozklad mimokořenového mycelia (Ekblad a kol. 2013, Massei a Genov 2004). Zatím existuje pouze omezené množství informací o rychlosti rozkladu houbového mycelia, faktorech určujících rychlost rozkladu nebo o organismech, které rozklad způsobují (Drigo a kol. 2012, Koide a Malcolm 2009). Pro výpočet rychlosti obratu mycelia v půdě je nutné znát produkci mycelia a délku jeho setrvání v půdě (Ekblad a kol. 2013). Některé studie poukazují na zhoršenou schopnost rozkladu buněčných stěn hub v porovnání s jinými typy opadu. V předchozích kapitolách bylo již uvedeno, jak obrovské množství houbového mycelia se v půdě nachází. Söderström (1979) zjistili, že pouze malá část z tohoto mycelia je aktivní. Proto lze předpokládat, že rozklad neaktivních hyf, kterých je v půdě velké množství, probíhá velmi pomalu (Ekblad a kol. 2013). Výsledky Wallander a kol. (2004) poukazují na poměrně dlouhou dobu rozkladu ektomykorhizního mycelia v půdě, ale přiznávají také možné nepřesnosti kvůli použití vrůstových sáčků na místo studií in situ. V tomto případě mohlo dojít k podhodnocení rychlosti rozkladu, k čemuž dochází podhodnocením produkce mycelia společně s nadhodnocením setrvání biomasy hub v půdě (Ekblad a kol. 2013). Několik laboratorních studií zaznamenalo poměrně rychlý rozklad mycelia, který probíhal v řádu týdnů (Drigo a kol. 2012, Ekblad a kol. 2013, Fernandez a Koide 2011). Není však jisté, zda výsledky těchto studií, stejně jako v případě podhodnocení rychlosti rozkladu 13
mycelia, platí i přirozeně v přírodě (Ekblad a kol. 2013). Studie provedená Staddon a kol. (2003) odhaduje dobu rozkladu mimokořenového mycelia arbuskulárně mykorhizních hub na 5-6 dní. Koide a Malcolm (2009) zaznamenali 20-80% ztrátu hmotnosti intaktního mycelia čisté kultury různých druhů hub během jednoměsíční inkubace v půdě. Ekblad a kol. (2013) odhadli, že rozklad celého mimokořenového mycelia proběhne maximálně třikrát za rok. Navrhli také hypotézu, že rozklad ektomykorhizních hyf je rychlejší v půdách s větším obsahem organického materiálu než v minerálních půdách. S tím se shodují výsledky Wallander a Pallon (2005), kteří pozorovali rychlou produkci a rozpad mycelia osídlujícího místa s vysokým množstvím organického materiálu, zatímco v minerální půdě zůstalo mycelium vitální po celou dobu experimentu. Cílem hub v organických půdách byla tedy rychlá kolonizace prostředí, přičemž v minerálních půdách mycelium zadržovalo živiny a pomáhalo uvolnění dalších látek pomocí zvětrávání minerálů. Takové mycelium pak bylo v půdě mnohem odolnější. Na těchto příkladech lze pozorovat, jak jsou změny v rychlosti rozkladu mycelia závislé na podmínkách okolní půdy (Ekblad a kol. 2013). Tyto omezené důkazy naznačují, že tkáně hub jsou méně odolné než tkáně rostlin alespoň v počátečních fázích rozkladu a že právě tehdy dochází k rychlé ztrátě nestabilního uhlíku (Koide a Malcolm 2009). Byl nalezen zřejmý posun ve složení společenstev hub v průběhu transformace organické hmoty v opadu, humusu a minerální půdě boreálních lesů. Je pravděpodobné, že tento posun nastává každých 3-5 let dekompozice materiálu (Lindahl a kol. 2007). Zásadní rozdíly v rychlosti rozkladu se objevují mezi jednotlivými druhy. Studie prokázala, že rychlost rozkladu ektomykorhizních hub souvisí s koncentrací dusíku ve tkáních, proto může hrát složení společenstev ektomykorhizních hub důležitou roli. Zároveň může mít struktura ektomykorhizního společenstva vliv na ukládání uhlíku v ekosystému (Koide a Malcolm 2009). Takovýto vztah nebyl ale potvrzen jinými studiemi. Laboratorní studie Wilkinson a kol. (2011) ukazuje, jak druhová rozmanitost ektomykorhizních hub může zvýšit tok CO2 půdou a jak je dekompozice hyf regulována spíše specifickými živinami v houbové nekromase, než jejich množstvím. Společenstva ektomykorhizních hub jsou obvykle složena z několika dominantních a velkého počtu řídce se vyskytujících druhů (Dahlberg 2001), takže i malá změna v druhovém složení může mít vážný dopad na obrat mimokořenového mycelia v půdě (Ekblad a kol. 2013). Houbové tkáně obsahují značné množství dusíku (Deacon 2006). Poměr C/N v houbové biomase je proto mnohem nižší než v čerstvém opadu, což může pozitivně ovlivnit 14
rychlost rozkladu hub (Koide a Malcolm 2009, Valášková a kol. 2007). Nicméně studie Langley a Hungate (2003) zpochybňuje tuto hypotézu, neboť předpokládá, že dusík obsažený v houbové biomase je přítomen v obtížně rozložitelných strukturách, takže nemá na rychlost rozkladu žádný vliv. Rychlost rozkladu houbového mycelia však může být kontrolována i jinými faktory než je koncentrace dusíku ve tkáních. Sezonní změny v obratu biomasy mimokořenového mycelia jsou pravděpodobně způsobeny kromě environmentálních faktorů prostředí také nepřímo změnou aktivity hostitelských rostlin. Blízký kontakt jemných hyf mimokořenového mycelia s půdními částicemi vysvětluje zdánlivou perzistenci mycelia v některých půdách (Ekblad a kol. 2013). Dalším faktorem snižujícím rychlost rozkladu může být hydrofobicita houbových hyf, která může houby chránit před rozkladnými enzymy (von Lützow a kol. 2006). U mnoha druhů se rostoucí mycelium postupně shlukuje za tvorby rhizomorf, pročež jemné hydrofilní hyfy prozkoumávají okolní půdu. Zatímco chemické složení jednotlivých hyf a rhizomorf daných druhů je pravděpodobně stejné, rhizomorfy jsou odolnější vůči rozkladu než jednotlivé hyfy (Koide a Malcolm 2009, Ekblad a kol. 2013). K tomu přispívá i jejich relativní hydrofobicita (Agerer 2001). Průměrná délka života rhizomorf byla stanovena na 11 měsíců, což značí pomalejší rozklad, než byl naměřen u zbytku mycelia. Podíl rhizomorf a ostatních (difúzních) hyf má tudíž vliv na rychlost rozkladu mimokořenového mycelia (Drigo a kol. 2012, Treseder a kol. 2005). Při sukcesi společenstva na dřevě dochází z nahrazení původních hub, které slouží jako substrát pro nově vznikající společenstvo, které jej využívá především jako zdroj dusíku (de Boer a kol. 2005). Byl pozorován rychlý nárůst množství saprotrofních hub na odumírajícím mykorhizním myceliu, což značí, že některé zdroje živin v houbových hyfách jsou přednostně degradovány saprotrofními mikroorganismy (Drigo a kol. 2012, Lindahl a kol. 2010). Mezi hlavní skupiny, které rychle dokázaly využít uhlík z rozkládajících se hyf mykorhizních hub, patřily bazidiomycety. Zvyšující se podíl bazidiomycet na úkor askomycet byl pozorován v průběhu celého rozkladu a mohl odrážet preference bazidiomycet k využívání sekundárních sloučenin nebo změnu v konkurenceschopnosti jednotlivých hub (Drigo a kol. 2012).
2.3 Bakterie v lesní půdě Lesní půdy obývají rozmanitá bakteriální společenstva, která se liší svým složením, četností a také svými funkcemi. Jednou z důležitých funkcí bakterií je jejich schopnost pozitivně nebo negativně interagovat s houbami, přičemž mají také významný podíl na rozkladu 15
jejich mycelia v půdě. Nezanedbatelný význam mají také při rozkladu jednoduchých látek v půdě. Zatím existuje pouze málo informací o celkové struktuře bakteriálních společenstev, neboť se dosavadní výzkumy zaměřovaly buď na malou oblast půdy, nebo používaly metody nevhodné ke zjištění celkové fylogenetické struktury bakteriálních komunit (Lauber a kol. 2009). Množství bakterií v půdě klesá s rostoucí hloubkou půdy. Společně s množstvím bakterií klesá také jejich celková enzymatická aktivita (Taylor a kol. 2002). Přesto lze konstatovat, že se význam bakterií v půdě s rostoucí hloubkou relativně zvyšuje (Bååth a Anderson 2003, Baldrian a kol. 2012). To potvrzuje i fakt, že byly bakterie nalezeny na rozdíl od hub i ve spodních vrstvách půdy ve velkých počtech (Taylor a kol. 2002). Jeden gram půdy obsahuje přibližně 109 bakteriálních buněk a až několik tisíc bakteriální druhů (Schloss a Handelsman 2006). Dřívější odhady udávaly hodnoty až 8,3 milionu jedinečných bakteriálních sekvencí v jednou gramu půdy (Gans a kol. 2005), nicméně pozdější studie určila s využitím pyrosekvenačních technik tuto hodnotu mnohem nižší, v řádu několika desítek tisíc unikátních bakteriálních sekvencí na gram půdy (Roesch a kol. 2007). Celkové množství bakterií i jejich diverzita klesá se snižujícím se pH půdy, přičemž největší rozmanitost bakteriálních společenstev byla nalezena v půdách s neutrálním pH (Lauber a kol. 2009, Rousk a kol. 2010). Hodnota pH půdy významně ovlivňuje zastoupení bakteriálních kmenů Actinobacteria, Acidobacteria a Bacteroidetes. Na pH půdy závisí také celková fylogenetická rozmanitost bakteriálních společenstev. Nicméně zatím není znám mechanismus, jakým pH půdy ovlivňuje bakteriální společenstva. K jeho vysvětlení byly vytvořeny dvě hypotézy. První z nich je založena na tom, že pH půdy působí nepřímo na bakteriální společenstva jako integrovaná proměnná, která mění jiné půdní faktory (dostupnost živin, slanost, rozpustnost kationtů, vlhkost), které také výrazně ovlivňují složení bakteriálních společenstev. Druhá hypotéza vychází z přímého vlivu pH na bakteriální společenstva, kde pH vytváří na půdní bakterie fyziologický tlak, který ovlivňuje jejich konkurenceschopnost nebo inhibuje růst konkrétních bakteriálních taxonů (Lauber a kol. 2009). Svou roli hraje také fakt, že je bakteriální růst často omezen na malý rozsah pH (Schneider a kol. 2012) Půdní bakteriální společenstva jsou obvykle složena z velkého množství řídce se vyskytujících druhů (Elshahed a kol. 2008). Při analýze celkového a aktivního mikrobiálního společenstva v půdě a opadu jehličnatého lesa bylo zjištěno, že se získané bakteriální sekvence řadí do 21 kmenů, z nichž ale jen 8 překročilo výskyt 0,1%. Mezi nejčastější bakteriální kmeny patřily Actinobacteria, Acidobacteria, Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Verrucomicrobia, Chlamydiae a Gemmatimonadetes. Celková fylogenetická diverzita 16
v opadu byla vyšší než v organickém horizontu (Baldrian a kol. 2012), k čemuž mohl přispívat i přísun zymogenních bakterií z rhizosféry. Rozdíly v druhové bohatosti jednotlivých taxonů mezi půdními horizonty byly pozorovány u kmenů Actinobacteria a Proteobacteria. Aktinobakterie byly nalézány častěji v minerálních horizontech než na povrchu půd, zatímco u proteobakterií to bylo naopak. Tomuto výsledku odpovídá i častý růst proteobakterií v asociaci s rostlinami (Axelrood a kol. 2002).
2.3.1 Bakterie na opadu Listový opad je složen hlavně z celulózy, ale také ligninu, hemicelulózy, pektinu, proteinů a aromatických látek (Yadav a Malanson 2007). Rozklad organického materiálu v opadu je klíčovým procesem, který umožňuje recyklaci uhlíku v ekosystému. Transformace organického materiálu v opadové vrstvě je podstatně rychlejší než v organickém horizontu (Baldrian a kol. 2012, Šnajdr a kol. 2008). Během rozkladu opadu probíhá sukcese jeho rozkladačů, což zároveň ovlivňuje celkové složení bakteriálních společenstev. Na opadu probíhá výrazná sukcese bakteriálních společenstev během celého roku. Studie Torres a kol. (2005) popsala změnu funkčních skupin bakterií v závislosti na změně chemické struktury opadu. V počátečních fázích rozkladu dominovaly na opadu zymogenní bakteriální společenstva pocházející z povrchu listů. Tato fáze byla charakteristická rychlým rozkladem organického materiálu, spojeným s dekompozicí jednoduchých organických látek. Z fyziologických skupin bakterií se v této fázi uplatňovaly amonifikační bakterie, dusík fixující bakterie a bakterie využívající jednoduché cukry. Následoval pomalejší rozklad s dominancí autochtonních bakterií žijících v půdě. V této fázi byla výrazná aktivita nitrifikačních a celulolytických bakterií, jako jsou například rody Cytophaga, Cellulomonas, Pseudomonas, Cellvibrio, Ruminococcus, Bacteroides, Anaerocellum, Caldocellulosirupto, Clostridium a Butyrivibrio (Dilly a Munch 1996, Torres a kol. 2005, Yadav a Malanson 2007). Kopiotrofie a oligotrofie jsou dvě životní strategie charakteristické pro různé bakterie. Kopiotrofní bakterie mají vyšší rychlost růstu než oligotrofní bakterie a rozkládají jednoduché a energeticky bohaté substráty, k nimž mají ale nižší afinitu. Naproti tomu oligotrofové se vyskytují spíše na lokalitách s nedostatkem živin nebo na místech, kde na organismy působí různé environmentální stresy (Fierer a kol. 2007). Studie Fierer a kol. (2007) předpokládá, že sukcese na energeticky bohatém substrátu jako je opad, je v časných fázích ovládána kopiotrofy, ale v pozdějších fázích, kdy dochází k vyčerpávání substrátu, získávají větší 17
důležitost oligotrofové. Naproti tomu lze očekávat, že oligotrofové kolonizují na živiny chudé substráty a četnost kopiotrofů roste s růstem oligotrofního společenstva. Schneider a kol. (2012) naměřili zvyšující se podíl bakterií kmene Proteobacteria od zimy do jara, zatímco podíl bakterií kmene Actinobacteria a Verrucumicrobia klesal. Aktinobakterie jsou známy jako významní rozkladači organických látek. Půdní bakterie kmene Acidobacteria nebyly v opadu nalezeny. Tyto bakterie dokáží degradovat širokou škálu organických látek, od jednoduchých až po komplexní polymery, například celulózu nebo chitin (Ward a kol. 2009). Baldrian a kol. (2012) provedli analýzu RNA opadové vrstvy jehličnatého lesa. Za dominantní bakterie byly označeny členové kmenů Acidobacteria, Actinobacteria a Proteobacteria. Podíl acidobakterií v opadu byl ale nižší než v celkovém půdním společenstvu. Za zmínku stojí také aktivita zástupců kmene Firmicutes a Bacteroidetes, která byla vyšší než v organickém horizontu.
2.3.2 Bakterie v půdě Tradiční studie spoléhaly na kultivaci půdních bakterií a charakteristiku dominantních izolátů. Pozornost byla přitom kladena na půdní bakterie mající nějaké zajímavé fyziologické funkce. V nedávné době se s nástupem DNA technik zjistilo, že kultivovatelné bakterie zastupují pouze malou část bakteriálního společenstva v lesních půdách (Axelrood a kol. 2002). Nicméně některé doposud nekultivovatelné bakterie mohou být vypěstovány za pomoci vhodných kultivačních médií nebo použitím vhodné délky kultivace (Janssen 2006). V současnosti se pro analýzu půdních mikrobiálních společenstev používají zpravidla pyrosekvenační metody, pomocí nichž lze detailně popsat složení bakteriálních populací v půdě (Lauber a kol. 2009, Roesch a kol. 2007). Pro metaanalýzu bakteriálních společenstev v půdě byly použity data z 32 půdních ekosystémů. Nejhojnějším rodem v bakteriálním společenstvu byl rod Pseudomonas. Členové devíti hlavních taxonů Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Bacteroidetes, Chloroflexi, Planctomycetes, Gemmatimonadetes a Firmicutes tvořily 92% záznamů v knihovnách (Obr. 2). Pouze malé množství bakterií bylo ale přiřazeno k určitému rodu. Odhady zastoupení těchto kmenů v celkovém množství se lišily mezi jednotlivými půdami (Janssen 2006). Výskyt kmene Verrucomicrobia je například velmi ovlivněn vlhkostí půdy (Buckley a Schmidt 2001), zatímco u jiných taxonů se na jejich výskytu a druhovém zastoupení podílí více faktorů (Janssen 2006).
18
Proteobacteria
39% 20%
Acidobacteria
13%
Actinobacteria Verrucomicrobia
7% 5%
Bacteroidetes Chloroflexi
3%
Planctomycetes
2%
Gemmatimonadetes
2%
Firmicutes
2%
Obr. 2: Procentuální zastoupení bakteriálních taxonů v půdě (upraveno dle Janssen (2006))
Různé studie zabývající se bakteriální diverzitou v půdě uvádějí zhruba totožné výsledky, které se mohou nepatrně lišit v závislosti na lokalitě nebo technice odběru. Baldrian a kol. (2012) identifikovali dominantní kmeny bakterií v půdě jehličnatého lesa pomocí izolace DNA a RNA. Převládajícími bakteriemi byly zástupci kmenů Proteobacteria, Acidobacteria a Actinobacteria, přičemž jejich dominance ještě zesílila v případě analýzy RNA. Studie Fierer a kol. (2007) zařadila mezi nejčastější rody ve vzorcích půdy z různých ekosystémů zástupce kmenů Acidobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria a tříd Alphaproteobacteria a Betaproteobacteria. Dále byly v malé míře nalezeni zástupci kmenů Verrucomicrobia a Planctomycetes. Podobných výsledků dosáhli i Schloss a Handelsman (2006) při analýze půdních bakteriálních společenstev na Aljašce. Vzorky pocházely z horní části minerálního horizontu. Lauber a kol. (2009) identifikovali bakteriální společenstva půd Jižní a Severní Ameriky, které byly tvořeny pěti dominantními taxony Acidobacteria, Actinobacteria, Proteobacteria, Bacteroidetes a Firmicutes. Z těchto kmenů pocházelo více než 90% sekvencí ve všech zkoumaných půdách. Proto je zřejmé, že tyto dominantní bakterie musí mít nějaké metabolické vlastnosti, které jim umožňují převažovat ve všech typech půd. Nejhojnější byl kmen Acidobacteria. Mezi nejčastější taxony kmene Actinobacteria patřily podtřídy Actinobacteridae a Rubrobacteridae. Třída Sphingobacteria dominovala v kmeni Bacteroidetes. Řády Rhizobiales a Burkholderiales byly nejčastějšími skupinami mezi proteobakteriemi. Kmeny Acidobacteria a Actinobacteria měly větší druhovou bohatost než 19
kmeny Proteobacteria a Bacteroidetes (Lauber a kol. 2009). Studie Roesch a kol. (2007) udává mezi nejčastěji nalézanými bakteriálními skupinami v lesní a zemědělské půdě kmen Bacteroidetes a třídy Alphaproteobacteria a Betaproteobacteria. Navíc byla bohatost kmenů bakterií v lesních půdách vyšší než v zemědělských půdách, kde bylo identifikováno mnoho různých druhů bakterií, které ale náležely jen do několika kmenů. Dále byla objevena nízká četnost archeí v lesní půdě v porovnání s půdou zemědělskou. Tato studie se zaměřila na bakteriální společenstva ve svrchních částech půd (Roesch a kol. 2007). Jiná studie stanovila, že do kmenů Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria a Verrucomicrobia náleželo 81% z celkového počtu bakterií v půdě boreálních lesů. Největší zastoupení měly proteobakterie, konkrétně třída Alphaproteobacteria. Bylo zjištěno také mnoho rodů, které jsou normálně v asociaci s rostlinami, například Bradyrhizobium, Rhizobium, Pseudomonas a Burkholderia. Bakteriální izoláty získané kultivací náležely do kmenů Proteobacteria, Firmicutes a Bacteroidetes. Hojnost gramnegativních bakterií byla vyšší v okolní půdě než v rhizosféře. Opačné výsledky byly prezentovány v případě proteobakterií (Axelrood a kol. 2002). Mezi četností acidobakterií a mineralizací uhlíku v půdě byla nalezena negativní korelace, zatímco četnost betaproteobakterií a Bacteroidetes pozitivně korelovala s mineralizací uhlíku. Tyto výsledky naznačují, že určité bakteriální kmeny mohou být zařazeny mezi kopiotrofní nebo oligotrofní organismy. Acidobakterie byly nejčastěji nalézány v místech s nízkou dostupností živin. Na rozdíl od oligotrofních acidobakterií vykazovaly betaproteobakterie a bakterie kmene Bacteroidetes kopiotrofní vlastnosti, jelikož byly nejhojnější v půdách s nejvyšší dostupností uhlíku. Tomu odpovídá i hypotéza, že jsou proteobakterie častější v asociaci s rostlinami, než v okolní na uhlík chudé půdě. Z těchto poznatků lze vyvozovat příčinu malého množství izolátů acidobakterií získaných kultivací. Třída Alphaproteobacteria a kmen Firmicutes nebyly jednoznačně zařazeni mezi kopiotrofní nebo oligotrofní bakterie. Výsledky naznačují, že četnost těchto skupin se nemění předvídatelně v závislosti na dostupnosti uhlíku. Nižší taxony těchto skupin mohou být ale zařazeny mezi kopiotrofní nebo oligotrofní bakterie. Je také možné, že se na některé taxony toto rozdělení nevztahuje (Fierer a kol. 2007).
2.4 Bakteriální dekompozice Přestože jsou bakterie zcela dominantní při rozkladu organické hmoty ve vodě a v sedimentech, nedokázaly toto postavení zaujmout v terestriálních ekosystémech. Houby jsou nepostradatelné při rozkladu obtížně rozložitelné organické hmoty, kterou bakterie rozkládat 20
nedokáží. Přítomnost hub má za následek nejen ztrátu potenciálních stanovišť pro bakterie, ale také tvorbu nových. Některé bakterie si vytvořily schopnost využít produkty rozkladu komplexních organických substrátů uvolněných v důsledku exoenzymatické aktivity hub (de Boer a kol. 2005, Merkens a kol. 2005), nicméně samotný rozklad ligninu a humusu je u nich velmi vzácný (Lindahl a kol. 2007).
2.4.1 Jednoduché substráty: kořenové a houbové exsudáty Uvolňování organických látek z kořenů je klíčovým procesem ovlivňujícím dostupnost živin v rhizosféře (Grayston a kol. 1997). Kořenové exsudáty poskytují půdním mikroorganismům většinu nízkomolekulárních látek, což jsou hlavně produkty fotosyntézy (Lynch a Whipps 1991). Tyto látky mohou rostliny chránit nebo mohou podporovat růst organismů, které jsou pro rostliny přínosné (Haichar a kol. 2008). Z toho důvodu je rhizosféra prostředím s nejpočetnějším a nejrozmanitějším půdním společenstvem, zejména bakterie jsou zde velmi početnou skupinou (Garbaye 1994). Kořenové exsudáty zahrnují jak ve vodě rozpustné látky, mezi něž patří cukry, aminokyseliny, organické kyseliny, vitamíny a hormony, tak i různé polymerní sekrety, lyzáty a plyny (Lynch a Whipps 1991). Tato komplexní směs organických látek poskytuje pro bakterie zdroje redukovaného uhlíku, dusíku a jiných živin (Buyer a kol. 2002). Složení bakteriálních společenstev využívajících rostlinné exsudáty závisí na druhu hostitelské rostliny, na jejím věku, lokaci bakterie a typu půdy. Výsledky svědčí o tom, že některé rhizosférní bakterie hojně využívají kořenové exsudáty, zatímco jiné specializované bakterie jsou zaměřeny pouze na rozklad půdní organické hmoty. Mezi bakteriemi využívajícími kořenové exsudáty jsou jak symbionti rostlin, tak jejich patogeni (Haichar a kol. 2008) Některé studie naznačují existenci bakterií přizpůsobených životu v mykosféře. Údaje svědčí o přítomnosti univerzálních nebo specializovaných bakterií využívajících houbové exsudáty. Výběr těchto bakterií je úzce spojen s jejich schopností využívat zvláštní uhlíkaté látky, které se vyskytují v mykosférních exsudátech. Byla naměřena nižší diverzita bakteriální společenstva v mykosféře v porovnání s okolní půdou, což může značit selekci několika bakteriálních druhů, které jsou schopné využívat mykosférní látky. Významná je zřejmě také jejich schopnost rychlé kolonizace povrchů nových hyf. Tato hypotéza je ještě potvrzena zvýšenou diverzitou bakterií rodu Pseudomonas v mykosféře v porovnání s okolní půdou. Většina zástupců kolonizujících povrchy hub se řadí do tříd Alphaproteobacteria a Betaproteobacteria, nicméně existují mezi nimi i výjimky, například rod Bacillus nebo Streptomyces (Warmink a kol. 2009). 21
2.4.2 Komplexní substráty: celulóza, lignin a chitin Celulóza je nejhojnější organická sloučenina na Zemi. Zaujímá 30 – 50 % suché hmotnosti rostlin, a proto je významným zdrojem energie pro mikroorganismy. Vlákna celulózy se zřídkakdy vyskytují samostatně, ale častěji jsou obklopeny jinými strukturálními polymery, zejména hemicelulózou a ligninem. Navíc má většina celulózy krystalickou strukturu, a tím je odolná k enzymatické hydrolýze (de Boer a kol. 2005). Její struktura je poměrně jednoduchá. Skládá se z dlouhých, nerozvětvených řetězců glukózových zbytků, spojených β-1,4 vazbami (Obr. 3) (Deacon 2006).
Obr. 3: Chemická struktura celulózy (upraveno dle Ravi Kumar (2000))
Předpokládá se, že většinu rozkladu celulózy v půdě zajišťují vláknité houby (de Boer a kol. 2005). Schopnost degradovat celulózu má ale také několik bakteriální druhů. Ty mohou být rozděleny podle své fyziologie na: 1) Fermentativní anaeroby, zpravidla grampozitivní bakterie (Clostridium, Ruminococcus, Caldicellulosiruptor) a několik gramnegativních rodů (Butyrivibio, Acetivibrio) 2) Aerobní grampozitivní bakterie (Cellulomonas, Thermobifida) 3) Aerobní klouzavé bakterie (Cytophaga, Sporocytophaga) Obecně platí, že pouze několik druhů z výše uvedených rodů dokáží aktivně rozkládat celulózu (Lynd a kol. 2002). Vláknité aktinomycety se téměř nikdy nezapojují do rozkladu dřeva a mnoho z nich není také schopno rozkládat krystalickou celulózu (Wirth a Ulrich 2002). Přesto jsou tyto bakterie možnými konkurenty hub při rozkladu celulózy za vhodných podmínek. Poznatky o rozkladu celulózy u nevláknitých bakterií jsou zatím velmi omezené (de Boer a kol. 2005). Vzhledem k jejich malé schopnosti pronikat substrátem jsou tyto bakterie omezeny pouze na 22
snadno využitelnou celulózu a pouze na časná stádia rozkladu, neboť jsou později potlačeny celulolytickými houbami (Hu a van Bruggen 1997). Bakteriální rozklad ligninu je zanedbatelný ve srovnání s činností hub bílé hniloby, přesto byl již růst bakterií na tomto substrátu několikrát pozorován (de Boer a kol. 2005). Bakteriální rozklad ligninu nabývá významu pouze v podmínkách nevhodných pro růst hub (Yadav a Malanson 2007). Aerobní a anaerobní bakterie mají rozdílné strategie při degradaci celulózy. Anaerobní bakterie rozkládají celulózu s pomocí komplexních celulázových systémů, které jsou umístěny ve specializovaných organelách nebo přímo na povrchu buňky. Celý proces rozkladu končí jako u normálních fermentací vznikem kvasných produktů. Tyto vysoce výkonné celulázové systémy nejsou přítomny u aerobních bakterií. Ty produkují, stejně jako houby, velké množství extracelulárních enzymů přímo do svého okolí a není u nich nutný jako u anaerobů kontakt se substrátem (Lynd a kol. 2002). Proces rozkladu celulózy s využitím extracelulárních enzymů probíhá ve dvou krocích. Celulázy mají schopnost štěpit β-1,4-glykozidickou vazbu prostřednictvím kyselé hydrolýzy. Celulázové enzymy mohou být rozděleny do třech hlavních typů: endoglukanázy, exoglukanázy a β-glukozidázy. Endoglukanázy štěpí náhodně na nespecifických místech uvnitř polysacharidového řetězce, a proto vznikají oligosacharidy různé délky. Exoglukanázy štěpí postupně redukující nebo neredukující konce polysacharidového řetězce za vzniku buď glukózy (glukanohydrolázy) nebo celobiózy (celobiohydrolázy). Glukozidázy hydrolyzují rozpustné celodextriny a celobiózu na glukózu. Jednotlivé enzymy vykazují často silnou synergii při hydrolýze celulózy (Lynd a kol. 2002).
2.5 Bakterie asociované s houbami Jelikož spolu bakterie a houby v půdě sdílí často stejná stanoviště, vyvinuly se mezi nimi rozmanité interakce. Zkoumání vztahů bakterií a hub začalo poměrně nedávno a již poskytlo zajímavé poznatky o vztazích těchto dvou skupin organismů. Nálezy pomocných bakterií, endobakterií a mykofágních bakterií, stejně tak jako interakce hub a bakterií při degradaci těžko rozložitelných látek, jsou stále málo prostudovány. Využití bakterií pro biologickou kontrolu houbových patogenů zemědělsky významných rostlin, zlepšení pěstování hub nebo kontrola mykorhizní symbiózy jsou velmi významné aspekty z ekonomického hlediska. Bakterie mohou navíc sloužit jako nové zdroje antibiotik nebo zajímavých sekundárních metabolitů (de Boer a kol. 2005). 23
Kromě těchto hledisek slouží mykosféra pro bakterie také jako významný zdroj živin (Nazir a kol. 2013). Houby si nicméně vyvinuly různé mechanismy, pomocí nichž dokáží činnost bakterií selektivně omezit. U bakterií v asociaci s houbami dochází k selekci bakteriálních kmenů uvolňováním rozpustných cukrů (obvykle trehalózy) a polyolů hub (RangelCastro a kol. 2002). Dalším selektivním vlivem mohou být organické kyseliny. Častá je například kyselina šťavelová, která je pro půdní bakterie většinou obtížně degradovatelná. Uvolňování chemických inhibitorů také zvýhodňuje určité bakterie, které jsou k danému antibiotiku rezistentní (de Boer a kol. 2005). Houby také ovlivňují bakteriální populace nepřímo stimulací kořenového růstu rostlin, změnou kořenové exsudace nebo struktury okolní půdy (Rillig 2004). Kromě specifických mechanismů selektujících určité bakterie existují v přírodě také nespecifícké mechanismy, mezi něž patří adherence bakterií na povrchy hub nebo určitá selektivita půdního prostředí (de Boer a kol. 2005). Přes všechny faktory závisí složení bakteriálního společenstva kolonizujícího houbová mycelia převážně na bakteriálním společenstvu vyskytujícím se v okolní půdě (de Ridder-Duine a kol. 2005).
2.5.1 Ektomykorhizní koberce Mnoho ektomykorhizních hub tvoří husté shluky hyf známé jako ektomykorhizní koberce (Obr. 4). Podle odhadů pokrývají ektomykorhizní koberce často až 40% povrchu některých lesních stanovišť. Ingham a kol. (1991) určili podstatně větší délku houbových hyf na jeden gram půdy v případě mykorhizních koberců než u okolní půdy, a dokonce tvořily hyfy až 50% suché hmotnosti půdy. Délka mycelia se pak pohybovala u mykorhizních koberců mezi 2 až 600 km g-1 půdy, zatímco u půdy netvořící mykorhizní koberce to bylo pouze 0,3 až 0,8 km g-1 (Ingham a kol. 1991). Délka mycelia hub se nemění jen prostrově, ale také sezónně (Ekblad a kol. 2013). Jsou známy dva morfotypy ektomykorhizních koberců. První jsou rhizomorfní koberce, které obsahují tlusté rhizomorfy a jsou primárně nalézány v organickém horizontu. Druhým typem jsou hydrofobní koberce, které mají popelavý vzhled a vyskytují se v minerálním horizontu (Kluber a kol. 2010). Ve starší literatuře se setkáme většinou s identifikací hub rhizomorfního růstu do rodu Hysterangium, zatímco houby hydrofobního vzhledu do rodu Gautieria (Griffiths a kol. 1994), nicméně nové poznatky odhalily větší diverzitu, než jaká byla původně odhadovaná. Navíc nejčetnějším taxonem byl určen rod Piloderma (Dunham a kol. 2007).
24
Obr. 4: Ektomykorhizní koberce na povrchu skal (Anderson a Cairney 2007)
Husté mycelium ektomykorhizních hub vytváří unikátní půdní prostředí s rozdílnými vlastnostmi a mikrobiální aktivitou než okolní půda (Kluber a kol. 2010). Koberce často hostí velké množství bakterií a jiných půdních organismů, což je provázeno vysokým množstvím mikrobiální biomasy a obsahu organického materiálu. Ektomykorhizní koberce mohou mít také významný vliv na celkový koloběh živin v lesním ekosystému. Jejich enzymatická aktivita (především chitinázová aktivita), rychlost respirace, tvorba organických látek (oxalát) i koncentrace uhlíku a dusíku je výrazně vyšší než půdách, které koberce netvoří. Rychlost denitrifikace a pH jsou naopak nižší (Cromack a kol. 1988, Griffiths a kol. 1990, Griffiths a kol. 1994, Kluber a kol. 2010). Zároveň byla v místech výskytu ektomykorhizních koberců zjištěna vyšší rychlost rozkladu opadu (Entry a kol. 1991). Významnou vlastností mykorhizních koberců je také podpora minerálního zvětrávání půdy, které zároveň podporuje růst rostlin zvýšenou dostupností minerálních živin (Griffiths a kol. 1994). Navzdory přibývajícím poznatkům o ektomykorhizních houbách je známo jen málo informací o společenstvu organismů, které ho kolonizují. Bakterie izolované z povrchu ektomykorhizní houby Suillus luteus měly na její růst stimulující i inhibující vliv (Bending a kol. 2002). Pomocí molekulárních technik porovnali Warmink a kol. (2009) složení bakteriálního společenstva ektomykorhizních koberců. Výsledky ukázaly pokles v celkové rozmanitosti společenstva a naopak zvýšení diverzity pseudomonád ve srovnání se zbytkem půdy. Pseudomonády jsou spolu s rody Bacillus a Paenibacillus nejčastěji izolované bakterie asociované s ektomykorhizními houbami (Burke a kol. 2008). Studie provedená Kluber a kol. 25
(2011) poukazuje na sezónní změny ve velikosti a aktivitě bakteriálního společenstva ektomykorhizních koberců, nikoliv v jeho složení. Mezi velikostí bakteriální společenstva asociovaného s houbami a okolní půdou byly určeny pouze malé rozdíly. To je v rozporu s prací Timonen a kol. (1998), v níž autoři zjistily zvyšující se množství bakterií směrem k mykorhizním kořenům. Při analýze bakteriálního společenstva asociovaného s ektomykorhizními houbami rostliny rodu Pseudotsuga (douglaska) byla zjištěna podobnost s rhizosférním půdním společenstvem jiných jehličnanů. Velmi časté byly Alphaproteobacteria a také bakterie kmene Bacteroidetes. Při srovnání s jinými publikacemi na toto téma se výsledky přibližně shodovaly (Burke a kol. 2008). Často byli v asociaci s kořeny ektomykorhizních rostlin nalézáni také zástupci aktinobakterií, acidobakterií (Burke a kol. 2006, Chow a kol. 2002) a betaproteobakterií (Timonen a kol. 1998), kteří pravděpodobně plnili funkci pomocných bakterií (Garbaye 1994).
2.5.2 Pomocné bakterie Dlouhou dobu byla mykorhizní symbióza považována pouze za vztah mezi kořeny rostlin a mykorhizními houbami. Nicméně v přirozeném prostředí jsou symbiotické vztahy mykorhizních hub s kořeny rostlin ovlivňovány také prostřednictvím jiných mikroorganismů rhizosféry, obzvláště pak bakteriemi (Obr. 5) (Garbaye 1994).
Obr. 5: Schéma mykorhizního komplexu u ektomykorhizní symbiózy (upraveno dle Frey-Klett a Garbaye (2005a))
26
Byla zaznamenána vyšší četnost bakterií v okolí mykorhizních kořenů než v okolí kořenů bez mykorhizy (Linderman 1988). V rhizosféře mohou bakterie potlačovat nebo stimulovat růst mykorhizních hub nebo na něj nemusí mít žádný vliv (Bowen a Theodorou 1979). Prospěšné bakterie byly označeny jako „mycorrhiza helper bacteria“ (MHB) neboli pomocné bakterie (Garbaye 1994). Tyto bakterie mohou mít pozitivní vliv na vznik mykorhizní symbiózy nebo mohou pozitivně působit na její funkci (Frey-Klett a kol. 2007). Pomocné bakterie mohou dokonce mykorhizní houby chránit před jinými nepřátelskými bakteriemi, a to například produkcí antibiotických látek nebo snižováním koncentrace antifungálních látek v mykorhizosféře přímým působením proti mikrobům ohrožujícím mykorhizní houby (Bowen a Theodorou 1979, Frey-Klett a Garbaye 2005a, Frey-Klett a kol. 2007). Pomocné bakterie mohou podporovat tvorbu různých fenolických látek, například hypaforinu, a tím zvyšovat agresivitu houbových symbiontů (Duponnois a Plenchette 2003). Bylo dokonce prokázáno, že pomocné bakterie mohou způsobit změny v genové expresi mykorhizních hub (Schrey a kol. 2005). Objevila se také hypotéza, že některé pomocné bakterie vystupují jako pomocníci jak mykorhizních, tak patogenních hub (Frey-Klett a kol. 2007). Řada studií potvrdila podpoření mykorhizní symbiózy v přítomnosti pomocných bakterií (Garbaye a kol. 1992, Duponnois a Plenchette 2003, Founoune a kol. 2002, Schrey a kol. 2005), nicméně studie autorů Brulé a kol. (2001) in vitro poukázala na to, že pomocné bakterie mohou mít na mykorhizní houby různý vliv v závislosti na podmínkách kultivace. Pomocné bakterie nejsou specificky vázány na určité rostliny (Duponnois a Plenchette 2003, Garbaye 1994), ale mohou být specificky vázány na určité rody mykorhizních hub (Duponnois a kol. 1993). Specificita pomocných bakterií se liší mezi jednotlivými bakteriálními druhy (Frey-Klett a Garbaye 2005a). Zatím nebylo potvrzeno, zdali pomocné bakterie dávají přednost soužití s mykorhizními houbami, nebo jestli mykorhizní houby selektují pomocné bakterie kolem svých hyf. Předpokládá se, že houbami vylučované metabolity, jako například trehalóza, mohou usnadnit kolonizaci hyf a tvorbu biofilmu pomocných bakterií (Frey-Klett a kol. 2007). Existuje několik hypotéz, podle kterých mohou bakterie ovlivňovat mykorhizní symbiózu (Garbaye 1994): 1) Zlepšení vnímavosti kořenů k mykorhizní houbě 2) Zvýšená schopnost rozpoznání a upevnění vztahu kořenů s houbami 3) Podpora přežití a růstu houby 27
4) Modifikace fyzikálně-chemických vlastností půdy 5) Zlepšení klíčení rozmnožovacích struktur hub Pozitivní vliv na vznik mykorhizní symbiózy mohou mít pomocné bakterie díky stimulaci růstu mycelií mykorhizních hub. Tím se zvýší plocha kontaktu houby s kořeny a sníží se dopad nepříznivých podmínek prostředí na mykorhizní houby (Frey-Klett a kol. 2007). Hlavním mechanismem působení pomocných bakterií při mykorhizní symbióze se zdá být podpora přežití a růstu mykorhizních hub. Tento mechanismus funguje na principu modifikace příjmu živin a regulace buněčného cyklu hub (Dunstan a kol. 1998, Frey-Klett a Garbaye 2005a). Klíčení spor a růst mycelia může být zvýšen v přítomnosti pomocných bakterií prostřednictvím tvorby růstových faktorů, detoxikací antagonistických látek anebo inhibicí konkurentů (Citterio a kol. 2001, Frey-Klett a kol. 2007). Naproti tomu byla popsána inhibice klíčení spor nazývaná „mykostáze“, při níž dochází ke spotřebování živin na povrchu spor nebo k tvorbě antibiotik činností bakterií (de Boer a kol. 2005). Pomocné bakterie také stimulují tvorbu laterálních kořenů (Frey-Klett a kol. 2007). Cho a kol. (2003) zaznamenali pozitivní vliv bakterií na fruktifikaci hub, nicméně získané výsledky mohou být interpretovány i jako odpovědi na stresové faktory prostředí (de Boer a kol. 2005).
2.5.3 Bakterie na dřevě Bakterie jsou považovány za primární kolonizátory dřeva, jež jsou v sukcesi mikrobiálních společenstev následovány houbami. Bakterie nedokáží rozkládat dřevo samostatně, ale působí v kooperaci s dřevokaznými houbami, zpravidla houbami bílé a hnědé hniloby, které mají schopnost rozkládat lignin obsažený ve dřevě díky svému enzymatickému aparátu (Clausen 1996, Leonowicz a kol. 1999). Studie Folman a kol. (2008) se zabývala bakteriálním společenstvem na vzorcích dřeva v počátečních fázích rozkladu. Po inokulaci dřevokazných hub byl naměřen značný pokles množství a diverzity bakterií kolonizujících dřevo, přičemž zajímavý byl nárůst metanotrofních bakterií. Studie Valášková a kol. (2009) prozkoumala bakteriální společenstva na vzorcích dřeva v pokročilém stádiu rozkladu způsobeném činností houby bílé hniloby Hypholoma fasciculare. Ze vzorků bylo izolováno značné množství kultivovatelných bakterií (0,2 – 8 x 109 CFU/g suché hmotnosti dřeva), z nichž většina patřila do kmenů Proteobacteria (75 %) a Acidobacteria (23 %). Bakteriální izoláty byly vysoce acidotolerantní a pravděpodobně využívaly substráty vzniklé působením lignocelulolytických enzymů hub. Stejné kmeny byly dominantní také při použití kvantifikačních technik. Diverzita celého bakteriálního společenstva však byla vyšší, neboť obsahovalo i kmeny, 28
které nebyly izolovány kultivačními technikami: Firmicutes (6,7 %), Bacteroidetes (2,2 %), Verrucomicrobia (3 %), Planctomycetes (3%) a Actinobacteria (1,5 %). Tyto výsledky naznačují, že dřevokazné houby mají buď selektivní vliv na bakteriální společenstvo na dřevě v počátečních fázích rozkladu, nebo bakterie, které se přizpůsobují podmínkám vytvořeným houbou, proliferují až v pozdějších stádiích dekompozice dřeva (Valášková a kol. 2009). Způsob, jakým je dřevo rozkládáno, se liší v závislosti na organismu, typu substrátu, povaze prostředí a interakcích s jinými organismy (Daniel 2003). Obecně platí, že bakterie mohou kolonizovat dřevo za aerobních i anaerobních podmínek, což je pro houby dost problematické (Clausen 1996, Greaves 1971). Greaves (1971) rozdělil bakterie do čtyř skupin podle jejich funkce: 1) Bakterie ovlivňující permeabilitu dřeva 2) Bakterie narušující strukturu dřeva 3) Bakterie kooperující s jinými bakteriemi na rozkladu dřeva 4) Pasivní kolonizátoři Bakteriální osídlení má pozitivní vliv na rozklad dřeva a růst houbového mycelia dřevokazných hub. Až 200% nárůst v růstu hyf byl zaznamenán po ošetření hub bílé a hnědé hniloby bakteriemi a kvasinkami, přičemž rychlejší rozklad byl naměřen u hub hnědé hniloby (Blanchette a Shaw 1978). Obdobné výsledky stanovili také Murray a Woodward (2003), v jejichž experimentu došlo ke zvýšení rychlosti rozkladu smrkového dřeva po inokulaci hub bílé hniloby bakteriemi. Tento výsledek je zřejmě ovlivněn zvýšenou dostupností určitých živin, hlavně vitamínů, produkovaných bakteriemi nebo stimulací celulázové aktivity hub v důsledku využívání produktů rozkladu. Navíc mohou bakterie pozitivně ovlivnit aktivitu hub tvorbou celuláz a pektináz, které zvyšují dostupnost substrátu nebo rozkladem sloučenin toxických pro určité houby (de Boer a kol. 2005). Rozkládající se dřevo je prostorově heterogenní substrát, jehož jednotlivé části jsou kolonizovány rozdílnými mikroorganismy. V porovnání s houbovou biomasou je hodnota bakteriální biomasy na rozkládajícím se dřevě velmi nízká. Větší četnost bakterií byla pozorována v distálních částech dřeva než v proximálních. Tento výsledek je překvapující vzhledem k tomu, že v proximálních částech probíhá intenzivnější hydrolýza polysacharidů, a tím je zde více látek dostupných pro bakterie. Je tedy pravděpodobné, že houby a bakterie kolonizují během rozkladu dřeva rozdílná stanoviště (Větrovský a kol. 2011). Nevláknité celulolytické bakterie jsou často odkázány pouze na určitou oblast, která obsahuje snadno dostupný 29
pektin, celulózu a hemicelulózu. Důležitou vlastností bakterií je tvorba celulolytických a pektinolytických enzymů, které hrají hlavní roli při strukturálních změnách dřeva. Bakteriální celulázy mění jeho permeabilitu, aby porušily krystalickou strukturu a usnadnily tak průnik dalších celulolytických enzymů. Tohoto mechanismu využívají houby hnědé hniloby k infiltraci houbových enzymů do nitra buněk (Clausen 1996). Kromě synergického účinku bakteriálních celuláz, hemiceluláz a pektináz na rozkladu buněčných stěn, mohou mrtvé bakteriální buňky poskytnout houbám cenné zdroje dusíku, neboť se dusík vyskytuje ve dřevě jen ve velmi malých koncentracích (Clausen 1996, Hendrickson 1991). V souvislosti s tím byly identifikovány dusík fixující bakterie v okolní půdě (Levy 1975). Půda zároveň obsahuje síran redukující bakterie, které jsou zodpovědné za přísun železa, neboť přirozeně se vyskytující železo ve dřevě není dostatečné pro růst dřevokazných hub (Ruddick a Kundzewicz 1991). Pouzdra nebo slizové vrstvy určitých bakterií mohou sloužit jako růstové faktory pro dřevokazné houby. Kyselina šťavelová, produkovaná houbami hnědé hniloby, je uložena jako šťavelan vápenatý ve dřevě a okolní půdě (Clausen 1996). Některé bakterie mohou využívat šťavelan vápenatý uložený v půdě jako zdroj uhlíku a vápníku. Uvolňování vápníku je tudíž jedním z možných synergických vztahů mezi houbami a bakteriemi v počátečních fázích degradace dřeva (Chandra a Shethna 1975). Mezi houbami a bakterie dochází jak k pozitivním, tak negativním interakcím. Při rozkladu lignocelulózových substrátů houbami dochází k tvorbě rozpustných cukrů a fenolů (Lang a kol. 2000). Tyto látky mohou být potravou jak pro rozkladné houby, tak pro okolní bakterie. Toto soutěžení o potravinové zdroje může vyústit až ve zpomalení rychlosti rozkladu lignocelulózy. Nicméně houby disponují řadou mechanismů, kterými mohou zabránit bakteriím ve využívání uvolněných oligomerů, například produkcí antibakteriálních látek, tvorbou silně hydrofobního podhoubí, okyselením prostředí nebo uvolněním hydroxylových radikálů. Z to vyplývá, že kompetitivní interakce mezi houbami a bakterie mohou výrazně ovlivnit rozklad komplexní organické hmoty (de Boer a kol. 2005).
2.6 Mykofágní bakterie Zatímco mykofágie je známa už poměrně dlouho (Barnett 1963), bakteriální mykofágie byla objevena poměrně nedávno (de Boer a kol. 2005). Bakteriální mykofágie představuje schopnost bakterií aktivně získávat živiny z živých hub a dovoluje přeměnu houbové
30
biomasy na bakteriální. Do této definice nespadá pasivní odvod a využívání živin z poškozených nebo odumřelých částí hub. Stejně tak schopnost lyzovat houby zcela neodpovídá mechanismu účinku bakteriální mykofágie (Leveau a Preston 2008). Byly popsány tři typy bakteriálních strategií, pomocí nichž mohou bakterie získat živiny z hub: nekrotrofie, extracelulární biotrofie a endocelulární biotrofie (Obr. 6). Jednotlivé bakteriální strategie se mohou vyskytovat samostatně nebo může jedna plynule přejít v druhou v závislosti na určitých podmínkách (Leveau a Preston 2008).
Obr. 6: Schéma tří hlavních mykofágních strategiií bakterií: extracelulární nekrotrofie, extracelulární biotrofie a endocelulární biotrofie (upraveno dle Leveau a Preston (2008))
Bylo zavedeno několik experimentálních přístupů k určení, zdali je daná bakterie mykofágní (Leveau a Preston 2008): 1) Prokázané zvýšení počtu bakterií nebo bakteriální biomasy v přítomnosti hub jako jediného zdroje živin 2) Prokázaný tok živin z houby do bakterie 3) Prokázaná existence a aktivita bakterií žijících a množících se uvnitř houbových hyf (endocelulární biotrofní bakterie) 4) Prokázaná schopnost bakterií destabilizovat buněčnou stěnu hub (extracelulární nekrotrofní bakterie) 31
5) Identifikace mutantů, u nichž je schopnost mykofágie oslabena nebo ztracena 6) Určení transkripčních profilů bakterií během mykofágie 7) Prokázaná schopnost bakterií měnit fyziologii hub 8) Využití bioreportérů pro prostorové a časové analýzy bakteriální mykofágie Zdokonalení těchto metod je klíčové pro možnost dalšího zkoumání mykofágního vztahu hub a bakterií, stejně tak jako pro stanovení doby rozkladu houbového mycelia nebo stanovení množství bakteriální biomasy vzniklé přeměnou z houbové biomasy. Předpokládá se, že je mykofágie významnější v prostředí chudém na živiny (Leveau a Preston 2008).
2.6.1 Extracelulární nekrotrofní bakterie Nektrotrofní bakterie vylučují proteiny nebo nízkomolekulární toxiny, které zvyšují propustnost buněčných membrán, způsobují ztrátu buněčné stěny, indukují buněčnou smrt nebo inhibují metabolismus hub, a tím dochází ke smrti buněk a k uvolněný jejich živin do okolí. Nekrotrofní bakterie mohou využívat kombinaci dvou a více z těchto mechanismů k zabití a konzumaci houbových buněk. Nekrotrofové vylučují toxiny nebo enzymy, které využívají k usmrcení houbových buněk s následným využitím chitináz, lipáz, glukanáz a proteáz k rozkladu a vstřebání polymerů hub. Bakterie používají také různé způsoby pro přichycení se na hostitelské houbě, včetně zapojení pilů a exopolysacharidů (Leveau a Preston 2008), nebo produkují různé biosurfaktanty, které snižují povrchové napětí na buněčné membráně a usnadňují tím kolonizaci povrchu hub (Nielsen a kol. 1999). Studie vypracovaná Budi a kol. (2000) potvrdila důležitost extracelulárních enzymů pro mykofágní aktivitu bakterií, zároveň ale poukázala na skutečnost, že je k inhibici růstu hub potřeba více mechanismů. Je také pravděpodobné, že se budou do značné míry překrývat molekulární mechanismy pro saprotrofní a nekrotrofní růst (Leveau a Preston 2008). Nekrotrofními bakterie jsou například myxobakterie. Tyto gramnegativní bakterie, někdy označované jako mikropredátoři, mají schopnost usmrtit různé půdní organismy, zejména bakterie a kvasinky. Produkují lytické enzymy a antibiotika, pomocí nichž se dostanou do buňky, kde rozštěpí a zkonzumují její obsah (Bull a kol. 2002, Reichenbach 1999). Dalšími mykofágními bakterie mohou být zástupci rodu Paenibacillus (Dijksterhuis a kol. 1999). V poslední době vzrůstá zájem o nekrotrofní bakterie kvůli jejich schopnosti zastavovat růst a zabíjet patogenní houby zemědělsky důležitých rostlin (Ajit a kol. 2006, Budi a 32
kol. 2000). Přesto je ale nutno tuto strategii biologické ochrany rostlin podrobněji prozkoumat (Leveau a Preston 2008).
2.6.2 Extracelulární biotrofní bakterie Extracelulární biotrofní bakterie nezabíjejí hyfy hub, ale žijí v jejich těsné blízkosti, často dokonce kolonizují jejich povrch a využívají živiny vylučované z houbových buněk. Rostoucí hyfy produkují směs nízkomolekulárních metabolitů, mezi něž patří odpadní látky, antimikrobiální látky a látky sloužící pro mobilizaci minerálů. Biotrofové jsou schopni tolerovat nebo potlačovat tvorbu antibakteriálních metabolitů houbami a mohou také upravovat metabolismus hub tak, aby podpořili uvolňování živin. Dokáží měnit fyziologii hub ve svůj prospěch, a to úpravou jejich vývoje, změnou propustnosti membrán a toků živin. Zvláště o změně vývoje a diferenciace hub se ví poměrně málo. Předpokládá se ale zapojení extracelulárních molekul produkovaných bakteriemi, například kyseliny indol-3-octové (IAA). Nejvýznamnější vlastnosti extracelulárních biotrofních bakterií jsou pravděpodobně schopnost chemotaxe, adheze na povrch hyf a odolnost k antimikrobiálním látkám. Dále také quorum sensing molekuly a quorum sensing inhibitory mohou významně ovlivňovat interakce mezi houbami a bakteriemi (Leveau a Preston 2008). Interakce extracelulárních biotrofů s houbami mohou mít pozitivní i negativní efekt na hostitelské organismy (Leveau a Preston 2008). Příkladem pozitivního vztahu mezi houbou a bakterií mohou být lišejníky, kde vzniká symbiotický vztah mezi houbou a sinicí (Honegger 2001, Richardson a Cameron 2004) nebo tripartitní vztah mezi houbou, řasou a sinicí, nazývaný cephalodia (Rai a kol. 1981). Fotosyntetizující bakterie poskytuje houbě organické látky a dusík, zatímco příspěvek hub do symbiotického vztahu není úplně jasný. Houba dodává pravděpodobně bakterii anorganické látky a vodu, a poskytuje pro ni protektivní prostředí (Leveau a Preston 2008).
2.6.3 Endocelulární biotrofní bakterie Dřívější mikroskopické studie naznačovaly přítomnost neznámých organismů v buňkách hub, které byly pojmenovány jako „bakteriím podobné organismy“ (BLOs) (Bianciotto a kol. 1996). S použitím sekvenčních metod byly tyto organismy později určeny jako endosymbiotické bakterie vyskytující se v cytoplasmě arbuskulárně mykorhizních hub (Bianciotto a Bonfante 2002). Endosymbiotické bakterie jsou v přírodě častější, než by se na první pohled 33
mohlo zdát. Nejsou výlučně jen kolonizátory arbuskulárně mykorhizních hub, ale vyskytují se také u jiných hostitelů (Barbieri a kol. 2002, Bertaux a kol. 2003, Bertaux a kol. 2005). Endocelulární biotrofní bakterie se množí uvnitř houbových buněk a vstřebávají živiny přímo z cytoplasmy. Jelikož se jedná o nekultivovatelné bakterie, není zatím jejich funkce v buňce zcela jasná. Pravděpodobně poskytují svému hostiteli důležité biochemické funkce výměnou za velmi výhodné prostředí. Studie Ruiz-Lozano a Bonfante (2001) prokázala u bakterií přítomnost nif genů, takže je pravděpodobné, že svou hostitelskou houbu zásobují dusíkem. Tyto výsledky ale zatím nebyly dostatečně potvrzeny (de Boer a kol. 2005). Další důležitou funkcí endocelulárních bakterií je jejich schopnost tvorby antimikrobiálních látek, které houby chrání před predátory a parazity a zároveň podporují jejich patogenezi k eukaryotním hostitelům (Leveau a Preston 2008). Bakterie jsou zcela závislé na svém hostiteli alespoň po dobu trvání endocelulárního soužití. Někteří endocelulární biotrofové jsou přenášeni vertikálně, zatímco fakultativní biotrofové mají mechanismy pro invazi do houbových buněk (Leveau a Preston 2008). Místem průniku bakterií mohou být koncové části hyf, kde není buněčná stěna natolik silná, aby zabránila bakteriálnímu osídlení. Vnitřní prostor hostitelů mohou osidlovat patogenní i nepatogenní druhy bakterií, které zároveň mohou kolonizovat také spory hub pomocí lytických enzymů nebo díky absenci hostitelské rostliny (Levy a kol. 2003, de Boer a kol. 2005). Zajímavá je schopnost vertikálního přenosu endosymbiontů mezi generacemi hub, která byla zkoumána na bakterii nově identifikovaného taxonu Candidatus Glomeribacter gigasporarum. Podle jedné z teorií došlo v minulosti k výjimečné události získání této endocelulární bakterie, která se následně přenášela mezi generacemi až do současnosti (Bianciotto a kol. 2003). Detailní studie byla provedena na endosymbiontech mykorhizní houby druhu Gigaspora marginata. S použitím universálních bakteriálních primerů a následné sekvenace byly endosymbiotické bakterie zařazeny do třídy Betaproteobacteria mezi rody Burkholderia, Pandoraea, Ralstonia a jejich blízké příbuzné (Bianciotto a kol. 2003). Obligátním endocelulárním parazitem je druh Candidatus Glomeribacter gigasporarum, který přežívá na mykorhizní houbě druhu Gigaspora margarita. Že se jedná o obligátního parazita, potvrzují i výsledky měření velikosti genomu bakterie, který patří mezi nejmenší z betaproteobakterií (Jargeat a kol. 2004). Jediným známým fotosyntetizujícím endosymbiontem hub je sinice rodu Nostoc. Houba druhu Geosiphon pyriformis, řadící se aktuálně k oddělení Glomeromycota, tvoří na koncích hyf měchýřky, vyskytující se na povrchu půdy. V těchto měchýřcích 34
jsou umístěny bakterie druhu Nostoc punctiforme, které uvnitř fotosyntetizují a fixují dusík (Schussler a kol. 1994). Tyto bakterie nemusí ovšem žít pouze jako endosymbionti, ale mohou se také vyskytovat volně v prostředí. K vytvoření symbiotického vztahu je potom nutné, aby se bakterie převedly do brzké fáze nepohyblivé formy, tzv. primordia, protože pozdější pohyblivé fáze už nejsou houbou rozpoznány. Houba bakterii následně inkorporuje (Kluge 2002).
2.7 Chitinolytické bakterie Chitin je po celulóze druhým nejrozšířenějším polymerem na Zemi (Duo-Chuan 2006), a zároveň hlavním stavebním prvkem buněčných stěn hub. Jedná se o heteropolysacharid skládající se z N-acetyl-D-glukozaminových (GlcNAc) a D-glukozaminových (GlcN) podjednotek spojených β-1,4-glykozidickou vazbou (Obr. 7) (Gortari a Hours 2008). V buněčných stěnách hub tvoří chitin komplexní struktury převážně s β-glukany (Patil a kol. 2000). Svojí chemickou strukturou odpovídá celulóze, kromě toho, že hydroxylová skupina na druhém uhlíku je nahrazena acetamidovou skupinou (Bhattacharya a kol. 2007). Modifikací chitinu je deacetylovaný chitosan, který vzniká působením chitin deacetylázy. Chitosan tvoří hlavní komponentu buněčných stěn u hub řádu Mucorales (Gooday 1994).
Obr. 7: Chemická struktura chitinu a chitosanu (upraveno dle Ravi Kumar (2000))
Byla prokázána přítomnost chitinu ve třech polymorfních formách, které se liší uspořádáním molekulových řetězců uvnitř krystalické mřížky. Nejčastější a také nejpevnější strukturou je α-chitin, vyskytující se v buněčné stěně hub (Dahiya a kol. 2006). V důsledku 35
existence různých forem chitinu existuje u bakterií široká škála enzymů, jejichž prostřednictvím vznikají produkty rozkladu, které jsou bakteriemi využívány jako zdroje uhlíku a energie (Gooday 1994). Tyto enzymy působí synergicky při rozkladu chitinového substrátu (Dahiya a kol. 2006).
2.7.1 Bakteriální chitinázy Chitinázy jsou hydrolytické enzymy, které rozkládají polymery chitinu na oligosacharidové podjednotky (Obr. 8). Jsou schopné degradovat také příbuzné polymery chitinu, jako například kyselinu N-acetylmuramovou (Bhattacharya a kol. 2007). Produkce chitináz je v přírodě řízena inducibilně v závislosti na zdrojích živin a vlastnostech prostředí (Dahiya a kol. 2006).
Obr. 8: Schéma rozkladu chitinu v buňce (upraveno dle Howard a kol. (2003))
Chitin je postupně rozkládán směsí mikrobiálních enzymů, které mohou být rozděleny do dvou skupin: 1) Endochitinázy, štěpící náhodně glykozidické vazby uvnitř polysacharidového řetězce. Jejich činností vznikají nízkomolekulární oligomery GlcNAc, jako jsou chitotetróza, chitotrióza nebo diacetylchitobióza. Vzniklý produkt závisí na povaze výchozího substrátu. 36
2) Exochitinázy, které mohou být rozděleny na chitobiozidázy a β-N-acetylglukozamidázy. Chitobiozidázy štěpí řetězec chitinu postupně od neredukujícího konce za vzniku dimeru diacetylchitobiózy. β-N-acetylglukozamidázy hydrolyzují diacetylchitobiózu a další oligomerní produkty rozkladu chitinu za vzniku monomeru GlcNAc (Bhattacharya a kol. 2007, Gortari a Hours 2008, Hodge a kol. 1995). Produkce chitináz je detekována u různých skupin organismů, u nichž plní chitinázy odlišné funkce. Bakteriální chitinázy hrají důležitou úlohu ve výživě a v parazitismu bakterií (Patil a kol. 2000). Půdní chitinolytické bakterie často zaměřují svou aktivitu proti živým houbovým hyfám. Proto je mezi chitinolytickými bakterie velmi rozšířen fakultativní mykoparazitismus (de Boer a kol. 1998). V parazitismu hrají chitinázy významnou roli při penetraci do hostitelského organismu a při vývoji onemocnění (Patil a kol. 2000). Enzymy s antifungální aktivitou působí především na vrcholy houbových hyf a na klíčící spory, kde rozkládají nascentní chitin (Gooday 1999). Zároveň je chitinolýza, tj. hydrolýza glykozidických vazeb chitinu pomocí chitináz, pravděpodobně nejdůležitější cestou degradace chitinu v půdě (de Boer a kol. 1998). Schopnost využívat chitin může být selektivní výhodou v prostředí chudém na živiny, kde jsou omezené zdroje dusíku. Obsah dusíku se v chitinu pohybuje kolem 6%, což z něj činí zásobárnu tohoto prvku pro chitinolytické bakterie (Hodge a kol. 1995). Bakteriální chitinázy jsou aktivní v širokém rozsahu teplot a pH, ale vždy v závislosti na vlastnostech bakterie, ze které jsou izolovány (Bhattacharya a kol. 2007).
2.7.2 Přehled chitinolytických bakterií Velké množství půdních bakterií produkuje chitinolytické enzymy (Patil a kol. 2000). Vláknité bakterie jsou schopny rychleji rozkládat chitin než nevláknité, což je patrně způsobeno zhoršenou schopností nevláknitých bakterií proniknout do substrátu. Chitinolytické bakterie mají určité vlastnosti, které jim pomáhají soupeřit při degradaci chitinu s houbami. Kromě produkce chitinolytických enzymů tvoří bakterie určitá antibiotika, která mohou inhibovat růst houbových rozkladačů, a tím prodloužit dobu, po kterou mohou sami využívat chitinové zbytky. Navíc může produkce antibiotik nastartovat autolýzu houbového mycelia. Také produkce jiných lytických enzymů, například glukanáz a proteáz, může ovlivnit antagonistické vztahy hub a bakterií. Zatím je zde ale málo důkazů o tom, zdali kombinace těchto lytických enzymů může inhibovat růst hub. Obecně platí, že chitinolytické bakterie působí spíše selektivně na určité houby, než že by měly nějaké obecné 37
antimykotické vlastnosti (de Boer a kol. 1998). Chitinázy mají komplexní strukturu, která je činí částečně citlivé k protelytickému rozkladu (Brurberg a kol. 2001). Proto houby vylučují různé antibiotické látky (allosamidin, psammaplin, argadin), které snižují účinnost bakteriálních chitináz (Dahiya a kol. 2006). Zimmerman a kol. (2013) analyzovali přes tři tisíce prokaryotických genomů, z nichž se pokoušeli zjistit, které taxony mají potenciální genetickou výbavu k produkci chitináz a acetylglukozamidáz. Výsledky ukázaly, že 36,9 % genotypů bakterií bylo schopno tvořit acetylglukozamidázy a 15,1 % chitinázy. Bakteriální taxony mající genetický potenciál pro tvorbu acetylglukozamidázy a chitinázy se nacházely v celém taxonomickém spektru, nicméně u některých kmenů (Proteobacteria, Actinobacteria, Firmicutes) a také rodů se vyskytovaly geny pro tvorbu těchto enzymů ve větším množství (Obr. 9).
Obr.
9:
Distribuce
prokaryotických
genomů
s
genetickým
potenciálem
produkce
acetylglukozamidázy (zelený kruh) a chitinázy (modrý kruh); šedé oblasti značí genotypy bez genetické výbavy k tvorbě těchto enzymů; žluté oblasti představují bakteriální rody: (1)
38
Enterococcus, (2) Burkholderia, (3) Vibrio, (4) Escherichia (upraveno dle Zimmerman a kol. (2013))
Gramnegativní bakterie se uplatňují v počáteční fázi rozkladu chitinu. Následně jsou pak nahrazeny grampozitivními bakteriemi, převážně aktinomycetami (Polyanskaya a kol. 2012). Aktinomycety jsou považovány za hlavní rozkladače houbových hyf a za významné producenty chitinolytických enzymů (Bhattacharya a kol. 2007, Lockwood 1968). Tato myšlenka je založena především na mikroskopickém pozorování kolonizace a rozkladu houbových hyf (de Boer a kol. 2005). Mitsutomi a kol. (1995) izolovali jako první bakteriální chitinázy na druhu Streptomyces griseus, které měly schopnost hydrolyzovat vazby mezi GlcN a částečně také N-acetylovaný chitosan. Postupem času byly izolovány i jiné chitinolytické streptomycety, které působily silně antagonisticky proti houbovým patogenům, což podpořilo zájem o další studie chitinolytických bakterií jako biokontrolních agens patogenních hub (Hoster a kol. 2005, El-Sayed a kol. 2000, Shekhar a kol. 2006, Yuan a Crawford 1995). Kromě streptomycet má schopnost rozkládat chitin také mnoho zástupců rodu Bacillus (BarbozaCorona a kol. 1999, Wang a kol. 2001, Wang a kol. 2002). Mezi další bakterie vykazující silnou chitinolytickou aktivitu se řadí zástupci rodů Serratia, Enterobacter, Aeromonas (Bhattacharya a kol. 2007), Nocardia (Paul 2007) a Burkholderia (Pichyangkura a kol. 2002). Druh Serratia marcescens je jedním z nejefektivnějších rozkladačů chitinu v přírodě. V přítomnosti chitinu produkuje celou škálu hydrolytických enzymů a proteinů vázajících chitin (Brurberg a kol. 2001). Dalšími významnými rozkladači hub jsou půdní myxobakterie (Reichenbach 1999). Studie de Boer a kol. (1998) zaznamenala nejčastější výskyt chitinolytických zástupců rodu Pseudomonas v půdách s nedostatkem vápna, zatímco ve vápenatých půdách převládaly zástupci rodů Xanthomonas a Cytophaga. Všechny tyto rody se řadily mezi nevláknité bakterie. Inhibice růstu hub byla zaznamenána také při kultivaci v přítomnosti fluorescenčních pseudomonád v médiu (Ajit a kol. 2006).
39
3 Cíle práce Tato práce sleduje několik cílů, které popisují proces rozklad houbového mycelia v lesní půdě.
Stanovení ztráty hmotnosti mycelií dvou druhů hub (T. felleus a Rusulla sp.) a mycelia T. felleus ve dvou půdních horizontech během rozkladu v půdě
Charakteristika chemických změn mycelií během rozkladu v půdě a porovnání prvkového složení mycelia hub s okolní půdou
Stanovení aktivity enzymů během rozkladu na myceliu a v půdě
Kvantifikace počtu bakterií na rozkládajícím se myceliu a v půdě
Identifikace bakteriálních izolátů, získaných z mycelií v různých fázích rozkladu, a stanovení jejich chitinázové aktivity
Stanovení složení bakteriálního společenstva na rozkládajícím se myceliu a porovnání složení bakteriálního společenstva ve dvou půdních horizontech
Popis sukcesních změn bakteriálního společenstva během degradace mycelií hub v půdě
Porovnání diverzity mikrobiálního společenstva na myceliích a v okolní půdě
40
4 Materiál a metody V následujících částech práce budou popsány dva experimenty označené jako Xaverov 1 a Xaverov 2, které probíhaly v letech 2010 až 2013. První experiment se zaměřuje především na určení rychlosti degradace houbového mycelia, chemických změn v průběhu rozkladu, stanovení enzymové aktivity a zabývá se také analýzou mikrobiálního společenstva na myceliu a v okolní půdě. Výsledky prvního experimentu posloužily jako vodítko k návrhu druhého experimentu. Ten se zaměřil především na komplexní analýzu bakteriálního společenstva kolonizujícího rozkládající se mycelia. Metody použité k těmto dvěma studiím se buď shodovaly, nebo byly použity jiné, v závislosti na požadovaných výsledcích experimentů.
4.1 Popis lokality a vzorkování Studie probíhala v listnatém lese v přírodní rezervaci Xaverovský háj poblíž Prahy (50°5`53.33``N, 14°36`51.58``E). Porost studované lokality tvořil výhradně dub zimní (Quercus petraea), který je zároveň typickým druhem původních lesů v nízké nadmořské výšce. Půdní typ představuje kyselý kambisol s rozvinutou opadovou vrstvou (pH 4,3; 46,2% C; 1,76% N), organickým horizontem (pH 3,7; 21,5% C; 0,56% N) a minerálním horizontem (pH 3,4; 14,3% C; 0,39% N). Průměrná roční teplota na povrchu půdy je 9,3 °C (Šnajdr a kol. 2011). Lyofilizované plodnice dvou druhů hub, hřibu žlučníku (Tylopilus felleus) a holubinky (Rusulla sp.), byly nastříhány na kostičky velikosti cca 4 x 4 x 4 mm. 3,0 g tohoto materiálu (mycelia) bylo umístěno do polyesterových sáčků velikosti 10 x 20 cm (velikost ok cca 1 x 2 mm), které byly následně sterilizovány gamma-zářením. V druhém pokusu byl použit pouze druh T. felleus. V prvním experimentu byly sáčky s myceliem („mykobagy“) hřibu a holubinky umístěny pod opadovou vrstvu a odebírány každých 14 dní po dobu osmi týdnů. Pro srovnání byla odebírána i okolní půda. V každém odběru byly brány 3 vzorky rozkládajícího se mycelia T. felleus a 3 vzorky půdy. Ve 4. a 8. týdnu byly navíc odebrány 3 vzorky mycelia Rusulla sp. a 3 vzorky okolní půdy. V druhém experimentu, kde se používalo pouze mycelia T. felleus, byly sáčky vloženy mezi opadovou vrstvu a organický horizont a mezi organický a minerálních horizont. Odběry probíhaly po 1, 2, 3, 9, 15 a 21 týdnech inkubace v půdě. Odebíraly se 41
opět jednotlivé mykobagy a okolní opad nebo půda pro srovnání (Tab. 1). Každý typ vzorku byl odebrán ve 4 paralelách. Houbová mycelia byla po vyjmutí z půdy očištěna a spolu se vzorky půdy uložena do sterilních zkumavek, které byly přemístěny do laboratoře pro další analýzy. Ze vzorků byly odstraněny kořínky a hmyz a degradované mycelium bylo homogenizováno rozstříháním na malé kousky. Vzorky byly použity pro stanovení úbytku substrátu, chemické analýzy, izolaci mikroorganismů, stanovení enzymové aktivity a pro extrakci DNA, ze které vycházely další metody. V laboratoři se vzorky uchovávaly při teplotě – 20 °C.
Tab. 1: Přehled experimentu Xaverov 1 a Xaverov 2
Datum Xaverov 1
Xaverov 2
Listopad 2010 – leden 2011
Únor 2012 – srpen 2012
Odběry (týden)
Materiál
Umístění
Počet vzorků
0, 2, 4, 6, 8
Tylopilus felleus Rusulla sp.
Opad/organický horizont
44
Tylopilus felleus
Opad/organický horizont Organický/minerální horizont
108
0, 1, 2, 3, 9, 15, 21
4.2 Kultivace bakterií Ze vzorků z druhého experimentu (Xaverov 2) byly po 3, 9 a 21 týdnech inkubace v půdě izolovány bakterie. Bakteriální kolonie byly spočítány a byl u nich stanoven CFU/g suché hmotnosti mycelia. U náhodně vybraných bakteriálních izolátů byla následně stanovena jejich chitinázová aktivita a tyto izoláty byly potom sekvenovány, aby se zjistila jejich taxonomická příslušnost. Cílem izolace bylo specificky identifikovat bakterie, asociované s myceliem hub. Proto bylo k přípravě izolačního média použito 100 g lyofilizovaných žampionů (Agaricus bisporus), které byly uvařeny v 1 l destilované vody. Vzniklý vývar byl doplněn na objem 1000 ml destilovanou vodou a jeho pH bylo upraveno na hodnotu 5. Kultivační médium o objemu 1000 ml bylo složeno ze 100 ml žampionového vývaru a 20 g agaru. Médium bylo sterilizováno autoklávováním 20 min při 121 °C a po zchladnutí na 55 °C bylo přidáno 20 42
mg/L cykloheximidu pro potlačení růstu hub (sterilizace filtrací). Pro kultivační testy se používalo médium bez přídavku antibiotika, pro stanovení chitinázové aktivity médium s antibiotikem. Médium byla nalito do 9-cm Petriho misek ve výšce cca 3-4 mm a nechalo se zatuhnout. 0,5 g mycelia nebo půdy bylo extrahováno 50 ml sterilního 25 % Ringerova roztoku (2,25 g NaCl, 0,105 g KCl, 0,045 g CaCl2, 0,05 g NaHCO3, 0,034 g kyseliny citronové v 1000 ml destilované vody). Extrakce probíhala po dobu 10 min na třepačce. Z extraktu a sterilní vody byla připravena ředící řada (neředěný vzorek až ředění 10-7). Pro výsev na misky bylo použito 50 µl vzniklého extraktu, který byl rozetřen po povrchu sterilní kličkou. Na každou misku připadalo jedno ředění a misky byly ve 3-4 paralelách podle počtu vzorků. Kultivace probíhala při 12 °C cca 1 týden dle rychlosti růstu bakterií. Po kultivaci byly vyhodnoceny pouze misky, na nichž bylo přítomno počitatelné množství kolonií, které měly dostatečnou velikost. Kolonie na miskách s vhodným ředěním byly spočítány a počet bakteriálních kolonií (CFU) byl vyjádřena na 1 g suché hmotnosti půdy. Výběr bakteriálních kolonií pro další analýzu závisel na jejich morfologických vlastnostech a jejich relativním zastoupení.
4.3 Fyziologické a biochemické metody 4.3.1 Stanovení úbytku substrátu a elementární analýza Ke stanovení rychlosti rozkladu houbového mycelia bylo nejprve mycelium důkladně očištěno a následně lyofilizováno. Takto upravené mycelium bylo zváženo a rychlost jeho rozkladu byla vypočítána porovnáním s počáteční hmotností. Vlhkost mycelia byla stanovena jako podíl hmotnosti vzorku před a po lyofilizaci. Prvkové složení mycelia, opadu a půdy, konkrétně obsah organické hmoty, uhlíku a dusíku, byly stanoveny v externí laboratoři.
4.3.2 Stanovení enzymové aktivity Enzymová aktivita byla stanovena spektrofotometricky s využitím fluorescenčně značených substrátů. Byly použity vysoce fluorescenční deriváty 4-methylumbellyferolu a 7amino-4-methylkumarinu. Fluorescence byla pozorována po enzymatickém štěpení komplexního substrátu. Takto byla stanovena aktivita α-glukozidázy, β-glukozidázy, fosfomonoesterázy (fosfatázy), N-acetylglukozamidázy (chitinázy), exocelulázy (celobiohydrolázy), β-
43
xylozidázy, β-manozidázy a α-galaktozidázy, alanin-aminopeptidázy, leucin-aminopeptidáza a lipázy ve vzorcích mycelií a půdy. Fluorescenčně značené substráty a jejich využití při stanovení:
1,0 mM MUF a 1,0 mM AMC (kalibrace); 2,75 mM MUFG (pro stanovení β-glukozidázy); 2,75 mM MUFP (fosfatázy); 1,0 mM MUFN (chitinázy); 2,5 mM MUFC celobiohydrolázy; 2,5 mM MUFaG (α-glukozidázy); 2,5 mM MUFX (β-xylozidázy); 2,5 mM AMCA (alanin-aminopeptidázy); 2,5 mM AMCL (leucin-aminopeptidázy); 2,5 mM MUFM (β-manozidázy); 2,5 mM MUFL (α-galaktozidázy); 2,5 mM MUFY (lipázy)
DMSO V 50 ml octanového pufru pH 5 (2,78 g octanu sodného, 900 µl kyseliny octové
a 1000 ml destilované vody) bylo extrahováno 0,5 g homogenizovaného vzorku. Následně bylo na mikrotitrační destičku do příslušných jamek napipetováno 40 µl daných substrátů a kalibračních roztoků v uvedeném ředění (Tab. 2). K MUFG a MUFP bylo přidáno ještě 20 µl DMSO, aby se zvýšila jejich rozpustnost. Nakonec bylo do každé jamky doplněno ještě 200 µl vzorku půdy nebo mycelia a takto připravená destička byla inkubována v termostatu při teplotě 40 °C. Fluorescence se načítala po 5 min, 35 min a 125 min na spektrofotometru Infinitive 200 (Tecan) s využitím softwaru Magellan při vlnové délce excitace 355 nm a emise 460 nm.
Tab. 2: Mikrotitrační destička s umístěním substrátů a kalibračních roztoků 1 A
B C D E F G H
2
3
4
5
6
7
8
9
1
1
1
1
2
2
2
2
MUFG
MUFG
MUFG
AMCA
MUFG
MUFG
MUFG
AMCA
10 1
11 2
12 1
2
1
1
1
1
2
2
2
2
1 +2ul
2 +2ul
1 +10ul
2 +10ul
MUFaG
MUFaG
MUFaG
AMCA
MUFaG
MUFaG
MUFaG
AMCA
AMC1/100
AMC1/100
MUF1/100
MUF1/100
1
1
1
1
2
2
2
2
1 +5ul
2 +5ul
1 +20ul
2 +20ul
MUFC
MUFC
MUFC
AMCA
MUFC
MUFC
MUFC
AMCA
AMC1/100
AMC1/100
MUF1/100
MUF1/100
1
1
1
1
2
2
2
2
1 +10ul
2 +10ul
1 +50ul
2 +50ul
MUFX
MUFX
MUFX
AMCL
MUFX
MUFX
MUFX
AMCL
AMC1/100
AMC1/100
MUF1/100
MUF1/100
1
1
1
1
2
2
2
2
1 +20ul
2 +20ul
1 +20ul
2 +20ul
MUFN
MUFN
MUFN
AMCL
MUFN
MUFN
MUFN
AMCL
AMC1/100
AMC1/100
MUF 1/10
MUF 1/10
1
1
1
1
2
2
2
2
1 +50ul
2 +50ul
1 +50ul
2 +50ul
MUFM
MUFM
MUFM
AMCL
MUFM
MUFM
MUFM
AMCL
AMC1/100
AMC1/100
MUF 1/10
MUF 1/10
2 +10ul
1
1
1
2
2
2
1 +10ul
2 +10ul
1 +10ul
MUFP
MUFP
MUFP
MUFP
MUFP
MUFP
AMC 1/10
AMC 1/10
MUF
MUF
1
1
1
2
2
2
1 +20ul
2 +20ul
1 +20ul
2 +20ul
MUFL
MUFL
MUFL
MUFL
MUFL
MUFL
AMC 1/10
AMC 1/10
MUF
MUF
44
4.3.3 Stanovení chitinázové aktivity Chitinázová aktivita bakteriální izolátů byla stanovena spektrofotometricky s využitím fluorescenčně značeného substrátu MUFN. Vybrané bakteriální kolonie na agarové plotně byly přeočkovány na novou plotnu se žampionovým médiem a přídavkem antibiotika a kultivovány při 12 °C několik dní. Po nárůstu bakteriálních kolonií byly izoláty přemístěny na hranaté misky s žampionovým médiem, kde byly následně přelity 4 ml 2,75 mM roztokem substrátu MUFN ve 40 ml 1 % nízkotající agarózy (0,4 g agarózy a 40 ml octanového pufru (pH 5)) při teplotě max. 40 °C. Misky se nechaly zatuhnout několik minut a potom byly ihned umístěny do spektrofotometru Infinitive 200 (Tecan). Fluorescence se načítala v pěti cyklech po deseti minutách při teplotě 40 °C. Výsledky byly vyhodnoceny s využitím softwaru Magellan v relativních fluorescenčních jednotkách při výše uvedených hodnotách excitace a emise.
4.4 Molekulární metody 4.4.1 Izolace DNA K extrakci DNA byla použita modifikovaná metoda SV popsaná autory SagovaMareckova a kol. (2008). Do sterilní zkumavky se skleněnými kuličkami (0,25 g kuliček s průměrem 0,1 mm a 0,25 g kuliček s průměrem 0,5 mm) bylo naváženo přibližně 0,2 g vzorku půdy, opadu nebo mycelií. Ke vzorku bylo následně přidáno 400 µl 1 M CaCO3, promícháno a inkubováno ve 4 °C přes noc. Poté bylo ke vzorku přidáno 400 µl extrakčního pufru (50 mM NaH2PO4 (pH 8), 50 mM NaCl, 500 mM Tris-HCl (pH 8) a 5% SDS), 100 µl fenolu (pH 8) a 100 µl chloroform/izoamylalkoholu (v poměru 24:1). Tato směs byla homogenizována po dobu 10 minut na vortexu v horizontální poloze a následně centrifugována 3 min při 12200 g. Supernatant byl odebrán do čisté 1,5 ml zkumavky (mikrozkumavky), kde k němu byl přidán fenol (0,5 objemu supernatantu) a chloroform/izoamylalkohol (0,5 objemu supernatantu). Směs byla důkladně protřepána a stočena 5 min při 6000 g. Supernatant byl znovu přemístěn do čisté mikrozkumavky, extrahován směsí chloroform/izoamylalkohol (1 objem supernatantu), důkladně protřepán a stočen 5 min při 6000 g. Poté byl supernatant odebrán do čisté 2 ml zkumavky a byl k němu přidán 6 M NaCl (1/3 objemu supernatantu) a 10 % CTAB v 0,7 M NaCl (1/10 objemu supernatantu). Směs byla promíchána a inkubována
45
30 minut při teplotě 65 °C. Po ochlazení na laboratorní teplotu byl ke směsi přidán chloroform/izoamylalkohol (1 objem supernatantu) a stočen 20 min při 3400 g. Supernatant byl následně přenesen do nových mikrozkumavek, v nichž byl srážen směsí izopropanolu (0,6 objemu supernatantu) a 3 M octanu sodného pH 4,8 (0,1 objemu supernatantu). Srážení směsi probíhalo alespoň 30 minut při laboratorní teplotě. Poté byla směs stočena 20 min při 12200 g. Vzniklá kapalina byla odstraněna a sediment byl promyt 200 µl studeného 70 % etanolu. Směs byla následně promíchána a centrifugována 20 min při 12200 g. Vzniklý supernatant byl opět odstraněn a sediment byl sušen po dobu 4 minut v přístroji SpeedVac a potom rozpuštěn v 50 µl sterilní deionizované vody. Izolovaná DNA byla přečištěna použitím GeneClean Turbo Kit. Před purifikací DNA byla ke vzorku přidána směs 1 M HEPES/ 1 M CaCl2 (pH 7) a směs byla inkubována 5 minut při laboratorní teplotě. Zbývající kroky purifikace probíhaly podle pokynů výrobce. Koncentrace DNA byla změřena na NanoDrop 1000 Spectrophotometr (Thermo Scientific) nebo fluorimetricky na přístroji Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies) s použitím barvení interkalačními agens. Výsledky extrakce DNA byly zobrazeny agarózovou gelovou elektroforézou. Byl připraven 1 % agarózový gel (0,5 g agarózy v 50 ml 1x TAE pufru). Zásobní roztok 50 x TAE pufru byl složen z 242 g Tris pufru, 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8), 57,1 ml ledové kyseliny octové a deionizované vody k doplnění na objem 1 l. Směs agarózy a TAE pufru byla zahřáta k bodu varu a udržována v tomto stavu, dokud se všechna agaróza nerozpustila. Poté byla ochlazena na přibližně 55 °C. Agarózový gel byl následně nalit do vaničky příslušné velikosti a bylo k němu přidáno 10 µl ethidium bromidu (1 % ethidium bromid : deionizovaná voda v poměru 1 : 10) a hřeben k vytvoření jamek pro zavádění vzorků. Gel se nechal zatuhnout přibližně 30 minut a poté byl umístěn do nádrže s 1x TAE. Do první jamky gelu byly naneseny 4 µl tzv. velikostního markeru (hmotnostní standard) O'GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder. Ke 4 µl vzorku byly přidány 3 µl 6x DNA Loading Dye a směs byla přenesena do zbylých jamek gelu. Elektroforéza byla puštěna přibližně 35 min při 90 V. Poté byly výsledky vizualizovány na transluminátoru a vyhodnoceny.
46
4.4.2 Terminální polymorfismus délky restrikčních fragmentů („Terminal restriction fragment length polymorphism“, T-RFLP) Pro orientační stanovení vzájemné podobnosti a diverzity mikrobiálních společenstev ve vzorcích mycelia, půdy a opadu byla použita metoda T-RFLP. Fluorescenčně značený primer je použit k amplifikaci purifikované DNA. Směs PCR produktů je hydrolyticky štěpena restrikční endonukleázou, přičemž vznikají různě dlouhé fragmenty DNA. Tyto fragmenty jsou na konci označeny fluorescenční značkou. Rozdíly v délce fragmentů jsou vizualizovány na elektroforéze v automatizovaném DNA sekvenátoru. Sekvenátor zaznamená kromě délky fragmentů také jejich relativní četnost. Vzniklý záznam (elektroforeogram) představuje profil („fingerprint“) studovaného mikrobiálního společenstva. Hlavním cílem metody T-RFLP je stanovit rozdíly mezi DNA profily získanými z různých společenstev (Marsh 1999). Pro analýzu bakteriální DNA byly vzorky amplifikovány s použitím primerů 16Seu27f (značení barvivem HEX) a 1492r cílené na eubakteriální 16S rDNA geny. Pro analýzu houbového společenstva byly použity primery ITS1f (značení HEX) a ITS4 (značení FAM) cílené k amplifikaci oblasti ITS1 a ITS2. Primery 27f a ITS1 byly fluorescenčně značeny 5-hexachlorfluoresceinem (HEX), primer ITS4 6-karboxyfluoresceinem (FAM) na 5’ konci. V PCR boxu byla připravena reakční směs o objemu 25 µl. Reakční směs byla následně amplifikována v termocykleru za níže uvedených podmínek. Sekvence primerů
ITS1f:
5’- HEX - CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA - 3’
ITS4r:
5’- FAM - TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3’
16Seu27f:
5’- HEX - AGAGTTTGATCMTGGCKCAG - 3’
1492r:
5’- TACGGYTACCTTGTTACGACTT - 3’
Reakční směs (bakterie)
Reakční směs (houby)
12,5 µl PPP-mix
12,5 µl PPP-mix
0,5 µl primer 27f (HEX, 10 µM)
0,5 µl primer ITS1f (HEX, 10 µM)
0,5 µl primer 1492r (10 µM)
0,5 µl primer ITS4 (FAM, 10 µM)
10,5 µl sterilní voda
10,5 µl sterilní voda
1 µl templátová DNA (2-50 ng/µl)
1 µl templátová DNA (2-50 ng/µl)
47
Průběh PCR amplifikace (bakterie)
Průběh PCR amplifikace (houby)
95 °C / 5 min
95 °C / 4 min
35 cyklů: 95 °C / 30 s
34 cyklů: 95 °C / 1 min
55 °C / 1 min
52 °C / 1 min
72 °C / 90 s
72 °C / 2 min
72°C / 10 min
72 °C / 10 min
4 °C -
4 °C -
Výsledky amplifikace byly ověřeny použitím agarózové gelové elektroforézy (viz. 4.4.1). Při elektroforéze nebylo v tomto případě nutné přidávat k PCR produktům 6x DNA Loading Dye, neboť byl již obsažen v PPP-mixu. Po ověření přítomnosti amplikonů DNA byly PCR produkty štěpeny pomocí restrikčních endonukleáz NlaIII a AluI. Do mikrozkumavky byly přidány chemikálie o celkovém objemu 25 µl. Reakční směs (bakterie)
Reakční směs (houby)
16,5 µl sterilní voda
16,5 µl sterilní voda
2,5 µl 10x NEBuffer 4
2,5 µl 10x NEBuffer 4
0,5 µl 100x BSA (10 mg/ml)
0,5 µl 100x BSA (10 mg/ml)
0,5 µl AluI (5 jednotek)
0,5 µl NlaIII (5 jednotek)
5 µl PCR produktu
5 µl PCR produktu
Směs byla inkubována při 37 °C 1 hod a poté byly restrikční endonukleázy inaktivovány při 65 °C po dobu 20 min. Následně byly vzorky přečištěny MinElute PCR Purification kitem. Takto připravené vzorky byly analyzovány na kapilárním sekvenátoru v externí laboratoři. Výsledné hodnoty délky restrikčních fragmentů a jejich intenzity byly zpracovány pomocí programu GeneMarker.
4.4.3 Kvantitativní PCR (qPCR) Ke kvantifikaci bakterií byla použita metoda kvantitativní PCR. Metoda je založena na kombinované amplifikaci a detekci cílové nukleové kyseliny pomocí světelného signálu z fluoroforů. Během každého cyklu je zaznamenám nárůst počtu amplikonů ve vzorku jako 48
zvýšení fluorescenčního záření emitovaného fluoroforem SYBR green, což je nespecifický interkalátor, který se začleňuje do vznikajícího řetězce DNA během PCR reakce. Detekce amplikonů během časné exponenciální fáze umožňuje kvantifikaci počtu transkriptů, které jsou úměrné koncentraci templátové DNA (Smith a Osborn 2009). Pro PCR reakci byla použita optická PCR destička. Každá jamka destičky obsahovala reakční směs o celkovém objemu 15 µl (Tab. 3). Jednotlivé vzorky byly přítomny v triplikátech. Za standard byl použit klonovaný gen 16S rDNA bakterie kmene Streptomyces lincolnensis DNS 40335. Negativní kontrola obsahovala místo templátové DNA sterilní vodu. DNA byla amplifikována s využitím fluorescenčních primerů 1108f a 1132r, specifických pro bakteriální 16S rDNA. Amplifikace probíhala v StepOne Plus cykleru (Applied Biosystems) za níže uvedených podmínek. K vyhodnocení výsledků – výpočtu počátečního počtu sekvencí amplifikovaného genu – byl použit StepOne Software v2.1 (Applied Biosystems). Tab. 3: Optická PCR destička s umístěním negativní kontroly (NK), standardů v příslušném ředění (St) a jednotlivých vzorků (1-24). Ředění standardů 100 až 10-6. 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
NK
St-1
St-4
1
3
6
9
11
14
17
19
22
B
NK
St-2
St-4
1
4
6
9
12
14
17
20
22
C
NK
St-2
St-5
1
4
7
9
12
15
17
20
23
D
St
St-2
St-5
2
4
7
10
12
15
18
20
23
E
St
St-3
St-5
2
5
7
10
13
15
18
21
23
F
St
St-3
St-6
2
5
8
10
13
16
18
21
24
G
St-1
St-3
St-6
3
5
8
11
13
16
19
21
24
H
St-1
St-4
St-6
3
6
8
11
14
16
19
22
24
Sekvence primerů
1108f (F primer)
5’- ATGGYTGTCGTCAGCTCGTG - 3’
1132r (R primer)
5’- GGGTTGCGCTCGTTGC- 3’
Reakční směs (bakterie)
Průběh PCR amplifikace (bakterie)
7,5 µl SYBR green master mix
56 °C / 2 min
0,6 µl BSA (10 mg/ml)
95 °C / 10 min
0,9 µl F primer (5 µM)
40 cyklů: 95 °C / 15 s
0,9 µl R primer (5 µM)
4,1 µl sterilní voda
1 µl templátová DNA
60 °C / 1 min
49
4 °C -
4.4.4 Sekvenace bakteriálních izolátů Biomasa bakteriálních izolátů z 3, 9 a 21 týdne byla odebrán do mikrozkumavky, do které bylo přidáno 300 µl deionizované vody. Vzorky byly důkladně rozmíchány a inkubovány v termostatu při 95 °C 10 min. Následně byly ochlazeny na laboratorní teplotu a opět inkubovány za stejných podmínek. Po ochlazení byl 1 µl této suspenze použit na přípravu reakční směsi o celkovém objemu 50 µl. K amplifikaci rDNA byly použity univerzální bakteriální primery pro oblast 16S rDNA: 27f a 1492r, amplifikace probíhala za níže uvedených podmínek. Sekvence primerů
27f:
5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’
1492r:
5’- TACGGYTACCTTGTTACGACTT - 3’
Reakční směs (bakterie)
Průběh PCR amplifikace (bakterie)
5 µl 10x Buffer s přídavkem MgCl2
94 °C / 2 min
1 µl PCR Nucleotide Mix (10 mM)
35 cyklů: 94 °C / 30 s
2 µl primer 27f (10 pmol/µl)
55 °C / 1 min
2 µl primer 1492r (10 pmol/µl)
72 °C / 90 s
3 µl BSA (10 mg/ml)
72 °C / 10 min
36,5 µl sterilní voda
4 °C -
1,5 µl Dynazyme II polymeráza (3 jednotky)
1 µl templátové DNA
Výsledky amplifikace byly ověřeny použitím agarózové gelové elektroforézy (viz. 4.4.1). Vzorky dostatečné délky (cca 1450 bp) byly po amplifikaci přemístěny na 96-ti jamkovou destičku a s přiloženým primerem 1492r odeslány do externí laboratoře na vyhodnocení (Macrogen, Korea). Získané sekvence byly manuálně upraveny pomocí programu BioEdit
7.1.3.0.
Sekvence
klonů
byly
srovnány
s
databází
GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) prostřednictvím algoritmu BLAST („Basic Local Alignment Search Tool“) pro určení přibližné fylogenetické příbuznosti. Izoláty mající podobnost větší než 98 % vůči známé sekvenci v databázi byly zařazeny do druhu, ostatní do vyšších taxonomických jednotek. 50
Pro přesné určení fylogenetického zařazení jednotlivých sekvencí byl zkonstruován fylogenetický strom sekvencí izolátů a známých sekvencí z Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu) metodou Neighbor-Joining. Výsledky analýzy bootstrap testu o 2000 opakování jsou uvedeny u jednotlivých větví, pokud byla hodnota 80 % a vyšší. Celkově bylo analyzováno 65 sekvencí o 428 bp. Analýza byla provedena v programu MEGA5. Podobné sekvence byly získány z databáze Ribosomal Database Project.
4.4.5 454-pyrosekvenace bakterií Složení a diverzita bakteriálního společenstva kolonizujícího rozkládající se houbová mycelia, respektive přítomného v okolní půdě či opad, byly analyzovány metodou 454-pyrosekvenace. Amplifikace cílové bakteriální sekvence probíhá ve dvou krocích. V prvním kroku dochází k normální amplifikaci cílové sekvence bakterií. V druhém kroku nastává ligace bakteriální sekvence s použitím značených primerů, s cílem získat amplikonovou knihovnu pro 454-pyrosekvenaci. Po tomto druhém kroku jsou jednotlivé fragmenty amplifikované DNA navázány na kuličky za podmínek, které zvýhodňují vazbu pouze jednoho fragmentu dostatečné velikosti. Kuličky jsou izolovány a rozděleny do kapiček v emulzní PCR. V každé kapce dochází k PCR amplifikaci, což má za následek, že každá kulička nese až 10 milionů kopií shodné DNA templátu. Po rozbití emulze dochází k denaturaci vláken DNA a kuličky nesoucí jednořetězcové DNA templáty jsou obohaceny a uloženy do jamek optické destičky, ve které probíhá pyrosekvenace. Menší kuličky nesoucí imobilizované enzymy potřebné pro další pyrosekvenační kroky jsou do jamek destičky uloženy také. Samotná sekvenace je založena na měření vyprodukovaného záření při postupné inkorporaci jednotlivých nukleotidů do templátového řetězce na základě komplementarity bazí (Rothberg a Leamon 2008). Amplifikace variabilních oblastí V4-V6 bakteriální 16S rDNA byla provedena s primery eub530f a eub1100br (modifikován dle Dowd a kol. (2008)) za použití DNA, získané ze vzorků mycelia, opadu a půdy, jako templátu. Izolovaná a přečištěná DNA byla použita pro primární PCR. Při primární PCR bylo nutné udělat 3 nezávislé paralelní PCR reakce o objemu 25 µl, aby byly omezeny náhodné efekty v PCR reakci. Úspěšnost PCR byla ověřena na elektroforéze (viz. 4.4.1). Sekvence primerů
Eub530f:
5’- GTGCCAGCA/GGCCGCGG - 3’ 51
Eub1100br:
5’- GGGTTNCGNTCGTTGCG - 3’
Reakční směs (bakterie)
Průběh PCR amplifikace (bakterie)
2,5 µl 10x Buffer pro DyNAzyme II
94 °C / 5 min
DNA polymerázu
35 cyklů: 94 °C / 1 min
1,5 µl BSA (10 mg/ml)
62 °C / 1 min
0,5 µl PCR Nucleotide Mix (10 mM)
72 °C / 1 min
1µl primer eub530f (10 pmol/µl)
72 °C / 10 min
1µl primer eub1100br (10 pmol/µl)
4 °C -
0,75 µl 4% Pfu polymeráza v DyNAzyme II DNA polymeráze (2 jednotky/µl)
16,75 µl sterilní voda
1 µl templátová DNA (5-50 ng/µl)
Tyto 3 paralely byly sloučeny do jednoho vzorku o objemu cca 75 µl. Ten byl následně přečištěn a zakoncentrován pomocí MinElute PCR Purification kitu (Quigen) a byla stanovena jeho koncentrace. Produkt primární PCR reakce sloužil jako templát pro sekundární PCR. Při sekundární PCR byl použit fúzní primer eub530f s identifikační značkou (tagem) a sekvencí adaptéru pro 454-pyrosekvenaci a primer eub1100br se sekvencí adaptéru pro 454-pyrosekvenaci. Každý vzorek obsahoval primer s jiným tagem. Celkový objem reakční směsi byl 50 µl. Úspěšnost PCR byla ověřena na elektroforéze (viz. 4.4.1).
Reakční směs (bakterie)
Průběh PCR amplifikace (bakterie)
5 µl 10x Buffer pro DyNAzyme II
94 °C / 5 min
DNA polymerázu
10 cyklů: 94 °C / 1 min
1,5 µl DMSO
64 °C / 1 min
1 µl PCR Nucleotide Mix (10 mM)
72 °C / 1 min
0,4 µl primer eub530f (10 pmol/µl)
52
72 °C / 10 min
0,4
µl
primer
eub1100br
(10
4 °C -
pmol/µl)
1,5 µl 4% Pfu polymeráza v DyNAzyme II DNA polymeráze (2 U/µl)
38,2 µl sterilní voda
2 µl templátová DNA (50-100 ng/µl)
K odstranění malých fragmentů byly PCR produkty upraveny pomocí AMPure Beads (Beckman Coulter). Do mikrozkumavky bylo přidáno 88 µl AMPure Beads a zkumavky byly vloženy do magnetického stojánku („Magnetic Particle Concentrator“, MPC). Po navázání kuliček na stěnu zkumavky byl odebrán supernatant a ke kuličkám bylo přidáno 88 µl Sizing Solution. Obsah zkumavky byl promíchán a do zkumavky bylo přidáno 40 µl PCR produktu. Směs byla inkubována při laboratorní teplotě 5 minut. Poté byla zkumavka opět vložena na MPC, byl odstraněn supernatant a kuličky byly 2x promyty 500 µl 70 % etanolu. Po promytí se kuličky nechaly vyschnout při 37 °C cca 15 min a DNA bylo následně eluováno 10 µl 1x TE pufru. Byla stanovena koncentrace jednotlivých vzorků (viz. 4.4.1) a byl připraven ekvimolární směsný vzorek, který obsahoval přibližně 2500 ng DNA. Tento vzorek byl separován na fragmenty určité délky pomocí 1,5 % gelové agarové elektroforézy a izolován z gelu prostřednictvím kitu Wizard SV Gel and PCR Clean-up System. Po extrakci byl vzorek zdenaturován při 95 °C 2 min, ochlazen na ledu a opět přečištěn pomocí AMPure Beads. K převedení DNA z TE pufru do vody byl vzorek opět přečištěn MinElute PCR Purification kitem, přičemž DNA bylo z kolonky extrahováno 10 µl sterilní vody. Poté byla opět stanovena koncentrace vzorku (viz. 4.4.1). Před emulzní PCR byly kopie genů kvantifikovány využitím Kapa Library Quantification Kit dle pokynů výrobce. Emulzní PCR byla připravena podle manuálu emPCR Amplification Method Manual Lib-L (Roche) pro GS Junior Titanium Series. V prvním kroku emulzní PCR došlo k ligaci AMP primeru na PCR produkt s MID adaptorem, což umožnilo zachycení DNA na kuličky („DNA Capture Beads“). Následně byla provedena amplifikace cílových molekul DNA navázaných na kuličky. Průběh PCR amplifikace
94 °C / 4 min 53
50 cyklů: 94 °C / 30 s 58 °C / 4,5 min 68 °C / 30 s
10 °C Kuličky s navázanou DNA byly přemístěny do 50 ml zkumavky a několikrát promyty
pufrem Enhancing Buffer, izopropanolem a etanolem. Sediment byl přesunut do čisté mikrozkumavky a byl k němu přidán Melt Solution (125 µl NaOH v 9,875 ml vody), který způsobil oddělení DNA řetězců. Pomocí Enrich primeru, který se navázal na volný konec DNA, byly k DNA připojeny magnetické kuličky („Enrich Magnetic Beads“). Směs byla několikrát promyta Enhancing pufrem kvůli odstranění špatně připojené DNA. „DNA Capture Beads“ byly následně odstraněny přidáním Melt Solution. Supernatant obsahující obohacené DNA s magnetickými kuličkami byl přesunut do nové zkumavky a byl k němu přidán Seq primer. Následně byla emulze rozrušena, DNA denaturována a kuličky nesoucí jednořetězcovou DNA byly přesunuty do jamek optické destičky („PicoTiterPlate“), přičemž v každé jamce byla přítomna pouze jedna kulička s navázanou DNA. Na optickou destičku byly přidány také kuličky nesoucí enzymy potřebné pro další pyrosekvenační kroky. Samotná sekvenace byla provedena dle pokynů výrobce s využitím Sequencing Method Manual (Roche) pro GS Junior Titanium Series. Pyrosekvenační reakce probíhá s použití směsi jednořetězcového DNA templátu, sekvenčního primeru, DNA polymerázy, ATP sulfurylázy, luciferázy, PPázy, apyrázy a substrátů APS a luciferinu (Obr. 10). První z deoxynukleotidů (dNTP) je přidán k sekvenační reakci a DNA polymeráza katalyzuje jeho připojení k DNA řetězci na základě komplementarity bazí. Postupným vkládáním dalších dNTP spojovaných fosfodiesterovou vazbou vzniká pyrofosfát (PPi), jehož kvalita závisí na množství inkorporovaných nukleotidů. Enzym ATP sulfuryláza přeměňuje PPi na ATP v přítomnosti APS. ATP je použito ke konverzi luciferinu na oxyluciferin v přítomnosti luciferázy. To vede k produkci záření, které svou intenzitou odpovídá množství použitého ATP. Záření, detekované CCD kamerou, je zaznamenáno do pyrogramu. Výška každého vrcholu (píku) pyrogramu odpovídá množství zavedených nukleotidů. Systém je regenerován apyrázou, která rozkládá ATP a nezačleněné nukleotidy, a PPázou, která degraduje pyrofosfát. Produkce signálu značí, který nukleotid je následně přítomen v sekvenci. S probíhající reakcí roste velikost komplementárního řetězce DNA, jehož nukleotidová sekvence je stanovena podle signálních vrcholů (Siqueira a kol. 2012). 54
Obr.10: Schéma pyrosekvenační reakce (upraveno dle Siqueira a kol. (2012))
Pyrosekvenací bylo získáno 176 497 sekvencí části bakteriální 16S rDNA dostatečné kvality a délky. Pyrosekvenační data byla vyhodnocena pomocí optimalizovaného postupu a s využitím programu SEED (Větrovský a Baldrian 2013). Odstranění nekvalitních sekvencí a snížení pyrosekvenačního šumu (tedy chybovosti metody) bylo provedeno programem MOTHUR64
(Schloss
a
kol.
2009).
Pomocí
programu
UCLUST
(http://www.drive5.com/usearch/) byly odstraněny chimerické sekvence, tedy sekvence, vzniklé při kombinované amplifikaci více templátů, což vedlo k reálnějšímu odhadu diverzity společenstva. Poté byly sekvence zkráceny na stejnou délku 380 bp. Programem USEARCH (Edgar 2010) byly sekvence sdruženy do klastrů, odpovídajících 97 % hladině podobnosti, které vytvořily operační taxonomické jednotky (OTU), odpovídající přibližně úrovni bakteriálních druhů. Pro každý klastr byla konstruována konsensuální sekvence s využitím programu MAFFT64 (Katoh a kol. 2009). Pro identifikaci OTU byl použit algoritmus BLAST proti nukleotidové databázi NCBI. Pro každou OTU byla nalezena nejpodobnější sekvence 55
se známým taxonomickým zařazením minimálně na úrovni rodu („best hit“). Počty sekvencí v jednotlivých OTU a vzorcích a jejich taxonomická identita na různých úrovních byly použity jako vstup pro statistické vyhodnocení složení společenstev bakterií.
4.4.6 Statistické vyhodnocení výsledků U výsledků stanovení úbytku substrátu, elementární analýzy, enzymové aktivity a qPCR byla stanovena střední chyba průměru, vypočítaná jako podíl směrodatné odchylky a odmocniny z počtu pozorování. Výsledky T-RFLP byly statisticky vyhodnoceny s použitím softwaru STATISTICA 10 (StatSoft). Jako vstupní hodnoty sloužily identity (tj. délky) a četnosti jednotlivých TRFLP fragmentů, reprezentující jejich relativní abundanci ve vzorku. Do analýzy byly z každého vzorku zahrnuty pouze ty fragmenty, jejichž relativní abundance (tedy intenzita fluorescence) byla vyšší než 0,5 % součtu abundancí všech fragmentů v daném vzorku. Před statistickou analýzou byly intenzity fluorescence jednotlivých fragmentů v každém vzorku vyjádřeny jako relativní hodnoty, tedy v procentech celkové fluorescence. Tato data byla vstupem pro analýzu hlavních komponent („principle component analysis, PCA), která byla použita k identifikaci hlavních zdrojů variability mezi vzorky půdy a mycelia v průběhu dekompozice. Dva nejvýznamnější gradienty variability jsou ve výsledcích této analýzy reprezentovány prvními dvěma osami (hlavními komponentami). Pro vyhodnocení pyrosekvenačních dat byl použit software STATISTICA 10. Do analýzy OTU byly zahrnuty pouze OTU s relativní četností ≥ 0,5 % (které reprezentují sekvence, jejichž četnost není výrazně ovlivněna náhodnými vlivy) ve ≥ 3 vzorcích. Přibližně 100 nejčastějších OTU bylo zpracováno ve formě tabulky s několika hlavními charakteristikami. Abundance na úrovni vyšších taxonů (rodů, kmenů, popřípadě tříd) byly získány sečtením abundancí všech OTU, jejichž nejbližší hit do taxonu spadal. Nejdominantnější rody a kmeny s celkovou abundancí alespoň 1 % v některém ze vzorků a sukcese bakteriálního společenstva byly vizualizovány ve formě grafů. K vytvoření grafů byl použit program Origin 7.0. Statisticky významné rozdíly mezi početností jednotlivých taxonů v půdě, opadu a na myceliu byly testovány s použitím one-way ANOVA následované Fischerovým LSD post hoc testem. Rozdíly p < 0,05 byly považovány za statisticky významné. PCA byla použita k analýze rozdílu bakteriálního společenstva mezi půdou a myceliem. S využitím programu SEED (Větrovský a Baldrian 2013) byly stanoveny indexy diverzity Shannon-Wiener index a Chao1 index, které reprezentovaly odhady diverzity společenstva a počet dominantních 56
OTU, které představovaly ≥ 80 % všech získaných sekvencí daného vzorku, který představoval vyrovnanost druhového složení. Dalšími stanovenými indexy diverzity byla druhová bohatost a vyrovnanost („Evenness“). Pro výpočet všech parametrů druhové diverzity byly použity redukované datasety, obsahující 1000 náhodně vybraných sekvencí na vzorek, v nichž byly OTU vytvořeny nezávisle. Tento postup byl zvolen proto, aby se odstranil vliv hloubky vzorkování na odhady diverzity při nestejném počtu sekvencí v jednotlivých vzorcích.
4.5 Speciální chemikálie Agaróza
United States Biochemical
AMC
Sigma
AMPure Beads
Beckman Coulter
APS
Serva
BSA
New England Biolabs
10x Buffer pro DyNAzyme DNA Polymerázu
Thermo Scientific
CTAB
Serva
Cykloheximid
Sigma
DMSO
Serva
6x DNA Loading Dye
Fermentas
Dynazyme II DNA polymeráza
Finnzymes
EDTA
Amersham
Ethidium bromid
Fluka
Fenol pro molekulární biologie
Serva
GeneClean Turbo Kit
Sigma
HEPES
Serva
Izoamylalkohol
Sigma
Izopropanol
Sigma
Kapa Library Quantification Kit
KAPPA Biosystems
Kyselina citrónová
Sigma
MinElute PCR Purification kit
Quigen
MUF substráty
Glycosynth
NEBuffer 4
New England Biolabs 57
O'GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder
Fermentas
PCR Nucleotide mix (dNTP)
Roche
Pfu polymeráza
Thermo Scientific
PPP-mix
Top-Bio
Primer ITS1f
Sigma
Primer ITS4r
Sigma
Primer 16Seu27f
Sigma
Primer 1492r
Sigma
Primer 1108f
Sigma
Primer 1132r
Sigma
Primer 27f
Sigma
Primer eub530f
Sigma
Primer eub 1100br
Sigma
Restriktáza NlaIII
New England Biolabs
Restriktáza AluI
New England Biolabs
SDS
Sigma
Skleněné kuličky 0,5 mm a 0,1 mm
Biospec product Inc
SYBR green master mix
Applied Biosystems
Tris
Sigma
Wizard SV Gel and PCR Clean Up System
Promega
58
5 Výsledky 5.1 Xaverov 1 5.1.1 Rychlost rozkladu mycelia hub v půdě Rozklad mycelií hub v půdě probíhal v prvních fázích inkubace v půdě velmi rychle. V prvním experimentu bylo během prvních dvou týdnů rozloženo více než 50 % mycelia hub, přičemž se rychlost rozkladu postupně snižovala. Ve čtvrtém týdnu inkubace bylo již degradováno 66 % mycelia Tylopilus felleus a dokonce 77 % mycelia Rusulla sp.. Po čtvrtém týdnu inkubace v půdě probíhal již rozklad velmi pomalu (Obr. 11).
Ztráta suché hmotnosti mycelia (%)
100
Tylopilus Rusulla
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
2
4
6
8
Čas (týden)
Obr. 11: Ztráta suché hmotnosti biomasy T. felleus a Rusulla sp. během osmitýdenní inkubace v půdě. Jsou uvedeny průměry ze 3 stanovení a střední chyby průměru.
59
5.1.2 Elementární analýza prvkového složení Při analýze prvkového složení půdy a mycelia byl kladen důraz na obsah dusíku, uhlíku, vodíku a organických látek. Obsah dusíku, uhlíku a vodíku byl výrazně vyšší u mycelií než v okolní půdě. Mezi obsahem těchto prvků u T. felleus a Rusulla sp. nebyly zjištěny výrazné rozdíly. V prvním experimentu se obsah dusíku u T. felleus během rozkladu mírně zvýšil, u Rusulla sp. naopak mírně klesl (Obr. 12).
6 Půda Tylopilus Rusulla
5
Obsah N (%)
4 3 2 1 0 0
2
4
6
8
Čas (týden)
Obr. 12: Obsah dusíku v půdě a u mycelií T. felleus a Rusulla sp. během osmitýdenní inkubace v půdě. Jsou uvedeny průměry ze 3 stanovení a střední chyby průměru.
Z hodnot obsahu prvků ve vzorcích byl stanoven poměr uhlíku a dusíku (C/N). Poměr C/N byl vyšší ve vzorcích půdy než mycelia. Počáteční hodnota C/N byla u vzorků půdy přibližně 20, u mycelií T. felleus 13,9 a u mycelií Rusulla sp. 11,3. Během rozkladu došlo k poklesu poměru C/N u T. felleus na hodnotu 10,5. Na rozdíl od toho se poměr C/N u Rusulla sp. mírně zvýšil na hodnotu 13,5 (Obr. 13).
60
24
Půda Tylopilus Rusulla
22 20 18
C/N
16 14 12 10 8 6 0
2
4
6
8
Čas (týden)
Obr. 13: Poměr C/N v půdě a u mycelií T. felleus a Rusulla sp. během osmitýdenní inkubace v půdě. Jsou uvedeny průměry ze 3 stanovení a střední chyby průměru.
5.1.3 Enzymová aktivita V prvním pokusu byla stanovována aktivita enzymů β-glukozidázy, α-glukozidázy, celobiohydrolázy, β-xylozidázy, chitinázy, β-manozidázy, fosfatázy, α-galaktozidázy, alanin-aminopeptidázy a leucin-aminopeptidázy. Na rozkládajícím se myceliu byla naměřena výrazně vyšší enzymová aktivita než v okolní půdě. Také relativní zastoupení jednotlivých enzymů se lišilo mezi půdou a rozkládajícím se myceliem. Aktivita β-glukozidázy, α-glukozidázy, celobiohydrolázy, β-xylozidázy, fosfatázy, α-galaktozidázy a leucin-aminopeptidázy na myceliích byla přibližně 10x vyšší než v půdě. Aktivita chitinázy a manozidázy na myceliích převyšovala až 100x hodnoty aktivit naměřených u půdy. Aktivita alanin-aminopeptidázy, která nebyla v půdě detekovaná, dosahovala na myceliu nejvyšších hodnot mezi enzymy. V půdy dominovala aktivita fosfatázy, vysoká byla také aktivita β-glukozidázy. Jednotlivé enzymové aktivity v půdě se v čase neměnily. Rozdíly v enzymových aktivitách byly pozorovány také mezi jednotlivými typy mycelií (Tab. 4).
61
Tab. 4: Aktivita enzymů v půdě a na myceliu během osmitýdenní inkubace v půdě. Data jsou uvedeny v jednotkách µM min-1g-1 suché hmotnosti substrátu, zahrnují průměry jednotlivých měření a jejich střední chybu průměru (n=3), (N.D. = aktivita nedetekována). Týden
β-glukozidáza
Půda 0 2 4 6 8
19,2 16,6 12,9 23,5 21,0
α-glukozidáza
celobiohydroláza
β-xylozidáza
chitináza
± ± ± ± ±
4,3 1,2 2,6 15,4 1,0
1,4 1,2 1,3 3,2 2,2
± ± ± ± ±
0,3 0,0 0,3 1,9 0,2
2,5 3,6 2,6 6,6 4,5
± ± ± ± ±
0,9 0,3 0,7 5,0 0,5
7,5 5,7 5,2 7,1 8,6
± ± ± ± ±
1,8 0,9 0,7 2,9 0,7
3,1 3,2 3,8 5,3 5,0
± ± ± ± ±
1,2 0,2 1,6 2,7 0,5
Tylopilus feleus 0 334,0 ± 2 97,0 ± 4 46,1 ± 6 114,1 ± 8 188,4 ±
26,8 4,5 13,5 3,1 37,4
31,5 79,2 50,2 81,0 90,2
± ± ± ± ±
3,4 20,2 6,6 10,4 15,2
41,4 9,1 7,0 10,4 22,8
± ± ± ± ±
8,1 1,5 3,8 3,2 14,4
65,8 10,4 5,8 14,1 28,1
± ± ± ± ±
6,1 1,8 1,7 0,4 8,1
147,0 104,9 62,8 186,0 170,1
± ± ± ± ±
24,5 13,2 9,0 1,6 17,0
Rusulla sp. 0 708,5 ± 194,8 4 176,7 ± 15,1 8 105,2 ± 14,2
Týden Půda 0 2 4 6 8
manozidáza
19,5 ± 0,4 22,9 ± 3,1 61,2 ± 10,3
fosfatáza
273,1 ± 66,1 37,7 ± 7,9 20,9 ± 0,8
166,4 ± 3,6 39,1 ± 7,1 29,5 ± 1,0
523,6 ± 9,0 217,2 ± 26,8 198,9 ± 14,4
alaninleucinα-galaktozidáza aminopeptidáza aminopeptidáza
0,6 0,4 0,7 1,5 0,8
± ± ± ± ±
0,1 0,0 0,2 1,0 0,1
107,3 89,2 84,9 125,3 107,2
± ± ± ± ±
15,5 0,8 15,7 54,2 5,9
6,5 6,2 6,2 8,0 7,0
± ± ± ± ±
1,3 0,1 1,3 4,2 0,7
N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
± ± ± ± ±
N.D. N.D. N.D. N.D. N.D.
2,9 2,1 1,6 2,4 2,1
± ± ± ± ±
0,4 0,2 0,3 0,9 0,3
Tylopilus feleus 0 304,0 2 57,7 4 26,7 6 38,1 8 51,1
± ± ± ± ±
18,8 3,8 8,5 9,6 6,1
782,6 1162,9 314,5 1165,0 1033,8
± ± ± ± ±
183,2 78,6 18,2 122,4 354,2
60,8 18,9 5,5 14,9 35,7
± ± ± ± ±
9,4 4,8 2,6 1,1 5,1
2220,6 960,1 N.D. 941,2 1402,6
± ± ± ± ±
98,6 173,6 N.D. 177,8 232,5
17,7 7,4 6,7 15,7 26,2
± ± ± ± ±
1,0 1,9 1,1 3,8 7,8
Rusulla sp. 0 31,8 ± 1,7 4 4,3 ± 0,2 8 7,1 ± 1,2
1090,5 ± 95,8 874,5 ± 75,9 633,1 ± 75,1
14,4 ± 0,5 8,9 ± 1,4 15,8 ± 0,7
1,4 ± 31,3 194,4 ± 18,2 344,3 ± 46,8
3,5 ± 2,3 17,4 ± 4,7 21,9 ± 2,6
Během rozkladu mycelií docházelo k výrazným změnám v aktivitě enzymů. V počátečních fázích rozkladu mycelií byla inhibována aktivita téměř všech sledovaných enzymů. Od 4. týdne rozkladu se ale jejich aktivita postupně zvyšovala. Na myceliích T. felleus a 62
Rusulla sp. byla naměřena vysoká aktivita β-glukozidázy, chitinázy, fosfatázy a alanin-aminopeptidázy. Patrný byl především rozdíl v aktivitě chitinázy a alanin-aminopeptidázy při srovnání s půdou. Výrazný nárůst aktivity alanin-aminopeptidázy byl zaznamenán mezi 4. a 8. týdnem rozkladu mycelií T. felleus. Přítomným substrátem byla stimulována také aktivita α-glukozidázy a u T. felleus aktivita β-manozidázy (Obr. 14).
Obr. 14: Relativní podíl enzymových aktivit v půdě, na myceliu T. felleus a Rusulla sp. ve 4. a 8. týdnu inkubace v půdě.
63
5.1.4 Analýza diverzity mikrobiálního společenstva ANOVA, využívající výsledků T-RFLP, prokázala statisticky významný rozdíl ve složení bakteriálního a houbového společenstva kolonizujícího rozkládající se mycelium a okolní půdu (p < 0,001), (Obr. 15 a 16). Rozdíly mezi populacemi na myceliu T. felleus a Rusulla sp. nebo na myceliích v průběhu rozkladu nebyly statisticky významné (p > 0.05).
Obr. 15: Analýza hlavních komponent diverzity bakteriálního společenstva na myceliu T. felleus (MT), Rusulla sp. (MR) a v půdě (S) v jednotlivých týdnech (p < 0,001).
64
Obr. 16: Analýza hlavních komponent diverzity bakteriální společenstva na myceliu T. felleus (MT), Rusulla sp. (MR) a v půdě (S) v jednotlivých týdnech (p < 0,001).
5.2 Xaverov 2 5.2.1 Rychlost rozkladu mycelia hub v půdě V druhém experimentu probíhal rozklad pomaleji než v prvním experimentu. Sáčky s myceliem byly uloženy pod opadovou vrstvu a mezi organický a minerální horizont. Během dvou týdnů bylo rozloženo pouze 10,3 % mycelia umístěného mezi opadovou vrstvou a organickým horizontem a 39,9 % mycelia umístěného mezi organický a minerální horizont. Degradace materiálu umístěného pod organickou vrstvu probíhala zpočátku významně rychleji než na povrchu půdy, nicméně konečné hodnoty byly přibližně stejné. Po 21 týdnech inkubace bylo již rozloženo 75 % mycelia pod opadovou vrstvou a 73 % mycelia pod organickým horizontem (Obr. 17).
65
Ztráta suché hmotnosti mycelia (%)
100 Opad Humus
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0
5
10
15
20
25
Čas (týden)
Obr. 17: Ztráta suché hmotnosti biomasy T. felleus pod opadovou vrstvou (opad) a organickou vrstvou (humus) během rozkladu. Jsou uvedeny průměry ze 4 stanovení a střední chyby průměru.
5.2.2 Elementární analýza prvkového složení Obsah dusíku, uhlíku a vodíku byl opět výrazně vyšší u mycelií než v okolní půdě. Opadová vrstva obsahovala průměrně 2 % dusíku, zatímco organický horizont 1,5 % dusíku. Výrazné rozdíly ve změně obsahu dusíku nebyly nalezeny ani mezi degradací mycelia pod opadovou vrstvou a organickým horizontem. Počáteční obsah dusíku v myceliích hub byl při druhém pokusu 5,1 %. Po 21 týdnech inkubace v půdě se obsah dusíku ve vzorcích mírně zvýšil. U vzorků uložených pod opadovou vstvou byla konečná hodnota obsahu dusíku 6,8 %, u vzorků uložených pod organickým horizontem 5,8 %. Při inkubaci mycelia pod opadovou vrstvou a organickým horizontem se v obou případech poměr C/N snížil z hodnoty 8,7 (0. týden) na hodnotu 7,3 v případě mycelií pod opadovou vrstvou a hodnotu 7,5 pod organickým horizontem (21. týden).
66
Obsah organických látek v myceliu se v průběhu rozkladu zvyšoval. Na začátku rozkladu obsahovalo mycelium 91,5 % organických látek. Na konci rozkladu (21. týden) obsahovaly vzorky mycelia inkubovaného pod opadovou vrstvou 98,8 % organických látek a mycelia pod organickým horizontem 95,8 % organických látek. Podobná hodnota byla naměřena i v případě opadu, který měl přibližně 90 % organických látek. V organickém horizont dominovaly anorganické látky (70 %).
5.2.3 Enzymová aktivita Ve druhém pokusu byla stanovována aktivita fosfatázy, α-glukozidázy, alanin-aminopeptidázy, β-glukozidázy, β-manozidázy, β-xylozidázy, celobiohydrolázy, α-galaktozidázy, chitinázy a lipázy na myceliu T. felleus ve dvou půdních vrstvách. Stejně jako v prvním pokusu byla na rozkládajícím se myceliu naměřena vyšší enzymová aktivita než v půdě. V opadové vrstvě i humusu byla výrazná aktivita fosfatázy a β-glukozidázy. U všech enzymů byla stanovena vyšší aktivita v opadové vrstvě než v humusu. Aktivita enzymů byla výrazně stimulována přítomností využitelného substrátu. Dominantní byla aktivita fosfatázy, β-glukozidázy, chitinázy, β-manozidázy a lipázy. Aktivita fosfafázy, alanin-aminopeptidázy, β-glukozidázy, α-galaktozidázy, β-xylozidázy a β-manozidázy v průběhu rozkladu klesala. Stimulována byla naopak aktivita lipázy. Vysoká aktivita byla stanovena u chitinázy v průběhu celého rozkladu. Výrazný nárůst byl zaznamenán v aktivitě β-glukozidázy, celobiohydrolázy a β-xylozidázy v humusu v 9. týdnu inkubace (Obr. 18).
67
68
Obr. 18: Aktivita enzymů v půdě a na myceliu T. felleus v různých vrstvách půdy během jednadvacetitýdenní inkubace v půdě. Jsou uvedeny průměry ze 4 stanovení a střední chyby průměru.
5.2.4 Kvantifikace počtu bakterií Kvantitativní PCR prokázala výrazně vyšší četnost bakterií na rozkládajícím se myceliu než v okolní půdě. V druhém experimentu byly sáčky s myceliem T. felleus umístěny pod opadovou vrstvu a organický horizont. Větší množství bakterií bylo přítomno v opadové vrstvě než v humusu. V počátečních fázích rozkladu rostl počet bakterií na myceliu. Maxima bylo dosaženo v 9. týdnu inkubace mycelií pod humusovou vrstvou a v 15. týdnu inkubace mycelií pod opadovou vrstvou, což ovlivnilo také četnost bakterií v okolní půdě. Následně došlo k poklesu počtu bakterií. Větší počet bakterií, kromě počáteční fáze rozkladu, byl nalezen u mycelia umístěného pod opadovou vrstvu (Obr. 19).
9 9
1,6x10
9
1,4x10
9
1,2x10
-1
Počet 16S sekvencí g suché půdy
1,8x10
9
1,0x10
8
8,0x10
8
6,0x10
8
4,0x10
8
2,0x10
0,0 0
5
10 15 Čas (týden) Opad Humus
20
25
Mycelium opad Mycelium humus
Obr. 19: Počet 16S sekvencí bakterií v 1 ng půdy a mycelia T. felleus, umístěném pod opadovou vrstvou (opad) a organickým horizontem (humus). Jsou uvedeny průměry ze 4 stanovení a střední chyby průměru.
69
Kultivací byly získány údaje o počtu kultivovatelných bakterií na myceliu a v půdě, které odpovídaly relativnímu zastoupení počtu bakterií na opadu, v půdě a na myceliu (Tab. 5).
Tab. 5: Počet CFU v 1 g sušiny v 9 a 21 týdnu odběru. Data zahrnují průměry ze 4 stanovení a jejich střední chybu průměru. Týden
Opad
Humus
Mycelium opad
Mycelium humus
9
8,4E+07 ± 3,2E+07 6,4E+05 ± 4,7E+05 1,2E+10 ± 5,1E+09
1,6E+10 ± 9,2E+09
21
2,1E+08 ± 3,4E+07 1,1E+07 ± 3,0E+06 9,0E+10 ± 3,5E+10
6,6E+10 ± 2,4E+10
Kvantita bakterií v opadové vrstvě byla vyšší než v humusu. Větší množství bakterií bylo zaznamenáno také na rozkládajícím se myceliu. V průběhu celého rozkladu mycelií se počet bakterií zvyšoval. Ve 3. týdnu rozkladu bylo na myceliích umístěných v půdě výrazně větší množství bakterií než na myceliích v opadu. Tento rozdíl byl ale do 9. týdne inkubace vyrovnán. Nápadný přírůstek v počtu bakterií byl zaznamenán ve 3. týdnu rozkladu v opadové vrstvě (Obr. 20).
11
10
10
9
10
8
10
-1
CFU g suché půdy
10
7
10
6
10
5
10
0
5
10 15 Čas (týden) Opad Humus
20
Mycelium opad Mycelium humus
70
25
Obr. 20: Počet CFU v g sušiny v 2., 3., 9. a 21. týdnu inkubace. Data zahrnují průměry ze 4 stanovení a jejich střední chybu průměru.
5.2.5 Identifikace bakteriálních izolátů Vybrané kultivovatelné bakterie z 3., 9. a 21. týdne odběru byly po sekvenaci oblasti 16S rDNA zařazeny do 17 rodů. Nejčastější byly izoláty patřící do rodu Pseudomonas (59 izolátů). Dalšími obvyklými izoláty byly zástupci rodů Chitinophaga (23 izolátů), Pedobacter (15 izolátů), Janthinobacterium (11 izolátů), Renibacterium (10 izolátů) a Stenotrophomonas (9 izolátů). V časných fázích rozkladu byl mezi izoláty dominantní rod Pseudomonas, v pozdějších fázích rozkladu mycelia došlo k větší diverzifikaci bakteriálního společenstva. Častým izolátem v této fázi rozkladu byl rod Chitinophaga (Tab. 6).
Tab. 6: Přehled bakteriálních izolátů z 3., 9., a 21. týdne inkubace mycelií v půdě Označení izolátu 001-A1 002-B1 003-C11 004-D11 006-F11 007-G11 008-H11 011-C21 012-D21 013-E21 016-H21 021-A31 022-B31 023-C31 024-D31 025-E31 026-F31 027-G31 028-H31 029-A41 030-B41 031-C41 032-D41 034-F41
Týden
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
Chitinázová aktivita (relativní hodnoty) 0 0 0 0 5 0 0 1 0 32 0 0 0 29 20 4 12 0 -
71
Nejbližší příbuzný
Podobnost sekvencí (%)
Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Flavobacterium Flavobacterium Serratia Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Janthinobacterium Janthinobacterium Pseudomonas
100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Označení izolátu 035-G41 036-H41 037-A51 038-B51 039-C51 040-D51 043-G51 045-A61 046-B61 047-C61 049-E61 050-F61 052-H61 053-A71 055-C71 059-G71 057-E71 060-H71 082-B81 084-D81 085-E81 081-A81 093-F81 094-G81 095-H81 096-A91 097-B91 099-C91 100-D91 103-F91 106-G91 107-H91 109-A101 111-C101 112-D101 113-E101 114-F101 116-G101 117-H101 119-A111 121-C111 123-E111 124-F111 125-G111 126-H111 130-B121 131-C121 132-D121 135-G121
Týden
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
Chitinázová aktivita (relativní hodnoty) 5 0 0 14 23 0 0 0 0 0 96 13 24 116 43 0 0 0 28 46 140 18 0 23 11 24 39 19 0 9 7 0
72
Nejbližší příbuzný
Podobnost sekvencí (%)
Janthinobacterium Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Janthinobacterium Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Janthinobacterium Pedobacter Pseudomonas Pedobacter Janthinobacterium Buttiauxella Pedobacter Flavobacterium Pseudomonas Pedobacter Pseudomonas Pedobacter Flavobacterium Pedobacter Pseudomonas Pedobacter Flavobacterium Variovorax Pedobacter Janthinobacterium Flavobacterium Janthinobacterium Pedobacter Flavobacterium Janthinobacterium Janthinobacterium Variovorax Janthinobacterium Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Stenotrophomonas
100 100 100 100 100 100 100 100 100 99 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 98 100 100 100 100 99 100 100
Označení izolátu 136-H121 142-3 146-G01-2 149-B02-2 150-3 158-C03-2 164-E02-1 165-B04-2 168-G02-1 169-H02-1 172-C04-1 173-B05-2 175-3 176-C03-1 177-F05-2 178-G05-2 179-H05-2 180-3 181-B06-2 182-A04-1 183-B04-1 184-D04-1 185-E04-1 186-3 188-3 189-B07-2 191-3 195-3 196-A08-2 197-B08-2 198-C08-2 199-D08-2 200-3 201-3 202-3 204-H08-2 205-A09-2 206-B09-2 207-C09-2 208-3 209-3 211-G09-2 213-A06-1 215-B06-1 216-D10-2 217-C06-1 218-F10-2 219-D06-1
Týden
9 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21
Chitinázová aktivita (relativní hodnoty) 0 8 3 0 9 24 0 119 0 47 2 183 0 135 0 355 58 0 14 0 138 41 62 12 4 0 25 2 9 25 74 17 25 14 0 1 0 40 21 22 11 10 2 0 0 23 0 18
73
Nejbližší příbuzný
Podobnost sekvencí (%)
Janthinobacterium Achromobacter Serratia Stenotrophomonas Stenotrophomonas Serratia Pseudomonas Renibacterium Chitinophaga Renibacterium Renibacterium Chitinophaga Pseudomonas Renibacterium Chitinophaga Renibacterium Chitinophaga Chitinophaga Pedobacter Renibacterium Renibacterium Renibacterium Renibacterium Stenotrophomonas Pseudomonas Pseudomonas Stenotrophomonas Pseudomonas Chitinophaga Pantoea Pantoea Plantibacter Stenotrophomonas Chitinophaga Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Stenotrophomonas Serratia Achromobacter Achromobacter Hafnia Pseudomonas Pseudomonas Delftia Parapusillimonas Delftia Pseudomonas
100 98 100 100 100 100 100 100 100 96 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 97 100 100 100 100 100 95 100 91 100 100 100 100 100 97 97 100 73 90 88 99
Označení izolátu 220-F06-1 223-C11-2 226-A07-1 227-F11-2 229-H11-2 230-B07-1 235-C071 239-F071 241-H071 242-D191 246-A081 247-B081 248-C081 249-D081 253-E081 254-F081 255-G081 258-B091 260-H081 261-G181 262-H181 263_1492r 266-D091 268-E091 269-F091 270-G091 271-H091 274-A101 275-B101 277-C191 286-G101 287-H101 288-A111 291-C111 292-D111 293-B191 299-A121 300-B121 301-G191 304-C121 306-D121 307-E121 308-F121 309-G121 310-H121 311-B201 312-C201 313-D201
Týden
21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21
Chitinázová aktivita (relativní hodnoty) 0 55 0 13 5 0 182 14 11 0 0 37 6 5 0 44 15 0 11 0 0 12 0 17 4 0 109 19 6 6 6 17 22 141 0 43 0 17 41 245 2 26 0 17 272 55 25
74
Nejbližší příbuzný
Podobnost sekvencí (%)
Pseudomonas Pedobacter Pseudomonas Chitinophaga Chitinophaga Chitinophaga Flavobacterium Chitinophaga Chitinophaga Pseudomonas Pseudomonas Stenotrophomonas Chitinophaga Chitinophaga Pseudomonas Pedobacter Filimonas Ochrobactrum Chitinophaga Chitinophaga Pseudomonas Stenotrophomonas Chitinophaga Pseudomonas Chitinophaga Chitinophaga Luteibacter Renibacterium Hydrotalea Phyllobacterium Variovorax Chitinophaga Pedobacter Chitinophaga Serratia Stenotrophomonas Plantibacter Variovorax Rhizobium Chitinophaga Serratia Rhizobium Chitinophaga Pseudomonas Chitinophaga Pedobacter Pedobacter Plantibacter
100 100 98 100 98 100 100 100 100 100 96 100 100 100 100 100 89 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 86 100 99 100 100 100 100 100 100 100 71 100 100 70 100 100 100 100 100 100
Bakteriální izoláty byly na základě svého fylogenetického postavení zařeny do kmenů Proteobacteria, Actinobacteria a Bacteroidetes (Obr. 21).
Obr. 21: Fylogenetický strom evoluční podobnosti sekvencí izolátů s vybranými podobnými sekvencemi. Červený symbol značí izoláty, které byly poprvé izolovány ve 3. týdnu, zelený symbol izoláty z 9. týdne a modrý symbol izoláty z 21. týdne inkubace mycelií v půdě. 75
5.2.6 Chitinázová aktivita izolátů U bakteriálních izolátů byla stanovena jejich chitinázová aktivita. Největší chitinázovou aktivitu vykazovaly izoláty rodů Renibacterium, Serratia, Pedobacter a Flavobacterium. U nejčastěji izolovaného rodu Pseudomonas byla naměřena pouze nízká chitinázová aktivita (Tab. 7). Celková chitinázová aktivita byla proto výrazně vyšší v pozdějších fázích rozkladu mycelia.
Tab. 7: Chitinázová aktivita u bakteriálních izolátů. Data zahrnují průměry jednotlivých měření a jejich střední chybu průměru. Rod Renibacterium Serratia Pedobacter Flavobacterium Pantoea Filimonas Plantibacter Buttiauella Psychrosphaera Variovorax Chitinophaga Ochrobactrum Stenotrophomonas Achromobacter Parapusillimonas Janthinobacterium Hafnia Rhizobium Hydrotalea Serpens Phyllobacterium Azorhizophilus Pseudomonas Xylophilus Delftia Azomonas Luteibacter Sinorhizobium
Počet izolátů 10 5 15 5 2 2 3 1 1 4 24 1 10 3 2 9 1 2 2 2 1 1 45 3 2 1 1 1
76
Aktivita chitinázy (relativní hodnoty) 100,7 ± 32,6 73,0 ± 40,4 65,8 ± 23,3 60,3 ± 30,6 49,1 ± 24,4 32,8 ± 10,9 28,3 ± 7,8 24,0 ± 0,0 24,0 ± 0,0 22,9 ± 11,7 19,7 ± 7,6 15,0 ± 0,0 14,9 ± 5,0 13,6 ± 4,1 11,3 ± 11,3 10,1 ± 3,1 10,0 ± 0,0 9,4 ± 7,7 9,3 ± 9,3 7,6 ± 0,7 6,0 ± 0,0 4,0 ± 0,0 2,7 ± 6,7 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
5.2.7 454-pyrosekvenace bakterií Sekvence části bakteriální 16S rDNA o délce 380 bazí, získané pomocí pyrosekvenace, byly použity pro popis složení bakteriálního společenstva v půdě, v opadu a na myceliu během rozkladu. Sekvence byly zařazeny do 5561 OTU na 97 % hladině podobnosti (z toho 3532 singletonů, tj. OTU obsahujících pouze jednu sekvenci). 943 OTU mělo > 97 % podobnost se sekvencí se známým taxonomickým zařazením v databázi. Pro 28 OTU nebyla nalezena v databázi žádná sekvence s dostatečnou hladinou podobnosti. Nejpodobnější sekvence OTU byly zařazeny do 184 bakteriálních rodů ve 14 kmenech. Pro 98 nejčastějších OTU, které měly relativní četnost ≥ 0,5 % ve ≥ 3 vzorcích, byla nalezena nejbližší sekvence se známým taxonomickým zařazením („best hit“), určena u nich E-hodnota a relativní podobnost s nalezenou sekvencí. U nejčetnějších OTU byla stanovena > 97 % podobnost se sekvencí bakteriálního izolátu, získaného kultivací z odběrů z 3., 9., a 21. týdne (podobnost izolátu). Relativní abundance sekvencí jednotlivých OTU v půdě, v opadu a na myceliu jsou znázorněny v Tab. 8. U většiny OTU se statisticky významně lišila jejich relativní abundance v půdě, v opadu a na myceliích (analýza Fisherovým LSD post-hoc testem). Nejčastěji zastoupenou OTU v organickém horizontu byla OTU 5 (best hit: Telmatobacter sp.), která se vyskytovala ve vzorcích půdy s průměrnou četností 5,4 sekvencí. Tato OTU byla přítomna na opadu a na rozkládajícím se myceliu ve statisticky významně nižším množství než v půdě. OTU 9 (best hit: Mucilaginibacter sp.) byla nejhojnější v opadu, s relativní četností 9 % sekvencí ve vzorku. Tato OTU byla také přítomna v půdě a na rozkládajícím se myceliu ve statisticky významně nižším množství než v opadové vrstvě. Nejpočetnější OTU na rozkládajícím se myceliu byla OTU 1 (best hit: Pedobacter cryoconitis), která se vyskytovala s relativní abundancí 33,8 % sekvencí ve vzorku mycelia. Její relativní zastoupení v půdě a na opadu bylo významně statisticky odlišné od její četnosti na rozkládajícím se myceliu. Druhá nejčastější OTU na myceliu byla OTU 2 (best hit: Pseudomonas sp.), která se vyskytovala pouze na rozkládajícím se myceliu a nebyla nalezena ve vzorcích půdy ani opadu. Podobné výsledky byly získány i pro OTU 3 (best hit: Pseudomonas sp.).
77
Tab. 8: Přehled nejčastějších OTU ve vzorcích půdy, opadu a mycelia. Zahrnuty jsou průměry relativní abundance sekvencí z 8 (půda, opad) a 46 (mycelium) stanovení (v ‰). Sloupce, označené rozdílnými indexy, se významně liší p < 0.05 (Fisherův LSD post-hoc test). Číslo OTU 1
Označení HQ824869
Best hits Pedobacter cryoconitis
E-hodnota 0
2
KC815308
Pseudomonas sp.
0
3 4 8 30 14 10
KF011698 KC107836 JN819569 KC778397 KF150395 KC252619
Pseudomonas sp. Ewingella americana Chitinophaga arvensicola Variovorax boronicumulans Janthinobacterium lividum Burkholderia sp.
72 9
HM113640 EU423302
Pseudochrobactrum kiredjianiae Mucilaginibacter sp.
6 18 13 795 210 128 40 50 164 84
JQ977531 JX976306 NR102820 AM988942 CP003041 AM181176 FR691412 GU213302 AB828263 JQ660209
112 34 53 23
Půda 4,3a
Opad 8,5a
Mycelium 338,4b
Podobnost izolátu (%) 98,1
99,7
0a
0a
133,2b
99,7
0 0 0 0 0 0
99,7 99,7 99,7 99,7 99,7 99,7
0,1 0,3 0,8 0,6 0,1 8,4a
0,8 14,4 0,2 5,1 5,5 47,4b
131,2 104,9 41,9 17,6 9,3 7,9a
97,9 99,7 99,7 99,7 -
0 0
98,7 99,5
0,1 9,4a
0,0 89,5b
6,7 6,5a
-
Pedobacter sp. Frondihabitans sp. Erwinia billingiae Chitinophaga sp. Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens Devosia sp. Paenibacillus sp. Rhodococcus globerulus Rhizobium endophyticum
0 0 0 9.46868e-151 8.8761e-126 2.38179e-120 0 0 0 0
99,2 99,7 99,7 92,3 87,2 86,1 98,4 99,7 99,7 99,7
0,5 1,4 0,0 0,1 0,0 0,0 0,6 0,1 0,0 0,2a
4,7 11,3 0,3 0,1 0,0 0,0 3,2 0,0 0,0 6,1b
5,9 5,8 4,9 4,7 4,3 3,9 3,6 3,5 3,1 2,2c
97,1
KC880358 KF011698 AF234888
Achromobacter sp. Pseudomonas sp. Bradyrhizobium japonicum
0 0 0
99,2 99,2 99,7
0,4 0,0 17,1b
2,3 0,0 13,8b
2,1 1,8 1,7a
97,3 -
JQ977633
Sphingomonas sp.
0
100,0
0,4a
11,2b
1,6a
-
78
Podobnost (%) 99,2
98,4 99,2
Číslo OTU
Označení
Best hits
241
JQ977406
Plantibacter sp.
32
JQ772093
Mucilaginibacter sp.
E-hodnota 0
Podobnost (%) 99,7
0
99,2
Půda
Opad
Mycelium
Podobnost izolátu (%)
0a
0,3ab
1,6b
100,0
1,4
a a
31
HE814666
Pedobacter sp.
0
99,5
0,1
16
FN400860
Mucilaginibacter sp.
0
99,7
5,9b
99,2
a
55
KC455427
Herbaspirillum sp.
0
1,1
b
350
KC355343
Luteibacter sp.
0
98,9
7,8
17
JX483769
Mucilaginibacter sp.
0
99,5
4,6a
99,5
a
322
JX483751
Mucilaginibacter sp.
51
DQ355184
Acidopila rosea
78 58
JN819569 KC951278
340 160 11 7
0
0,2
b
22
b
6,2
b
24,8c 4,4
b
40,4
c
21,8b 4,0
b
97,3
1,4
a
97,3
1,4a
-
1,3
a
-
1,3
a
-
1,2a
-
1,2
a
-
1,2
a
-
0
96,0
23,0
Chitinophaga arvensicola Mycobacterium szulgai
6.37431e-172 0
96,0 99,5
0,0 2,7a
0,0 7,3b
1,1 1,0a
-
JQ977423 AB819626
Mesorhizobium sp. Pseudomonas sp.
0 2.08377e-165
100,0 94,7
0,2 22,4b
0,3 2,4a
1,0 1,0a
-
AB245337
Acidobacterium capsulatum
0
98,1
13,4b
9,9b
0,9a
-
98,1
24,2
b
a
0,9
a
-
a
0,9
a
-
AY234512
Acidopila rosea
0
1,4
a
1,4
a
3,2
12
JN408295
Mucilaginibacter sp.
0
99,7
4,2
5
KC954751
Telmatobacter sp.
0
98,1
53,6b
1,4a
0,9a
-
153 21
DQ298787 FR716684
Chitinophaga niastensis Granulicella paludicola
0 0
97,3 98,7
0,0 10,6b
0,0 15,0c
0,9 0,8a
-
70
JN872548
Luteibacter rhizovicinus
0
100,0
4,3b
13,1c
0,8a
-
a
-
0,6a
-
0,6
a
-
0,5
a
-
b
92
JX869441
Iamia majanohamensis
2.37549e-177
89,1
34,1
15
HQ687090
Granulicella sapmiensis
0
98,4
10,1b
201 22
JQ689172 AY234503
Duganella zoogloeoides 22
0
99,7
1.60059e-179
79
97,6
0,1
a
14,0
b
23,0
b
0,2
a
13,6b 4,0
b
16,3
b
0,7
Číslo OTU
Označení
Best hits
54
KC537738
Mucilaginibacter sp.
26
KC924939
Granulicella paludicola
E-hodnota 0
Podobnost (%) 99,2
0
99,7
Půda
Opad
Mycelium
Podobnost izolátu (%)
1,0a
13,3b
0,5a
-
0,5
a
-
0,5
a
-
0,6a
0,5a
-
c
0,4
a
-
0,4
a
-
11,4
c
b
20
DQ123621
Paenibacillus sp.
5.58893e-179
97,1
22,4
29
JX869411
Aciditerrimonas ferrireducens
2.71043e-170
91,5
16,2b
24
DQ419951
Burkholderia sp.
212
JN713383
Syntrophaceticus schinkii
59
AF498744
59
42
AF498722
Methylosinus trichosporium
101
AY673181
Lysobacter sp.
19
AY234473
Edaphobacter sp.
27 49
AY960767 AM161158
Conexibacter sp. Rhodopila globiformis
65
FN870346
Actinomadura umbrina
129
EU196641
185 89 36
99,7
3,0
b
0,6
a
6,3
3.31074e-112
84,1
6,1
0
98,4
8,5c
2,5b
0,4a
-
96,3
c
b
0,3
a
-
0,3
a
-
0
6,2
1,3
a
4,4
a
14,6
b
2.37549e-177
96,3
1,5
0
97,6
7,0b
5,3b
0,3a
-
98,1
c
b
0,3
a
-
0,3
a
-
0,3
a
-
0 1.23053e-174
96,6
6,9 7,3
b b
1,6
0,1
a
0,2
a
0
95,2
8,9
4.03498e-111
84,1
13,1b
0,3a
0,3a
-
KC355350
Phormidium cf. aerugineo-coeruleum Ideonella sp.
0
99,2
0,8a
17,0b
0,3a
-
AY234546
Actinomadura sp.
5.58893e-179
94,7
5,4b
0,0a
0,3a
-
0,0
a
0,2
a
-
0,4
a
0,2
a
-
HM748676
46
NR
67
JQ687103
39
0
b
3,7
b
NR
Candidatus Koribacter versatilis Candidatus Koribacter versatilis Novosphingobium sp. Conexibacter woesei
4.02263e-168
92,6
22,2
b b
1.71047e-166
95,0
12,9
0
98,9
0,1a
5,8b
0,2a
-
95,0
b
0,6
a
0,2
a
-
0,2
a
0,2
a
-
1.71047e-166
5,4
b
41
JX029998
Acidobacterium capsulatum
1.71047e-166
94,7
11,8
45
AY234546
Actinomadura sp.
4.58577e-180
94,2
6,3b
0,5a
0,2a
-
97,1
a
b
a
-
344
DQ490375
Sphingomonas polyaromaticivorans
0
80
0,0
5,6
0,2
Číslo OTU
Označení
Best hits
56
JF488134
Chitinophaga pinensis
88
AB668307
Actinoallomurus vinaceus
1046
JQ977655
Methylibium sp.
90
AB682174
Acidocella aluminiidurans
141
CP003379
Terriglobus roseus
76
AB365487
76
35
CP003130
Granulicella mallensis
452
NR
Candidatus Solibacter usitatus
E-hodnota
Podobnost (%)
Půda
Opad
Mycelium
Podobnost izolátu (%)
0
97,3
2,1b
4,5c
0,2a
-
a
0,2
a
-
0,2
a
-
2.89393e-176
b
96,8
10,3
0
99,7
0,4
a
1.23053e-174
96,6
6,3b
0,0a
0,2a
-
99,5
a
b
0,2
a
-
0,1
a
-
0
0,1
b
0,7 5,5 7,6
b
3.30198e-169
95,5
3,7
0
98,7
1,7b
4,4c
0,1a
-
96,3
5,3
b
0,5
a
0,1
a
-
b
0,7
a
0,1
a
-
1.4991e-173
0,0
a
48
JX469404
Phenylobacterium sp.
6.37431e-172
96,0
5,4
66
AY960777
Pedosphaera parvula
2.89393e-176
96,8
4,0c
1,2b
0,1a
-
97,6
a
3,8
b
0,1
a
-
1,9
b
0,1
a
-
0,1
a
-
370 107
KC690141 AY234615
135
HM748715
133
JX268541
63
NR
Ferruginibacter sp. 107 135 Mucilaginibacter sp. Candidatus Solibacter usitatus
4.58768e-180 2.37549e-177
97,1
0,4
9,9
c
b
5.58661e-179
97,3
5,9
0
99,5
0,1a
6,1b
0,1a
-
96,0
5,0
b
0,3
a
0,1
a
-
b
0,0
a
0,1
a
-
6.37431e-172
0,0
a
251
JN713383
Moorella thermoacetica
1.715e-109
84,6
7,3
57
AB364581
Actinoallomurus spadix
3.30198e-169
95,5
5,0b
0,3a
0,1a
-
90,2
a
b
0,1
a
-
0,1
a
-
138
KC862593
Polyangium sp.
1.31617e-142
0,1
b
4,9
265
HM748702
Acidobacterium capsulatum
2.38068e-139
84,4
6,8
94
AB246770
Haliangium ochraceum
2.89393e-176
91,5
0,5a
4,5b
0,1a
-
96,8
8,3
b
0,1
a
0,1
a
-
b
0,2
a
0,0
a
-
64
HM748715
64
2.89393e-176
0,1
a
79
AY960777
Pedosphaera parvula
3.30335e-169
95,5
7,5
207
HM748719
207
2.08377e-165
94,7
3,4b
0,1a
0,0a
-
93,4
b
a
a
-
109
GU187034
Bryobacter aggregatus
1.07987e-162
81
4,2
0,3
0,0
Číslo OTU
Označení
Best hits
1252
AY234531
252
122
HQ290510
171
HM748675
226
NR
Pedosphaera parvula
E-hodnota
Podobnost (%)
Půda
Opad
Mycelium
Podobnost izolátu (%)
1.71047e-166
95,0
14,5b
0,1a
0,0a
-
0,0
a
0,0
a
-
0,0
a
0,0
a
-
0,0a
-
8.86826e-145
90,2
5,0
b b
171
5.58661e-179
97,3
6,3
Acidisoma tundrae
6.37431e-172
96,0
4,9b
82
0,2a
Nejčastější OTU, identifikované na rozkládajícím se myceliu, byly OTU 1 (Pedobacter cryoconitis), OTU 2 (Pseudomonas sp.), OTU 3 (Pseudomonas sp.) a OTU 4 (Ewingella americana), k nimž byla nalezena nejpodobnější sekvence se známým taxonomickým zařazením na úrovni rodu nebo druhu. Na myceliu docházelo během rozkladu ke změnám četnosti sekvencí spadajících do jednotlivých OTU. OTU 1 vykazoval na počátku rozkladu nízkou četnost, nicméně během rozkladu mycelií vzrostla četnost jeho sekvencí až na stonásobek počátečních hodnot a dosahovala 60 % všech sekvencí. OTU 2, OTU 3 a OTU 4 byly přítomny s vyšší četností pouze v prvních týdnech inkubace mycelií v půdě. V prvním týdnu rozkladu mycelií pod opadovou vrstvou dominovala OTU 4 s nejvyšší četností sekvencí ze všech stanovených OTU – až 60 %. Naopak její četnost na myceliu inkubovaném pod organickým horizontem byla velmi nízká. OTU 3 byla nejhojnější skupinou bakterií vyskytujících se v počáteční fázi rozkladu na myceliu pod organickým horizontem. Vysoké četnosti dosahovala i OTU 2 ve třetím týdnu rozkladu v obou vrstvách a OTU 3 ve třetím týdnu inkubace mycelií pod opadovou vrstvou (Obr. 22).
Obr. 22: Zastoupení četností sekvencí spadajících do nejčastějších OTU na myceliích během rozkladu. Jsou uvedeny průměry ze 4 stanovení a střední chyby průměru. 83
Analýza hlavních komponent vizualizovala rozdíl v četnosti jednotlivých OTU v půdě a na myceliu. První dvě osy představovaly 34,0 % a 20,1 % variability společenstva (Obr. 23). Analýzou ANOVA byl stanoven statisticky významný rozdíl v zastoupení jednotlivých OTU v půdě, v opadu a na myceliu (p = 0.001). Mezi četností OTU v organickém horizontu a opadu nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly (p > 0.05).
Obr. 23: Analýza hlavních komponent četnosti bakteriální OTU v půdě a na myceliu (p = 0,001)
K jednotlivým OTU byla nalezena nejpodobnější sekvence se známým taxonomickým zařazením na úrovni rodu. OTU, které měly četnost ≥ 0,5 % alespoň ve 3 vzorcích, byly zařazeny do 30 rodů. Zástupci rodů Telmatobacter, Granulicella a Candidatus Koribacter patřily mezi nejhojnější bakterie osídlují půdní organický horizont. V opadu dominoval rod Mucilaginibacter, časté byly také rody Burkholderia, Luteibacter a Granulicella. Na myceliu byly početné rody Pedobacter, Pseudomonas, Ewingella a Chitinophaga (Tab. 9). 84
Tab. 9: Přehled rodů a průměrných četností jejich sekvencí v půdě, na opadu a na myceliích. Četnosti jsou udány v ‰. (Bact = Bacteroidetes, Gamm = Gammaproteobacteria, Beta = Betaproteobacteria, Alph = Alphaproteobacteria, Firm = Firmicutes, Acti = Actinobacteria, Acid = Acidobacteria). Rod (kmen) Pedobacter (Bact) Pseudomonas (Gamm) Ewingella (Gamm) Chitinophaga (Bact) Variovorax (Beta) Sphingobacterium (Bact) Mucilaginibacter (Bact) Stenotrophomonas (Gamm) Janthinobacterium (Beta) Burkholderia (Beta) Pseudochrobactrum (Alph) Paenibacillus (Firm) Frondihabitans (Acti) Devosia (Alph) Ochrobactrum (Alph) Rhodococcus (Acti) Granulicella (Acid) Sphingomonas (Alph) Acidopila (Acid) Luteibacter (Gamm) Bradyrhizobium (Alph) Acidobacterium (Acid) Telmatobacter (Acid) Actinomadura (Acti) Aciditerrimonas (Acti) Iamia (Acti) Candidatus Solibacter (Acid) Candidatus Koribacter (Acid) Actinoallomurus (Acti) Pedosphaera (Verr)
Humus 5,6 25,0 0,3 9,5 0,9 2,3 28,8 0,1 0,2 14,1 0,1 24,6 1,4 0,8 0,3 0,0 46,8 0,9 59,1 12,9 20,1 37,2 61,6 23,2 36,1 37,0 30,3 46,5 23,4 21,5
85
Opad 21,6 5,1 14,7 12,6 8,8 5,6 216,4 0,3 5,7 63,7 0,0 1,3 11,7 4,2 0,3 0,2 50,1 32,6 7,8 56,9 19,7 14,7 1,5 1,3 1,2 0,6 5,2 0,8 1,5 2,5
Mycelium 359,3 283,5 106,1 55,1 20,9 14,4 13,9 11,6 10,1 9,2 7,3 6,1 5,9 5,5 3,5 3,4 2,7 2,7 2,6 2,2 2,0 1,5 1,0 0,8 0,8 0,7 0,7 0,6 0,5 0,3
Relativní četnost bakteriálních rodů v půdě, v opadu a na myceliích je znázorněna na Obr. 24 až 26. V půdě byla stanovena větší diverzita bakteriálních rodů než na opadu a myceliu. Žádný bakteriální rod zde nebyl dominantní. V opadu, a především na rozkládajícím se myceliu, již převládalo v bakteriálním společenstvu několik dominantních rodů.
Obr. 24: Relativní zastoupení bakteriálních rodů v půdě.
86
Obr. 25: Relativní zastoupení bakteriálních rodů v opadu.
Obr. 26: Relativní zastoupení bakteriálních rodů na myceliu. 87
U nejčastěji se vyskytujících rodů na myceliu byla pozorována jejich sukcese během rozkladu biomasy hub, podobně jako tomu bylo v případě analýzy jednotlivých OTU. Rod Pedobacter byl početný v pozdějších fázích rozkladu mycelií v obou vrstvách půdy. Naopak rody Pseudomonas, Ewingella, Mucilaginibacter, Janthinobacterium a Burkholderia byly zastoupeny ve výrazných počtech pouze v počátečních fázích rozkladu. Rod Ewingella byl přitom významný pouze v opadové vrstvě, rody Janthinobacterium a Burkholderia pouze v humusové vrstvě. Četnost rodu Variovorax dosáhla vrcholu během 9. týdne inkubace mycelií v půdě, zatímco u rodu Sphingobacterium bylo dosaženo maxima v opadové vrstvě. Množství bakterií rodu Chitinophaga přibývalo v pozdějších fázích rozkladu na myceliích v opadové i humusové vrstvě, rodu Stenotrophomonas pouze v opadové vrstvě (Obr. 27).
88
Obr. 27: Sukcese deseti nejčastějších bakteriálních rodů na myceliu během rozkladu. Zahrnuty jsou průměry ze 4 stanovení a střední chyby průměru.
Kmeny s četností > 1 % v půdě, opadu nebo na myceliu byly vybrány pro posouzení rozdílů mezi bakteriálními společenstvy v těchto prostředích. Zároveň byla sledována sukcese bakteriálních kmenů na rozkládajícím se myceliu, v opadové vrstvě a v organickém horizontu.
89
V půdě byla většina bakteriálních sekvencí zařazena do kmene Acidobacteria (32,5 %), třídy Alphaproteobacteria (17,4 %) a kmene Actinobacteria (16,2 %). S četností nad 1 % se v půdě vyskytovaly také zástupci taxonů Gammaproteobacteria (7,9 %), Bacteroidetes (5,5 %), Firmicutes (5,4 %), Verrucomicrobia (3,8 %), Deltaproteobacteria (2,6 %), Betaproteobacteria (2,1 %) a Cyanobacteria (1,4 %). Bakteriální společenstva v opadu se od společenstev v půdě lišily pouze v relativním zastoupení některých kmenů. V opadu se vyskytovalo více sekvencí řadících se do kmene Bacteroidetes (29,8 %), než v půdě. Nižší četnost v opadu byla stanovena u kmene Acidobacteria (10,9 %) a Actinobacteria (7,5 %). Na myceliu dominovaly dva kmeny, Bacteroidetes (44,8 %) a Gammaproteobacteria (41,4 %). Kmen Bacteroidetes byl zastoupen větším počtem sekvencí na myceliích, umístěných pod organickým horizontem, než třída Gammaproteobacteria. Ta byla naopak dominantnější ve svrchních vrstvách půdy. Dále byly na myceliu zastoupeny třídy Betaproteobacteria (4,8 %), Alphaproteobacteria (3,9 %) a kmeny Actinobacteria (2,3 %), Firmicutes (1,1 %) a Acidobacteria (1,0 %). Ostatní kmeny nepřekročily hranici 1 % (Obr. 28).
100 90 80 70
%
60 50 40 30 20 10 0 Půda Bacteroidetes Alphaproteobacteria Acidobacteria Cyanobacteria
Opad Gammaproteobacteria Actinobacteria Verrucomicrobia Ostatní
Mycelium Betaproteobacteria Firmicutes Deltaproteobacteria
Obr. 28: Relativní zastoupení sekvencí bakteriálních kmenů v půdě, opadu a na myceliu.
90
Během rozkladu mycelia docházelo k sukcesi bakteriálního společenstva. V počátečních fázích rozkladu mycelia v půdě i v opadu byla patrná dominance bakteriálních sekvencí náležejících do kmene Gammaproteobacteria. Od 9. týdnu rozkladu ovšem převládaly sekvence kmene Bacteroidetes. Relativní četnost bakteriálních sekvencí ostatních kmenů byla nízká. Například kmen Acidobacteria, který se hojně vyskytoval v půdě, byl na myceliu přítomen pouze v prvních dvou týdnech rozkladu. Zástupci tříd Alphaproteobacteria a Betaproteobacteria kolonizovali mycelia především v pozdějších fázích inkubace. Zástupci kmenů Firmicutes a Actinobacteria byly přítomny v nízkém počtu téměř během celého rozkladu mycelia (Obr. 29).
100 90 80 70
%
60 50 40 30 20 10 0 P1
P2
P3
P9
Bacteroidetes Alphaproteobacteria Acidobacteria Cyanobacteria
P15
P21
O1
O2
Gammaproteobacteria Actinobacteria Verrucomicrobia Ostatní
O3
O9
O15
O21
Betaproteobacteria Firmicutes Deltaproteobacteria
Obr. 29: Relativní zastoupení sekvencí bakteriálních kmenů na myceliu inkubovaném pod organickým horizontem (P) a opadovou vrstvou (O) během rozkladu. Čísla udávají počet týdnů inkubace v půdě.
Pro jednotlivé vzorky byly stanoveny indexy diverzity. Druhová bohatost, která vyjadřovala počet druhů ve vzorku, byla významně vyšší v půdě než na myceliu. Nejnižší druhová bohatost byla při rozkladu mycelií hub stanovena ve 3. týdnu inkubace v obou půdních vrstvách. Zatímco odhady celkového počtu druhů Chao1 byly u půdy a opadu mezi 850-900 91
OTU, u mycelia to bylo pouze 100-400 OTU. Chao1 index byl tedy přibližně 3,5x vyšší u půdy v porovnání s myceliem. Nejnižších hodnot opět dosahoval ve 3. týdnu rozkladu. Shannon-Wiener index byl u vzorků půdy oproti myceliu dvojnásobný. Vyšší hodnota vyrovnanosti byla stanovena u vzorků půdy a opadu, než u vzorků mycelií. Během rozkladu se vyrovnanost ve vzorcích mycelia zvyšovala (Tab. 10).
92
Tab. 10: Indexy diverzity pro vzorky humusu, opadu, mycelia, mycelia pod opadovou vrstvou (MO) a mycelia pod organickým horizontem (MP) v jednotlivých týdnech inkubace v půdě. Zahrnuty jsou průměry z 8 (humus, opad), 46 (mycelium) a 4 (mycelium v čase) stanovení a střední chyby průměru. Materiál Humus Opad Mycelium MO1 MO2 MO3 MO9 MO15 MO21 MP1 MP2 MP3 MP9 MP15 MP21
Druhová bohatost (S) 412 ± 17 396 ± 25 112 ± 9 143 ± 44 137 ± 38 45 ± 5 81 ± 5 129 ± 15 157 ± 8 190 ± 80 60 ± 15 56 ± 4 90 ± 4 126 ± 13 133 ± 8
Chao-1 854 ± 48 893 ± 73 263 ± 24 429 ± 107 349 ± 109 155 ± 49 161 ± 9 278 ± 45 359 ± 23 425 ± 202 139 ± 42 93 ± 8 183 ± 14 301 ± 43 296 ± 19
93
Shannon-Wiener index 5,52 ± 0,06 5,33 ± 0,13 2,73 ± 0,11 2,13 ± 0,62 2,44 ± 0,38 2,03 ± 0,19 2,53 ± 0,23 3,08 ± 0,25 3,47 ± 0,13 3,57 ± 0,83 1,90 ± 0,18 2,29 ± 0,12 2,88 ± 0,08 3,30 ± 0,11 3,16 ± 0,19
Vyrovnanost 0,92 ± 0,00 0,89 ± 0,01 0,59 ± 0,02 0,42 ± 0,10 0,52 ± 0,06 0,53 ± 0,04 0,58 ± 0,05 0,63 ± 0,04 0,69 ± 0,02 0,70 ± 0,09 0,47 ± 0,02 0,57 ± 0,02 0,64 ± 0,02 0,68 ± 0,01 0,65 ± 0,03
6 Diskuze Rozkladu biomasy hub v lesní půdě bylo již věnováno několik studií (Koide a Malcolm 2009, Koide a kol. 2011, Ekblad a kol. 2013, Drigo a kol. 2012), nicméně komplexní pohled na rozklad houbové biomasy in situ v lesní půdě stále chybí. Vývoj nových metod zkoumání půdních ekosystémů umožnil získat detailnější informace o struktuře a složení mikrobiálních společenstev. Díky tomu si můžeme vytvořit lepší představu o rozkladu biomasy hub v lesní půdě. Výsledky diskutované v této části práce sestávají opět ze dvou experimentů. První z nich byl založen na srovnání rozkladu myceliích dvou druhů hub (T. felleus a Rusulla sp.) a okolní půdy. Druhý experiment pracoval pouze s myceliem druhu T. felleus, které bylo inkubovaného v různých půdních horizontech. Pro přehlednost textu je diskuze rozdělena, stejně jako výsledky, do dvou částí v závislosti na daném experimentu.
6.1 Xaverov 1 Rozklad mycelií T. felleus a Rusulla sp. probíhal v počátečních fázích inkubace v lesní půdě velmi rychle. Během prvních několika týdnů bylo rozloženo více než 60 % mycelia hub. Tyto výsledky jsou v souladu také s jinými studiemi (Koide a Wu 2003, Koide a Malcolm 2009). Rozdíly v rychlosti rozkladu T. felleus a Rusulla sp. nebyly příliš velké. Důvodem rychlého rozkladu houbového mycelia je patrně velký povrch houbových hyf, které jsou v kontaktu s okolní půdou, a tím snadno přístupné pro mikrobiální rozkladače. Další příčinou může být chemické složení buněčné stěny. Nepřítomnost ligninu a jiných obtížně rozložitelných látek v buněčné stěně hub může podstatně urychlit rozklad houbové biomasy (Koide a kol. 2011). Přestože některé studie poukazují na špatnou rozložitelnost chitinu (Godbold a kol. 2006, Treseder a Allen 2000), přítomnost chitinu, jako obtížně rozložitelného polymeru, není patrně pro počáteční fázi rozkladu rozhodující. Chitin je obsažen v buněčné stěně hub v takovém množství, jaké by nemělo mít na rychlost rozkladu velký vliv. Navíc je rozklad chitinu na rozdíl od celulózy a ligninu, což jsou látky obsažené v buněčných stěnách rostlin, daleko rychlejší (Koide a kol. 2011). Při srovnání prvkového složení mycelií během rozkladu a okolní půdy byl stanoven vyšší obsah dusíku u mycelií než v okolní půdě. To není překvapující zjištění, neboť biomasa hub obsahuje značné množství dusíku (Langley a Hungate 2003). Vliv rozkladu mycelia na 94
obsah dusíku lze u prvního experimentu těžko posoudit, protože během degradace se obsah dusíku u mycelií T. felleus mírně zvyšoval a u mycelií Rusulla sp. naopak mírně klesal. Stanovení poměru C/N prokázalo vyšší hodnoty u půdy než u mycelií. Tento fakt vychází z vysokého obsahu dusíku v houbové biomase. U obou druhů mycelií měl poměr C/N hodnotu přibližně 12. To se shoduje s výsledky Koide a Malcolm (2009), kteří udávají průměrnou hodnotu C/N přibližně 13,3. Poměr C/N je jedním z faktorů, které ovlivňují rychlost rozkladu houbového mycelia v počátečních fázích dekompozice v půdě. Při porovnání poměru C/N v houbové biomase a rostlinném opadu dojdeme k závěru, že mnohem nižší poměr C/N houbového mycelia může urychlit rychlost jeho rozkladu (Koide a Malcolm 2009). Celková enzymová aktivita na rozkládajícím se myceliu byla výrazně vyšší než enzymová aktivita v okolní půdě. To je spojeno s přítomností mycelia hub jako snadno dostupného substrátu pro výživu mikroorganismů a koresponduje s rychlejším rozkladem mycelia, než je tomu u rostlinného opadu, kde dochází k 50 % ztrátě hmotnosti až po roce inkubace (Šnajdr a kol. 2011). Buněčná stěna hub je složena převážně z polysacharidů, ale jejich relativní zastoupení se může lišit mezi různými skupinami hub (Bowman a Free 2006). Tato skutečnost by mohla vysvětlovat rozdílnou enzymovou aktivitu, stanovenou při rozkladu druhu T. felleus a Rusulla sp.. V průběhu rozkladu mycelií docházelo ke změnám v celkové enzymové aktivitě. Inhibice enzymové aktivity v průběhu prvních 4 týdnů rozkladu mycelia může být způsobena vyčerpáním jednoduchých organickým látek, jejichž rozklad je v půdě velmi rychlý (Osono 2007). S tím mohou být spojeny také sukcesní změny ve složení společenstev mikrobiálních rozkladačů. Primární kolonizátoři mycelií hub mohou být v pozdějších fázích dekompozice mycelia nahrazeny mikroorganismy, specializovanými na rozklad složitějších látek. Tím dochází k dalšímu přísunu dostupných látek pro mikrobiální růst, který je spojen se zvýšenou enzymovou aktivitou. Další vysvětlení inhibice enzymové aktivity v prvních týdnech dekompozice a jejího následného vzrůstu, může být založena na vlivu půdní mikrofauny, která svou aktivitou rozrušuje houbová mycelia a dodává tak vysoce energeticky bohaté látky do půdního prostředí (Ekblad a kol. 2013). Jednotlivé enzymy hrají rozdílné role při rozkladu různých složek mycelia hub. βglukozidáza, α-glukozidáza, celobiohydroláza, β-xylozidáza, β-manozidáza a α-galaktozidáza jsou známy jako enzymy, které se podílejí na rozkladu různých polysacharidů (Suwanto a kol. 2011, Šnajdr a kol. 2011). Chitináza (N-acetylglukozamidáza) je hlavním enzymem, uplatňujícím se při rozkladu chitinu v buněčných stěnách hub. Její produkce je v půdě řízena 95
inducibilně (Dahiya a kol. 2006), což vysvětluje rozdíl mezi nízkou chitinázovou aktivitou v půdě a vysokou aktivitou na myceliích hub. Dalším enzymem, u kterého byla stanovena výrazně odlišná aktivita v půdě a na myceliích, byla alanin-aminopeptidáza. Alanin-aminopeptidáza patří mezi proteázy, které hydrolyzují půdní proteiny. Jejich aktivita je vysoce stimulovaná přítomností zdrojů dusíku a uhlíku v prostředí (Geisseler a Horwath 2008). Pro cyklus fosforu v půdě je důležitá aktivita fosfatázy (fosfomonoesterázy), která hydrolyzuje monoesterové vazby organických sloučenin fosforu, a uvolňuje fosfázy, které jsou nezbytnou součástí výživy mikroorganismů. Z toho důvodu byla fosfatáza nejvýznamnějším enzymem v půdních vzorcích a svůj význam měla také při rozkladu houbového mycelia. Analýzou ANOVA byl prokázán statisticky významný rozdíl ve složení mikrobiálních společenstev v půdě a na myceliích. Tyto výsledky odpovídají patrně schopnosti některých mikroorganismů rychle kolonizovat dostupný substrát nebo preferenci určitých mikroorganismů k tomuto substrátu. Mezi myceliem T. felleus a Rusulla sp. nebyl prokázán statisticky významný rozdíl ve složení bakteriálních a houbových společenstev. Toto zjištění vychází pravděpodobně z podobného chemického složení obou druhů hub, které nijak neselektuje možné kolonizátory.
6.2 Xaverov 2 Ve druhém experimentu bylo mycelium hub umístěno do dvou půdních vrstev. Rozklad mycelia, umístěného pod organickým horizontem, probíhal v počátečních fázích významně rychleji než ve svrchních vrstvách půdy. Důvodů k tomuto zjištění mohlo být několik. Opadová vrstva je více vystavena působení klimatických podmínek než organický horizont. Jelikož počáteční rozklad mycelia probíhal v zimním období, mohla být aktivita mikroorganismů degradujících houbovou biomasu pod opadovou vrstvou ovlivněna nízkou teplotou více, než aktivita mikroorganismů v organickém horizontu. Jiným vysvětlením nižší rychlosti rozkladu pod opadovou vrstvou může být negativní zpětná vazba, ke které dochází při vysokém obsahu živin v půdě. Mikrobiální aktivita může být tímto způsobem inhibována a mineralizace substrátu tím značně zpomalena (Olander a Vitousek 2000). Rozdíly v obsahu dusíku mezi myceliem, umístěným v opadu a v organickém horizontu, nebyly příliš výrazné. Během rozkladu mycelií docházelo k nárůstu obsahu dusíku v houbové biomase. To je ve shodě s výsledky Koide a Malcolm (2009). Poměr C/N se bě-
96
hem rozkladu snižoval, což je patrně způsobeno tím, že během rozkladu dochází k mineralizaci uhlíkatých látek na CO2, které se systému unikají (Koide a Malcolm 2009). Jelikož uhlíku ubývá rychleji než dusíku, poměr C/N klesá. Aktivita půdních enzymů byla stanovena vyšší v opadové vrstvě než v organickém horizontu. To souvisí s prostorovou heterogenitou půdního profilu. Andersson a kol. (2004) stanovily, shodně s výsledky této práce, vyšší enzymovou aktivitu v opadové vrstvě než v organickém horizontu. Vyšší enzymová aktivita v opadové vrstvě byla stanovena také v práci Šnajdr a kol. (2008), která se zabývala enzymovou aktivitou v půdě listnatého lesa (Q. petraea). Tento rozdíl je patrně spojen s aktivním růstem půdních mikroorganismů v opadové vrstvě. Hlubší vrstvy půdy obsahují méně dostupného substrátu pro mikrobiální růst, proto je zde aktivita enzymů nižší. Jednotlivé aktivity enzymů byly již diskutovány v kapitole Xaverov 1. Zde zmíním jen několik nových poznatků, které byly získány ve druhém experimentu. Aktivita většiny enzymů se během rozkladu snižovala. Výjimkou byla aktivita lipázy, která se postupně zvyšovala. Tato zjištění mohou souviset s vyčerpáním snadno využitelných látek. Chitináza si udržovala vysokou aktivitu během celého rozkladu. Nárůst aktivit β-glukozidázy, celobiohydrolázy a β-xylozidázy v 9. týdnu rozkladu v organické vrstvě může být opět spojen se sukcesními změnami mikrobiálních rozkladačů nebo s vnějšími vlivy prostředí. Kvantifikace bakterií prokázala vyšší četnost bakterií na opadu než v organickém horizontu. Tyto výsledky odpovídající skutečnosti, že množství bakterií klesá s rostoucí hloubkou půdy (Taylor a kol. 2002). S tím souvisí také vyšší četnost bakterií na myceliu umístěném pod opadovou vrstvou, než na myceliu pod organickým horizontem. Maximálního počtu bakterií bylo dosaženo na myceliu v humusu během 9. týdne a na myceliu v opadu během 15. týdnu rozkladu. Po této fázi patrně došlo k poklesu početnosti bakteriálního společenstva z důvodu vyčerpání substrátu, neboť se následně počet bakterií postupně snižoval. Výsledky stanovení počtu kultivovatelných bakterií na myceliu a v půdě odpovídaly hodnotám, získaným z kvantitativní PCR. Mezi nejčastějšími bakteriálními izoláty, získanými z 3., 9. a 21. týdne rozkladu mycelií v půdě, byly zástupci rodů Pseudomonas, Chitinophaga, Pedobacter, Janthinobacterium, Renibacterium a Stenotrophomonas, což jsou běžné, kultivovatelné bakterie v půdě. Rod Pseudomonas byl již dříve identifikován jako hojný bakteriální rod, vyskytující se v různých typech půd (Janssen 2006). Zástupci jednotlivých izolátů byly zařazeni do kmenů Pro-
97
teobacteria, Actinobacteria a Bacteroidetes. Diverzita bakteriálních izolátu byla vyšší v pozdějších fázích rozkladu mycelií, což je patrně způsobeno postupným vyčerpáním dostupných organických živin a rychlým růstem primárních kolonizátorů. Vybrané izoláty byly testovány na produkci chitináz. U nejčastěji izolovaného rodu Pseudomonas byla stanovena velmi nízká chitinázová aktivita. Výsledky studie de Boer a kol. (1998) poukazují u pseudomonád na výraznou chitinázovou aktivitu, nicméně tento rod je tak obsáhlý, že v našem případě mohlo dojít k izolaci převážně nechitinolytických zástupců. Mezi izoláty s nejvyšší chitinázovou aktivitou byly zařazeny rody Renibacterium, Serratia, Pedobacter a Flavobacterium. Vysokou chitinázovou aktivitu měl i blíže neurčený izolát, který se řadil do říše Archaea. Rod Renibacterium obsahuje psychrotrofní bakterie, u nichž nebyla v půdě chitinázová aktivita zatím prokázána. Naopak významným producentem chitinolytických enzymů je rod Serratia (de Boer a kol. 1998, Brurberg a kol. 2001). Chitinázová aktivita byla již dříve popsána také u rodu Pedobacter (Nissinen a kol. 2012) i Flavobacterium (Takegawa a kol. 1991). 454-pyrosekvenací byly získány údaje o složení bakteriálního společenstva a relativním zastoupení bakteriálních taxonů v půdě, opadu a na rozkládajících se myceliích. Selekcí dat bylo získáno 98 nejčastějších OTU. U většiny OTU se statisticky významně lišila jejich relativní abundance v půdě, v opadu a na myceliích. Statisticky významný rozdíl byl stanoven také analýzou ANOVA. Mezi četností OTU v organickém horizontu a opadu nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly. Nejčastější OTU v organickém horizontu byla OTU 5 (Telmatobacter sp.), v opadu OTU 9 (Mucilaginibacter sp.) a na myceliu OTU 1 (Pedobacter cryoconitis). Sekvenací se nám podařilo získat izolát, který měl s konsensus sekvencí OTU 1 98,1 % podobnost sekvencí a do tohoto OTU by tedy náležel. Z toho můžeme usuzovat, že jsme izolovali nejčastější druh vyskytující se na rozkládajícím se myceliu. Na myceliu docházelo během rozkladu ke změnám četnosti sekvencí nejčastějších OTU – OTU 1 (Pedobacter cryoconitis), OTU 2 (Pseudomonas sp.), OTU 3 (Pseudomonas sp.) a OTU 4 (Ewingella americana). Zatímco abundance OTU 1 se během rozkladu zvyšovala, abundance ostatních OTU po 3. týdnu rozkladu mycelií klesala. K nejčastějším OTU byla nalezena nejpodobnější sekvence se známým taxonomickým zařazením na úrovni rodu. Nejpočetnějšími bakteriemi v půdě byly zástupci rodů Telmatobacter, Granulicella a Candidatus Koribacter, kteří se řadí do kmene Acidobacteria. Jedná se o aerobní nebo fakultativně anaerobní, nekultivovatelné, psychrotolerantní bakterie, 98
které preferují kyselé půdy s nízkým obsahem živin (Männistö a kol. 2012). U rodu Telmatobacter byla studií Pankratov a kol. (2012) prokázána chitinázová aktivita. V opadu dominoval rod Mucilaginibacter. Zástupci tohoto rodu jsou acidofilní, psychrotolerantní bakterie, které byly již dříve izolovány například z rašelinné půdy (Pankratov a kol. 2007). Dále byly s vyšší abundancí přítomny rody Burkholderia a Luteibacter. Tyto rody jsou známými endofytními bakteriemi rostlin (Johansen a kol. 2005, Nissinen a kol. 2012). Rod Burkholderia je také často přítomen v myceliích houby Gigaspora margarita (Ruiz-Lozano a Bonfante 2001). Na myceliích se vyskytovaly nejčastěji rody Pedobacter, Pseudomonas a Ewingella. U těchto rodů, řadících se mezi kmeny Bacteroidetes a Gammaproteobacteria, byla již dříve prokázána chitinázová aktivita (de Boer a kol. 1998, Inglis a Peberdy 1997, Nissinen a kol. 2012). V půdě byla stanovena vyšší diverzita bakteriálních rodů než v opadu a na myceliu. Sukcesní změny byly pozorovány na myceliu během rozkladu u deseti nejčastějších rodů. Rod Pedobacter byl hojný po 9. týdnu inkubace mycelií v půdě. Tento trend byl zaznamenán také u rodu Chitinophaga v opadové vrstvě. To může být, kromě jiných faktorů prostředí, způsobeno jejich chitinázovou aktivitou, která zvýhodňuje tyto rody v pozdějších fázích rozkladu mycelií (Nissinen a kol. 2012, Sangkhobol a Skerman 1981). Naopak rody Pseudomonas, Ewingella, Mucilaginibacter, Janthinobacterium a Burkholderia byly dominantní během prvních 3 týdnů rozkladu. U většiny těchto rodů byla již dříve také popsána chitinolytická aktivita, nicméně naše výsledku stanovení chitinázové aktivity u bakteriální izolátů prokázaly, že izoláty rodu Pedobacter a Chitinophaga měly chitinázovou aktivitu mnohem vyšší. Výskyt rodů Ewingella a Stenotrophomonas byl omezen pouze na opadovou vrstvu, rodů Janthinobacterium a Burkholderia pouze na organický horizont. V organickém horizontu byly bakteriální sekvence zařazeny do 10 kmenů. Dominantní byl kmen Acidobacteria (32,5 %), třída Alphaproteobacteria (17,4 %) a kmen Actinobacteria (16,2 %). Tyto výsledky odpovídají studii Baldrian a kol. (2012), která identifikovala dominantní kmeny v půdě jehličnatého lesa pomocí izolace DNA a RNA a následné pyrosekvenace. Ostatní taxony nepřekročily abundanci 8 %. V opadové vrstvě bylo relativní zastoupení bakteriální kmenů výrazně odlišné. Zde dominoval kmen Bacteroidetes (29,8 %), třída Gammaproteobacteria (10,9 %) a kmen Actinobacteria (7,5 %). Výrazně vyšší abundance oproti organickému horizontu byla zaznamenána u kmene Verrucomicrobia, jehož četnost je výrazně ovlivněna vlhkostí půdy (Buckley a Schmidt 2001). Podobných výsledků dosáhli i Roesch a kol. (2007) ve studii, zabývající se diverzitou bakteriálních společenstev lesních a zemědělských půd Jižní a Severní Ameriky. 99
Mezi nejčastější kmeny byly v této studii zařazeny Proteobacteria a Bacteroidetes, nicméně v kmeni Proteobacteria dominovaly, na rozdíl od našich výsledků, třídy Alphaproteobacteria a Betaproteobacteria. Tento rozdíl mohl být způsoben rozdílným pH půdy, neboť v oblastech s nízkým pH byla stanovena dominance třídy Gammaproteobacteria, kmene Bacteroidetes a kmene Actinobacteria (Roesch a kol. 2007). Na myceliu byly nejčastější dva taxony: Bacteroidetes (44,8 %) a Gammaproteobacteria (41,4 %). Kmen Bacteroidetes byl častější na myceliích pod organickým horizontem, třída Gammaproteobacteria pod opadovou vrstvou, což mohlo být způsobeno tím, že jsou proteobakterie častěji nalézány v kontaktu s rostlinami, než v okolní na uhlík chudé půdě (Fierer a kol. 2007). S tím mohou být spojeny i změny dominance těchto taxonů během rozkladu mycelia. V počátečních fázích rozkladu dominovaly na myceliu zástupci třídy Gammaproteobacteria, v pozdějších fázích byly nahrazeni zástupci kmene Bacteroidetes. Kmen Acidobacteria, který se vyskytoval hojně v půdě, byl přítomen na myceliu pouze v prvních dvou týdnech rozkladu, což potvrzuje jeho preference k půdám s nízkým obsahem živin (Fierer a kol. 2007). Analýza diverzity prokázala vyšší bakteriální diverzitu a vyrovnanost bakterií ve vzorcích půdy než mycelia, které bylo charakteristické dominancí několika bakteriálních rodů. To odpovídá menší variabilitě chemického složení mycelia oproti komplexnímu prostředí půdy a opadu, a s tím související nižší diverzitou ekologických nik.
100
7 Závěr Tato práce sledovala několik cílů, které měly popsat rozklad houbového mycelia v lesní půdě a identifikovat složení a funkci jeho případných rozkladačů. V prvním experimentu probíhal rozklad mycelia hub v lesní půdě velmi rychle. Během 4 týdnů bylo rozloženo 66 % mycelia T. felleus a dokonce 77 % mycelia Rusulla sp.. Po čtvrtém týdnu inkubace mycelií v půdě se rychlost rozkladu rapidně snížila. Obsah uhlíku, dusíku a vodíku byl výrazně vyšší u mycelií než v okolní půdě. Mezi obsahem těchto prvků u T. felleus a Rusulla sp. nebyly nalezeny významné rozdíly. Poměr C/N byl vyšší u vzorků půdy než na myceliích. Výrazně vyšší enzymová aktivita byla naměřena na rozkládajícím se myceliu, než v okolní půdě. Rozdíly v enzymových aktivitách byly pozorovány také mezi oběma druhy hub. Složení bakteriálního a houbové společenstva v půdě se výrazně lišilo od mikrobiálního společenstva kolonizujícího rozkládající se mycelia. V druhém experimentu probíhal počáteční rozklad mycelií pomaleji. Během prvních 4 týdnů bylo rozloženo pouze 10,3 % hmotnosti mycelií umístěných pod opadovou vrstvou a 39,9 % hmotnosti mycelií, umístěných pod organickým horizontem. Nicméně ve 21. týdnu inkubace mycelií v půdě bylo již degradováno 75 % hmotnosti mycelií, umístěných pod opadovou vrstvou, a 73 % hmotnosti mycelií, umístěných pod organickým horizontem. Obsah dusíku na myceliích se během rozkladu hub mírně zvýšil, poměr C/N naopak mírně poklesl. Vyšší enzymová aktivita byla stanovena v opadové vrstvě, než v organickém horizontu. Množství bakterií na rozkládajících se myceliích bylo vyšší, než v půdě a opadu. Kultivací a následnou sekvenací bakterií byly identifikovány nejčastější bakteriální izoláty v půdě a na myceliích, mezi něž patřily rody Pseudomonas, Chitinophaga, Pedobacter, Janthinobacterium, Renibacterium a Stenotrophomonas. V počátečních fázích rozkladu byl dominantním izolátem rod Pseudomonas, v pozdějších fázích došlo k větší diverzifikaci bakteriálního společenstva. Bakteriální izoláty byly zařazeny do kmenů Proteobacteria, Bacteroidetes a Actinobacteria. Mezi izoláty s nejvyšší chitinázovou aktivitou patřily rody Renibacterium, Serratia, Pedobacter a Flavobacterium. Sekvence části bakteriální 16S rDNA získané pomocí pyrosekvenace, byly použity pro popis složení a četnosti bakteriálního společenstva v půdě, v opadu a na myceliích během rozkladu. Abundance většiny OTU byla odlišná v půdě, v opadu a na myceliích. Mezi abundancí OTU v organickém horizontu a opadu nebyl nalezen statisticky významný rozdíl, nicméně nejčastěji zastoupenou OTU v organickém horizontu byla OTU 5 (Telmatobacter 101
sp.), zatímco v opadové vrstvě byla nejhojnější OTU 9 (Mucilaginibacter sp.) a na rozkládajících se myceliích dominovala OTU 1 (Pedobacter cryoconitis) a dále OTU 2 (Pseudomonas sp.), OTU 3 (Pseudomonas sp.) a OTU 4 (Ewingella americana). Během rozkladu se měnila jejich relativní četnost. Mezi nejhojnější rody, osídlující organický horizont, patřily Telmatobacter, Granulicella a Candidatus Koribacter. V opadu dominovaly rody Mucilaginibacter, Burkholderia, Luteibacter a Granulicella. Na myceliích byly nejčastěji zastoupeny rody Pedobacter, Pseudomonas, Ewingella a Chitinophaga. V organickém horizontu půdy a na opadu byla pozorována výrazně vyšší diverzita bakterií než na myceliu. Výsledky této práce poskytují bližší pohled na rozklad houbové biomasy v lesní půdě a strukturu společenstva mikrobiálních rozkladačů, nicméně stále existuje v této problematice mnoho nezodpovězených otázek. Tato práce se proto může stát podkladem pro další zkoumání ekologie půdních mikroorganismů při rozkladu houbových mycelií, například podrobnějším studiem ekofyziologie bakteriálních izolátů, reprezentujících dominantní taxony, vyskytující se na myceliu hub.
102
8 Seznam použité literatury AGERER R. (2001): Exploration types of ectomycorrhizae. Mycorrhiza 11, 107-114. AJIT N., VERMA R., SHANMUGAM V. (2006): Extracellular chitinases of fluorescent pseudomonads antifungal to Fusarium oxysporum f. sp. dianthi causing carnation wilt. Curr. Microbiol. 52, 310-316. ANDERSON I. C., CAIRNEY J. W. G. (2007): Ectomycorrhizal fungi: exploring the mycelial frontier. FEMS Microbiol. Rev. 31, 388-406. ANDERSSON M., KJØLLER A., STRUWE S. (2004): Microbial enzyme activities in leaf litter, humus and mineral soil layers of European forests. Soil Biol. Biochem. 36, 1527-1537. ATTIWILL P. M., ADAMS M. A. (1993): Nutrient cycling in forests. New Phytol. 124, 561582. AXELROOD P. E., CHOW M. L., RADOMSKI C. C., MCDERMOTT J. M., DAVIES J. (2002): Molecular characterization of bacterial diversity from British Columbia forest soils subjected to disturbance. Can. J. Microbiol. 48, 655-674. BÅÅTH E., ANDERSON T. H. (2003): Comparison of soil fungal/bacterial ratios in a pH gradient using physiological and PLFA-based techniques. Soil Biol. Biochem. 35, 955-963. BÅÅTH E., NILSSON L. O., GÖRANSSON H., WALLANDER H. (2004): Can the extent of degradation of soil fungal mycelium during soil incubation be used to estimate ectomycorrhizal biomass in soil? Soil Biol. Biochem. 36, 2105-2109. BALDRIAN P., KOLARIK M., STURSOVA M., KOPECKY J., VALASKOVA V., VETROVSKY T., ZIFCAKOVA L., SNAJDR J., RIDL J., VLCEK C., VORISKOVA J. (2012): Active and total microbial communities in forest soil are largely different and highly stratified during decomposition. ISME J 6, 248-258. BALDRIAN P., VALÁŠKOVÁ V. (2008): Degradation of cellulose by basidiomycetous fungi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 501-521. BALDRIAN P., VĚTROVSKÝ T., CAJTHAML T., DOBIÁŠOVÁ P., PETRÁNKOVÁ M., ŠNAJDR J., EICHLEROVÁ I. (2013): Estimation of fungal biomass in forest litter and soil. Fungal Ecol. 6, 1-11.
103
BARBIERI E., RICCIONI G., PISANO A., SISTI D., ZEPPA S., AGOSTINI D., STOCCHI V. (2002): Competitive PCR for quantitation of a Cytophaga-FlexibacterBacteroides phylum Bacterium associated with the Tuber borchii Vittad. mycelium. Appl. Environ. Microbiol. 68, 6421-6424. BARBOZA-CORONA J. E., CONTRERAS J. C., VELÁZQUEZ-ROBLEDO R., BAUTISTA-JUSTO M., GÓMEZ-RAMÍREZ M., CRUZ-CAMARILLO R., IBARRA J. E. (1999): Selection of chitinolytic strains of Bacillus thuringiensis. Biotechnol. Lett. 21, 1125-1129. BARNETT H. L. (1963): The nature of mycoparasitism by fungi. Annu. Rev. Microbiol. 17, 1-14. BATJES N. H. (1998): Mitigation of atmospheric CO2 concentrations by increased carbon sequestration in the soil. Biol. Fertility Soils 27, 230-235. BENDING G. D., POOLE E. J., WHIPPS J. M., READ D. J. (2002): Characterisation of bacteria from Pinus sylvestris–Suillus luteus mycorrhizas and their effects on root– fungus interactions and plant growth. FEMS Microbiol. Ecol. 39, 219-227. BERTAUX J., SCHMID M., HUTZLER P., HARTMANN A., GARBAYE J., FREYKLETT P. (2005): Occurrence and distribution of endobacteria in the plant-associated mycelium of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N. Environ. Microbiol. 7, 1786-1795. BERTAUX J., SCHMID M., PREVOST-BOURE N. C., CHURIN J. L., HARTMANN A., GARBAYE J., FREY-KLETT P. (2003): In situ identification of intracellular bacteria related to Paenibacillus spp. in the mycelium of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N. Appl. Environ. Microbiol. 69, 4243-4248. BHATTACHARYA D., NAGPURE A., GUPTA R. K. (2007): Bacterial chitinases: properties and potential. Crit. Rev. Biotechnol. 27, 21-28. BIANCIOTTO V., BANDI C., MINERDI D., SIRONI M., TICHY H. V., BONFANTE P. (1996): An obligately endosymbiotic mycorrhizal fungus itself harbors obligately intracellular bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3005-10. BIANCIOTTO V., BONFANTE P. (2002): Arbuscular mycorrhizal fungi: a specialised niche for rhizospheric and endocellular bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek 81, 365371. BIANCIOTTO V., LUMINI E., BONFANTE P., VANDAMME P. (2003): ‘Candidatus Glomeribacter gigasporarum’ gen. nov., sp. nov., an endosymbiont of arbuscular mycorrhizal fungi. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53, 121-124. 104
BLANCHETTE R. A., SHAW C. G. (1978): Associations among bacteria, yeasts, and basidiomycetes during wood decay. Phytopathology 68, 631-637. BOWEN G. D., THEODOROU C. (1979): Interactions between bacteria and ectomycorrhizal fungi. Soil Biol. Biochem. 11, 119-126. BOWMAN S. M., FREE S. J. (2006): The structure and synthesis of the fungal cell wall. Bioessays 28, 799-808. BRODA P., BIRCH P. R. J., BROOKS P. R., SIMS P. F. G. (1996): Lignocellulose degradation by Phanerochaete chrysosporium: gene families and gene expression for a complex process. Mol. Microbiol. 19, 923-932. BRULÉ C., FREY-KLETT P., PIERRAT J. C., COURRIER S., GÉRARD F., LEMOINE M. C., ROUSSELET J. L., SOMMER G., GARBAYE J. (2001): Survival in the soil of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor and the effects of a mycorrhiza helper Pseudomonas fluorescens. Soil Biol. Biochem. 33, 1683-1694. BRURBERG M. B., SYNSTAD B., KLEMSDAL S. S., VAN AALTEN D. M., SUNDHEIM L., EIJSINK V. G. (2001): Chitinases from Serratia marcescens. Recent Res Dev Microbiol 5, 187-204. BUCKLEY D. H., SCHMIDT T. M. (2001): Environmental factors influencing the distribution of rRNA from Verrucomicrobia in soil. FEMS Microbiol. Ecol. 35, 105112. BUDI S. W., VAN TUINEN D., ARNOULD C., DUMAS-GAUDOT E., GIANINAZZIPEARSON V., GIANINAZZI S. (2000): Hydrolytic enzyme activity of Paenibacillus sp. strain B2 and effects of the antagonistic bacterium on cell integrity of two soilborne pathogenic fungi. Applied Soil Ecology 15, 191-199. BULL C. T., SHETTY K. G., SUBBARAO K. V. (2002): Interactions between Myxobacteria, plant pathogenic fungi, and biocontrol agents. Plant Dis. 86, 889-896. BURKE D. J., DUNHAM S. M., KRETZER A. M. (2008): Molecular analysis of bacterial communities associated with the roots of Douglas fir (Pseudotsuga menziesii) colonized by different ectomycorrhizal fungi. FEMS Microbiol. Ecol. 65, 299-309. BURKE D. J., KRETZER A. M., RYGIEWICZ P. T., TOPA M. A. (2006): Soil bacterial diversity in a loblolly pine plantation: influence of ectomycorrhizas and fertilization. FEMS Microbiol. Ecol. 57, 409-419.
105
BUTLER M. J., DAY A. W. (1998): Fungal melanins: a review. Can. J. Microbiol. 44, 11151136. BUYER J. S., ROBERTS D. P., RUSSEK-COHEN E. (2002): Soil and plant effects on microbial community structure. Can. J. Microbiol. 48, 955-964. CITTERIO B., MALATESTA M., BATTISTELLI S., MARCHEGGIANI F., BAFFONE W., SALTARELLI R., STOCCHI V., GAZZANELLI G. (2001): Possible involvement of Pseudomonas fluorescens and Bacillaceae in structural modifications of Tuber borchii fruit bodies. Can. J. Microbiol. 47, 264-268. CLAUSEN C. A. (1996): Bacterial associations with decaying wood: a review. Int. Biodeterior. Biodegrad. 37, 101-107. CROMACK J. K., FICHTER B. L., MOLDENKE A. M., ENTRY J. A., INGHAM E. R. (1988): Interactions between soil animals and ectomycorrhizal fungal mats. Agric., Ecosyst. Environ. 24, 161-168. CULLINGS K., COURTY P.-E. (2009): Saprotrophic capabilities as functional traits to study functional diversity and resilience of ectomycorrhizal community. Oecologia 161, 661-664. DAHIYA N., TEWARI R., HOONDAL G. (2006): Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol. 71, 773-782. DAHLBERG A. (2001): Community ecology of ectomycorrhizal fungi: an advancing interdisciplinary field. New Phytol. 150, 555-562. DANIEL G. (2003): Wood Deterioration and Preservation. American Chemical Society 3472 s. KAPITOLA: Microview of Wood under Degradation by Bacteria and Fungi, 4 s. DE BOER W., FOLMAN L. B., SUMMERBELL R. C., BODDY L. (2005): Living in a fungal world: impact of fungi on soil bacterial niche development. FEMS Microbiol. Rev. 29, 795-811. DE BOER W., KLEIN GUNNEWIEK P. J. A., LAFEBER P., JANSE J. D., SPIT B. E., WOLDENDORP J. W. (1998): Anti-fungal properties of chitinolytic dune soil bacteria. Soil Biol. Biochem. 30, 193-203. DE RIDDER-DUINE A. S., KOWALCHUK G. A., KLEIN GUNNEWIEK P. J. A., SMANT W., VAN VEEN J. A., DE BOER W. (2005): Rhizosphere bacterial community composition in natural stands of Carex arenaria (sand sedge) is determined by bulk soil community composition. Soil Biol. Biochem. 37, 349-357. 106
DEACON J. (2006): Fungal biology, Čtvrté vydání. Blackwell Publishing, Edinburg. 371 s. DIJKSTERHUIS J., SANDERS M., GORRIS L. G. M., SMID E. J. (1999): Antibiosis plays a role in the context of direct interaction during antagonism of Paenibacillus polymyxa towards Fusarium oxysporum. J. Appl. Microbiol. 86, 13-21. DILLY O., MUNCH J.-C. (1996): Microbial biomass content, basal respiration and enzyme activities during the course of decomposition of leaf litter in a black alder (Alnus glutinosa (L.) Gaertn.) forest. Soil Biol. Biochem. 28, 1073-1081. DIXON R. K., BROWN S., HOUGHTON R. A., SOLOMON A. M., TREXLER M. C., WISNIEWSKI J. (1994): Carbon pools and flux of global forest ecosystems. Science 263, 185-190. DOWD S., CALLAWAY T., WOLCOTT R., SUN Y., MCKEEHAN T., HAGEVOORT R., EDRINGTON T. (2008): Evaluation of the bacterial diversity in the feces of cattle using 16S rDNA bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). BMC Microbiol. 8, 125. DRIGO B., ANDERSON I. C., KANNANGARA G. S. K., CAIRNEY J. W. G., JOHNSON D. (2012): Rapid incorporation of carbon from ectomycorrhizal mycelial necromass into soil fungal communities. Soil Biol. Biochem. 49, 4-10. DUNHAM S., LARSSON K.-H., SPATAFORA J. (2007): Species richness and community composition of mat-forming ectomycorrhizal fungi in old- and second-growth Douglas-fir forests of the HJ Andrews Experimental Forest, Oregon, USA. Mycorrhiza 17, 633-645. DUNSTAN W. A., MALAJCZUK N., DELL B. (1998): Effects of bacteria on mycorrhizal development and growth of container grown Eucalyptus diversicolor F. Muell. seedlings. Plant Soil 201, 241-249. DUO-CHUAN L. (2006): Review of fungal chitinases. Mycopathologia 161, 345-360. DUPONNOIS R., GARBAYE J., BOUCHARD D., CHURIN J. L. (1993): The fungusspecificity of mycorrhization helper bacteria (MHBs) used as an alternative to soil fumigation for ectomycorrhizal inoculation of bare-root Douglas-fir planting stocks with Laccaria laccata. Plant Soil 157, 257-262. DUPONNOIS R., PLENCHETTE C. (2003): A mycorrhiza helper bacterium enhances ectomycorrhizal and endomycorrhizal symbiosis of Australian Acacia species. Mycorrhiza 13, 85-91.
107
EDGAR R. C. (2010): Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics 26, 2460-2461. EKBLAD A., WALLANDER H., GODBOLD D. L., CRUZ C., JOHNSON D., BALDRIAN P., BJÖRK R. G., EPRON D., KIELISZEWSKA-ROKICKA B., KJÖLLER R., KRAIGHER H., MATZNER E., NEUMANN J., PLASSARD C. (2013): The production and turnover of extramatrical mycelium of ectomycorrhizal fungi in forest soils: role in carbon cycling. Plant Soil 366, 1-27. EL-SAYED E.-S. A., EZZAT S. M., GHALY M. F., MANSOUR M., E1-BOHEY M. A. (2000): Purification and characterization of two chitinases from Streptomyces albovinaceus S-22. World Journal of Microbiology and Biotechnology 16, 87-89. ELSHAHED M. S., YOUSSEF N. H., SPAIN A. M., SHEIK C., NAJAR F. Z., SUKHARNIKOV L. O., ROE B. A., DAVIS J. P., SCHLOSS P. D., BAILEY V. L., KRUMHOLZ L. R. (2008): Novelty and uniqueness patterns of rare members of the soil biosphere. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5422-5428. ENTRY J. A., ROSE C. L., CROMACK JR K. (1991): Litter decomposition and nutrient release in ectomycorrhizal mat soils of a Douglas fir ecosystem. Soil Biol. Biochem. 23, 285-290. FERNANDEZ C. W., KOIDE R. T. (2011): The role of chitin in the decomposition of ectomycorrhizal fungal litter. Ecology 93, 24-28. FIERER N., BRADFORD M. A., JACKSON R. B. (2007): Toward an ecological classification of soil bacteria. Ecology 88, 1354-1364. FOLMAN L. B., KLEIN GUNNEWIEK P. J. A., BODDY L., DE BOER W. (2008): Impact of white-rot fungi on numbers and community composition of bacteria colonizing beech wood from forest soil. FEMS Microbiol. Ecol. 63, 181-191. FOUNOUNE H., DUPONNOIS R., BÂ A. M., SALL S., BRANGET I., LORQUIN J., NEYRA M., CHOTTE J. L. (2002): Mycorrhiza helper bacteria stimulate ectomycorrhizal symbiosis of Acacia holosericea with Pisolithus alba. New Phytol. 153, 81-89. FREY-KLETT P., GARBAYE J. (2005a): Mycorrhiza helper bacteria: a promising model for the genomic analysis of fungal–bacterial interactions. New Phytol. 168, 4-8. FREY-KLETT P., GARBAYE J., TARKKA M. (2007): The mycorrhiza helper bacteria revisited. New Phytol. 176, 22-36.
108
FREY-KLETT P., CHAVATTE M., CLAUSSE M.-L., COURRIER S., ROUX C. L., RAAIJMAKERS J., MARTINOTTI M. G., PIERRAT J.-C., GARBAYE J. (2005b): Ectomycorrhizal symbiosis affects functional diversity of rhizosphere fluorescent pseudomonads. New Phytol. 165, 317-328. GANS J., WOLINSKY M., DUNBAR J. (2005): Computational improvements reveal great bacterial diversity and high metal toxicity in soil. Science 309, 1387-1390. GARBAYE J. (1994): Tansley Review No. 76 Helper bacteria: a new dimension to the mycorrhizal symbiosis. New Phytol. 128, 197-210. GARBAYE J., CHURIN J.-L., DUPONNOIS R. (1992): Effects of substrate sterilization, fungicide treatment, and mycorrhization helper bacteria on ectomycorrhizal formation of pedunculate oak (Quercus robur) inoculated with Laccaria laccata in two peat bare-root nurseries. Biol. Fertility Soils 13, 55-57. GEISSELER D., HORWATH W. R. (2008): Regulation of extracellular protease activity in soil in response to different sources and concentrations of nitrogen and carbon. Soil Biol. Biochem. 40, 3040-3048. GODBOLD D., HOOSBEEK M., LUKAC M., COTRUFO M. F., JANSSENS I., CEULEMANS R., POLLE A., VELTHORST E., SCARASCIA-MUGNOZZA G., ANGELIS P., MIGLIETTA F., PERESSOTTI A. (2006): Mycorrhizal hyphal turnover as a dominant process for carbon input into soil organic matter. Plant Soil 281, 15-24. GOODAY G. (1994): Biochemistry of microbial degradation. Springer Netherlands 279-312 s. KAPITOLA: RATLEDGE, C., Physiology of microbial degradation of chitin and chitosan, 9 s. GOODAY G. (1999): Chitin and Chitinases. Birkhäuser Basel 157-169 s. KAPITOLA: JOLLÈS, P. & MUZZARELLI, R. A. A., Aggressive and defensive roles for chitinases, 11 s. GORTARI M., HOURS R. (2008): Fungal chitinases and their biological role in the antagonism onto nematode eggs. A review. Mycological Progress 7, 221-238. GRAYSTON S. J., VAUGHAN D., JONES D. (1997): Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology 5, 29-56. GREAVES H. (1971): The bacterial factor in wood decay. Wood Science and Technology 5, 6-16.
109
GRIFFITHS B. S., RITZ K., EBBLEWHITE N., DOBSON G. (1998): Soil microbial community structure: Effects of substrate loading rates. Soil Biol. Biochem. 31, 145153. GRIFFITHS R. P., BAHAM J. E., CALDWELL B. A. (1994): Soil solution chemistry of ectomycorrhizal mats in forest soil. Soil Biol. Biochem. 26, 331-337. GRIFFITHS R. P., CALDWELL B. A., CROMACK JR K., MORITA R. Y. (1990): Douglas-fir forest soils colonized by ectomycorrhizal mats. I. Seasonal variation in nitrogen chemistry and nitrogen cycle transformation rates. Canadian Journal of Forest Research 20, 211-218. GRYNDLER M., BALÁŽ M., HRŠELOVÁ H., JANSA J., VOSÁTKA M. (2004): Mykorhizní symnióza: O soužití hub s kořeny rostlin, Praha. 366 s. HAICHAR F. E. Z., MAROL C., BERGE O., RANGEL-CASTRO J. I., PROSSER J. I., BALESDENT J., HEULIN T., ACHOUAK W. (2008): Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. ISME J 2, 1221-1230. HEINEMEYER A., HARTLEY I. P., EVANS S. P., CARREIRA DE LA FUENTE J. A., INESON P. (2007): Forest soil CO2 flux: uncovering the contribution and environmental responses of ectomycorrhizas. Global Change Biol. 13, 1786-1797. HENDRICKSON O. Q. (1991): Abundance and activity of N2-fixing bacteria in decaying wood. Canadian Journal of Forest Research 21, 1299-1304. HENSON J. M., BUTLER M. J., DAY A. W. (1999): The dark side of the mycelium: melanins of phytopathogenic fungi. Annu. Rev. Phytopathol. 37, 447-471. HODGE A., ALEXANDER I. J., GOODAY G. W. (1995): Chitinolytic enzymes of pathogenic and ectomycorrhizal fungi. Mycol. Res. 99, 935-941. HÖGBERG M. N., HÖGBERG P. (2002): Extramatrical ectomycorrhizal mycelium contributes one-third of microbial biomass and produces, together with associated roots, half the dissolved organic carbon in a forest soil. New Phytol. 154, 791-795. HONEGGER R. (2001): Fungal Associations. Springer Berlin Heidelberg 165-188 s. KAPITOLA: HOCK, B., The Symbiotic Phenotype of Lichen-Forming Ascomycetes, 10 s. HOSTER F., SCHMITZ J., DANIEL R. (2005): Enrichment of chitinolytic microorganisms: isolation and characterization of a chitinase exhibiting antifungal activity against phytopathogenic fungi from a novel Streptomyces strain. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 434-442. 110
HOWARD M., EKBORG N., WEINER R., HUTCHESON S. (2003): Detection and characterization of chitinases and other chitin-modifying enzymes. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30, 627-635. HU S., VAN BRUGGEN A. H. C. (1997): Microbial dynamics associated with multiphasic decomposition of 14C-labeled cellulose in soil. Microb. Ecol. 33, 134-143. CHANDRA T. S., SHETHNA Y. I. (1975): Isolation and characterization of some new oxalate-decomposing bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek 41, 101-111. CHO Y.-S., KIM J.-S., CROWLEY D. E., CHO B.-G. (2003): Growth promotion of the edible fungus Pleurotus ostreatus by fluorescent pseudomonads. FEMS Microbiol. Lett. 218, 271-276. CHOW M. L., RADOMSKI C. C., MCDERMOTT J. M., DAVIES J., AXELROOD P. E. (2002): Molecular characterization of bacterial diversity in Lodgepole pine (Pinus contorta) rhizosphere soils from British Columbia forest soils differing in disturbance and geographic source. FEMS Microbiol. Ecol. 42, 347-357. INGHAM E. R., GRIFFITHS R. P., CROMACK K., ENTRY J. A. (1991): Comparison of direct vs fumigation incubation microbial biomass estimates from ectomycorrhizal mat and non-mat soils. Soil Biol. Biochem. 23, 465-471. INGLIS P. W., PEBERDY J. F. (1997): Production and purification of a chitinase from Ewingella americana, a recently described pathogen of the mushroom, Agaricus bisporus. FEMS Microbiol. Lett. 157, 189-194. JANSSEN P. H. (2006): Identifying the dominant soil bacterial taxa in libraries of 16S rRNA and 16S rRNA genes. Appl. Environ. Microbiol. 72, 1719-1728. JARGEAT P., COSSEAU C., OLA'H B., JAUNEAU A., BONFANTE P., BATUT J., BÉCARD G. (2004): Isolation, free-living capacities, and genome structure of “Candidatus Glomeribacter gigasporarum,” the endocellular bacterium of the mycorrhizal fungus Gigaspora margarita. J. Bacteriol. 186, 6876-6884. JENNINGS D. H. (1987): Translocation of solutes in fungi. Biological Reviews 62, 215-243. JOHANSEN J. E., BINNERUP S. J., KROER N., MØLBAK L. (2005): Luteibacter rhizovicinus gen. nov., sp. nov., a yellow-pigmented gammaproteobacterium isolated from the rhizosphere of barley (Hordeum vulgare L.). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55, 2285-2291.
111
KATOH K., ASIMENOS G., TOH H. (2009): Bioinformatics for DNA sequence analysis. Humana Press 39-64 s. KAPITOLA: POSADA, D., Multiple alignment of DNA sequences with MAFFT, 3 s. KLUBER L. A., SMITH J. E., MYROLD D. D. (2011): Distinctive fungal and bacterial communities are associated with mats formed by ectomycorrhizal fungi. Soil Biol. Biochem. 43, 1042-1050. KLUBER L. A., TINNESAND K. M., CALDWELL B. A., DUNHAM S. M., YARWOOD R. R., BOTTOMLEY P. J., MYROLD D. D. (2010): Ectomycorrhizal mats alter forest soil biogeochemistry. Soil Biol. Biochem. 42, 1607-1613. KLUGE M. (2002): A fungus eats a cyanobacterium: the story of the Geosiphon pyriformis endocyanosis. Biology & Environment: Proceedings of the Royal Irish Academy 102, 11-14. KOIDE R. T., FERNANDEZ C. W., PEOPLES M. S. (2011): Can ectomycorrhizal colonization of Pinus resinosa roots affect their decomposition? New Phytol. 191, 508-514. KOIDE R. T., MALCOLM G. M. (2009): N concentration controls decomposition rates of different strains of ectomycorrhizal fungi. Fungal Ecol. 2, 197-202. KOIDE R. T., WU T. (2003): Ectomycorrhizas and retarded decomposition in a Pinus resinosa plantation. New Phytol. 158, 401-407. KUZYAKOV Y., FRIEDEL J. K., STAHR K. (2000): Review of mechanisms and quantification of priming effects. Soil Biol. Biochem. 32, 1485-1498. LANG E., KLEEBERG I., ZADRAZIL F. (2000): Extractable organic carbon and counts of bacteria near the lignocellulose–soil interface during the interaction of soil microbiota and white rot fungi. Bioresour. Technol. 75, 57-65. LANGLEY A. J., CHAPMAN S. K., HUNGATE B. A. (2006): Ectomycorrhizal colonization slows root decomposition: the post-mortem fungal legacy. Ecol. Lett. 9, 955-959. LANGLEY J. A., HUNGATE B. A. (2003): Mycorrhizal controls on belowground litter quality. Ecology 84, 2302-2312. LAUBER C. L., HAMADY M., KNIGHT R., FIERER N. (2009): Pyrosequencing-based assessment of soil pH as a predictor of soil bacterial community structure at the continental scale. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5111-5120.
112
LEONOWICZ A., MATUSZEWSKA A., LUTEREK J., ZIEGENHAGEN D., WOJTAŚWASILEWSKA M., CHO N.-S., HOFRICHTER M., ROGALSKI J. (1999): Biodegradation of lignin by white rot fungi. Fungal Genet. Biol. 27, 175-185. LEVEAU J. H. J., PRESTON G. M. (2008): Bacterial mycophagy: definition and diagnosis of a unique bacterial–fungal interaction. New Phytol. 177, 859-876. LEVY A., CHANG B. J., ABBOTT L. K., KUO J., HARNETT G., INGLIS T. J. J. (2003): Invasion of spores of the arbuscular mycorrhizal fungus Gigaspora decipiens by Burkholderia spp. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6250-6256. LEVY J. F. (1975): Biological transformation of wood by microorganisms. Springer Berlin Heidelberg 64-73 s. KAPITOLA: LIESE, W., Bacteria associated with wood in ground contact, 6 s. LIANG C., BALSER T. C. (2011): Microbial production of recalcitrant organic matter in global soils: implications for productivity and climate policy. Nat Rev Micro 9, 7575. LINDAHL B. D., DE BOER W., FINLAY R. D. (2010): Disruption of root carbon transport into forest humus stimulates fungal opportunists at the expense of mycorrhizal fungi. ISME J 4, 872-881. LINDAHL B. D., IHRMARK K., BOBERG J., TRUMBORE S. E., HÖGBERG P., STENLID J., FINLAY R. D. (2007): Spatial separation of litter decomposition and mycorrhizal nitrogen uptake in a boreal forest. New Phytol. 173, 611-620. LINDERMAN R. G. (1988): Mycorrhizal interactions with the rhizosphere microflora - the mycorrhizosphere effect. Phytopathology 78, 366-371. LOCKWOOD J. L. (1968): The fungal environment of soil bacteria. The Ecology of Soil Bacteria. University of Toronto Press, Toronto, 44-65. LYND L. R., WEIMER P. J., VAN ZYL W. H., PRETORIUS I. S. (2002): Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 506-577. LYNCH J. M., WHIPPS J. M. (1991): The Rhizosphere and Plant Growth. Springer Netherlands 15-24 s. KAPITOLA: KEISTER, D. & CREGAN, P., Substrate flow in the rhizosphere, 2 s. MALIK K. A., HADER K. (1982): Decomposition of 14C-labeled melanoid fungal residues in a marginally sodic soil. Soil Biol. Biochem. 14, 457-460.
113
MÄNNISTÖ M. K., RAWAT S., STAROVOYTOV V., HÄGGBLOM M. M. (2012): Granulicella arctica sp. nov., Granulicella mallensis sp. nov., Granulicella tundricola sp. nov. and Granulicella sapmiensis sp. nov., novel acidobacteria from tundra soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62, 2097-2106. MARSH T. L. (1999): Terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP): An emerging method for characterizing diversity among homologous populations of amplification products. Curr. Opin. Microbiol. 2, 323-327. MASSEI G., GENOV P. V. (2004): The environmental impact of wild boar. Galemys 16, 135-145. MERKENS H., BECKERS G., WIRTZ A., BURKOVSKI A. (2005): Vanillate metabolism in Corynebacterium glutamicum. Curr. Microbiol. 51, 59-65. MILTNER A., BOMBACH P., SCHMIDT-BRÜCKEN B., KÄSTNER M. (2012): SOM genesis: microbial biomass as a significant source. Biogeochemistry. MITSUTOMI M., HATA T., KUWAHARA T. (1995): Purification and characterization of novel chitinases from Streptomyces griseus HUT 6037. J. Ferment. Bioeng. 80, 153158. MURRAY A. C., WOODWARD S. (2003): In vitro interactions between bacteria isolated from Sitka spruce stumps and Heterobasidion annosum For. Pathol. 33, 53-67. NAZIR R., SEMENOV A. V., SARIGUL N., VAN ELSAS J. D. (2013): Bacterial community establishment in native and non-native soils and the effect of fungal colonization. Microbiology Discovery 1. NIELSEN T. H., CHRISTOPHERSEN C., ANTHONI U., SØRENSEN J. (1999): Viscosinamide, a new cyclic depsipeptide with surfactant and antifungal properties produced by Pseudomonas fluorescens DR54. J. Appl. Microbiol. 87, 80-90. NISSINEN R. M., MÄNNISTÖ M. K., VAN ELSAS J. D. (2012): Endophytic bacterial communities in three arctic plants from low arctic fell tundra are cold-adapted and host-plant specific. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 510-522. OLANDER L., VITOUSEK P. (2000): Regulation of soil phosphatase and chitinase activityby N and P availability. Biogeochemistry 49, 175-191. OSONO T. (2007): Ecology of ligninolytic fungi associated with leaf litter decomposition. Ecol. Res. 22, 955-974. 114
PANKRATOV T. A., KIRSANOVA L. A., KAPARULLINA E. N., KEVBRIN V. V., DEDYSH S. N. (2012): Telmatobacter bradus gen. nov., sp. nov., a cellulolytic facultative anaerobe from subdivision 1 of the Acidobacteria, and emended description of Acidobacterium capsulatum Kishimoto et al. 1991. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62, 430-437. PANKRATOV T. A., TINDALL B. J., LIESACK W., DEDYSH S. N. (2007): Mucilaginibacter paludis gen. nov., sp. nov. and Mucilaginibacter gracilis sp. nov., pectin-, xylan- and laminarin-degrading members of the family Sphingobacteriaceae from acidic Sphagnum peat bog. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57, 2349-2354. PATIL R. S., GHORMADE V., DESHPANDE M. V. (2000): Chitinolytic enzymes: an exploration. Enzyme Microb. Technol. 26, 473-483. PAUL E. A. (2007): Soil microbiology, ecology, and biochemistry, Třetí vydání. Academic Press Elsevier, Oxford. 514 s. PICHYANGKURA R., KUDAN S., KUTTIYAWONG K., SUKWATTANASINITT M., AIBA S.-I. (2002): Quantitative production of 2-acetamido-2-deoxy-d-glucose from crystalline chitin by bacterial chitinase. Carbohydr. Res. 337, 557-559. POLYANSKAYA L. M., IVANOV K. E., ZVYAGINTSEV D. G. (2012): Fluctuations in the population density of gram negative bacteria in a chernozem in the course of a succession initiated by moistening and chitin and cellulose introduction. Eurasian Soil Sci+ 45, 958-967. RAI A. N., ROWELL P., STEWART W. D. P. (1981): Nitrogenase activity and dark CO2 fixation in the lichen Peltigera aphthosa Willd. Planta 151, 256-264. RAJCHARD J., BALOUNOVÁ Z., KVĚT J., ŠANTRŮČKOVÁ H., VYSLOUŽIL D. (2002): Ekologie 3. KOPP České Budějovice, 197 s. KAPITOLA: ŠANTRŮČKOVÁ, H., Základy ekologie půdy, 24-53 s. RANGEL-CASTRO J. I., DANELL E., PFEFFER P. E. (2002): A 13C-NMR study of exudation and storage of carbohydrates and amino acids in the ectomycorrhizal edible mushroom Cantharellus cibarius. Mycologia 94, 190-199. RAVI KUMAR M. N. V. (2000): A review of chitin and chitosan applications. React. Funct. Polym. 46, 1-27. REICHENBACH H. (1999): The ecology of the myxobacteria. Environ. Microbiol. 1, 1521.
115
RICHARDSON D. H. S., CAMERON R. P. (2004): Cyanolichens: their response to pollution and possible management strategies for their conservation in northeastern North America. Northeast. Nat. 11, 1-22. RILLIG M. C. (2004): Arbuscular mycorrhizae and terrestrial ecosystem processes. Ecol. Lett. 7, 740-754. ROESCH L. F. W., FULTHORPE R. R., RIVA A., CASELLA G., HADWIN A. K. M., KENT A. D., DAROUB S. H., CAMARGO F. A. O., FARMERIE W. G., TRIPLETT E. W. (2007): Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity. ISME J 1, 283-290. ROTHBERG J. M., LEAMON J. H. (2008): The development and impact of 454 sequencing. Nat Biotech 26, 1117-1124. ROUSK J., BAATH E., BROOKES P. C., LAUBER C. L., LOZUPONE C., CAPORASO J. G., KNIGHT R., FIERER N. (2010): Soil bacterial and fungal communities across a pH gradient in an arable soil. ISME J 4, 1340-1351. RUDDICK J., KUNDZEWICZ A. (1991): Bacterial movement of iron in waterlogged soil and its effect on decay in untreated wood. Material und Organismen 26. RUIZ-LOZANO J., BONFANTE P. (2001): Intracellular Burkholderia strain has no negative effect on the symbiotic efficiency of the arbuscular mycorrhizal fungus Gigaspora margarita. Plant Growth Regulation 34, 347-352. SAGOVA-MARECKOVA M., CERMAK L., NOVOTNA J., PLHACKOVA K., FORSTOVA J., KOPECKY J. (2008): Innovative methods for soil DNA purification tested in soils with widely differing characteristics. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2902-2907. SANGKHOBOL V., SKERMAN V. B. D. (1981): Chitinophaga, a new genus of chitinolytic Myxobacteria. Int. J. Syst. Bacteriol. 31, 285-293. SETÄLÄ H. (2000): Reciprocal interactions between Scots pine and soil food web structure in the presence and absence of ectomycorrhiza. Oecologia 125, 109-118. SHEKHAR N., BHATTACHARYA D., KUMAR D., GUPTA R. K. (2006): Biocontrol of wood-rotting fungi with Streptomyces violaceusniger XL-2. Can. J. Microbiol. 52, 805-808. SCHLOSS P. D., HANDELSMAN J. (2006): Toward a census of bacteria in soil. PLoS Comp. Biol. 2, e92.
116
SCHLOSS P. D., WESTCOTT S. L., RYABIN T., HALL J. R., HARTMANN M., HOLLISTER E. B., LESNIEWSKI R. A., OAKLEY B. B., PARKS D. H., ROBINSON C. J., SAHL J. W., STRES B., THALLINGER G. G., VAN HORN D. J., WEBER C. F. (2009): Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl. Environ. Microbiol. 75, 7537-7541. SCHMIDT M. W., TORN M. S., ABIVEN S., DITTMAR T., GUGGENBERGER G., JANSSENS I. A., KLEBER M., KÖGEL-KNABNER I., LEHMANN J., MANNING D. A. (2011): Persistence of soil organic matter as an ecosystem property. Nature 478, 49-56. SCHNEIDER T., KEIBLINGER K. M., SCHMID E., STERFLINGER-GLEIXNER K., ELLERSDORFER G., ROSCHITZKI B., RICHTER A., EBERL L., ZECHMEISTER-BOLTENSTERN S., RIEDEL K. (2012): Who is who in litter decomposition? Metaproteomics reveals major microbial players and their biogeochemical functions. ISME J. 6, 1749–1762. SCHREY S. D., SCHELLHAMMER M., ECKE M., HAMPP R., TARKKA M. T. (2005): Mycorrhiza helper bacterium Streptomyces AcH 505 induces differential gene expression in the ectomycorrhizal fungus Amanita muscaria. New Phytol. 168, 205216. SCHUSSLER A., MOLLENHAUER D., SCHNEPF E., KLUGE M. (1994): Geosiphonpyriforme, an endosymbiotic association of fungu and cyanobacteria - the spore structure resembles that of arbuscular mycorrhizal (AM) fungi. Botanica Acta 107, 36-45. SIQUEIRA J. F., FOUAD A. F., RÔÇAS I. N. (2012): Pyrosequencing as a tool for better understanding of human microbiomes. Journal of oral microbiology 4. SIX J., FREY S. D., THIET R. K., BATTEN K. M. (2006): Bacterial and fungal contributions to carbon sequestration in agroecosystems. Soil Sci. Soc. Am. J. 70, 555-569. SMITH C. J., OSBORN A. M. (2009): Advantages and limitations of quantitative PCR (QPCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol. Ecol. 67, 6-20. SÖDERSTRÖM B. E. (1979): Seasonal fluctuations of active fungal biomass in horizons of a podzolized pine-forest soil in central Sweden. Soil Biol. Biochem. 11, 149-154. SOLLINS P., HOMANN P., CALDWELL B. A. (1996): Stabilization and destabilization of soil organic matter: mechanisms and controls. Geoderma 74, 65-105.
117
STADDON P. L., RAMSEY C. B., OSTLE N., INESON P., FITTER A. H. (2003): Rapid turnover of hyphae of mycorrhizal fungi determined by AMS microanalysis of 14C. Science 300, 1138-1140. STADLER M., STERNER O. (1998): Production of bioactive secondary metabolites in the fruit bodies of macrofungi as a response to injury. Phytochemistry 49, 1013-1019. SUWANTO A., HENAWIDJAJA M., URWADARIA T. R. (2011): Isolation and characterization of mannanolytic thermophilic bacteria from palm oil shell and their mannanase enzyme production properties. BIOTROPIA. ŠNAJDR J., CAJTHAML T., VALÁŠKOVÁ V., MERHAUTOVÁ V., PETRÁNKOVÁ M., SPETZ P., LEPPÄNEN K., BALDRIAN P. (2011): Transformation of Quercus petraea litter: successive changes in litter chemistry are reflected in differential enzyme activity and changes in the microbial community composition. FEMS Microbiol. Ecol. 75, 291-303. ŠNAJDR J., VALÁŠKOVÁ V., MERHAUTOVÁ V. R., HERINKOVÁ J., CAJTHAML T., BALDRIAN P. (2008): Spatial variability of enzyme activities and microbial biomass in the upper layers of Quercus petraea forest soil. Soil Biol. Biochem. 40, 2068-2075. TAKEGAWA K., MIKAMI B., IWAHARA S., MORITA Y., YAMAMOTO K., TOCHIKURA T. (1991): Complete amino acid sequence of endo-β-Nacetylglucosaminidase from Flavobacterium sp. Eur. J. Biochem. 202, 175-180. TAYLOR J. P., WILSON B., MILLS M. S., BURNS R. G. (2002): Comparison of microbial numbers and enzymatic activities in surface soils and subsoils using various techniques. Soil Biol. Biochem. 34, 387-401. TIMONEN S., JØRGENSEN K. S., HAAHTELA K., SEN R. (1998): Bacterial community structure at defined locations of Pinus sylvestris - Suillus bovinus and Pinus sylvestris - Paxillus involutus mycorrhizospheres in dry pine forest humus and nursery peat. Can. J. Microbiol. 44, 499-513. TORRES P. A., ABRIL A. B., BUCHER E. H. (2005): Microbial succession in litter decomposition in the semi-arid Chaco woodland. Soil Biol. Biochem. 37, 49-54. TRESEDER K., ALLEN M., RUESS R., PREGITZER K., HENDRICK R. (2005): Lifespans of fungal rhizomorphs under nitrogen fertilization in a pinyon-juniper woodland. Plant Soil 270, 249-255. TRESEDER K. K., ALLEN M. F. (2000): Mycorrhizal fungi have a potential role in soil carbon storage under elevated CO2 and nitrogen deposition. New Phytol. 147, 189200. 118
TUOMELA M., VIKMAN M., HATAKKA A., ITÄVAARA M. (2000): Biodegradation of lignin in a compost environment: a review. Bioresour. Technol. 72, 169-183. VALÁŠKOVÁ V., BALDRIAN P. (2009): Denaturing gradient gel electrophoresis as a fingerprinting method for the analysis of soil microbial communities. Plant Soil Environ 55, 413-423. VALÁŠKOVÁ V., DE BOER W., KLEIN GUNNEWIEK P. J. A., POSPISEK M., BALDRIAN P. (2009): Phylogenetic composition and properties of bacteria coexisting with the fungus Hypholoma fasciculare in decaying wood. ISME J 3, 1218-1221. VALÁŠKOVÁ V., ŠNAJDR J., BITTNER B., CAJTHAML T., MERHAUTOVÁ V., HOFRICHTER M., BALDRIAN P. (2007): Production of lignocellulose-degrading enzymes and degradation of leaf litter by saprotrophic basidiomycetes isolated from a Quercus petraea forest. Soil Biol. Biochem. 39, 2651-2660. VĚTROVSKÝ T., BALDRIAN P. (2013): Analysis of soil fungal communities by amplicon pyrosequencing: current approaches to data analysis and the introduction of the pipeline SEED. Biol. Fertility Soils, 1-11. VĚTROVSKÝ T., VOŘÍŠKOVÁ J., ŠNAJDR J., GABRIEL J., BALDRIAN P. (2011): Ecology of coarse wood decomposition by the saprotrophic fungus Fomes fomentarius. Biodegradation 22, 709-718. VON LÜTZOW M., KÖGEL-KNABNER I., EKSCHMITT K., MATZNER E., GUGGENBERGER G., MARSCHNER B., FLESSA H. (2006): Stabilization of organic matter in temperate soils: mechanisms and their relevance under different soil conditions – a review. Eur. J. Soil Sci. 57, 426-445. VON LÜTZOW M., KÖGEL-KNABNER I., LUDWIG B., MATZNER E., FLESSA H., EKSCHMITT K., GUGGENBERGER G., MARSCHNER B., KALBITZ K. (2008): Stabilization mechanisms of organic matter in four temperate soils: Development and application of a conceptual model. J. Plant Nutr. Soil Sci. 171, 111-124. VOŘÍŠKOVÁ J. (2009): The role of saprotrophic basidiomycetes in soil fungal community. Diplomová práce, Univerzita Karlova, Praha. 88 s. WALLANDER H., GÖRANSSON H., ROSENGREN U. (2004): Production, standing biomass and natural abundance of 15N and 13C in ectomycorrhizal mycelia collected at different soil depths in two forest types. Oecologia 139, 89-97.
119
WALLANDER H., NILSSON L. O., HAGERBERG D., BÅÅTH E. (2001): Estimation of the biomass and seasonal growth of external mycelium of ectomycorrhizal fungi in the field. New Phytol. 151, 753-760. WALLANDER H., PALLON J. (2005): Temporal changes in the elemental composition of Rhizopogon rhizomorphs during colonization of patches with fresh organic matter or acid-washed sand. Mycologia 97, 295-303. WANG S.-L., SHIH I.-L., LIANG T.-W., WANG C.-H. (2002): Purification and characterization of two antifungal chitinases extracellularly produced by Bacillus amyloliquefaciens V656 in a shrimp and crab shell powder medium. J. Agric. Food Chem. 50, 2241-2248. WANG S.-Y., MOYNE A.-L., THOTTAPPILLY G., WU S.-J., LOCY R. D., SINGH N. K. (2001): Purification and characterization of a Bacillus cereus exochitinase. Enzyme Microb. Technol. 28, 492-498. WARD N. L., CHALLACOMBE J. F., JANSSEN P. H., HENRISSAT B., COUTINHO P. M., WU M., XIE G., HAFT D. H., SAIT M., BADGER J., BARABOTE R. D., BRADLEY B., BRETTIN T. S., BRINKAC L. M., BRUCE D., CREASY T., DAUGHERTY S. C., DAVIDSEN T. M., DEBOY R. T., DETTER J. C., DODSON R. J., DURKIN A. S., GANAPATHY A., GWINN-GIGLIO M., HAN C. S., KHOURI H., KISS H., KOTHARI S. P., MADUPU R., NELSON K. E., NELSON W. C., PAULSEN I., PENN K., REN Q., ROSOVITZ M. J., SELENGUT J. D., SHRIVASTAVA S., SULLIVAN S. A., TAPIA R., THOMPSON L. S., WATKINS K. L., YANG Q., YU C., ZAFAR N., ZHOU L., KUSKE C. R. (2009): Three genomes from the phylum Acidobacteria provide insight into the lifestyles of these microorganisms in soils. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2046-2056. WARMINK J. A., NAZIR R., VAN ELSAS J. D. (2009): Universal and species-specific bacterial ‘fungiphiles’ in the mycospheres of different basidiomycetous fungi. Environ. Microbiol. 11, 300-312. WESSELS J. G. H. (1996): Fungal hydrophobins: proteins that function at an interface. Trends Plant Sci. 1, 9-15. WILKINSON A., ALEXANDER I. J., JOHNSON D. (2011): Species richness of ectomycorrhizal hyphal necromass increases soil CO2 efflux under laboratory conditions. Soil Biol. Biochem. 43, 1350-1355. WIRTH S., ULRICH A. (2002): Cellulose-degrading potentials and phylogenetic classification of carboxymethyl-cellulose decomposing bacteria isolated from soil. Syst. Appl. Microbiol. 25, 584-591.
120
YADAV V., MALANSON G. (2007): Progress in soil organic matter research: litter decomposition, modelling, monitoring and sequestration. Progress in Physical Geography 31, 131-154. YUAN W. M., CRAWFORD D. L. (1995): Characterization of Streptomyces lydicus WYEC108 as a potential biocontrol agent against fungal root and seed rots. Appl. Environ. Microbiol. 61, 3119-28. ZIMMERMAN A. E., MARTINY A. C., ALLISON S. D. (2013): Microdiversity of extracellular enzyme genes among sequenced prokaryotic genomes. ISME J 7, 11871199.
121
