Role of Yoghurt Therapy on Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) Expression and Histopathological Thyroid of Autoimmune Thyroiditis (AITD) Rats Model

Peran Yoghurt Terhadap Ekspresi Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) dan Gambaran Histopatologi Jaringan Tiroid Tikus Model Autoimmune Thyroiditis (AITD) Role of Yoghurt Therapy on Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) Expression and Histopathological Thyroid of Autoimmune Thyroiditis (AITD) Rats Model Hendra Legatawa, Aulanni’am dan Dyah Kinasih Wuragil Program Studi Kedokteran Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya [email protected]

ABSTRAK Autoimmune thyroiditis (AITD) adalah penyakit autoimun yang menyerang organ spesifik kelenjar tiroid. Tujuan dari penelitian ini adalah mempelajari peran yoghurt terhadap ekspresi TNF-α dan perbaikan gambaran histopatologi jaringan tiroid tikus (Rattus norvegicus) model AITD. Penelitian dibagi dalam 3 kelompok yaitu kelompok kontrol (A), kelompok AITD yang diinduksi NaI dengan dosis 0,05% selama 5 minggu (B), dan kelompok AITD yang diinduksi NaI dengan dosis 0,05% selama 5 minggu dilanjutkan terapi dengan suplementasi yoghurt sebanyak 109 cfu/ml/hari selama 4 minggu (C). Ekspresi TNF-α diamati dengan menggunakan metode imunohistokimia dan gambaran histopatologi jaringan dengan menggunakan pewarnaan HematoxilinEosin. Terapi yoghurt pada hewan model AITD menghasilkan ekspresi TNF-α yang berbeda nyata pada tiap perlakuan (p<0,05) yaitu 0,446±0,29 % (A); 3,411±1,28 % (B); 1,303±0,53 % (C). Selain itu, yoghurt dapat memperbaiki gambaran histopatologi jaringan tiroid. Kata kunci : AITD, NaI, Yoghurt, TNF-α, Histopatologi tiroid ABSTRACT Autoimmune thyroiditis (AITD) is a specific-organ diseases appearance in thyroid gland. The aim of this study was to learn the role of yogurt on reducing TNF-α expression and histopatological in thyroid tissue in animal model Autoimmune thyroiditis. In this study, rats were divided into 3 groups : control group, AITD group that induced with NaI 0.05% on five weeks (B), and AITD group that induced with NaI 0.05% in 5 weeks and group that induced with NaI 0.05% in 5 weeks and got the therapy yogurt of 109 cfu/ml/day in 4 weeks (C). In this study, TNF-α expression were observed by immunohistochemistry and the histopathology of thyroid were observed microscopically. Yogurt therapy in animal model of AITD caused different respons of TNF-α expression (p<0.05), were 0.446 ± 0.29% (A), 3.411 ± 1.28% (B), 1.303 ± 0.53 % (C). Besides, yogurt therapy could repair histopathology of thyroid tissue. Keywords :

AITD, Yogurt, Sodium iodide, TNF-α, Histopatology of thyroid

1

berbagai penyakit kardiovaskular dan hipersensitifitas atau reaksi alergi (Deruiter, 2002). Yoghurt merupakan produk fermentasi susu yang dapat dihasilkan dari susu kambing atau sapi. Yoghurt susu kambing memiliki kandungan protein lebih tinggi dibandingkan yoghurt susu sapi (Hidayat, 2009). Yoghurt dapat menginduksi sistem imun seluler dengan menginduksi sitokin antiinflamasi (TGF- dan IL10) yang berfungsi sebagai penghambat proses inflamasi (Chiba et al., 2009). Peran Bakteri Asam Laktat (BAL) dalam yoghurt dapat memodulasi sistem imun (Grajek et al., 2005). Penelitian sebelumnya menyatakan bahwa pemberian BAL dalam yoghurt dapat digunakan sebagai terapi penyakit autoimun (Lavasani et al., 2009). Hal ini membuktikan yoghurt starter Lactobacillus sp dapat memodulasi kekebalan tubuh pada tikus model autoimmune enchepalomyelitis. Namun, sedikit dilaporkan penggunaan yoghurt untuk pengobatan penyakit autoimun, bahkan belum ada penelitian yang melaporkan pengunaan yoghurt susu kambing sebagai pengobatan AITD. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui potensi yoghurt sebagai terapi penyakit autoimun tiroiditis berdasarkan ekspresi tumor necrosis factor alpha (TNF-α) dan gambaran histopatologi jaringan tiroid.

1. Pendahuluan Autoimmune thyroiditis (AITD) adalah penyakit autoimun yang menyerang organ spesifik yaitu kelenjar tiroid. AITD merupakan penyakit autoimun yang sering muncul dan mempengaruhi 10% populasi manusia di dunia (Tozzoli, 2008; Akin, 2011). Kejadian AITD juga sering muncul pada anjing dobermen great dane, greyhounds dan boxer. Penyebab penyakit ini antara lain interaksi gen yang sesuai dengan faktor pemicu lingkungan. Penyakit AITD ditandai dengan adanya infiltrasi sel-sel limfosit akibat mekanisme radang yang diikuti kerusakan jaringan tiroid (Burek and Talor, 2009). Hal ini mengakibatkan sekresi hormon tiroid terganggu, peningkatan sitokin proinflamasi dan destruksi sel folikular tiroid (Rose et al., 2002). Kondisi AITD menyebabkan peningkatan sitokin proinflamasi yaitu Tumor Necrosis Factor (TNF-α) dan kerusakan jaringan tiroid (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010). Kerusakan jaringan tiroid yang muncul ditandai dengan perubahan struktur sel sel epitel tiroid. Kondisi ini bertambah parah dengan adanya natrium iodida dengan kadar tinggi di dalam minuman. Natrium iodida (NaI) dengan kadar tinggi dalam tubuh akan memicu reaksi toksisitas tirosit dan autoreaktivitas protein intratiroid yang menyebabkan AITD. Selama ini penderita hashimoto’s thyroiditis harus menjalani terapi hormon sintetis selama hidupnya. Pengobatan AITD dilaporkan masih menimbulkan efek samping yang ditimbulkan yaitu bayi memiliki bentuk kepala dan wajah tidak normal (craniosynostosis), merangsang

2. Materi dan Metode Persiapan Hewan Coba Tikus diaklimatisasi terhadap lingkungan selama tujuh hari. Tikus ditaruh dalam bak plastik dengan diameter 80 cm dengan tinggi 40 cm. Hewan model AITD yang digunakan

2

adalah tikus (Rattus norvegicus) dari Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan umur 8-12 minggu dengan berat badan 100-150 gram yang telah mendapatkan sertifikat laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya No. 141-KEP.

membandingkan distribusi TNF-α pada sediaan histologi tiroid kontrol dengan perlakuan pada perbesaran rendah (400x), kemudian dibandingkan penghitungan per luas bidang pandang pada 5 seri sayatan yang diambil secara acak untuk setiap kelompok perlakuan menggunakan software Axio Vision.

Induksi NaI pada Hewan Coba

Pengamatan gambaran histopatologi dilihat menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran sedang (400x). Kerusakan sel-sel epitel tiroid diamati melalui pewarnaan HE.

Induksi NaI 0,05% dilakukan pada kelompok AITD (B) dan kelompok terapi (C). Setelah diinduksi NaI dilakukan pembedahan pada hewan coba untuk pengamatan gambaran histopatologi tiroid dan ekspresi TNFα.

Analisa Data Analisa data yang digunakan secara kualitatif untuk gambaran histopatologi jaringan tiroid yang akan dianalisis serta disajikan secara deskriptif dan data kuantitatif dianalisis dengan one-way ANOVA kemudian apabila signifikan dilanjutkan uji Tukey (Beda Nyata Jujur) dengan α =0,05.

Terapi Yoghurt pada hewan Coba Terapi yoghurt diberikan pada tikus kelompok terapi (C) secara per oral sebanyak 1 ml/tikus dengan jumlah bakteri 109 cfu/ml setiap hari. Yoghurt diberikan selama empat minggu. Setelah 4 minggu terapi tikus dibedah dan diamati histopatologi jaringan tiroid dan ekspresi TNF-α.

3. Hasil dan Pembahasan Ekspresi Tumor Necrosis Faktor Alpha (TNF-α) pada Tikus Model AITD yang diterapi Yoghurt

Pengamatan Gambaran Histopatologi Tiroid dan Ekspresi TNF-α

Ekspresi TNF-α diamati pada kelenjar tiroid dengan metode imunohistokimia. Hasil peningkatan ekspresi TNF-α terhadap 3 kelompok perlakuan yaitu kelompok kontrol, kelompok AITD dan kelompok yang mendapat terapi yoghurt menunjukkan hasil yang berbeda (Gambar 1.)

Pengamatan Tumor necrosis factor (TNF-α) dalam jaringan akan tampak dengan warna coklat dan terdapat disekitar folikel tiroid yang menunjukkan adanya reaksi inflamasi. Keberadaan TNF-α pada tiroid yang diamati melalui metode imunohistokimia (IHK), dianalisis secara kualitatif dengan cara

3

Gambar 1. Ekspresi Tumor Necrosis Faktor Alpha (TNF-α) pada Tiroid Hewan Model AITD (400x). Keterangan: (A) kontrol ; (B) AITD; (C) AITD yang diterapi yoghurt; ↑ekspresi TNF-α

Ekspresi TNF-α ditunjukkan dengan warna coklat yang menandakan adanya interaksi antara TNF-α pada jaringan dengan antibodi yang ditambahkan (antibodi primer antiTNF-α dan anti rabbit labeled biotin). Hasil ekspresi TNF-α dilihat

menggunakan software axio vision (Tabel 1). Analisa uji statistik tentang ekspresi TNF-α menggunakan ANOVA dilanjutkan dengan uji Tukey untuk menentukan perlakuan yang memberikan hasil terbaik.

Tabel 1. Ekspresi Tumor Necrosis Faktor Alpha (TNF-α) pada Tiroid Tikus Model AITD Kelompok Perlakuan

Rata-rata Ekspresi TNF-α

Kenaikan Ekspresi Penurunan Ekspresi TNF-α Dibandingkan TNF-α Dibandingkan Dengan Kelompok Dengan Kelompok Kontrol (%) AITD (%) Kontrol (A) 0,45±0,29a 0 b AITD (B) 3,41±1,28 657,78 0 Terapi (C) 1,30±0,53a 188,89 61,8 Keterangan : notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang nyata antar perlakuan (p<0,05)

4

Kelompok tikus kontrol menunjukkan adanya ekspresi TNF-α yang rendah dibandingkan kelompok AITD (Gambar 1.A, dan Tabel 1). Rata-rata ekspresi TNF-α pada kelompok kontrol sebesar 0,45. TNF-α muncul pada kondisi normal karena efek fisiologis dari hormon tiroid. Hormon tiroid (tiroksin dan triiodotironin) berfungsi menginisiasi seluruh metabolisme tubuh termasuk di tiroid. Hormon tiroksin akan diubah menjadi triiodotironin melalui proses translasi untuk menginisiasi metabolisme sel diseluruh tubuh. Proses translasi menimbulkan efek samping seperti peningkatan suhu tubuh. Peningkatan suhu tubuh pada kondisi normal disebabkan meningkatnya TNF-α yang berperan sebagai pyrogen. Hal ini berbeda nyata dengan kondisi AITD yang menunjukkan peningkatan ekspresi TNF-α. Kelompok AITD menunjukkan ekspresi TNF-α yang meningkat dibandingkan kontrol sebesar 657,78% (Gambar 1.B, dan Tabel 1). Menurut Mori (1998) dalam penelitiannya, pemberian NaI pada hewan coba sebesar 0,05% menyebabkan peningkatan ekspresi TNF-α. Morohoshi (2011) menyatakan untuk membuat hewan model AITD digunakan NaI 0,05% melalui air minum selama 5 minggu. Peningkatan ekspresi TNF-α disebabkan oleh aktivitas sel-sel imun, yaitu meningkatnya kemampuan Antigen Presenting Cells (APCs) untuk mengenali antigen dalam kelenjar tiroid. Selanjutnya, terdapat infiltrasi sel-sel imun tubuh pada kelenjar tiroid. Kemudian, Sel T akan berdeferensiasi menjadi T-Helper dan T-Cytotoxic untuk melakukan mekanisme kerja

imun humoral. Selain itu, sel-sel imun spesifik tubuh juga diaktifkan untuk memperparah kondisi AITD. TNF-α yang muncul merupakan produk dari makrofag, baik dalam peranannya sebagai APCs atau sebagai sel fagositosis. TNF-α yang diproduksi juga akan mengerahkan sel-sel fagosit untuk menghancurkan antigen sehingga terjadi kerusakan kelenjar tiroid. Interaksi antara autoantigen dengan makrofag menimbulkan aktivitas Thelper. Selanjutnya T-helper akan memproduksi sejumlah sitokin seperti IFN- yang akan mengaktivasi makrofag. Makrofag memproduksi TNF-α untuk mengerahkan neutrofil dan leukosit untuk memfagositosis autoantigen yang ada di tiroid (Baratawidjaja dan Rengganis, 2010). Sedangkan, dari hasil penelitian kelompok AITD menunjukkan penurunan dalam perbedaan yang nyata dengan kelompok terapi. Kelompok terapi menunjukkan ekspresi TNF-α yang menurun dibandingkan dengan kelompok AITD sebesar 61,8 % (Gambar 1.C dan Tabel 1). Namun tidak berbeda nyata antara kelompok terapi dengan kelompok kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa terapi yoghurt dapat menurunkan ekspresi TNF-α. Penurunan ekspresi TNF-α diakibatkan efek imunomodulator yang berasal dari yoghurt. Efek imunomodulator disebabkan oleh bakteri asam laktat (BAL). BAL akan memodulasi sistem imun dengan cara memproduksi sitokin antiinflamasi yaitu IL-10 dan TGF-β. Sitokin-sitokin antiinflamasi bekerja menghambat aktivitas sel-sel fagosit dan mengurangi defek sel T-regulator yang berasal dari kegagalan mekanisme regulasi (Lavasani et al., 2009). Selanjutnya, Menurut Wang dan Baker

5

(2007), yoghurt berperan dalam perbaikan kerja sel T-regulator yang berfungsi sebagai pengatur autoimun. Hal tersebut terjadi karena muncul sitokin IL-10 dan TGF-β yang disekresikan oleh sel T-regulator kepada sel T sehingga sel T berhenti berdeferensiasi. Kemudian makrofag, sitokin proinflamasi dan enzim-enzim penyebab apoptosis akan berhenti diproduksi dan kerusakan jaringan dapat dikurangi (Chiba et al., 2009). Zat-zat makanan yang terkandung dalam yoghurt juga berperan dalam memodulasi sistem imun tubuh seperti basic nutrient (PUFA, asam amino, karbohidrat), micronutrient (vitamin C), dan mineral (iron, dan selenium)

ikut berperan dalam meregulasi sistem imun. Vitamin C berperan sebagai antioksidan yang bekerja menghambat sitokin proinflamasi. Sedangkan iron berperan sebagai kofactor enzim pada reaksi oksidasi phosporilisasi dalam sintesis DNA. Kejadian ini menyebabkan sekresi IFN γ terhambat dan penurunan ekspresi TNF-α (Gamal, 2011). Gambaran Histopatogi Tiroid pada Tikus Model AITD yang diterapi Yoghurt Hasil pengamatan dengan histopatologi kelenjar tiroid tikus AITD yang mendapat terapi yoghurt dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2 Gambaran Histopatologi Tiroid Hewan Model AITD (400x) Keterangan: A = tiroid tikus kontrol; B = tiroid tikus autoimmune thyroiditis; C = tiroid tikus autoimmune thyroiditis yang diterapi yoghurt; a = lumen; = sel tirosit.

6

Kelompok tikus normal (Gambar 2.A) menunjukkan gambaran sel epitel tiroid penyusun dinding folikel tiroid yang tersusun beraturan dan lumen normal berisi koloid. Hal ini sesuai dengan pendapat Dellmann dan Brown (2002) yang menyatakan kondisi kelenjar tiroid normal terlihat dari dinding folikel yang tersusun beraturan dan lumen berwarna cerah yang berisi koloid. Kondisi ini berbeda pada kelenjar tiroid kelompok AITD yang menunjukkan kerusakan jaringan. Kelompok tikus AITD (Gambar 2.B) menunjukkan susunan sel epitel tiroid yang tidak beraturan dan tidak mengelilingi folikel tiroid. Kerusakan jaringan tiroid yang ada disebabkan oleh mekanisme autoimun tubuh. Respon imun bekerja dengan cara mengenali antigen yang masuk ke dalam tubuh termasuk autoantigen seperti protein-protein intratiroid. Selanjutnya, antigen yang dikenali menyebabkan deferensiasi sel T yang berakibat kerusakan kelenjar tiroid. Sitokin-sitokin proinflamasi yang muncul pada reaksi imun tubuh (TNFα, IFN-γ, IL-1) menyebabkan proses penghancuran sel oleh makrofag, neutrofil dan leukosit. Menurut Song et al., (2011) tingkat kerusakanjaringan ditunjukkan terjadinya apoptosis sel-sel tiroid yang ditandai dengan tidak teraturnya letak sel-sel epitel tiroid. Kondisi ini berbeda pada kelenjar tiroid kelompok terapi yang menunjukkan perbaikan jaringan. Kelompok AITD yang diterapi dengan yoghurt (Gambar 2.C) menunjukkan sel-sel epitel tiroid yang berada disekitar folikel tiroid mendekati gambaran histologi kelompok A, dinding folikel tiroid tersusun beraturan. Hal ini menunjukkan bahwa terapi yoghurt

dapat memperbaiki susunan sel epitel disekitar folikel tiroid. Menurut Lavasani et al.,(2009) terapi yoghurt dapat menurunkan autoimunitas tubuh. Berhentinya autoimunitas tubuh menyebabkan tubuh mengkompensasi kerusakan-kerusakan tubuh melalui proses regenerasi sel tiroid. Terapi yoghurt akan memberikan efek perbaikan jaringan yang merupakan manfaat dari zat-zat makanan yang terkandung dalam yoghurt seperti basic nutrient (PUFA, asam amino, karbohidrat), micronutrient ( asam folat, carotene, vitamin A, vitamin B6, vitamin C, vitamin E), dan mineral ( Zn, iron, dan selenium) yang berperan dalam perkembangan sel-sel tiroid (Gamal, 2011). 4. Kesimpulan Pemberian terapi yoghurt pada tikus AITD dengan jumlah bakteri 109 cfu/ml mampu menurunkan ekspresi TNF-α sebesar 61% dan memperbaiki kerusakan struktur jaringan tiroid yang ditunjukkan kembalinya struktur sel epitel tiroid disekitar folikel tiroid. 5. Saran Diperlukan penelitian lanjutan mengenai peran yoghurt untuk mencegah AITD. 6. Ucapan Terima Kasih Terima kasih kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi yang membantu pendanaan penelitian ini melalui Program Kreatifitas Mahasiswa serta Laboratoirum Biokimia dan Fisiologi Hewan FMIPA Universitas Brawijaya sebagai tempat penelitian.

7

Pertumbuhan Escherichia coli Secara in vitro. [Skripsi]. Fakultas Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor.

Daftar Pustaka Akin, F (ed.). 2011. Basic and Clinical Endocrinology Up-to-Date, InTech, Rijeka.

Lavasani, S.D., B. Nouri, M. Fak, F. Buske, S. Molin, G. Thorlacius, H. Alenfall, J. Jeppsson, and B.Westrom. 2009. A Novel Probiotics Mixture Exert a Therapeutic Effect on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mediated by IL-10 Producing Regulatory TCell. Autoimmunity 5: 1-11.

Baratawidjaja, K.G., dan I. Rengganis. 2010. Imunologi Dasar. Edisi ke-10. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Burek, C.L., and M.V. Talor,. 2009. Environmental Trigger of Autoimmune Thyroiditis. Autoimmunity 33 (2009) :183189 Chiba, Y., S. Kun, N. Saturo, and W. Mariko. 2009. Well-controlled proinflammatory cytokines responses of Peyer patch cells to proboitic lactobacillus casei. Immunology130 : 352-362

Morohoshi, Kazuki,. Y. Katsumi, N. Yoshinori, H. Saeko, O. Hiroshi, T. Yurie, I. Sadayoshi, and M. Kouki. 2011. Effect of Synthetic Retinoid Am80 on Iodine-Induced Autoimmune thyroiditis in Nonobese Diabetic Mice. Cellular Immunology 270 :1-4

Dellmann, H.D., dan E.M. Brown. 2002. Buku Teks Histologi Veteriner II. Edisi ketiga. UI Press.

Mori. K. 1998. Increased expression of tumor necrosis factor-α and decreased expression of thyroglobulin and thyroid peroxidase mRNA levels in the thyroids of iodide-treated BB/Wor rat. Division of Endocrinology. University of Massachusetts Medical Center. European Journal of Endocrinology 139:139-545

Deruiter, J. 2002. Thyroid hormone tutorial: Drug and other therapies. Endocrine Pharmacotherapy Module. Gamal, Y.M.E., O.A. Elmasry, and D.H.E. Ghoneimy. 2011. Immunomodulatory effects of food. Departement of Pediatrics, Ain Shams University, Cairo. Egypt journal of food technology 1:3-13

Rose, N.R., B. Raphael, and B. Lynne. 2002. Iodine : An Environmental Trigger of Thyroiditis. Autoimmunity Reviews 1: 97 – 103.

Grajek, W., A. Olejnik, and A.Sip. 2005. Probiotics, Prebiotics, and Antioxidants as Functional Food . Biotechnology 52 (3) : 665-671

Song, X.H., R. Z. Zan, C. H.Yu, and F. Wang,. 2011. Effect of Modified Haizao Yuhu Decoction in Autoimmune experimental autoimmune

Hidayat, A.N.R. 2009. Potensi Yoghurt Susu Kambing Peranakan Etawa Sebagai Penghambat

8

thyroiditis rat. College of Pharmautical Science. Zheylang Chinese Medical University. Elvesier Ireland Ltd. Tozzoli, R.B., O. Ram, M. Villalta, D. Bizzaro, N. Sherer, dan Y. Shoenfeld. 2008. Infection and Autoimmune Thyroid Disease : Parallel Detection of Antibodies Against Pathogens with Proteomic Technology. Autoimmune Reviews 8 : 112115. Wang, S.H., dan Baker J.R. 2007. The role of apoptosis in thyroid autoimmunity. Thyroid 17(10) :975-9.

9

34

35