H.-Hartziekenhuis Roeselare - Menen vzw Wilgenstraat 2 - 8800 Roeselare
DNA/RNA extracties uit FFPE weefsel Dr. Sc. Elke Boone, H.-Hartziekenhuis Roeselare-Menen
Belang van intacte DNA/RNA moleculen voor moleculaire diagnostiek
Diagnostiek gebaseerd op de analyse van moleculen.
Moleculaire Diagnostiek: PCR analyses
Intact DNA! Zuiver DNA! Geen contaminatie!
Moleculaire Diagnostiek: RT-PCR analyses
Intact RNA! Inactivering van de endogene RNasen!
Moleculaire Diagnostiek: FISH analyses
Intacte morphologie!
Pre-analytische fase?
Periode voorafgaand aan de eigenlijke analyse van het staal in het laboratorium. Belangrijke component in de laboratoriumgeneeskunde, en dus ook in de moleculaire diagnostiek. Belangrijke bron van foute resultaten.
Staaltransport
Gouden regel voor de afname: onmiddellijk na afname doorsturen op kamertemperatuur naar laboratorium! Stabilisering van het staal gebeurt in het laboratorium! Doel: morfologie, DNA en RNA moleculen intact houden! Verzendingen: labo weet hoe, wat en wanneer Interne staalverwerking om batch analyse toe te laten
Staaltransport
Gouden regel voor de afname: onmiddellijk na afname doorsturen op kamertemperatuur naar laboratorium! “Intern labotransport” verlengt tijd tot stabilisering Primaire aanvraag: onmiddellijk stabilisering MAAR! moleculaire analyses worden vaak pas in 2de lijn aangevraagd: door klinisch bioloog na het vaststellen van een hematologische maligniteit in bloed, beenmerg, klieren, etc… door patholoog na het vaststellen van de aanwezigheid of sterk vermoeden van een tumor in de genomen biopsie
Staalvoorbereiding
Afhankelijk van type staal, type analyse (FISH, DNA of RNA) en/of nucleïnezuur extractiemethode Perifeer bloed of BM FISH-analyse: onmiddellijk uitstrijkjes maken! (CLL, fragiele cellen) Fixeren in EtOH DNA-analyse: invriezen < -17°C (Qiagen extractie) Lyseren en dan invriezen (EasyMAG extractie) RNA-analyse: verwijdering van RBC (niet-relevant RNA) Lyseren en invriezen van WBC om RNasen te inactiveren
Staalvoorbereiding: biopten en/of FFPE weefsel
Staal type Staal verwerving Fixatie Paraffine inbedding Kleuring (niet goed) Opslag (voor RNA best bij 4°C)
Deparaffiniseren Opzuiveren van DNA/RNA PCR analyse
Staalvoorbereiding: biopten en/of FFPE weefsel
Elk weefsel heeft een specifieke fysiologische functie, een unieke structuur en opbouw van celtypes Degradatiesnelheid, eventuele inductie en modificatie van biomoleculen is weefsel specifiek Tengevolge van anesthesie, ligatie van bloedvaten en het uitsnijden van het weefsel kunnen biomoleculen veranderen. Zo vlug mogelijk verwijderen en fixeren/ stabiliseren!!!!
Staalvoorbereiding: biopten en/of FFPE weefsel
Staalvoorbereiding: FFPE weefsel
Type buffer Neutrale, gebufferde, formaline (minder degradatie van formaline, beter voor de DNA kwaliteit) Geen Bouin of picric acid Dikte van het weefsel Hoeveelheid buffer Fixatieduur Onderfixatie: DNA/RNA of eiwit afbraak of verandering Overfixatie: teveel crosslinking, slechte DNA kwaliteit
Staalvoorbereiding: paraffine embedding
Dehydratatie: water wordt vervangen door alcohol, meestal ethanol Moet volledig zijn want restwater kan tot degradatie leiden van bv. eiwitten “Clearing”: alcohol wordt vervangen door xyleen of equivalent “Impregnation”: xyleen wordt vervangen door paraffine “Embedding” : staal wordt volledig omgeven door paraffine Daarom: Niet verdunde reagentia moeten gebruikt worden (geen water verdunningen) Verse reagentia (alcohol en xyleen) om wateroverdracht te vermijden Tijdsduur en temperatuur moeten optimaal zijn Samenstelling en smelttemperatuur van paraffines kan verschillen: geen “beeswax” additiven en paraffine met hoge smelttemperaturen gebruiken (meer degradatie)
Qiagen DNA-extractie uit FFPE weefsel
Kwaliteitscontrole
DNA-kwaliteit Concentratie van de bekomen DNA-oplossing OD260/280 ratio (1.8-2.0) Amplificeerbaarheid van het DNA: Mate van irreversibele crosslinking Fragmentatie van DNA
BM
FFPE
Tonsil
Kwaliteitscontrole
Darmbiopten - FFPE
KRAS exon 2 - 234bp
KRAS exon 3 - 261bp
Kwaliteitscontrole
Longbiopsies - FFPE
Kwaliteitscontrole
96bp, 206bp, 400bp, 613bp, en 785bp
Penetratiesnelheid formaline: 1 mm per uur Snelheid omgekeerd evenredig met de dikte van het weefsel Dikte moet optimaal zijn om overfixatie aan de rand, en onderfixatie in het centrum te vermijden
Kwaliteitscontrole
RNA-kwaliteit Concentratie van de bekomen RNA-oplossing OD260/280 ratio (1.8-2.0) Amplificeerbaarheid van het RNA: Mate van irreversibele crosslinking Mate van afbraak door RNasen
Kwaliteitscontrole
Ratio buffer/weefsel best 10:1 Niet langer dan 24h fixeren om verhoogde crosslinking te vermijden
