ÖRÖKLETES FAKTOROK ÉS INFEKTÍV TÉNYEZŐK

ÖRÖKLETES FAKTOROK ÉS INFEKTÍV TÉNYEZŐK HATÁSA AZ ATEROSZKLEROTIKUS FOLYAMAT PROGRESSZIÓJÁRA

Doktori értekezés

Dr. Rugonfalvi Kiss Szabolcs Témavezető: Prof. Dr. Füst György

Doktori Iskola:

7/5 Elméleti és Klinikai Immunológia

Szigorlati Bizottság: Prof. Dr. Keltai Mátyás (Elnök), Dr. Kiss Róbert Gábor, Dr. Rajczy Katalin Hivatalos Bírálók:

Dr. Kalina Ákos, Dr. Sótonyi Péter

Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola 2006

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ...................................................................................................................4 1. BEVEZETÉS ..........................................................................................................................................5 1.1 ÉRSZŰKÜLETHEZ VEZETŐ FOLYAMATOK ............................................................................................7 1.1.1 Ateroszklerózis ..........................................................................................................................7 1.1.2 Az ateroszklerózis gyulladásos betegség ...................................................................................9 1.1.2.1. Infektív tényezők szerepe az ateroszklerózisban..............................................................10 1.1.3. Invazív terápiás beavatkozások a vizsgált érterületeken.........................................................12 1.1.4. A restenosis patobiológiája.....................................................................................................15 1.2. A KOMPLEMENT RENDSZER .............................................................................................................16 1.3. MANNÓZ KÖTŐ FEHÉRJE (MBL) ......................................................................................................19 1.3.1. Humán lektinek és a természetes immunitás...........................................................................19 1.3.2. Az MBL biokémiája ...............................................................................................................23 1.3.2.1. A polipeptid szerkezete ....................................................................................................23 1.3.2.2. Génszerkezet....................................................................................................................26 1.3.2.3. Genetikai változatok........................................................................................................27 1.3.2.4. Kapcsolat a genotípus és a fenotípus között....................................................................29 1.3.3. Az MBL biológiai aktivitása...................................................................................................30 1.3.3.1. MBL biológiai folyamatokban.........................................................................................30 1.3.3.2. MBL és betegségek kapcsolata........................................................................................32 2. VIZSGÁLATOK ..................................................................................................................................36 2.1. CÉLKITŰZÉSEK ................................................................................................................................36 2.2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ...............................................................................................................38 2.2.1. Vizsgálati csoportok és vizsgálati terv....................................................................................38 2.2.1.1. Az 1. betegcsoport – Súlyos koszorúér betegek prospektív vizsgálata ............................38 2.2.1.2. A 2. betegcsoport – Carotis endarterectomia utáni retrospektív párosított eset-kontroll vizsgálat .......................................................................................................................................39 2.2.1.1. A 3. betegcsoport – Carotis endarterectomia utáni prospektív vizsgálat........................39 2.2.2. Vizsgálati módszerek ..............................................................................................................41 2.2.2.1. Laborvizsgálatok .............................................................................................................41 2.2.2.2. Klinikai vizsgálatok .........................................................................................................44 2.3. EREDMÉNYEK ..................................................................................................................................46 2.3.1. Súlyos koszorúérbetegek prospektív vizsgálata..................................................................46 2.3.2. Carotis endarterectomia utáni retrospektív elemzés ..........................................................52 2.3.3. Carotis endarterectomia utáni prospektív vizsgálat...........................................................53 2.4. MEGBESZÉLÉS .................................................................................................................................59 2.4.1. Az iszkémiás szívbetegség, az iszkémiás szívbetegség progressziója és Chlamydia fertőzés, valamint az MBL variáns allél közti összefüggés .........................................................................59 2.4.2. Az MBL allélek és a carotis endarterectomia utáni restenosis közti összefüggés ..............61 2.5. KÖVETKEZTETÉSEK .........................................................................................................................65 2.5.1. Az eredmények összefoglalása ...............................................................................................65 2.5.2. Következtetések ......................................................................................................................66 3. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS..............................................................................................................67 4. IRODALOMJEGYZÉK ......................................................................................................................68 5. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE............................................................................................78 5.1. AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK ......................................................................78 5.2. A TÉMÁVAL ÖSSZEFÜGGŐ KÖZLEMÉNYEK .......................................................................................78

2

5.3. EGYÉB KÖZLEMÉNYEK ....................................................................................................................78 6. ÖSSZEFOGLALÓ ...............................................................................................................................80 6.1. MAGYAR ÖSSZEFOGLALÓ ................................................................................................................80 6.2. SUMMARY IN ENGLISH ....................................................................................................................81 7. MELLÉKLET ......................................................................................................................................82 I.

SÚLYOS KORONÁRIABETEGEKNEK KÜLDÖTT POSTAI KÉRDŐÍV .....................................................83

II.

MBL PRIMEREK ............................................................................................................................85

III.

DOLGOZAT ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNY 1 .....................................................................86

IV.

DOLGOZAT ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNY 2 .....................................................................93

V.

TÉMÁVAL ÖSSZEFÜGGŐ KÖZLEMÉNY 1 ....................................................................................99

VI.

TÉMÁVAL ÖSSZEFÜGGŐ KÖZLEMÉNY 2 ..................................................................................105

VII.


VIII.


IX.


3

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

AA AHA AT ATP BMI CABG CDS CEA CI CMV CRD CRP DES DNS EKG ELISA FEV1 HDL hsp60 IFN-γ Ig IL ISZB kDa LDL LPS MAC MASP MBL MDCC MI OR PAMP PCR PRR PTCA RNS RPM sMAP STD TIA

Aminosav American Heart Association Antitest Adenosin triphosphat Body mass index Coronary artery bypass graft Carotis doppler scan Carotis endarterectomia Konfidencia intervallum Cytomegalovirus Carbohydrate recognition domain C-reactive protein Drug eluting stent – gyógyszerkibocsájtó stent Desoxyribonucleinsav Elektrokardiogramm Enzyme-linked immunosorbent assay Forszírozott kilégzési térfogat 1 sec alatt High density lipoprotein Heat shock protein 60 kDa – 60kDa-os hősokk fehérje Interferon gamma Immunglobulin Interleukin Iszkémiás szívbetegség Kilodalton Low density lipoprotein Lipopolisacharid Membrane attack complex Mannan associated serine proteases – Mannóz kötött szerin proteáz Mannan binding lectin – mannóz kötő fehérje MBL-dependent cell mediated cytotoxicity Miokardiális infarktus Odds ratio Patogen associated molecular pattern – patogénre jellemző molekuláris mintázat Polymerase chain reaction Pathogen recognition receptor – patogén felismerő receptor Percutan transluminary coronaro angiography – perkután transzlumináris koronaro angioplasztika Ribonucleinsav Rotation per minute Small Mannan associated protease Sexually transmitted disease Transitoric ischemic attack

4

1. B E V E Z E T É S

Jelen értekezés nemcsak a négyévnyi kutatómunkának, hanem a III. Sz. Belgyógyászati Klinika Kutatólaboratóriumának azt megelőző és azt követő egymásra épülő eredményeinek köszönhetően jöhetett létre. 1995-ben súlyos koszorúérbetegek körében indított alapos keresztmetszeti vizsgálat, illetve ezt prospektívvé tett kérdőíves adatgyűjtés volt a munkacsoport vizsgálatának tárgya. Ennek tanúságait felhasználva a carotisban manifesztálódó ateroszklerotikus folyamatokat vizsgáltunk a későbbiekben retrospektív és prospektív mintában. Ezen követéses és keresztmetszeti vizsgálatok eredményei képezik az értekezés alapját. Munkacsoportunk

az

ateroszklerotikus

folyamat

több

manifesztációjának

megfigyelésével az érfalban zajló gyulladásos folyamat progresszióját akarta vizsgálni, egy az ebben feltételezhetően szerepet játszó – a természetes immunrendszer tárgykörébe tartozó – molekula, a mannóz kötő fehérje megfigyelésével.

Az irodalmi háttér részeként röviden áttekintem ateroszklerózis a jelen tudásunk szerinti elméletét, illetve ennek kapcsolódási pontjait a munkánk tárgyával, valamint a komplement kaszkádot, mely a mannóz kötő fehérje legfőbb effektor rendszere is. Tekintettel arra, hogy a közölt eredmények mindegyike kapcsolódik a mannóz kötő fehérjéhez, valamint arra, hogy e fehérje biológiai szerepe csak a közelmúltban kezdett el tisztulni, ezért úgy éreztem, hogy bővebb szerkezeti és molekuláris biológiai magyarázatokon túl szükséges kitérni a természetes immunitásban elfoglalt szerepére is. Ennek nyomán foglalkozom a mintázatfelismerő receptorok felépítésével, biológiájával és a természetes immunitásban elfoglalt helyével, valamint az mannóz kötő fehérje különböző betegségekben betöltött szerepével is. Ezt követően röviden ismertetésre kerülnek a megismert irodalmi adatokon alapuló munkahipotézisek, a vizsgálati csoportok és módszerek. A követéses vizsgálatok protokollja nem a módszerek, hanem a betegcsoportok leírásához került a töredezettség elkerülése érdekében. Az eredmények bemutatása a különböző betegcsoportoknak és azon belül a problémafelvetéseknek megfelelően készült el. A megbeszélés az értekezés végén található meg a problémafelvetés szerinti bontásban.

5

Az értekezésben a Magyar Tudományos Akadémia megengedő iránymutatásának megfelelően igyekeztem kizárólagosan a magyar helyesírás szabályai szerint használni a szakmai nyelvet. Olyan esetekben, ahol nincs, vagy a magyar változat nem megfelelő, dőlt betűkkel az eredeti terminus technicust alkalmaztam.

6

1.1 Érszűkülethez vezető folyamatok Egy 1997-ben közölt tanulmány jóslata szerint 2020-ig a nyugati civilizáció által befolyásolt területeken a kardiovaszkuláris megbetegedések és az ezen okból bekövetkezett halálozás további növekedése várható (1). A korábbi arterió- és ateroszklerózis elméletek után (monoklonális növekedés elmélete (2), és a Karl Freiherr von Rokitanskynak tulajdonított szervült vérrög elmélet) a kizárólag koleszetrinre öszpontosító lipidelméletet elemeit is magába foglaló sérülésre adott válasz (response to injury) a jelenleg elfogadott aterogenetikus hipotézis (3). Ezt mai formájában a közelmúltban elhunyt Russel Ross fogalmazta meg (4). Régóta ismertek az ateroszklerózis klasszikusnak tekinthető rizikófaktorai (magas vérnyomás betegség, hypecholesterinaemia, obesitas, diabetes, dohányzás, életkor, kedvezőtlen életmód, férfi nem), melyekhez az elmúlt időben még néhány csatlakozott (pl. hyperhomocisteinaemia). Ezek fontos individuális és populációs prognosztikai faktorok, de a sejtbiológiai mehanizmus megértéséhez nem visznek közelebb. Mivel ezen kockázati tényezők együttesen csak az esetek felét fedik le, ezért egyéb kockázati tényezők fennállásával kell számolni (3). Az American Heart Association által 1994ben kiadott klasszifikáció (5,6) által makroszkópos ismérvek alapján csoportosított ateroszklerotikus folyamatról sok mindent tudunk, de az egész iniciációja még kérdéses és az egyéb kockázati tényezők között felmerül infektív (pl. C. pneumoniae, CMV), és autóimmun faktorok (hsp60) kóroki, illetve additív szerepe is.

1.1.1 Ateroszklerózis A koreai háborúban elesett katonák vizsgálata óta biztosan tudjuk, hogy a patológiás folyamat a fatty streak kialakulásával már fiatal korban kezdődik. Ez panaszt nem okoz, de ateromába progrediálhat, vagy akár meg is szűnhet. Az előrehaladott ateroma kötőszövetes sapkából, illetve az elváltozás tömegét adó lipid dús magból áll. A magot habos sejtek, lipidzárványok, sejttörmelék, míg ezt a lumen felé lezáró sapkát a simaizom sejtek és az általuk termelt által termelt kollagéngazdag mátrix alkotja. A széleken lévő váll részen T-sejt, makrofág, és hízósejt infiltráció figyelhető meg. Az ateroma jellemzője továbbá a neutrofilek hiánya is.

7

1. ábra: Az ateroszklerotikus folyamat sematikus ábrázolása a koszorúserekben: a fatty streaktól a plakkruptráig. Az érfalban zajló gyulladás következtében lipid dús mag és azt a lumen felé lezáró kötőszövetes sapka alakul ki, mely az érbe domborodva egyre növekvő áramlási akadályt képez. Plakkruptúra esetén erősen trombogén felszín válik szabaddá és gyors trombusképződés indul meg akut koronáriaszindróma klinikai képét alakítva ki.

A lumen felé diszfunkciós endotél réteg borítja az elváltozást, melynek a nyugvó állapothoz képest jelentősen megváltozik az adhéziós molekula mintázata. Ezen megváltozott

mintázat

elősegíti

leukociták

(monociták,

T-sejtek,

hízósejtek)

megtapadását és szöveti migrációját. Az endotéliumban számos anyag szintézise módosul. A nitrogén monoxid szintézis csökken, és az arachidonsav származékok is vasoconstrictio és thrombogenitás felé tolják el a korábbi egyensúlyi állapotot. Az aktivált makrofágoknak kulcsszerepe van a plakk morfológiájának (habos sejtek a magban) és súlyos klinikai állapot kialakulásában (plakkruptúra miatt acut coronaria syndroma) így a progresszió egyik lényegi mozzanata (7) az, hogy az endotélium által termelt kemotaktikus feaktorok (pl. macrophage chemoatractans protein-1 [MCP-1]) hatására keringő monociták tapadnak ki az érintett érszakaszhoz (vita kérdése, hogy direktben a lumen felől, avagy az alacsony nyírási feszültségű vasa vasorumból), majd az érfalba jutva szöveti makrofággá differenciálódnak. Az aktivált makrofágok a mintázatfelismerő receptoraikon keresztül internalizálni képesek egy sor, jelen 8

folyamatban is szerepet játszó, partikulumot (például endotoxin, apoptotikus tömelék, oxidált LDL), és ezek – döntően a koleszterin – akkumulációja által alakulnak át habos sejtekké (8). A makrofágok ezen patológiás formái által alakul ki a későbbi lipid dús mag. CD4+ T-sejtek is mindig izolálhatóak a plakkokból melyek közül kimutathatóak oxidált LDL-re (9), 60 kDa hősokk fehérjére (10), valamint Chlamydiára (11) reaktív klónok is. A plakkokra jellemző Th1 túlsúlyú citokin mintázat (IFN-γ, IL-2) kialakulása is T-sejtek által indul. Ezek hatására öngerjesztő folyamatként további endotél, simaizomsejt és antigén prezentáló sejt aktiváció, valamint citokin termelés következik be.

1.1.2 Az ateroszklerózis gyulladásos betegség A kardiovaszkuláris rendszer lokális mikrokörnyezetét ért többszörös és sokrétű hatások (genetikai, haemorrheologiai, toxikus, infektív), pontosabban az ezek által kiváltott válaszok vezethetnek hosszú idő után a krónikus gyulladásos folyamat kialakulásához. A mikrokörnyezetet az érfal – rétegeivel, saját ér- és nuronhálózatval együtt – a keringő vér – minden oldott és partikuláris elemével –, illetve az immunrendszer jelentik. Az endotélium számtalan anyag termelésére képes szervünk, mely részt vesz az érpermeabiltitás, a trombózis, az értónus, a természetes és az adaptív immunválasz kialakításában. A szervezetben helyenként különböző és dinamikusan változó mikrokörnyezetet érő hatások az endotél aktivációjához, majd diszfunkciójához vezethetnek. Ez a fent felsorolt funkciók nem szabályozott – dinamikus nyugalmi állapotba visszatérni nem képes – állapotát jelenti, melyet legegyszerűbben a nitrogénmonoxid (NO) válasz csökkenésével jellemezhetünk. Az endotélsejtek számtalan jelre képesek reagálni, így aktiválódni, és végső soron diszfunkcióssá válni. Többek között a felhalmozott foszfolipidek (12), módositott LDL (13), a véráramlási mintázat, illetve ennek megváltozása (14), és a trombociták is (15) mind képesek akár ép endotélt is aktív, majd diszfunkciós állapotba juttatni. Mindezek még kifejezettebben jelentkeznek az érfalban már zajló gyulladás esetén.

A gyulladásos folyamat hatására lokálisan és a zsírszövetben megemelkedik az IL-6 termelés, és valószínűleg ennek következtében, szintén mind lokálisan (16) mind szisztémásan (17), megjelennek az akut-fázisra jellemző fehérjék (CRP, szérum 9

amiloid A, fibrinogén). Évekkel ezelőtt fény derült arra, hogy ezen gyulladásos markereknek komoly prognosztikai szerepe lehet (18) és mára a CRP-t független rizikófaktornak tarják (19). A szervezetben zajló gyulladás jeleként ezen emberekben emelkedett IL-7 (20), IL-8, szolubilis CD40-ligand (sCD40L) is mérhető (21). Az aktivált makrofágok, T-sejtek és hízósejtek különböző molekula termelése által (proteázok, citokinek, koagulációs fakorok, reaktív oxigén gyökök, vazoaktív mediátorok) destabilizálhatják a nyíróerőnek kitett fibrózus sapka szerkezetét, mely berepedhet (plakk ruptúra). Ezáltal egyrészt mehanikai akadály képződik, másrészt erősen trombogén felszín válik szabaddá és a képződött trombus által az ér átmenetileg (pl. angina), vagy végleg elzáródhat (pl. infarktus) (8), illetve trombusforrásként működhet (pl. TIA). Az aktiválódó trombocitákból további, gyulladást segítő, mediátor szabadul fel.

1.1.2.1. Infektív tényezők szerepe az ateroszklerózisban A klasszikus ateroszklerózis rizikófaktorok együttesen is csak az esetek felében magyarázzák a betegség kialakulását, ezért további potenciális rizikófaktorok keresése került a kutatás középpontjába (22).

1.1.2.1.1. Chlamydia pneumoniae A Chlamydia non-motilis, obligát intraceluláris parazita, mert nem képes ATP szintézisre. Eredetileg vírusnak tartották, de mivel DNS-t és RNS-t is tartalmaznak és sejtfaluk kémiailag hasonló a gram-negatív baktériumokhoz, valamint riboszómáik vannak, ezért a baktériumok közé sorolták őket. A Chlamydia genusba ma 4 species tartozik: C. psittaci (psittacosis), a C. pneumoniae (chlamydia pneumonia) és a C. trachomatis 15 serotípusa (A, B, Ba, C: trachoma, inkluziós conjunctivitis; D-K: STD; L1, L2: lymphogranuloma venereum; L3: egér pneumonitis) és a C. pecorum. A korábban TWAR-ként, ma Chlamydia pneumoniae-ként ismert baktériumot a C. psittaci egyik szerotípusának tartották. Különösen gyermekekben és fiatal felnőttekben a pneumonia kórokozója lehet. Közösségben szerzett tüdőgyulladások 6-19%-ban izolálható Chlamydia pneumoniae és nem mutat szezonálist. Szövetkultúra segítségével izolálható, direkt fluorescens antitest és enzim immunoassay segítségével szintén kimutatható. Szerológiai vizsgálatokkal kizárható a fertőzöttség. Fejlődési ciklusuk 10

során morfológiailag és funkcionálisan is különböző két formában léteznek: fertőzőképes elemi test (elementary body) és a szaporódóképes retikulált test (reticulate body). Szeroepidemiológiai vizsgálatok szerint a Chlamydia genus földrajzilag igen elterjedt, körülbelül 5-10 évente járványokat okoz. A szeropozitivitás a felnőtt lakosság körében világszerte 50-80% (3,8,23). Saikku és mtsai eredeti közleménye óta – ahol összefüggést tudtak kimutatni a C. pneumoniae szeropozitivitás és akut szívizom infarktus között (24) – sok vizsgálat történt ezzel kapcsolatban, de az eredmények mind a mai napig ellentmondóak. A baktérium kimutatható volt ateroszklerotikus elváltozások simaizom sejtjeiben, makrofágokban, illetve az extracelluláris mátrixban is. Az érrendszer különböző helyéről vett mintában is előfordul, úgy mint coronaria (25), aorta (26), arteria carotis (27), iliaca illetve femoralis artéria (28). Amint azt korábban láthattuk a morfológiai jelenléten túl funkcionális kapcsolatra utaló jelek is felfedezhetőek, ugyanis Chlamydia-reaktív T-sejt klónok is izolálhatóak (11). A gyulladás folyamat fenntartásában egyes feltételezések szerint a Chlamydia és humán antigének közti molekuláris mimikrinek lehet szerepe, mások direkt endotél hatásokat hangsúlyoznak (pl.

Chlamydia

lipopolisacharid),

mivel

kimutatták,

hogy

számtalan

az

ateroszklerózisban is szerepet játszó, gén aktiválódik a fertőzés hatására (29).

1.1.2.1.2. Egyéb fertőző ágensek A többi vírus és baktérium esetén kevésbé bizonyított a patogenetikai szerep. Cytomegalo vírus és Herpes simplex vírust is mutattak ki aterómából, valamint sikerült ebben a folyamatban fontos szerepet játszó sejtek kísérletes körülmények közötti aktiválása is (30). Vannak adatok Helicobacter pylori (31,32) és Coxsackie B vírusok (31), valamint odontopatogének (Pophyromonas gingivalis, Streptococcus sanguis) (22) feltételezett szerepéről is.

Az infektív ágensekre vonatkoztatva Zhu és munkatársai fogalmazták meg az összesített patogénterhelés elméletet (total pathogen burden), mely szerint a koronáriabetegség kialakulására annál nagyobb az esély, minél több fertőzést szenved el az egyén bizonyos kórokozóktól (33,34). Erre alapozva valószínűnek látszik, hogy az ateroszklerózis 11

multifaktoriális jellegéből adódóan az egyén genetikai adottságára épülve a számtalan apró hatás összessége képes a folyamatot elindítani, a krónikus gyulladást fenntartani illetve a patológiás elváltozást létrehozni.

1.1.2.1.3. Antibiotikus kezelés hatása az ateroszklerózis progressziójára Annak ellenére, hogy a C. pneumoniae fertőzés összefüggést mutat az ateroszklerotikus folyamat indulásával és a betegség progressziójával, az ISZB esetén adjuvánsként alkalmazott anti-Chlamydia antibiotikus kezelés eredményességéről szóló közlemények ellentmondóak. A közelmúltban megjelent metaanalízis 11 releváns vizsgálat által az 1966 és 2005 április közti időszakot fogja át 19.217 beteg adatainak elemzésével (35). Közleményük szerint az antibiotikus kezelésnek nincs hatása az összesített mortalitásra (4.7% vs 4.6%; odds ratio [OR], 1.02; 95% konfidencia intervallum [CI] 0.89-1.16; P = 0.83), a miokardiális infarktus (MI) előfordulására (5.0% vs 5.4%; OR, 0.92; 95% CI, 0.81-1.04; P = 0.19), vagy kombinált végpont esetén sem (MI és instabil angina) (9.2% vs 9.6%; OR, 0.91; 95% CI, 0.76-1.07; P = 0.25). Mindenhol a kezelt és a kezeletlen csoport értékei vannak összehasonlítva.

1.1.3. Invazív terápiás beavatkozások a vizsgált érterületeken Az ateroszklerotikus folyamat előrehaladtával rendszerint az ér lumenébe domborodó ateroma fokozódó véráramlási akadályt jelent, illetve a benne zajló gyulladás miatt alkalmanként felszíne trombogénné válva lokális és távoli elzáródási tüneteket produkálhat. Az egyes szerveknek megfelelő tünetcsoportokat produkáló betegek kivizsgálásában az érpálya vizualizálásának van kiemelt szerepe. Amennyiben az érlumen átjárhatósága ismételten biztosítható, és az ellátási területen nem következett be jelentős szövetpusztulás, akkor a tünetek gyakorlatilag azonnal megszűnnek. Több támadáspontra fokuszált gyógyszeres kezeléssel javítható az invazív beavatkozások rövid-, illetve hosszútávú sikeressége.

12

Érfali gyulladás Növekvő ateróma Haemodynamikai zavar Panaszok Coronaria: angina pectoris, szívinfartus; Perifériás artériák: claudicatio, üszkösödés, bélelhalás; Carotis: TIA, stroke

Diadnosztika Angiográfia, doppler ultrahang, CT/ MR angiográfia

Terápia Invazív

Konzervatív 2. ábra: Ateroszklerotikus betegség klinikai megközelítése

1.1.3.1. Coronary artery bypass surgery (CABG) A szűkült koszorúsér szakasz megkerülése céljából végzett beavatkozás, melyben mellkas és szívburok megnyitást követően a szív pumpafunkcióját szívmotor veszi át a műtét idejére. Az elzáródott részt vena saphena, vagy arteria mammaria interna grafttal hidalják át. A graft occlusiót trombózis okozza a korai szakban, míg évek múltán a vénás graft arterializálódása után ott is ateroma fejlődhet ki. Az 10-éves túlélés 80% 65 éves kor alatt, míg afelett 65% körül mozog (36).

1.1.3.2. Percutan transluminaris coronaria angioplastica (PTCA) Ballon angioplastica során perifériás artériából (rendszerint a. femoralis) hosszú vezetődróttal irányítva diagnosztikus, majd terápiás katétert vezetnek egymás után a coronáriákba. Az obstructio szintjében a katéren lévő ballont nagy nyomással felfújják. Az ateromatikus plakk összetörik és az érfalba nyomódik. A véráramlás fenntartása céljából az utóbbi időben többnyire hálót (stent) deponálnak ugyanerre a helyre. Újabban a beavatkozást követő proliferációs válasz gátlása céljából β-sugárzó, vagy citosztatikus hatású anyagot kibocsájtó stenteket (drug eluting stent – DES) használnak 13

sikerrel. PTCA-t követően a stentek alkalmazása óta a korábbi 30-40%-ról 15-30%-ra csökkent a visszaszűkülés gyakorisága (37). A DES-sel még jobbak az eredmények.

1.1.3.3. Carotis endarterectomia (CEA) A carotisokat az oszlás közelében kipreparálják. Időlegesen szükség lehet shunt kiépítésére is. Az elváltozástól proximálisan és distalisan az eret lefogják, majd a carotis internát megnyitják, az eret kifordítják és a plakkot a sérült intimarésszel együtt lefejtik. Alkalmanként foltplasztikát kell végezni az ér átmérőjének megnövelése céljából (Lásd a 3. ábrán). A műtéti eljárástól – és a restenosis definiciójától – függően 10% körül mozog restenosis valószínűsége (38).

3. ábra: Everziós carotis endarterectomia során a carotis internán végzett beavatkozás vázlatosan Az érintett oldali eret kipreparálják és az ér megnyitását követően a sérült intimát a megfelelő vastagságban elválasztva kifordítják a lumenből. A rajz sönt nélkül végzett műtétet mutat.

14

1.1.4. A restenosis patobiológiája A sejtszintű folyamatok a terápiás beavatkozással, vagyis az intimasérüléssel indulnak. A denudált trombogén szubendoteliális felszín és a mechanikus sérülés hatására trombózis és gyulladás indul. A gyulladásos reakciót hasonló felszíni és excretiós jelenségek kísérik, mint bárhol máshol a szervezetben, például simaizomsejtek és neutrofilek valamint trombociták adhéziós molekulák expressziójának növekedése. Szoros összefüggés mutatható ki az érsérülés nagysága (39), valamint a bevándorolt monociták száma (40) és a kialakuló restenosis között. Az érfalban zajló gyulladás jeleként – valószínűleg az IL-6 közvetítette gyulladásos kaszkád részeként – a preprocedurálisan emelkedett CRP a korai és kései koronária restenosis prediktorának bizonyult (41). A sérülést követően fokozódik a reaktív szabadgyökök mennyisége is az érintett érszakaszon, mely szintén növeli az adhéziós molekulák expresszióját, aktiválja az NF-κB szignalizációs utat és így szerepet játszik a proliferációs válasz kialakulásában is. Fontos szerepet tulajdonítanak az elkerülhetetlen adventitia sérülésnek is mind az ateroszklerózis, mind a restenosis patológiájában (42). A sérült érfelszínhez trombociták adherálódnak, majd aktiválódnak. Az aktivált endotél, szöveti makrofág és trombocita együttesen számtalan simaizomsejt proliferációra ható anyagot képes termelni, úgy mint platelet-derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), insulin-like growht factor (IGF) és transforming growth factor-β (TGF-β) (4). A felszabaduló trombin erős trombocita aktivátor, monocita kemoatraktáns, és direkt simaizom proliferációs hatása is van. Mindezen folyamatok a neointimális hyperplasiába konvergálnak (43), mely során a media rétegéből simaizomsejtek migrálnak az intimába, majd proliferálnak és szintetikus fázisba jutva extracelluláris proteoglikán tartalmú mátrixot termelnek ami az érfal remodellingjét okozza (44). Amint az antiproliferatív hatások (re-endotelizált ér, kellő NO termelés, és megfelelő lokális heparin koncentráció) kerülnek túlsúlyba, a folyamat leáll. Adataink alapján pusztán az ateromatikus szövet eltávolításával csökken a szervezet egészét érő gyulladásos szignál, és a műtétet követően a CRP és a fibrinogén szint jelentősen csökken (45). Amennyiben a gyulladás folyamatos aktivációs jelek miatt fennmarad, akkor végbemegy az érfali remodelling és a megvastagodó neointima ismételt occlusiót valamint klinikai panaszokat okozhat.

15

1.2. A komplement rendszer A komplement rendszer a természetes (innate) immunitás fő effektora, három – egymással átfedő – biológiai aktivitást fejt ki: véd bakteriális fertőzések ellen, összekapcsolja az adaptív és természetes immunitást, valamint szerepe van az immunválasz (gyulladás) során termelődött immunkomplexek és sérült struktúrák eltávolításában is (Lásd 1. táblázat).

1. Táblázat: A komplementrendszer fő biológiai aktivitása [Walport, 2005 alapján (46)] Biológiai aktivitás Fertőzés elleni védelem Opszonizáció Kemotaxis és leukocita aktiváció Sejtlízis

Effektor fehérjék Kovalensen kötött C3 és C4 fragmentek Anaphylatoxinok és ezek leukocita receptorai (C3a, C4a, C5a) Membran attack complex (C5b-C9)

Természetes és adaptív immunitás összekapcsolása Antitest válasz erősítése Immunológiai memória fokozása

C3b és C4b keresztkötése az antigén-antitest komplex és az antigén között; C3 receptorok B-sejteken illetve antigén prezentáló sejteken C3b és C4b keresztkötése az antigén-antitest komplex és az antigén között; C3 receptorok follikuláris dendritikus sejteken

Törmelék eltávolítása Immunkomplexek eltávolítása Apoptotikus sejtek eltávolítása

C1q és kovalensen kötött C3,C4 fragmentumok

Több, mint 30 fehérje alkotta kaszkádrendszerről van szó, melyek részben oldva, részben sejtmembránhoz kötve találhatóak meg. Komplement fehérjék a plazmában 3mg/ml körüli koncentrációban vannak jelen, és megközelítőleg a globulin frakció 15%-át jelentik. A komplement rendszer mai ismereteink szerint három úton iniciálható, melyek mindegyike a C3 aktivációjába konvergál: az alternatív, a lektin és a filogenetikailag legfiatalabb klasszikus úton. A C3 hasítás után keletkezett két fragmentjét C3a-nak és C3b-nek nevezzük. A C3b központi szereplője a komplement rendszernek, hiszen kovalansen köthet komplement aktiváló felszínekhez, ahol bomlástermékével együtt (iC3b) erős opszoninként fagocitózist indukál, a C3-konvertázokkal együtt pedig a C5-konvertázként működik, és így a membrane attack complex (MAC) kialakulását indítja el. A MAC a target membránján pórusokat nyit, mely a sejt líziséhez vezet. A C3a, C4a és a C5a, egyéb

16

komplement fragmentek együtt anafilatoxinként kemotaxist és leukocita aktivációt indukál (46). A klasszikus útvonal mintázatfelismerő receptora a C1q, mely két szerin-proteázzal (C1r, C1s) együtt komplexet képezve található meg (C1qr2s2). Elsődlegesen antigénhez kötött immunglobulinokat ismer fel (IgM és G), valamint azok nélkül is különféle töltött és hidrofób felszínekhez (apoptotikus sejtek, bizonyos vírusok, gram-negatív baktériumok és ligand kötött CRP) képest kötni, majd aktiválódni. Amint C1q targetet köt, C1r autoaktivációja következik be, és hasítja C1s-t, mely a C4-t egy kisebb (C4a) és egy nagyobb fragmentre (C4b) vágja. A C4b kovalensen köt az aktiváló felszínhez és összekapcsolódik C2-vel, melyet az aktivált C1s két fragmentre hasít szét. A C2b leválik és a C2a kötve marad. Így a C4bC2a, vagyis a C3-konvertáz komplex alakul ki (Lásd 3. ábra). A lektin útvonal iniciátora a megfelelő repetitív szénhidrát mintázat felismerése. Az MBL és az L- (47) valamint H-fikolin (48) szintén szerin proteázokkal képzett komplexben találhatóak meg (MASP-1,-2,-3 és sMAP/ MAp19). A MASP-2 a C1s-hez hasonlóan a klasszikus C3-konvertáz komplex kialakulását indítja el. Újabban vitatják ugyan, de vannak adatok arra is, hogy MASP-1 direkt hasíthat C3-t (49,50,51). [Részletesebben lásd az MBL biológiai aktivitása c. fejezetben (Lásd 3. ábra). Az alternatív útvonal a plazmában kis mennyiségben normál állapotban is jelenlévő C3b bakteriális sejtfelszíni szénhidrát vagy fehérje hidroxil-, illetve amin csoportjának aspecifikus kötésével iniciálható. C3b ilyenkor B faktort köt, mely C2 homológja. A kialakult C3bB-ben D faktor hasítja B-t, kialakítva az alternatív út C3-aktivátorát, C3bBb-t. Properdin kötődésével a kialakult enzimkomplex stabilizálódik, majd a komplement aktiváció helyszínén nagy mennyiségben termelődő C3b számtalan helyen kovalensen köt a target felszínéhez. Szolubilis C3b kapcsolódhat C4b-hez (klasszikus C3-konvertázban) és C3b-hez (alternatív C3-konvertázban) így a C5-konvertáz enzimet alakítva ki, melyekben a C5 akceptoraként funkcionál. A hasított C5a anafilatoxinként mediátor funkciót tölt be, C5b pedig, a MAC kialakulását (C5b-C6-9), és így a lítikus utat indítja el (Lásd 4. ábra).

17

4. ábra: A komplement rendszer aktivációs útvonalai és a lítikus út sematikus ábrázolása [Walport, 2004 alapján (46)] Részleteket lásd a szövegben.

18

1.3. Mannóz kötő fehérje (MBL) 1.3.1. Humán lektinek és a természetes immunitás A természetes immunitás az immunitás evolúcionárisan ősi formája, a mikróbiális patogének elleni védekezés fő eszköze a fertőzés megjelenésének első perceitől. Azonos, vagy homológ molekuláris megoldások konzerválódtak a növényektől az emlősökig, tehát igen alapvető fontosságú funkcióról van szó (52). A felismerés többféle patogénekre jellemző molekuláris mintázatfelismerő (pathogen-associated molecular patterns – PAMPs) receptorokon keresztül zajlik. Ilyen mintázatok infekció és malignus transzformáció esetén jelennek meg. Patogén felsimerő receptorokat (PRR – Patogen recognition receptor) találhatunk makrofágok (MA), dendritikus sejtek (DC), hízósejtek (MC), neutrofilek (NE), eozinofilek (EO) és az NK-sejtek felszínén (53). Funkcionális szempontból ide sorolhatóak még az intracelluláris kompartmentben [pl. protein kináz-R (PKR) kettősszálú DNS (dsDNS) kötését követően aktiválódik, mely típusosan vírusfertőzés alatt kerülhet a sejtplazmába (54)], vagy szekretálva a szövetközti folyadékban és a vérben is megtalálható [pl. C-reaktív protein (CRP) és a serum amyloid protein (SAP) (55) és az MBL] patogén felismerő molekulák is.

Bakteriális, virális, protozoális és a gombák felszínén megtalálható komplex szénhidrátok, és különösen azok mintázata alapvetően különbözik a megtámadott gazdaszervezet sejtfelszíni molekuláitól, ezért egyszerű, de évmilliók óta hatékonyan működő lehetőséget biztosítanak a saját-idegen felismerésre. Ilyen szénhidrát felismerő molekulák a lektinek, melyeknek az előgerinchúrosoktól kezdve igen fontos szerep jut az immunvédekezésben, de ilyenfokú diverzitást csak az emlősökben értek el: Lektin domént és funkciót írtak le szelektinek (E-szelektin), pentraxinok (pl.: CRP és serumamyloid P), I-típusú lektinek, egyes cytokinek (56) fikolinok és a kollektinek között is (57). Ezen belül a kollektinek (kollagénszerű lektinek) és fikolinok a vérplazmában és mukozális felszíneken egyaránt megtalálható glikoproteinek, melyek a természetes immunrendszer tagjaiként PAMP-ket ismernek fel, majd különböző effektor funkciót indítanak el. Jellemző rájuk, hogy a géntermékből trimerizálódó funkcionális alegységeik mindkét csoportban kollagénszerű szerkezetet mutatnak, míg a szénhidrát 19

felismerő régiójuk (carbohydrate recognition domain – CRD) lektin- (a kollektineknél), illetve fibrinogén szerű doménből áll (fikolinoknál). Elektronmikroszkóp alatt Nterminális végükkel összekapcsolt funkcionális alegységekből tovább oligomerizálódó molekuláik sertiformis, X, vagy esetenként kerékküllőszerű képet adnak, mint ahogy ezt elektron- és atomerő mikroszkópos felvételek alapján Holmskov U. és munkatársai több korábbi közlemény alapján összefoglalták (Lásd 5. ábra). SP-D döntően tetramerként Xalakban, míg a mannan-kötő fehérjék magasabb oligomerizációs fokot elérve virágcsokorhoz hasonlító negyedleges szerkezetet vesznek fel.

20

5. ábra: Humán kollektinek és az L-fikolin szerkezete [3. ábra, Holmskov 2003 (58)] Az elektronmikroszkópos felvételek mellett a sematizált szerkezeti ábra látható. Közös jellemző az N-terminálisok által kialakított központi csomó, melyből a kollagénszerű domének divergálva erednek.

21

1.3.1.1. Fikolinok Három identikus polipeptid trimerizációjával kialakuló, majd tovább oligomerizálódó glikopeptidek. Rövid N-terminális domént követően – mely 1-2 cysteint tartalmaz csupán – kollagénszerű régió következik, mely L- és H-fikolinban a második Gly-XaaYaa triplet után egy kis szakaszon megtörik. Egy rövid kötő régió kapcsolja a fibrinogén szerű C-terminális CRD domént a lánchoz. A CRD 200-250 aminosavból áll, melyből kb. 40 konzervált és 24 variábilis, bár többnyire hidrofób aminosav (58). Humán fikolinok közé a szérumban az L-fikolin (P35) és H-fikolin (Hakata antigén), valamint a keringő monocita felszínén megtalálható M-fikolin (P35 related protein) tartozik, melyek 10-20 nm hosszúságú makromolekulák. Az L- és H-fikolin képes MASP-okkal komplexet képezni, és az MBL mellett a komplement lektin aktivációs útvonalának aktivátorai lehetnek (47,48).

1.3.1.2. Kollektinek Szintén 3 azonos, illetve az SP-A esetén csak majdnem azonos, peptidlánc trimerizációjával alakul ki a funkcionális alegység. Fehérjétől függően további oligomerizáció után alakul ki a végleges működő molekula. N-terminálisan 7-28 aminosav hosszúságú keresztkötő régió található, melyben 1-3 darab cisztein felelős a láncok közti diszulfid kötések kialakításáért. Ezt kifejezetten hosszú kollagénszerű domén követi (MBL esetén 19, míg SP-A-ban 59 Gly-Xaa-Yaa triplet), majd egy rövid α-helikális nyak és a specificitásért felelős C-típusú (kalcium függő) lektin domén található meg. A ligandkötés hidrogén kötés, valamint kalciummal kordinációs kötések által valósul meg (59). A cukrok repetitív mintázatának felismerését a strukturális alegységek ologomerizációjával körülbelül 5 nm-enként meglévő CRD-k adják, így az egy kötéshez képest összességében 8 nagyságrenddel erősebb aviditást biztosítva (58). Különböző kollektineket karakterizáltak: a tüdő surfactan protein A és D (SP-A, -D) a tüdő epitélt borítő surfactant alkotórésze. Mannan binding fehérjéket a szérumban (MBP-A) és a májban találhatunk (MBP-C). Rovarokban, nyúlban, egérben és Rhesus majomban az MBL előbbi 2 formája, míg csimpánzban és emberben csak egyetlen fehérje található meg. A hepatikus forma több fajban külön gén terméke és struktúrálisan is különbözik a szérumban megtalálhatótól. Emberben van némi különbség ugyan, de mindkettő azonos gén poszttranszlációs modifikációja révén jön

22

létre. Egérben MBL-C jelenlétét igazolták vékonybélben, ami felveti a szekretoros IgAhoz hasonló humorális immunfaktor szerepet is (60). Szarvasmarha félékben conglutinint (BC), a CL-43-t és a CL-46-t azonosították, melyek sokkal inkább a SP-Dvel mutatnak hasonlóságot. A közelmúltban izoláltak két egymással rokon intracelluláris kollektint a májból (CL-1 és CL-2), melyek funkciója egyelőre ismeretlen (61). A kollektinek igazi makromolekulák, méretük a vírusokéval összemérhető. A csoport legrövidebb polipeptidje az MBL mely 13nm, a leghosszabb tagja pedig a SP-D mely 90nm hosszúságú (62). Méretük valóban lehetővé teszi akár nagy partikulumok agglutinációját is. Az SP-A és MBL maximum hexamereket (virágcsokor alak), míg a CL-46 és SP-D cruifrom tetramereket, illetve az SP-D tovább polimerizálódva több millió daltonos gömböket képes is kialakítani.

1.3.2. Az MBL biokémiája

1.3.2.1. A polipeptid szerkezete A rekombináns géntermék a monomer peptidláncon kívül (228 aminosav, 24 kDa) 20 aminosav hosszúságú szignál peptidet is tartalmaz. Különböző közlemények egy kicsit eltérően határozzák meg az izolált fehérje molekulatömegét, ami feltehetően a poszttranszlációs modifikáció eredménye lehet (lizin és prolin hidroxiláziója, valamint hidroxilizin glikozilációja) (63). Kollektinekre jellemzően 4 doménből áll: Nterminális kötő régió, hosszú kollagén szerű domén, rövid α-helikális nyak és a Ctípusú lektin domén (64). A fehérje vázlatos szerkezetét, valamint a polimerizáció menetét a 6. ábra mutatja. A fehérje valós röntgendiffrakciós szerkezetét a Protein DataBank alapján a 7- ábra mutatja be.

23

6. ábra: Az MBL szerkezete és polimerizációja vázlatosan

1.3.2.1.2. Polimerizáció A trimerizációt a nyak régió iniciálja. Kísérletes körülmények között egymástól izolált kollektin domének nem oligomerizálódnak. Mivel a kollagén monomerként nem stabil, ezért a kollagénszerű domén trimerizációja már spontán végbemegy. A trimerek oligomerizációjában az N-terminális régiónak van szerepe. Ennek karakterisztikája határozza meg az oligomerizáció fokát. Az intracelluláris térben végbemenő folyamat után a keringésben a negyedleges szerkezet már nem változik (65). A strukturális alegységek a keringésben dimer, trimer, tetramer, pentamer és hexamer formájában fordulhatnak elő, de újabb adatok szerint többségében trimerek és tetramerek találhatóak meg (63). A magasabb fokú oligomerek nagyobb affinitással kötnek mannant, aktiválják a komplement rendszert, illetve. Hepatocytákban alacsonyabb oligomerizációs fokot érnek el az MBL molekulák (66).

24

7. ábra: A mannóz kötő fehérje CRD és nyaki domén valós 3D szerkezete röntgendiffrakció alapján [Protein DataBank azonosító: 1HUP (67)] A homotrimer egyik molekulája szalagrajzzal, míg a másik 2 molekula a könnyebb érthetőség kedvéért csak vonalrajzzal van ábrázolva. Jól látható a CRD-t alkotó 2 egység. A ligandkötésért a C-terminális egység (5 β-lemez) a felelős

25

1.3.2.2. Génszerkezet A humán mannóz kötő fehérje egyetlen gén (MBL-2) terméke, mely 10q11.2-q21 lókuszon található meg (68). Érdekes, hogy a humán kollektin gének 10q21-24-ig csoportosulnak (SP-A1, -A2, SP-A pszeudogén, SP-D és MBL). Mivel nagyfokú homológia mutatató ki a csoporton belül, valószínűség szerint génduplikáció eredményeként jöhettek létre. A 10. kromoszómán található meg a nem funkcionáló pszeudo MBL gén (MBL-1) is, mely evolucionáris szempontból a rhesus MBL-A, míg az MBL-2 a rhesus MBL-C homológja (69). A funkcionális MBL-2 gén 4 exonból áll (70), egymástól 643, 1200, illetve 800 bpnyi intronnal elválasztva. Az Exon1 a szignálpeptidet, az N-terminális régiót, valamint a kollagénszerű régió egy részét kódolja (ld. Strukturális génmutációk c. fejezetben). Az Exon2 a Gly-Xaa1-Yaa2 tripletek nagy részének kódját tartalmazza. Az Exon3 az αhelikális nyak régióért felelős. Az Exon4 a CRD és a 3’-UTR szekvencia kódolását végzi. Kimutatták, hogy 5’ irányban egy nem transzlálódó exon is található (Exon0). A transzkripció a májban termelődő MBL döntő többségénél az Exon1-nél, míg egy kis része az Exon0-nál indul (71).

8. ábra: A mannóz kötő fehérje gén és fehérjeszerkezete és a gyakori mutációs helyek Az MBL-2 gén 4 exonból áll. A strukturális mutációk mindegyike az Exon1-ben található meg és ezek a fehérje kollagénstruktúráját érintik és mennyiségi, valamint jelentős minőségi változást okoznak a keringő fehérjekomplexekben. A vad alélt A-nak az összes mutáns alélt együtt egyszerűsítve O-nak nevezik.

26

Az MBL-2 géntől felfelé több regulátor elemet találtak. TATAA és CAAT box-ok -38, illetve -79 bp távolságban (68), valamint heat shock consensus element -592 bp-nyira 5’ irányban (70). A szérum amyloid-A nevű akut fázis fehérje promóterével 90%-ban homológ génszakasz helyezkedik el a -204, -184 régióban. Az akut fázisban mérhető koncentrációemelkedésért (kb. 3x) az előbbieken kívül a -245, -656, valamint -736 bp távolságban megtalálható glucocorticoid responsive element-ket (GC) teszik felelőssé, bár Naito adatai szerint glükokortikoid adagolása csökkentette az MBL transzkripcióját (71).

1.3.2.3. Genetikai változatok

1.3.2.3.1. Strukturális génmutációk Három pontmutációt mutatható ki, melyek mindegyike az 1. exonban található meg (Lásd 8. ábra). A két korábban felfedezett mutáció a Gly-Xaa1-Yaa2 tripletben a glicint asparaginsavra (B variáns (72); codon54 G-A csere; az 5. kollagén tripletbe kerül), illetve glutaminsavra (C variáns (73); codon57 G-A csere; a 6. kollagén tripletbe kerül) módosul. B és C variáns esetén megtörik a monomer kollagén-hélix, mivel az axiális helyzetű glicin helyére nagyobb, töltött aminósav kerül, és ezáltal az oligomerizáció, a komplement aktivációs készség és esetleg a szerin-proteáz komplex kialakulása is károsodnak (74,75). A harmadik esetben (D variáns (76); codon52 C-T csere; a 4. kollagén tripletbe kerül) Xaa1 pozícióba cisztein kerül, ami miatt újabb diszulfid hidak képződése valósulhat meg, és ez nagymértékben csökkenti a magasfokú oligomerek kialakulását (77). A vad alélt A-nak az összes mutáns alélt együtt egyszerűsítve O-nak nevezik. A B variáns Európában az alacsony MBL koncentráció második leggyakoribb oka az X haplotípusú promoter után [alélfrekvencia 0,14 (78)]. A szub-szaharai populációban a C variáns gyakori (50-60%), a B viszont ritka (79), a D variáns pedig, szintén inkább az európai populációban fordul elő (14%). A strukturális, illetve a promóter variánsok jellegzetes földrajzi megoszlását a 9. ábra szemlélteti.

27

1.3.2.3.2. Promóter polimorfizmus A promóter régióban is több alélikus dimorfizmust fedeztek fel. A legfontosabbnak a -221 X/Y bizonyult. Az X alél hatása kvantitatíve hasonló a struktúrális variánsokéhoz (Y erősebb promóter, mint X; Y>X). Frekvenciája 0,2 körül van kaukázusi populációban (78). A -550 H/L dimorfizmusnak (H>L) kisebb hatása van az MBL transzkripciójára az X/Y-hoz és a strukturális génmutációkhoz képest is (80). 5’ irányban egy nem transzlálódó szakaszon lokalizálódik a +4 P/Q (Q>P) polimorfizmus (79). Erős linkage disequilibrium áll fenn, ezért mindezidáig 4 gyakori promóter (LXP, LYP, LYQ és HYP), és összességében 7 különböző haplotípust közöltek (van még egy ismert haplotípus, de eddig összesen 2 embernél írták le eddig).

HYPA – 81%

HYPA – 30%

LYPB – 12%

LXPA – 24%

HYPA – 44%

LYQA – 21%

LYPB – 22%

LYPB – 12%

LYQA – 16%

HYPD – 7%

LXPA – 11% LYPA – 7%

LYQA – 26% LYQC – 24%

HYPA – 48% LYPB – 43%

LYPA – 23%

HYPA – 75%

LXPA – 18%

LYPA – 21%

HYPA – 7%

9. ábra: A leggyakoribb 7 haplotípus földrajzi megoszlása [1. ábra Casanova, 2004 alapján (81)] Csak az 5%-ot elérő mutációk vannak feltűntetve. Színessel a strukturális mutációk, dőlttel szedve a promóter polimorfizmus miatt deficienciával járó haplotípus van jelölve. AFRIKA: Mozambik és Kenya (80,79); AUSZTRÁLIA (82); ÁZSIA: Japán (83); DÉLAMERIKA: Argentína (79); EURÓPA: Dánia (79,78), Grönland (80,79);

28

1.3.2.4. Kapcsolat a genotípus és a fenotípus között A homo sapiens fajon belül 1000-szeres MBL koncentrációkülönbség mérhető a <10>5000 µgL-1 tartományban. A köldökzsinórban a felnőttekéhez képest általában alacsonyabb koncentráció mérhető (84), majd az élet első hetében gyorsan emelkedik és a gyerekkor alatt végig valamivel a felnőttkori szint felett marad (85). A terhesség önmagában nem változtatja meg az MBL szintet, legalábbis az első trimeszterben (86). Mindhárom strukturális variáns szignifikánsan csökkent MBL-szinttel jár a homozigóta vad alélt hordozókhoz viszonyítva. Az A/A genotípushoz képest az A/B tizednyi plazmakoncentrációval jár, míg homozigóta variáns alélt hordozók esetén gyakran a mérésre használt ELISA detektálási küszöbe környékén van csupán a keringő fehérje mennyisége. Az X promóter variáns önmagában is hasonló léptékű hatással van a plazmaszintre, mint a strukturális mutánsok. A mérhető MBL koncentrációra az örökölt genetikai adottságnak van a legnagyobb szerepe [a HYP haplotípussal rendszerint normál/ magas MBL koncentráció, míg LXP-hez alacsony koncentráció tartozik (79)], de ezen felül komoly környezeti hatások is fontosak az aktuális szint kialakulásában. Régóta ismert, hogy akut fázis fehérjeként sérülés vagy infekciót követően körülbelül háromszoros koncentrációnövekedés várható (87). Ez az interindividuális több nagyságrendbeli különbséghez képest ugyan kisfokú emelkedést jelent, de az egyénre jellemző alapkoncentrációhoz képest mégis jelentős változásnak értékelendő (78). Ahogy korábban láthattuk az MBL-2 közelében megtalálható ugyan egy glucocorticoid responsive element, de glukokortikoid adásával a szintézis gátlódott (71). Érdekes módon növekedési hormon hatására az akut fázisban mérhetőekkel azonos koncentrációnövekedést tapasztalhatunk (88). A genotípus meghatározása így csak populációs szinten elégséges, míg individuális különbségek magyarázatához, illetve predikcióra inkább az MBL fehérjemeghatározás javasolható.

Az MBL deficienciát és az alacsony MBL szintet a közleményekben mindenki egy kicsit máshogy határozza meg. A legcélszerűbb mindig adott biológiai funkcióhoz kötni deficiencia határértékét. Az eredeti funkcionális vizsgálat szerint deficienciát az élesztő sejteket opszonizálni képtelen plazmára használták, ami az egészséges populáció 510%-a és körülbelül <100 µgL-1 értéknek felelhet meg. Felnőttekben a kemoterápia utáni szövődmények kialakulására <50 µgL-1 (89), míg hasonló gyermekpopuláció esetén <1000µgL-1 (90) hordozta a súlyos infekciók kialakulásának határértékét. 29

Sorozatos vetélés előrejelzésére az anyai <100µgL-1 (91) koncentráció jelent rizikót. (Részletesebben lásd a MBL és betegségek kapcsolata c. fejezetben.) Újabban a genetikai szemléletű vizsgálatokban a haplotípushoz (gyakran csak strukturális mutációk meghatározásával) igazított definíció az európai populáció 40%-t érinti és <600 µgL-1 értéknek felehet meg (57). A promóter varrációk mennyiségi változást jelentenek az MBL fehérjeszintézisben. A strukturális génmutációk viszont ezen túlmenően mélyen érintik szerkezetet és ezzel összefüggésben a biológiai aktivitást is. Sumiya és munkatársai szerint az oligomerizáció nehezítettségén túl a mutánsokban fokozódhat a lebomlás is (72). Rekombináns B allél expressziójával végzett in vitro kísérletekben magas fokú oligomerek is kialakultak (92), de a molekula képtelen volt komplementet aktiválni (92,93). Egy másik kísérletben a rekombináns MBL a vad változattal egyenértékű tumorsejt citotoxikus hatást fejtett ki (ld. MDCC), de komplementet nem aktivált (94). Homozigóta

mutáns

alélt

hordozók

plazmájában

kis

mennyiségű

alacsony

molekulasúlyú (120-130.000 Da) fehérje mutatható ki, míg a heterozigótákban részben megtalálható volt a 200-700.000 Da dimernek ill. trimernek megfelelő forma is (95). Az alacsonyabb fokú oligomerek szénhidrát affinitása a korábban részletezettek értelmében érthetően alacsonyabbnak bizonyult.

1.3.3. Az MBL biológiai aktivitása Az utóbbi 10 év egyre szaporodó közleményei alapján az MBL-nek legalább 4, egymástól elkülönülő biológiai szerepe azonosítható.

1.3.3.1. MBL biológiai folyamatokban A harmadik útvonal elkülönül a klasszikus és az alternatív útvonaltól. A Mannan kötő lektin asszociált proteázok egész családját azonosították, de a komplement aktivációban igazi szerepet csak a MASP-2-nek tulajdonítanak (96) Képes C3b formálására és így a komplement rendszer erősítő körébe kapcsolódva nagy mennyiségben opszonin generálódik. A komplement MBL általi aktiváció fontosságára jellemző, hogy az MBL deficienciát először olyan ismételt fertőzésektől szenvedő gyermekekben írták le, akiknél az opszonizáció szenvedett zavart (97).

30

Az MBL, az L-fikolin (P35) és a C1q opszoninként hatnak és a fagocitózist erősítik. Továbbra sincs konszenzus abban kérdésben, hogy direkt opszoninként hat-e, vagy egyéb utak (komplement- és az antitest-mediált fagocitózis) aktivációjával segíti elő az idegenként felismertek fagocitózisát. Ebben a folyamatban nyilván szerepet kapnak a különböző feltételezett MBL-kollektin receptorok.

Az MBL képes saját sejtekkel is reagálni, amennyiben azok a megfelelő mintázatban fejezik ki a ligandként felismerhető molekulákat. C1q-hoz hasonlóan MBL is képes apoptotikus sejtekhez kötni és a makrofágok fagocitózisát indukálni (98). Ebben a folyamatban a transzmembrán doménnal nem rendelkező cC1qR, és a vele asszociáló α2-makroglobulin receptor (CD91) szerepe gyanítható. Apoptotikus sejtek felszínére kerülhetnek citoszkeletális proteinek, és ezek terminális GlcNAc molekulái (99) szerepelhet ligandként. A szövetekben lerakódott glikált antitestek (IgG(0), IgA, IgM és C3) is megfelelő mannan mikromintázattal rendelkezhetnek (100,101), ezért az MBL ligandjai lehetnek. Iszkémia-reperfúzió után károsodott szövetekben az N-és Oglikoziláció mind intra- mind extracellulárisan változhat és esetleg ez szerepelhet neoepitópként. A korábbi nézettel ellentétben – miszerint a károsodást a klasszikus és/ vagy alternatív útvonal aktivációja okozza – újabb adatok szerint, legalábbis bizonyos szervekben a lektin útvonalnak lehet ebben szerepe. Patkány miokardiális iszkémia modellben az MBL-A gátlásával csökkenteni lehetett a poszt-iszkémiás miokardiális károsodást. A hatás feltehetően csökkent neutrofil infiltráció és pro-inflammatórikus válasz által valósult meg (102,103). Az onkogén transzformáció eszenciálisan aberráns glikozilációval jár minden metasztatizáló tumor esetén. Több független közlés szól MBL és különböző daganat sejtvonal interakciójáról (104). Muto és munkatársai azt találták, hogy MBL C3 és C4 depozíciót okozott sejtlízis nélkül (105), míg Ma és munkatársai kísérletében (94) az MBL kötés citotoxikus hatással járt a daganatsejtekre (MBL-dependent cell mediated cytotoxicity – MDCC-nek nevezték el).

Egyre több adat szól amellett, hogy a gyulladásos válasz befolyásolásában is szerep hárul az MBL-re. Jack és munkatársai MBL deficiens teljes vérben inkubáltak N. meningitidis-t és a rendszerhez növekvő koncentrációban MBL-t adtak. A mért citokinek (TNF-α, IL-1β, IL-6) szintje 4 µg/ml MBL koncentrációig emelkedett, majd e

31

fölött csökkent. Ezek alapján gyanítható, hogy az MBL-nek is szerepe lehet egy adott immunválasz során mérhető citokin mintázat kialakulásában (106).

1.3.3.2. MBL és betegségek kapcsolata

1.3.3.2.1. Immundeficiencia Az MBL felfedezésére is klinikai problémát okozó immundeficiencia miatt került sor gyerekekben (107), majd a korai közlemények is mind ezt a területet dolgozták fel (108). A legmeggyőzőbb adatokat egy grönlandi prospektív populációs vizsgálat szolgáltatta (109), ahol a 2 év alatti MBL-inszuficiens gyermekek között kétszeres relatív rizikóemelkedést mutattak ki akut légúti fertőzések kialakulására. A szerzők nagy része egyetért abban, hogy az MBL más immunhiánnyal együtt okoz csak klinikailag jelentős deficienciát. Hasonló eredményre jutottak Koch és munkatársai az előbb citált vizsgálatban, ahol a tranziens hipogammaglobulinémiai idején (6-17 hónap) nagyobb volt a fertőzés kialakulásának valószínűsége, mint a 18-23 hónapig terjedő időszakban. Egyes közlemények szerint minden életkorban rizikót jelent fertőzések kialakulására (110), míg egy másik vizsgálatban lázas betegségekben szenvedő felnőttekben sem jelentett különbséget (111). Százhetvenkét gasztrointesztinális tumor miatt elektív bélrezekción átesett beteg követéses vizsgálatakor az derült ki, hogy azoknál alakult ki posztoperativ infekció, akiknek a pre-, és posztoperativ MBL koncentráció alacsonyabb volt (112). Kemoterápia kiváltotta neutropénia nagyban megnöveli a fertőzések kialakulásának kockázatát. Száz többnyire malignus hematológiai betegség miatt kezelt gyermek esetén fordított arányosság mutatkozott az MBL koncentráció és a 6 hónapos követési idő alatt lezajlott lázas neutropéniás események száma között (90). Egy másik vizsgálatban felnőttek kemoterápia utáni infekcióinak súlyossága mutatott hasonló összefüggést plazmakoncentrációval (89). A rizikót jelentő határérték 550 µgmL-1 volt.

1.3.3.2.2. Infekciók Az MBL mikroorganizmusok sokaságához képes kötni, baktériumokról, gombákról, vírusokról és protozoákról is közöltek ilyen adatokat (Lásd 3. táblázat). Szilárdfázisú 32

mannanhoz való kötéshez hasonlóan ehhez is kalcium szükséges, és a kötés mannózzal valamint GlcNAc-nal gátolható. Az MBL kötés a komplement aktiváció mértékével korrelál. Érdekes megfigyelés, hogy akár klinikai izolátumról, akár laboratóriumi törzsek esetén azonos fajon belül változó arányban tapasztalható MBL-kötést. Ez a fajon belüli variáció lehet a magyarázata a gyakran inkonzisztens eredményű klinikai vizsgálatoknak (57).

2. Táblázat: Mikróbák, melyekhez MBL kapcsolódhat [Kilpatrick, 2002 alapján (57)] Mikróbák Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Cryptococcus neoformans Actinomyces israelii, Bifidobacterium bifidum, Burkholderia cepacica, Chlamydia pneumoniae, Eschericia coli, Fusobacteriae, Haemophilus influenzae, Leptotrichia buccalis, Listeria monocytogenes, Mycobacterium Baktériumok avium, Neisseria meningitidis, Proprionibacterium acnes, Salmonella montevideo, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Veillonella dispar Cryptosporidium parvum, Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi Protozoák Influenza A, HIV, Herpes simplex 2 Vírusok Gombák

Van néhány fertőző betegség melyben nagyobb bizonyossággal mutatható ki kapcsolat az MBL deficienciával: HIV (113), illetve AIDS-be való progresszió (114), virushepatitis (115), Infuenza-A vírus fertőzés (116).

Egyes közlemények összefüggést tudtak kimutatni intracelluláris patogénekkel való fertőzöttség és a jól opszonizáló, tehát homozigóta vad alél, hordozása között. Másként megfogalmazva a variáns alél hordozásnak bizonyos infektív környezetben lehet előnye. Visceralis leishmaniasis kialakulásának a lehetősége egyenes arányban áll az MBL szinttel (117). Hasonló eredményre jutottak több független vizsgálatban Mycobacterium-mal kapcsolatban is (118,114).

Munkánk alapjául szolgáló feltételezést, mely szerint az MBL-nek szerepe lehet az iszkémiás szívbetegség kialakulásában, több adat is alátámasztja. Az érfalban zajló krónikus gyulladás hátterében egyes feltételezések szerint infekció is állhat. Ebben több ágensnek, közte a Chlamydia pneumoniae-nak is lehet szerepe (29). (Részletesebben lásd az Infektív tényezők szerepe az ateroszklerózisban c. fejezetben) Rekombináns MBL a fő sejtfelszíni glikoproteinhez kötve gátolta HeLa sejtek Chlamydia (pneumoniae, trachomatis, psittaci) fertőződését (119). Ez is magyarázhatja egy 33

norvég populációban talált mutáns alél és súlyos ateroszklerózis összefüggését (120), illetve azt, hogy egy kanadai vizsgálatban a mutáns alél hordozása korrelált a megnövekedett carotis plakk méretével (121).

1.3.3.2.3. Nem infektív betegségek Az

irodalmi

adatok

erős

koherenciával

támasztják

alá,

hogy

alacsony

plazmakoncentrációval járó genotípusok kisfokban, de emelkedett rizikót jelentenek SLE kialakulására (116). Van némi inkonzisztencia az MBL szerepéről reumatoid arthritis-szel kapcsolatban, de annak ellenére, hogy a betegség fogékonyságára való hajlam tisztázatlan, aránylag erős kapcsolat mutatható ki a betegség lefolyásának súlyossága és az alacsony MBL szint között (116). Cysticus fibrosisban erős összefüggést mutattak ki súlyos pulmonalis (vitalkapacitás, FEV1) és a hepaticus lefolyás, valamint az alacsony MBL szint között. Ennek mechanizmusa kevéssé ismert, mivel a tüdőfunkció romlása a nyákdugók által infekciókra hajlamossá vált bronchiolusok P.aeruginosa fertőzés gyakoriságával mutatott összefüggést, ugyanakkor in vitro az MBL sokkal inkább a klinikai fertőzést ritkábban okozó B.cepacia-hoz képes kötni (116). Szintén szoros összefüggés mutatható ki több vizsgálat alapján a sorozatos vetélések és az alacsony MBL koncentráció között. Itt nem a genotípus, hanem a fehérjeszint mutat összefüggést, sőt jelzi előre az esemény bekövetkeztét (116). Iszkémia-reperfúziós károsodás feltehetően szabadgyök termelés, lektin út általi komplement aktiváció [endotél sejtek oxidatív stresszt követően MBL-t kötnek (102)] és granulocita kemotaxis útján valósul meg. Anti-MBL antitestek protektív hatásúak voltak patkány szívizom modellben (103). Ígéretes eredmények ellenére – ahol állatkísérletes modellben intratumorális, illetve subcutan adott MBL-t hordozó vírusvektor cititoxikus hatású volt a transzplantált humán colorectalis carcinoma sejtekre (94) – klinikai vizsgálat még ismereteim szerint nem történt.

1.3.3.2.4. Szubsztitúciós kezelés Az első szubsztitúciós kísérletekben teljes plazma adásával sikerült az opszonizációs defektust korrigálni (107). A stabil és biológiailag is hatékonynak bizonyuló rekombináns MBL gyártásával megnyílik az út a kellő klinikai evidenciát meghozó vizsgálatok indításához. 2003-ban konszenzus nyilatkozat született a jövőbeni MBL

34

terápia bevezetésének elvi kritériumairól (122). A fent felsorolt betegségkapcsolatok közül valószínűleg rheumatoid arthritisben, cysticus fibrosisban, hepatitis C virus fertőzésben, sorozatos vetélésektől és a halmozott gyermekkori fetőzésekben szenvedők lehetnek az első célcsoportok (116).

35

2. V I Z S G Á L A T O K

2.1. Célkitűzések 1. Van-e összefüggés az ISZB és a Chlamydia fertőzés, valamint az MBL variáns allél hordozás között? Az első közleményt – melyben összefüggést tudtak kimutatni a szerológiai Chlamydia fertőzöttség, és a krónikus illetve, az akut manifesztációjú koronáriabetegség között (24) – még számtalan követett, de konszenzus nem született az intracelluláris parazita szerepét illetően. Vannak szöveti, patomorfológiai, szerológiai és in-vitro eredmények is pro és contra egyaránt. Swanson és munkatársai HeLa sejtek Chlamydia fertőzését MBL-lel gátolni tudták (119). Egy norvég populációban a korábban koronária bypass műtéten (CABG) átesett betegekben gyakoribb volt a homozigóta variáns MBL allél hordozása (120). A carotis intima-media vastagság mellett szintén a koronáriabetgség prediktorának tartják a carotis plakk méretének növekedését is. Nagyobb carotis plakk méretet mutattak ki MBL variáns allél hordozás esetén egy kanadai populációban (121). Ezek alapján azt akartuk vizsgálni súlyos koszorúér betegeken, hogy van-e összefüggés a koronáriabetegség, a Chlamydia fertőzöttség, illetve az MBL genotípus között.

2. Van-e összefüggés az ISZB progressziója és a Chlamydia fertőzés, valamint az MBL variáns allél hordozás között? Alapvető orvosi kívánság, hogy legalább populációs szinten, de még inkább individuálisan érvényes prognosztikai faktorokat találjunk. Az irodalomban számtalan, döntően a gyulladásos folyamatban szerepet játszó, markert vizsgáltak. Újonnan kialakult instabil angina pectorisban az akut fázis után is emelkedett makrofág kolonia stimuláló factor (MCSF) erősen korrelál a súlyos kimenetellel (123). Carotis ateroszklerózis progressziójával az emelkedett fibrinogén koncentráció mutatott összefüggést (124). Koronáriaesemények kialakulása, súlyos kimenetel, valamint PTCA utáni restenosis előrejelzésére pedig az emelkedett C-reactive protein és az

36

alacsony nagy denzitású lipoprotein (HDL) szint (125) használható sikerrel populációs szinten. Azon túlmenően, hogy kíváncsiak voltunk arra, hogy a fenti faktorok befolyásolhatják-e az ateroszklerózis kialakulását, korábbi eredményeink alapján azt is vizsgálni kívántuk, hogy a Chlamydia fertőzöttség, és az MBL genotípus interakciójának van-e prediktív szerepe a vizsgált csoportban.

3. Van-e összefüggés valamely MBL allélek és a carotis endarterectomia utáni restenosis között? A fenti adatok alapján elképzelhető, hogy az MBL rendszernek szerepe lehet az érfalban zajló gyulladásban és befolyásolja a kardiovaszkuláris betegségek progresszióját is. Az aterómát kialakító érfali gyulladás az ateroma eltávolításával nem szükségszerűen szűnik meg. Az esetek 10%-ában az első évben, a második évben 3%-ban, a harmadikban 2%-ban, míg a következőkben már csak 1%-ban alakul ki hemodinamikai zavart okozó ismételt stenosis (126). Az ateromatikus elváltozással ellentétben ezen folyamatot a simaizom proliferáció uralja (43). Az MBL mediálta folyamatok az intravasalis gyulladás ezen másik megjelenési formájára gyakorolt hatását akartuk vizsgálni a carotis oszlás közelében kialakuló ateromatikus plakk eltávolítását követően.

37

2.2. Anyagok és módszerek 2.2.1. Vizsgálati csoportok és vizsgálati terv

2.2.1.1. Az 1. betegcsoport – Súlyos koszorúér betegek prospektív vizsgálata 1995 és 96 között a mai nevén Gottsegen György Országos Kardiológiai Intézetben súlyos koronáriabetegég miatt by-pass műtéttel kezelt 437 beteg kezdeti adatait rögzítettük, miután írásosos beleegyezést adtak. Az iszkémiás szívbetegség (ISZB) diagnózisát koronarográfiával igazolt stenosis után mondták ki. A műtéti indikáció minden esetben stabil vagy instabil angina pectoris volt, melyet típusos EKG elváltozás kísért. Minden betegnél szívultrahang vizsgálatot végeztek. A szérum és a DNS preparálásra használt minták preoperatíve kerültek levételre.

Prospektivitás: A komplett adatokkal rendelkező 210 betegnek (50 nő, 29%) 2000 decemberében postai úton kérdőívet küldtünk ki. Az elkövetkezendő hónapokban 150 értékelhető válasz érkezett. A betegek újbóli postai és telefonos megkeresésével, illetve a későbbiekben a háziorvosoktól kapott információk alapján a 210 beválogatott betegből 177 (84,3 %; 57 nő ) esetében kaptunk információt az eltelt időszakról és így 65 ± 5,8 hónapos követési idő adódott. A kérdőívben különös hangsúlyt fektettünk a következő végpontok felderítésére: exitus, kardiális esemény következtében bekövetkezett halál, a beválogatás óta eltelt időszakban bekövetkezett új miokardiális infarktus (MI), bypass műtét, angioplasztika szükségessége (PTCA), carotis endarterectomia (CEA), stroke, perifériás éren végzett beavatkozás (A kérdőívet lásd az I.számú mellékletben). A vizsgálatból kizártuk azokat, akiknél súlyos komorbiditás állt fenn (pl. akut infekció, malignitás, arthritis vagy kötötőszöveti betegség).

Az ISZB-s csoport kontrolját 257 egészséges véradó és önkéntes (93 nő, 36%) képezte, akiknél alapos fizikai vizsgálat és körültekintő anamnésis felvétel történt. A csoport adatait, vér- és DNS mintáikat írásos beleegyezés után tároltuk. Csak azok a

38

betegek kerültek be a vizsgálatba, akiknél nem utalt semmi koronáriabetegség jelenlétére.

Azok, akik több, mint 20 éve hagyták abba a dohányzást a nemdohányzó csoportba kerültek. Hypertoniás csoportba azon emberek kerültek, akik korábbi vizsgálataik során ilyen diagnosist kaptak, illetve 140/90 Hgmm feletti vérnyomásuk volt, vagy antihypertensiv kezelést kaptak. Az 1. betegcsoport demográfiai adatait a 7. táblázat tartalmazza.

2.2.1.2. A 2. betegcsoport – Carotis endarterectomia utáni retrospektív párosított eset-kontroll vizsgálat A vizsgálatot megelőzően 4 évvel a Semmelweis Egyetem Ér- és Szívsebészeti Klinikáján eversios carotis endarterectomia (CAE) műtéten átesett betegek retrospektiv analízise során a betegcsoportot azok alkották, akik a carotis duplex scan (CDS) eredménye szerint legalább 50%-os restenosis volt detektálható [n=17, 7 nő (42%); életkor = 66,7±2,1 év] a követési idő végén [29 hónap (14-85)]. A kontrollcsoportba pedig követési idő, nem és életkor, valamint a szérum lipidszintek szerint párosított 29 olyan beteg tartozott ugyanezen betegpopulációból, akiknél az érátmérő százalékában megadott stenosis mértéke nem érte el az 50%-ot. Itt a követési idő 50 hónap (35-80) volt. A 2. betegcsoport demográfiai adatait a 12. táblázat tartalmazza. Ezen kis mintaszámú vizsgálat eredménye hypotesisgeneráló volt és a jelenség pontosabb vizsgálata érdekében nagyobb mintában prospektív adatgyűjtést terveztünk.

2.2.1.1. A 3. betegcsoport – Carotis endarterectomia utáni prospektív vizsgálat Prospektív adatgyűjtésünk 123 beteggel indult, akiknél a Semmelweis Egyetem Ér- és Szívsebészeti Klinikáján 2000 október és 2003 március között eversios carotis endarterectomiát végeztek. A vizsgálati protokoll szerinti teljes adatgyűjtés 117 betegnél volt kivitelezhető (39 nő, 33%; életkor = 64,1 ± 9,1 év). Hat beteg exitált a 13,8 hónap (12,3-19) alatt. A halál oka 4 esetben miokardiális infarktus, 1 esetben suicidum és 1 esetben pulmonális embolia volt.

39

Az anamnézisfelvétel során kiemelt hangsúlyt kapott korábbi koronáriabetegség, a diabetes mellitus és a perifériás érszűkület, a hypertensio, hyperlipidaemia valamint a dohányzás. A kórházi felvétellel együtt mellkasi röntgenvizsgálat, vizeletvizsgálat és szérum elektrolit, valamint vérkép készült. Kizártuk az adatgyűjtésből azokat, akiknek ismert neoplasticus betegsége volt, valamint a vasculitisben szenvedőket. A betegek adatait a 13. táblázat tartalmazza. Akkor tekintettük a betegeket hypertoniásnak, diabetesesnek, koszorúér illetve perifériás verőér betegnek amennyiben orvosi dokumentációjában ez szerepelt, vagy ezeknek megfelelő kezelés alatt állt.

Endartectomia indikációja: összhangban állt a Magyarországon is elfogadott AHA ajánlással (127), vagyis szimptómás (83 beteg, akik közül TIA 61, minor stroke 19 és major stroke 3 esetben), vagy 70% fölötti stenosissal rendelkező aszimptómás betegeknél (40 beteg) végezték a beavatkozást. A betegek érintett oldali carotis stenosisa a műtét előtt átlagosan 80 ± 14% volt. A beválogatott betegek közül 11-nél bilateralis stenosis alakult ki, de a vizsgálatba csak a súlyosabb szűkületet mutató oldal került. Műtétre csak olyan betegek kerülhettek, akiknél felvételkor sem a fizikáális vizsgálat, sem a laborértékei nem utaltak fennálló fertőzésre.

Endarterectomia: Eversiós technikával carotis endarterectomiát (128) végzett 6 sebész egyazon intézményben. A sebészek között nem volt különbség a posztoperatív kimenetelt illetően.

Betegkövetés: Az átlagos követés medián ideje 13,8 hónap (12,3-19,0) volt. Carotis angiographia és carotis doppler scan vizsgálat történt minden betegnél a műtét előtt, melyek eredménye egyező volt. A továbbiakban a carotisok keringési viszonyait ismételt CDS vizsgálattal ellenőriztük 5,7 héttel (4,6-8,0), 6,8 hónappal (6,2-7,9) és 13,8 hónappal (12,3-19,0) a beválogatás után. A 4. táblázatban jelölt vizitek alkalmával a betegek vizsgálatán, carotis doppleren kívül vérmintavétel is történt. A vizsgálati protokollt az egyetem etikai bizottsága engedélyezte, a betegek részletes felvilágosítás után írásos beleegyezést adtak.

40

3. Táblázat: 3. Betegcsoport vizsgálati protokollja Vizsgálatok CDS1

MBL genotipus +

Lipid profil +

α-C. pneum.2 1 +

Gyulladásos marker3 Preoperatív + + 4 nap + + + + Postopeartív 6 hét 7 hó + + 14 hó + + + 1: Carotis doppler ultrahang vizsgálat; 2: anti-Chlamydia pneumoniae antitest; 2: CRP Betegvizit

2.2.2. Vizsgálati módszerek

2.2.2.1. Laborvizsgálatok

Vérmintavétel Szérum és EDTA-antikoagulált plazmamintát gyűjtöttünk vákumcsövekbe. A minták felét a kórházi laboratóriumba szállították, szállításig szobahőn tárolták, majd vérkép, süllyedés, CRP, teljes koleszterin, LDL-koleszterin, HDL-koleszterin és plazma fibrinogén került meghatározásra. A minták másik részénél a kutatólaboratóriumba érkezés után a szérumot illetve plazmát és a buffy-coatot elválasztottuk, a mintákat aliquotoztuk és -70°C-on tároltuk a mérésekig.

Szérum total-koleszterin (TC) és triglicerid (TG) (Roche/ Hitachi), HDL-C (Human, Wiesbaden, Németország) paraméterei Cobas Mira Plus klinikai kémiai analizátorral kerültek meghatározásra. LDL-C Friedewald formula alapján számítottuk (129), illetve amennyiben a TG koncentráció 4,5 mM felett volt, direkt mérést végeztek.

CRP meghatározás Nagy érzékenységű módszerrel (high sensitivity CRP), a partikulumokkal erősített immunturbidimetriás vizsgálat (Roche, Cobas Integra 400) segítségével, 0,07 mgL-1

41

detektálási küszöb érzékenységgel határoztuk meg. A variációs koefficiens 2,9% 6,3 mgL-1 illetve 3,9% volt 108 mgL-1 átlagértéknél.

MBL fehérjeszint meghatározása Kettős ellenanyag ELISA módszerrel (130) történt a mérés kollaborációs partnerünk laboratóriumában. A rendszer a magasabb oligomerizáltságú komplexeket preferálja, 20 µgL-1 detekciós küszöbbel. A standardot a kit tartalmazta 15 µgL-1 koncentrációtól (Antibodyshop, Copenhagen, Denmark). Monoklonális antihumán MBL antitestet (AT) (HYB-131-01, Antibodyshop) használtunk capture AT-ként és ugyanezen ellenanyag biotinilált változatát detektor antitestként. A specifikus felismerés előhívása a kit leírása szerinti mennyiségben streptavidin-peroxidázzal és szubsztrátként ABTS (2,2'-azino-bis 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic

acid)

és

H2O2-val

történt.

A

színreakciót

denzitometriás módszerrel 405nm hullámhosszon olvastuk le.

Chlamydia pneumoniae IgG antitestek meghatározása (α-C. pneum. AT) C.

pneumoniae

ellenes

specifikus

IgG

típusú

ellenanyagokat

micro-

immunofluorescencia vizsgálat (ServiMif Chlamydia S630, Servibio, Meudon, France) segítségével 1: 128-ra hígított szérumból határoztuk meg. A gyártó instrukciói szerint a mintát pozitívnak vettük, ha az <= 1:128-as hígításban, illetve negatívnak, ha ennél nagyobb hígításban adott jelet. A vizsgálatokból kizártuk azon embereket, akik széruma Chlamydia trachmatis, vagy Chlamydia psittaci antitestet tartalmazott.

Humán hsp60 ellenes IgG kimutatása (α-hsp60 AT) Humán 60kDa-os hősokk fehérjével (hsp60) reagáló IgG antitestek kimutatása a laborunkban bevezetett ELISA módszerrel történt (131). A 96 lyukú polisztirén lemezeket (Enzy-Plate, Propilane Kft., Pécs) humán rekombináns hsp60 antigénnel (Lionex GmbH, Braunschweig, Germany) fedtük 1µg/well koncentrációban bikarbonát pufferben (pH 9,6, 100 µl/well) 4°C-on, egy éjszakán át. Egyszeri mosás után (PBSTween20 0,05%) 1 órán át blokkoltuk szobahőn [PBS-zselatin (0,5%)-Tween (0,05%), pH 7,2]. Mosás után a szérummintákat két párhuzamosban mértük be (PBS-zselatin-

42

Tween 50 µl/well; 1:100 higítás). Inkubálás (60min, szobahőn). Többszöri mosás után peroxidáz konjugált γ-lánc specifikus kecske anti-humán (GAH) IgG-t (Dako, Glostrup, Dánia) adtunk hozzá 1:5000 hígításban és inkubáltuk (60min, szobahőn). Többszöri mosás után a szubsztrát reakció OPD-vel (Sigma, USA) zajlott citrát pufferben H2O2 jelenlétében. A reakciót kénsavval állítottuk le és az optikai denzitást (OD) 490 nm-en olvastuk le. Az OD értékeket ugyanazon lemez fedetlen részén mért OD-k kivonásával korrigáltuk. Az antitest koncentrációkat önkényes egységben (arbitary unit – AU/ml) adtuk meg, melyet α-hsp60-at magas koncentrációban tartalmazó humán szérum hígítási sorából készített standard görbe alapján számoltunk ki.

DNS izolálálás Teljes genomiális DNS-t Miller módszere szerint (132) vontuk ki fehérvérsejtekből. Egy ml EDTA-val alvadásgátolt vért lizáltunk és a fehérvérsejteket centrifugálással választottuk el (2 perc 13.000 rpm). A felülúszó eltávolítása után kétszer mostuk desztillált vízzel majd centrafugáltuk (2 perc, 13.000 rpm). A pelletre emésztőenzimeket (20µl SDS, 30µl Proteinase K enzimet, 80 µl proteinase K) mértünk, és desztillált vízzel egészítettük ki úgy hogy a sejtekkel együtt a végtérfogat 450 µl legyen. Az emésztés (vízfürdőben 30 min 55°C) majd kihűlés után 5 molL-1 NaCl-oldatból 200µl-t adtunk hozzá a fehérjék kisózása céljából. Centrifugálás (7 perc, 13.000 rpm) után a felülúszót egy tiszta csőbe öntöttük át, és belőle 500 µl i-propranollal csaptuk ki a DNS-t, amit centrifugálással ülepítettünk (2 perc 13.000 rpm). Felülúszó eltávolítás után 500µl 70%os

etanolban

tisztítottuk,

majd

ismét

centrifugáltunk.

A

maradék

alkoholt

elpárologtattuk és 200 µl desztillált vízben oldottuk fel, és végül a DNS oldatot -20°Con tároltuk.

MBL genotípus és promóter polimorfizmus meghatározása A génpolimorfizmusok meghatározására Madsen és munkatársai által közölt polymerase chain reaction (PCR) alapú SSP (Sequence Specific Primer) technikát alkalmaztuk (76).

43

PCR Egyenként 10µl PCR minta a következőkből állt össze: 5µl primer-mix; 3µl PCR oldat; 2µl DNS oldat; 0,25U Taq Polymerase. A PCR program a következő volt: Denaturálás (94°C-2’); 10 ciklus (94°C-10’’ és 65°C-1’); 20 ciklus (94°C-10’’ és 61°C50’’ és 72°C-30’’). Kimutatás 2%-os agarose gélen 150V-20’ futtatás és Ethidium Bromide festés után UV fényben történt. Kiértékelés Chemi Genius2 Image Analyser (Syngene) segítségével digitális képrögzítés útján történt. PCR primer-mix: 1 pmolml-1 primer + 0,4 pmolml-1 kontroll primer (Lásd a No. 13 primer szekvenciát a II. sz. Mellékletben). PCR oldat: 3,3x PCR puffer; 250 µM minden dNTP-ből; 330 µgml-1 Cresol Red (SIGMA, C-9877); 16,5% glicerin. SSP A genotypusváltozatokra jellemző primerrel ( ld. II. Mellékletben) végzett PCR eredményeként elektroforetikus futtatást követően identifikálhatóak voltak a különbőző genotypusok.

2.2.2.2. Klinikai vizsgálatok

Carotis Doppler Scan – CDS A nyaki artériákat color duplex ultrahanggal vizsgálta ugyanaz a tapasztalt radiológus (5 MHz lineáris fej, ATL Ultramark 9 HDI). Az a. carotis communis, a carotis interna és a carotis externa mindkét oldalon azonos módon kerül vizsgálatra. A stenosis mértéke – a nemzetközi irodalomban elfogadottakkal egyezően – a véráramlás sebességéből származtatott, ahol a 0% jelenti az intakt eret és a 100 % a teljes okklúziót. A szűkület megállapításához az adott ér systole és diastole végi csúcsáramlási sebességei, valamint az a. carotis interna és carotis communis végsystolés sebességarányok szolgáltak alapul (Lásd a 4. táblázatban).

44

4. Táblázat: Sebesség diaméter-stenosis konverziós táblázat Stenosis foka <50% 50-69%

Leírás

Systolés csúcssebesség (PSV1 cm/s)

Normál, enyhe Közepes

Diastolés csúcssebesség PSV ICA/ (PDV2 cm/s) PSV CCA3

<120

<40

<1.5

120-200

40-100

1.5-1.8

Súlyos >200 >100 >1.8 ≥70% 1: PSV=Peak Systolic Velocity; 2: PDV=Peak Diastolic Velocity; 3: carotis interna és carotis communis systolés csúcs áramlási sebesség hányadosa

Betegkövetés, adatgyűjtés A prospektivitást biztosító folyamatos adatgyűjtés a rendszeres betegvizitek alkalmával történt a 3. betegcsoport esetén, míg postai úton egyszerre kézbesített kérdőív segítségével az 1. betegcsoport esetén. Amennyiben másodszori kézbesítésre sem kaptunk választ, a korábbi beküldő háziorvost kerestük meg orvosi adatszolgáltatás céljából telefonon, illetve levélben. Az adatokat MS Excell 2002 adattáblában gyűjtöttük.

Statisztikai analízis és adatábrázolás Diszkrét változók gyakoriság vizsgálatára a Fisher-féle egzakt tesztet, független minták folytonos változóinak összehasonlítására a Mann-Whitney próbát használtunk (Graphpad Prism 4.03, www.graphpad.com). Bináris adatok kapcsolatának vizsgálata többszörös logisztikus regresszióval történt. Csoporton belül különböző időben vett minták összehasonlítását nonparaméteres varianciaanalízissel (Friedman teszt) végeztük Dunn-féle többszörös összehasonlítás post hoc analízissel kiegészítve (SPSS 11.0, SPSS Inc. Chicago, IL, www.spss.com). Normál eloszlású folytonos adatok átlag ± SD, nem normál eloszlásúak pedig medián (interkvartlis tartomány), míg a diszkrét változók arányszám, illetve százalék formában vannak ábrázolva.

45

2.3. Eredmények Az eredmények tárgyalása a vizsgálati csoportoknak megfelelően kerül részletezésre. Összefüggések tárgyalása a Megbeszélés fejezetben található meg.

2.3.1. Súlyos koszorúérbetegek prospektív vizsgálata

Az 1. csoportban a beteg- és a kontrollcsoport leírása A betegek átlagéletkora magasabb volt, mint az egészséges kontrolloké. A betegcsoportban mért szérum teljes koleszterin és triglicerid szintek szignifikánsan magasabbak voltak a kontrollcsoporthoz képest. A férfi/ nő arány magasabb a betegcsoportban. A testtömeg index (Body mass index – BMI), a dohányzók és a hypertoniások aránya szintén magasabb a betegcsoportban. Ezen kívül a Chlamydia pneumoniae szeropozitívak is ritkábban fordulnak elő a kontrollok között (Lásd 6. Táblázat).

5. Táblázat: Az ISZB és a kontrollcsoport demográfiai és alapadatai ISZB csoport Kontroll P 210 257 Mintaszám (n) 58 ± 8,2 46,5 ± 11,9 <0,0001 Életkor (év) 160/ 50 164/ 93 0,005 Nem (férfi/ nő) 6,2 (5,5-7,25) 5,59 (4,83-6,4) <0,0001 Össz koleszterin (mM) 2,0 (1,45-3,1) 1,5 (0,98-2,23) <0,0001 Triglicerid (mM) 58,5 23,9 <0,0001 Dohányzás (%) 33,3 21,2 0,046 Hypertonia (%) 28,5 ± 5 26,7 ± 4,1 0,004 BMI (kg/m2) 157/ 53 162/ 95 0,007 C. pneumonia szerostátusz (pozitív/ negatív) Normál eloszlású adatok átlag ± SD, a nem normál eloszlásúak medián (interkvartilis tartomány) szerint megjelenítve

MBL variáns allél gyakorisága a súlyos koszorúérbeteg csoportban a C. pneumoniae státusz függvényében

46

Az IgG típusú C. pneumoniae antitestek jelenlétének kvalitatív meghatározása, valamint az MBL allélek frekvenciájának meghatározása történt az 1. csoportba tartozó 210 ISZB-s beteg és 257 kontroll mintájában. Az eredményeket a 7. táblázat foglalja össze. A C. pneumoniae pozitívak és negatívak között nem volt különbség az MBL variáns allél frekvenciában [p=0,75; OR 0,94 (95 % CI 0,63-1,39)]. A C. pneumoniae pozitívakat vizsgálva, a betegcsoport tagjai között jelzetten gyakrabban fordult elő a variáns allél a kontrollhoz viszonyítva [p=0,091; OR: 1,48 (0,94-2,31)], de nem mutatkozott különbség betegcsoport és a kontrollok között C. pneumoniae szeronegativitás esetén. A megfigyelés okán többszörös logisztikus regressziós analízist végeztünk annak vizsgálatára, hogy a C. pneumoniae pozitivitás és a koronáriabetegség összefüggését befolyásolja-e az MBL genotípus.

6. Táblázat: MBL allélek megoszlása a C. pneumoniae státusz függvényében az 1. betegcsoportban #

MBL genotípus

Mindenki Beteg

Î

A/A A/B A/C A/D Összes A/O B/B B/C B/D C/C C/D D/D

Î

Összes O/O A/O + O/O Összesen O allélfrekvencia

118 (56,2) 54 (25,7) 5 (2,4) 25 (11,9) 84 (40) 2 (1) 1 (0,5) 1 (0,5) 0 (0) 0 (0) 4 (1,9) 8 (3,8) 92 (43,8) 210 (100) 0,24

C. pneumoniae negatív

Kontroll

Beteg

Kontroll

149 (58) 57 (22,2) 8 (3,1) 25 (9,7) 90 (35) 5 (1,9) 3 (1,2) 5 (1,9) 2 (0,8) 2 (0,8) 1 (0,4) 18 (7) 108 (42) 257 (100) 0,25

35 (66) 9 (17) 0 (0) 6 (11,3) 15 (28,3) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 3 (5,7) 3 (5,7) 18 (34) 53 (100) 0,2

48 (50,5) 27 (28,4) 2 (2,1) 8 (8,4) 37 (38,9) 2 (2,1) 3 (3,2) 2 (2,1) 1 (1,1) 2 (2,1) 0 (0) 10 (10,5) 47 (49,5) 95 (100) 0,3

C. pneumoniae pozitív Beteg 83 (52,9) 45 (28,7) 5 (3,2) 19 (12,1) 69 (43,9) 2 (1,3) 1 (0,6) 1 (0,6) 1 (0,6) 1 (0,6) 1 (0,6) 5 (3,2) 74 (47,1) 157 (100) 0,25

Kontroll 101 (62,3) 30 (18,5) 6 (3,7) 17 (10,5) 53 (32,7) 3 (1,9) 0 (0) 3 (1,9) 1 (0,6) 0 (0) 1 (0,6) 8 (4,9) 61 (37,7) 162 (100) 0,21

Az értékek n (oszlopösszeg százalékában) vannak kifejezve; ’A’ a vad MBL allélt, ’O’ bármely variáns allélt jelöli. #: Kiemelt jelentőségű genotípus csoportok.

Az MBL polimorfizmus befolyásolja a C. pneumoniae szeropozitivitás és a koszorúérbetegség kapcsolatát A betegek és kontrollok teljes csoportjára nézve, a C. pneumoniae pozitivitásra történt korrekció után két csoport között a szignifikancia határán lévő különbség mutatkozott csak.

47

A vizsgálati és a kontrol csoport tagjait két alcsoportra bontottuk aszerint, hogy hordozták-e az MBL variáns allélt (A/O és O/O), vagy nem (A/A). A variáns allélt hordozók csoportjában (A/O és O/O) 3,34 [1,69-6,66] nagyságú OR adódott p=0,0002 szignifikanciával. Ez az összefüggés akkor is megmaradt, ha korra, nemre, szérum koleszterin és triglicerid koncentrációra adjusztáltuk: OR 2,63 [1,07-6,45; p=0,035] (Lásd 8. táblázat Modell 1.) Az összefüggés akkor is megmaradt, amikor a Modell 1 változóin kívül a 6. táblázatban megmutatkozó csoportkülönbségek szerint BMI-re, a dohányzási szokásra és a hypertonia meglétére is adjusztáltunk (Lásd 8. táblázat Modell 2). Mivel a BMI és a szérum triglicerid szintek között szignifikáns összefüggés mutatkozott (P<0,001), a két paraméter nem volt egy regressziós modellbe vehető.

7. Táblázat: ISZB és anti-C. pneumoniae pozitivitás közti összefüggés logisztikus regressziós analízise az MBL polimorfizmus szerint az 1. betegcsoportban C. pneumoniae Model 1a Beteg Kontroll státusz OR(95%CI); P OR(95%CI); P Teljes 1. betegcsoport 162 (62,3) Pozitív 157 (74,8) 1,74 (1,14-2,65); 1,78 (0,98-3,12); 95 (37,7) Negatív 53 (25,2) 0,0067 0,058 Összes 210 (100) 257 (100) A/A 101 (64,9) Pozitív 83 (70,3) 1,13 (0,65-1,97); 1,39 (0,64-3,02); 48 (35,3) Negatív 35 (29,7) 0,65 0412 Összes 118 (100) 149 (100) A/O és O/O 61 (58,5) Pozitív 74 (80,4) 3,34 (1,69-6,66); 2,63 (1,07-6,45); 47 (41,5) Negatív 18 (19,6) 0,0002 0,035 Összes 92 (100) 108 (100) a: korra, nemre, szérum kolesztrinre és triglicerid koncentrációra adjusztálva b: korra, nemre, BMI-re, dohányzók és hypertoniások számára adjusztálva

Model 2b OR(95%CI); P 1,8 (0,55-5,93); 0,336

0,64 (0,09-4,53); 0,64

7,98 (1,07-59,24); 0,043

Összefüggés nem mutatható ki a C. pneumoniae pozitivitás és ISZB között, a vad MBL allélt hordozók között.

Az összefüggés minél tisztább vizsgálata érdekében a betegcsoport 147 tagja mellé kontrollt párosítottunk nem, kor, C. pneumoniae pozitivitás szempontjából mind a homozigóta vad, mind a heterozigóta variáns allélt hordozók alcsoportjában (Lásd a 9. táblázatot).

48

8. Táblázat: ISZB és α-C. pneumoniae AT pozitivitás közti összefüggés logisztikus regressziós analízise az MBL polimorfizmus szerint az 1. betegcsoport 147 betegében és a hozzájuk kor és nem szerint párosított egészségesekben C. pneumoniae Párosított Beteg státusz Kontroll OR(95%CI); p Teljes betegcsoport Pozitív 115 (78,2) 93 (63,2) 2,09 (1,25-3,5); 54 (36,7) Negatív 32 (21,8) 0,005 Összes 147 (100) 147 (100) A/A 54 (67,5) Pozitív 63 (75) 1,44 (0,73-2,83); 26 (32,5) Negatív 21 (25) 0,289 Összes 84 (100) 80 (100) A/O és O/O 39 (58,2) Pozitív 52 (82,5) 3,94 (1,51-7,64); 28 (41,8) Negatív 11 (17,5) 0,003 Összes 63 (100) 67 (100) a: szérum kolesztrinre és triglicerid koncentrációra adjusztálva

Model 1a OR(95%CI); p 1,78 (0,98-3,12); 0,058

1,44 (0,68-3,06); 0,343

2,88 (1,1-3,39); 0,016

A párosítást követően sem az átlagéletkor – 54,9 ± 6,3 év illetve 53,6 ± 7,7 év – sem a férfi/női nemek aránya – 110/37 illetve 96/51 – nem különbözött a két csoportban. A teljes betegpopuláción tett megfigyeléshez hasonlóan a koszorúér betegség csak az MBL variáns allélt hordozók között mutatott összefüggést a C. pneumoniae szeropoztivitással. A különböző zavaró faktorokra történt korrekció után 2,88-szoros esély adódott koronáriabetegség jelenlétére.

Az MBL promóter allélek vizsgálata ebben a kérdésben nem volt informatív.

Végpontok a követési idő alatt A 210 betegből 177-nél (84,3 %) kaptunk adatokat a kérdőívek segítségével, és így összességében 65 ± 5,8 hónapos követési idő adódott. Súlyos kimenetelként definiáltuk az

új

miokardiális

infarktust

és/vagy

koronária

by-pass

műtétet,

és/vagy

kardiovaszkuláris halálozás bekövetkeztét. Összesen 12 betegnél alakult ki új miokardiális infarktus; egy betegnél végeztek újabb by-pass műtétet infarktus kialakulása nélkül; egy beteg exitált kardiális okból. Így összesen 14 súlyos kimeneteli eseményt regisztráltunk a követési időszak alatt. A vizsgálatból kiesett 33 beteg demográfiai, C. pneumoniae szerológiai és a vizsgált MBL allélgyakorisága nem különbözött sem a beteg, sem a kontrollcsoporttól. 49

Az MBL polimorfizmus prediktív értéke koronáriabetegség súlyos szövődményei kialakulásának tekintetében C. pneumoniae pozitív és negatív betegek között A betegek Chlamydia pneumoniae szerostátusza, az MBL génpolimorfizmusa került meghatározásra a beválogatáskor levett vérmintákból és az egyes faktorok prediktív értékét számoltuk ki, a kimenetelt befolyásoló változók figyelembevételével.

9. Táblázat: MBL genotípus prediktív értéke súlyos kardiovaszkuláris esemény kialakulására C. pneumoniae pozitív és negatív ISZB-s betegekben MBL allélek

Kardiovaszkuláris esemény1 Igen Nem

OR (95% CI); P

Model2 OR (95% CI); P

3,24 (0,97-10,7); 0,053

2,4 (0,96-5,96); 0,06

Minden beteg A/A A/O és O/O

4 10 14

92 71 163

Összesen C. pneumoniae pozitív 2 68 A/A 5,28 (1,1-25,4); 3,27 (1,1-9,71); 9 58 A/O és O/O 0,029 0,033 Összesen 11 126 C. penumoniae negatív 2 24 A/A 0,92 (0,08-11,2); 0,86 (0,08-8,89); 1 13 A/O és O/O 1,0 0,896 Összesen 3 37 1: Új miokardiális infarktus és/vagy revaszkularizáció és/vagy kardiovaszkuláris halálozás 2: Coronariastenosis mértékére, korábbi MI előfordulására, kiindulási TC és TG értékekre adjusztálva

Az eredményeket a 10. táblázatban foglaltuk össze. Az egyes csoportok alacsony elemszáma miatt inkább a jelenség meglétére hívnánk fel a figyelmet. Súlyos esemény nagyobb valószínűséggel fordult elő az MBL variáns allélt hordozók között (adjusztált OR: 2,4 [0,96-5,96]; p=0,060), bár az összefüggés megint csak a Chlamydia pneumoniae pozitívakra korlátozódott. Ebben a csoportba tartozó 11 embernél 9 súlyos eseményt regisztráltunk. Náluk nagyobb valószínűséggel alakult ki súlyos esemény (OR: 3,27 [1,10-9,71]; p=0,033), mint a variánst allélt nem hordozókban. Az MBL polimorfizmus nem bírt prediktív erővel súlyos esemény kialakulására C. pneumoniae szeronegatív egyénekben.

50

Az MBL polimorfizmus nincs összefüggésben a C-reaktív proteinnel és a 60 kDa hősokk fehérje elleni antitestek jelenlétével Mivel a CRP szint és a hsp60 elleni antitestek magas koncentrációja is befolyásolhatja a súlyos események kialakulását, megvizsgáltuk, hogy áll-e fenn összefüggés az MBL polimorfizmus és ezen változók között. Nem találtunk statisztikai különbséget a két csoport között sem a CRP, sem az α-hsp60 tekintetében (Lásd a 11. táblázatot). Az elkülönített C. pneumoniae pozitív és a negatív alcsoportok analízise esetén is hasonló eredményt kaptunk.

10. Táblázat: a-hsp60 és CRP az MBL genotípustól független

CRP [mg/l] α-hsp60 IgG [AU/ml]

MBL variáns allél hordozó (A/O, O/O) 3,14 (1,83-6,79) 87 (39-204)

51

MBL homozigóta vad (A/A) 4,06 (1,88-7,30) 103 (46-92)

p 0,572 0,576

2.3.2. Carotis endarterectomia utáni retrospektív elemzés

A retrospektív vizsgálatban normál MBL allél túlsúly van a restenoticus csoportban Összehasonlítottuk 17 beteg – akiknél legalább 50%-os restenosis volt kimutatható – MBL genotípusát a kontrollcsoport 29 betegével, akiknél a restenosis nem volt kimutatható. A vizsgálat jellegénél fogva a két csoport között nem volt különbség a követés hosszát, az életkort, nemek megoszlást tekintve, és a szérumlipid-szintek sem különböztek szignifikánsan.

11. Táblázat: Életkor, nem, lipidkoncentrációk és MBL polimorfizmus megoszlása a carotis enartectomia utáni keresztmetszeti vizsgálat két alcsoportjában >50% restenosis Mintaszám (n) Életkor (év) Nem (ffi/nő) Követési idő (hónap) Teljes koleszterin (mmol/l) Triglicerid (mmol/l) HDL-koleszterin (mmol/l) LDL-koleszterin (mmol/l) MBL genotípus A/A A/O O/O Variáns allél frekvenciája a: χ2 for trend;

17 66.65 ± 2.05 10/7 29 (14-85) 6.11 ± 0.31 2,37 ± 0.35 1.29 ± 0.07 3.31 ± 0.20 10 (59%) 7 (41%) 0 (0) 7/34=0.206

=<50% restenosis 29 67.48 ± 2.31 22/7 50 (35-80) 5.98 ± 0.22 2.07 ± 0.14 1.26 ± 0.04 3.74 ± 0.19 7 (24%) 16 (55%) 6 (21%) 30/58=0.517

p 0.789 0.321 0.158 0.750 0.444 0.713 0.210 0,007a 0.0041

A variáns MBL O-allél hordozók gyakorisága szignifikánsan alacsonyabb a restenoticus csoportban a kontrollhoz képest (p=0,024) (Lásd 12. táblázatban). Továbbá a χ2 for trend analízis azt mutatta, hogy a hatás géndózis függő, vagyis a homozigóta (O/O) hordozók védettebbek, mint akik heterozigóták az MBL variáns allél tekintetében (p=0,007). A hat homozigóta O/O hordozó közül egynél sem alakult ki restenosis.

52

2.3.3. Carotis endarterectomia utáni prospektív vizsgálat

Restenosis határértéke Az irodalmi adatok egybehangzó véleménye alapján az 50%-ot meghaladó restenoticus folyamatok többnyire progrediálnak, míg az ez alattiak stagnálnak, illetve vissza is fejlődhetnek. Jelen vizsgálatban ezért a patobiológiai folyamat és nem a sebészi indikáció szerinti határértéket vettük a restenosis indikátorának.

A 3. csoportban a restenoticus és a kontrollcsoport leírása A követési idő alatt bármikor is 50% fölötti restenosist mutató operált oldali a. carotis volt a vizsgálatban a restenoticus csoportba kerülés kritériuma. A két csoport között nem volt különbség az életkorban, a nemek arányában, a követési idő hosszában, a kiindulási érátmérőben, a lipidprofilban, gyulladásos szérummarkerekben, illetve az ateroszklerózis egyéb hagyományos rizikófaktoraiban sem (dohányzás, diabetes, hypertonia, meglévő koszorúér betegség és obliteratív perifériás verőérbetegség) (Lásd a 12. Táblázatban).

12. Táblázat: Carotis endarterectomia utáni követéses vizsgálatban szereplő csoportok alapadatai Restenosis*

Nincs restenosis**

p

17 100 Mintaszám (n) 67 ± 11 66 ± 8,7 0,4672 Életkor (év) 11/6 65/35 1,0 Nem (férfi/ nő) 19 ± 4,7 17 ± 4,4 0,3430 Követési idő (hónap) 84 ± 8,7 83 ± 9,1 0,7832 Preoperatív érátmérő csökkenés (%) 6,5 ± 1,8 6,3 ± 1,2 0,6343 Össz koleszterin (mM) 2,3 ± 1,5 2,3 ± 1,2 0,5963 Triglicerid (mM) 3,4 ± 1,2 3,4 ± 1,0 0,6989 LDL-koleszterin (mM) 1,3 ± 0,37 1,3 ± 0,29 0,6619 HDL-koleszterin (mM) 9,7 ± 8,8 11 ± 11 0,7777 CRP (mg/ml) 27 ± 3,6 26 ± 4,1 0,3534 BMI (kg/m2) 7 (41,2) 45 (45) 0,7989 Dohányzás n(%) 8 (47) 33 (33) 0,2815 Diabetes n(%) 16 (94) 88 (88) 0,6888 Hypertonia n(%) 11 (65) 58 (58) 0,7907 ISZB n(%) 9 (53) 41 (41) 0,4302 Obliteratív perif. verőérbetegség n(%) * >50% érátmérő csökkenés carotis doppler vizsgálattal; ** 0-50% érátmérő csökkenés carotis doppler vizsgálattal

53

A betegeknél nem történt terápiamódosítás a műtétet követően. Az antihyperlipidaemiás szerek közül a statinkezelés jelzett összefüggést mutatott a későbbi restenosis kivédésével.

Restenosis, morbiditás, mortalitás A plakk műtéti eltávolítása után a hathetes kontroll eredményei szerint 100/123 beteg esetén 100% érpatencia volt tapasztalható. A maradék 23 esetben kisfokú reziduális stenosis mutatkozott. A 14 hónap teljes követési idő során 72/117 beteg (az élő betegek 61,5%-a) maradt 10 százaléknyi szűkület alatt a postoperativ hat hetes ultrahang kontrollt alapul véve. Tíztől tizenkilenc százalék restenosis 6, 20-40% 13, 41-50% restenosis pedig 10 beteg esetén volt mérhető. Ötven százalékot meghaladó szűkületet 17 betegnél (15%) találtunk. A 6 operatőr által végzett beavatkozások kimenetele nem különbözött egymástól (p=0,532).

A preoperatív doppler eredmény és a konvencionális laborvizsgálatok között nincs összefüggés A preoperatív doppler eredmény és az össz-koleszterin (a Spearman korrelációs koeficiens p értéke: 0,279), triglicerid szint (p=0,843), a HDL-C (p=0,843), és LDL-C koncentrációk között (p=0,613) korreláció nem volt kimutatható. A homozigóta vad allélt (A/A), és legalább egy variáns MBL allélt hordozók (A/O, O/O) carotis doppler értékei

között

statisztikai

különbség

nincs

(Mann-Whitney

teszt,

p=0,325).

Hasonlóképpen a C. pneumoniae szeropozitivitás sem befolyásolta a carotis stenosis nagyságát (p=0,144). Száztizennyolc carotis endarterektómián átesett érbeteg és 257 egészséges magyar kontroll C. pneumoniae szerostátusza között különbség nem volt kimutatható akkor sem, ha az MBL genotípust is számításba vesszük (nem ábrázolt adat).

MBL genotípusa és a fehérje plazmakoncentrációja között erős az összefüggés Eredményeink azt mutatják, hogy az MBL genotípus erősen korrelál az MBL fehérjekoncentrációval (Kruskal-Wallis p<0,0001, lásd 10. ábra). Az A/A genotípusú alcsoportban (n=76) a preoperatív mintában 2016 (1192-3560) µgL-1, az A/O 54

alcsoportban (n=41) 336 (106-800) µgL-1, az O/O alcsoportban (n=6) pedig csak detektálási küszöb alatti (<20 µgL-1 ) plazmakoncentrációk voltak mérhetőek.

10. ábra: MBL plazmakoncentráció a különböző genotípusokban Az A/A homozigóta vad (n=76), A/O a heterozigóta (n=41) és az O/O a homozigóta variáns allélt (n=6) hordozókat jelöli. Medián és interkvartilis tartomány, illetve a minimum és maximum értékek vannak feltüntetve. Az MBL koncentrációkban mutatkozó különbségek jelentősen eltérnek egymástól (Kruskal-Wallis p<0,0001)

Korábban és nagyobb gyakorisággal alakul ki restenosis a homozigóta vad allélt hordozókban, mint a legalább egy variáns allélt hordozókban. Nemi különbségek Jelentős és szignifikáns különbség figyelhető meg az érszűkület mértékének változásában a homozigóta vad allélt hordozók (A/A) és a variáns allélt (A/O) hordozók között (Lásd 11. ábra). Nemparaméteres ANOVA és Dunn-féle post hoc teszt használatával kimutatható,hogy a homozigóta A/A allélt hordozókban már hét hónappal az endarterectomia után csökken az érpatencia (p<0,05) és ez a csökkenés a követési időszak végéig tovább folytatódik (p<0,0001). Ezzel ellentétben a variáns allélt hordozókban (A/O és O/O) szignifikáns érátmérő csökkenés csak a követési idő végén

55

mutatható ki (p<0,05). Az érpatencia csökkenést a dopplerrel megállapított növekvő stenosissal ábrázoltuk. A promoterpolimorfizmusok vizsgálata nem szolgált további információval.

30

p<0,001 25

Érátmérő csökkenés (%)

p<0,05 20

A/A A/O és O/O

15

10

p<0,05

5

0

6 hét

7 hó

14 hó

11. ábra: Doppler eredmények a genotípus függvényében MBL genotípus függvényében ábrázolt dopplerrel mérhető carotis érátmérő csökkenés a posztoperatív 6 hetes, 7 hónapos és 14 hónapos kontroll alkalmával. A nemparaméteres ANOVA után (Friedman teszt) végzett Dunn posthoc analízis szerint A/A vad genotípus hordozókban már 7 hónapos kontroll alkalmával csökkent a carotis átjárhatósága (p<0,05), és ez a tendencia fokozódott a követési idő végére (p<0,001). Ezzel ellentétben az A/O és a O/O genotípust hordozókban szignifikáns eltérés (p<0,05) csak a követési idő végére alakult ki.

Mivel a postoperatív hetedik hónapos ultrahang eredmények alapján készített logisztikus regressziós analízis erős interakciót (p=0,001) mutatott a genotípus és a nem között, ezért a továbbiakban az MBL genotípus hatását a két nemben külön vizsgáltuk.

56

12. ábra: Az MBL genotípus illetve az MBL plazmakoncentráció és a nem együttes hatása a restenosisra Magyarázatot lásd a szövegben.

Ha a nem és az MBL genotípus hatását vizsgáljuk a dopplerrel mért érátmérőre, akkor jelentős különbség a férfiak és nők között (P=0,0038) csak az A/A genotípus esetén mutatható ki (Lásd 13/A. ábra). Az adatok további analízise azt mutatta, hogy homozigóta vad allélt hordozó nőknek már a 7. hónapos vizit idején szűkület mutatkozott (p<0,05), és ez a tendencia folytatódott a követési idő végéig (p<0,01). Férfiak esetén statisztikai különbség csak a követési idő végén mérhető (p<0,05). Ezzel ellentétben variáns allélt hordozó (A/O és O/O) férfiak és nők között ilyen összefüggés nem mutatkozott (Lásd 13/B. ábra).

57

Az alacsony expressziójú promoter allél hatása A -221-es lokalizációjú promoter variáns (X) egy diszfunkcionális O allélel (XA/O; n=10) kombinálódva az O/O betegekkel (n=6) azonos fokú restenosis progressziót mutatott.

A restenosis a plazma MBL koncentrációval is összefüggést mutat A varianciaanalízis azt mutatta, hogy a magas (>500 µgL-1) plazmaszint mellett már 7hónapos vizit idején szignifikánsan szűkebb erek voltak mérhetőek nők esetén (p<0,01), míg férfiakban nem. Jelentős változás nem mutatkozott alacsony MBL koncentrációk (<500 µgL-1) mellett egyik nemben sem (Lásd 13/D ábra).

C. pneumoniae szerostátusznak és MBL genotípusnak nincs együttes hatása a carotis restenosisra Ezen betegcsoportban a restenosis mértéke (CDS) és Chlamydia szeropozitivitás között nem volt korreláció. Az MBL genotípusnak nem volt hatása a fenti kapcsolatra.

A követési idő alatt új miokardiális infarktus MBL variáns allél hordozókban és C. pneumoniae fertőzöttekben alakult ki A követési idő alatt 6 beteg exitált. A halál oka 3 esetben akut miokardiális infarktus volt. Mindhárom beteg variáns allélt hordozott és C. pneumoniae szeropozitívak voltak (egy beteg esetén a műtét és a hathetes kontroll között történt szerokonverzió). Egy beteg depressziós állapotban öngyilkosságot követett el, két másik pedig tüdőembólia következtében halt meg. A többi variáns allélt hordozó és C. pneumoniae pozitív betegnél (27/117) a követés alatt nem alakult ki miokardiális infarktus [OR (95% CI): 23,0 (1,2-460,2), p=0,0145].

58

2.4. Megbeszélés

2.4.1. Az iszkémiás szívbetegség, az iszkémiás szívbetegség progressziója és Chlamydia fertőzés, valamint az MBL variáns allél közti összefüggés Vizsgálatunk megerősíti a feltételezést, miszerint van kapcsolat a koronáriabetegség és a C. pneumoniae fertőzés között. Az összefüggést az MBL gén (MBL2) polimorfizmusa befolyásolja. A homozigóta vad allél hordozóknál nem, csak a variáns allél hordozóknál figyelhető meg a szignifikáns rizikó emelkedés, a kor, nem , szérum lipid, a BMI, a magas vérnyomás és a dohányzásra való statisztikai korrekció után is. Vizsgálatunk 5,5 éves követési ideje alatt háromszoros rizikóemelkedés volt megfigyelhető súlyos koronáriaesemény kialakulására variáns allél hordozókban, C. pneumoniae pozitivitás esetén a homozigóta vad allélt hordozó C. pneumoniae negatívokhoz képest.

MBL és ateroszklerózis a szakirodalomban Vizsgálatunk szerint tehát genetikai predispozició esetén a Chlamydia fertőzés is hozzájárulhat súlyos koronáriabetegség kialakulásához. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy az MBL variáns allél hordozás összefüggést mutatott súlyos koszorúér betegséggel (120) és megnövekedett carotis plakk mérettel (121). A közelmúltban született közlemény szerint a homozigóta variáns allél amerikai indiánok között önmagában független rizikófaktorként növelte a ISZB kialakulását (133). A retrospektív Reykjavik Study 987 betegénél (134) magas (>1000 µgL-1) MBL koncentráció mellett lényegesen csökkent a MI kialakulásának esélye (OR: 0,64; P<0,001). Albert és munkatársai viszont nem találtak összefüggést az MBL koncentráció és a betegek által jelentett perifériás érbetegség kialakulása között (135). Ezen tanulmányok C. pneumoniae szerostátuszt nem vizsgáltak. Alacsony MBL szint aterogén szerepét az magyarázhatja, hogy a krónikus gyulladás fennállására nagyobb a lehetőség, ha a deficiens MBL kevésbé véd például az infektív ágensek ellen.

Eredményeink, reprodukálhatóságuk esetén, segítenének megmagyarázni a C. pneumoniae és a CAD ellentmondásos összefüggését, ugyanis az egészséges populáció

59

C. pneumoniae magas fertőzöttsége miatt a relatíve alacsony odds ratio ellentmondásos eredményekhez vezethet.

CRP-nek és α-hsp60-nak nincs szerepe a vizsgált mechanizmusban Egyes vizsgálatok a diszfunkcionáris érszakaszon CRP vagy degradált, nonoxidált-LDL kötését

és

következményes

komplement

aktivációt

tartanak

fontosnak

az

ateroszklerotikus folyamat hátterében (136,137). Jelen vizsgálat adatai alapján viszont azt mondhatjuk, hogy a C. pneumoniae fertőzés és az MBL polimorfizmus interakciója nem CRP és hsp60 antitestek által mediáltan fejti ki hatását az ateroszklerózis progressziójára.

Feltételezett mechanizmus MBL deficienciának szerepe lehet a Chlamydia fertőzés kialakulásában, mivel a baktérium felszínén az MBL fehérje szénhidrát felismerő doménje által felismerhető struktúrák találhatóak meg (119). In vitro kísérletekben az MBL gátolta a C. pneumoniae intracelluláris felvételét (119). Vizsgálatunkban az MBL direkt C. pneumoniae fertőzés elleni protektív hatása nem volt megfigyelhető, ami érthető is, hiszen az egészséges populáció szeropozitivitása meghaladja a 60 %-ot. Az élet során legtöbbünk fertőződik C. pneumoniae-vel, sokan reinfektálódnak is (138). A korábbi feltételezésekkel ellentétben (120) az MBL inkább a Chlamydia fertőzés súlyosságának befolyásolásában játszhat szerepet, mintsem a betegség ellen véd. Úgy tudjuk, hogy a tüdőben nem található MBL (139,140), de elképzelhető, hogy gátolja a monocyta/ makrofágok által közvetített tüdőből a vérbe illetve végső soron az érfalba mutató disszeminációt. Ezen kívül ateroszklerózisban az érfalban meglévő krónikus gyulladás során az MBL a C. pneumoniae fertőzésre, vagy egyéb stimulusra adott immunválaszt is modulálhatja mivel kísérletes eredmények azt mutatják, hogy az MBL módosíthatja a cytokin választ (141), illetve korábban kimutatták, hogy a rheumatoid arthritishez társult gyulladást erősen befolyásolja az MBL in vivo (142).

Jelen vizsgálat eredményei szerint az ateroszklerotikus folyamat szempontjából a Chlamydia önmagában ártalmatlan faktor, de egyéb tényezők együttes hatásaként

60

(például az MBL deficiencia) képes a koronáriabetegség progressziójának alakítására. Hasonló megfigyelést tettek állatkísérletes adatok alapján (143), miszerint C. pneumoiae-vel atherosclerosist nehéz indukálni, de egyéb atherogén faktorok adjuvánsaként működik.

Megfigyeléseinket nagy prospektív vizsgálatok adatainak kell megerősítenie mielőtt a végleges következtetést levonhatjuk. Amennyiben feltevésünk igaznak bizonyul, a Chlamydia pneumoniae szeropozitív koronáriabetegek MBL génpolimorfizmusának meghatározásával identifikálhatóvá válna a betegek azon csoportja, akik az antibiotikum terápiától a legtöbbet profitál.

2.4.2. Az MBL allélek és a carotis endarterectomia utáni restenosis közti összefüggés

A nem szerepe a restenosisban Más vizsgálatok is a restenosis kialakulására rizikófaktorként tartották számon a női nemet (144). Adataink szerint nemi különbség csak az A/A genotípus hordozás esetén látható, és mivel a genotípus erősen meghatározza a fehérjekoncentrációt, ezért az összefüggés átfordítható egyszerűen mérhető plazmaszintre is. A retrospektív analízisben (2. betegcsoport) több, mint 2,5 évvel a műtét után is tapasztalható a homozigóta vad allél összefüggése a restenosis kialakulásával. Ebben a vizsgálatban, adatok híján, a nemi különbségek nem voltak vizsgálhatóak. A nemek közti különbség patofiziológiai háttere ismeretlen, de tekintve az érfalban zajló gyulladás komplex mulifaktoriális eredetét, ez a jelenség is valószínűleg genetikai és hormonális faktorok közötti kölcsönhatás eredményeként jöhet létre, és természetesen az sem zárható ki, hogy linkage disequilibrium áll fenn valamely más génnel a 10 kromoszómán.

Chlamydia nincs hatással a carotis restenosisra Több vizsgálat is felvetette a C. pneumoniae és a cerebrovascularis betegségek közötti kapcsolatot. Korábbi vizsgálatunk eredménye szerint a C. pneumoniae csak az MBL variáns allél hordozókban jelentett rizikót a kardiovaszkuláris betegség progressziójára. 61

Jelen adataink bizonyos mértékig szintén alátámasztják ezen felvetést: mindhárom beteg, aki a követési idő alatt miokardiális infarktust kapott MBL variáns allélt hordozott és C. pneumoniae pozitív volt, bár e faktorok együttes jelenléte a többi beteg kevesebb, mint negyedében volt jelen. Másrészről a műtétre került betegek és az egészséges kontrollok között a C. pneumoniae szerostátuszban különbség nem ábrázolódott, valamint a Chlamydia fertőzöttség és az MBL genotípus között sem lehetett kapcsolatot találni. Adataink szerint a kialakult restenosis mértékére nincs hatással a Chlamydia szerostátusz.

Súlyos

miokardiális

infarktus

összefüggésben

áll

a

C.

pneumoniae

szeropozitivitással és az MBL variáns allél hordozással Kis elemszámú alcsoportok analíziséből önmagában véleményt nem lehet mondani, de az 1. betegcsoport vizsgálatakor ábrázolt összefüggést erősíti meg a jelenség. A követési idő alatt ebben a betegcsoportban 3 miokardiális infarktust regisztráltunk és mindegyikük C. pneumoniae pozitívnak bizonyult. Mindhárom beteg exitált. A többi variáns allélt hordozó és C. pneumoniae pozitív betegnél nem alakult ki infarktus (27/117).

Lehetséges patofiziológiai magyarázat – a komplement aktiváció szerepe Az erős statisztikai összefüggés patofiziológiai alapja ismeretlen, bár a komplement rendszer MASP2 általi aktivációja valószínűleg szerepet játszhat benne (96). A komplement rendszer szerepe vetődött fel iszkémia-reperfúzió esetén kísérletes modellekben (103) továbbá, hogy a komplement MBL általi aktivációja gyanítható (102). Endotél sejtek hipoxiája és reoxigenációja MBL-dependens komplement aktivációt okozott, továbbá az MBL gátlása jelentősen csökkentette a miokardiális reperfúziós sérülést patkányban (103). A műtétet követő 2 éven belül azonos helyszínen re-obstructiót okozó elváltozásokat neointimalis hypeplasia okozza. A neointimalis hyperplasia folyamatos aktivációsgyulladásos szignál esetén alakul normál repair mechanizmusból patológiás folyamattá. Két év után problémát jelentő postoperatív elváltozások hátterében gyakran ismét ateromát találhatunk (145).

62

Fiane és munkatársai jelentős fokú komplement aktivációt és citokin termelést mértek thoracoabdominalis aneurisma műtét utáni állapotban (146). A műtét alatti aortalefogás okán lehet a műtétet a fent hivatkozott iszkémia-reperfúzió humán modelljeként is értelmezni. Eredményeik azt mutatták, hogy elmaradt a komplement aktiváció, és alacsony citokin termelést kaptak MBL deficiens (<100 µgL-1) betegek esetén. Az eversiós endarterectomia során rövid idejű (15-20 perc) érlefogás történt, mely felengedése után az érintett területen (magában a lefogott érfalban is – vasa vasorum) iszkémiás-reperfúziós károsodás következik be. A feltételezett mechanizmus szerint hipoxiás endotél aktiváció, majd MBL általi komplement aktiváció következhet be. Komplement deponálódik a károsodott felülethez és a komplement anafilatoxinok (pl. C5a) fenntartják az endotél aktivációt, mely így többek között citokineket, növekedési faktorokat termel. Mindezek proliferatív hatásúak simaizom sejtekre, és azok migrációját, illetve mátrix termelését serkentve a neointima kialakulás felé terelik az érfali gyulladást (147).

Ezen gondolatmenet folytatásaként azt feltételezhetjük, hogy a homozigóta vad (A/A) genotípusú betegek, akiknek magas MBL szintje van erős komplementaktivációs képességűek. Náluk nagyobb eséllyel következhet be erős immunválasz, érfaligyulladás és végső soron restenosis.

A vad vagy a variáns MBL allél protektív hatású? Az ateroszklerotikus illetve a restenoticus folyamat különböző. a) Súlyos koszorúér betegek követéses vizsgálata által nyert adataink azt mutatták, hogy a defektív (O) allél hordozása a C. pneumoniae szeropozitivitással együttesen emekedett rizikót jelent az ateroszklerotikus folymat kialakulására, valamint a betegség progressziójára is.

b) Retrospektív és a prospektív vizsgálatunk is azt mutatja, hogy carotis szűkület miatt eversiós endarterectomiára kerülő betegek közül az MBL vad allélt hordozó homozigótáknak nagyobb esélye van a korai restenosis kialakulására, mint a legalább 1 funkcionálisan defektív variáns allélt hordozóknak.

63

A két érfali folyamat nem azonos. Az ateroszklerózisban esetlegesen szerepet játszó infektív faktorok (esetleg ezek összeadódó összege) akkor jelenthetnek emelkedett rizikót, ha gyenge az immunválasz (defektív O allél hordozás), míg folyamatos gyulladás és következményes restenosis erős immunválaszra képes genotípus (A) esetén alakulhat ki nagyobb eséllyel.

A vizsgálatok ereje Igyekeztünk ezen multifaktoriális betegség progresszióját és esetlegesen kialakulását is hatások eredőjével modellezni, és nem önálló faktorok hatásait vizsgálni. Összehasonlítva

a

súlyos

koszorúér

betegek

prospektív

vizsgálatával

az

endarterectomiás követéses vizsgálat pontosabban tervezett és gondosan szervezett vizsgálat volt, jobban ügyeltünk az orvosi vizitek alatt végzett adatgyűjtésre. Azonos ultrahangos szakember végezte a méréseket. Az eseményekről orvosi dokumentálásból értesültünk.

A vizsgálatok gyöngesége MIndhárom vizsgált betegpopuláció relatíve kis számú volt, és ezért relatíve kevés volt a megfigyelt esemény is. A súlyos koszorúér betegektől kérdőív útján nyert információknál biztosan pontosabb lenne az orvosi dokumentáció követése, bár ezen egyszerű végpontok felmérését laikus válaszolókkal is kivitelezhetőnek tartjuk. Nagyobb,

esetleg

több

centrumra

kiterjedő

bizonyításához.

64

vizsgálat

szükséges

a

jelenség

2.5. Következtetések 2.5.1. Az eredmények összefoglalása 1) Elsőként vizsgáltuk a Chlamydia pneumoniae és MBL kapcsolatát érbetegségben. 2) Nemre, korra, dohányzásra, koleszterinszintre való adjusztálás után is szignifikáns odds ratio (2.63 [1,07-6,44]) mutatkozott a C. pneumoniae szeropozitívak és negatívak között koronáriabetegség kialakulására, de ez csak a variáns MBL allélt hordozók csoportjában (A/O és O/O) volt jelen. 3) A követéses vizsgálatban súlyos esemény, vagyis a betegség progressziója, – melyet miokardiális infarktus, ismételt revaszkularizáció, illetve a kardiovaszkuláris halálozás meglétével jellemeztünk – nagyobb valószínűséggel fordult elő az MBL variáns allélt hordozók között Chlamydia pneumoniae pozitívitás együttes fennállása esetén (adjusztált OR: 2,4 [0,96-5,96]; p=0,060). 4) A retrospektív vizsgálat adatai szerint carotis restenosis kialakulása a variáns MBL O-allél hordozók között szignifikánsan alacsonyabb a kontrollhoz képest (p=0,024). A hatás géndózis függő, vagyis a homozigóta (O/O) hordozók védettebbek, mint akik heterozigóták az MBL variáns allél tekintetében (p=0,007). A hat homozigóta O/O hordozó közül egynél sem alakult ki restenosis. 5) Követéses vizsgálat adatai szerint homozigóta vad MBL allélt (A/A) hordozó nőkben már a 7. hónapos vizit idején carotis szűkület mutatkozott a heterozigóta vad, illetve a homozigóta variáns allélt (A/O, O/O) hordozókhoz képest (p<0,01), és ez a tendencia folytatódott a követési idő végéig (p<0,001). Férfiak esetén statisztikai különbség csak a követési idő végén mérhető (p<0,05).

65

2.5.2. Következtetések

1. Van-e összefüggés az ISZB és a Chlamydia fertőzés, valamint az MBL variáns allél hordozás között? 2. Van-e összefüggés az ISZB progressziója és a Chlamydia fertőzés, valamint az MBL variáns allél hordozás között? Súlyos

koszorúérbetegek

követéses

vizsgálatával

nyert

adataink

alapján

megalapozottnak tartjuk a hipotézist, hogy az MBL deficienciának (variáns O allél hordozása) komoly szerepe lehet, a Chlamydia pneumoniae fertőzéssel együtt, az iszkémiás szívbetegség progressziójának alakulásában és esetleg az ateroszklerotikus folyamat kialakulásában is.

3. Van-e összefüggés valamely MBL allélek és a carotis endarterectomia utáni restenosis között? Carotis ateroszklerózis műtéti megoldása után végzett követéses vizsgálatunk az kimutatta, hogy eversiós carotis endarterectomia utáni restenosis kialakulásában genetikai faktoroknak, és közte a mannóz kötő fehérjének is lehet szerepe, mivel az A/A vad genotípus hordozása szignifikánsan magasabb rizikót jelentett a korai restenosis kialakulására nők esetén, mint a defektív variáns allél. A hatás géndózis függőnek bizonyult.

66

3. K Ö S Z Ö N E T N Y I L V Á N Í T Á S

Abban, hogy a további életemre meghatározó időszak zárulhat most le döntő szerepe Füst György Professzor Úrnak van. Munkalehetőséget biztosított számomra a kutatólaboratóriumban, tapasztalt bölcsességével irányította és segítette munkámat a gondolatoktól a publikációig. Köszönöm a klinikus partnereknek, de különösen Dósa Editnek a gondos szakszerű munkát, amellyel kivitelezte a vizsgálatot. Hálával tartozom Duba Jenő főorvos Úrnak és Prohászka Zoltánnak, hogy alapos gondoskodásuknak hála lehetőség volt az 1995ben kezdett adatgyűjtés folytatására. Köszönet a számtalan átgondolkozott, végigvitatkozott baráti hangulatban eltöltött óráért a labor falain belül és kívül, valamint a leírhatatlan segítségért Cervenak László barátomnak. Az értekezés elkészítése közben nyújtott segítségükért külön köszönet illeti meg kedves kollégáimat: Blaskó Bernadettet, Laki Juditot és Kovács Margitot és tisztelettel köszönöm Jánoskúti Lívia Docensasszonynak az értekezést érintő számtalan értékes észrevételt, mely által lényegesen javult a dolgozat. Hálával tartozom Karádi István és Romics László Professzor Uraknak, hogy támogatták munkámat. Örömmel gondolok mindig a legvidámabb kollégáimra, köszönöm, hogy velük dolgozhattam:, Kiszel Petra, Bíró Adrienn, Oroszlán Melinda, Herczenik Eszter, Udvarnoki Katalin, Veres Amarilla, Nagyné Vers Mária, Szigeti Antallné, Dóczy Andrásné, Farkas Henriette, Varga Lilian, Széplaki Gábor. Köszönöm barátaimnak a támogatását és nógatását, ami segített továbbgördülni, amikor elakadtam a dolgozat írása közben. Soha nem szűnő tisztelet és hála illeti szüleimet, nagyszüleimet, testvéremet. Azt, hogy napokat, heteket és még több időt tölthettem, illetve tölthetek a vizsgálatokkal egyedül Feleségem segítsége teszi lehetővé, aki szüntelen mosollyal terelgeti gyakran helyettem is Nórát és Jankát.

67

4. I R O D A L O M J E G Y Z É K

1. MURRAY CJ és Lopez AD. Alternative projections of mortality and disability by cause 19902020: Global Burden of Disease Study. Lancet. 1997. 349:1498-1504. 2. BENDITT EP és Benditt JM. Evidence for a monoclonal origin of human atherosclerotic plaques. Proc Natl Acad Sci U S A. 1973. 70:1753-1756. 3. KÁDÁR A és Glasz T. Az Atherothrombosis Patológiai - Patobiokémiai Alapjai. in Az Atherothrombosis; Patofiziológiai alapoktól a prevencióig. Eds: Blaskó, Gy. Pharma Press Kft., Budapest, 2004. pp.7-56. 4. ROSS R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature. 1993. 362:801809. 5. STARY HC; Chandler AB; Dinsmore RE; Fuster V; Glagov S; Insull W, Jr.; Rosenfeld ME; Schwartz CJ; Wagner WD; Wissler RW. A definition of advanced types of atherosclerotic lesions and a histological classification of atherosclerosis. A report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association. Circulation. 1995. 92:1355-1374. 6. STARY HC; Chandler AB; Glagov S; Guyton JR; Insull W, Jr.; Rosenfeld ME; Schaffer SA; Schwartz CJ; Wagner WD; Wissler RW. A definition of initial, fatty streak, and intermediate lesions of atherosclerosis. A report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association. Circulation. 1994. 89:2462-2478. 7. SMITH JD; Trogan E; Ginsberg M; Grigaux C; Tian J; Miyata M. Decreased atherosclerosis in mice deficient in both macrophage colony-stimulating factor (op) and apolipoprotein E. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995. 92:8264-8268. 8. HANSSON GK. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. N Engl J Med. 2005. 352:1685-1695. 9. STEMME S; Faber B; Holm J; Wiklund O; Witztum JL; Hansson GK. T lymphocytes from human atherosclerotic plaques recognize oxidized low density lipoprotein. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995. 92:3893-3897. 10. XU Q. Role of heat shock proteins in atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002. 22:1547-1559. 11. DE BOER OJ; van der Wal AC; Houtkamp MA; Ossewaarde JM; Teeling P; Becker AE. Unstable atherosclerotic plaques contain T-cells that respond to Chlamydia pneumoniae. Cardiovasc Res. 2000. 48:402-408. 12. SKALEN K; Gustafsson M; Rydberg EK; Hulten LM; Wiklund O; Innerarity TL; Boren J. Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis. Nature. 2002. 417:750-754. 13. NAKASHIMA Y; Raines EW; Plump AS; Breslow JL; Ross R. Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1998. 18:842-851.

68

14. DAI G; Kaazempur-Mofrad MR; Natarajan S; Zhang Y; Vaughn S; Blackman BR; Kamm RD; Garcia-Cardena G; Gimbrone MA, Jr. Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004. 101:14871-14876. 15. MASSBERG S; Brand K; Gruner S; Page S; Muller E; Muller I; Bergmeier W; Richter T; Lorenz M; Konrad I; Nieswandt B; Gawaz M. A critical role of platelet adhesion in the initiation of atherosclerotic lesion formation. J Exp Med. 2002. 196:887-896. 16. JABS WJ; Theissing E; Nitschke M; Bechtel JFM; Duchrow M; Mohamed S; Jahrbeck B; Sievers HH; Steinhoff J; Bartels C. Local Generation of C-Reactive Protein in Diseased Coronary Artery Venous Bypass Grafts and Normal Vascular Tissue. Circulation. 2003. 108:14281431. 17. WANG TJ; Larson MG; Levy D; Benjamin EJ; Kupka MJ; Manning WJ; Clouse ME; D'Agostino RB; Wilson PWF; O'Donnell CJ. C-Reactive Protein Is Associated With Subclinical Epicardial Coronary Calcification in Men and Women: The Framingham Heart Study. Circulation. 2002. 106:1189-1191. 18. TZOULAKI I; Murray GD; Lee AJ; Rumley A; Lowe GDO; Fowkes FG. C-Reactive Protein, Interleukin-6, and Soluble Adhesion Molecules as Predictors of Progressive Peripheral Atherosclerosis in the General Population: Edinburgh Artery Study. Circulation. 2005. 112:976-983. 19. PEARSON TA; Mensah GA; Alexander RW; Anderson JL; Cannon RO, III; Criqui M; Fadl YY; Fortmann SP; Hong Y; Myers GL; Rifai N; Smith SC, Jr.; Taubert K; Tracy RP; Vinicor F. Markers of Inflammation and Cardiovascular Disease: Application to Clinical and Public Health Practice: A Statement for Healthcare Professionals From the Centers for Disease Control and Prevention and the American Heart Association. Circulation. 2003. 107:499511. 20. DAMAS JK; Waehre T; Yndestad A; Otterdal K; Hognestad A; Solum NO; Gullestad L; Froland SS; Aukrust P. Interleukin-7-mediated inflammation in unstable angina: possible role of chemokines and platelets. Circulation. 2003. 107:2670-2676. 21. AUKRUST P; Muller F; Ueland T; Berget T; Aaser E; Brunsvig A; Solum NO; Forfang K; Froland SS; Gullestad L. Enhanced levels of soluble and membrane-bound CD40 ligand in patients with unstable angina. Possible reflection of T lymphocyte and platelet involvement in the pathogenesis of acute coronary syndromes. Circulation. 1999. 100:614-620. 22. HELTAI K; Gönczöl É; Vályi-Nagy I. Infekció. in Atherosclerosis. Eds: Császár, A. Synergo Kiadó és Marketing Kft., Budapest, 2005. pp.80-89. 23. Chlamydial diseases. in The Merck Manual of Medical Therapy. 17th. edition. Eds: Beers, M. H. and Berkow, R. Merck Research Laboratories, Whitehouse Station,N.J., 1999. pp.1237-1237. 24. SAIKKU P; Leinonen M; Mattila K; Ekman MR; Nieminen MS; Makela PH; Huttunen JK; Valtonen V. Serological evidence of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with chronic coronary heart disease and acute myocardial infarction. Lancet. 1988. 2:983-986. 25. CAMPBELL LA; O'Brien ER; Cappuccio AL; Kuo CC; Wang SP; Stewart D; Patton DL; Cummings PK; Grayston JT. Detection of Chlamydia pneumoniae TWAR in human coronary atherectomy tissues. J Infect Dis. 1995. 172:585-588. 26. BLASI F; Denti F; Erba M; Cosentini R; Raccanelli R; Rinaldi A; Fagetti L; Esposito G; Ruberti U; Allegra L. Detection of Chlamydia pneumoniae but not Helicobacter pylori in atherosclerotic plaques of aortic aneurysms. J Clin Microbiol. 1996. 34:2766-2769.

69

27. JACKSON LA; Campbell LA; Kuo CC; Rodriguez DI; Lee A; Grayston JT. Isolation of Chlamydia pneumoniae from a carotid endarterectomy specimen. J Infect Dis. 1997. 176:292-295. 28. KUO CC; Coulson AS; Campbell LA; Cappuccio AL; Lawrence RD; Wang SP; Grayston JT. Detection of Chlamydia pneumoniae in atherosclerotic plaques in the walls of arteries of lower extremities from patients undergoing bypass operation for arterial obstruction. J Vasc Surg. 1997. 26:29-31. 29. SHI Y és Tokunaga O. Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) infection upregulates atherosclerosis-related gene expression in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Atherosclerosis. 2004. 177:245-253. 30. HSICH E; Zhou YF; Paigen B; Johnson TM; Burnett MS; Epstein SE. Cytomegalovirus infection increases development of atherosclerosis in Apolipoprotein-E knockout mice. Atherosclerosis. 2001. 156:23-28. 31. MORRE SA; Stooker W; Lagrand WK; van den Brule AJC; Niessen HWM. Microorganisms in the aetiology of atherosclerosis. J Clin Pathol. 2000. 53:647-654. 32. OSHIMA T; Ozono R; Yano Y; Oishi Y; Teragawa H; Higashi Y; Yoshizumi M; Kambe M. Association of Helicobacter pylori infection with systemic inflammation and endothelial dysfunction in healthy male subjects. J Am Coll Cardiol. 2005. 45:1219-1222. 33. ZHU J; Nieto FJ; Horne BD; Anderson JL; Muhlestein JB; Epstein SE. Prospective study of pathogen burden and risk of myocardial infarction or death. Circulation. 2001. 103:45-51. 34. ZHU J; Quyyumi AA; Norman JE; Csako G; Waclawiw MA; Shearer GM; Epstein SE. Effects of total pathogen burden on coronary artery disease risk and C-reactive protein levels. Am J Cardiol. 2000. 85:140-146. 35. ANDRAWS R; Berger JS; Brown DL. Effects of Antibiotic Therapy on Outcomes of Patients With Coronary Artery Disease: A Meta-analysis of Randomized Controlled Trials. JAMA. 2005. 293:2641-2647. 36. Cardiovascular Surgery and Percutaneous Interventional Techniques. in The Merck Manual of Geriatrics. 17th. edition. Eds: Beers, M. H. Merck Research Laboratories, Whitehouse Station,N.J., 1999. pp.http://www.merck.com/mrkshared/mmg/sec11/ch96/ch96b.jsp37. PAPP E; Késmárky G; Tóth K. Restenosis. in Atherosclerosis. Eds: Császár, A. Synergo Kiadó és Marketing Kft., Budapest, 2004. pp.179-187. 38. SZABO A; Brazda E; Dosa E; Apor A; Szabolcs Z; Entz L. Long-term restenosis rate of eversion endarterectomy on the internal carotid artery. Eur J Vasc Endovasc Surg. 2004. 27:537-539. 39. KORNOWSKI R; Hong MK; Tio FO; Bramwell O; Wu H; Leon MB. In-stent restenosis: contributions of inflammatory responses and arterial injury to neointimal hyperplasia. J Am Coll Cardiol. 1998. 31:224-230. 40. ROGERS C; Welt FG; Karnovsky MJ; Edelman ER. Monocyte recruitment and neointimal hyperplasia in rabbits. Coupled inhibitory effects of heparin. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1996. 16:1312-1318. 41. BUFFON A; Liuzzo G; Biasucci LM; Pasqualetti P; Ramazzotti V; Rebuzzi AG; Crea F; Maseri A. Preprocedural serum levels of C-reactive protein predict early complications and late restenosis after coronary angioplasty. J Am Coll Cardiol. 1999. 34:1512-1521.

70

42. ORFORD JL; Selwyn AP; Ganz P; Popma JJ; Rogers C. The comparative pathobiology of atherosclerosis and restenosis. Am J Cardiol. 2000. 86:6H-11H. 43. AUSTIN GE; Ratliff NB; Hollman J; Tabei S; Phillips DF. Intimal proliferation of smooth muscle cells as an explanation for recurrent coronary artery stenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty. J Am Coll Cardiol. 1985. 6:369-375. 44. FORRESTER JS; Fishbein M; Helfant R; Fagin J. A paradigm for restenosis based on cell biology: clues for the development of new preventive therapies. J Am Coll Cardiol. 1991. 17:758-769. 45. DOSA E; Rugonfalvi-Kiss S; Prohaszka Z; Szabo A; Karadi I; Selmeci L; Romics L; Fust G; Acsady G; Entz L. Marked decrease in the levels of two inflammatory markers, hs-C-reactive protein and fibrinogen in patients with severe carotid atherosclerosis after eversion carotid endarterectomy. Inflamm Res. 2004. 53:631-635. 46. WALPORT MJ. Complement- First of Two Parts. N Engl J Med. 2001. 344:1058-1066. 47. MATSUSHITA M; Endo Y; Fujita T. Cutting edge: complement-activating complex of ficolin and mannose-binding lectin-associated serine protease. J Immunol. 2000. 164:2281-2284. 48. MATSUSHITA M; Kuraya M; Hamasaki N; Tsujimura M; Shiraki H; Fujita T. Activation of the lectin complement pathway by H-ficolin (Hakata antigen). J Immunol. 2002. 168:3502-3506. 49. DAHL MR; Thiel S; Matsushita M; Fujita T; Willis AC; Christensen T; Vorup-Jensen T; Jensenius JC. MASP-3 and its association with distinct complexes of the mannan-binding lectin complement activation pathway. Immunity. 2001. 15:127-135. 50. MATSUSHITA M és Fujita T. Cleavage of the third component of complement (C3) by mannosebinding protein-associated serine protease (MASP) with subsequent complement activation. Immunobiology. 1995. 194:443-448. 51. ROSSI V; Cseh S; Bally I; Thielens NM; Jensenius JC; Arlaud GJ. Substrate specificities of recombinant mannan-binding lectin-associated serine proteases-1 and -2. J Biol Chem. 2001. 276:40880-40887. 52. FUJITA T. Evolution of the lectin-complement pathway and its role in innate immunity. Nat Rev Immunol. 2002. 2:346-353. 53. JANEWAY CA, Jr. és Medzhitov R. Innate immune recognition. Annu Rev Immunol. 2002. 20:197216. 54. CLEMENS MJ és Elia A. The double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR: structure and function. J Interferon Cytokine Res. 1997. 17:503-524. 55. SCHWALBE RA; Dahlback B; Coe JE; Nelsestuen GL. Pentraxin family of proteins interact specifically with phosphorylcholine and/or phosphorylethanolamine. Biochemistry. 1992. 31:4907-4915. 56. CEBO C; Vergoten G; Zanetta JP. Lectin activities of cytokines: functions and putative carbohydrate-recognition domains. Biochim Biophys Acta. 2002. 1572:422-434. 57. KILPATRICK DC. Mannan-binding lectin and its role in innate immunity. Transfus Med. 2002. 12:335-352. 58. HOLMSKOV U; Thiel S; Jensenius JC. Collections and ficolins: humoral lectins of the innate immune defense. Annu Rev Immunol. 2003. 21:547-578.

71

59. VAN DE WETERING JK; van Golde LM; Batenburg JJ. Collectins: players of the innate immune system. Eur J Biochem. 2004. 271:1229-1249. 60. UEMURA K; Saka M; Nakagawa T; Kawasaki N; Thiel S; Jensenius JC; Kawasaki T. L-MBP is expressed in epithelial cells of mouse small intestine. J Immunol. 2002. 169:6945-6950. 61. OHTANI K; Suzuki Y; Eda S; Kawai T; Kase T; Yamazaki H; Shimada T; Keshi H; Sakai Y; Fukuoh A; Sakamoto T; Wakamiya N. Molecular cloning of a novel human collectin from liver (CLL1). J Biol Chem. 1999. 274:13681-13689. 62. HOLMSKOV U; Malhotra R; Sim RB; Jensenius JC. Collectins: collagenous C-type lectins of the innate immune defense system. Immunol Today. 1994. 15:67-74. 63. TEILLET F; Dublet B; Andrieu JP; Gaboriaud C; Arlaud GJ; Thielens NM. The two major oligomeric forms of human mannan-binding lectin: chemical characterization, carbohydrate-binding properties, and interaction with MBL-associated serine proteases. J Immunol. 2005. 174:2870-2877. 64. HAKANSSON K és Reid KB. Collectin structure: a review. Protein Sci. 2000. 9:1607-1617. 65. BERMAN HM; Westbrook J; Feng Z; Gilliland G; Bhat TN; Weissig H; Shindyalov IN; Bourne PE. The Protein Data Bank. Nucl Acids Res. 2000. 28:235-242. 66. WALLIS R és Drickamer K. Molecular determinants of oligomer formation and complement fixation in mannose-binding proteins. J Biol Chem. 1999. 274:3580-3589. 67. KURATA H; Sannoh T; Kozutsumi Y; Yokota Y; Kawasaki T. Structure and function of mannanbinding proteins isolated from human liver and serum. J Biochem (Tokyo). 1994. 115:11481154. 68. SASTRY K; Herman GA; Day L; Deignan E; Bruns G; Morton CC; Ezekowitz RA. The human mannose-binding protein gene. Exon structure reveals its evolutionary relationship to a human pulmonary surfactant gene and localization to chromosome 10. J Exp Med. 1989. 170:1175-1189. 69. GUO N; Mogues T; Weremowicz S; Morton CC; Sastry KN. The human ortholog of rhesus mannose-binding protein-A gene is an expressed pseudogene that localizes to chromosome 10. Mamm Genome. 1998. 9:246-249. 70. TAYLOR ME; Brickell PM; Craig RK; Summerfield JA. Structure and evolutionary origin of the gene encoding a human serum mannose-binding protein. Biochem J. 1989. 262:763-771. 71. NAITO H; Ikeda A; Hasegawa K; Oka S; Uemura K; Kawasaki N; Kawasaki T. Characterization of human serum mannan-binding protein promoter. J Biochem (Tokyo). 1999. 126:1004-1012. 72. SUMIYA M; Super M; Tabona P; Levinsky RJ; Arai T; Turner MW; Summerfield JA. Molecular basis of opsonic defect in immunodeficient children. Lancet. 1991. 337:1569-1570. 73. LIPSCOMBE RJ; Sumiya M; Hill AV; Lau YL; Levinsky RJ; Summerfield JA; Turner MW. High frequencies in African and non-African populations of independent mutations in the mannose binding protein gene. Hum Mol Genet. 1992. 1:709-715. 74. WALLIS R. Dominant effects of mutations in the collagenous domain of mannose-binding protein. J Immunol. 2002. 168:4553-4558.

72

75. YOKOTA Y; Arai T; Kawasaki T. Oligomeric structures required for complement activation of serum mannan-binding proteins. J Biochem (Tokyo). 1995. 117:414-419. 76. MADSEN HO; Garred P; Kurtzhals JA; Lamm LU; Ryder LP; Thiel S; Svejgaard A. A new frequent allele is the missing link in the structural polymorphism of the human mannan-binding protein. Immunogenetics. 1994. 40:37-44. 77. WALLIS R és Cheng JY. Molecular defects in variant forms of mannose-binding protein associated with immunodeficiency. J Immunol. 1999. 163:4953-4959. 78. STEFFENSEN R; Thiel S; Varming K; Jersild C; Jensenius JC. Detection of structural gene mutations and promoter polymorphisms in the mannan-binding lectin (MBL) gene by polymerase chain reaction with sequence-specific primers. J Immunol Methods. 2000. 241:33-42. 79. MADSEN HO; Satz ML; Hogh B; Svejgaard A; Garred P. Different molecular events result in low protein levels of mannan-binding lectin in populations from southeast Africa and South America. J Immunol. 1998. 161:3169-3175. 80. MADSEN HO; Garred P; Thiel S; Kurtzhals JA; Lamm LU; Ryder LP; Svejgaard A. Interplay between promoter and structural gene variants control basal serum level of mannanbinding protein. J Immunol. 1995. 155:3013-3020. 81. CASANOVA JL és Abel L. Human Mannose-binding Lectin in Immunity: Friend, Foe, or Both? J Exp Med. 2004. 199:1295-1299. 82. TURNER MW; Dinan L; Heatley S; Jack DL; Boettcher B; Lester S; McCluskey J; Roberton D. Restricted polymorphism of the mannose-binding lectin gene of indigenous Australians. Hum Mol Genet. 2000. 9:1481-1486. 83. MATSUSHITA M; Miyakawa H; Tanaka A; Hijikata M; Kikuchi K; Fujikawa H; Arai J; Sainokami S; Hino K; Terai I; Mishiro S; Gershwin ME. Single nucleotide polymorphisms of the mannose-binding lectin are associated with susceptibility to primary biliary cirrhosis. J Autoimmun. 2001. 17:251-257. 84. THIEL S; Bjerke T; Hansen D; Poulsen LK; Schiotz PO; Jensenius JC. Ontogeny of human mannan-binding protein, a lectin of the innate immune system. Pediatr Allergy Immunol. 1995. 6:20-23. 85. TERAI I és Kobayashi K. Perinatal changes in serum mannose-binding protein (MBP) levels. Immunol Lett. 1993. 38:185-187. 86. KILPATRICK DC; James VS; Blackwell CC; Weir DM; Hallam NF; Busuttil A. Mannan binding lectin and the sudden infant death syndrome. Forensic Sci Int. 1998. 97:135-138. 87. THIEL S; Holmskov U; Hviid L; Laursen SB; Jensenius JC. The concentration of the C-type lectin, mannan-binding protein, in human plasma increases during an acute phase response. Clin Exp Immunol. 1992. 90:31-35. 88. HANSEN TK; Thiel S; Dall R; Rosenfalck AM; Trainer P; Flyvbjerg A; Jorgensen JO; Christiansen JS. GH strongly affects serum concentrations of mannan-binding lectin: evidence for a new IGF-I independent immunomodulatory effect of GH. J Clin Endocrinol Metab. 2001. 86:5383-5388. 89. PETERSLUND NA; Koch C; Jensenius JC; Thiel S. Association between deficiency of mannosebinding lectin and severe infections after chemotherapy. Lancet. 2001. 358:637-638.

73

90. NETH O; Hann I; Turner MW; Klein NJ. Deficiency of mannose-binding lectin and burden of infection in children with malignancy: a prospective study. Lancet. 2001. 358:614-618. 91. KILPATRICK DC; Starrs L; Moore S; Souter V; Liston WA. Mannan binding lectin concentration and risk of miscarriage. Hum Reprod. 1999. 14:2379-2380. 92. SUPER M; Gillies SD; Foley S; Sastry K; Schweinle JE; Silverman VJ; Ezekowitz RA. Distinct and overlapping functions of allelic forms of human mannose binding protein. Nat Genet. 1992. 2:50-55. 93. KURATA H; Cheng HM; Kozutsumi Y; Yokota Y; Kawasaki T. Role of the collagen-like domain of the human serum mannan-binding protein in the activation of complement and the secretion of this lectin. Biochem Biophys Res Commun. 1993. 191:1204-1210. 94. MA Y; Uemura K; Oka S; Kozutsumi Y; Kawasaki N; Kawasaki T. Antitumor activity of mannanbinding protein in vivo as revealed by a virus expression system: mannan-binding proteindependent cell-mediated cytotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999. 96:371-375. 95. LIPSCOMBE RJ; Sumiya M; Summerfield JA; Turner MW. Distinct physicochemical characteristics of human mannose binding protein expressed by individuals of differing genotype. Immunology. 1995. 85:660-667. 96. THIEL S; Vorup-Jensen T; Stover CM; Schwaeble W; Laursen SB; Poulsen K; Willis AC; Eggleton P; Hansen S; Holmskov U; Reid KB; Jensenius JC. A second serine protease associated with mannan-binding lectin that activates complement. Nature. 1997. 386:506-510. 97. SUPER M; Thiel S; Lu J; Levinsky RJ; Turner MW. Association of low levels of mannan-binding protein with a common defect of opsonisation. Lancet. 1989. 2:1236-1239. 98. OGDEN CA; deCathelineau A; Hoffmann PR; Bratton D; Ghebrehiwet B; Fadok VA; Henson PM. C1q and mannose binding lectin engagement of cell surface calreticulin and CD91 initiates macropinocytosis and uptake of apoptotic cells. J Exp Med. 2001. 194:781-795. 99. NAUTA AJ; Raaschou-Jensen N; Roos A; Daha MR; Madsen HO; Borrias-Essers MC; Ryder LP; Koch C; Garred P. Mannose-binding lectin engagement with late apoptotic and necrotic cells. Eur J Immunol. 2003. 33:2853-2863. 100. MALHOTRA R; Wormald MR; Rudd PM; Fischer PB; Dwek RA; Sim RB. Glycosylation changes of IgG associated with rheumatoid arthritis can activate complement via the mannosebinding protein. Nat Med. 1995. 1:237-243. 101. ROYLE L; Roos A; Harvey DJ; Wormald MR; Gijlswijk-Janssen D; Redwan e; Wilson IA; Daha MR; Dwek RA; Rudd PM. Secretory IgA N- and O-glycans provide a link between the innate and adaptive immune systems. J Biol Chem. 2003. 278:20140-20153. 102. COLLARD CD; Vakeva A; Morrissey MA; Agah A; Rollins SA; Reenstra WR; Buras JA; Meri S; Stahl GL. Complement Activation after Oxidative Stress : Role of the Lectin Complement Pathway. Am J Pathol. 2000. 156:1549-1556. 103. JORDAN JE; Montalto MC; Stahl GL. Inhibition of mannose-binding lectin reduces postischemic myocardial reperfusion injury. Circulation. 2001. 104:1413-1418. 104. GADJEVA M; Takahashi K; Thiel S. Mannan-binding lectin--a soluble pattern recognition molecule. Mol Immunol. 2004. 41:113-121.

74

105. MUTO S; Takada T; Matsumoto K. Biological activities of human mannose-binding lectin bound to two different ligand sugar structures, Lewis A and Lewis B antigens and high-mannose type oligosaccharides. Biochim Biophys Acta. 2001. 1527:39-46. 106. JACK DL; Read RC; Tenner AJ; Frosch M; Turner MW; Klein NJ. Mannose-binding lectin regulates the inflammatory response of human professional phagocytes to Neisseria meningitidis serogroup B. J Infect Dis. 2001. 184:1152-1162. 107. MILLER ME; Seals J; Kaye R; Levitsky LC. A familial plasma-associated defect of phagocytosis. Lancet. 1968. 2:60-63. 108. SUMMERFIELD JA; Sumiya M; Levin M; Turner MW. Association of mutations in mannose binding protein gene with childhood infection in consecutive hospital series. BMJ. 1997. 314:1229-1232. 109. KOCH A; Melbye M; Sorensen P; Homoe P; Madsen HO; Molbak K; Hansen CH; Andersen LH; Hahn GW; Garred P. Acute respiratory tract infections and mannose-binding lectin insufficiency during early childhood. JAMA. 2001. 285:1316-1321. 110. KAKKANAIAH VN; Shen GQ; Ojo-Amaize EA; Peter JB. Association of low concentrations of serum mannose-binding protein with recurrent infections in adults. Clin Diagn Lab Immunol. 1998. 5:319-321. 111. AITTONIEMI J; Rintala E; Miettinen A; Soppi E. Serum mannan-binding lectin (MBL) in patients with infection: clinical and laboratory correlates. APMIS. 1997. 105:617-622. 112. SIASSI M; Hohenberger W; Riese J. Mannan-binding lectin (MBL) serum levels and postoperative infections. Biochem Soc Trans. 2003. 31:774-775. 113. NIELSEN SL; Andersen PL; Koch C; Jensenius JC; Thiel S. The level of the serum opsonin, mannan-binding protein in HIV-1 antibody-positive patients. Clin Exp Immunol. 1995. 100:219-222. 114. GARRED P; Madsen HO; Balslev U; Hofmann B; Pedersen C; Gerstoft J; Svejgaard A. Susceptibility to HIV infection and progression of AIDS in relation to variant alleles of mannose-binding lectin. Lancet. 1997. 349:236-240. 115. MATSUSHITA M; Hijikata M; Matsushita M; Ohta Y; Mishiro S. Association of mannosebinding lectin gene haplotype LXPA and LYPB with interferon-resistant hepatitis C virus infection in Japanese patients. J Hepatol. 1998. 29:695-700. 116. KILPATRICK DC. Mannan-binding lectin: clinical significance and applications. Biochim Biophys Acta. 2002. 1572:401-413. 117. SANTOS IK; Costa CH; Krieger H; Feitosa MF; Zurakowski D; Fardin B; Gomes RB; Weiner DL; Harn DA; Ezekowitz RA; Epstein JE. Mannan-binding lectin enhances susceptibility to visceral leishmaniasis. Infect Immun. 2001. 69:5212-5215. 118. GARRED P; Harboe M; Oettinger T; Koch C; Svejgaard A. Dual role of mannan-binding protein in infections: another case of heterosis? Eur J Immunogenet. 1994. 21:125-131. 119. SWANSON AF; Ezekowitz RA; Lee A; Kuo CC. Human mannose-binding protein inhibits infection of HeLa cells by Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 1998. 66:1607-1612. 120. MADSEN HO; Videm V; Svejgaard A; Svennevig JL; Garred P. Association of mannose-bindinglectin deficiency with severe atherosclerosis. Lancet. 1998. 352:959-960.

75

121. HEGELE RA; Ban MR; Anderson CM; Spence JD. Infection-susceptibility alleles of mannosebinding lectin are associated with increased carotid plaque area. J Investig Med. 2000. 48:198-202. 122. KILPATRICK DC. Consensus statement on the future of mannan-binding lectin (MBL)replacement therapy. Biochem Soc Trans. 2003. 31:776123. RALLIDIS LS; Zolindaki MG; Manioudaki HS; Laoutaris NP; Velissaridou AH; Papasteriadis EG. Prognostic value of C-reactive protein, fibrinogen, interleukin-6, and macrophage colony stimulating factor in severe unstable angina. Clin Cardiol. 2002. 25:505-510. 124. SABETI S; Exner M; Mlekusch W; Amighi J; Quehenberger P; Rumpold H; Maurer G; Minar E; Wagner O; Schillinger M. Prognostic impact of fibrinogen in carotid atherosclerosis: nonspecific indicator of inflammation or independent predictor of disease progression? Stroke. 2005. 36:1400-1404. 125. RIDKER PM; Hennekens CH; Buring JE; Rifai N. C-reactive protein and other markers of inflammation in the prediction of cardiovascular disease in women. N Engl J Med. 2000. 342:836-843. 126. FRERICKS H; Kievit J; van Baalen JM; van Bockel JH. Carotid recurrent stenosis and risk of ipsilateral stroke: a systematic review of the literature. Stroke. 1998. 29:244-250. 127. BILLER J; Feinberg WM; Castaldo JE; Whittemore AD; Harbaugh RE; Dempsey RJ; Caplan LR; Kresowik TF; Matchar DB; Toole JF; Easton JD; Adams HP, Jr.; Brass LM; Hobson RW; Brott TG; Sternau L. Guidelines for carotid endarterectomy: a statement for healthcare professionals from a Special Writing Group of the Stroke Council, American Heart Association. Circulation. 1998. 97:501-509. 128. ENTZ L; Jaranyi S; Nemes A. Eversion endarterectomy in surgery of the internal carotid artery. Cardiovasc Surg. 1996. 4:190-194. 129. FRIEDEWALD JT; Levy RI; Fredrickson DS. Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of of the preparative ultracentrifuge. Clin Chem. 1972. 18:499-502. 130. GARRED P; Madsen HO; Kurtzhals JA; Lamm LU; Thiel S; Hey AS; Svejgaard A. Diallelic polymorphism may explain variations of the blood concentration of mannan-binding protein in Eskimos, but not in black Africans. Eur J Immunogenet. 1992. 19:403-412. 131. BURIAN K; Kis Z; Virok D; Endresz V; Prohaszka Z; Duba J; Berencsi K; Boda K; Horvath L; Romics L; Fust G; Gonczol E. Independent and joint effects of antibodies to human heatshock protein 60 and Chlamydia pneumoniae infection in the development of coronary atherosclerosis. Circulation. 2001. 103:1503-1508. 132. MILLER SA; Dykes DD; Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988. 16:1215133. BEST LG; Davidson M; North KE; MacCluer JW; Zhang Y; Lee ET; Howard BV; DeCroo S; Ferrell RE. Prospective analysis of mannose-binding lectin genotypes and coronary artery disease in American Indians: the Strong Heart Study. Circulation. 2004. 109:471-475. 134. SAEVARSDOTTIR S; Oskarsson OO; Aspelund T; Eiriksdottir G; Vikingsdottir T; Gudnason V; Valdimarsson H. Mannan binding lectin as an adjunct to risk assessment for myocardial infarction in individuals with enhanced risk. J Exp Med. 2005. 201:117-125.

76

135. ALBERT MA; Rifai N; Ridker PM. Plasma levels of cystatin-C and mannose binding protein are not associated with risk of developing systemic atherosclerosis. Vasc Med. 2001. 6:145149. 136. BHAKDI S; Torzewski M; Klouche M; Hemmes M. Complement and atherogenesis: binding of CRP to degraded, nonoxidized LDL enhances complement activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1999. 19:2348-2354. 137. SEIFERT PS; Hugo F; Tranum-Jensen J; Zahringer U; Muhly M; Bhakdi S. Isolation and characterization of a complement-activating lipid extracted from human atherosclerotic lesions. J Exp Med. 1990. 172:547-557. 138. KUO CC; Jackson LA; Campbell LA; Grayston JT. Chlamydia pneumoniae (TWAR). Clin Microbiol Rev. 1995. 8:451-461. 139. GARRED P; Pressler T; Madsen HO; Frederiksen B; Svejgaard A; Hoiby N; Schwartz M; Koch C. Association of mannose-binding lectin gene heterogeneity with severity of lung disease and survival in cystic fibrosis. J Clin Invest. 1999. 104:431-437. 140. READING PC; Morey LS; Crouch EC; Anders EM. Collectin-mediated antiviral host defense of the lung: evidence from influenza virus infection of mice. J Virol. 1997. 71:8204-8212. 141. SOELL M; Lett E; Holveck F; Scholler M; Wachsmann D; Klein JP. Activation of human monocytes by streptococcal rhamnose glucose polymers is mediated by CD14 antigen, and mannan binding protein inhibits TNF-alpha release. J Immunol. 1995. 154:851-860. 142. GRAUDAL NA; Madsen HO; Tarp U; Svejgaard A; Jurik G; Graudal HK; Garred P. The association of variant mannose-binding lectin genotypes with radiographic outcome in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2000. 43:515-521. 143. CAMPBELL LA; Rosenfeld M; Kuo CC. The role of Chlamydia pneumoniae in atherosclerosis-recent evidence from animal models. Trends Microbiol. 2000. 8:255-257. 144. SARAC TP; Hertzer NR; Mascha EJ; O'Hara PJ; Krajewski LP; Clair DG; Karafa MT; Ouriel K. Gender as a primary predictor of outcome after carotid endarterectomy. J Vasc Surg. 2002. 35:748-753. 145. TRISAL V; Paulson T; Hans SS; Mittal V. Carotid artery restenosis: an ongoing disease process. Am Surg. 2002. 68:275-279. 146. FIANE AE; Videm V; Lingaas PS; Heggelund L; Nielsen EW; Geiran OR; Fung M; Mollnes TE. Mechanism of complement activation and its role in the inflammatory response after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Circulation. 2003. 108:849-856. 147. HUNTER GC. Edgar J. Poth Memorial/W.L. Gore and Associates, Inc. Lectureship. The clinical and pathological spectrum of recurrent carotid stenosis. Am J Surg. 1997. 174:583588.

77

5. S A J Á T K Ö Z L E M É N Y E K J E G Y Z É K E

5.1. Az értekezés alapjául szolgáló közlemények RUGONFALVI-KISS S; Endresz V; Madsen HO; Burian K; Duba J; Prohaszka Z; Karadi I; Romics L; Gonczol E; Fust G; Garred P . Association of Chlamydia pneumoniae with coronary artery disease and its progression is dependent on the modifying effect of mannose-binding lectin. Circulation. 2002. 106:1071- 1076. RUGONFALVI-KISS S; Dosa E; Madsen HO; Endresz V; Prohaszka Z; Laki J; Karadi I; Gonczol E; Selmeci L; Romics L; Fust G; Entz L; Garred P. High rate of early restenosis after carotid eversion endarterectomy in homozygous carriers of the normal mannose-binding lectin genotype. Stroke. 2005. 36:944-948.

5.2. A témával összefüggő közlemények DOSA E; Rugonfalvi-Kiss S; Prohaszka Z; Szabo A; Karadi I; Selmeci L; Romics L; Fust G; Acsady G; Entz L. Marked decrease in the levels of two inflammatory markers, hs-C-reactive protein and fibrinogen in patients with severe carotid atherosclerosis after eversion carotid endarterectomy. Inflamm Res. 2004. 53:631-635. SZEPLAKI G; Prohaszka Z; Duba J; Rugonfalvi-Kiss S ; Karadi I; Kokai M; Kramer J; Fust G; Kleiber M; Romics L; Varga L. Association of high serum concentration of the third component of complement (C3) with pre-existing severe coronary artery disease and new vascular events in women. Atherosclerosis. 2004. 177:383-389. BIRO A; Dosa E; Horvath A; Prohaszka Z; Rugonfalvi-Kiss S; Szabo A; Karadi I; Acsady G; Selmeczi L; Entz L; Fust G; Romics L. Dramatic changes in the serum levels of anti-cholesterol antibodies after eversion endarterectomy in patients with severe carotid atherosclerosis. Immunol Lett. 2005. 99:51-56. DOSA E; Szabo A; Prohaszka Z; Karadi I; Rugonfalvi-Kiss S; Apor A; Jaranyi Z; Huttl K; Selmeci L; Acsady G; Fust G; Entz L. Changes in the plasma concentration of soluble thrombomodulin in patients with severe carotid artery stenosis after eversion endarterectomy. Inflamm Res. 2005. 54:289-294. JANOSKUTI L; Forhecz Z; Hosszufalusi N; Kleiber M ; Walentin S; Balint O; Duba J; Rugonfalvi-Kiss S; Romics L; Karadi I; Fust G; Prohaszka Z. High levels of C-reactive protein with low total cholesterol concentrations additively predict all-cause mortality in patients with coronary artery disease. Eur J Clin Invest. 2005. 35:104-111.

5.3. Egyéb közlemények HAMAR P, Rugonfalvi Kiss Szabolcs, Markovics Gyula, Szilágyi Edit. Az ezerarcú endotél. Érbetegségek. 2003 X.4.103-110

78

DOSA E; Szabo A; Entz L; Selmeci L; Walentin S; Kleiber M; Rugonfalvi KS; Hosszufalusi N; Fust G; Prohaszka Z. [C-reactive protein levels determined by an ultrasensitive method in a healthy Hungarian population]. Orv Hetil. 2004. 145:567-572. HUNYADI J, Bihari I, Landi A, Cervenák L, Rugonfalvi K Sz. Krónikus vénás elégtelenség és ulcus cruris. Érbetegségek. 2004 XI.4.123-133. RUGONFALVI K SZ. Mellkasi fájdalom és ST eleváció a kardiológus szemével. Háziorvosi Továbbképző Szemle (2006, megjelenés alatt)

79

6. Ö S S Z E F O G L A L Ó

6.1. Magyar összefoglaló Irodalmi és saját korábbi adatok alapján kérdéssé vált, hogy a Chlamydia pneumoniae esetleg egy a természetes immunitásban fontos szerepet betöltő mintázatfelismerő receptor molekulával (mannóz kötő fehérje) együtt, pontosabban ennek örökletes hiányával, szerepet játszat súlyos koszorúér betegség további progressziójában. Kíváncsiak voltunk továbbá, hogy egy másik érterületen (arteria carotis) jelent-e hasonló rizikót ezen komoly komplement effektor hatású fehérje polimorfizmusa. Munkánk elsőként vizsgálta a Chlamydia pneumoniae és MBL kapcsolatát érbetegségben. Az alacsony fehérjeszinttel járó genetikai variáns (A/O és O/O) 2-3szoros rizikót jelent koszorúérbetegség fennállására, valamint további súlyos koronáriaszövődmény kialakulására a C. pneumoniae pozitív betegek között. Ez az összefüggés nemre, korra, dohányzásra, koleszterinszintre való korrekció után is megmarad. A retrospektív vizsgálat adatai szerint carotis restenosis kialakulása a vad MBL A-allél hordozók között szignifikánsan magasabb a kontrollhoz képest. A hatás géndózis függő, vagyis a homozigóta (O/O) hordozók védettebbek, mint akik heterozigóták az MBL variáns allél tekintetében. Követéses vizsgálat adatai szerint homozigóta vad MBL allélt (A/A) hordozó nőkben már a 7. hónapos vizit idején magasabb fokú carotis szűkület mutatkozott a heterozigóta vad, illetve a homozigóta variáns allélt (A/O, O/O) hordozókhoz képest, és ez a tendencia folytatódott a követési idő végéig. Férfiak esetén statisztikai különbség csak a követési idő végén mérhető. Alacsony MBL szint aterogén szerepét az magyarázhatja, hogy a deficiens MBL kevésbé véd az infektív ágensek (pl. Chlamydia pneumoniae) ellen. Egy másik érfali folyamatban, a restenosisban, a magas MBL szint viszont a kifejtett intakt biológiai effektorfunkciói által erős gyulladásos választ, és következményes szöveti destrukciót okozhat.

80

6.2. Summary in English Influence of congenital and infective factors on the progression of atherosclerotic disease Based on literature data and our previous studies it seemed reasionable that a pattern recognition molecule (mannan binding lectin) – or rather it’s genetically defective mutant form – wich takes role in the innate immunity may contribute in the progression of severe atherosclerosis. We also wondered if this molecule, wich is able to activate the complement system, has any role at an other vascular territory of the arterial system (carotid artery). Our work was to investigate the relation of Chlamydia and the mannan binding lectin for the first time in vascular disease. The mutant variant has lower plasma concentration of the functionally active mannan binding lectin protein and seemed to put the patients under 2-3 times higher risk for having coronary artery disease and for developing severe complication in anti-Chlamydia positive individuals. This correlation was existed even after adjustment for sex, age, smoking habits and total cholesterol level. There were no correlation among patients carrying homozygote wild genotype (A/A). Patients carrying the wild A allele develop restenosis after eversion type carotid endarterectomy more frequently as our retrospective analysis revealed. This effect semmed to be gene-dose dependent: patients with the homozygote variant allele (O/O) are to be more protected compared to heterozygotes. None of the 6 patients carrying homozygote genotype has had developed restenosis. According to the data of the prospectie study a higher degree of restenosis was present in women carrying the homozygote wild allel (A/A) compared to the A/O and O/O genotype at 7 month postoperatively and they kept on having this tendency al the way. Significant difference could be measured only at the end of the follow-up in men. Deficient mannan binding lectin has a lower affinity to microorganism and carries a higher chance for the inflammation to stay chronically and may contribute to the development of vascular wall inflammation. On the contrary high levels of mannan binding lectin may cause tissue destruction through complement activation.

81

7. M E L L É K L E T

I.

Súlyos koronáriabetegeknek küldött kérdőív

II.

MBL primerek

III.

Értekezés alapjául szolgáló közlemény 1

IV.

Értekezés alapjául szolgáló közlemény 2

V.

A témával összefüggő közlemény 1

VI.


VII.


VIII.


IX.


82

I.

Súlyos koronáriabetegeknek küldött postai kérdőív

Reg. szám: [ ]

Név: [ ]

Születési idő: _ _ _ _ . _ _ . _ _ Volt-e valaha szívizom infarktusa? egyszer

többször

nem

Mikor? Dátum(ok):1) _ _ _ _ . _ _ . _ _2): _ _ _ _ . _ _ . _ _ Régi szívműtéte óta [ ] történt-e újabb koszorúér műtét (bájpassz)? egyszer

többször

nem

Mikor? Dátum(ok):1) _ _ _ _ . _ _ . _ _2): _ _ _ _ . _ _ . _ _ Régi szívműtéte óta [ ] történt-e újabb koszorúér festés (koronarografia)? egyszer

többször

nem

Régi szívműtéte óta [ ] történt-e újabb koszorúér tágítás (PTCA)? egyszer

többször

nem

Mikor? Dátum(ok):1) _ _ _ _ . _ _ . _ _2): _ _ _ _ . _ _ . _ _ Testsúlya?: _ _ _ kg

Testmagassága: _ _ _ cm

Mennyi a vérnyomása?: _ _

_/_ _ _ Ha változik, milyen értékek között változik?: _ _ _ / _ _ _ – _ _ _ / _ _ _ Dohányzik?

igen

Abbahagyta? igen

nem; Mennyit dohányzik egy nap? _ _ szál; nem; Mikor? _ _ éve

Mennyi ideig dohányzott? _ _ évig

További kérdéseink a műtét óta eltelt időszakra vonatkoznak. Kérjük, hogy a megfelelő válasz aláhúzásával válaszoljon!

1) Hogyan ítéli meg állapotát a műtét előttihez képest?

Javult Nem változott Romlott

2) Van jelenleg panasza?

Nincs

Mellkasi nyomás, szorítás, fájdalom jelentkezik: Nyugalomban fizikai terhelésre

időjárás változáskor Szabálytalan

ritmuszavar Van-e úgy, hogy nehezen veszi a levegőt, fullad és emiatt meg kell állnia…:

83

szívverés,

– több utcányi táv megtétele vagy 10 kg cipelése közben – lassú lépcsőjárás vagy 10-20 méter megtétele közben – a lakásban, öltözködés, mosakodás, házimunka közben? Egyéb:_________________________________________________________________ 3) A műtét óta alakult-e ki Önnél valamelyik a következő betegségek közül?: Agyvérzés, szélütés

Dátum: ____________________

Infarktus

Dátum: ____________________

Cukorbetegség

Dátum: ____________________

Érszűkület lábon vagy kézen

Dátum: ____________________

Más betegség: (Dátumok): ______________________________________________________________________ 4) Feküdt kórházban a műtéte óta? Ha igen, miért és mikor (diagnózisok, dátum)?: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ 5)

Milyen

gyógyszert

szed

rendszeresen?

(Az

elmúlt

hónapban):

______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________

Abban az esetben, ha Ön ebbe beleegyezik, szükség esetén felvesszük a kapcsolatot háziorvosával. beleegyezem

nem egyezem bele

6) Háziorvosának neve, címe és telefonja: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ 7) Abban a sajnálatos esetben,ha a vizsgálat óta eltelt hosszú idő alatt hozzátartozója bármilyen okból elhunyt, kérem írja meg, hogy mikor és mi volt a halál oka: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Olvasható aláírása: __________________________________

Köszönöm türelmét és segítségét!

84

II.

MBL primerek

1

A non-B

2

B

3

A non-C

4

C

5

A non-D

6

D

7

X

8

Y

9

H

10

L

11

P

12

Q

13

MBL exon4

forward: 5’→ AGT-CGA-CCC-AGA-TTG-TAG-GAC-AGAG- 3’ reverse: 5’→ CCT-TTT-CTC-CCT-TGG-TGC- 3’ forward: 5’→ GCA-AAG-ATG-GGC-GTG-ATGA- 3’ reverse: 5’→ GGG-CTG-GCA-AGA-CAA-CTA-TTA- 3’ forward: 5’→ AGT-CGA-CCC-AGA-TTG-TAG-GAC-AGAG- 3’ reverse: 5’→ CCT-GGT-TCC-CCC-TTT-TCTC- 3’ forward: 5’→ AGT-CGA-CCC-AGA-TTG-TAG-GAC-AGAG- 3’ reverse: 5’→ ACC-TGG-TTC-CCC-CTT-TTC-TT- 3’ forward: 5’→ AGT-CGA-CCC-AGA-TTG-TAG-GAC-AGAG- 3’ reverse: 5’→ TCC-CTT-GGT-GCC-ATC-ACG- 3’ forward: 5’→ AGT-CGA-CCC-AGA-TTG-TAG-GAC-AGAG- 3’ reverse: 5’→ CTC-CCT-TGG-TGC-CAT-CACA- 3’ forward: 5’→ CAT-TTG-TTC-TCA-CTG-CCA-CC- 3’ reverse: 5’→ CTC-AGG-GAA-GGT-TAA-TCT-CAG- 3’ forward: 5’→ CAT-TTG-TTC-TCA-CTG-CCA-CG- 3’ reverse: 5’→ CTC-AGG-GAA-GGT-TAA-TCT-CAG- 3’ forward: 5’→ GGC-TTA-GAC-CTA-TGG-GGC-TA- 3’ reverse: 5’→ GCT-TCC-CCT-TGG-TGT-TTT-AC- 3’ forward: 5’→ GGC-TTA-GAC-CTA-TGG-GGC-TA- 3’ reverse: 5’→ GCT-TCC-CCT-TGG-TGT-TTT-AG- 3’ forward: 5’→ TAG-GAC-AGA-GGG-CAT-GCTC- 3’ reverse: 5’→ AGG-ATC-CAG-GCA-GTT-TCC-TCT-GGA-AGG- 3’ forward: 5’→ TAG-GAC-AGA-GGG-CAT-GCTT- 3’ reverse: 5’→ AGG-ATC-CAG-GCA-GTT-TCC-TCT-GGA-AGG- 3’ forward: 5’→ GAG-TTT-CAC-CCA-CTT-TTT-CACA- 3’ reverse: 5’→ GCC-TGA-GTG-ATA-TGA-CCC-TTC- 3’

85

III. Dolgozat alapjául szolgáló közlemény 1 RUGONFALVI-KISS S; Endresz V; Madsen HO; Burian K; Duba J; Prohaszka Z; Karadi I; Romics L; Gonczol E; Fust G; Garred P . Association of Chlamydia pneumoniae with coronary artery disease and its progression is dependent on the modifying effect of mannose-binding lectin. Circulation. 2002. 106:1071- 1076.

86

Association of Chlamydia pneumoniae With Coronary Artery Disease and Its Progression Is Dependent on the Modifying Effect of Mannose-Binding Lectin Szabolcs Rugonfalvi-Kiss, MD; Valéria Endrész, PhD; Hans O. Madsen, PhD; Katalin Burián, MD; Jenô Duba, MD; Zoltán Prohászka, MD; István Karádi, MD; László Romics, MD; Éva Gönczöl, MD; George Füst, MD; Peter Garred, MD Background—The possible association between coronary artery disease (CAD) and Chlamydia pneumoniae (C pneumoniae) infection is controversial. On the basis of the recent suggestion that mannose-binding lectin (MBL) variant alleles are related to an increased risk of severe atherosclerosis, and on the in vitro interaction of MBL with C pneumoniae, we asked whether MBL might contribute to CAD in conjunction with C pneumoniae. Methods and Results—Antibodies to C pneumoniae were measured by immunofluorescence and MBL alleles were determined by polymerase chain reaction technique in samples from 210 patients with CAD and 257 healthy subjects from Hungary collected between 1995 and 1996. A higher percentage of patients with CAD were anti-C pneumoniae positive as compared with the control group (P⫽0.058). However, at logistic regression analysis adjusted to age, sex, and serum lipid levels, this difference was confined only to subjects carrying MBL variant alleles (P⫽0.035, odds ratio 2.63, [95% CI: 1.07 to 6.45]). In contrast, no significant difference was seen in those homozygous for the normal MBL allele (P⫽0.412). During a 65⫾5.8-month follow-up period, major outcomes (new myocardial infarction, and/or bypass operation or cardiovascular death) occurred in 11 C pneumoniae positive and 3 C pneumoniae negative patients. In the C pneumoniae positive group, the odds ratio of development of outcomes was 3.27 (95% CI: 1.10 to 9.71, P⫽0.033) in the carriers of the MBL variant alleles compared with the homozygous carriers of the normal MBL allele. Conclusions—These results indicate that infection with C pneumoniae leads mainly to the development and progression of severe CAD in patients with variation in the MBL gene. (Circulation. 2002;106:1071-1076.) Key words: coronary disease 䡲 genetics 䡲 immunology 䡲 infection

S

ince the original study by Saikku et al,1 several studies have indicated an association between Chlamydia pneumoniae (C pneumoniae) infection and coronary artery disease (CAD),2– 4 although this field remains highly controversial.5 Mannose-binding lectin (MBL) is a complement-activating innate immune defense serum protein which binds to mannose and acetylglucosamine sugar groups on different microorganisms.6 Recent findings indicate that MBL inhibits infection of HeLa cells by different Chlamydia species,7 suggesting that MBL participates in the protection against C pneumoniae. MBL variant alleles that result in decreased serum levels of functional MBL are associated with an increased risk of respiratory infections especially during early childhood,8 and also with susceptibility and outcome of infections in adults already weakened by a concomitant condition like cystic fibrosis.9 Furthermore, we10 and others11

have reported that MBL variant alleles are associated with accelerated development of severe atherosclerosis. On the basis of these observations, we asked whether the association between the presence of C pneumoniae and CAD and the further progression of severe CAD in patients who underwent coronary bypass surgery might be associated with a modifying effect of MBL variant alleles, which cause low levels of functional MBL in the blood.12–14

Methods Patients and Controls The study was performed in 210 Hungarian patients with CAD (50 women and 160 men, aged 58.8⫾8.2 years) with signs of severe stenosis and clinical signs of unstable angina pectoris with typical ECG changes. Diagnosis was confirmed by coronary angiography. All patients underwent bypass surgery. Serum and DNA samples

Received April 10, 2002; revision received June 7, 2002; accepted June 7, 2002. From the 3rd Department of Medicine (S.R.-K., Z.P., I.K., L.R., G.F.), Faculty of Medicine, Semmelweis University, Budapest; the Department of Medical Microbiology (V.E., K.B.), Szeged University, Szeged, Hungary; Tissue-Typing Laboratory-7631, Department of Clinical Immunology (H.O.M., P.G.), Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark; National Institute of Cardiology (J.D.), Budapest; and the Research Group of Metabolism, Genetics and Immunology (Z.P., L.R., G.F.), Hungarian Academy of Sciences, Budapest, Hungary; and the Virus Department (E´.G.), Bela Johan National Center for Epidemiology, Budapest, Hungary. Correspondence to Peter Garred, MD, Tissue-Typing Laboratory-7631, Rigshospitalet, Blegdamsvej 9, DK-2100 Copenhagen-Ø, Denmark. E-mail [email protected] © 2002 American Heart Association, Inc. Circulation is available at http://www.circulationaha.org

DOI: 10.1161/01.CIR.0000027137.96791.6A

1071

1072

Circulation

August 27, 2002

TABLE 1. Demographic Variables and Laboratory Data in 210 Patients With Severe CAD and in 257 Healthy Controls

Other Laboratory Tests C-reactive protein (CRP) serum concentrations were measured by particle enhanced immunoturbidimetric assay (Roche, Cobas Integra 400). The detection limit of the assay is 0.07 mg/L, the coefficient of variation 3.9% at 108 mg/L mean value. The amount of IgG-type antibodies reacting with human hsp60 (Lionex GmbH, Braunschweig, Germany) was assessed by ELISA, as described previously.15

Patients With Severe CAD (n⫽210)

Healthy Controls (n⫽257)

P

58.8⫾8.2

46.5⫾11.9

⬍0.0001*

160/50

164/93

0.005†

Total cholesterol, nmol/L

6.20 (5.50–7.25)

5.59 (4.83–6.40)

⬍0.0001*

Statistical Analyses

Triglyceride, nmol/L

2.00 (1.45–3.10)

1.50 (0.98–2.23)

⬍0.0001*

Smokers, %

58.5

23.9

⬍0.0001†

Hypertension, %

33.3

21.2

0.046†

Fisher’s exact test was used to compare frequencies. Mann-Whitney test was used to compare quantitative data. In some comparisons, logistic regression analyses were performed. Two-tailed tests were used throughout.

0.285⫾0.050

0.267⫾0.041

0.004*

157/53

162/95*

0.007†

Age, y Sex, n, male/female

BMI

C pneumoniae, n, positive/negative

Values are given as mean⫾SD, median (interquartile range), number of patients, or percentage of patients. P calculated with the *Mann-Whitney test and †Fisher’s exact test for the continuous and categorical variables, respectively.

were collected from the patients between 1995 and 1996. A questionnaire on the occurrence of different events (death of the patient, new myocardial infarction, necessity of bypass reoperation, coronary angioplasty, stroke, carotid endarterectomy, etc) was mailed to each patient in December 2000. In 4 months, 150 patients sent back filled questionnaires that could be properly evaluated. By contacting the family doctors, information on an additional 27 patients was obtained. Thus, in 177 of 210 patients (84.3%) the number and types of events that occurred during the 65⫾5.8-month follow-up period were known. Healthy controls included 93 women and 164 men, all Hungarian (blood donors and volunteers) and aged 46.5⫾11.9 years. All control subjects were examined and asked about any diseases, including CAD, in their medical history. Only healthy subjects without suspicion of CAD were enrolled in this study. A history of past and current cigarette smoking was obtained for each patient and control. Those who had stopped smoking ⬎20 years ago were considered not to have smoking as a risk factor. Patients were considered to have hypertension if they had received a diagnosis with an arterial pressure ⬎140/90 mm Hg. Table 1 lists the demographic variables and some laboratory data assessed in the patients and control groups. The review committee of Semmelweis Medical University approved the study, and the subjects gave informed consent. The patients and some controls have recently been described.15

Titration of IgG-Type Antibodies Against C pneumoniae C pneumoniae-specific IgG antibodies were quantitated in serum samples diluted 1:128 by microimmunofluorescence assay (ServiMif Chlamydia S630, Servibio, Meudon, France) according to the manufacturer’s instructions. Sera were designated as positive (titer: ⱖ1:128) or weakly positive or negative (titer: ⬍1:128), referred to as negative in the text and tables, on the basis of typical immunofluorescence associated with evenly distributed C pneumoniae organisms. Sera positive for Chlamydia trachomatis or Chlamydia psittaci were excluded from the study.

Determination of MBL Alleles MBL variant alleles B (codon 54), C (codon 57), and D (codon 52) in the mbl2 gene, which disrupts the structure of the protein and causes a dominant decrease in the functional MBL serum level, were determined by PCR-based techniques as described.12 The normal allele is named A, whereas the common designation of the variant alleles is O. MBL promoter alleles were also analyzed.16

Results Basic Characteristics of the Patients and Controls The average age of the patients was markedly higher than that of the healthy control subjects (Table 1). Similarly, serum concentrations of total cholesterol and triglyceride were significantly higher in the group of patients than in the control group. The ratio of men to women was higher in the patient group than among the controls. Body mass index (BMI), as well as the percentage of smokers and subjects with hypertension, was also significantly higher in the patients than in the control group. Additionally, a significantly higher percentage of the patients were C pneumoniae seropositives (Table 1).

Frequencies of MBL Variant Alleles in Patients With CAD and Healthy Controls in Relation to C pneumoniae Status Antibodies to C pneumoniae and the frequency of various MBL alleles were assessed in the 210 patients with CAD and in the 257 control subjects (Table 2). No significant difference between C pneumoniae–seropositive and -seronegative individuals in the frequency of MBL variant alleles was revealed (P⫽0.75, odds ratio 0.94 [95% CI 0.63 to 1.39]). However, in C pneumoniae–seropositive subjects, we found that the carriers of variant MBL alleles (A/O and O/O) occurred more frequently among patients than controls (P⫽0.091, odds ratio: 1.48 [0.94 to 2.31]), whereas no difference between patients with CAD and controls in MBL allele distribution was observed in the group of C pneumoniae– seronegative subjects. This observation prompted us to use multiple logistic regression analysis to study if C pneumoniae infection is associated with CAD more frequently in carriers of MBL variant alleles.

Dependence of the Association of C pneumoniae Seropositivity With Coronary Artery Disease on the MBL Polymorphisms Patients were stratified according to MBL alleles, and homozygous carriers of normal allele (A/A) were compared with heterozygous and homozygous carriers of the variant MBL alleles (A/O and O/O) (Table 3). Odds ratios adjusted for variables that were found to be significantly different at univariate analysis are shown in Table 1. For the total number of patients and controls, after adjustment, C pneumoniae positivity was associated with CAD only with a marginal significance. When only subjects

Rugonflavi-Kiss et al

C pneumoniae, MBL, and Coronary Artery Disease

1073

TABLE 2. Occurrence of MBL Alleles Stratified According to C pneumoniae Antibody Status in 210 Patients With Coronary Heart Disease and 257 Controls C pneumoniae Positive

C pneumoniae Negative

All Subjects

MBL Genotype*

Patients

Healthy Controls

Patients

Healthy Controls

Patients

Healthy Controls

A/A

83 (52.9)

101 (62.3)

35 (66.0)

48 (50.5)

118 (56.2)

149 (58.0)

A/B

45 (28.7)

30 (18.5)

9 (17.0)

27 (28.4)

54 (25.7)

57 (22.2)

A/C

5 (3.2)

6 (3.7)

0 (0.0)

2 (2.1)

5 (2.4)

8 (3.1)

A/D

19 (12.1)

17 (10.5)

6 (11.3)

8 (8.4)

25 (11.9)

25 (9.7)

Total A/O

69 (43.9)

53 (32.7)

15 (28.3)

37 (38.9)

84 (40.0)

90 (35.0)

B/B

2 (1.3)

3 (1.9)

0 (0.0)

2 (2.1)

2 (1.0)

5 (1.9)

B/C

1 (0.6)

0 (0.0)

0 (0.0)

3 (3.2)

1 (0.5)

3 (1.2)

B/D

1 (0.6)

3 (1.9)

0 (0.0)

2 (2.1)

1 (0.5)

5 (1.9)

C/C

0 (0.0)

1 (0.6)

0 (0.0)

1 (1.1)

0 (0.0)

2 (0.8)

C/D

0 (0.0)

0 (0.0)

0 (0.0)

2 (2.1)

0 (1.9)

2 (0.8)

D/D

1 (0.6)

1 (0.6)

3 (5.7)

0 (1.2)

4 (1.9)

1 (0.4)

Total O/O

5 (3.2)

8 (4.9)

3 (5.7)

10 (10.5)

8 (3.8)

18 (7.0)

A/0 ⫹ 0/0

74 (47.1)

61 (37.7)

18 (34.0)

47 (49.5)

92 (43.8)

108 (42.0)

157 (100.0)

162 (100.0)

53 (100.0)

95 (100.0)

210 (100.0)

257 (100.0)

0.25

0.21

0.20

0.30

0.24

0.25

Sum

O allele frequency

Values are given as n (%). *A indicates normal MBL allele; allele O, the variant alleles B (codon 54), C (codon 57), and D (codon 52).

carrying MBL variant O alleles were considered, however, a high (2.62 [1.07 to 6.44]) and significant (P⫽0.035) adjusted odds ratio of the patients with C pneumoniae positive was found. Similar results were obtained when the results were adjusted for age, sex, serum triglyceride concentration, BMI, as well as for the percentage of smokers and subjects with hypertension (Table 3). Because there was a significant (P⬍0.001) interaction between BMI and serum cholesterol

concentrations, it was not possible to put these 2 variables in the same model. In contrast, no association between C pneumoniae positivity and CAD was seen in subjects homozygous for the normal A allele (Table 3). To further minimize the effect of potentially confounding factors, 147 patients with severe CAD and 147 controls were matched for age and sex, and results for C pneumoniae antibodies in carriers of normal or variant MBL alleles were

TABLE 3. Logistic Regression Analysis for the Association Between the Prevalence of Anti-C pneumoniae Antibodies and CAD in 210 Patients With Severe CAD and 257 Healthy Controls Stratified According to MBL Genotypes

C pneumoniae Status

Patients, n (%)

Healthy Controls, n (%)

157 (74.8)

162 (62.3)

53 (25.2)

95 (37.7)

Odds Ratio (95% CI)

P

Model 1,* Adjusted Odds Ratio (95% CI)

P

Model 2,† Adjusted Odds Ratio (95% CI)

P

All subjects Positive Negative Sum

1.74 (1.14–2.65) 0.0067 1.78 (0.98–3.12) 0.058 1.80 (0.55–5.93)

0.336

1.13 (0.65–1.97) 0.65

0.640

210 (100.0) 257 (100.0)

Subjects homozygous for the normal (A/A) MBL alleles Positive

83 (70.3)

101 (64.9)

Negative

35 (29.7)

48 (35.3)

Sum

1.39 (0.64–3.02) 0.412 0.64 (0.09–4.53)

118 (100.0) 149 (100.0)

Subjects heterozygous and homozygous for the variant (A/0 and 0/0) MBL alleles Positive

74 (80.4)

61 (58.5)

Negative

18 (19.6)

47 (41.5)

Sum

92 (100.0) 108 (100.0)

3.34 (1.69–6.66) 0.0002 2.63 (1.07–6.45) 0.035 7.98 (1.07–59.24) 0.043

*Adjusted for age, sex, serum cholesterol, and triglyceride concentration. †Adjusted for age, sex, serum triglyceride concentration, BMI, percentage of smokers, and hypertension.

1074

Circulation

August 27, 2002

TABLE 4. Logistic Regression Analysis of the Association Between the Prevalence of Anti–C pneumoniae Antibodies and CAD in 147 Patients and 147 Age and Sex-Matched Healthy Controls Stratified According to MBL Genotypes

C pneumoniae Status

Patients, n (%)

Healthy Controls, n (%)

115 (78.2)

93 (63.2)

Odds Ratio (95% CI)

P

Adjusted* Odds Ratio (95% CI)

P

2.09 (1.25–3.50)

0.005

1.93 (1.10–3.39)

0.021

1.44 (0.73–2.83)

0.289

1.44 (0.68–3.06)

0.343

3.94 (1.51–7.64)

0.003

2.88 (1.10–3.39)

0.016

All subjects Positive Negative

32 (21.8)

54 (36.7)

147 (100.0)

147 (100.0)

Positive

63 (75.0)

54 (67.5)

Negative

21 (25.0)

26 (32.5)

Sum

84 (100.0)

80 (100.0)

52 (82.5)

39 (58.2)

Sum Subjects homozygous for the normal (A/A) MBL allele

Subjects heterozygous and homozygous for the variant MBL allele (A/O and O/O) Positive Negative

11 (17.5)

28 (41.8)

Sum

63 (100.0)

67 (100.0)

*Adjusted to the serum total cholesterol and triglyceride levels.

compared (Table 4). The average age (54.9⫾6.3 years for the patients and 53.6⫾7.7 years for controls) was almost identical (P⫽0.119), and the distribution of men and women did not differ significantly (P⫽0.1) in the groups of patients (110/37) and matched controls (96/51). Similar to the results obtained in the whole study population, CAD was associated with C pneumoniae positivity only in subjects carrying the MBL variant alleles, even when matched pairs were compared by logistic regression analysis adjusted to the serum cholesterol and triglyceride concentrations (Table 4). Genotyping for MBL promoter alleles (not shown) was not additionally informative.

Predictive Value of Polymorphisms of the MBL of the Major Outcomes With Severe CAD in the C pneumoniae–Positive and C pneumoniae– Negative Patients One hundred and seventy seven of 210 patients (84.3%) could be monitored up for 65⫾5.8 months. We calculated the predictive value of the MBL polymorphisms on the development of major outcomes of CAD (new myocardial infarction and/or new bypass operation and/or cardiovascular death). Altogether, 12 patients developed myocardial infarction, and bypass operation was performed on an additional patient who did not develop myocardial infarction in the meantime. An additional patient died of heart attack without previous myocardial infarction or bypass operation. Therefore, major outcomes occurred in 14 patients during the follow-up period. These patients were divided according to MBL polymorphisms and C pneumoniae serostatus measured in the baseline serum samples and predictive values of these variables were determined with the use of multiple logistic regression analysis. We also adjusted the analysis to other variables that may affect the outcomes (Table 5). Major outcomes occurred more frequently in the carriers of the variant MBL alleles

(adjusted odds ratio: 2.40 [95% CI 0.96 to 5.96], P⫽0.060). This association was, however, restricted to the patients positive with C pneumoniae. In this group, 9 events occurred in 11 carriers of the variant alleles. The MBL variant allele carriers had a 3.27 (CI: 1–10 –9.71, P⫽0.033) higher adjusted odds ratio to develop major outcomes than noncarriers. By contrast MBL polymorphisms did not predict the development of events in patients negative for C pneumoniae (Table 5).

Lack of Association Between MBL Polymorphisms and Serum Concentration of CRP and IgG Antibodies to hsp60 We compared serum concentrations of CRP and IgG antihsp60 in homozygous carriers of the wild MBL allele with carriers of the variant MBL alleles. We did not find significant differences between the 2 groups: CRP concentrations (median (25th-75th percentile) was 4.06 (1.88 to 7.30) mg/L and 3.14 (1.83 to 6.79) mg/L, respectively (P⫽0.572). Serum concentrations of anti-hsp60 antibodies were 103 (46 to 192) AU/mL and 87 (39 to 204) AU/mL, respectively (P⫽0.576). Similar results were obtained when subjects both positive and negative for C pneumoniae were analyzed separately.

Discussion This study supports the association between C pneumoniae infection and CAD; however, the association was solely dependent on individual variation in the MBL gene (mbl2). No increased risk was seen in individuals homozygous for the normal MBL allele, although a significant risk characterized individuals with MBL variant alleles, even after adjustment for age, sex, serum lipid concentrations, BMI, as well as for the percentage of smokers and occurrence of hypertension. Moreover, during a follow-up period of 5.5 years, a 3-fold increased risk of a major cardiovascular event was observed

Rugonflavi-Kiss et al

C pneumoniae, MBL, and Coronary Artery Disease

1075

TABLE 5. Predictive Value Calculated Logistic Regression of MBL Genotypes Influence on the Major Outcomes in the C pneumoniae—Positive and—Negative patients (at Baseline) With Severe CAD New Myocardial Infarction and/or Bypass Operation and/or Cardiovascular Death Yes

No

Odds Ratio (95% CI) (P)

Adjusted* Odds Ratio (95% CI) (P)

Normal A/A†

2

68

5.28 (1.10–25.4) (0.029)

3.27 (1.10–9.71) (0.033)

Variant A/O or O/O†

9

58

11

126 0.92 (0.08–11.20) (1.00)

0.86 (0.08–8.89) (0.896)

3.24 (0.97–10.70) (0.053)

2.40 (0.96–5.96) (0.060)

MBL Alleles

C pneumoniae positive

Total

C pneumoniae negative Normal A/A†

2

24


1

13

Total

3

37

All patients Normal A/A†

4

92


10

71

Total

14

163

*Adjusted to extent of stenosis of coronary arteries, occurrence of previous myocardial infarction, as well as baseline serum total cholesterol and triglyceride levels by logistic regression. †See Table 2 for explanation.

in MBL variant alleles carriers (provided that they were positive for C pneumoniae) compared with homozygous carriers of the normal MBL allele. Thus, C pneumoniae infection may lead to the development of severe CAD in genetically predisposed individuals carrying MBL variant alleles. These findings are consistent with previous observations indicating that MBL variant alleles are associated with severe CAD10 and with increased carotid plaque areas.11 C pneumoniae status was not assessed in either study. Moreover, if reproduced, the present findings should also help to clarify much of the inconsistency in literature about C pneumoniae and CAD.5 A relatively small odds ratio because of the high frequency of infected individuals in the background population might undoubtedly lead to miscellaneous results in different studies because of variations in additive parameters leading to vascular pathology. MBL deficiency has been implicated in C pneumoniae infection because the bacteria carry the sugar structures relevant for MBL binding.7 Moreover, MBL inhibits the uptake of the bacteria to target cells in vitro.7 We did not observe a direct protective effect of MBL against C pneumoniae per se, which is not unexpected because the seroprevalence in healthy adults exceeds 60%. Almost all individuals are probably infected with C pneumoniae during their lifetime and many are reinfected.17 Moreover, MBL is not present in the normal lung.9,18 Therefore, MBL may act to modulate the severity of the infection, rather than protect against it, as previously suggested.10 For example, MBL might inhibit the dissemination of C pneumoniae from the lungs by monocytes/macrophages to the blood stream and subsequently to the vascular wall. Alternatively, or in addition, MBL might modulate the inflammatory response initiated by chronic infection with C pneumoniae or other stimuli in the atherosclerotic plaque. Experimental studies support

such a view in which it has been shown that MBL may modulate cytokine responses.19 We have previously shown that MBL in vivo can exert a striking modulating effect on inflammation associated with rheumatoid arthritis.20 Nevertheless, the present results indicate that C pneumoniae in general may be a rather harmless bacteria in relation to the atherosclerotic process and that an additional component, such as MBL deficiency, is necessary for clinically relevant pathology. This conclusion is in line with the evidence from animal models indicating that it is difficult to induce atherosclerosis with C pneumoniae alone, but that the microorganism acts in conjunction with other atherosclerotic risk factors.21 Some studies suggest a direct inflammatory role of complement in atherogenesis mediated through the binding of CRP to degraded, nonoxidized LDL, enhancing complement activation associated with vascular pathology.22,23 According to the present study, however, interaction of MBL polymorphisms and C pneumoniae infection does not exert its effect on CAD development either through CRP or antihsp60 antibodies. A dual role of MBL in CAD has been suggested, on the basis of the exposure of MBL ligands through oxidative stress of endothelial cells, a model of ischemia/reperfusion injury.24 Moreover, MBL and complement factor C3 immunostaining was found throughout an ischemic area after rat myocardial reperfusion.24 Thus, MBL might partly protect against severe atherosclerosis in conjunction with C pneumoniae or other related conditions, but this relative advantage may be turned in to a disadvantage during revascularization procedures. This study indicates that MBL deficiency may represent an important factor in connection with C pneumoniae infection in the development of CAD and disease progression. However, the relatively small size and lack of supportive biological data make it necessary that these observations are

1076

Circulation

August 27, 2002

confirmed in additional prospective studies before definitive conclusions can be drawn. If confirmed, the results suggest that determination of the MBL genetic status in C pneumoniae– seropositive CAD patients may serve to identify those patients more likely to benefit from antibiotic therapy.

Acknowledgments This work was supported by the following grants: AKP 97-100 3, 2/41 Hungarian Academy of Sciences (Dr Füst), FKFP2025 (Dr Gönczöl) 0084/1997 (Dr Füst), FKFP 0138/2001 (Dr Prohászka), Ministry of Education, OTKA F029030 (Dr Prohászka), TO3495 (Dr Gönczöl), T029044 (Dr Karádi), and T032661 (Dr Füst), the Danish Medical Research Council and The Novo Nordisk Research Foundation (Dr Garred). Dr Prohászka is a “Bolyai János” research fellow. We thank Bente Frederiksen for her skillful technical assistance. We are most grateful for the two anonymous reviewers of our paper for their helpful comments.

References 1. Saikku P, Leinonen M, Mattila KJ, et al. Serological evidence of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with chronic heart disease and acute myocardial infarction. Lancet. 1988;2:983–986. 2. Danesh J, Collins R, Peto R. Chronic infections and coronary heart disease: is there a link? Lancet. 1997;350:430 – 436. 3. Wald NJ, Law MR, Morris JK, et al. Chlamydia pneumoniae infection and mortality from ischaemic heart disease: large prospective study. BMJ. 2000;321:204 –207. 4. Grayston JT. Background and current knowledge of Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis. J Infect Dis. 2000;131:402– 410. 5. Danesh J, Whincup P, Walker M, et al. Chlamydia pneumoniae IgG titres and coronary heart disease: prospective study and meta-analysis. BMJ. 2000;321:208 –213. 6. Turner MW, Hamvas RMJ. Mannose-binding lectin: structure, function, genetics and disease associations. Rev Immunogenetics. 2000;2:305–322. 7. Swanson A, Ezekowitz RAB, Lee A, et al. Human mannose-binding protein inhibits infection of HeLa cells by Chlamydia trachomatis. Infect Immun. 1998;66:1607–1612. 8. Koch A, Melbye M, Sorensen P, et al. Acute respiratory tract infections and mannose-binding lectin insufficiency during early childhood. JAMA. 2001;285:1316 –1321. 9. Garred P, Pressler T, Madsen HO, et al. Association of mannose-binding lectin gene heterogeneity with severity of lung disease and survival in cystic fibrosis. J Clin Invest. 1999;104:431– 437.

10. Madsen HO, Videm V, Svejgaard A, et al. Association of mannosebinding lectin deficiency with severe atherosclerosis. Lancet. 1998;352: 959 –960. 11. Hegele RA, Ban MR, Anderson CM, et al. Infection-susceptibility alleles of mannose-binding lectin are associated with increased carotid plaques area. J Invest Med. 2000;48:198 –202. 12. Madsen HO, Garred P, Kurtzhals JAL, et al. A new frequent allele is the missing link in the structural polymorphism of the human mannanbinding protein. Immunogenetics. 1994;40:37– 44. 13. Lipscombe RJ, Sumiya M, Summerfield JA, et al. Distinct physicochemical characteristics of human mannose binding protein (MBP) expressed by individuals of differing genotype. Immunology. 1995;85: 660 – 667. 14. Wallis R, Cheng JY. Molecular defects in variant forms of mannosebinding protein associated with immunodeficiency. J Immunol. 1999;163: 4953– 4959. 15. Burian K, Kis Z, Dezso V, et al. Independent and joint effects of antibodies to human heat-shock protein 60 and Chlamydia pneumoniae infection in the development of coronary atherosclerosis. Circulation. 2001;103:1503–1508. 16. Madsen HO, Garred P, Thiel S, et al. Interplay between promoter-and structural gene variants control basal serum level of mannan-binding protein. J Immunol. 1995;155:3013–3020. 17. Kuo C-C, Jackson LA, Campbell LA, et al. Chlamydia pneumoniae (TWAR). Clin Microb Rev. 1995;8:451– 461. 18. Reading PC, Morey LS, Crouch EC, et al. Collectin-mediated antiviral host defence of the lung: evidence from influenza virus infection in mice. J Virol. 1997;71:8204 – 8212. 19. Soell M, Lett E, Holveck F, et al. Activation of human monocytes by streptococcal rhamnose glucose polymers is mediated by CD14 antigen and mannan binding protein inhibits TNF-a release. J Immunol. 1995; 154:851– 860. 20. Graudal NA, Madsen HO, Tarp U, et al. The association of variant mannose-binding lectin genotypes with radiographic outcome in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2000;43:515–521. 21. Campbell LA, Rosenfeld M, Kuo C-C. The role of Chlamydia pneumoniae in atherosclerosis-recent evidence from animal models. Trends in Microbiol. 2000;8:255–257. 22. Seifert PS, Hugo F, Tranum-Jensen J, et al. Isolation and characterization of a complement-activating lipid extracted from human atherosclerotic lesions. J Exp Med. 1990;172:547–557. 23. Bhakdi S, Torzewski M, Klouche M, et al. Complement in atherogenesis: Binding of CRP to degraded, nonoxidized LDL enhances complement activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1999;19:2348 –2354. 24. Collard CD, Vakeva A, Morrissey MA, et al. Complement activation after oxidative stress: role of the lectin complement pathway. Am J Pathol. 2000;156:1549 –1556.

IV.

Dolgozat alapjául szolgáló közlemény 2

RUGONFALVI-KISS S; Dosa E; Madsen HO; Endresz V; Prohaszka Z; Laki J; Karadi I; Gonczol E; Selmeci L; Romics L; Fust G; Entz L; Garred P. High rate of early restenosis after carotid eversion endarterectomy in homozygous carriers of the normal mannose-binding lectin genotype. Stroke. 2005. 36:944-948.

93

High Rate of Early Restenosis After Carotid Eversion Endarterectomy in Homozygous Carriers of the Normal Mannose-Binding Lectin Genotype Szabolcs Rugonfalvi-Kiss, MD; Edit Do´sa, MD; Hans O. Madsen, PhD; Vale´ria Endre´sz, MD; Zoltań Proha´szka, MD; Judit Laki, MD; Istvań Kara´di, MD; E´va Go¨nczo¨l, MD; La´szlo´ Selmeci, MD; La´szlo´ Romics, MD; George Fu¨st, MD; La´szlo´ Entz, MD; Peter Garred, MD Background and Purpose—Mannose-binding lectin (MBL) is thought to influence the pathophysiology of cardiovascular disease by decreasing the risk of advanced atherosclerosis and by contributing to enhanced ischemia reperfusion injury. Thus, we investigated the role of MBL in restenosis after eversion endarterectomy in patients with severe carotid atherosclerosis. Methods—In a prospective study, 123 patients who underwent carotid endarterectomy were followed-up by carotid duplex scan (CDS) sonography for 14 months. In a retrospective study, we examined 17 patients and 29 patients, respectively, who had or had not at least 50% restenosis 29 months after carotid eversion endarterectomy. MBL genotypes were analyzed by a polymerase chain reaction-based method, and MBL serum concentrations were measured. Results—In the prospective study in the patients homozygous for the normal MBL genotype, CDS values were significantly higher after 14 months of follow-up compared with the values measured 6 weeks after surgery (P⬍0.001). In contrast, only a slight increase was registered in patients carrying MBL variant alleles. The differences were much more pronounced in female than in male patients. Similar differences were observed when patients with high and low MBL serum concentrations were compared. In the retrospective study, a significant increase in the frequency of MBL variant genotypes was observed in patients not experiencing restenosis compared with the patients with restenosis (P⫽0.007). Conclusions—These results indicate that reoccurrence of stenosis after carotid endarterectomy is partially genetically determined and imply that MBL contributes significantly to the pathophysiology of this condition. (Stroke. 2005;36: 944-948.) Key Words: atherosclerosis 䡲 cardiovascular disease 䡲 carotid endarterectomy 䡲 carotid stenosis 䡲 complement 䡲 genetics 䡲 ischemia 䡲 mannose-binding lectin 䡲 MBL2 䡲 reperfusion injury

M

icrosurgical carotid eversion endarterectomy is a procedure in which plaque material is removed from inside of the carotid artery to avoid a primary or recurrent cerebral attack. The beneficial effect of carotid eversion endarterectomy for carotid stenosis is well-documented.1 However, restenosis is common after carotid eversion endarterectomy, and it may often appear quite rapidly after the operation.2 According to a meta-analysis, the risk of potentially clinically significant restenosis was 10% in the first year, 3% in the second year, 2% in the third, and 1% thereafter.3 When a carotid stenosis reaches a maximum of ⬎50% of the vascular diameter, it typically progresses and re-operation may become necessary.4,5

Early restenosis, defined as disease presenting within 24 months of the initial operation, is thought to be secondary to the proliferation of medial smooth muscle cells, leading to myointimal hyperplastic lesions, whereas late disease, presenting after 24 months of the initial operation, is frequently secondary to renewed atherosclerosis.6 Mannose-binding lectin (MBL) is a liver-derived serum protein of importance for innate immunity. On binding to a ligand, MBL may activate the lectin pathway of complement via the MBL-associated serine protease 2.7–9 Human MBL is encoded from a single gene (MBL2) on chromosome 10.10,11 Three single-base substitutions in exon 1 of the MBL2 gene independently cause low serum levels of MBL: at codon 54

Received November 17, 2004; final revision received January 3, 2005; accepted January 18, 2005. From the Third Department of Internal Medicine (S.R.-K., Z.P., J.L., I.K., L.R., G.F.), and the Department of Vascular and Cardiac Surgery (E.D., L.S., L.E.), Faculty of Medicine, Semmelweis University, Budapest, Hungary; the Tissue-Typing Laboratory-7631 (H.O.M., P.G.), Department of Clinical Immunology, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark; the Department of Medical Microbiology (V.E.), Szeged University, Szeged; Hungary; the Research Group of Metabolism and Atherosclerosis (Z.P., I.K., L.R., G.F.), Hungarian Academy of Sciences, Budapest, Hungary; and the Department of Virology (E.G.), Johan Be´la National Center of Epidemiology, Budapest, Hungary. Correspondence to Dr Peter Garred, Tissue Typing Laboratory-7631, Department of Clinical Immunology, Rigshospitalet, Blegdamsvej 9, 2100 Copenhagen-Ø, Denmark. E-mail [email protected] © 2005 American Heart Association, Inc. Stroke is available at http://www.strokeaha.org

DOI: 10.1161/01.STR.0000160752.67422.18

944

Rugonfalvi-Kiss et al

MBL and Restenosis After Carotid Endarterectomy

(glycine to aspartic acid, allele B), at codon 57 (glycine to glutamic acid, allele C), and finally at codon 52 (arginine to cysteine, allele D).12–14 The common designation for these variant alleles is O, whereas the normal allele has been named A. Each of the 3 variants reduces the amount of functional MBL subunits in heterozygous individuals 5- to 10-fold.15 Recently, a dual role of MBL in cardiovascular disease has been suggested because it has been shown that lack of functional alleles is associated with severe coronary artery disease and/or increased carotid plaque formation.16 –18 Moreover, it has been shown that MBL deficiency may amplify the putative effect Chlamydia pneumoniae may have on coronary artery disease.19 However, experimental data and clinical observations suggest that MBL and the lectin pathway of complement may initiate the inflammatory reaction seen in relation to ischemia reperfusion injury.20,21 Based on these findings that indicate probable involvement of the MBL system in pathological processes leading to restenosis, we investigated a possible association of MBL alleles with restenosis in patients undergoing carotid eversion endarterectomy.

Materials and Methods Subjects Group 1 included patients examined in a prospective study. A total of 123 patients (80 men, 43 women, 63.0⫾9.4 years old) with severe (mean: 80⫾14%) stenosis of carotid artery who underwent eversion type carotid endarterectomy between October 2000 and March 2003 were included and followed-up. Group 2 included patients examined in a cross-sectional study. Seventeen patients (10 men, 7 women, 66.7⫾2.1 years old) who underwent operation by eversion-type carotid endarterectomy 29 months (range, 14 to 85 months) before and had an at least 50% restenosis measured by carotid color duplex scan (CDS) sonography measurements. Twenty-nine patients were controls (22 men, 7 women, 67.5⫾2.3 years old) who underwent the same operation without detectable restenosis matched with the patients experiencing restenosis by the length of follow-up time, age, gender, and serum lipid levels.

Surgery and Follow-up of the Patients During the Prospective Study The study protocol was approved by the Institutional Review Committee at Semmelweis University, and the subjects gave informed consent. After detailed medical examination, careful medical history was taken. All consecutive patients who underwent eversion endarterectomy at the Department of Vascular and Cardiac Surgery were included in the study. Indication for carotid eversion endarterectomy was in accordance with American Heart Association guidelines22. The operation and the clinical follow-up were performed as described previously.23,24 Eleven patients had bilateral stenosis but only the findings at the side with the highest degree of stenosis were included in the study. Only patients without symptoms of infections were eligible for the intervention. All patients had duplex scan examinations (ATL Ultramark 9 HDI system) preoperatively, 5.7 (4.6 to 8.0) weeks (in the following 6 weeks), 6.8 (6.2 to 7.9) months (7 months), and 13.8 (12.3 to 19.0) months (14 months) after the operation. All carotid duplex scans were performed by an experienced radiologist. At the same time as carotid duplex scans were performed, blood samples were drawn and stored at ⫺80°C. The common carotid artery, internal carotid artery, and external carotid artery on both sides were examined in the standard fashion. We recorded the peak systolic velocity and the end diastolic velocity in the common carotid artery, in the internal carotid artery, and the external carotid artery. The spectral measurements were taken with a

945

Figure 1. MBL serum concentration according to the method described.27 A/A (n⫽76) indicates individuals homozygous for the normal MBL allele. A/O (n⫽41) indicates individuals heterozygous for any MBL variant allele (B, C, or D). O/O (n⫽6) indicates individuals homozygous or compound heterozygous for any MBL variant allele. Median, interquartile range, and range are indicated. The difference in MBL serum concentration was highly significant between the genotypes (Kruskall–Wallis P⬍0.0001)

Doppler angle of 55° to 65°. The diagnostic criteria for internal carotid artery stenosis and restenosis were based on peak systolic velocities and end diastolic velocities, as well as internal carotid artery/common carotid artery ratios. The velocity spectra of the internal carotid artery were further categorized as mild (⬍50%), moderate (50% to 69%), and severe (ⱖ70%).

C pneumoniae-Specific IgG Antibodies C pneumoniae-specific IgG antibodies were quantitated as described previously.19

Genotyping of MBL Total genomic DNA was extracted from white blood cells using the method of Miller.25 Determination of the alleles of the MBL2 gene at codons 52 (D), 54 (B), and 57 (C) and the regulatory variants at positions ⫺221, ⫺550, and ⫹4 were performed by polymerase chain reaction using sequence-specific priming as described.26

Measurement of MBL Serum Concentration MBL serum concentration was measured in a double-sandwich enzyme-linked immunosorbent assay as previously described in samples obtained preoperatively.27 This assay preferentially detects higher-order oligomerized MBL (detection limit, 20 ␮g/L) and is closely associated with the function of the MBL activation pathway of complement.15

Statistical Analyses Statistical analyses were made using GraphPad Prism V 3.0 for Windows software package (GraphPad Software). Several group comparisons were performed with the Kruskall–Wallis 2-way ANOVA or nonparametric repeated measures ANOVA (Friedman) tests. Comparison of categorical variables was performed with the ␹2 for trend test.

Results MBL Genotypes and Serum Concentrations We found that the MBL genotypes correlated highly significantly with the MBL serum concentrations (Kruskall–Wallis P⬍0.0001) (Figure 1). Median MBL serum concentration at baseline was 2016 ␮g/L (interquartile range, 1192 to 3560) in patients with the A/A genotype (n⫽76), 336 (range, 106 – 800) for patients with the A/O (n⫽41) genotype and below

946

Stroke

May 2005

Figure 2. The difference in the CDS sonography values (mean⫾SEM) by MBL genotypes at the operated site after median 6 weeks, 7 months, and 14 months after the carotid endarterectomy operation is shown. Dunn post-hoc test after nonparametric repeated measures ANOVA (Friedman test) revealed that carriers of the normal MBL A/A genotype increased significantly in CDS values at 7 months (P⬍0.05) and 14 months (P⬍0.001), whereas significant increase (P⬎0.05) was seen in patients with MBL variant genotypes (A/O⫹O/O) only at 14 months after surgery.

detection limit (20 ␮g/L) in patients with the O/O genotype (n⫽6).

Evidence for a Role of MBL in Restenosis After Carotid Endarterectomy After removal of plaques by endarterectomy, the carotid CDS values decreased to 0% in 100 of 123 patients (controlled ⬇6 weeks after the operation). After that period, a fraction of the patients experienced restenosis. During the 14-month follow-up period, 10% to 19% restenosis was observed in 6 patients, 20 to 39% in 13 patients, 40% to 49% restenosis in 10 patients, whereas restenosis equal to or exceeding 50% was recorded in 16 patients. There was no significant difference (P⫽0.532) in the restenosis rate between patients operated by different surgeons (n⫽7). According to an analysis by nonparametric ANOVA followed by a post hoc test, in A/A homozygous carriers an

increase in the CDS values could be detected already 7 months after endarterectomy (P⬍0.05), and it progressed until the end of the follow-up period (P⬍0.001). By contrast, the increase in the CDS values became weakly significant (P⬍0.05) only at the end of the follow-up period in the group of the patients who were heterozygotes (A/O) or homozygous for MBL variant genotypes (O/O) (Figure 2). Testing for MBL regulatory variants did not provide additional information. Gender has been shown to be a significant parameter in reoccurrence of stenosis after carotid eversion endarterectomy,28 and when gender-related and MBL genotype-related effects were considered together, significant (P⫽0.0038) differences between male and female patients in the CDS sonography values were found only in patients with the normal (A/A) genotype (Figure 3A). The data were evaluated by 2-way ANOVA test. The analysis showed that females carrying the normal MBL A/A genotype increased significantly in CDS values already at 7 months (P⬍0.01) and further at 14 months (P⬍0.001), whereas in male patients the increase in the CDS values became significant (P⬍0.05) only at14 months after surgery. By contrast, no significant CDS increase was seen either in male or in female patients carrying MBL variant genotypes (A/O⫹O/O) (Figure 3B). MBL variant alleles have been shown to modulate the effect C pneumoniae may have on coronary artery disease.19 In this cohort, no correlation between the corrected CDS values measured either at 7 months or at 14 months after endarterectomy and seropositivity for C pneumoniae was observed (data not shown), nor did the presence of MBL variant alleles influence this observation.

Strong Correlation Between MBL Serum Concentration and Restenosis Changes in CDS values according to MBL serum concentration are shown in Figure 3C and 3D. The data were evaluated by 2-way ANOVA test. Analysis revealed that female carriers

Figure 3. The difference between male and female patients in the CDS sonography values (mean⫾SEM) at the operated site at median 6 weeks, 7 months, and 14 months after the carotid endarterectomy operation by MBL genotypes is shown separately in patients with the A/A genotype (A) and A/O or O/O genotypes (B), Changes in the CDS values for male and females patients with high (⬎500 ␮g/L) and low (ⱕ500 ␮g/L) MBL serum concentrations are shown in (C) and (D), respectively. The data were evaluated by 2-way ANOVA test. Probability values denote differences compared with the 6 weeks values. The significance of the differences in the CDS values between males and females are P⫽0.0038, P⫽0.2056, P⬍0.001, and P⫽0.1987 for (A), (B), (C), and (D), respectively.

Rugonfalvi-Kiss et al

MBL and Restenosis After Carotid Endarterectomy

Distribution of Carriers of Normal and Variant MBL Genotypes in 17 and 29 Patients, Respectively, Who Had or Had Not at Least 50% Restenosis After Carotid Eversion Endarterectomy Operations Patients With Restenosis, n⫽17 (%)

Patients With No Restenosis, n⫽29 (%)

P, ␹2 for Trend

A/A carriers

10 (59)

7 (24)

0.007

A/O carriers

7 (41)

16 (55)

O/O carriers

0 (0)

6 (21)

Variable: MBL Genotypes

A/A vs A/O⫹O/O, ␹2, P⫽0.024.

with high MBL concentration (⬎500 ␮g/L) increased significantly in CDS values already at 7 months (P⬍0.001), whereas no significant increase in CDS values was observed in males (Figure 3C). By contrast, CDS values did not significantly change in the male and female patients with low (ⱕ500 ␮g/L) MBL concentration (Figure 3D). Confirmatory evidence for a role of MBL in restenosis after carotid endarterectomy, normal MBL genotype, dominates in patients who had restenosis in a retrospective matched case-control study. MBL genotypes were determined in 17 and 29 patients, respectively, who underwent carotid endarterectomy and did or did not have at least 50% restenosis. The frequency of patients carrying MBL variant genotypes (A/O⫹O/O) was significantly lower in the restenosis than in the control group (P⫽0.024) (Table). Moreover, a ␹2 for trend analysis clearly indicated that the effect was gene dose dependent, showing that homozygous (O/O) carriers of MBL variant alleles were more protected than the heterozygous carriers of MBL variant alleles, which again were more protected than the patients homozygous for the normal A/A genotype (P⫽0.007). In fact, none of the 6 homozygous carriers belonged to the restenosis group (Table).

Discussion This prospective study shows that patients undergoing eversion endarterectomy for carotid stenosis are at higher risk for experiencing restenosis provided they are homozygous for the normal MBL A/A genotype than those carrying 1 or 2 variant MBL alleles (A/O or O/O). As has been shown in other studies a higher rate of restenosis after carotid eversion endarterectomy was seen in females than in males in the prospective study.28 However, significant differences between male and female patients in the restenosis rate were seen only in those who carried the A/A genotype (Figure 3). The findings were corroborated by the analysis of the relationship between MBL serum concentration and restenosis. The observation in the prospective study was substantiated in a retrospective study performed ⬎2.5 years after surgery. In the latter matched case-control study, the gender effect could not be tested. The mechanisms behind the gender effect are at present unknown but suggest a complicated interplay between different genetic and hormonal factors. We cannot rule out conclusively that our findings are caused by linkage disequilibrium to another gene than MBL2 on chromosome 10. However, the results were independently borderline significant at 5% level when we examined the B and

947

D alleles separately, which points at the MBL2 variant genotypes as protective loci (data not shown). The pathophysiological mechanisms behind the association between the MBL genotype and restenosis are unknown. However, it is pertinent to suggest that it involves activation of the complement system, because MBL-associated serine protease 2 initiates activation of the lectin pathway of complement.9 Complement has been implicated in the pathogenesis of ischemia-reperfusion injury in experimental models29 and an involvement of MBL mediated activation of complement has been suggested.20 It is highly probable that early restenosis— defined as disease presenting within 24 months of initial operation—is secondary to the proliferation of medial smooth muscle cells leading to myointimal hyperplastic lesions, whereas late restenosis is caused by atherosclerotic processes.6 Fiane et al found substantial MBLdependent complement activation and cytokine production in patients undergoing thoracoabdominal aortic aneurysm repair with thoracoabdominal cross-clamping, a human in vivo model of ischemia-reperfusion.21 By contrast, no complement activation occurred and low amounts of cytokines were produced when MBL was deficient. In carotid eversion endarterectomy, a short period (15 to 20 minutes) of crossclamping occurs, which in turn may result in ischemic reperfusion injury. Thus, it may be suggested that MBL is deposited after carotid eversion endarterectomy and that complement activation products including the highly active C5a may activate endothelial cells. Activated endothelial cells produce cytokines and growth factors and other molecules, which have been shown to be essential for smooth muscle proliferation, migration, and matrix formation, and for triggering neointimal hyperplasia, giving rise to a viscous circle resulting in restenosis.2 It has been shown that MBL deficiency may be associated with accelerated atherosclerosis16 –18 and also cardiovascular occlusion.19,30,31 Thus, it is likely that the MBL genetic system may promote and protect against inflammation depending on the pathophysiological scenario within the vessel wall and that it is a fine-tuned balance that determines whether complement is an advantage or disadvantage in cardiovascular disease settings. In conclusion, it is shown that the reoccurrence rate of early restenosis after eversion carotid endarterectomy is partially genetically determined because female patients homozygous for the MBL A/A genotype have a significantly higher risk for restenosis than patients with variant MBL genotypes. The effect was found in 2 independent studies and suggests that MBL is a central player in the pathophysiology of this condition.

Acknowledgment Financial support was given from The Novo-Nordisk Research Foundation, the Danish Medical Research Council, ATHERNET (QLG1-CT-2002-90393), grants 138/3001(Z.P.) of the Ministry of Education, 248/2001 (Z.P.), and 196/2003 (G.F.) of the Ministry of Health and the T032661 (G.F.) of the National Research Fund of Hungary. The authors thank Bente Frederiksen, Margit Kovaćs, and Vibeke Weirup for skillful technical assistance.

948

Stroke

May 2005

References 1. Bond R, Rerkasem K, Rothwell PM. Systematic review of the risks of carotid endarterectomy in relation to the clinical indication for and timing of surgery. Stroke. 2003;34:2290 –2301. 2. Hunter GC. Edgar J. Poth Memorial/W.L. Gore and Associates, Inc. Lectureship. The clinical and pathological spectrum of recurrent carotid stenosis. Am J Surg. 1997;174:583–588. 3. Frericks H, Kievit J, van Baalen JM, van Bockel JH. Carotid recurrent stenosis and risk of ipsilateral stroke: a systematic review of the literature. Stroke. 1998;29:244 –250. 4. Zierler RE, Bandyk DF, Thiele BL, Strandness DE, Jr. Carotid artery stenosis following endarterectomy. Arch Surg. 1982;117:1408 –1415. 5. Ricotta JJ, O’Brien MS, DeWeese JA. Natural history of recurrent and residual stenosis after carotid endarterectomy: implications for postoperative surveillance and surgical management. Surgery. 1992;112: 656 – 661. 6. Trisal V, Paulson T, Hans SS, Mittal V. Carotid artery restenosis: an ongoing disease process. Am Surg. 2002;68:275–279. 7. Turner MW, Hamvas RMJ. Mannose-binding lectin: structure, function, genetics and disease associations. Rev Immunogenetics. 2000;2:305–322. 8. Matsushita M, Fujita T. Activation of the classical complement pathway by mannose-binding protein in association with a novel C1s-like serine protease. J Exp Med. 1992;176:1497–1503. 9. Thiel S, Vorup-Jensen T, Stover CM, Schwaeble W, Laursen SB, Poulsen K, Willis AC, Eggleton AC, Hansen S, Holmskov U, Reid KBM, Jensenius JC. A second serine protease associated with mannan-binding lectin that activates complement. Nature. 1997;386:506 –510. 10. Sastry K, Herman GA, Day L, Deignan E, Bruns G, Morton CC, Ezekowitz RAB. The human mannose-binding protein gene. Exon structure reveals its evolutionary relationship to a human pulmonary surfactant gene and localization to chromosome 10. J Exp Med. 1989; 170:1175–1189. 11. Guo N, Mogues T, Weremowicz S, Morton CC, Sastry KN. The human ortholog of rhesus mannose-binding protein-A gene is an expressed pseudogene that localizes to chromosome 10. Mamm Genome. 1998;9: 246 –249. 12. Sumiya M, Super M, Tabona P, Levinsky RJ, Arai T, Turner MW, Summerfield JA. Molecular basis of opsonic defect in immunodeficient children. Lancet. 1991;337:1569 –1570. 13. Lipscombe RJ, Sumiya M, Hill AV, Lau YL, Levinsky RJ, Summerfield JA, Turner MW. High frequencies in African and non-African populations of independent mutations in the mannose binding protein gene. Hum Mol Gen. 1992;1:709 –715. 14. Madsen HO, Garred P, Kurtzhals JAL, Lamm LU, Ryder LP, Thiel S, Svejgaard A. A new frequent allele is the missing link in the structural polymorphism of the human mannan-binding protein. Immunogenetics. 1994;40:37– 44. 15. Garred P, Larsen F, Madsen HO, Koch C. Mannose-binding lectin deficiency-revisited. Mol Immunol. 2003;40:73– 84. 16. Madsen HO, Videm V, Svejgaard A, Svennevig JL, Garred P. Association of mannose-binding lectin deficiency with severe atherosclerosis. Lancet. 1998;352:959 –960.

17. Hegele RA, Ban MR, Anderson CM, Spence JD. Infection-susceptibility alleles of mannose-binding lectin are associated with increased carotid plaques area. J Invest Med. 2000;48:198 –202. 18. Best LG, Davidson M, North KE, MacCluer JW, Zhang Y, Lee ET, Howard BV, DeCroo S, Ferrell RE. Prospective analysis of mannosebinding lectin genotypes and coronary artery disease in American Indians: the Strong Heart Study. Circulation. 2004;109:471– 475. 19. Rugonfalvi-Kiss S, Endresz V, Madsen HO, Burian K, Duba J, Prohaszka Z, Karadi I, Romics L, Gonczol E, Fust G, Garred P. Association of Chlamydia pneumoniae with coronary artery disease and its progression is dependent on the modifying effect of mannose-binding lectin. Circulation. 2002;106:1071–1076. 20. Collard CD, Vakeva A, Morrissey MA, Agah A, Rollins SA, Reenstra WR, Buras JA, Meri S, Stahl GL. Complement activation after oxidative stress: role of the lectin complement pathway. Am J Pathol. 2000;156: 1549 –1556. 21. Fiane AE, Videm V, Lingaas PS, Heggelund L, Nielsen EW, Geiran OR, Fung M, Mollnes TE. Mechanism of complement activation and its role in the inflammatory response after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Circulation. 2003;108:849 – 856. 22. Biller J, Feinberg WM, Castaldo JE, Whittemore AD, Harbaugh RE, Dempsey RJ, Caplan LR, Kresowik TF, Matchar DB, Toole JF, Easton JD, Adams HP, Jr., Brass LM, Hobson RW, Brott TG, Sternau L. Guidelines for carotid endarterectomy: a statement for healthcare professionals from a Special Writing Group of the Stroke Council, Am Heart Association. Circulation. 1998;97:501–509. 23. Entz L, Jaranyi S, Nemes A. Eversion endarterectomy in surgery of the internal carotid artery. Cardiovasc Surg. 1996;4:190 –194. 24. Entz L, Jaranyi Z, Nemes A. Comparison of perioperative results obtained with carotid eversion endarterectomy and with conventional patch plasty. Cardiovasc Surg. 1997;5:16 –20. 25. Miller S, Dykes D, Polesky H. A simple salting out procedure for extracting DNA from nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988;16:1215. 26. Garred P, Strom JJ, Quist L, Taaning E, Madsen HO. Association of mannose-binding lectin polymorphisms with sepsis and fatal outcome in patients with systemic inflammatory response syndrome. J Infect Dis. 2003;188:1394 –1403. 27. Garred P, Madsen HO, Kurtzhals JAL, Lamm LU, Thiel S, Hey AS, Svejgaard A. Diallelic polymorphism may explain variations of blood concentration of mannan-binding protein in Eskimos, but not in black Africans. Eur J Immunogenetics. 1992;19:403– 412. 28. Sarac TP, Hertzer NR, Mascha EJ, O’Hara PJ, Krajewski LP, Clair DG, Karafa MT, Ouriel K. Gender as a primary predictor of outcome after carotid endarterectomy. J Vasc Surg. 2002;35:748 –753. 29. Jordan JE, Montalto MC, Stahl GL. Inhibition of mannose-binding lectin reduces postischemic myocardial reperfusion injury. Circulation. 2001; 104:1413–1418. 30. Limnell V, Aittoniemi J, Vaarala O, Lehtimaki T, Laine S, Virtanen V, Palosuo T, Miettinen A. Association of mannan-binding lectin deficiency with venous bypass graft occlusions in patients with coronary heart disease. Cardiology. 2002;98:123–126. 31. Ølhenschlæger T, Garred P, Madsen HO, Jacobsen S. Mannose-binding lectin variant alleles and the risk of arterial thrombosis in systemic lupus erythematosus. N Engl J Med. 2004;351:260 –267.

V.

Témával összefüggő közlemény 1

DOSA E; Rugonfalvi-Kiss S; Prohaszka Z; Szabo A; Karadi I; Selmeci L; Romics L; Fust G; Acsady G; Entz L. Marked decrease in the levels of two inflammatory markers, hs-C-reactive protein and fibrinogen in patients with severe carotid atherosclerosis after eversion carotid endarterectomy. Inflamm Res. 2004. 53:631-635.

99

© Birkhäuser Verlag, Basel, 2004 Inflamm. res. 53 (2004) 001–05 1023-3830/04/000001-05 DOI 10.1007/s00011-004-1304-y

Inflammation Research

Marked decrease in the levels of two inflammatory markers, hs-C-reactive protein and fibrinogen in patients with severe carotid atherosclerosis after eversion carotid endarterectomy E. Dósa 1, Sz. Rugonfalvi-Kiss 2, Z. Prohászka 2, A. Szabó 1, I. Karádi 2, L. Selmeci 1, L. Romics 2, G. Füst 2, Gy. Acsády 1 and L. Entz 1 1 2

Department of Cardiovascular Surgery, Faculty of Medicine, Semmelweis University, Budapest, Hungary Third Department of Internal Medicine and Research Group of Metabolism, and Atherosclerosis, Semmelweis University and Hungarian Academy of Sciences, Faculty of Medicine, Semmelweis University, Budapest, Kútvölgyi út 4, 1125, Hungary, Fax: 361 225 3899, e-mail: [email protected]

Received 20 April 2004; returned for revision 9 June 2004; accepted by A. Falus 25 June 2004

Abstract. Objective and design: To study changes in the levels of two acute phase proteins, plasma fibrinogen and serum C-reactive protein (hs-CRP) in patients with severe carotid stenosis after eversion endarterectomy. Material and subjects: A total of 117 consecutive patients who underwent eversion endarterectomy were included in the study. Blood samples for acute phase protein measurement were taken before operation as well as 5.7 weeks and 13.8 months (median) post-surgery. Plasma fibrinogen and serum hs-CRP concentrations were promptly determined. Results: During the follow-up period sharp, highly significant (p < 0.0001) drop occurred in the serum concentrations of both acute phase proteins. The drop in the hs-CRP levels during the follow up period was mainly due to decrease in patients with highest baseline CRP levels. Conclusions: Our present findings indicate that removal of atherosclerotic plaques from the carotid arteries markedly decreases the production of two acute phase proteins due to the decrease of the inflammatory burden or the removal of the advanced plaques able to produce these proteins. Key words: CRP – Fibrinogen – Acute phase protein – Atherosclerotic plaque – Endarterectomy

Introduction Inflammatory processes play a pivotal role in the pathogenesis of atherosclerosis and mediate many of the stages from atheroma development to eventual rupture of the unstable atherosclerotic plaque [1]. Elevated plasma levels of several inflammatory markers such as acute phase proteins (C-reactive protein (CRP), fibrinogen, orosomucoid), cytokines Correspondence to: G. Füst

(interleukin-6, tumor necrosis factor-a), and soluble adhesion molecules have been shown to predict future risk of progression of atherosclerosis and/or plaque rupture. Out of these markers CRP seems to have the highest clinical significance. Measurement of CRP with hypersensitive methods (hs-CRP) became a standard clinically useful laboratory marker in cardiology and neurology [1–4]. Several recent findings indicate that there is a strong association between hs-CRP levels and subsequent cardiac events following percutaneous transluminal coronary angioplasty [5–9]. In addition to hs-CRP, measurement of preprocedural fibrinogen also has predictive value concerning coronary stenting [10]. Although hs-CRP predicts progression of atherosclerosis at various sites (carotid, aortic, iliac, lower extremities) in the arterial tree [11], relatively few data are available on the relationship of carotid atherosclerosis and serum concentration of hs-CRP and other acute phase proteins. Hs-CRP concentrations are elevated in symptomatic compared with asymptomatic patients with carotid artery disease [12], and hs-CRP was found to be an independent predictor of the rate of increase in early carotid atherosclerosis [13, 14]. Increased acute phase reactant levels are associated with increased carotid plaque volume [15]. The efficacy of carotid endarterectomy (CEA) for carotid stenosis has been well demonstrated. Early studies established CEA to be a safe procedure with acceptable preoperative morbidity and mortality rates [16], which provides protection against stroke in selected patients with symptomatic and asymptomatic lesions of the internal carotid artery [17]. Restenosis is common after CEA, however, according to a metaanalysis of minor lesions (<50% diameter stenosis) accounts for 59% to 72% of recurrent stenosis [18]. Recently Schillinger et al. [19] reported on a strong positive association between the extent of hs-CRP response and 6-month restenosis after stent implantation in the carotid artery. To our best knowledge, however, no data on longitu-

IR 1304/M

2

dinal measurement of any acute phase protein after carotid endarterectomy have been published. Therefore in the present study we followed up for 14 months not only the clinical status of the patients after carotid endarterectomy but measured serum hs-CRP and plasma fibrinogen levels before operation, 6 weeks and 14 months post-surgery as well. Since advanced atherosclerotic plaques were found to produce high amounts of CRP, long pentraxin PTX3, a protein belonging to the same family as CRP, as well as complement components [20, 21] we assumed that that surgical removal of a large plaque from the carotid artery will affect serum levels of the CRP and probable by indirect way the levels of the other acute phase protein, fibrinogen as well. Materials and methods Patients and controls subjects A total of 117 patients (78 males, 39 females, 64.1 ± 9.1 years (mean ± S.D.) old) who underwent eversion type carotid endarterectomy between October 2000 and March 2003 were included for this prospective study. All patients were followed up for more than one year. Seven patients died during the 13.8 (12.3 – 19.0) long follow-up period, they were excluded from the analysis. The study was approved by the Institutional Review Committee, and the subjects gave informed consent. Clinical history and physical examination were taken with special attention to cardiovascular risk factors as follows: age; gender; current history of smoking; presence of hyperlipidemia, arterial hypertension, diabetes mellitus, peripheral arterial disease, and coronary arterial disease; history of cerebrovascular events; current use of medications. Routine laboratory values, urinalysis results, and chest X-ray findings were used to exclude inflammatory/infectious diseases. We also excluded patients who were already known to have neoplasia. None of the patients had renal, liver, or hematologic disease. Patients with temporal arteritis and/or polymyalgia rheumatica were also excluded. Indication for carotid endarterectomy was in accordance with AHA guidelines [22]. Ninenty-two patients had neurologic symptoms (TIA in 69 patients, minor stroke in 20 patients, major stroke in 3 patients), 44 patients were asymptomatic but had a stenosis of over 70% in diameter of the internal carotid artery. One hundred forty-five apparently healthy subjects (81 males, 64 females, 52.6 ± 10.0 years old) who volunteered for a regular medical check up and gave informed consent served as control . Patients had medical checkup at 5.7 (4.6–8.0) weeks (median (interquartile range)), 6.8 (6.2–7.9) months, and finally 13.8 (12.3–19.0) months after endarterectomy. In all patients the neck arteries were investigated by color duplex ultrasound [5 MHz linear probe, ATL Ultramark 9 HDI (Advanced Technology Laboratories)] and all carotid arterial US was performed by an experienced radiologist. The common carotid artery (CCA), internal carotid (ICA) and external carotid arteries (ECA) on both sides were examined in the standard fashion. All patients had preoperative, 11.13 ± 1.46 weeks, 7.11 ± 0.32 months and 14.66 ± 0.50 months postsurgery duplex scan examinations (ATL Ultramark 9 HDI system). All carotid duplex scans were performed by an experienced radiologist. The common carotid, internal carotid and external carotid arteries on both sides were examined in the standard fashion. The diagnostic criteria for internal carotid artery stenosis and restenosis was based on peak systolic velocities and end diastolic velocities as well as internal carotid artery:common carotid artery ratios. The velocity spectra of the ICA was further categorized as mild (<50%), moderate (50–69%) and severe (≥70%). 7 patients developed restenosis of >50% of diameter during the follow-up while no restenosis occurred in the other 110 patients. Due to the small proportion of the patients with restenosis the two groups were not separately analysed.

E. Do´sa et al.

Inflamm. res.

Determination of the serum concentration of fibrinogen and hs-CRP Blood samples were drawn preoperatively, 4 days after the operation, at the first follow-up examination that is 5.7 (4.6–8.0) weeks weeks after operation and finally 13.8 (12.3–19.0) months postsurgery. Plasma fibrinogen concentrations were promptly determined in the samples by using the method of Clauss. C-reactive protein (hs-CRP) concentrations were measured in serum samples with the ultrasensitive particle-enhanced immunoturbidimetric assay in Cobas Integra Mira Plus400 analyser.

Statistical analysis Statistical analysis was made mostly by using GraphPad Prism V 3.00 software package (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com). Two group comparisons were done with the Mann-Whitney U test, difference in the values within a group over a period of time was measured by nonparametric ANOVA (Kruskal Wallis multiple comparison test); comparison of categorical variables was done with Fisher’s exact test. Multiple regression analysis was done by the SPSS 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) software.

Results Comparison of the baseline hs-CRP and fibrinogen levels measured in patients and in healthy controls Serum levels of hs-CRP were determined in 145 healthy controls, and the preoperative blood samples from 117 patients. Preoperative samples were taken immediately after the admission of the patients, before the preoperative medication was started. The patients had significantly (p < 0.0001) higher median preoperative hs-CRP levels (7.90 (3.45–13.65) mg/L) than the healthy controls (1.93 (1.09–4.07) mg/L). (Fig. 1). Since there were significant differences in the gender distribution and mean age of the patients and controls we calculated by multiple logistic regression if the difference in the CRP level between the two groups remained significant after adjustment for age and gender. A significant (p < 0.0001) difference in the CRP concentration was found between patients and controls even after these adjustments. Since

Fig. 1. Levels of C-reactive protein (CRP) in serum samples from 117 patients taken before operation and from 45 healthy controls. P value calculated by the Mann-Whitney test is indicated.

Vol. 53, 2004

Decrease of acute phase protein levels after endarterectomy

3

plasma fibrinogen values were not available for the group of healthy control subjects, we used laboratory reference values for the evaluation. Fibrinogen levels exceeding the upper limit of the reference values (400 mg/dL) were found in 68 patients that is in 50% of the patients tested. Seven patients died before the end of the follow-up period. The cause of death was acute myocardial infarction in 4 patients. Three other patients died during the follow-up. One patient committed suicide while two patients died due to pulmonary embolism and tumor. There was no significant difference (p = 0.2525) in the preoperative CRP levels of the 4 patients who subsequently died in myocardial infarction (4.19 (2.53–6.29) mg/L) and the whole group of the patients (7.06 (3.08–13,65) mg/L. 37 patients had no symptoms, 60 patients had transient ischaemic attack (TIA), 16 and 3 patients had minor and major stroke, respectively before the operation. There were no significant differences between asymptomatic patients and those with preoperative symptoms (TIA or stroke) in the hs-CRP (p = 0.6025), or fibrinogen levels (p = 0.7302) measured before operation or hs-CRP and fibrinogen levels measured at the end of incubation period (p = 0.8768 and p = 0.4419, respectively). Early changes in the fibrinogen and hs-CRP levels Levels of the two acute phase proteins were determined before operation, 4 days (median) and 5.7 (4.6–8.0) postsurgery in 90 patients (Table 1). There was a sharp, highly significant rise in serum concentrations of both proteins during the acute post-surgery period which went down to the baseline values at the first follow up visit. Changes in the fibrinogen and hs-CRP levels during the follow-up period after carotid endarterectomy Concentrations of the proteins were measured before the operation and at the end of the follow up period, that is 13.8 (12.3 – 19.0) months after endarterectomy (in the followings: at final visit) in all patients (Fig. 2). Both hs-CRP and fibrinogen levels markedly (p < 0.0001) decreased during the follow up period. Serum hs-CRP levels decreased from 7.90 (3.20 – 14,25) mg/L measured preoperatively to 3,00 (1.23 – 7.93) mg/L at the last follow up visit. Plasma

Fig. 2. Serum concentration of CRP and plasma concentration of fibrinogen in 117 patients before carotid endarterectomy, and 13.8 (12.3–19.0) months postsurgery. P values for the Wilcoxon signed rank test are indicated.

fibrinogen levels were 410 (346 – 479) mg/dL and 352 (285 – 401) mg/dL, respectively. When the patients were divided according to the tertiles of the baseline hs-CRP and fibrinogen levels and the concentrations of the two acute phase proteins measured before operation and at final visit were compared (Fig. 3), it turned out that the drop of the hs-CRP (Fig. 3A) levels during the follow up period was mainly due to decrease in patients in the highest tertile of the baseline levels. In the case of fibrinogen (Fig. 3B) highly significant drop occurred in both the medium and highest tertile, while no changes occurred in the patients with plasma fibrinogen concentration at the lowest tertile. We compared the extent carotid stenosis in patients with CRP levels in the highest tertile and the rest of patients. Not only the operated site but the mean of the operated and

Table 1. Changes in the serum concentrations of hs-CRP and fibrinogen during the early phase of the post-surgery period in 90 patients after carotid endarterectomy.

Hs-CRP mg/L, median (interquartile range) Fibrinogen mg/dL, median (inter-quartile range)

Before operation (BO)

4 days post-surgery

P values* (compared to BO value)

5.7 (4.6–8.0) weeks post-surgery

P values* (compared to the 4 days values)

6.44 (2.91–13.38)

17.44 (10.79 – 29.58)

P < 0.001

4.31 (2.05 – 8.56)

P < 0.001

416 (356–474)

511 (452–581)

P < 0.001

387 (333 – 466)

P < 0.001

*Dunn post hoc test after repeated measures ANOVA (Friedman test).

4

E. Do´sa et al.

Inflamm. res.

80 patients, however, hs-CRP and fibrinogen measurements were made before operation, and at both at 5.7 weeks and the final visit which allowed to study the dynamics of changes in the levels of the two acute phase proteins (Table 2). Hs-CRP levels significantly decreased as compared to the levels measured before surgery already at first follow up visit, and the drop continued till the final visit. Plasma fibrinogen concentrations did not change during 6 weeks after eversion endarterectomy but thereafter a significant decrease in this marker was measured too. Lack of medical treatment to influence changes in the plasma fibrinogen levelsL As it is expected for a group of patients with severe atherosclerosis, most patients received drugs which may affect fibrinogen levels, such as beta receptor blocking drugs (62 patients), ACE-inhibitors (86 patients), other antihypertensive drugs (18 patients), statins (23 patients) or platelet aggregation inhibitors (94 patients). In most (99/116) patients, however, no changes in the medical treatment occurred postsurgery compared to the preoperative period. When the two groups were compared no significant difference (p = 0.6771) in the extent of the decrease in fibrinogen levels during the follow up period was detected. Discussion Fig. 3. Changes in the serum CRP (A) and plasma fibrinogen (B) levels during the follow up period as compared to the respective tertiles of the baseline levels of the two acute phase proteins. P values calculated by the Mann-Whitney test are indicated.

ipsilateral site were considered. There were, however, no differences between patients with CRP levels in the highest tertile and the rest of the patients either in the extent of carotid stenosis at the operated site (p = 0.7157) or the mean value of the two sites (p = 0.4061). Similar no difference was found in the case of high fibrinogen levels as well. Dynamics of the changes in acute phase protein levels In 37 patients acute phase proteins levels were not determined at the first visit since they did not presented at it. All these patients, however, attended the last follow up visit. In

We report here on novel observations obtained in 117 patients with severe carotid atherosclerosis who underwent eversion endarterectomy and followed up for a median time of 13,8 months. We found a sharp and highly significant decrease in the concentrations in two acute phase proteins, serum hs-CRP and plasma fibrinogen after surgical removal of the atherosclerotic plaques. To our knowledge no data on longitudinal measurements of either acute phase protein after endarterectomy were published so far. On the other hand, the present observations are in line with the earlier findings of Montalescot et al. [23] obtained in patients after coronary angioplasty: patients with high fibrinogen concentration at follow up within 6 months had higher restenosis rates than patients with low fibrinogen concentration. Apparently it is surprising that removal of atherosclerotic plaques by surgical intervention from one site of the arterial tree results in such dramatic changes in the production of hs-

Table 2. Serum concentration of hs-CRP and fibrinogen before and after carotid endarterectomy. CRP, mg/L Median (25th–75th percentile)

CRP, mg/L Fibrinogen, mg/dL

Before operation

5.7 weeks after operation

13.8 months after operation

Friedman test, p value

6.95 (3.00–13.55) 416 (348–478)

4.31 (2.19 – 9.26 * 380 (330–460)

3.01 (1.23 – 8.31) ** 371 (307–420)**

< 0.0001 <0.0001

Dunn post hoc test after repeated measures ANOVA (Friedman test) compared to the preoperative values, *p < 0.01, **p < 0.001.

Vol. 53, 2004

Decrease of acute phase protein levels after endarterectomy

CRP and fibrinogen. No definite explanation for this finding can be given at the present time. Since most patients were given the same medical treatment pos-surgery as in the preoperative period, it seems probable, that the operation itself resulted in a marked attenuation of the inflammatory burden of the patients: overall decrease of serum hs-CRP is due to an almost three-fold drop that occurred in patients who had the baseline hs-CRP levels at the highest tertile that is produced the highest amounts of hs-CRP. A similar but less sharp difference was found in the case of fibrinogen, overall drop of the plasma fibrinogen levels during the follow up period was due to decrease in patients with baseline fibrinogen levels in the medium and highest tertiles. Recent findings of Hashimoto et al. [13] who concluded that hs-CRP concentration is a marker of carotid atherosclerotic activity rather than the extent of atherosclerosis also seem to be relevant for understanding the mechanism of our present observations. In addition to this indirect mechanism, however, it is possible that the removed plaques also significantly contributed to the production of the acute phase proteins. Hs-CRP belongs to the pentraxin protein family. According to the studies of Rolph at al. [20] an other member of the family PTX3 is produced in advanced carotid atherosclerotic plaques. More importantly, Yasojima et al. [21] detected 10.2-fold higher hs-CRP at mRNA and protein levels in post-mortem samples from atherosclerotic plaques compared to normal arterial tissues. Other observations of the present study such as the significantly higher hs-CRP and fibrinogen levels in patients with severe carotid atherosclerosis are in agreement with the results of previous studies [12, 14, 15] On the other hand, in contrast to the findings of Rerkasem et al. [12] we did not find significantly elevated hs-CRP concentrations in symptomatic compared with asymptomatic patients with carotid artery disease. Clearly this study can be considered only as hypothesis generating and should be retested in patients and animal experiments as well. In an unpublished study of another institute performed in collaboration with us (Tamás L. et al, manuscript in preparation) we found a similar sharp decrease in hs-CRP serum levels in patients with high initial hs-CRP concentrations followed up for a more than one year long period after eversion endarcterectomy.

5

[5]

[6]

[7]

[8] [9] [10] [11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

Acknowledgements. This work was supported by the ATHERNET (QLG1-CT-2002-90393) grant of EC, grants 138/3001(ZP) of the Ministry of Education, 248/2001 (ZP) of the Ministry of Health and the T032661 (GF) of the National Research Fund of Hungary

[18]

References

[20]

[1] Blake GJ, Ridker PM. Novel clinical markers of vascular wall inflammation. Circ Res 2001; 89: 763–71. [2] Yeh ET, Willerson JT. Coming of age of C-reactive protein: using inflammation markers in cardiology. Circulation 2003; 107: 370– 71. [3] Ridker PM. Clinical application of C-reactive protein for cardiovascular disease detection and prevention. Circulation 2003; 107: 363–69. [4] Pearson TA, Mensah GA, Alexander RW, Anderson JL, Cannon RO, III, Criqui M et al. Markers of inflammation and cardiovascular disease: application to clinical and public health practice: A statement for healthcare professionals from the Centers for Dis-

[19]

[21] [22]

[23]

ease Control and Prevention and the American Heart Association. Circulation 2003; 107: 499–511. Buffon A, Liuzzo G, Biasucci LM, Pasqualetti P, Ramazzotti V, Rebuzzi AG et al. Preprocedural serum levels of C-reactive protein predict early complications and late restenosis after coronary angioplasty. J Am Coll Cardiol 1999; 34: 1512–21. Angioi M, Abdelmouttaleb I, Rodriguez RM, Aimone-Gastin I, Adjalla C, Gueant JL et al. Increased C-reactive protein levels in patients with in-stent restenosis and its implications. Am J Cardiol 2001; 87: 1189–93. Dibra A, Mehilli J, Braun S, Hadamitzky M, Baum H, Dirschinger J et al. Association between C-reactive protein levels and subsequent cardiac events among patients with stable angina treated with coronary artery stenting. Am J Med 2003; 114: 715–22. de Winter RJ, Koch KT, van Straalen JP, Heyde G, Bax M, Schotborgh CE et al. C-reactive protein and coronary events following percutaneous coronary angioplasty. Am J Med 2003; 115: 85–90. Anderson JL, Muhlestein JB. Restenosis after coronary intervention: narrowing C-reactive protein’s prognostic potential? Am J Med 2003; 115: 147–49. Otsuka M, Hayashi Y, Ueda H, Imazu M, Kohno N. Predictive value of preprocedural fibrinogen concerning coronary stenting. Atherosclerosis 2002; 164: 371–78. Van Der Meer, I, de Maat MP, Hak AE, Kiliaan AJ, Del Sol AI, Van Der Kuip DA et al. C-reactive protein predicts progression of atherosclerosis measured at various sites in the arterial tree: the Rotterdam Study. Stroke 2002; 33: 2750–55. Rerkasem K, Shearman CP, Williams JA, Morris GE, Phillips MJ, Calder PC et al. C-reactive protein is elevated in symptomatic compared with asymptomatic patients with carotid artery disease. Eur J Vasc Endovasc Surg 2002; 23: 505–9. Hashimoto H, Kitagawa K, Hougaku H, Shimizu Y, Sakaguchi M, Nagai Y et al. C-reactive protein is an independent predictor of the rate of increase in early carotid atherosclerosis. Circulation 2001; 104: 63–7. Magyar MT, Szikszai Z, Balla J, Valikovics A, Kappelmayer J, Imre S et al. Early-onset carotid atherosclerosis is associated with increased intima-media thickness and elevated serum levels of inflammatory markers. Stroke 2003; 34: 58–63. Gronholdt ML, Sillesen H, Wiebe BM, Laursen H, Nordestgaard BG. Increased acute phase reactants are associated with levels of lipoproteins and increased carotid plaque volume. Eur J Vasc Endovasc Surg 2001; 21: 227–34. Coe DA, Towne JB, Seabrook GR, Freischlag JA, Cambria RA, Kortbein EJ. Duplex morphologic features of the reconstructed carotid artery: changes occurring more than five years after endarterectomy. J Vasc Surg 1997; 25: 850–56. Endarterectomy for asymptomatic carotid artery stenosis. Executive Committee for the Asymptomatic Carotid Atherosclerosis Study. JAMA 1995; 273: 1421–28. Hunter GC. Edgar J. Poth Memorial/W.L. Gore and Associates, Inc. Lectureship. The clinical and pathological spectrum of recurrent carotid stenosis. Am J Surg 1997; 174: 583–8. Schillinger M, Exner M, Mlekusch W, Rumpold H, Ahmadi R, Sabeti S et al. Acute-phase response after stent implantation in the carotid artery: association with 6-month in-stent restenosis. Radiology 2003; 227: 516–21. Rolph MS, Zimmer S, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A, Hansson GK. Production of the long pentraxin PTX3 in advanced atherosclerotic plaques. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22: e10–e14. Yasojima K, Schwab C, McGeer EG, McGeer PL. Generation of C-reactive protein and complement components in atherosclerotic plaques. Am J Pathol 2001; 158: 1039–51. Biller J, Feinberg WM, Castaldo JE, Whittemore AD, Harbaugh RE, Dempsey RJ et al. Guidelines for carotid endarterectomy: a statement for healthcare professionals from a Special Writing Group of the Stroke Council, American Heart Association. Circulation 1998; 97: 501–9. Montalescot G, Ankri A, Vicaut E, Drobinski G, Grosgogeat Y, Thomas D. Fibrinogen after coronary angioplasty as a risk factor for restenosis. Circulation 1995; 92: 31–8.

VI.


SZEPLAKI G; Prohaszka Z; Duba J; Rugonfalvi-Kiss S ; Karadi I; Kokai M; Kramer J; Fust G; Kleiber M; Romics L; Varga L. Association of high serum concentration of the third component of complement (C3) with pre-existing severe coronary artery disease and new vascular events in women. Atherosclerosis. 2004. 177:383-389.

105

Atherosclerosis 177 (2004) 383–389

Association of high serum concentration of the third component of complement (C3) with pre-existing severe coronary artery disease and new vascular events in women Gábor Széplakia , Zoltán Prohászkaa,b , Jen˝o Dubac , Szabolcs Rugonfalvi-Kissa , István Karádia,b , Márta Kókaia , Judit Kramerd , George Füsta,b , Mónika Kleibere , László Romicsa,b , Lilian Vargaa,∗ b

a Third Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine, Semmelweis University, K´ utvölgyi u´ t 4 Budapest H-1125, Hungary Research Group of Atherosclerosis and Metabolism, Semmelweis University and Hungarian Academy of Sciences, Budapest, Hungary c National Institute of Cardiology, Budapest, Hungary d Central Laboratory, St. John’s Hospital, Budapest, Hungary e Central Laboratory, K´ utvölgyi Clinical Center, Semmelweis University, Budapest, Hungary

Received 9 January 2004; received in revised form 21 May 2004; accepted 22 July 2004 Available online 11 September 2004

Abstract Atherosclerosis is an inflammatory disease. The complement system plays an important role in the atherosclerotic process. However, lesser data is available on the possible role of C3 as a risk factor for atherosclerosis. Therefore, in a follow up study we determined C3 levels in 266 patients with pre-existing severe coronary artery disease (CAD) and compared their serum C3 concentrations with the cause of the disease. We investigated whether C3 levels predict the major complications of severe CAD during a 5-year long follow up period in patients, who have received an aorto-coronary bypass graft surgery. C3 concentrations were elevated in the patients with severe CAD compared to 182 healthy controls, and women had higher C3 concentrations than men. Pathological C3 levels (C3≥1.8 g/L) were able to predict major complications of atherosclerosis (death by cardiac events, new acute myocardial infarction, stroke, carotid surgery and peripheral arterial disease) that developed during the follow up period only in women (OR: 4.1, 95% C.I. 1.23–13.61, p = 0.0249) independent of other risk factors for atherosclerosis. Our data supports the assumption that high C3 indicates the progression of atherosclerosis as a special marker of chronic inflammation. © 2004 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. Keywords: Atherosclerosis; Complement; C3; Inflammation; Myocardial infarction; Coronary artery disease

1. Introduction Several studies show evidence that atherosclerosis is an inflammatory disease [1,2]. The role of the complement system in the chronic inflammatory process is also described by several reports [3–5]. Early studies already pointed out the presence of elevated concentrations of complement components in the circulation of patients with atherosclerosis [6] ∗

Corresponding author. Tel.: +361 212 9351. E-mail address: [email protected] (L. Varga).

0021-9150/$ – see front matter © 2004 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.atherosclerosis.2004.07.022

and the presence of activated complement components in the atherosclerotic lesions [7]. Some recent reports focus on the co-localization of some products of complement activation and other risk factors of atherosclerosis [4,8–10]. A possible activator could be C-reactive protein (CRP) [9], which activates the complement cascade via the classical pathway [11,12]. Circulating C3, an acute phase protein produced by the liver and macrophages is a useful marker of inflammation. However, it has been rarely studied as a risk factor for atherosclerosis [13–16]. The serum concentration of C3 cor-

384

G. Széplaki et al. / Atherosclerosis 177 (2004) 383–389

relates with several risk factors, such as age, body mass index (BMI), blood pressure, cholesterol and triglyceride levels, and history of smoking or hypertension [15]. Recently, we also found significant positive correlation between C3 levels, BMI and serum lipid concentrations in healthy Hungarian subjects [17]. According to the studies of Muscari et al., high C3 levels are able to predict acute myocardial infarction in men [14]. Our purpose for this study was to examine the possible role of C3 in assessing risks for the severe complications of atherosclerosis; focusing also on women, who are often left out of studies on cardiovascular diseases. The study was performed in patients with pre-existing severe coronary artery disease, who were followed up for 5 years after a coronary bypass surgery.

2. Methods 2.1. Patients and controls Two hundred and sixty six (67 women and 199 men, aged 41–85 years) Hungarian patients with severe coronary artery disease (CAD) were included in the present study. The diagnosis was based on clinical signs of stable or unstable angina pectoris, typical ECG changes and signs of severe stenosis confirmed by coronary angiography using Judkin’s technique. Between 1995 and 1996 all patients received an aortocoronary bypass graft (ACBG) by an open-heart surgery in the National Institute of Cardiology, Budapest. Those with >140 mmHg systolic or >90 mmHg diastolic blood pressure were treated with anti-hypertensive drugs; lipid-lowering therapy was used when serum total cholesterol or triglycerides exceeded 5.6 or 2.2 mmol/L, respectively. The serum and DNA samples were collected 6 months after the coronary bypass operation, when none of the patients were showing clinical signs of acute inflammation. The samples were deep frozen in −70 ◦ C until used for the laboratory examinations. In December 2000, we sent a questionnaire to the patients on the occurrence of new events after the operation (death of the patient, new acute myocardial infarction (AMI), stroke, carotid surgery and peripheral arterial disease). Patients were asked to detail their medical history. All events were linked to hospital admissions according to their questionnaire data. The indication for carotid artery surgery in Hungary is in accordance with the current AHA guidelines: patients had stenosis over 70% of the internal carotid artery or have had TIA previously. Peripheral artery diseases was mentioned when patients had the exmission diagnosis, or were under treatment for it. In 4 months, most of the patients (239) sent back questionnaires that could be properly evaluated. On an additional 27 patients we were able to gather information by contacting the family doctors. One hundred and eighty two healthy controls (100 women and 82 men, Hungarian blood donors or volunteers, aged 20–79 years) took part in this study. All of them were ex-

amined and asked about any diseases. Only healthy subjects without any clinical signs or suspicion of CAD were enrolled in this study. The local ethical committee approved the study and all subjects gave informed consent. Some of the patients and controls have been recently described [18–20]. 2.2. Laboratory procedures Serum C3 concentrations were measured by radial immunodiffusion method [21]. We used the following reagents: anti-human C3 Complement IgG Fraction (DiaSorin Inc., Stillwater, USA) as the antibody and Human Serum Protein Calibrator (DAKO A/S, Glostrup, Denmark) as the standard. Serum CRP concentrations were measured by particle enhanced immunturbidimetric assay (Roche, Cobas Integra 400, detection limit: 0.07 mg/L, coefficient variation 3.9% at 108 mg/L mean value), as described previously [19]. Serum cholesterol and triglyceride levels were determined by enzymatic colorimetric assays using Enzachol-F and ENZGlycide reagents (Diachem). As a part of our study, we studied the polymorphism of the C3 gene also. C3 allotypes were determined by the method of Teisberg [22] as described previously [20]. 2.3. Statistical analysis Since many variables had non-Gaussian distributions, we used the Mann–Whitney test for comparisons between groups, Fisher’s exact test to compare frequencies and Spearman’s rho coefficient to calculate correlations. Multiple logistic regressions were also performed. The calculations were performed with Prism 3.0 (GraphPad Software, San Diego California, USA) for descriptive statistics, Mann–Whitney test and Fisher’s exact test and SPSS for Windows 10.0 and 11.5 (SPSS Inc., Chicago Illinois, USA) for Spearman’s nonparametric correlations and multiple logistic regressions. Values presented in the text are median values (interquartile range).

3. Results 3.1. Serum C3 concentrations in patients and controls Serum concentrations of C3 were compared in 266 patients with severe CAD and 182 healthy controls. The analysis was separately performed on men and women (Table 1). Serum C3 concentrations were significantly higher in the patients than in the controls. In both groups we measured significantly higher C3 levels in women than in men. (Table 1). The normal ranges for serum C3 level in our laboratory is 0.70–1.80 g/L, values above and below that range indicate pathological changes. Elevated C3 levels (C3 ≥ 1.8 g/L) were found in 16 out of the 67 (23.88%) female patients with severe CAD, compared to 18 out of the 199 (9.05%) male patients, which is also a significant difference (p = 0.0029). Consid-


385

Table 1 Differences in serum C3 levels in patients and control subjects by gendera

Patients Controls p-value a

Women

Men

p-value

Total

1.48 (1.14–1.79) (n = 67) 1.31 (1.08–1.48) (n = 199) 0.0037

1.26 (1.08–1.55) (n = 100) 1.09 (0.96–1.38) (n = 82) <0.0001

0.0043 0.0018

1.30 (1.08–1.60) 1.19 (1.01–1.43) 0.0002

Values presented as median (interquartile range) and number of subjects, p-value was calculated with Mann–Whitney’s nonparametric test.

ering the gender-related differences in the C3 concentrations we made all the following calculations for women and men separately.

3.2. Analysis of the relationship between high C3 levels and other risk factors Age, systolic and diastolic blood pressure, BMI as well as serum total cholesterol, triglyceride and CRP concentrations were significantly higher in patients compared to healthy subjects in both sexes (Table 2). Considering these differences in risk factors between the patients and healthy controls, we performed a multiple logistic regression analysis to test whether the differences between patients and controls in C3 levels remain significant after adjustment to these factors (Table 3). High serum C3 concentrations occurred significantly (OR: 12.921.48–112.68, p = 0.021) more frequently in female patients than in the female controls even after adjustment for CRP concentrations, age, BMI, systolic and diastolic blood pressure, and total cholesterol and triglyceride levels. By contrast the adjusted odds ratio of males with high C3 levels to have severe CAD was not found to be significant (Table 3).

3.3. Association of serum C3 levels with history of smoking in the patients Serum C3 concentrations were compared according to the patient’s smoking status in women and in men respectively. Data on smoking habits of the patients were available in 259/266 (97.4%) cases (64/67 and 195/199 in women and men, respectively). Due to the small number of current female smokers, patients were categorized into two group, ever (i.e. current and past smokers) and never smokers. We found no significant differences in C3 levels according to the smoking habit in the patients in both genders (Table 4). 3.4. Correlation between serum concentrations of serum C3 concentrations, CRP, age, BMI and lipid levels in the different study groups Table 4 shows the correlation of C3 concentrations to CRP, age, BMI, total cholesterol and triglyceride levels in male and female patients and controls separately. We found significant positive correlations between C3 and CRP levels in all study groups. Age did not correlate to the C3 in groups of female patients and controls and male patients, but there was a significant positive correlation between the age of the healthy men and their serum C3 concentration. Strong positive cor-

Table 2 Comparison of patients and control subjects by risk factors for atherosclerosis, divided by gendera Women

Men

Patients (n = 67)

Controls (n = 100)

Age, (years)

60.25 (46.68–64.88)

46.00 (37.00–51.00)

BMI, (kg/m2)

29.00 (27.00–30.00)

SBP, (mmHg)

p-value

Patients (n = 199)

Controls (n = 82)

p-value

< 0.0001

63.75 (57.94–69.92)

48.00 (46.00–56.00)

< 0.0001

24.22 (22.01–27.53)

< 0.0001

29.00 (26.00–31.00)

27.08 (24.55–29.07)

0.0001

140.0 (130.0–160.0)

128.5 (118.5–140.5)

< 0.0001

140.0 (121.0–150.0)

130.0 (120.0–140.0)

0.0078

DBP, (mmHg)

90.0 (80.0–91.0)

77.0 (69.5–83.0)

< 0.0001

80.0 (80.0–90.0)

80.0 (75.0–84.0)

0.0004

TC, (mmol/L)

6.50 (5.50–7.50)

5.43 (4.66–6.24)

< 0.0001

6.30 (5.45–7.35)

5.60 (5.09–6.11)

< 0.0001

TG, (mmol/L)

2.15 (1.55–2.90)

1.18 (0.83–1.73)

< 0.0001

2.10 (1.30–2.95)

1.36 (0.98–2.40)

< 0.0001

CRP, (mg/L)

4.06 (1.77–9.03)

2.08 (0.97–4.79)

0.0007

3.90 (2.03–7.22)

1.62 (0.65–3.75)

< 0.0001

a Values presented as number of subjects, median (interquartile range), p-value was calculated with Mann–Whitney’s nonparametric test. Abbreviations used, BMI: body mass index, SBP: systolic blood pressure, DBP: diastolic blood pressure, TC: total cholesterol, TG: triglycerides, CRP: C-reactive protein.

386


Table 3 Multiple regression analysis of C3 ≥ 1.8 g/L vs. C3 < 1.8 g/L values in patients vs. controls adjusted for all measured risk factors in women and men, respectivelya Women

C3 ≥ 1.8g/L vs. C3 < 1.8 g/L CRP Age BMI SBP DBP TC TG

Men

Odds ratio (95% C.I.)

p-value

Odds ratio (95% C.I.)

p-value

12.92 (1.48–112.68) 0.92 (0.82–1.04) 1.26 (1.14–1.38) 0.96 (0.79–1.16) 0.98 (0.93–1.04) 1.10 (1.00–1.21) 1.38 (0.82–2.33) 3.38 (1.25–9.16)

0.021 0.200 0.000 0.670 0.504 0.039 0.229 0.016

1.83 (0.33–10.12) 1.05 (0.97–1.15) 1.20 (1.13–1.28) 1.23 (1.07–1.42) 0.98 (0.65–1.01) 1.05 (1.00–1.11) 1.79 (1.20–2.64) 1.07 (0.74–1.54)

0.486 0.238 0.000 0.003 0.197 0.071 0.004 0.716

a Abbreviations used, CRP: C-reactive protein, BMI: body mass index, SBP: systolic blood pressure, DBP: diastolic blood pressure, TC: total cholesterol, TG: triglycerides.

relation was found between serum C3 levels and BMI in both the healthy men and women, in patients this correlation was found to be significant only in men. Serum C3 levels exhibited significant or nearly significant positive correlation to lipids in healthy subjects of both sexes but in the patient’s group such correlation could be detected only in men (Table 5).

To avoid mistakes occurring from the correlation of C3 to other risk factors, we studied whether the age, BMI, blood pressure, total cholesterol and triglyceride values were different in women with complications compared to women without any complications. No significant differences were found between the two groups, except differences of marginal significance in age (p = 0.081) and BMI (0.076) of the patients. A

3.5. Predictive values of the baseline C3 levels on the occurrence of pathological vascular events during the follow up period In the 65.8 ± 5.8-months long follow up period following the bypass operation, 57/266 patients (18/67 women and 39/199 men) had at least one out of the following severe vascular manifestations of atherosclerosis: death by cardiac events, new acute myocardial infarction, stroke, carotid surgery and peripheral arterial disease. Baseline C3 levels were compared in patients with and without complications (Fig. 1). In women, but not in men, C3 levels were found significantly higher in those who suffered any atherosclerosis related diseases after receiving the ACBG. High C3 levels (>1.8 g/L) occurred in 8/18 female patients with complication but only in 8/49 patients who did not develop any complication during the follow up. The odds ratio of patients with high C3 levels to develop complication was 4.1 with a 95% confidence interval of 1.23 to 13.61 (p = 0.0249). In men no such relation was found, 2/39 and 16/160 patients with and without complication (p = 0.530) had high C3 levels. Table 4 Association of C3 concentrations with smoking habits of the patients in women and men, respectivelya Ever smokers (current and past smokers) A. Women n (%) C3 (g/L) B. Men n (%) C3 (g/L) a

Never smokers

p

45 (71.31%) 1.33 (1.07–1.80)

19 (29.69%) 1.58 (1.19–1.76)

0.318

138 (70.77%) 1.27 (1.07–1.53)

57 (29.23%) 1.24 (1.07–1.58)

0.855

Values presented as median (interquartile range) and number of subjects (%), p-value was calculated with Mann–Whitney’s nonparametric test.

Fig. 1. Comparison of serum C3 concentrations in patients with and without complications during the follow-up period in women and men respectively. In women C3 levels were found significantly higher than those who suffered any atherosclerosis related diseases compared to those who had not, after receiving the aorto-coronary bypass-graft (1.70 (1.32–1.95) vs. 1.33 (1.09–1.71), p = 0.0364). In men no such relation was found (1.13 (1.00–1.57) vs.1.32 (1.09–1.54), p = 0.0905). Lines indicating median values and interquartile ranges, p-values calculated with Mann–Whitney’s nonparametric test.


387

Table 5 Correlation of C3 to some risk factors in women and mena CRP

Age

BMI

TC

TG

Patients Controls

0.490 (0.000) 0.263 (0.008)

–0.034 (0.797) 0.005 (0.958)

0.122 (0.340) 0.322 (0.002)

0.179 (0.151) 0.245 (0.016)

0.007 (0.956) 0.403 (0.000)

CRP

Patients Controls

– –

–0.018 (0.907) 0.235 (0.019)

0.362 (0.012) 0.419 (0.000)

0.106 (0.467) 0.235 (0.020)

0.322 (0.024) 0.418 (0.000)

Age

Patients Controls

– –

−0.150 (0.261) 0.382 (0.000)

−0.085 (0.520) 0.350 (0.000)

−0.125 (0.342) 0.331 (0.001)

BMI

Patients Controls

– –

−0.027 (0.834) 0.197 (0.063)

0.259 (0.040) 0.473 (0.000)

TC

Patients Controls

– –

0.193 (0.120) 0.582 (0.000)

A. Women C3

B. Men C3

Patients Controls

0.261 (0.001) 0.279 (0.012)

−0.097 (0.224) −0.288 (0.009)

0.189 (0.008) 0.418 (0.000)

0.152 (0.032) 0.207 (0.066)

0.218 (0.002) 0.237 (0.034)

CRP

Patients Controls

– –

−0.029 (0.743) 0.274 (0.013)

0.196 (0.018) 0.256 (0.024)

0.022 (0.790) 0.254 (0.064)

0.182 (0.028) 0.334 (0.003)

Age

Patients Controls

– –

−0.191 (0.011) −0.041 (0.721)

−0.061 (0.417) 0.324 (0.003)

−0.125 (0.096) 0.071 (0.529)

BMI

Patients Controls

– –

0.120 (0.095) 0.120 (0.298)

0.173 (0.015) 0.534 (0.000)

TC

Patients Controls

– –

0.375 (0.000) 0.376 (0.001)

a

Values presented as Spearman’s rho (p-value). Abbreviations used, CRP: C-reactive protein, BMI: body mass index, TC: total cholesterol, TG: triglycerides.

multiple logistic regression analysis was performed in female patients to calculate the predictive value for the development of major vascular events of high serum C3 concentrations after adjustment for age, BMI and history of smoking (Table 6). The predictive value of the high C3 levels remained approximately the same after adjustment (odds ratio is 4.777 with 95% confidence interval of 1.137–20.070 for new complications, p = 0.033). 3.6. Relationship between C3 concentrations and polymorphism of the C3 gene To test whether the predictive value of elevated serum C3 concentrations is linked to different allotypes of the C3 gene, or not, we determined the patient’s genotypes and analyzed their C3 concentrations (Table 7). No significant differ-

ences were found between patients according to their genotypes.

4. Discussion The principal novel finding in this present study is that elevated (>1.8 g/l) C3 levels are able to predict major complications of atherosclerosis (death by cardiac events, new acute myocardial infarction, stroke, carotid surgery and peripheral arterial disease) that developed during a 5-year long follow up period in women with severe CAD. Adjustment to age, BMI and smoking status did not diminish the predictive value of the high baseline C3 levels. This observation is in line with the previous findings of Muscari et al. [14], which indicated that C3 is a strong and in-

Table 6 The predictive value of elevated C3 levels in women adjusted for age, body mass index and history of smokinga Variable

B

S.E.

Significance

Odds ratio

95% C.I. for OR

C3 ≥ 1.8 g/L vs. C3 < 1.8 g/L Age BMI History of smoking Constant

1.564 0.099 0.148 0.287 −12.878

0.732 0.049 0.098 0.602 5.333

0.033 0.045 0.131 0.634 0.016

4.777 1.104 1.160 1.332 0.000

1.137–20.070 1.002–1.216 0.957–1.406 0.409–4.337

a

Age and body mass index (BMI) are continuous variables, while history of smoking is a categorical variable (the categories are: ever (i.e. current and past) and never smokers) in the model.

388


Table 7 Serum C3 Concentrations in patients carrying different C3 phenotypesa SSb A. Women n 49 C3 (g/L) 1.43 (1.12–1.71) p vs. FS 0.5475 B. Men n 129 C3 (g/L) 1.28 (1.09–1.54) p vs. FF 0.8733 p vs. FS 0.4268

FSb

FFb

16 1.70 (1.15–1.86) –

1 1.48 (1.48–1.48) –

57 1.23 (1.08–1.54) 0.6879 –

9 1.26 (0.99–1.93) – –

a Values presented as number of patients and C3 concentrations as median (interquartile range), p-values calculated with Mann–Whitney’s nonparametric test. b S and F are indicating the two most common alleles of the C3 gene; slow (S) and fast (F).

dependent predictor of AMI and CAD. Authors found that high serum C3 concentration was significantly (p < 0.0005) associated with any ischemic events, CAD and myocardial infarction which developed during a 4-year follow-up period [14], however, obtained their results in a random population, where no subjects had any ischemic events at the time of taking baseline blood samples. Our present findings together with those of Muscari et al. [14] indicates that high C3 levels can be considered as a strong and independent predictor of the progression of atherosclerotic vascular diseases. There is an important difference between the results of our present findings and the previous study of Muscari et al. [14]. They found that serum C3 was a particularly powerful indicator of myocardial infarction in men, while according to our study high C3 levels predict complications only in women. In agreement with the previous findings of Muscari’s group [13,14], we found significantly higher C3 levels in the patients with severe CAD as compared to the healthy controls. Complement activation [23] and acute phase reaction [24] follows cardiac surgery. C3 is a positive acute phase reactant therefore, elevated concentrations measured after the ACBG may have spoiled our results. Complement activation and consumption was detected during postoperative period but the level of complement components (C3 and C4) returned to normal within several days in a timedependent fashion after cardiopulmonary bypass operations [25]. Therefore, 6 months after the ACBG surgery, the level of C3 is not affected by the post-surgical acute phase reaction, so we precluded this factor in our study. According to our data, elevated C3 concentrations remained associated with the severity of the atherosclerotic process, post-surgery as well. In principle, increased C3 levels in patients with severe CAD can be explained by different mechanisms. One possible explanation of the predictive value of C3 levels could be the allelic differences in the C3 gene. We [20] and others [26] have already shown in previous reports that

carriers of the C3*F allele have increased risk of atherosclerosis. However, no association was found between the different allotypes of the C3 gene and the serum C3 concentrations in the present study. Another possible explanation is the relation of C3 to BMI and serum lipids. The lipid profile was poor for our patients; median levels were above the wanted for total cholesterol and triglycerides, notwithstanding with the lipid lowering therapy. According to the literature data [15] and our recently published findings [17], in our present study C3 levels correlated with BMI, cholesterol and triglycerides in our control group which consisted of healthy subjects. But in female patients, where C3 showed significant predictive value these correlations were missing indicating that predictive value of high baseline C3 levels are independent of the lipid risk factors of atherosclerosis. Finally, the most probable explanation of our results is that C3 is an acute phase reactant. Our data is compatible with the assumption that high C3 indicates the progression of atherosclerosis as a specific marker of chronic inflammation. In addition to the differences between patients and healthy subjects we found gender-related differences in C3 levels too, median C3 levels were found to be higher in women than in men in both patients and control subjects in our study population. This observation supports earlier findings of Muscari et al. [14,15] who also measured high C3 levels more frequently in women than in men. Muscari et al. [15] explained their findings with the accumulation of subjects with high C3 levels in elderly women, they found a positive correlation between C3 levels and age of their female patients. In the present study, however, we did not find positive correlation between serum C3 levels and age. Besides these data only scarce studies were published on the gender related differences in C3 levels with no significant differences between boys and girls [27] and adult women and men [28]. Unfortunately, we did not have detailed data of the hormonal status of our subjects. The mean age for menopause is 50 years in Hungary. 60/67 (89.6%) female patients were older than 50 years in the present study, thus theoretically postmenopausal. Hormonal changes may affect the regulation of C3 production, as estrogen increases, while progesterone inhibits the synthesis of C3 in the uterus [29]. Recently Yilmazer et al. demonstrated that hormone replacement therapy is able to increase C3 levels in postmenopausal women [30]. These findings taken together suggest that C3 levels fall after the menopause, thus we should expect lower C3 values in our postmenopausal subjects. In contrast we found higher C3 concentrations in our female patients compared to healthy controls. No literature data is available to decide, whether hormonal changes following the menopause may affect the systemic C3 synthesis. We think that the elevated C3 concentrations related to the inflammatory and not to the hormonal status of the patients.


Acknowledgements These studies were supported by grants from the Ministry of Education (FKFP 0138/01), Ministry of Welfare (ETT 248/2001) and the EC ATHERNET (QLG1-CT-200290397).

References [1] Ross R. Atherosclerosis is an inflammatory disease. Am Heart J 1999;138(5 Pt 2):S419–20. [2] Plutzky J. Inflammatory pathways in atherosclerosis and acute coronary syndromes. Am J Cardiol 2001;88(Suppl):10K–5K. [3] Geertinger P, Sorensen H. Complement and arteriosclerosis. Atherosclerosis 1973;57(2–3):163–77. [4] Bhakdi S, Torzewski M, Klouche M, Hemmes M. Complement and atherogenesis: binding of CRP to degraded, nonoxidized LDL enhances complement activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999;19:2348–54. [5] Oksjoki R, Kovanen PT, Pentikainen MO. Role of complement activation in atherosclerosis. Curr Opin Lipidol 2003;14:477–82. [6] Snyder S, Coodley EL, Durham BC, Pennock RS. Serum glycoproteins in coronary artery disease. Circulation 1977;56(3):359–62. [7] Hansson GK, Holm J, Kral JG. Accumulation of IgG and complement factor C3 in human arterial endothelium and atherosclerotic laesions. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand 1984;92(6):429–35; Hansson GK, Holm J, Kral JG. Accumulation of IgG and complement factor C3 in human arterial endothelium and atherosclerotic laesions. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand 1985;57(2–3):163–77. [8] Torzewski M, Klouche M, Hock J, et al. Immunohistochemical demonstration of enzymatically modified human LDL and its colocalization with the terminal complement complex in the early atherosclerotic lesion. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998;18:369–78. [9] Torzewski J, Torzewski M, Bowyer DE, et al. C-reactive protein frequently colocalizes with the terminal complement complex in the intima of early atherosclerotic lesions of human coronary arteries. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998;18:1386–92. [10] Yasojima K, Schwab C, McGeer EG, McGeer PL. Generation of C-reactive protein and complement components in atherosclerotic plaques. Am J Pathol 2001;158:1039–51. [11] Siegel J, Rent R, Gewurz H. Interactions of C-reactive protein with the complement system. J Exp Med 1974;140:631–7. [12] Wolbink GJ, Brouwer MC, Buysmann S, ten Berge IJ, Hack CE. CRP-mediated activation of complement in vivo. J Immunol 1996;157:473–9. [13] Muscari A, Bozzoli C, Gerratana C, et al. Associations of serum IgA and C4 with severe atherosclerosis. Atherosclerosis 1988;74(1–2):179–86. [14] Muscari A, Bozzoli C, Puddu GM, et al. Association of serum C3 levels with the risk of myocardial infarction. Am J Med 1995;98(4):357–64.

389

[15] Muscari A, Massarelli G, Bastagli L, et al. Relationship between serum C3 levels and traditional risk factors for myocardial infarction. Acta Cardiol 1998;53(6):345–54. [16] Muscari A, Massarelli G, Bastagli L, et al. Relationship of C3 to fasting insulin, risk factors and previous ischaemic events in middleaged men. Eur Heart J 2000;21:1081–90. [17] Yang Y, Chung EK, Zhou B, et al. Diversity in intrinsic strengths of the human complement system: serum c4 protein concentrations correlate with c4 gene size and polygenic variations, hemolytic activities, and body mass index. J Immunol 2003;171(5):2734–45. [18] Burian K, Kis Z, Virok D, et al. Independent and joint effects of antibodies to human heat-shock protein 60 and Chlamydia pneumonia infection in the development of coronary atherosclerosis. Circulation 2001;103:1503–8. [19] Rugonfalvi-Kiss Sz, Endresz V, Madsen HO, et al. Association of Chlamydia pneumoniae with coronary artery disease and its progression is dependent on the modifying effect of mannose-binding lectin. Circulation 2002;106:1071–6. [20] Csaszar A, Duba J, Melegh B, et al. Increased frequency of the C3*F allele and the Leiden mutation of coagulant factor V in patients with severe coronary heart disease who survived myocardial infarction. Exp Clin Immunogenet 2001;18:206–12. [21] Kohler PF, Muller-Eberhard HJ. Immunochemical quantitation of the third, fourth and fifth components of human complement: concentrations in the serum of healthy adults. J Immunol 1967;99(6):1211–6. [22] Teisberg P. High voltage agarose electrophoresis in the study of C3 polymorphism. Vox Sang 1970;19:47–56. [23] Bruins P, te Velthuis H, Yazdanbaksh AP, et al. Activation of the complement system during and after cardiopulmonary bypass surgery: postsurgery activation involves C-reactive protein and is associated with postoperative arrhythmia. Circulation 1997;96(10):3542–8. [24] Fransen E, Maessen J, Dentener M, Senden N, Geskes G, Buurman W. Systemic inflammation present in patients undergoing CABG without extracorporal circulation. Chest 1998;113(5):1290–5. [25] Nomoto S, Shimara Y, Kumada K, Okamoto Y, Ban T. Influence of hepatic mitochondrial redox state on complement biosynthesis and activation during and after cardiopulmonary bypass operations. Eur J Cardiothorac Surg 1996;10(4):273–8. [26] Sorensen H, Dissing J. Association between the C3F gene and atherosclerotic vascular diseases. Hum Hered 1975;25(4):279–83. [27] Norman ME, Gall EP, Taylor A, Laster L, Nilsson UR. Serum complement profiles in infants and children. J Pediatr 1975;87(6 Pt 1):912–6. [28] Butts WC, James GE, Keuhneman M. Intra-individual variation in the concentrations of IgA, IgG, IgM and complement component C3 in serum of normal adult population. Clin Chem 1977;23(3):511–4. [29] Hasty LA, Lambris JD, Lessey BA, Pruksananonda K, Lyttle CR. Hormonal regulation of complement components and receptors throughout the menstrual cycle. Am J Obstet Gynecol 1994;170(1 Pt 1):168–75. [30] Yilmazer M, Fenkci V, Fenkci S, Aktepe O, Sonmezer M, Kurtay G. Associations of serum complement (C3, C4) and immunoglobulin (IgG, IgM) levels with hormone replacement therapy in healthy postmenopausal women. Hum Reprod 2003;18(7):1531–5.

VII. Témával összefüggő közlemény 3

BIRO A; Dosa E; Horvath A; Prohaszka Z; Rugonfalvi-Kiss S; Szabo A; Karadi I; Acsady G; Selmeczi L; Entz L; Fust G; Romics L. Dramatic changes in the serum levels of anti-cholesterol antibodies after eversion endarterectomy in patients with severe carotid atherosclerosis. Immunol Lett. 2005. 99:51-56.

113

Immunology Letters 99 (2005) 51–56

Dramatic changes in the serum levels of anti-cholesterol antibodies after eversion endarterectomy in patients with severe carotid atherosclerosis Adrienn B´ıróa,c , Edit Dósab , Anna Horvátha , Zoltán Prohászkaa,c , Szabolcs Rugonfalvi-Kissa , Attila Szabób , István Karádia,c , György Acsádyb , László Selmeczib , László Entzb , George Füsta,c,∗ , László Romicsa,c a

c

3rd Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine, Semmelweis University, Kútvölgyi u´ t 4, H-1125 Budapest, Hungary b Department of Vascular and Cardiac Surgery, Semmelweis University, Budapest, Hungary Research Group of Metabolism, and Atheroclerosis, Semmelweis University and Hungarian Academy of Sciences, Budapest, Hungary Received 4 November 2004; received in revised form 7 December 2004; accepted 31 December 2004 Available online 19 January 2005

Summary Our goal was to study changes in anti-cholesterol antibodies (ACHA) levels in patients with severe carotid stenosis after eversion endarterectomy. Seventy consecutive patients who underwent eversion endarterectomy at the Department of Cardiovascular Surgery, Semmelweis University, Budapest, were included in the study. Serum samples from 66 healthy volunteers served as controls. Patients had medical check up at 5.7 (4.6–8.0) weeks (median (interquartile range)), 6.8 (6.2–7.9) months as well as 13.8 (12.3–19.0) months after endarterectomy. In all patients the carotid arteries were investigated by color duplex ultrasound. ACHA concentrations were determined in the serum samples taken before operation as well as at the first and last follow-up visits by using an ELISA method. ACHA concentrations (median (interquartile range) were found to be significantly (p < 0.0001) lower in the sera of the patients with carotid atherosclerosis (13.5 (8.4–21.3) AU/ml) than in the healthy subjects (26.1 (20.9–33.2) AU/ml) (Mann–Whitney test). Strong negative correlation was found between the preoperative ACHA and LDL-cholesterol levels (r = −0.413, p = 0.0004). Serum ACHA concentrations significantly (p < 0.0001) increased from the values measured before operation (13.5 (8.4–21.3) AU/ml) to 27.1 (19.9–34.7) AU/ml measured at the end of the 14 months long follow-up. Increase occurred only in patients with low or medium baseline ACHA concentration. Our present findings indicate that after surgical removal of atherosclerotic plaques from the carotid arteries the reduced baseline levels of ACHA reach normal values in 1 year. Different not mutually exclusive mechanisms (binding of ACHA to lipid/lipoproteins particles, to advanced plaques or reversibly injured endothelial cells in CNS) can be responsible for this novel finding. © 2005 Elsevier B.V. All rights reserved. Keywords: Anti-cholesterol antibody; Endarterectomy; Stroke

1. Introduction Naturally occurring autoantibodies against cholesterol reacting with the 3␤-OH group of the compound [1] are present in the sera of almost all healthy individuals [2,3]. The protective role of these antibodies against atherosclerosis induced ∗

Corresponding author. Tel.: +361 212 9351; fax: +361 212 9351. E-mail address: [email protected] (G. Füst).

0165-2478/$ – see front matter © 2005 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.imlet.2004.12.012

by cholesterol-rich diet was demonstrated in rabbit models [4,5]. Recently we have measured ACHA levels in patients with different atherosclerotic vascular diseases [6] and found marked alterations. ACHA levels were high in patients with coronary heart disease but low in patients with stroke or peripheral artery disease as compared to the age-matched healthy control subjects. In addition, in a substudy to the prospective HOPE (heart outcomes prevention efforts) study we observed that high ACHA levels are protective against

52

A. B´ıró et al. / Immunology Letters 99 (2005) 51–56

development of stroke during the follow-up period whereas they did not affect new myocardial infarction or sudden cardiac death [7]. Several properties of ACHA are different from the anti-phospholipid antibodies, ACHA do not require any co-factor for binding to cholesterol [6], the binding can be inhibited by purified LDL or VLDL fractions [3,6]. Inflammatory processes and high cholesterol level play a main role in the pathogenesis of atherosclerosis and mediate many of the stages of atheroma development form to eventual rupture of the unstable atherosclerotic plaque [8]. Elevated plasma levels of several inflammatory markers such as acute phase proteins (C-reactive protein (CRP), fibrinogen, orosomucoid), cytokines (interleukin-6, tumor necrosis factor-␣), and soluble adhesion molecules have been shown to predict future risk of progression of atherosclerosis. The efficacy of carotid endarterectomy (CEA) for carotid stenosis has been well demonstrated. Early studies established CEA to be a safe procedure with acceptable preoperative morbidity and mortality rates [9] which provides protection against stroke in selected patients with symptomatic and asymptomatic lesions of the internal carotid artery [10]. In a recent study [11] we have longitudinally measured serum concentration of two acute phase proteins, hsCRP and fibrinogen in 117 consecutive patients who underwent eversion endarterectomy. During the follow-up period sharp, highly significant (p < 0.0001) drop occurred in the serum concentrations of both acute phase proteins. The drop in the hsCRP levels during the follow-up period was mainly due to decrease in patients with highest baseline CRP levels. We assume that the decrease in the levels of two acute phase proteins is due to the decrease of the inflammatory burden or the removal of the advanced plaques able to produce these proteins. Considering this finding as well as the above-mentioned association between stroke and low ACHA levels, it seemed interesting to study the ACHA levels in patients with severe atherosclerosis before and after surgical removal of the atherosclerotic plaques.

2. Materials and methods 2.1. Patients and controls A total of 70 patients (47 males, 23 females, 66.7 ± 9.1 years old) who underwent eversion type carotid endarterectomy between October 2000 and March 2003 were included for this prospective study. The study was approved by the Institutional Review Committee, and the subjects gave informed consent. Indication for carotid endarterectomy was in accordance with AHA guidelines [12]. Only patients without any signs of infection were eligible for the intervention. Sixty six healthy subjects (23 males, 43 females, 45.0 ± 9.2 years old) who volunteered for a regular medical check up and gave informed consent served as control. For an other comparison a partly overlapping group of 70 age-

matched (56.0 (54.0–61.5) years old, 33 males, 37 females) healthy controls were used. Patients had medical checkup at 5.7 (4.6–8.0) weeks (median (interquartile range)), 6.8 (6.2–7.9) months, and finally 13.8 (12.3–19.0) months after endarterectomy. All carotid duplex scans were performed by an experienced radiologist. The common carotid, internal carotid and external carotid arteries on both sides were examined in the standard fashion. We recorded the peak systolic velocity (PSV) and the end diastolic velocity (EDV) in the common carotid artery (CCA), in the internal (ICA) and the external carotid arteries (ECA). The spectral measurements taken with a doppler angle of 55–65◦ . The velocity spectra of the ICA was further categorized as mild (<50%), moderate (50–69%) and severe (≥70%). Blood samples were drawn preoperatively, at the first follow-up examination that is 5.7 (4.6–8.0) weeks after operation and finally 13.8 (12.3-19.0) months postsurgery. 2.2. Measurement of the serum concentration of anti-cholesterol antibodies (ACHA) Serum cholesterol-specific antibodies were measured by solid phase enzyme immunoassay as described previously [6]. Briefly polystyrene plates (Greiner, Frickenhausen, Germany) coated with 5 ␮g/well cholesterol dissolved in 100 ␮l absolute ethanol were incubated at +4 ◦ C for 24 h. After washing with phosphate buffered saline (PBS) and blocking with 0.1% casein (Reanal, Budapest, Hungary) in PBS, the wells were incubated with 100 ␮l of serum samples diluted to 1:800 in PBS containing 0.1% casein. Binding of anti-cholesterol antibodies was detected by antihuman horseradish peroxidase conjugated gamma-chainspecific rabbit antibodies (DAKO, Glostrup, Denmark); ophenylene-diamine (Sigma, St. Louis, USA) and H2 O2 as substrate. Optical density was measured at 490 nm (reference at 600) and the mean value of duplicates was calculated. Serial dilution of intravenous immunoglobulin (IVIG) (Sandoglobulin, 50 mg/ml) was used as the standard in all experiments. Data obtained as optical density values were expressed in arbitrary units per milliliter (AU/ml) related to the standard curve. 2.3. Other laboratory measurements Serum concentrations of total cholesterol and triglycerides (Roche/Hitachi), HDL-cholesterol and LDL-cholesterol (Human, Wiesbaden, Germany) were measured in a Cobas Mira Plus (Diagnostica, Basel, Switzerland) clinical chemistry analyzer. Plasma fibrinogen concentrations were promptly determined in the samples by using the method of Clauss. C-reactive protein (hsCRP) concentrations were measured in serum samples with the ultrasensitive particleenhanced immunoturbidimetric assay in Cobas Integra 400 analyzer.


53

2.4. Statistical analysis Statistical analysis was made mostly by using GraphPad Prism V 3.00 software package (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, http://www.graphpad.com). Two group comparisons were done with the Mann–Whitney U test, correlation between the variables was expressed by the Spearman correlation coefficient. Difference in the values within a group over a period of time was measured by non-parametric repeated measure ANOVA (Friedman test); comparison of categorical variables was done with Fisher’s exact test. Multiple regression analysis was done by the SPSS 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) software.

3. Results 3.1. Comparison of the ACHA levels in patients with severe carotid atherosclerosis and healthy subjects ACHA levels were determined in the sera of 70 patients and 66 healthy controls (Fig. 1). Serum ACHA concentrations (median (interquartile range) were found to be significantly (p < 0.0001) lower in the sera of the patients with carotid atherosclerosis (13.5 (8.4–21.3) AU/ml) than in the healthy subjects (26.1 (20.9–33.2) AU/ml) (Mann–Whitney test). Since both age distribution (male/female ratio: 47/23 and 23/43, respectively, p < 0.0001) and median age (68 (58–73) years, and 46 (37–52) years, respectively, p < 0.0001) differed between the groups of patients and controls we have calculated the difference between the two groups by ageand gender-adjusted multiple logistic regression. The difference between the patients and controls remained significant (p = 0.004) even after adjustment for age and gender. There was no correlation between age or gender on the one hand and the preoperative ACHA levels on the other hand either in the endarterectomy or the control group (data not shown). At an other comparison, we selected a subgroup 44 patients with lower age (60.5 (56.0–67.0) years old, 26 males,

Fig. 2. Levels of anti-cholesterol antibodies (ACHA) in a subgroup of 44 younger 60.5 (56.0–67.0) years old) patients with severe carotis atherosclerosis and 70 age-matched (56.0 (54.0–61.5) years old) healthy subjects.

18 females) and a group of 70 age-matched (56.0 (54.0–61.5) years old, 33 males, 37 females) healthy controls. Median ages and gender distribution of the two groups did not significantly differ (p = 0.1114, and p = 0.2506, respectively). The difference in the ACHA levels between the patients and controls was found to be highly significant (p < 0.0001) at this comparison, too (Fig. 2). There was no significant difference in smoking habits (p = 0.5045, Fisher’s exact test) and body-mass index (p = 0.0547, Mann–Whitney test) between the patients and control groups. Never smokers and ever smokers had the same ACHA levels (p = 0.388), and there was no significant correlation (R = 0.049, p = 0.686) between BMI and serum concentration of ACHA. 3.2. Lack of correlation between preoparative ACHA levels and CDS values There was no correlation (R: −0.057, p = 0.639) between the preoperative ACHA levels at the operated site and the severity of carotid atherosclerosis assessed by the preoperative CDS values. Similarly preoparative CDS values at the opposite site and ACHA levels did not significantly (R = −0.023, p = 0.852) correlate to each other.

Fig. 1. Levels of anti-cholesterol antibodies (ACHA) in 70 patients with severe carotid atherosclerosis before, 6 weeks and 14 months after the eversion endarterectomy as well as in 66 healthy subjects.

54


Fig. 3. Strong negative correlation of serum ACHA levels to LDLcholesterol concentrations in the sera of patients with severe carotid atherosclerosis taken before carotid endarterectomy operation. Spearman correlation coefficient and its p value are indicated.

3.3. Correlation between the ACHA levels, lipid parameters and acute phase proteins measured before operation No correlation was found between serum ACHA concentrations and total cholesterol (p = 0.168), triglycerides (p = 0.578), and HDL-cholesterol (p = 0.296) levels. We found, however, a strong negative correlation (R = −0.413, p = 0.0004) between ACHA and LDL-cholesterol concentrations (Fig. 3). LDL concentration of the patients (3.90 (2.80–4.80) mmol/L) was significantly (p = 0.0013) higher than that measured in the healthy controls (2.68 (2.59–2.96) mmol/L). Preoperative ACHA levels did not significantly correlate to serum CRP (p = 0.317) or fibrinogen (p = 0.328) concentrations measured in the same serum samples. 3.4. Marked increase of the ACHA levels during the 14 months long follow-up period after eversion endarterectomy operation ACHA levels measured in the same patients before, 6 weeks and 14 months postsurgery were compared by using the non-parametric Friedman test followed by the post hoc Dunn test (Fig. 1). Serum ACHA concentrations significantly (p < 0.001) increased from the values measured before operation ((13.5 (8.4–21.3) AU/ml) to 27.1 (19.9–34.7) AU/ml measured at the end of the follow-up. Six weeks postsurgery levels (16.2 (9.1–29.3) were higher but did not significantly differ from the preoperative levels. ACHA concentrations measured at the end of follow-up did not significantly differ (p = 0.933) from those present in the sera of healthy controls as calculated by the Mann–Whitney test (Fig. 1). Next the subjects were divided according to the tertiles of baseline ACHA levels. Fig. 4 shows that ACHA levels increased only in patients with ACHA in the two lower tertiles, and remained stable in patients with ACHA in the highest tertile. In contrast to the ACHA levels serum LDL concentrations did not significantly (p = 0.1714) change during the follow-

Fig. 4. . Changes in ACHA levels after operation by tertiles of the baseline ACHA values.

up period. In the samples taken at the end of 14 months long observation period no correlation was found between ACHA and lipid parameters except a weak but significant negative correlation (R = −0.287, p = 0.017) between ACHA and HDL-cholesterol levels. ACHA levels did not significantly correlate to serum CRP (r = 0.211, p = 0.082) and plasma fibrinogen (r = 0.188, p = 0.123) 14 months postsurgery either.

4. Discussion In the present study we found that serum concentration of anti-cholesterol antibodies (ACHA) is markedly influenced by the presence and removal of atherosclerotic plaques from carotid artery. In patients with severe carotid atherosclerosis ACHA levels were significantly lower than in the healthy controls and the difference remained unchanged after adjustment to age and gender. On the other hand, surgical removal of the plaques resulted in dramatic increase in the ACHA levels. 14 months postsurgery ACHA levels reached the mean of those measured in the healthy controls. Different but not mutually exclusive mechanisms (binding of ACHA to lipid/lipoprotein particles, to advanced plaques or reversibly injured endothelial cells in CNS) may be responsible for this novel finding. Since it was demonstrated [1,6] that ACHA binds to LDL particles, and according to Alving and Wassef [13] ACHA have a major role in the LDL metabolism, the most probable explanation would be that high LDL concentration in patients with advance carotid atherosclerosis leads to reduced preoperative ACHA levels. We found a strong negative correlation between baseline LDL and ACHA serum concentration, indeed, which supports the assumption. Since, however, LDL levels in the patients did not change during the postoperative follow-up period, LDL–ACHA interaction could not be responsible for the postsurgery normalization of the ACHA levels. Of course increased production of ACHA could also account for the normalization. Disappearance at the end of the follow-up period of the negative correlation between LDL and ACHA levels observed preoperatively seems to support


this latter hypothesis, but no data are available which directly prove this assumption. An other explanation would be that low baseline levels of ACHA is due to the consumption of antibodies by cholesterol exposed in the surface of advanced atherosclerotic plaques. Removal of the plaques may significantly diminish the consumption which in turn can result in the increase and normalization of the ACHA levels postsurgery. As it is shown in Fig. 4, the higher of the preoperative ACHA consumption was the higher increase in the ACHA levels occurred during the follow-up period. Since atherosclerosis is a multifocal process, and no data in the literature indicate that plaques from different sites differ in composition, at a first glance this explanation seems to be improbable. However, some literature data indicate that large advanced carotid plaques can be biologically more active than it is expected: According to the studies of Rolph et al. [14] a member of the family PTX3 is produced in advanced carotid atherosclerotic plaques. More importantly, Yasojima et al. [15] detected 10.2-fold higher hsCRP at mRNA and protein levels in post-mortem samples from atherosclerotic plaques compared to normal arterial tissues. Due to lack of any tool so far to study the distribution of cholesterol in the membrane of endothelial cells covering atherosclerotic plaques no data which may directly support or exclude our assumption are available. Therefore we plan to use the IgG type monoclonal anti-cholesterol antibodies (B´ıró A et al., submitted for publication) recently developed in our laboratory to compare the accessibility by specific antibodies of cholesterol in the membrane of the normal endothelial cells and those covering plaques. An other similar explanation is that ACHA is consumed by brain endothelial cells deprived of oxygen due to carotid stenosis. Again no data are available on the effect of ischemia on distribution of the cholesterol and its accessibility to the ACHA in the membrane of endothelial cells, therefore this explanation can be considered only speculation. Finally, a connection between preoperative decrease in ACHA levels and increased inflammatory burden can be considered as well. High preoperative levels of inflammatory markers (CRP and fibrinogen) detected by the same patients with carotid atherosclerosis [11] indicate that the inflammatory burden of the patients in high, indeed. Moreover this burden decreases postsurgery as indicated by the decrease of serum CRP and plasma fibrinogen levels [11]. When, however, we addressed this possibility it turned out that there is no significant correlation between the baseline, preoperative CRP and ACHA or CRP and fibrinogen levels or between the extent of the decrease of the acute phase protein concentrations and increase in ACHA levels. Moreover we found increased ACHA levels in patients with other diseases associated with inflammation, such as chronic hepatitis [16] or systemic lupus erythematosus [17]. Clearly many studies are needed yet to find an explanation for our present novel findings.

55

Acknowledgements This work was supported by the ATHERNET (QLG1-CT2002-90393) grant of EC, grants 138/3001(ZP) of the Ministry of Education, 248/2001 (ZP) of the Ministry of Health and the T032661 (GF) of the National Research Fund of Hungary. We are highly indebted to Dr. László Cervenak for critical reading of the revised form of manuscript.

References [1] Dijkstra J, Swartz GM, Raney JJ, Aniagolu J, Toro L, Nancy CA, Green SJ. Interactions of anti-cholesterol antibodies with human lipoproteins. J Immunol 1996;157:2006–13. [2] Alving CR, Swartz Jr GM, Wassef M. Naturally occurring autoantibodies to cholesterol in humans. Biochem Soc Trans 1989:629– 37. [3] Alving CR, Swartz Jr GM. Antibodies to cholesterol, cholesterol conjugates and liposomes: implications for atherosclerosis and autoimmunity. Immunology 1991;10:441–53. [4] Alving CR, Swartz GM, Wassef M, Ribas JL, Heredrick EE, Virmani R, Kolodgie FD, Matyas CR, Corhill JF. Immunization with cholesterol-rich liposomes induces anti-cholesterol antibodies and reduces diet-induce hypercholesterolaemia and plaque formation. J Lab Clin Med 1996;127:40–9. [5] Horváth I, Szende B, Horváth AN, Kocsis I, Horváth A. Influence of cholesterol liposome immunization and immunostimulation on rabbits atherosclerosis induced by a high cholesterol diet. Med Sci Monitor 1998;4:403. [6] Horváth A, Füst G, Horváth I, Vallus G, Duba J, Harcos P, ´ Jánoskuti L, Kovács M, Antal-Szalmás Prohászka Z, Rajnavölgyi E, P, Császár A, Romics L, Karádi I. Antibodies against cholesterol (ACHA) in patients with different atherosclerotic vascular diseases and healthy individuals. Characterization of human ACHA. Atherosclerosis 2001;156:185–92. [7] Veres A, Füst G, Smieja M, McQueen M, Horváth A, Qilong Y, B´ıró A, Pogue J, Romics L, Karádi I, Singh M, Gnarpe J, Prohászka Z, Yusuf S. Heart outcomes prevention evaluation (HOPE) study investigators: relationship of anti-60 kDa heat shock protein and anti-cholesterol antibodies to cardiovascular events. Circulation 2002;106:2775–80. [8] Blake GJ, Ridker PM. Novel clinical markers of vascular wall inflammation. Circ Res 2001;89:763–71. [9] Coe DA, Towne JB, Seabrook GR, Freischlag JA, Cambria RA, Kortbein EJ. Duplex morphologic features of the reconstructed carotid artery: changes occurring more than five years after endarterectomy. J Vasc Surg 1997;25:850–6. [10] Executive Committee for the Asymptomatic Carotid Atherosclerosis Study. Endarterectomy for asymptomatic carotid artery, stenosis. JAMA 1995;273:1421–8. [11] Dósa E, Rugonfalvi-Kiss Sz, Prohászka Z, Szabó A, Karádi I, Selmeci L, Romics L, Füst G, Acsády Gy, Entz L. Marked decrease in the levels of two inflammatory markers, hs-C-reactive protein and fibrinogen in patients with severe carotid atherosclerosis after eversion carotid endarterectomy. Inflamm Res 2004;53:631– 5. [12] Biller J, Feinberg WM, Castaldo JE, Whittemore AD, Harbaugh RE, Dempsey RJ, Caplan LR, Kresowik TF, Matchar DB, Toole JF, Easton JD, Adams Jr HP, Brass LM, Hobson II RW, Brott TG, Sternau L. Guidelines for carotid endarterectomy: a statement for healthcare professionals from a Special Writing Group of the Stroke Council, American Heart Association. Circulation 1998;97: 501–9.

56


[13] Alving CR, Wassef M. Naturally occurring antibodies to cholesterol: a new theory of LDL cholesterol metabolism. Immunol Today 1999;20:362–6. [14] Rolph MS, Zimmer S, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A, Hansson GK. Production of the long pentraxin PTX3 in advanced atherosclerotic plaques. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002;22:e10–4. [15] Yasojima K, Schwab C, McGeer EG, McGeer PL. Generation of C-reactive protein and complement components in atherosclerotic plaques. Am J Pathol 2001;158:1039–51.

[16] B´ıró A, Horváth A, Varga L, Nemesánszky E, Csepregi A, Dávid K, Tolvaj G, Ibrányi E, Telegdy L, Pár A, Romics L, Karádi I, Horányi M, Gervain J, Ribiczey P, Csöndes M, Füst G. Serum anti-cholesterol antibodies in chronic hepatitis-C patients during IFN-␣-2b treatment. Immunobiology 2003;207:1–8. [17] Nagy G, Horvath A, Fust G, Romics L, Gergely P, Karadi I. Anticholesterol antibody levels in patients with systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis 2001;60(7):722–3.

VIII. Témával összefüggő közlemény 4

DOSA E; Szabo A; Prohaszka Z; Karadi I; Rugonfalvi-Kiss S; Apor A; Jaranyi Z; Huttl K; Selmeci L; Acsady G; Fust G; Entz L. Changes in the plasma concentration of soluble thrombomodulin in patients with severe carotid artery stenosis after eversion endarterectomy. Inflamm Res. 2005. 54:289-294.

120

© Birkhäuser Verlag, Basel, 2005 Inflamm. res. 54 (2005) 289–294 1023-3830/05/070289-06 DOI 10.1007/s00011-005-1354-9

Inflammation Research

Changes in the plasma concentration of soluble thrombomodulin in patients with severe carotid artery stenosis after eversion endarterectomy E. Dósa, A. Szabó, Z. Prohászka, I. Karádi, S. Rugonfalvi-Kiss, A. Apor, Z. Járányi, K. Hüttl, L. Selmeci, G. Acsády, G. Füst and L. Entz 3rd Department of Internal Medicine, Faculty of Medicine, Semmelweis University, Kútvölgyi út 4, 1125 Budapest, Hungary, Fax: ++361 225 3899, e-mail: [email protected] Received 17 November 2004; returned for revision 8 March 2005; accepted by A. Falus 11 March 2005

Abstract. Objective and design: The purpose of the study was to investigate the putative role of soluble thrombomodulin (sTM) in severe carotid artery stenosis. Materials and methods: We prospectively studied 64 patients who were undergoing carotid endarterectomy (2001–2003). Plasma sTM concentration was determined in each patient before surgery and at 14 months postsurgery. –308 TNF-a promoter polymorphism was also determined. Results: Strong negative correlation was found between the preoperative duplex scan values and the plasma sTM concentrations (R = –0.418, p = 0.0006). Patients with 308 A TNF-a genotype had significantly lower (p = 0.0415) preoperative sTM values than their counterparts with no such polymorphism. Soluble TM concentrations measured in plasma samples taken at the end of the postsurgical follow-up period of 14 months duration were significantly higher compared to the preoperative values (p < 0.0001). Conclusions: Our present findings indicate that sTM may be adsorbed to the atherosclerotic plaques or inflamed endothelium in carotid arteries. The pathological significance of this adsorption remains to be determined. Key words: Atherosclerosis; restenosis; endarterectomy; thrombomodulin; TNF-a.

Introduction During the last ten years numerous experimental and clinical studies have been performed to elucidate the pathophysiology of carotid atherosclerosis and restenosis after PTA or carotid endarterectomy. Now, it is widely accepted, that atherosclerosis is a complex process, which is still only partially understood. Serum lipids, lipoproteins, some components of the blood coagulation system, microorganisms, inflammatory proteins, the complement system etc. are thought to be Correspondence to: G. Füst

involved in the pathogenesis of atherosclerosis and restenosis [1–3]. A special organ, the vascular endothelium able to release and bind several bioactive molecules became a new target for studies. The endothelium plays an important role in the coagulation and fibrinolysis, in the adhesion of monocytes and platelets, and it also has an essential part in the modulation of the growth and migration of subendothelial smooth muscle cells. On the surface of the vascular endothelial cells several glycoproteins can be found, such as von Willebrand factor, thrombomodulin and plasminogen activators. The plasma levels of these molecules have been noted to increase with endothelial damage, despite the fact that they are not absolutely specific for endothelial cells [4–8]. Thrombomodulin (TM) is a special endothelial marker. It is a transmembrane glycoprotein located primarily on endothelial cells. It can bind thrombin and activate protein C. Through the protein C pathway TM inhibits thrombin formation and limits blood coagulation. The molecule seems to have a protective function on the endothelial cells. Intact TM is associated with the cell membrane, but some cleaved TM fragments can be found in the circulation in a soluble TM (sTM) form [9, 10]. The physiologic role of sTM is unknown at this time; it has been suggested as a laboratory marker of endothelial damage/dysfunction [5]. As determined by ELISA technique (Dialone, France) normal plasma levels of TM are 4.46 ± 1.36 ng/ml; in males and among smokers these levels are higher; TM levels also rise during menopause (11). Plasma levels have been shown to be elevated in various pathological conditions e.g. diabetes mellitus, lupus erythematosus, cancer, disseminated intravascular coagulation (DIC), adult respiratory distress syndrome (ARDS), liver cirrhosis, atherosclerosis, cerebral and myocardial infarction, and multiple sclerosis [12–14]. Endothelial dysfunction is thought to be an early event in the development of the atherosclerotic process, therefore it is not suprising, that TM aroused researchers’ interest. Thrombomodulin is a multi-domain molecule: the EGF domains of TM catalyse the activation of protein C and thrombin activat-

290

able fibrinolysis inhibitor (TAFI), whereas the lectin domain inhibits leukocyte attachment to endothelium and decreases cytokine induced increases in nuclear factor kB (NF kB) and activation of the ERK (externally regulated kinases) pathway. Several inflammatory cytokines can down-regulate the thrombomodulin gene transcription. Leukocyte activation and oxidant release can decrease TM activity, too. So, TM became a favourite molecule, because it presents a possible marker for both inflammation and thrombosis and it can be a link between the two entities [15, 16]. Previously we have reported on a marked decrease in the serum and plasma levels of two inflammatory markers, C reactive protein and fibrinogen respesctively after eversion endarterectomy in patients with severe carotid atherosclerosis [17]. Recently it has been shown, that TM has a direct anti-inflammatory activity [16]. Therefore, the primary aim of the present study was to investigate the changes in plasma sTM levels in patients with severe carotid artery stenosis before and after carotid eversion endarterectomy. Tumor necrosis factor a (TNF-a) is a proinflammatory cytokine mainly produced by macrophages. Several frequent polymorphisms are known in the gene encoding TNF-a. Among them, a guanine (G) to adenine (A) substitution located at position –308 in the promoter region is one of the most important polymorphisms. This genetic polymorphism can be involved in several diseases in wich inflammation plays a crucial role [18–20]. Since TNF-a was reported to able to downregulate the thrombomodulin gene transcription [21] it seemed interesting to study the relationship between the preoperative levels and postoperative changes in the sTM levels and the TNF-a –308A promoter polymorphism in the patients. Materials and methods Patients This prospective study included 64 patients [45 males, 19 females; mean age: 68 years (range 46–86 years)] with carotid artery stenosis who were undergoing elective carotid endarterectomy between January 2001 and January 2003. Clinical history and physical examination were taken with special attention to cardiovascular risk factors as follows: age; gender; current history of smoking; presence of dyslipidemia, diabetes mellitus, peripheral artery disease, coronary artery disease; history of cerebrovascular events; current use of medications. Routine laboratory tests and chest X-ray findings were used to exclude patients with acute inflammatory/infectious diseases. We also excluded patients who were already known to have neoplasia. None of the patients had renal, liver, or hematologic diseases. A group of 64 healthy volunteer blood donors [39 males, 25 females; mean age: 59 years (range 41–79 years)] underwent regular medical check-up served as control. Data for the groups of patients and healthy controls are summarized in Table 1. All patients gave their informed consent for the study.

Endarterectomy Procedure Operative indications included no symptoms (n = 19), transient ischemic attack (n = 34), minor stroke (n = 10), and major stroke (n = 1). All patients had significant carotid artery stenosis (≥ 80%). Carotid endarterectomies were performed by eversion technique in all patients [22–24].

E. Dósa et al.

Inflamm. res.

Follow-up All patients had preoperative and postoperative (11.1 ± 1.5 weeks, 7.1 ± 0.3 months and 14.7 ± 0.5 months) duplex scan examinations (ATL Ultramark 9 HDI system). The common carotid, internal carotid and external carotid arteries on both sides were examined in the standard fashion. We recorded the peak systolic velocity (PSV) and the end diastolic velocity (EDV) in the common carotid artery (CCA), in the internal (ICA) and the external carotid arteries (ECA). The spectral measurements were taken with a Doppler angle of 50° to 60°. The diagnostic criteria for internal carotid artery stenosis and restenosis were based on peak systolic velocities and end diastolic velocities as well as internal carotid artery:common carotid artery velocity ratios. On the basis of the velocity spectra of the ICA lesions were further categorized as mild (<5 0%), moderate (50–69%) and severe (≥70%).

Laboratory Tests Venous blood samples were collected preoperatively and 14.7 ± 0.5 months after the operations. Samples were promptly transferred to the laboratory for further processing. Serum concentrations of total cholesterol and triglycerides (Roche/Hitachi), HDL-cholesterol and LDL-cholesterol (Human, Wiesbaden, Germany) were measured in a Cobas Mira Plus (Diagnostics Basel, Switzerland) clinical chemistry analyzer. Soluble TM concentrations were determined in citrated plasma stored at –80°C until assay, using sCD141 (Thrombomodulin) ELISA kit (Dialone, France). The TNF-a promoter polymorphism at position –308 was determined by PCR using the primers as suggested by Day et al. [25]. The PCR products were digested at 37_C with NcoI to detect the –308 polymorphism, as described by Vatay et al. [26].

Statistics Data were collected in MS Excel 2002 and were analyzed with the Statistica 6.0 version for Windows statistical package. Two groups comparisons were done with the Mann-Whitney U test, differences in the values within a group over a period of time were compared using the Wilcoxon matched pair test; comparison of categorical variables was done with Fisher’s exact test. When evaluating a possible relationship between the preoperative duplex scan values and sTM levels, Spearman rank correlation coefficient was calculated. Values are presented as mean ± S.E.M., unless otherwise stated. Values of p < 0.05 were considered statistically significant.

Results Soluble thrombomodulin levels measured in patients before operation and healthy controls The study group consisted of 45 males and 19 females, with a mean age of 68 (range 61–76) years. A group of 64 healthy individuals [39 males, 25 females; mean age: 59 years (range 41–79 years)] underwent on medical check-up served as control. In citrated plasma samples from healthy volunteers the sTM levels ranged from 2.39 to 7.90 ng/mL, while in the patients it ranged from 0.48 to 15.32 ng/mL. In the study group the sTM levels in 11% of the patients, but only in 1% of the control individuals were equal or less than 2.39 ng/mL. There was no significant difference (p = 0.545) between the plasma sTM levels measured in patients and healthy subjects (Table 1).

Vol. 54, 2005

Relationship between inflammation and atherosclerosis

291

Table 1. Clinical and laboratory characteristics of the study and the control population.

Age (years) Gender (male/female) Preoperative BMI (kg/m2) Diabetes (yes/no) Smoking (yes/no) Total cholesterol (mmol/l) Triglycerides (mmol/l) Preoperative plasma sTM (ng/ml)

Study group (n = 64)

Control group (n = 64)

P value

67.9 ± 1.2 45/19 26.69 ± 0.45 20/44 24/40 6.29 ± 0.17 2.39 ± 0.18 6.26 ± 0.42

59.0 ± 1.3 39/25 26.42 ± 0.49 0/64 16/48 5.69 ± 0.11 1.63 ± 0.14 6.27 0.29

< 0.0001* 0.176** 0.434* < 0.0001** 0.908** 0.005* < 0.0001* 0.545*

Values are mean±S.E.M., except for gender, diabetes, smoking. * Mann-Whitney U test ** Fisher’s exact test.

Preoperative serum total cholesterol and triglycerides levels were significantly higher in our patients, than in the control group (p = 0.005; p < 0.0001). The incidence of diabetes was 31% in the study group, whereas in the control group no diabetic patient was noted (Table 1).

duplex scan values were significantly higher in patients with than in those without TNF2 allele (88.1 ± 1.56%, 82.1 ± 1.53%; respectively p = 0.037). Postoperative changes in the sTM levels and incidence of carotid restenosis

Negative correlation between baseline plasma sTM levels and preoperative CDS values

15/64 (23%) of the patients and 22/64 (34%) of the controls carried the GÆA substitution at position –308 in the TNF-a gene promoter region (designated the TNF2 allele) [6] (p = 0.4297). Distribution of the TNF-a alleles corresponded to the Hardy-Weinberg equilibrium in both populations. The preoperative sTM concentration was significantly (p = 0.0415) lower in patients with TNF2 allele (4.80 ± 0.75 ng/ml) than in the non-carriers (6.78 ± 0.55 ng/ml). In the control group the sTM levels were almost the same independently of the TNF-a genotype (6.08 ± 0.56 and 6.35 ± 0.34 ng/ml; p = 0.691). It was also found, that the presurgical

Fourteen months postsurgery the sTM levels (8.70 ± 3.59 ng/ml) were significantly (p = 0.0002) higher compared to the preoperative state (6.26 ± 3.35 ng/ml) (Fig. 2). By contrast, other laboratory or clinical variables (total cholesterol, triglycerides, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, BMI) did not change during the follow-up period. The 14 months sTM levels did not differ significantly in the carriers and non-carriers of the TNF2 allele (7.83 ± 0.88 and 9.56 ± 0.53 ng/ml; p = 0.105). There were no operating room or intensive care unit deaths. During the 14 months follow-up none of the patients developed stroke, but one patient underwent coronary artery bypass surgery and 2 patients had revascularisation on the lower limb. Most carotid restenosis were asymptomatic and hemodynamically non significant. Internal carotid artery stenosis of 50% or greater was detected in 15 patients (23%), but only 4 patients (6%) had severe (≥70%) restenosis in the operated region during the 14 months follow-up period. One patient who had early recurrent stenosis was assigned for carotid stenting and 1 patient for PTA. (Carotid PTA and/or stent placement for significant recurrent carotid artery stenosis was indicated for patients with symptomatic disease and

Fig. 1. Correlation between the preoperative duplex scan values and the plasma sTM concentrations. Spearman correlation coefficient and its significance are indicated.

Fig. 2. Comparison of the plasma thrombomodulin levels measured in patients with carotid atherosclerosis before and 14 months after carotid endarterectomy. P value for Wilcoxon signed rank test is indicated.

Strong negative correlation (R = –0.418, p = 0.0006) was found between the plasma sTM concentrations measured in 64 patients before operation and the preoperative duplex scan values (Fig. 1). Preoperative sTM levels in the carriers and non-carriers of the TNF2 allele

292

E. Dósa et al.

Table 2. Plasma concentration of sTM in patients without+ and with++ restenosis before and after carotid endarterectomy. Groups

No restenosis+ (n = 49) Restenosis++ (n = 15) P value**

Thrombomodulin (ng/ml) Mean ± S.E.M. Before surgery

14 months after operation

P value*

6.31 ± 0.49

8.59 ± 0.53

< 0.0001

6.09 ± 0.76

8.97 ± 0.81

= 0.005

0.943

0.674

* Wilcoxon matched pair test ** Mann-Whitney U test + No restenosis during the follow-up period. ++ Restenosis over 50% of diameter during any time of the follow-up

for patients with asymptomatic restenosis if diameter reduction was ≥80% in the ICA.) According to the duplex scan values we divided the study group into two subgroups: restenosis subgroup (≥50% stenosis at 14 months postsurgery, n = 15) and no restenosis subgroup (no or <50% stenosis at 14 months postsurgery, n = 49). In the restenosis subgroup the serum total cholesterol, triglycerides and LDL-cholesterol were significantly higher compared to the no restenosis subgroup (p = 0.027; p = 0.033; p = 0.022). The mean sTM concentration in the restenosis subgroup was 6.09 ng/ml and in the no restenosis subgroup was 6.31 ng/ml before the surgery. While at 14 months follow-up the sTM level among the restenotic patients was 8.97 ng/ml and among the non-restenotic patients was 8.59 ng/ml. Neither the preoperative nor the postoperative sTM levels were significantly different in the two subgroups (p = 0.943; p = 0.674) The plasma sTM concentrations significantly increased in both subgroups during the follow-up period (Table 2). The percentage of subjects with –308 TNF-a polymorphism was very similar in the restenosis (29%) and in the no restenosis group (26%). Discussion Several studies were published on the relationship between plasma thrombomodulin concentrations and atherosclerotic vascular diseases [12–14, 27]. No data on longitudinal measurements of sTM, however, are available, and the effect of TNF-a polymorphisms on sTM levels was not tested either. Our present work that was aimed to address these questions resulted in several novel observations. We found a strong (p = 0.0006) negative correlation between preoperatively measured plasma sTM levels and carotid duplex scan values. After surgical removal of the plaques from carotid arteries sTM levels were observed to significantly increase as compared to the preoperative values. In addition, we report on significantly lower sTM plasma levels in the carriers than non-carriers of the TNF2 allele known to be associated with higher TNF-a production [28].

Inflamm. res.

We prospectively studied 64 patients who were undergoing carotid eversion endarterectomy between January 2001 and January 2003. A group of 64 healthy volunteers who underwent medical check-up served as control. We found an inverse correlation between the preoperative duplex scan values and sTM concentrations. Patients whose plasma sTM levels were higher had less severe carotid artery stenosis, than those with lower sTM concentrations. In line with this finding, Salomaa et al. found that the risk of coronary heart disease gradually decreased with increasing quintile of sTM [29]. On the other hand, in contrast to our present results, the same author showed a positive association between sTM levels and carotid intima-media thickness (IMT) among 803 caucasian subjects [29]. Petit et al. reported a positive trend between these two variables, but no association with plaques was found [30]). Some other studies have reported a positive association between sTM concentrations and carotid artery disease, while others have failed to find any association [31, 33]. Thrombomodulin has been shown to have not just anticoagulant, but anti-inflammatory effect, as well [16]). It is not clear yet, if it is a relationship between the endothelial TM activity and the plasma sTM concentration, but such connection has been suggested by Salomaa and coworkers and by other studies, too [7, 29, 32, 33]. These findings and the inflammatory theory of atherosclerosis can provide explanation why the presurgical duplex scan values were higher in patients with lower sTM levels. Until now there is no data about the changes in plasma concentration of sTM after carotid surgery. Our second measurement was 14.7 ± 0.5 months after the surgery. It was interesting that the sTM level of the whole study population increased highly significantly at the end of the follow-up period. The observed negative correlation between sTM plasma levels and the preoperative duplex scan values as well as the marked increase in the sTM plasma concentrations after surgical removal of the plaques indicate that sTM may be adsorbed to the atherosclerotic plaques in carotid arteries. The pathological significance of this adsorption remains to be determined. On the other hand, atherosclerotic plaques are known to be active inflammatory loci, which can produce different cytokines, including TNFa, which can suppress the functional TM. In line with this assumption we found a markedly elevated p-selectin levels in the same patients before operation. Therefore, it cannot be exluded that removal (together with the plaques) of the activated endothelium that covers the plaques leads to the decrease of this suppression and consequently to increase in the sTM plasma levels. This assumption may also explain the lower sTM levels measured in patients with more severe carotic atherosclerosis. We found in our prior prospective study that in 117 patients with severe carotid artery stenosis the high-sensitive C-reactive protein (hsCRP) and the fibrinogen levels markedly decreased 14 months after the operations compared to the preoperative values [17]. It was suprising that carotid endarterectomy could result such dramatic changes in the serum and plasma concentrations of two acute phase proteins. Our present findings are in line with our assumption: that the atherosclerotic plaques can be an active inflammatory locus and with their removal the inflammatory factors are becoming weaker, while the anti-inflammatory and the anticoagulant effects are getting stronger.

Vol. 54, 2005

Relationship between inflammation and atherosclerosis

To date, few studies have examined the role of thrombomodulin in the pathophysiology of restenosis after carotid endarterectomy. Tsakiris et al. found in 71 patients with peripheral arterial occlusive disease 6 months after transluminal angioplasty a trend for higher TM in those who developed restenosis [34]. Mihara et al. gave an account of no significant difference in the TM level in patients with and without restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty [27]. In our prospective study 15 patients (23%) developed ≥50% restenosis, among them 4 patients (6%) had at least 70% recurrent stenosis. In both subgroups (restenosis, no restenosis) the 14 months postoperative sTM concentrations were significantly higher, but neither the preoperative nor the postoperative sTM levels were different in the two subgroups. Thus our present observations indicate that soluble TM is not a predictive marker for recurrent carotid artery stenosis. Interestingly, the preoperative sTM concentration was significantly lower among the carriers of the TNF2 allele, while we could not find such difference 14 months after the operations, in the restenosis and in the control group. Moreover, the presurgical carotid duplex scan values were significantly higher in patients with the TNF2 allele. Therefore is seems probable that the higher sTM level measured in the TNF2 carriers is secondary to the higher extent of carotid atheroscelrois in this group of patients. This assumption is in line with the findings of Skoog et al [35] and Elkind et al. [36] who observed that the plasma TNF-concentration is associated with degrees of early atherosclerosis and correlates with metabolic and cellular perturbations that are considered important for the vascular process. Acknowledgements. This work was supported by the ATHERNET (QLG1-CT-2002-90393) grant of EC, grants 138/3001 (ZP) of the Ministry of Education, 248/2001 (ZP) of the Ministry of Health and the T032661 (GF) of the National Research Fund of Hungary as well as by the 1/0020/2002 NKFP grant of the Ministry of Education.

References [1] Moore WS, Kempenzinski RF, Nelson JJ, Toole JF. Recurrent carotid stenosis. Results of the Asymptomatic Carotid Atherosclerosis Study. Stroke 1998; 29: 2018–25. [2] Peter K, Nawroth P, Conradt C, Nordt T, Weiss T, Boehme M et al. Circulating vascular cell adhesion molecule-1 correlates with the extent of human atherosclerosis in contrast to circulating intercellular adhesion molecule-1, E-selectin, P-selectin, and thrombomodulin. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997; 17: 505–12. [3] Smith EB. Haemostatic factors and atherogenesis. Atherosclerosis 1996; 124: 137–43. [4] Blann A. von Willebrand factor and the endothelium in vascular disease. Br J Biomed Sci 1993; 50: 125–34. [5] Ishii H, Uchiyama H, Kazama M. Soluble thrombomodulin antigen in conditioned medium is increased by damage of endothelial cells. Thromb Haemost 1991; 65: 618–23. [6] Kwaan HC. The biologic role of components of the plasminogenplasmin system. Prog Cardiovasc Dis 1992; 34: 309–16. [7] Seigneur M, Dufourcq P, Conri C, Constans J, Mercie P, Pruvost A et al. Levels of plasma thrombomodulin are increased in atheromatous arterial disease. Thromb Res 1993; 71: 423–31. [8] Sernau T, Wilhelm C, Seyfert U, Gabath S, Henkels M, Amiral J et al. Thrombomodulin is a marker of microvascular, but not for macrovascular endothelial cell damage. Vasa 1995; 24: 347–53.

293 [9] Ishii H, Majerus PW. Thrombomodulin is present in human plasma and urine. J Clin Invest 1985; 76: 2178–81. [10] Sadler JE. Thrombomodulin structure and function. Thromb Haemost 1977; 78: 392–5. [11] Califano F, Giovanniello T, Pantone P, Campana E, Parlapiano C, Alegiani F, Vincentelli GM, Turchetti P. Clinical importance of thrombomodulin serum levels. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2000; 4: 59–66. [12] Califano F, Giovanniello T, Pantone P, Campana E, Parlapiano C, Alegiani F et al. Clinical importance of thrombomodulin serum levels. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2000; 4: 59–66. [13] Fujiwara Y, Tagami S, Kawakami Y. Circulating thrombomodulin and hematological alterations in type 2 diabetic patients with retinopathy. J Atheroscler Thromb 1998; 5: 21–8. [14] Takano S, Kimura S, Ohdama S, Aoki N. Plasma thrombomodulin in health and disease. Blood 1990; 76: 2024–9. [15] Antonov A, Key N, Smirnov M, Jacob HS, Vercellotti GM, Smirnov VN. Prothrombotic phenotype diversity of human aortic endothelial cells in culture. Thromb Res 1992; 67: 135–45. [16] Esmon CT. Crosstalk between inflammation and thrombosis. Maturitas 2004; 47: 305–14. [17] Dosa E, Rugonfalvi-Kiss Sz, Prohaszka Z, Szabo A, Karadi I, Selmeci L et al. Marked decrease in the levels of two inflammatory markers, hs-C-reactive protein and fibrinogen in patients with severe carotid atherosclerosis after eversion carotid endarterectomy. Inflamm Res. In Press. [18] Densem CG, Hutchinson IV, Yonan N, Brooks NH. Influence of tumor necrosis factor-a gene -308 polymorphism on the development of coronary vasculopathy after cardiac transplantation. J Heart Lung Transplant 2001; 20: 1265–73. [19] Ferrari R. The role of TNF in cardiovascular disease. Pharmacol Res 1999; 40: 97–105. [20] Wu KK, Aleksic N, Ballantyne CM, Ahn C, Juneja H, Boerwinkle E. Interaction between soluble thrombomodulin and intercellular adhesion molecule-1 in predicting risk of coronary heart disease. Circulation 2003; 107: 1729–32. [21] Nan B, Lin P, Lumsden AB, Yao Q, Chen C. Effects of TNF-alpha and curcumin on the expression of thrombomodulin and endothelial protein C receptor in human endothelial cells. Thromb Res. 2005;115: 417–26. [22] Ballotta E, Da Gau G, Baracchini C, Manara R. Carotid eversion endarterectomy: perioperative outcome and restenosis incidence. Ann Vasc Surg 2002; 16: 422–9. [23] Entz L, Jaranyi Z, Nemes A. Eversion endarterectomy in surgery of the internal carotid artery. Cardiovasc Surg 1996; 4: 190–4. [24] Raithel D. Carotid eversion endarterectomy. Cardiovasc Surg 1997; 5: 471–2. [25] Day CP, Grove J, Daly AK, Stewart MV, Avery PJ, Walker M. Tumor necrosis factor alpha gene promoter polymorphism and decreased insulin resistance. Diabetologia 1998; 41: 430–4. [26] Vatay A, Rajczy K, Pozsonyi E, Hosszufalusi N, Prohaszka Z, Fust G et al. Differences in the genetic background of latent autoimmune diabetes in adults (LADA) and type I diabetes mellitus. Immunol Lett 2002; 84: 109–15. [27] Mihara H, Murai A, Handa K, Saku K, Shirai K, Tanaka K et al. Thrombomodulin levels in patients with coronary artery disease. Artery 1997; 22(6): 293–308. [28] Vendrell J, Fernandez-Real JM, Gutierrez C, Zamora A, Simon I, Bardaji A et al. A polymorphism in the promoter of the tumor necrosis factor-a gene (-308) is associated with coronary heart disease in type 2 diabetic patients. Atherosclerosis 2003; 167: 257–64. [29] Salomaa V, Matei C, Aleksic N, Sansores-Garcia L, Folsom AR, Juneja H et al. Soluble thrombomodulin as a predictor of incident coronary heart disease and symptomless carotid artery atherosclerosis in the Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study: a case-cohort study. Lancet 1999; 353: 1729–34. [30] Petit L, Van Oort FVA, Le Gal G, Mennen LI, Alhenc-Gelas M, Touboul PJ et al. Association of postmenopausal hormone replacement therapy with carotid atherosclerosis and soluble thrombomodulin. The vascular aging (EVA) study. Thromb Res 2002; 105: 291–7.

294 [31] Ramsis N, El-Hawary AA, Ismail E. Relation between carotid intima-media thickness, platelet surface activation and endothelial cell markers. Haemostasis 1998; 28: 268–75. [32] Schumacher A, Seljeflot I, Sommervoll L, Christensen B, Otterstad JE, Arnesen H. Increased levels of endothelial haemostatic markers in patients with coronary heart disease. Thromb Res 2002; 105: 25–31. [33] Yi-Heng L, Chih-Hung C, Poh-Shiow Y, Huey-Juan L, Bi-Ing C, Jia-Chung L et al. Functional mutation in the promoter region of thrombomodulin gene in relation to carotid atherosclerosis. Atherosclerosis 2001; 154: 713–9.

E. Dósa et al.

Inflamm. res.

[34] Tsakiris DA, Tschopl M, Jager K, Haefeli WE, Wolf F, Marbet GA. Circulating cell adhesion molecules and endothelial markers before and after transluminal angioplasty in peripheral arterial occlusive disease. Atherosclerosis 1999; 142(1): 193–200. [35] Skoog T, Dichtl W, Boquist S, Skoglund-Andersson C, Karpe F, Tang R, Bond MG, de Faire U, Nilsson J, Eriksson P, Hamsten A. Plasma tumour necrosis factor-alpha and early carotid atherosclerosis in healthy middle-aged men. Eur Heart J. 2002; 23: 376–83 [36] Elkind MS, Cheng J, Boden-Albala B, Rundek T, Thomas J, Chen H, Rabbani LE, Sacco RL. Tumor necrosis factor receptor levels are associated with carotid atherosclerosis. Stroke 2002; 33: 31–7.

IX.


JANOSKUTI L; Forhecz Z; Hosszufalusi N; Kleiber M ; Walentin S; Balint O; Duba J; Rugonfalvi-Kiss S; Romics L; Karadi I; Fust G; Prohaszka Z. High levels of C-reactive protein with low total cholesterol concentrations additively predict all-cause mortality in patients with coronary artery disease. Eur J Clin Invest. 2005. 35:104-111.

127

European Journal of Clinical Investigation (2005) 35, 104–111

High levels of C-reactive protein with low total cholesterol concentrations additively predict all-cause mortality in patients with coronary artery disease Blackwell Publishing, Ltd.

L. Jánoskuti*, Z. Förhécz*, N. Hosszúfalusi*†, M. Kleiber*, S. Walentin*, O. Bálint‡, J. Duba‡, S. Rugonfalvi-Kiss*§, L. Romics*†, I. Karádi*†, G. Füst*† and Z. Prohászka*† *

Semmelweis University, †National Academy of Sciences, ‡National Institute of Cardiology, and §National Institute of

Trauma and Emergency Care, Budapest, Hungary

Abstract

Background This study aimed to investigate independent and additive predictive effects of raised C-reactive protein (CRP) levels and decreased total cholesterol levels on mortality in patients with chronic coronary artery disease (CAD). Low total cholesterol (TC) levels are associated with worsened survival in chronic and acute diseases. Elevated CRP level is an important predictor of vascular events and mortality in patients with CAD. Potential inhibition of immune activation by circulating lipoproteins could be a link between cholesterol and inflammatory markers. Materials and methods A group of 387 patients (median age 59 years) with CAD and with or without severe heart failure (HF) were followed for a median of 5·06 years. Serum total cholesterol and CRP concentrations were measured at enrollment. Results The relationship between lipoproteins, CRP and survival was explored. High CRP concentrations were in significant association with severity of HF and predicted worsened survival in patients with CAD (hazard ratio 5·214, 95% CI 1·762–15·427). The association between CRP levels and mortality was independent of potential confounding factors such as age, body-mass index, severity of HF, smoking habits, hypertension and TC levels. The prediction of mortality by low TC levels was significant (hazard ratio 2·932, 95% CI 1·021– 8·422). Furthermore, patients with increased CRP and decreased TC (additive predictive effect) phenotype had 11·714-times higher risk (95% CI 2·619–52·385) of being nonsurvivors than patients with low CRP/high TC. Conclusions High CRP levels and low TC concentrations are independent and additive predictors of mortality in patients with CAD. Our data indicate that joint analysis of circulating lipoproteins and inflammatory biomarkers may improve prediction of survival in patients with CAD. Keywords Coronary artery disease, C-reactive protein, mortality, total cholesterol. Eur J Clin Invest 2005; 35 (2): 104–111

IIIrd Department of Medicine, Faculty of Medicine, Semmelweis University (L. Jánoskuti, Z. Förhécz, N. Hosszúfalusi, S. RugonfalviKiss, L. Romics, I. Karádi, G. Füst, Z. Prohászka); Research Group of Metabolism and Atherosclerosis, National Academy of Sciences (N. Hosszúfalusi, L. Romics, Karádi, G. Füst, Z. Prohászka); Central Laboratory, Kútvölgyi Clinical Center, Semmelweis University (M. Kleiber, S. Walentin); National Institute of Cardiology (O. Bálint, J. Duba); National Institute of Trauma and Emergency Care (S. Rugonfalvi-Kiss), Budapest, Hungary. Correspondence to: Zoltán Prohászka, MD, PhD, IIIrd Department of Medicine, Semmelweis University, Kútvölgyi st. 4., H-1125 Budapest, Hungary. Tel.: +361 2129351/+361–3551122/379; fax: +361–2129351; e-mail: [email protected] Received 11 October 2004; accepted 9 December 2004 © 2005 Blackwell Publishing Ltd

Total cholesterol, C-reactive protein and survival in CAD

Introduction

Patients and methods

Hypercholesterolaemia is a known risk factor for the development of coronary artery disease (CAD), a world-wide health care problem. High level of total cholesterol (especially low-density lipoprotein) is an important risk factor for CAD mortality [1], and clinical trials demonstrate that 3-hydroxy3-methyglutaryl coenzyme A reductase inhibitors (statins) are safe and effective in treating hyperlipidaemia and reducing cardiovascular events [2,3]. In a wide range of chronic and acute disorders, however, low cholesterol level is associated with increased mortality [4]. The finding that low serum cholesterol may be associated with increased mortality from cancer, respiratory disease, heart failure and trauma also caused discussion [5,6]. The reported association between low cholesterol levels and noncoronary mortality probably reflects the cholesterol-lowering metabolic consequences of long-term, clinically not manifest diseases rather than a hazard association with low cholesterol per se. A clinically not manifest form of malignancy or infectious disease has mainly been referred to as the primary cause of hypocholesterolaemia. However, the inverse relationship between mortality and lipid and lipoprotein levels has repeatedly been observed in different disease states. Critical care literature provides strong evidence for a survival advantage associated with higher lipid levels in critically ill patients [7– 10]. Low serum cholesterol has also been associated with worsened survival in the elderly [11,12]. Recent concordant studies of patients with heart failure (HF) have also suggested an association between decreased cholesterol and impaired survival [13–16]. Reports of a survival advantage with high cholesterol are unexpected because CAD was the dominant aetiology of HF in the above studies. In patients with severe disease states, including HF, the classic relationship between elevated cholesterol and increased mortality may no longer apply. Accumulating evidence now suggest for a so-called reverse epidemiology of conventional cardiovascular risk factors in patients with severe, chronic diseases, such as chronic heart failure [17], and maintenance dialysis patients [18]. Extensive study of C-reactive protein (CRP) has demonstrated that this inflammatory marker predicts cardiovascular risk, which is not reflected by traditional risk factors. The measurement of CRP is an appropriate indicator of systemic inflammation with reliable and widely available laboratory tests for measurement. C-reactive protein determination adds prognostic information to traditional risk assessment, and predicts long-term cardiovascular risk not only in patients with manifest cardiovascular diseases but also in individuals with no prior evidence of disease. C-reactive protein is a risk factor for cardiovascular outcomes and mortality in the general population and in patients after myocardial infarction (MI) [19–22]. Taken together, a low level of cholesterol may adversely affect survival in patients with severe, chronic diseases. In addition, inflammatory markers are very good predictors of mortality in patients with CAD. Therefore the aim of the present study was to analyze whether predictive effect of total cholesterol- and C-reactive protein levels on survival are additive in patients with severe CAD.

Study population

105

Serum samples were obtained from 437 patients with coronary artery disease (median age 59 years, 104 [26·8%] female, Table 1) after having their written consent. A total of 50 patients from the whole population (n = 437) [11·4%] were lost for follow up; data of the 387 successfully followed patients are presented in this study. The characteristics of the drop-out population was statistically not different from the successfully followed population (data not shown). Diagnosis of CAD was based on the history of either acute myocardial infarction, or aorto-coronary bypass grafting or percutaneous coronary intervention. The study was approved by the local Ethics Committee and was in accordance with the Declaration of Helsinki. The patients were hospitalized for complex therapy of CAD with /without chronic HF and were consecutively selected for the study. Our patients were classified according to the New York Heart Association (NYHA) guidelines (class I to IV) based on the clinical symptoms, physical and chest X-ray examination. Patients were investigated by trans-thoracic echocardiography as well (see later). Baseline clinical parameters and major risk factors of the patients were registered. All patients received complex medical therapy thought to be optimal for their individual status at that time [Table 1]; presampling medication is indicated. Patients were excluded if there was severe comorbidity such as acute ischaemic events (typical chest pain, acute Q- or non-Q MI), acute infection (temperature > 38 °C), malignancy (diagnosis based on histology), arthritis or connective-tissue disease (rheuma factor positivity with typical clinical symptoms). Venous blood was collected in native vacuum tubes after fasting, and the sera were separated, then aliquoted and stored at −20 °C. The determinations of different routine laboratory parameters, such as lipid determinations, were performed within 6 weeks of storage.

Clinical follow up All patients were followed in-hospital or through regular outpatient visits. The minimum follow-up time was 27 days, the maximum 6 years, and the median 5·06 years (25 –75th percentiles, 1745 –1953 days). All patients enrolled were contacted by questionnaires or telephone 5 years after enrollment and survival data were obtained. Patients who returned the questionnaires and reported no events were censored to be alive by that time. A minority of patients who could not be reached by any of the above means were censored at the time-point of the last outpatient (or in-hospital) visit to be alive. Death occurred in 41 patients (10·6% of the 387 patients) during the median 5·06 years of follow up. The cause of death was cardiovascular in 14 patients, noncardiac in 10 patients (malignancy, gastrointestinal bleeding, viral pneumonia) unknown in nine patients and progressive heart failure in eight patients.

© 2005 Blackwell Publishing Ltd, European Journal of Clinical Investigation, 35, 104–111

106

L. Jánoskuti et al.

Table 1 Basic characteristics of patients in the study stratified according to all-cause mortality

Number of subjects Age (y) Females, n Body mass index (kg m−2) Left ventricular ejection fraction (%) NYHA Class (%) 1 2 3 4 Total cholesterol (mmol L−1) HDL-cholesterol (mmol L−1) LDL-cholesterol (mmol L−1) Triglycerides (mmol L−1) Hypertension (%) Ever smokers (%) Diabetes mellitus (%) Previous myocardial infarction (%) Statin therapy (%) Fibrate therapy (%) ACE inhibitor therapy (%) β-blocker therapy (%) Acetyl salicylate therapy (%) C-reactive Protein (mg L−1)

All patients

Survivors

Non-Survivors

Univariate P-value (survivors vs. nonsurvivors)*

387 59 (53 – 66) 104 28·1 (25·7–30·5) 48 (35 – 60)

346 58 (53–65) 91 28·3 (25·8–30·7) 52 (38–61)

41 70 (61–75) 13 26·3 (22·4–29·4) 37·5 (21·5–48·0)

< 0·0001 0·453 0·0077 0·0018

53·9 30·9 12·4 2·6 5·9 (5·1–7·0) 1·2 (0·92–1·31) 3·7 (2·8 – 4·5) 1·9 (1·3 –2·8) 61·5 64·4 23·7 48·1 19·2 11·6 57·2 82·8 78·3 3·89 (1·92–7·47)

58·7 30·1 9·1 1·8 6·0 (5·2–7·0) 1·24 (0·96–1·31) 3·76 (2·92–4·52) 2·41 (1·30–2·80) 63·9 65·8 22·8 47·5 19·7 11·2 56·1 82·4 82·8 3·70 (1·87–7·06)

23·0 30·7 35·8 10·2 5·0 (4·21–6·32) 0·86 (0·61–1·25) 3·19 (2·62–4·75) 1·63 (1·1–2·60) 42·5 51·4 29·4 52·7 11·1 16·6 72·2 88·8 61·1 6·62 (3·07–14·82)

< 0·0001 (for trend)

0·0002 0·00003 0·0451 0·117 0·01 0·097 0·396 0·601 0·541 0·166 0·224 0·864 0·0074 0·0014

Median and interquartile range or percentage are presented. * Mann–Whitney or Chi-squared tests.

Echocardiographic measurements Left ventricular function was determined by two-dimensional echocardiography and Doppler examinations by the same investigator, who was blinded to the results of other tests. The equipment used was a Hewlett-Packard Sonos 2500 echocardiography system with a 2·5-MHz transducer (General Electrics, USA). Pulsed, continuous and colourflow Doppler examinations were performed with the same transducer. Parasternal and apical views were obtained with the patient in a left lateral recumbent position. M-mode tracings were recorded on strip chart paper at a speed of 50 mm s−1. Left ventricular end-diastolic (Dd) and endsystolic diameters (Ds) were measured and the left ventricular ejection fraction (LVEF) was calculated as described by Quinones (LVEF = Dd2 − Ds2/Dd2) (23).

Determination of laboratory parameters Serum total cholesterol, HDL-C and triglyceride concentrations were measured by the Roche Cobas Integra 400 automat (Hoffmann-La Roche Ltd, Switzerland) using standard enzymatic colourimetric protocols. LDL-C-values were calculated by the Friedewald formula, or measured by direct assays if the triglyceride value was > 4·5 mmol L−1. C-reactive protein serum concentrations were measured by

particle-enhanced immunoturbidimetric assay (Cobas Integra 400, Roche). The detection limit of the assay is 0·07 mg L−1, the coefficient of variation is 2·9% at 6·3 mg L−1 and 3·9% at 108 mg L−1 mean value. Cut-off points for total cholesterol and CRP levels towards survival were determined using receiver operating characteristic (ROC) analysis. The best cut-off point of the parameters for discrimination between survivors and nonsurvivors was 5·2 mmol L−1 for TC [sensitivity (true negatives): 0·69, 1-specificity (true positives): 0·68] and 6·24 mg L−1 for CRP [sensitivity (true negatives): 0·51, 1-specificity (true positives): 0·29].

Statistical analysis Statistical analysis was performed using GraphPad Prism V 3·00 for Windows software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com), SPSS (SPSS Inc., www.spss.com) and Statistica (StatSoft, Tulsa, OK, USA, www.statsoft.com) software packages. Comparison of categorical variables was carried out with Fisher’s exact test or the Chi-squared test; medians of groups were compared by the nonparametric Mann–Whitney test. Multivariable Cox proportional hazards regression models were applied on different categorized variables to determine the independent predictive effects on mortality. ROC analysis was applied to estimate the best cut-off point



of variables for discrimination between survivors and nonsurvivors. Kaplan-Meyer cumulative mortality curves were plotted to display trends in mortality over time and different variables. The log-rank test was used to determine which variables were related significantly to mortality during the follow-up period. Two-tailed P-values were calculated and values of P < 0·05 were considered statistically significant. Data are presented in the text and tables as median (interquartile range).

Results Basic characteristics of the patients Three hundred and eighty-seven consecutively selected patients with CAD who were successfully followed for a median of 5·06 years were enrolled in this study. The study population was carefully investigated to record the presence of HF (clinical symptoms and signs) at study entrance. Subjects were divided into classes according to the recommendations of the New York Heart Association (I to IV, see Patients and methods). All-cause mortality was registered based on clinical records or interviews with the relatives/ family doctors. The basic characteristics of the study population are presented in Table 1. Patients in NYHA class I (n = 206) had a median left-ventricular ejection fraction value of 57·5% (IQ range: 53–65), whereas in class II (n = 121) 50% (44–61), in class III (n = 49) 29% (20 – 40.5) and in class IV (n = 11) 30% (20–38) values were measured. Allcause mortality rate in patients with CAD in the different NYHA classes during the median 5·06 years of follow up were: I: 0·044, II: 0·107, III: 0·311 and IV: 0·400. There

107

was significant correlation (P < 0·05) between TC levels and HDL-C (r = 0·238), LDL-C (r = 0·925) and triglyceride concentrations (r = 0·501). All-cause mortality was in significant association with the following parameters in the univariate analysis: increased age (P < 0·0001), decreased body mass index (P = 0·0077), decreased LVEF (0·0018), severity of HF (P < 0·0001), decreased TC (P = 0·0002) and HDL-C (P = 0·00003) levels, hypertension (P = 0·01), acetyl salicylate treatment (P = 0·0074) and increased CRP concentrations (P = 0·0014). Additionally, there was a significant association between severity of HF and TC or CRP levels [ Tables 2 and 3]. The frequency of statin, fibrate, angiotensin-converting enzyme (ACE)-inhibitor and βblocker was similar in the survivors and the nonsurvivors [ Table 1].

C-reactive protein, total cholesterol and mortality in CAD Relationship between CRP and total cholesterol values and all-cause mortality was further analyzed. The highest mortality rate [0·204] was observed in patients in the lowest TC tertile [Table 2]. Furthermore, CRP levels were also in significant association with mortality (P = 0·016, Table 3). As several parameters were in association with mortality in the univariate analysis, multivariable Cox’s proportional hazards regression analysis was applied to rule out potential influences of co-variables on the association between CRP or TC and mortality in CAD. As presented in Table 4, low TC values (defined as values < 5·2 mmol L−1) predicted mortality (adjusted HR: 2·932 95% CI: 1·021–8·422). Besides low TC, smoking habit and acetyl salicylate treatment were significant predictors of mortality in this model. Furthermore,

Table 2 All-cause mortality in patients with coronary artery disease stratified according to total cholesterol levels Variable

Tertile 1, n = 127

Tertile 2, n = 121

Tertile 3, n = 139

Univariate P-value

Total cholesterol (mmol L−1) Deaths (n) Mortality rate C-reactive protein (mg L−1) Body mass index (kg m−2) NYHA class

< 5·4 26 0·204 3·91 (1·82–7·33) 27·6 (24·8 –29·7) 1·91 (0·94)

5·4–6·5 5 0·041 3·78 (2·06–7·33) 28·3 (25·5–30·8) 1·55 (0·75)

> 6·5 10 0·071 3·96 (1·86–7·95) 28·4 (26·1–30·9) 1·46 (0·62)

– < 0·0001 – 0·211 0·03 < 0·0001

NYHA class is presented as mean (SD) and treated as a continuous variable.

Table 3 All-cause mortality in patients with coronary artery disease stratified according to C-reactive protein levels Variable −1

C-reactive protein (mg L ) Deaths (n) Mortality rate Total cholesterol (mmol L−1) Body mass index (kg m−2) NYHA class

Tertile 1, n = 129

Tertile 2, n = 126

Tertile 3, n = 132

Univariate P-value

< 2·48 8 0·062 5·71 (5·1– 6·8) 27·2 (24·8 –29·6) 1·50 (0·66)

2·48–5·9 11 0·087 6·10 (5·2–7·0) 28·4 (26·2–30·9) 1·61 (0·83)

> 5·9 22 0·166 5·9 (5·1–7·0) 28·2 (25·4–30·8) 1·79 (0·87)

– 0·016 – 0·527 0·031 0·013

NYHA class is presented as mean (SD) and treated as a continuous variable. © 2005 Blackwell Publishing Ltd, European Journal of Clinical Investigation, 35, 104–111

108


Table 4 Multivariable Cox proportional hazards regression analysis of total cholesterol levels and all-cause mortality in patients with coronary artery disease*

Total cholesterol (low vs. high) Sex (male vs. female) Ever vs. never smoking NYHA Class Age (per year) Body mass index (per 1 increment in kg m−2) Hypertension (yes/no) Acetyl salicylate treatment (yes/no) Statin treatment (yes/no) ACE-inhibitor treatment (yes/no)

Hazard ratio

95% CI

2·932 4·524 3·625 2·199 1·071 1·028

1·021–8·422 0·949–2·127 1·198–10·964 0·923–5·237 0·995–1·153 0·915–1·153

1·589 3·197 1·381 1·476

0·554–4·555 1·070–9·549 0·278–6·861 0·472–4·618

Low TC level was defined as values < 5·2 mmol L−1, based on receiver-operating characteristic analysis, and severity of HF was defined as NYHA class I–II vs. III–IV. Significant predictors of mortality are marked in bold. *

Table 5 Multivariable Cox proportional hazards regression analysis of C-reactive protein levels and all-cause mortality in patients with coronary artery disease*

C-reactive protein (high vs. low) Sex (male vs. female) Ever vs. never smoking NYHA Class Age (per year) Body mass index (per 1 increment in kg m−2) Hypertension (yes/no) Acetyl salicylate treatment (yes/no) Statin treatment (yes/no) ACE-inhibitor treatment (yes/no)

Hazard ratio

95% CI

5·214 9·17 5·182 2·510 1·096 1·015

1·762–15·427 1·81–45·45 1·501–17·896 1·096–5·747 1·014–1·184 0·9–1·143

1·092 3·085 1·362 2·375

0·376–3·171 1·059–8·992 0·263–7·065 0·762–7·409

* High CRP level was defined as values ≥ 6·24 based on receiveroperating characteristic analysis, and severity of HF was defined as NYHA class I–II vs. III–IV. Significant predictors of mortality are marked in bold.

we analyzed the prediction of mortality by HDL-C (< 2·88 mmol L−1) and LDL-C (< 0·92 mmol L−1) in the same multivariable Cox model, as presented in Table 4. In case of HDL-C a hazard ratio of 3·485 (95% CI 1·341– 9·041), whereas in case of LDL-C a nonsignificant hazard ratio [0·626 (0·253–1·549)] was obtained. Prediction of mortality by CRP levels was analyzed using the multivariable Cox proportional hazards regression model [ Table 5]. High CRP level (defined as values ≥ 6·24) was a significant predictor of mortality (hazard ratio 5·214, 95% CI 1·762–15·427). In this model, other significant predictors of mortality were male sex, ever smoking habit, severity of HF, age and acetyl-salicylate treatment.

Table 6 Additive predictive effect of low total cholesterol/ high Creactive protein levels on mortality in patients with coronary artery disease as analyzed by multivariable Cox proportional hazards regression method Hazard 95% ratio CI CRP low/ TC high CRP low/ TC low CRP high/TC high CRP high/TC low Sex (male vs. female) Ever vs. never smoking NYHA Class (per one class increase) Age (per year) Body mass index (per 1 increment in kg m−2) Hypertension (yes/no) Acetyl salicylate treatment (yes/no) Statin treatment (yes/no) ACE-inhibitor treatment (yes/no)

1 2·649 4·915 11·714 6·896 4·901 2·087 1·091 1·011

– 0·564 1·173 2·619 1·298 1·424 0·837 1·008 0·900

– 12·433 20·584 52·385 37·037 16·863 5·199 1·180 1·136

1·261 3·191 1·254 2·025

0·426 1·075 0·240 0·614

3·735 9·469 6·568 6·678

* High CRP level was defined as values ≥ 6·24; low TC level was defined as values < 5·2 mmol L−1, based on receiveroperating characteristic analysis, and severity of HF was defined as NYHA class I–II vs. III–IV. Significant predictors of mortality are marked in bold.

The lack of correlation (r = 0·018, P > 0·05) or relationship [Tables 2 and 3] between TC and CRP values together with the significant, independent predictive values of the two parameters on mortality prompted us to investigate additive predictive effects between TC and CRP levels on all-cause mortality in CAD.

Additive predictive value of high CRP and low TC levels on mortality in CAD To determine additive predictive effects, subjects with low CRP and high TC levels were used as reference to compare other combinations of variables. As presented in Table 6, the highest mortality risk was observed in patients with a low TC/ high CRP phenotype, hazard ratio 11·714 (95% CI 2·619– 52·385), compared with the high TC low/CRP group. In this model other variables, such as male sex, ever smoking habit, age and acetyl salicylate treatment, were also significant predictors of mortality. These data strongly support that an elevated CRP concentration with a decreased total cholesterol level is an additive, independent predictor of mortality in patients with CAD. In Fig. 1 the cumulative proportion of surviving patients is plotted against time of follow up according to the KaplanMeyer method. Significant difference was recorded between patients with low TC/ high CRP as compared with patients with highTC/low CRP (reference) by the log-rank test (P < 0·0001).

Discussion The aim of the present study was to analyze the additive predictive effect of total cholesterol- and C-reactive protein



109

Figure 1 Cumulative proportion of surviving patients plotted against time of follow up according to the Kaplan-Meyer method in case of different variables. P < 0·0001 (as determined by the log-rank test, total cholesterol [TC] high / C-reactive protein [CRP] low [reference] compared to TC low /CRP high).

(CRP) levels on survival in patients with CAD. C-reactive protein measured by ultrasensitive assay was applied as an appropriate indicator of systemic inflammation with reliable and widely available laboratory tests for measurement. Our study population represents relatively young (median age 58 years) randomly selected patients with CAD with different severity of HF of ischaemic origin. The major novel observation of our study is the prediction of all-cause mortality by a phenotype of low total cholesterol and high CRP (additive predictive effect). Subjects with low TC / high CRP phenotype suffer an 11·714-fold higher risk of mortality than patients with high TC/low CRP. After a median follow up of 5·06 years, only 56% of the subjects with low TC / high CRP phenotype were alive, whereas 95% of patients with high TC/low CRP had survived by that time. Using low TC or high CRP levels as predictors of mortality can achieve a substantially weaker risk prediction than using low TC /high CRP phenotype. Additive predictive effect of decreased TC and increased CRP levels on mortality in CAD has never been described. Studies focused on the relationship between cytokines and mortality in patients with chronic heart failure (CHF) have been repeatedly published [24 –26]. In the study of Rauchhaus et al. [25], tumour necrosis factor-alpha concentrations showed a strong, inverse correlation with TC levels, and the relationship with the soluble CD14 /TC ratio (potentially reflecting recent lipopolysacharide [LPS] bioactivity) was even more pronounced. As presented earlier by Rauchhaus et al. for different cytokines, low TC levels are associated with elevated amounts of inflammatory markers. As already proposed [22], increased bowel wall oedema may cause translocation of bacterial endotoxin from the gut which may induce pro-inflammatory cytokines. As shown for the first time in this report, the simultaneous presence of low TC levels with high concentrations of CRP indeed increases mortality in patients with CAD.

Our observation on the worsened survival of patients with CAD with decreased TC levels is unexpected, as elevated TC and LDL-C levels are widely accepted traditional risk factors of vascular diseases and cardiovascular mortality. However, recent observations of Richartz et al. [13] showed that low TC levels were associated with increased mortality in patients undergoing left ventricular assist device implantation. In addition, Rauchhaus et al. [27] presented a worse prognosis in CHF patients with low vs. normal TC levels. More recently, this observation has convincingly been proven in two large studies including patients with severe HF [15,16]. The phenomenon of so-called reverse epidemiology of traditional risk factors received attention recently in chronic diseases [17,18]. Total cholesterol levels were associated in our study with severity of HF and body mass index. Thus, low TC levels may merely reflect the metabolic consequences of advanced heart failure. However, after adjustment for NYHA class and body mass index (among other covariables) the relationship between low TC and mortality remained significant. This fact indicates that lower TC levels are probably not only a marker of poor nutritional state or cachexia, or of decreased hepatic synthetic capacity. Rather, some of the patients are prone to have low cholesterol levels by their genetic background or environmental (nutritional) factors or practice. These patients with CAD are at increased risk to have bad prognosis and impaired survival, especially if a substantial inflammatory reaction is present. Investigations into the pathophysiology behind the cholesterol survival association in sepsis have focused on a role for lipoproteins in down-regulating the inflammatory response via an interaction between lipoproteins and bacterial lipopolysaccharide (LPS). Low-density lipoprotein and HDL have been shown to bind LPS and to protect against the immediate toxic effects of LPS on endothelial


110


cells [28]. LDL-receptor knock-out mice with increased LDL levels exposed to LPS produced fewer cytokines and survived longer than wild-type controls [29]. Mice pretreated with hypolipidaemic agents produced more TNF and had markedly reduced survival after being subjected to bacteria or endotoxin [30]. A similar mechanism may operate in patients with CAD as well. Patients with CAD may suffer from episodic endotoxemia owing to infections and oedematous alterations in the gut epithelium. The protective role of lipoproteins in CAD may stem from an ability to diminish the LPS-induced elaboration of cytokines detrimental to the heart, such as TNF [31]. Our study, reporting additive predictive effects of low TC and high CRP levels, supports this link between lipoproteins and inflammation. Clinical trials demonstrate that 3-hydroxy-3-methyglutaryl coenzyme A reductase inhibitors (statins) are safe and effective in treating hyperlipidaemia and reducing cardiovascular events [2,3]. Furthermore, statins are effective in the long-term reduction of plasma CRP levels [32]; therefore, treatment of patients with normal LDL but high CRP concentrations with statins has been suggested [33]. However, it has not convincingly been cleared whether the antiinflammatory and lipid-lowering effects of statins are independent or not. Most importantly, recent studies [34,35] indicate that statin therapy is associated with lower mortality among patients with severe HF. Furthermore, the improved outcomes were observed regardless of cholesterol level, aetiology of HF, or other medications, despite the previous reports on the association between low total cholesterol and impaired HF prognosis in the same population [15]. These results warrant further studies to be designed to analyze whether the beneficial effects of statins in HF are related to their anti-inflammatory or lipid-lowering effects, or both. We acknowledge potential limitations of our study. The study was underpowered to detect interactions with different causes of death. However, we have reported on all-cause mortality, which may be the only indisputable and unbiased end-point in patients with CAD. As coronary-angiography was available only for a proportion of the patients, the potential impact of the number of affected vessels on mortality could not be analyzed. Important confounders (such as nutritional state, alcohol abuse, diet prescriptions and presence of kidney disease) could not be analyzed in our study owing to insufficient information. C-reactive protein and lipid parameters were assessed only at a single time point. However, an important strength of our investigation is the measurement of a widely available inflammatory marker by a high-sensitivity assay. In conclusion, in this study we have reported on the significantly shorter survival of patients with CAD carrying low TC levels or high CRP concentrations. The predictive effect of low TC and high CRP is additive and is independent from other variables such as male sex, smoking habit, severity of heart failure, age and body mass index. These results support and confirm data of previous reports on the link between low lipoprotein levels and inflammation in patients with heart failure.

Acknowledgements We thank the subjects for their participation in the study. This study was supported by ‘ATHERNET’ QLG1-CT2002 – 90397 (European Commission, http://www.athernet.hu), ETT 27a/2003 and T046837 (National Research Fund) grants. The excellent technical assistance of Szigeti Antalné, Korponay Gézáné and the staff of the Central Laboratory is acknowledged with many thanks.

References 1 Pekkanen J, Linn S, Heiss G, Suchindran CM, Leon A, Rifkind BM et al. Ten-year mortality from cardiovascular disease in relation to cholesterol level among men with and without preexisting cardiovascular disease. N Engl J Med 1990;322:1700–7. 2 The Scandinavian Simvastatin Survival Study Group. Randomized trial of cholesterol lowering in 4,444 patients with coronary heart disease: The Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S). Lancet 1994;344:1383–9. 3 Shepherd J, Cobbe SM, Ford I, Isles CG, Lorimer AR, MacFarlane PW et al. Prevention of coronary heart disease with pravastatin in men with hypercholesterolemia. West of Scotland Coronary Prevention Study Group. N Engl J Med 1995;333:1301–7. 4 Jacobs D, Blackburn H, Higgins M, Reed D, Iso H, McMillan G. Report of the Conference on Low Blood Cholesterol: Mortality Assocs. Circulation 1992;86:1046– 60. 5 Meilahn EN. Low serum cholesterol. Hazardous to health? Circulation 1995;92:2365–6. 6 Fonarow GC, Horwich TB. Cholesterol and mortality in heart failure: The bad gone good? J Am Coll Card 2003;42:1941–3. 7 Elliot DC, Wiles CE III. Low lipid concentration in critical illness; hypocholesterolemiaamong trauma patients. Crit Care Med 1994;22:1437–9. 8 Gui D, Spada PL, De Gaetano A, Pacelli F. Hypocholesterolemia and risk of death in the critically ill surgical patient. Intensive Care Med 1996;22:790–4. 9 Fraunberger P, Nagel D, Walli AK, Seidel D. Serum cholesterol and mortality in patients with multiple organ failure. Crit Care Med 2000;28:3574–5. 10 Lowrie EG, Lew NL. Death risk in hemodialysis patients: the predictive value of commonly measured variables and an evaluation of death rate differences between facilities. Am J Kidney Dis 1990;15:458–82. 11 Schatz IJ, Masaki K, Yano K, Chen R, Rodriguez BL, Curb JD. Cholesterol and all-cause mortality in elderly people from the Honolulu Heart Program: a cohort study. Lancet 2001;358:351–5. 12 Weverling-Rijnsburger AWE, Blauw GJ, Lagaay AM, Knook DL, Meinders AE, Westendorp RGJ. Total cholesterol and risk of mortality in the oldest old. Lancet 1997;350:1119–23. 13 Richartz BM, Radovancevic B, Frazier OH, Vaughn WK, Taegtmeyer H. Low serum cholesterol levels predict high perioperative mortality in patients supported by a leftventricular assist system. Cardiology 1998;89:184–8. 14 Vredevoe DL, Woo MA, Doering LV, Brecht ML, Hamilton MA, Fonarow GC. Skin test anergy in advanced chronic heart failure secondary to either ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol 1998;82:323–8.



15 Horwich TB, Hamilton MA, Maclellan WR, Fonarow GC. Low serum total cholesterol is associated with marked increase in mortality in advanced heart failure. J Card Fail 2002;8:216 –24. 16 Rauchhaus M, Clark AL, Doehner W, Davos C, Bolger A, Sharma R et al. The relationship between cholesterol and survival in patients with chronic heart failure. J Am Coll Cardiol 2003;42:1933 –40. 17 Kalantar-Zadeh K, Block G, Horwich T, Fonarow GC. Reverse epidemiology of conventional cardiovascular risk factors in patients with chronic heart failure. J Am Coll Cardiol 2004;43:1439 –44. 18 Kalantar-Zadeh K, Block G, Humphreys MH, Kopple JD. Reverse epidemiology of cardiovascular risk factors in maintenance dialysis patients. Kidney Int 2003;63:793–808. 19 Ridker PM, Brown NJ, Vaughan DE, Harrison DG, Mehta JL. Established and emerging plasma biomarkers in the prediction of first atherothrombotic events. Circulation 2004;109:IV–6–19. 20 Ridker PM, Rifai N, Rose L, Buring JE, Cook NR. Comparison of C-reactive protein and low-density lipoprotein cholesterol levels in the prediction of first cardiovascular events. N Engl J Med 2002;347:1557– 65. 21 Ridker PM, Rifai N, Pfeffer MA, Sacks FM, Moye LA, Goldman S et al. Inflammation, pravastatin, and the risk of coronary events after myocardial infarction in patients with average cholesterol levels. Circulation 1998;98:839 – 44. 22 Ridker PM, Cushman M, Stampfer MJ, Tracy RP, Hennekens CH. Inflammation, aspirin, and risks of cardiovascular disease in apparently healthy men. N Engl J Med 1997;336:973 – 9. 23 Quinones MA, Waggoner AD, Reduto LA, Nelson JG, Young JB, Winters WL Jr et al. A new, simplified and accurate method for determining ejection fraction with two dimensional echocardiography. Circulation 1981;64:744 –53. 24 Vasan RS, Sullivan LM, Roubenoff R, Dinarello CA, Harris T, Benjamin EJ et al. Inflammatory markers and risk of heart failure in elderly subjects without prior myocardial infarcion. The Framingham Heart Study. Circulation 2003;107:1486–91.

111

25 Rauchhaus M, Coats AJS, Anker SD. The endotoxinlipoprotein hypothesis. Lancet 2000;356:930–3. 26 Deswal A, Petersen NJ, Feldman AM, Young JB, White BG, Mann DL. Cytokines and cytokine receptors in advanced heart failure. An analysis of the cytokine database from the Vesnarinone trial (VEST). Circulation 2001;103:2055–9. 27 Rauchhaus M, Koloczek V, Hans-Dieter V, Kemp M, Niebauer J, Francis DP et al. Inflammatory cytokines and the possible immunological role for lipoproteins in chronic heart failure. Int J Cardiol 2000;76:125–33. 28 Van Lenten BJ, Fogelman AM, Haberland ME, Edwards PA. The role of lipoproteins and receptor-mediated endocytosis in the transport of bacterial lipopolysaccharide. Proc Natl Acad Sci U S A 1986;83:2704–8. 29 Netea MG, Demacker PNM, Kullberg BI, Boerman OC, Verschueren I, Stalenhoef AF et al. Low-density lipoprotein receptor deficient mice are protected against lethal endotoxaemia and severe gram-negative infections. J Clin Invest 1996;97:1366–72. 30 Feingold KR, Funk JL, Moser AH, Shigenaga JK, Rapp JH, Grunfeld C. Role for circulating lipoproteins in protection from endotoxin toxicity. Infect Immunol 1995;63:2041–6. 31 Rauchhaus M, Doehner W, Bolger AS, Schmidt H, Davos C. Endotoxin and severity of chronic heart failure. J Am Coll Cardiol 2001;37:190 (Abstract). 32 Ridker PM, Rifai N, Pfeffer MA, Sacks F, Braunwald E for the Cholesterol and Recurrent Events (CARE) Investigators. Long-term effects of pravastatin on plasma concentration of C-reacive protein. Circulation 1999;100:230–5. 33 Ridker PM. High-sensitivity C-reactive protein: potential adjunct for global risk assessment in the primary prevention of cardiovascular disease. Circulation 2001;103:1813–8. 34 Horwich TB, MacLellan WR, Fonarow GC. Statin therapy is associated with improved survival in ischaemic and nonischaemic heart failure. J Am Coll Cardiol 2004;43:642–8. 35 Mozaffarin D, Nye R, Levy WC. Statin therapy is associated with lower mortality among patients with sever heart failure. Am J Cardiol 2004;93:1124–9.


ÖRÖKLETES FAKTOROK ÉS INFEKTÍV TÉNYEZŐK

Recommend Documents