Regulátor és effektor tényezők szerepének vizsgálata autoimmun megbetegedések pathomechanizmusában Doktori értekezés
Szente-Pásztói Mária
Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Buzás Edit egyetemi docens, Phd, DSc Hivatalos bírálók: Dr. Dankó Katalin egyetemi docens, PhD, DSc Dr. Szeberényi Júlia egyetemi tanársegéd, PhD Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Gergely Péter egyetemi tanár, Phd, DSc Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Dérfalvi Beáta egyetemi tanársegéd, PhD Dr. Miklós Katalin PhD
Budapest 2009
TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS ........................................................................................................... 8 1.1. Genetikai tényezők jelentősége.......................................................................... 8 1.2. Környezeti tényezők és a citrullináció ............................................................... 9 1.3. Az RA pathomechanizmusának fő szabályozási és effektor mechanizmusai . 12 1.3.1. A citokinek, kemokinek és sejtkölcsönhatások RA-ban .......................... 12 1.3.1.1. T-limfociták szerepe RA-ban ............................................................. 12 1.3.1.2. B-limfociták szerepe RA-ban ............................................................ 14 1.3.1.3. A makrofágok funkciója RA-ban....................................................... 15 1.3.1.4. Neutrofil granulociták RA-ban .......................................................... 17 1.3.1.5. Hízósejtek szerepe RA-ban ................................................................ 17 1.3.1.6. Szinoviális fibroblasztok, kondrociták, porc degradáció ................... 17 1.3.2. A membrán mikrovezikulák szerepe RA-ban .......................................... 20 1.3.3. Szénhidrátfelismerő rendszerek ............................................................... 22 1.3.4. Természetes és patológiás autoantitestek RA-ban ................................... 25 1.3.5. A glikoziláció immunregulációs szerepe ................................................. 26 1.4. A porc szerkezete és a porcdegradációért felelős enzimek RA-ban: ............... 28 1.4.1. A porc szerkezete ..................................................................................... 28 1.4.2. Metalloproteinázok .................................................................................. 30 1.4.3. Exo- és endoglikozidázok, glikozidáz-szerű molekulák .......................... 32 1.4.3.1. Exoglikozidázok ................................................................................ 32 1.4.3.2. Endoglikozidázok .............................................................................. 34 1.4.3.3. Hc-gp 39, glikozidáz-szerű molekula ................................................ 34 1.5. Nitrogén monoxid ............................................................................................ 35 2. CÉLKITŰZÉSEK ................................................................................................. 37 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ........................................................................... 39 3.1. Felhasznált humán minták ............................................................................... 39 3.2. Sejtkultúrák ...................................................................................................... 41 3.2.1. Szinoviális fibroblaszt sejttörzsek izolálása............................................. 41 3.2.2. Perifériás vér mononukleáris sejtek izolálása .......................................... 43 3.3. Real Time PCR ................................................................................................ 43 3.4. Enzimaktivitás mérések ................................................................................... 44 3.5. Citokinek hatásának vizsgálata szinoviális fibroblasztok glikozidázainak génexpressziójára és szekréciójára .................................................................... 45 3.6. Hisztokémiai vizsgálatok ................................................................................. 45 3.6.1. SF glikozidázainak kimutatása enzimhisztokémiával ............................. 45 3.6.2. GAG ellenes antitestek porcmátrixhoz való kötődésének vizsgálata immunhisztokémiával ........................................................................................ 45 3.7. Áramlási citometriás (FACS) mérések ............................................................ 46 3.7.1. SF-eredetű mikrovezikulák FACS vizsgálata .......................................... 46 3.7.2. PBMC-k immunfenotípusának és citokintermelésének vizsgálata .......... 46 3.7.3. PBL vizsgálata FACS segítségével .......................................................... 47 3.8. SF-eredetű MV-k vizsgálata elektron mikroszkópiával (EM) ......................... 48 3.9. ELISA rendszerek ............................................................................................ 48 3.9.1. Szénhidrát ELISA .................................................................................... 48 3.9.2. Peptid-specifikus antitestek mérése ELISA módszerrel .......................... 49 3.10. Szénhidrát chip............................................................................................... 49 3.11. ELISPOT mérések citokintermelő sejetk számának meghatározására .......... 50 3.12. Lineáris peptidek szintézise ........................................................................... 50 3.13. HLA genotipizálás ......................................................................................... 52
2
3.14. Ciklikus citrullinált peptid-ellenes (anti-CCP) antitestek meghatározása ..... 52 3.15. Statisztikai analízis......................................................................................... 52 4. EREDMÉNYEK ................................................................................................... 54 4.1. Glikozidázok génexpressziójának és enzimaktivitásának vizsgálata rheumatoid arthritises és osteoarthritises szinoviális fibroblasztokban ................................ 54 4.1.1. Glikozidázok génexpressziójának vizsgálata ........................................... 54 4.1.2. Glikozidázok enzimaktivitásának vizsgálata ........................................... 57 4.1.3. GusB és NAG enzimhisztokémiai kimutatása SF-ben ............................ 59 4.1.4. A citokinek és az NO hatása az SF-ek glikozidázainak génexpressziójára és enzimaktivitására ........................................................................................... 59 4.1.5. A HexDC expressziójának és aktivitásának vizsgálata ........................... 64 4.1.6. SF-eredetű MV-k és az MV-kel asszociált GusB és NAG aktivitás vizsgálata............................................................................................................ 66 4.2. GAG-ellenes természetes autoantitestek vizsgálata rheumatoid arthritisben .. 69 4.2.1. GAG-ellenes antitestek kimutatása szérum mintákból ............................ 69 4.2.2. A GAG-ellenes antitestek kimutatása szinoviális folyadékból ................ 70 4.2.3. Anti-GAG antitestek, mint betegség markerek ........................................ 71 4.2.4. A GAG-ellenes antitestek és az RF közti reláció..................................... 75 4.2.5. A CSC-IgM és az anti-CCP antitestek közötti összefüggés .................... 75 4.2.6. A GAG-ellenes antitestek keresztreakciója más típusú GAG-al, peptidoglikánokkal és gomba eredetű poliszaharidokkal .................................. 75 4.2.7. A GAG-ellenes antitestek kötődésének gátlása anioncserélő gyantával . 76 4.2.8.Glikozidázzal emésztett humán porc aggrekán antitestek általi felismerése ............................................................................................................................ 76 4.2.9. Szénhidrát-felismerő mintázatok meghatározása .................................... 77 4.2.10. Szénhidrát-specifikus antitestek kötődése a porc mátrixhoz ................. 78 4.3. T-sejt aktiváló peptidek és citrullinált változataik perifériás vérsejtek IL-17 termelésére gyakorolt hatásának vizsgálata ....................................................... 79 4.3.1. A kontrollok és az RA-s betegek aggrekán és HLA peptidekre adott IL-17 válasza ................................................................................................................ 79 4.3.2. A kontrollok és az RA-s betegek sejtjeinek IL-17 válasza különbözően citrullinált peptidvariánsokra ............................................................................. 80 4.3.3. Szintetikus peptidekkel stimulált PBMC-k Th1/Th2 citokin termelése .. 83 4.3.4. Az egészséges kontrollok és RA-s betegek perifériás vérsejtjeinek immunfenotípizálása .......................................................................................... 83 4.3.5. HLA genotipizálás ................................................................................... 83 4.3.6. Szérum antitestek reaktivitása a különbözőképpen citrullinált HLA és aggrekán peptidekkel szemben. ......................................................................... 84 4.4. RA-s és kontroll T-limfociták intracelluláris NO szintjének, citoplazmatikus Ca2+ koncentrációjának és mitokondrium-tömegének meghatározása .............. 87 4.5. Az eredmények rövid összefoglalása ............................................................... 89 5. MEGBESZÉLÉS................................................................................................... 90 6. KÖVETKEZTETÉSEK ..................................................................................... 101 7. ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................................ 103 8. SUMMARY ......................................................................................................... 104 9. IRODALOMJEGYZÉK..................................................................................... 105 10. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE ........................................................... 141 10.1. A disszertáció témájához kapcsolódó közlemények listája: ........................ 141 10.2. A disszertáció témájához nem kapcsolódó közlemények listája: ................ 142 11. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS .......................................................................... 143
3
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACPA
citrullinált fehérjékkel szembeni antitest, anti-citrullinated protein antibody
ADAMTS
trombospondin motívummal rendelkező diszintegrin és metalloproteináz, A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin motifs
ANOVA
varianciaanalízis, Analysis of Variance
APRIL
B-sejt túlélési faktor, a proliferation-inducing ligand
BAFF
B-sejt aktiváló faktor, B cell activating factor
bFGF
bázikus fibroblaszt növekedési faktor, basic fibroblast growth factor
BIK
Budai Irgalmasrendi Kórház
BSA
marha szérum albumin, bovine serum albumin
CCL_
CC-kemokin ligand
CCP
ciklikus citrullinált peptid
CD
katalogizált sejtfelszíni marker sorszám-azonosítóját bevezető előtag, Cluster of Differentiation
CIA
kollagén-indukált arthritis, collagen-induced arthritis
CXCL_
CXC-kemokin ligand
cDNS
komplementer DNS
COMP
porc oligomer mátrix fehérje, cartilage oligomeric matrix protein
CRP
C-reaktív protein
CSA, B, C
kondroitin-szulfát A, B, C
CT
Cycle Threshold
CTLA-4
citotoxikus T-limficita antigén-4, Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4
DAS28
Disease Activity Score for 28 joints
DMARD
disease modifying antirheumatic drugs
DMEM
Dulbecco's modified Eagle's medium
DNS
dezoxiribonukleinsav
dNTP
dezoxiribonukleotid-trifoszfát
ECM
extracelluláris mátrix
EDTA
etilén-diamin-tetraecetsav
EM
elektron mikroszkóp
EULAR
European League Against Rheumatism
4
FACS
áramlási citometria, Fluorescence Activated Cell Sorting
FCS
embrionális borjúsavó, Fetal Calf Serum
FOXP3
forkhead box P3 transzkripciós faktor
FSC-H
előre szórás, forward scatter
GAG
glükózaminoglikán
GalNAc
N-acetil-galaktózamin
GlcNAc
N-acetil-glükózamin
GusB, GUS
β-D-glükuronidáz gén, enzim
HA
hialuronsav
Hc-gp 39
39 kDa-os humán porc-glikoprotein, Human cartilage-glycoprotein 39
HexA/B
hexózaminidáz A/B alegység
HGPRT
hipoxanthin-guanin foszforibozil transzferáz, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase
HLA
humán leukocita antigén
HS
heparán-szulfát
HSP_
hősokk fehérje
Hyal1
hialuronidáz-1
ICAM_
intercelluláris adhéziós molekula_
IFN-γ
interferon-γ
Ig_
immunoglobulin_
IL-_
interleukin-_
KO egér
génkiütött egér, knock out
KS
keratán-szulfát
LTα/β
limfotoxin-α/β
MBL
mannóz-kötő lektin, mannan-binding lectin
MgCl2
magnézium-klorid
MHC
fő hisztokompatibilitási komplex, major histocompatibility complex
MMP
mátrix metalloproteináz
MV
mikrovezikula
MVB
multivezikuláris test
NAb
természetes autoantitest, natural autoantibody
NAG
β-D-N-acetil-glükózaminidáz
NAGA
β-D-N-acetil-galaktózaminidáz
NAO
nonyl acridine orange 5
NO
nitrogén-monoxid
NOC-18
nitrogén-monoxid donor, (Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl) amino] diazen-1-ium-1,2-diolate diethylenetriamine
NOS
nitrogén-oxid szintetáz
OA
osteoarthritis
OD
optikai denzitás
ORFI
Országos Rheumatológiai és Fizioterápiás Intézet
PAD
peptidilarginin deimináz
PBL
perifériás vér limfocita, peripheral blood lymphocyte
PBMC
perifériás vér mononukleáris sejtek, peripheral blood mononuclear cells
PBS
foszfát-pufferelt fiziológiás sóoldat, phosphate buffered saline
PCR
polimeráz láncreakció, polymerase chain reaction
PDGF
vérlemezke eredetű növekedési faktor, platelet-derived growth factor
PGIA
proteoglikán-indukált arthritis, proteoglycan-induced arthritis
PI
propidium-jodid
PMSF
fenil-metil-szulfonil-fluorid
RA
rheumatoid arthritis
RF
rheuma faktor
RNS
ribonukleinsav
RP-HPLC
reverz-fázisú, magas teljesítményű folyadék kromatográfia, reverse-phase high-performance liquid chromatography
RPMI
Roswell Park Memorial Instituteban Moore és mtsai által kifejlesztett tápfolyadék
SE
shared epitóp
SFl
szinoviális folyadék
SF
szinoviális fibroblaszt
SLE
systemas lupus erythematosus
SLRP
leucinban gazdag ismétlődéseket hordozó fehérjecsalád, small leucine rich proteins
SM
szinoviális membrán
SNP
egypontos polimorfizmus, single nucleotide polymorphism
Spam1
sperm adhesion molecule 1
SSC-H
oldalszórás, side scatter 6
TCR
T-sejt receptor, T-cell receptor
TGF-β1
tumor növekedési faktor-β1, tumor growth factor- β1
Th
T-helper sejt
TI
csecsemőmirigy-független antigén, thymus independent
TIMP
metalloproteinázok szöveti inhibitorai, tissue inhibitors of metalloproteinases
TLR
Toll-like receptor
TNF-α
tumor nekrózis faktor- α
TReg
természetes reguláló T-sejtek
VEGF
vaszkuláris endoteliális növekedési faktor, vascular endothelial growth factor
7
1. BEVEZETÉS A rheumatoid arthritis pathomechanizmusa A rheumatoid arthritis (RA) krónikus, progresszív, szisztémás autoimmun megbetegedés, mely a felnőtt lakosság körülbelül 0,5-1%-át érinti. Jellemzője a perifériás ízületek gyulladása, az ízületi porc és csont radiológiai destrukciója, ami végül az ízületek deformitása következtében a mozgásfunkciók és a fizikai aktivitás romlásához vezethet. Ez a többnyire 40-50 éves korban kialakuló betegség nőkben háromszor gyakrabban fordul elő, mint férfiakban. Multifaktoriális kórképről van szó, hiszen kialakulásának hátterében komplex genetikai hajlam mellett szerepe van különböző környezeti tényezőknek, mikróbiális fertőzéseknek, illetve autoimmun mechanizmusoknak is. 1.1. Genetikai tényezők jelentősége Egypetéjű ikrekben az RA konkordanciája 15-20%, kétpetéjű ikrekben ez kevesebb, mint 5%, mely igazolja a genetikai tényezők szerepét a betegség kialakulásában. A betegség kialakulásának kockázatát 50-60%-ban genetikai eredetű tényezők határozzák meg (MacGregor és mtsai, 2000). A 70-es évek végén Stastny állapította meg a HLA (humán leukocita antigén) gének elsődleges szerepét a RA-re való hajlam kialakításában (Stastny, 1976, 1978). A HLA régió tehető felelőssé a teljes genetikai hajlam 30-50%-áért (Bowes és Barton, 2008). John és munkatársai egy nagyszabású teljes genomszűréses analízist hajtottak végre, melynek során a HLA*DRB1 régiót az RA fő hajlamosító lókuszaként azonosították (John és mtsai, 2004). Az RA-val asszociáló HLA DRB1 allélek egy konzervatív pentapeptid
szekvenciát
kódolnak,
a
shared
epitópot
(SE),
mely
a
fő
hisztokompatibilitási komplex (MHC) molekula β1 láncának harmadik hipervariábilis régiójában (Gregersen és mtsai, 1987). A shared epitóp aminosav szekvenciája QKRAA, QRRAA vagy RRRAA lehet, mely szekvenciákat a következő allélek hordozhatják: DRB1*0401, DRB1*0404, DRB1*0405, DRB1*0408, DRB1*0101, DRB1*0102, és DRB1*1001. Ezen RA-asszociált SE allélek gyakorisága etnikai csoportonként különböző lehet. A homozigóta genotípussal szemben az allélek kombinációja tovább fokozza a betegség kockázatat. Erre kiváló példa a DRB1*0401/*0404 genotípus, mely a betegség korai megjelenésével és rendkívül
8
súlyos lefutásával jár (Newton és mtsai, 2004). Míg a DRB*0401/DRX hordozók (az X egy SE-t nem kódoló allélt jelöl) RA-ra vonatkozó relatív kockázata 4.7, addig DRB1*0401/*0404 heterozigóták esetén ugyanez az érték már 31.3 (Hall és mtsai, 1996). Megemlítendő továbbá, hogy a HLA régión belüli DQB1 (HLA DQ7 és DQ8) allélekkel szoros kapcsoltságot mutat a DRB1 allélek öröklődése (Ilonen és mtsai, 1990). A HLA régión kívül számos más gén is hozzájárulhat az RA-ra való genetikai hajlam kialakításához. Ilyen például az arginin-citrullin átalakításért felelős peptidilarginin deimináz enzimet kódoló PADI4 gén (Suzuki és mtsai, 2003), az NFKBIL1 lókusz (Okamoto és mtsai, 2003), a szerves kationtranszporter SLC22A4 és RUNX1 gének intronikus egypontos polimorfizmusai (SNP) (Tokuhiro és mtsai, 2003), a protein tirozin foszfatáz PTPN22 gén SNP-jének minor allélje (1858C-T, R620W) (Begovich és mtsai, 2004), vagy a transzkripció szignál transzducerét és aktivátorát kódoló STAT4 gén harmadik intronjában található haplotípusok (Remmers és mtsai, 2007). Megemlítendők továbbá a hatodik kromoszóma hosszú karjának 23-as régiójában (6q23) található SNP-k (Thomson és mtsai, 2007; Penge és mtsai, 2007), az interferon reguláló faktort kódoló IRF5 gén SNP-k (Sigurdsson és mtsai, 2007), a tumor nekrózis faktor receptor-asszociált faktor 1 és az 5-ös komplement komponenst kódoló TRAF1-C5 lókusz (Plenge és mtsai, 2007), valamint a CD40 és CC-kemokin ligand-21 (CCL21) lókuszok (Raychaudhuri és mtsai, 2008) RA-val való asszociációja. Ezen felül számos citokin illetve citokin receptor gén polimorfizmusa mutat még asszociációt RA-vall, melyek közül csak néhány fontosabbat említenék meg: mint például az interleukin-1β (IL-1β), az IL-1R antagonista és a tumor nekrózis faktor-α (TNF-α) polimorfizmusait (Cvetkovic és mtsai, 2006), az IL-6 promoter (Pascual és mtsai, 2000), az IL-10 promoter (Lard és mtsai, 2003), illetve az IL-18 promoter polimorfizmusok (Sivalingam és mtsai, 2003).
1.2. Környezeti tényezők és a citrullináció A rheumatoid arthritis kialakulásában szerepet játszó környezeti tényezők közül kiemelkedő a mikrobiális fertőzések jelentősége. Számos fertőző ágensről
9
bebizonyosodott, hogy kockázati faktorként részt vehetnek a betegség kialakításában: mint például a humán parvovírus B19, az Epstein-Barr vírus EBV, különböző retrovírusok,
alfavírusok,
hepatitisz
B
vírus,
Mycobacterium
tubercolosis,
Escherichia coli, Proteus mirabilis, és a Mycoplasma (Kobayashi és mtsai, 2008). A fertőzés során szervezetbe jutott mikrobiális antigének egy része ugyanis szerkezetileg hasonlít bizonyos porc alapállomány vagy mátrix molekulákhoz. A primer fertőzést követően a molekuláris mimikri elve alapján zajlik tovább a folyamat, melynek során olyan T-sejtek aktiválódnak a fertőző ágens elpusztítása céljából, melyek saját antigének felismerésére (keresztreakcióra) is képesek, így autoimmun folyamatokat indítanak el (Wucherpfennig, 2001). Emellett rendkívül érdekes összefüggést mutattak ki a dohányzás és az SE-t hordozó HLA DRB1 allélek között. Mielőtt azonban ezt részletesebben elemeznénk, fontos kitérnünk a citrullináció folyamatának és jelentőségének ismertetésére. A citrullináció a fehérjék szintézisét követő poszttranszlációs módosítás, melynek során a fehérjék argininje citrullinná alakul a peptidilarginin deimináz (PAD) enzim segítségével. A folyamat végeredményeként deiminált aminosavat kapunk egy amino csoport felszabadulása révén (1. ábra) (György és mtsai, 2006). A PAD enzim emellett az autoantitestek cél antigénjeként is ismert RA-ban, mely immunkomplexek képzése révén synovitis kialakulásához járul hozzá (Halvorsen és mtsai, 2008).
1. ábra: A citrullináció lépései (György és mtsai, 2006)
10
Bár RA-ban nagy koncentrációban vannak jelen a saját antigénekkel, mint a II. kollagén, aggrekán, hősokk fehérjék, glikoproteinek, és IgG-vel szembeni autoantitestek,
mégis
a
betegség
szempontjából
legspecifikusabbnak
és
legérzékenyebbnek a citrullinált fehérjékkel szembeni antitesteket (ACPA, anticitrullinated protein antibody) (99%-os specificitás, 65,2% szenzitivitás) tekintjük. Az ACPA-nak számos target antigénje ismert: fibrin, vimentin, kollagén, α-enoláz és az EBNA-1 (Anzilotti és mtsai, 2009). De említhetnénk a kemokineket is, melyek kemotaktikus és szignalizációs képessége a citrullináció következtében lecsökken (Loos és mtsai, 2008). A mindennapi klinikai gyakorlatban tehát a citrullinált fehérjékkel szemben termelt antitestek rendkívül jól alkalmazható diagnosztikai markerek (Sebbag és mtsai, 2004). Összegezve tehát a citrullinált fehérjék jelenléte és az emelkedett PAD2 enzim expressziója jellemzi az RA-s szinoviumot/ízületet (DeRycke és mtsai, 2005). Mindezek ismeretében már visszatérhetünk a kiindulópontban említett hipotézishez, mely szerint az ACPA pozitív, shared epitópot hordozó RA-s egyénekben a dohányzás fontos kockázati tényező lehet. Az elképzelés szerint dohányzás hatására fokozódik a tüdőbeli fehérjék citrullinációja. Ezen poszttranszlációsan módosított fehérjékkel szembeni immunválasz az SE-t hordozó HLA DRB1 allélel rendelkező egyénekben nagyobb eséllyel alakulhat ki, hiszen citrullináció hatására a fehérjék nagyobb affinitással kötődnek az SE-t hordozó HLA DR β-láncához (Hill és mtsai, 2003; Kallberg és mtsai, 2007), végül pedig ACPA termeléséhez vezethet ez a folyamat. Lundberg munkájából azt is tudjuk, hogy a saját antigének citrullinációja még tovább fokozhatja azok immunogenitását és arthritogenitását (Lundberg és mtsai, 2005). Az RA-ra hajlamosító környezeti tényezők közül megemlítendők még a túlzott alkohol fogyasztás, a diéta, az orális fogamzásgátlók szedése, csecsemőkori anyatejes táplálás, és az illető szociálökonómiai státusza (Liao és mtsai, 2009).
11
1.3. Az RA pathomechanizmusának fő szabályozási és effektor mechanizmusai A betegség patomechanizmusában proinflammatorikus citokinek és kemokinek, különböző gyulladásos sejtek közötti kölcsönhatások, sejt eredetű mikrovezikulák, különböző
szénhidrátfelismerő
rendszerek
és
a
természetes
autoantitestek
kulcsfontosságú szerepet töltenek be. E mellett rendkívül fontos szerepet kapnak az effektor funkciójú proteázok és glikozidázok, illetve a különböző reaktív oxigén származékok is.
1.3.1. A citokinek, kemokinek és sejtkölcsönhatások RA-ban A betegség kialakulása során az eredetileg sejtszegény szinoviális membrán megvastagszik, és két jellegzetes sejttípusa, a szinoviális fibroblaszt (SF) és makrofág mellett különböző sejtek, mint hízósejtek, CD4+ T-sejtek, CD8+ T-sejtek, természetes ölő-(NK) sejtek, NKT-sejtek, B-sejtek, és plazma sejtek infiltrálják az ízület üregét. A gyulladt szinovium rákúszik a porcra, majd kondrociták, oszteoklasztok és fibroblasztok proteázai révén megkezdődik az ízületi porc károsítása. Ezen folyamat során új autoantigének szabadulnak fel az ízület szöveteiből, melyek további autoimmun folyamatokat generálhatnak. A szinoviumot e mellett hipoxiás körülmények, az angiogenezis fokozódása, a sejtek transzformált-tumoros fenotípusa, és kemokinek fokozott expressziója jellemzi, mely utóbbiak további gyulladásos sejteket vonzanak az ízület üregébe. A lokálisan termelődő citokinek az RA pathogenezisének minden fázisában részt vesznek autoimmun folyamatok generálása, a krónikus gyulladásos synovitis fenntartása, és az ízületi szövetek károsításának szabályozása révén (McInnes és mtsa, 2007). 1.3.1.1. T-limfociták szerepe RA-ban A T-sejteknek az RA pathogenezisében betöltött szerepét számos kísérletes és klinikai eredmény támasztja alá: mint például az MHCII allélekkel illetve a limfoid specifikus PTPN22-vel való asszociáció, a gyulladt szinoviumban mérhető emelkedett T-sejt szám, illetve az a tény, hogy számos arthritis állatmodellben igazolták, hogy a T-sejtek nélkülözhetetlenek az ízületi gyulladás kialakításában. A
12
tudomány mai állása szerint az RA T-helper 1 (Th1) sejt mediálta megbetegedés, bár egyre több eredmény igazolja az újonnan felfedezett Th17 populáció effektor funkcióinak jelentőségét is: - Mind az arthritises egérmodellekben, mind az emberi RA során fokozódó IL-17 termelés tapasztalható (Koenders és mtsai, 2008; Shahrara és mtsai, 2008). - A megemelkedett IL-17 szint súlyos ízületi károsodással korrelál (Kirkham és mtsai, 2006). - Az IL-17 deficiens egerekben nem alakul ki a kollagén-indukált arthritis (CIA, collagen-induced arthritis), míg az IL-17-ellenes antitestek, vagy a szolubilis IL-17 receptorok alkalmazása során kialakul a CIA. (Bush és mtsai, 2002; Lubberts és mtsai, 2004). - Az IL-6 és IL-23p18 KO egerekben nem alakul ki CIA. Az IL-17 gátlása vagy overexpressziója pedig az ízületi gyulladás és károsodás mértékének csökkenéséhez vagy fokozódásához vezet (Murphy és mtsai, 2003; Lubberts és mtsai, 2005). - Limfotoxin-α-t expresszáló Th1 és Th17 sejtek depléciója megakadályozza autoimmun folyamatok kialakulását, többek között a CIA-t is (Chiang és mtsai, 2009). A szinoviális T-sejtek tehát T-sejt receptoron (TCR, T-cell receptor) és kostimulációs útvonalon keresztül, illetve Toll-like receptoraikon (TLR) keresztül aktiválódhatnak. A szinoviális környezetben található szinoviális makrofág, fibroblaszt és dendritikus sejt eredetű citokinek, mint az IL-1, IL-6, IL-7, IL-12, IL15, IL-18, IL-23, TNF-α és tumor növekedési faktor-β (TGF-β, tumor growth factorβ) hatására Th1 vagy Th17 irányba differenciálódnak (Schulze-Koops és mtsa, 2001;
Lubberts és mtsai, 2005). Az aktivált T-sejtek interferon-γ (IFNγ), IL-17, IL-22, és osteopontin
citokineket
termelnek,
melyek
révén
további
leukocitákat
és
mesenchymális sejteket aktiválnak (Vermeire és mtsai, 1997; Ikeuchi és mtsai, 2005; Xu és mtsai, 2005). Emellett segítik a B-sejtek működését, CD8+ T-sejtek citotoxicitását fokozzák, makrofágokat, fibroblasztokat, és endotélsejteket direkt kontaktus révén aktiválnak, illetve prosztaglandinok és mátrix metalloproteinázok termelését stimulálják (McInnes és mtsa, 2007) (2. ábra). 13
2. ábra T-sejtek aktivációja és effektor funkciói RA-ban (McInnes és Schett, 2007) Bár TNF-α krónikus jelenléte esetén a T-sejtek TCR/CD3-on keresztüli aktivációja elmarad, anti-TNF-α antitestek adását követően helyreáll a T-limfociták aktivációs küszöbe, tehát azt feltételezhetjük, hogy in vivo és in vitro a TNF-α gátolja a T-sejtek működését (Cope, 2004; Cope és mtsai, 1994; Isomaki és mtsai, 2001). A természetes reguláló T-sejtek (TReg, CD4+CD25+, illetve a forkhead boksz P3, azaz FOXP3 transzkripciós faktor expressziója jellemzi) is megtalálhatók a betegség aktív stádiumában lévő betegek szinoviumában illetve szinoviális folyadékában, de úgy tűnik, hogy szabályozó funkciójuk nem működik tökéletesen (Leipe és mtsai, 2005). Anti-TNF
terápia
során
azonban
egy
olyan
populációjuk
(CD4+CD25+FOXP3+CD62L-) aktiválódik az RA-s betegekben, mely hatékonyan szupresszálja az effektor T-sejteket (Nadkarni és mtsai, 2007). 1.3.1.2. B-limfociták szerepe RA-ban A B-sejtek túlélését és aktivációját többnyire a TNF szupercsalád tagjai teszik lehetővé, mint a csíraközpontbeli dendritikus sejt expresszálta APRIL B-sejt túlélési 14
faktor (a proliferation-inducing ligand) (Seyler és mtsai, 2005), illetve a szinoviális szövet makrofágjai és fibroblasztjai által termelt B-sejt aktiváló faktor (BAFF, B-cell activating factor) (Ohata és mtsai, 2005). Ez utóbbi faktor termelése szinoviális fibroblasztokban
fokozódik
TNF-α
és
IFN-γ
hatására.
A
csíraközpontok
kialakításában fontos szerep jut a kemokinek, mint a CXC-kemokin ligand 13 (CXCL13) és a CCL21 (Takemura és mtsai, 2001; Manzo és mtsai, 2005) mellett a limfotoxin-β-nak (LTβ) (Weyand és mtsa, 2003) is. Az aktiválódott és differenciálódott B-sejtek autoantitestek (rheuma faktor (RF), ACPA) termelése és immunkomplexek képzése mellett számos citokin és kemokin termelése (IL-6, IL-10, LTβ) révén járulnak hozzá a pathogenezishez. Az említett citokinek révén szabályozzák a follikuláris dendritikus sejtek aktivációját, és a limfoid neogenezist, létrehoznak egy visszacsatoló hurkot a T-sejt-makrofág és T-sejt-B-sejt kontaktusok során, de antigénprezentáló sejtként is fontos szerepük van az ízületben. 1.3.1.3. A makrofágok funkciója RA-ban A legfrissebb irodalmi adatok alapján a szinoviális makrofágok száma az RA súlyosságának biomarkere, és egyes elképzelések szerint ez az érték jól használható lenne a DMARD (disease modifying antirheumatic drugs) terápia hatékonyságának megbecslésére (Hamilton és mtsa, 2009). A makrofágok rendkívül fontos szerepet kapnak a szinoviális proinflammatorikus citokinek termelésében. Aktivációjukat és ennek köszönhető citokin termelésüket mintázatfelismerő Toll-like receptoraikon (TLR2, TLR3, TLR4, TLR6) keresztül mikrobiális, illetve endogén ligandok indukálják (Brentano és mtsai, 2005). Emellett sejtfelszíni FcγR-hoz kötődő immunkomplexek, valamint neutrofil és hízósejt eredetű szerin proteázok, mint triptáz és tripszin által aktivált proteáz-aktivált receptor 2 (PAR2) hatására is aktiválódhatnak (Kelso és mtsai, 2007). Citokinjeik közül a TNF-α kiemelkedő jelentőségű az RA pathogenezisében (Feldmann és mtsai, 1996). Szinoviális biopsziákban kimutatható a TNF jelenléte, és míg gátlása számos arthritis modelben az arthritis súlyosságát csökkenti, addig TNF transzgén overexpressziója spontán erozív arthritis kialakulásához vezet (Keffer és mtsai, 1991). TNF-α hatására leukociták és endotélsejtek aktiválódnak, szinoviális fibroblasztok
aktiválódnak
és
segíti
túlélésüket,
illetve
fájdalom-receptor
szenzitizációt és angiogenezist indukál. A TNF-α gátlása óriási terápiás áttörést 15
eredményezett, hiszen a mai napig ez az egyik leghatékonyabb szer, mely csökkenteni képes az RA-s betegek klinikai tüneteit, mint a szinoviális gyulladás mértékét és a radiológiai progressziót (Quinn és mtsai, 2005). Kulcsfontosságú monocita eredetű effektor citokin az IL-6 is, mely T-sejtek proliferációját,
differenciációját,
plazmasejtek
antitest
termelését,
szinoviális
fibroblasztok aktivációját fokozza és elengedhetetlen a kollagén-indukált arthritis kialakulásához. Említendő továbbá az IL-2-vel strukturális hasonlóságot mutató IL-15 (McInnes és mtsai, 1996), mely IL15R-án keresztüli interakció révén, illetve más citokinekkel, mint TNF-α, IL-18, IL-12, IL-6 szinergisztikus pozitív visszacsatolása révén fontos szerepe van az arthritogén immunfolyamatok kialakulásában és a szinoviális gyulladás expanziójában (Gabay és mtsa, 2009). Az IL-1 citokin család számos tagja megtalálható az RA-s szinoviumban: az IL-1α, és az IL-1β (Dayer és mtsa, 2002), az IL-18 (McInnes és mtsai, 2005), illetve az új IL-1 citokinek közül az IL-33 (vagy IL-1F11) (Palmer és mtsai, 2009). Közülük az IL-1β a központi citokin a porc degradációs folyamataiban a mátrix szintézisének gátlásával és mátrix metalloproteinázok (MMP1, 3, 8, 13, 14) expressziójának indukciójával. Ezt bizonyítja az IL-1RA deficiens egér, melyben gyors és kiterjedt porc degradáció alakul ki (van der Berg, 2002), illetve, hogy az IL-1β intra-artikuláris oltása a porc proteoglikán tartalmának csökkenéséhez, kondrociták apoptózisához végül mátrix degradációhoz vezet (Pettipher és mtsai, 1986). A TNF-α és az IL-18 a porc degradációt IL-1β közvetítésével stimulálja (Joosten és mtsai, 2004). Az IL-17 direkt és szinergisztikus módon, az IL-1β és TNF-α segítségével indukálja a porc katabolizmust (Dudler és mtsai, 2000; Lubberts és mtsai, 2002). A TNF-α gátlásához hasonlóan, az IL-1 útvonal terápiás célzása is kiemelkedő szerepet kap a mindennapi klinikai gyakorlat során az RA-s betegek tüneteinek csökkentésében (Furst és mtsai, 2005). A szinoviális makrofágokban kimutatták továbbá az IL-18 által indukálható IL-32 konstitutív és indukálható expresszióját is, mely in vivo ízületi gyulladást indukál TNF-dependens módon, míg a mátrix degradációt TNF független módon stimulálja
16
(Joosten és mtsai, 2006). TLR agonistákkal együtt kiváló monocita/makrofág aktiváló citokin (Netea és mtsai, 2006). Végül még két makrofág eredetű citokint kell megemlíteni: a gyulladás és ízületi károsítás közötti kapcsolatot megteremtő HMGB1 (high-mobility group box 1 protein) molekulát (Kokkola és mtsai, 2002), és a makrofágok citokin és prosztaglandin termelését kiváltó makrofág migrációt gátló faktort (MIF) (Morand és mtsai, 2006). 1.3.1.4. Neutrofil granulociták RA-ban A gyulladás akut fázisa során a szinoviális folyadékban nagy mennyiségben található a szinoviális membránon keresztül ide vándorolt neutrofil granulocita. Az immunkomplex és komplement komponensek vagy citokinek aktiválta neutrofilek TNF, IL-1, IL-18, IL-15, IL-6 és BAFF termelése révén számos pathológiás esemény előidézői. Kemokinek, prosztaglandinok, reaktív oxigén származékok, és reaktív nitrogén intermedierek felszabadítása által pedig a lokális hipoxia kialakulásában van szerepük (McInnes és mtsa, 2007). 1.3.1.5. Hízósejtek szerepe RA-ban Az RA-s szinoviális szövetekben kimutatható a hízósejtek jelenléte, melyek proteázaik (triptáz, kimáz), gyulladásos citokinek (TNF-α), hisztamin, prosztaglandin D2, és leukotriének révén makrofágokat aktiválnak, MMP-k termelését stimulálják, és porcsejtek katabolikus folyamatait serkentik (Nigrovic és mtsa, 2005). A betegség kialakulásában játszott szerepüket támasztja alá az a munka is, melyben a hízósejt deficiens egerek rezisztensnek bizonyultak a szérum transzfer okozta ízületi gyulladás kialakulásával szemben (Lee és mtsai, 2002).
1.3.1.6. Szinoviális fibroblasztok, kondrociták, porc degradáció A krónikus synovitis létrejöttében a szinoviális fibroblasztoknak kulcsfontosságú szerepe van (Huber és mtsai, 2006). A hyperplasia kialakulása során a fibroblasztok felszabadulnak a kontaktgátlás alól, nagymértékű proliferációba kezdenek, és a tumoros sejtekhez hasonlóan rezisztenssé válnak az apoptózissal szemben (Meyer és
17
mtsai, 2006; Meinecke és mtsai, 2009). Aktivációjukhoz bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bFGF, basic fibroblast growth factor), vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF, platelet-derived growth factor), TGFβ, illetve RAS és MYC onkogének expressziója, valamint túlélésükhöz szükséges fehérjék, mint a hősokk fehérje 70 (HSP70), szentrin és szumoilált fehérjék (Müller-Ladner és mtsai, 2007), továbbá TNF-α és IL-1β citokinek szükségesek. Az íly módon aktivált fibroblasztok TNF-α, IL-1β és IL-6 citokinek termelése révén egy pozitív visszacsatolási kört hoznak létre, mely mátrix-bontó enzimek, mint MMP-k, aggrekanázok, katepszinek és azok inhibitorainak termelését indukálja (Warstat és mtsai, 2008) (4. ábra). Ez az enzimatikus környezet teszi lehetővé a sejtek helyi migrációját, és lehetőséget teremt az ízületi porc inváziójára. Az SF eredetű citokinek és kemokinek (TNF, IL-7, IL-15, IL-16 és BAFF) a T- és B-sejtek migrációját, aktivációját és túlélését segítik. Válaszképp a B-sejtek aktiválják a fibroblasztokat az IgG molekulák nagy affinitású FcγR-hoz kötődése révén (Pap, 2005). Az SF termelte vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF, vascular endothelial growth factor), bFGF, oncostatin M, és IL-18 pedig angiogenezist indukál.
18
3. ábra: Szinoviális fibroblasztok és kondrociták az RA-s porc degradációban (McInnes és Schett, 2007) A porc degradációban szintén szerepet játszó kondrociták mátrix-bontó folyamatokba kezdenek ADAMTS (trombospondin motívummal rendelkező diszintegrinek és metalloproteinázok) és MMP enzimek segítségével, melyek a porc proteoglikánjait és a kollagén rostokat hasítják. A kondrociták önmagukban is képesek citokinek termelésére, de a környezetbeli IL1-β, IL-17, IL-18 és TNF is fontosak ezen katabolikus állapot felgyorsításában (Olee és mtsai, 1999; McInnes és mtsa, 2007) (3. ábra)
19
1.3.2. A membrán mikrovezikulák szerepe RA-ban A membrán mikrovezikulák (MV) apoptózis vagy sejtaktiváció során keletkező, illetőleg konstitutív módon a sejtekből lefűződő membránnal határolt képletek. Képződésük és átmérőjük alapján lehetséges osztályozásuk (Pap és mtsai, 2009) (4. ábra):
ektoszómák
ektocitózis endoszómák MVB
exocitózis
apoptózis apoptotikus testek
exoszómák
4. ábra: Különböző mikrovezikula populációk képződése (Pap és mtsai, 2009) - az apoptotikus testek 1-5 μM nagyságúak, apoptotikus folyamatok során keletkeznek - a közepes, 100-1000 nm átmérőjű vezikulák a mikropartikulumok vagy más néven ektoszómák. Sejtaktiváció vagy apoptotikus folyamatok során a sejtmembrán lefűződésével, azaz ektocitózissal keletkeznek. - a legkisebb populációt a 100 nm alatti átmérővel rendelkező exoszómák alkotják. Endocitózis során keletkeznek, majd a multivezikuláris testekben (MVB) tárolódnak a sejteken belül. Megfelelő stimulusra az MVB plazmamembránnal történő összeolvadása vezet a felszabadulásukhoz.
20
A legfrisebb irodalmi adatok szerint azonban további populációk különböztethetők meg. A legkisebb vezikula kategórián belül a csésze alakú és 50-100nm átmérőjű exoszómák mellett megkülönböztetik az 50-80nm átmérőjű kerek membrán partikulumokat, valamint a 20-50 nm átmérőjű szabálytalan alakú exoszóma-szerű vezikulákat. A közepes méret tartományban a 100-1000 nm-es szabálytalan, elektrondenz vezikulákat nevezik mikrovezikuláknak, melyektől elkülönítik a bilamelláris, kerek ektoszómákat 50-200 nm átmérőjükkel. Apoptotikus vezikulaként pedig az 50-500 nm átmérővel rendelkező heterogén populációt tartják számon (Théry és mtsai, 2009). A legfrisebb irodalmi adatok szerint a sejtek közötti információáramlás legújabban felfedezett közvetítői az MV-k. Amellett, hogy biológiailag aktív vegyületek (exoszómális shuttle RNS: mRNS + μRNS, proteázok, autoantigének) koncentrált forrását képezik (Valadi és mtsai, 2007; Giusti és mtsai, 2008; Schiller és mtsai, 2008), különböző immunológiai folyamatok (gyulladás, véralvadás, antigén prezentáció, apoptózis) szabályozásában van szerepük (Distler és mtsai, 2005, 2006, Obregon és mtsai, 2006). Továbbá számos immunológiai megbetegedés (gyulladásos és autoimmun betegségek, AIDS, tumor) (Guiducci és mtsai, 2008; Krishnamoorthy és mtsai, 2009; Iero és mtsai, 2008) pathológiai folyamataiért is felelőssek. Napjainkban egyre több irodalmi adat hangsúlyozza az MV-k szerepét az RA pathogenezisében, melynek során különböző gyulladásos sejtek aktivációjában, gyulladásos folyamatokban és a porcdegradációban van kitüntetett szerepük. Emellett az RA prognosztikai markere is lehetne a betegek szérumában megfigyelhető emelkedett vérlemezke-eredetű MV szint (Knijff és mtsai, 2002). Az RA-s szinoviális folyadékot (SFl) tekintve azonban a granulocita és monocita-eredetű MV-k száma, emelkedett a T-sejt, B-sejt, vérlemezke és vörösvértest eredetű MV-k mellett (Berckmans és mtsai, 2002; Knedla és mtsai 2007). Számos tanulmány vizsgálja az MV-k szerepét az RA pathogenezisében. Berckman és munkatársai például leukocita eredetű MV-ket vizsgáltak az SFl mintákban, melyek a VII véralvadási faktor közreműködésével lokális hyperkoagulációt és fibrin lerakódást idéztek elő (Berckmans és mtsai, 2002). Más munkacsoportok a szinoviális fibroblasztokra gyakorolt hatásukat vizsgálták, és azt tapasztalták, hogy az MV-k a fenti sejtek esetén citokinek és kemokinek (MCP-1, IL-6, IL-8, ICAM-1, VEGF és RANTES) termelését indukálják (Berckmans és mtsai, 2005). In vitro vizsgálatokból
21
az is kiderült, hogy a fibroblasztok porcdegradáló metalloproteinázainak (MMP-1, MMP-3, MMP-9, MMP-13) szintézise T-sejt eredetű MV-k hatására fokozódik (Distler és mtsai, 2005), továbbá prosztaglandin E2 expresszióját is stimulálják ciklooxigenáz 2 és mikroszómális prosztaglandin E szintáz 1 indukcióján keresztül (Jüngel és mtsai, 2007). Az indolamin 2,3-dioxigenáz (IDO) triptofán degradáló enzimet expresszáló dendritikus sejtek és a dendritikus sejt-eredetű exoszómák immunszupresszív és gyulladás gátló hatásúak, mely tulajdonságuk révén a már kialakult arthritist enyhítik (Bianco és mtsai, 2009). A plazma és SFl eredetű MV-k membrán molekulák vizsgálata segíthet annak megértésében, hogy miképp járulnak hozzá az MV-k az RA pathogeneziséhez. Sikerült kimutatni különböző komplement komponenesek és aktivátor molekulák jelenlétét az MV-k membránján, így feltételezhetjük, hogy a klasszikus komplement aktivációja révén járulnak hozzá az RA pathogeneziséhez (Biró és mtsai, 2007). Meglepő módon az SF eredetű exoszómák felszínén membránkötött TNF-α. található, mely a CD4+ T-sejtek aktiváció-indukálta sejthalálához vezetett in vitro (Zhang és mtsai, 2006). Arra vonatkozólag, hogy az exoszómák belsejében található fehérjék szerepet játszanak-e az RA pathogenezisében, csak néhány adat áll rendelkezésre az irodalomban. Skriner és munkatársai citrullinált fehérjéket találtak a szinoviális exoszómákban (Skriner és mtsai, 2006). Az eredetileg sejtmagi fehérjeként ismert DEK autoantigén jelenlétét is kimutatták juvenilis idiopátiás arthritises betegek gyulladásos sejt eredetű és SFl-beli exoszómáiban. Valószínűsíthető azonban, hogy kemoattraktáns funkciójuk révén járulnak hozzá a gyulladásos folyamatokhoz (MorVaknin és mtsai, 2006).
1.3.3. Szénhidrátfelismerő rendszerek Mind az emlős sejtek, mind a mikróbák komplex szénhidrát struktúrák meghatározott profiljával rendelkeznek. A sejtfelszínen található szénhidrátok szenzorokként illetve biokémiai szignálokként is működnek (Gabius és mtsai, 2002). Ennek függvényében azt gondolhatjuk, hogy a szervezetünk olyan felismerő rendszerrel rendelkezik, mely a saját és a patogén szénhidrát-profilok érzékelésére szolgál (Buzás és mtsai, 2006). A szénhidrátok szerkezeti diverzitását nézve, azok komplexitása messze meghaladja a 22
fehérjék és nukleinsavak szerveződésének bonyolultságát. Az antitestekkel reagáló oligoszaharidok becsült mérete a di- és hexaszaharid között változhat. Ha csak a hexamerek szerkezetek variációs lehetőségeit tekintjük, 4096 hexanukleotid, 64 millió hexapeptid, és 1.44 x 1015 hexaszacharid képződésére nyílik lehetőség (Laine, 1997). A glikoproteinek képzésénél a szénhidrát struktúrák 41 különböző módon kapcsolódhatnak a fehérjékhez (Spiro, 2002). A szénhidrátfelismerő rendszerek számára a következő szénhidrátok szolgálhatnak ligandként az emlős sejtfelszínen: terminális sziálsav, galaktóz, fukóz, mannóz, Nacetil-galaktózamin (GalNAc) és N-acetil-glükózamin (GlcNAc). Ezek közül a terminális GlcNAc felismerése szoros összefüggést mutat az autoimmunitással, hiszen számos autoimmun megbetegedés, mint például az RA során is találtak GlcNAc felismerésére képes autoantitesteket (Sharif és mtsai, 1990). A DC-SIGN a dendritikus sejtek szénhidrát felismerő molekulája, mely a T-sejtekhez kötőve (erősen glikozilált intercelluláris adhéziós molekula-2 (ICAM-2) és ICAM-3 molekuláin keresztül) a leukociták homingját és migrációját segíti (Geijtenbeek és mtsai, 2000). Ez az interakció nagy valószínűséggel fontos szerepet kap az RA pathogenezisében, mivel az érintett ízületekben mind a DC-SIGN expressziója, mind az ICAM-3 pozitív T-sejtek száma megemelkedett (van Lent és mtsai, 2003). A dectin-1 konzervált, C-típusú lektin doménnel nem rendelkező szénhidrátkötő molekula. Az általa megkötött β-glükánok T-sejt-mediálta autoimmun arthritist indukálnak az SKG egerekben (az SKG egerekben a 70 kDa-os zeta asszociált ZAP70 fehérje pontmutációja miatt spontán polyarthritis alakul ki konvencionális körülmények között), ahol a saját ízületi antigének dectin-1-függő módon prezentálódnak az arthritogén T-sejtek számára (Yoshitomi és mtsai, 2005). A Toll-like receptorok közül a TLR2 és TLR4 képes szénhidrát epitópok felismerésére, melyek a különböző mikróbiális struktúrák mellett gazdaszervezeteredetű hialuronsav degradációs termékek (Termeer és mtsai, 2002), továbbá a TLR4 esetében a heparán-szulfát lehetnek (Johnson és mtsai, 2002). Az RA-s betegek perifériás vér mononukleáris sejtjei felszínén a TLR2 és TLR4 expressziója megemelkedett (más spondylarthropátiákkal szemben). Másrészről azonban, a spondylarthropátiás betegek szinoviumában mindkét TLR expressziója magasabb,
23
mint az RA-s vagy OA-s betegek esetében, de anti-TNF terápia hatására drámaian lecsökken az expressziójuk (De Rycke és mtsai, 2005). A Streptococcus sejtfal indukálta arthrits kialakulása nagy valószínűséggel TLR2-függő folyamat, mivel a TLR2 deficiens egerekben nem alakul ki az arthritis (Joosten és mtsai, 2003). Az IL12 és IL-18 IFN-γ-n keresztül szabályozza az RA-s szinoviumon belüli TLR2 és TLR4 expresszióját (Radstake és mtsai, 2004). Az RA-s SF-ek TLR2, TLR3 és TLR4-en keresztüli aktivációja MMP-k, gyulladásos citokinek és kemokinek expresszióját fokozza a sejtekben (Kyburz és mtsai, 2003; Pierer és mtsai, 2004; Brentano és mtsai, 2009). Végül fontos megemlíteni a TLR4 legújabban felfedezett endogén glikoprotein ligandját, a tenascin-C-t, mely nélkülözhetetlen az arthritises ízület gyulladásának fenntartásában (Midwood és mtsai, 2009). A saját struktúrák felismerésére szolgáló szelektinek a limfociták érését és vándorlását segítik. RA során, IL-6 hatására fokozódik az E- és P-szelektin expressziója a szinoviális fibroblasztokban, mely jelenség a neutrofil granulociták érpályából történő kilépését segíti (Lally és mtsai, 2005). Az E- és P-szelektin ellenes blokkoló antitestek hatékonyan csökkentették a neutrofilek endotéliumhoz történő adhézióját. Az RA során alkalmazott dexamethasone kezelés hatékonysága valószínűleg az endotél sejtek E-szelektin expresszió csökkentő hatásának köszönhető (Lally és mtsai, 2005). Az E- és P-szelektin knockout (KO) egerekben rendkívül súlyos arthritis alakul ki, ezt magyarázhatja a kettős KO egerek bazális IL-1β szintjének emelkedése, vagy a P-szelektin KO egerek Th2 citokinjeinek (IL-10, IL-5) emelkedett szintje valamint az IL-2 és IL-4 szintjének csökkenése (Ruth és mtsai, 2005). RA-ban a szolubilis E-szelektin szintje a betegség súlyosságával korrelál (Egerer és mtsai, 2003). A
mannóz-kötő
lektinnek
(MBL,
mannan-binding
lectin)
fontos
szerepet
tulajdonítanak a saját struktúrák, mint például az immunkomplexek eltakarításában. Az MBL a dimer és polimer IgA, az agalaktozil IgG és bizonyos IgM immunglobulinok
megkötésére
képes.
Az
utóbbi
fontos
az
RA
pathomechanizmusában, ugyanis az RF IgM molekulák az IgG Fc részéhez kötődnek, és nagy immunkomplexeket képezhetnek. Az MBL tehát rendkívüli szerepet kap az RA során képződött RF és immunkomplex aggregátumok eltávolításában (Goldstone és mtsai, 1991). Az MBL deficienciája az RA-s betegek RF pozitivitásával, rossz
24
prognózissal, fokozódó ízületi erózióval, a betegség korai kialakulásával, fokozódó gyulladással, és a terápiára adott kevésbé hatékony válasszal jár együtt. Az MBL-nek a megváltozott glikozilációs mintázattal kapcsolatban is szerepe lehet az RA kialakulásában. RA során ugyanis megemelkedik az agalaktozil IgG szintje (Sturm és mtsai, 2004; Stillman és mtsai, 2004), mely GlcNAc-t, az MBL ligandját prezentálja, így MBL-en keresztül komplement aktivációhoz, majd lokális gyulladáshoz vezet. Ezzel összhangban az MBL-2 gén variánsa RA-val asszociál (Siebert és mtsai, 2006; Jacobsen és mtsai, 2009).
1.3.4. Természetes és patológiás autoantitestek RA-ban RA-ra számos autoantigénnel szembeni autoantitest termelődése jellemző (Blass és mtsai, 2001; Robinson és mtsai, 2002). A számos autoantitest közül a legismertebbek közé tartoznak a már fentebb említett RF, az ACPA és a kollagén ellenes antitestek (van Gaalen és mtsai, 2004; Visser és mtsai, 2002; Verpoort és mtsai, 2006). Manapság rendkívül nagy figyelem fordul ezekre az ellenanyagokra, hiszen az RA-s betegek 50%-ában már a klinikai fázist megelőzően emelkedett bizonyos autoantitestek szintje (van Gaalen és mtsai, 2004; Visser és mtsai, 2002; Verpoort és mtsai, 2006). Régóta ismert az RF emelkedett szintje RA során, de számos virális és bakteriális fertőzésre adott fiziológiás válasz során, illetve bizonyos gyulladásos körülmények között is termelődhet RF a képződött immunkomplexek eltávolítása érdekében (Dorner és mtsai, 2004). Az RA során termelődött specifikus RF hozzájárul az ízületi gyulladás kialakulásához, továbbá a B-sejtek autoantigén felvételét és prezentálását is segíti (Dorner és mtsai, 2004). Az RF és az ACPA is fontos prognosztikus faktorok RA-ban. A szérumbeli IgM, IgG és IgA molekulák túlnyomóan a B1 B-sejtekből származó természetes autoantitestek (NAbs, natural autoantibodies). A fertőző ágensekkel szemben az első védelmi vonalat képezik ezek a polireaktív és alacsony affinitású immunoglobulinok. Cohen és munkatársai az NAb-k rendszerét ’immunológiai homunculusként’ említi (Cohen, 2007), mely rendszer változása az adott megbetegedés korai markereként vagy prediktoraként használható (Quintana és mtsai,
25
2004). Az NAb-k emellett szénhidrátok felismerésére is képesek, és autoantigéneket prezentálnak. Szénhidrát ellenes antitestek jelentőségére kiváló példa az aggrekán-indukált arthritis egérmodell, ahol az aggrekán molekula kondroitin-szulfát oldalláncainak csonkjai erős B-sejt választ indukálnak. A szénhidrát-specifikus B-sejtek a továbbiakban proteoglikánok prezentálása révén járulnak hozzá az arthritis kialakulásához (Glant és mtsai, 1998). A porc kis proteoglikánjai, mint a dekorin és biglikán ellen termelt szinoviális antitestek szintje is megemelkedett RA és szeronegatív spondylarthritis során. Ráadásul a szérum és szinoviális folyadék aggrekán és biglikán-ellenes antitestjei között erős korreláció mutatható ki (Polgár és mtsai, 2003), feltételezhetően azért, mert a két különböző proteoglikán molekula azonos glükózaminoglikán (GAG) láncokat tartalmaz.
1.3.5. A glikoziláció immunregulációs szerepe Az utóbbi időben egyre nagyobb figyelmet irányul a poszt-transzlációs fehérje módosítások alapvető, és különböző betegségekkel kapcsolatos jelentőségére. A rheumatológiában ezt a citrullináció fontosságának felismerése példázza a legjobban (Ménard, 2007; Avouac és mtsai, 2006; György és mtsai, 2006). Habár a szénhidrátok végleges struktúrájának kialakítását végző glikozil-transzferázok és glikozidázok által végzett glikoziláció a leggyakoribb poszt-transzlációs módosítások egyike (az emberi fehérjék 50-70%-a glikozilálódik), szerepét még igen kevéssé ismerjük. Azt már sikerült megfigyelni, hogy a saját molekulák glikoziláltságának megváltozása dendritikus sejtek érésén, és az általuk közvetített hatékony immunválasz révén autoimmun folyamatok kialakulásához vezethet (’t Hart és mtsai, 2004). Ráadásul a glikozidázok aktivitása következtében az IgG molekulák arthritogenitása megszűnik (Nandakumar és mtsai, 2007). A glikoziláció jelentőségét hangsúlyozza a proteoglikán-indukált arthritis (PGIA, proteoglycan-induced arthritis) egérmodell is, mivel a humán aggrekán csak akkor idéz elő a BALB/c egérben krónikus, progresszív poliarthritist, ha glikozidázok segítségével részlegesen leemésztjük a GAG oldalláncokat. Az így kialakított arthritis tünetei az emberi RA-hoz hasonlóak, és átvihető naiv szingénikus egerekbe (Glant és mtsai, 1987). A GAG oldalláncok
26
kitüntetett szerepet kapnak, hiszen a keratán-szulfát láncok elfednek bizonyos T-sejt epitópokat, a kondroitin-szulfát láncok csonkjai pedig a B-sejt választ indukálják, majd a B-sejtek mint antigén-prezentáló sejtek járulnak hozzá az aggrekán-indukált egér arthrtitis kialakulásához (Glant és mtsai, 1998). Az említett epitópok az aggrekán molekula core proteinjének központi, legerősebben glikozilált doménjeiben találhatók. A core protein G3 globuláris doménjének C-terminálisán található P 135 epitóp (peptid 135, rövidítve: P135, TTYKRRLQKRSSRHP) szekvenciája rendkívül hasonlít a shared epitóp szekvenciájára (Buzás és mtsai, 2005). SCID egerekben a fenti szekvenciára specifikus T-sejtek arthritist indukálnak (Hanyecz és mtsai, 2003). Ezen felül, humanizált HLA DR4 transzgén egerekben erős T-sejt választ indukál a P135 peptid (Szántó és mtsai, 2004), de ezen shared epitópot hordozó aggrekán peptiddel szembeni T-sejt választ RA-ban a disszertációban bemutatott munkánkon kívül korábban nem vizsgálták.
27
1.4. A porc szerkezete és a porcdegradációért felelős enzimek RA-ban:
1.4.1. A porc szerkezete Az ízületi felszínt borító hialin porcnak csak kis hányadát alkotják maguk a porcsejtek, nagyobbik részét a sejtek által termelt extracelluláris mátrix (ECM) képezi. A hialin porc érdekessége még az idegek és vérerek hiánya is. Az ECM rendezett struktúráját két molekula szerveződése hozza létre: a kollagén rostok (II, VI, IX és XI kollagén) sűrű hálózata biztosítja a mátrix alapvázát, míg a nagymennyiségben jelen lévő proteoglikánok (aggrekán) vízmegkötő képességük révén a rugalmasságért felelnek. Ezen molekulák aránya eltér a felszíni tangenciális, a közép, a mély és az elmeszesedett zónában, melyeket az ízfelszíntől a subchondralis csont felé haladva különböztethetünk meg. A fent említett kollagének közűl a II-es típusú kollagén alkotja a hialin porc ECM rostjainak fő tömegét, illetve a porc száraz tömegének 60%-át (Eyre, 2002). Tripla helikális struktúráját tovább bonyolítják a szintézist követő módosítások: mint a prolin és lizin aminosavak hidroxilációja, a hidroxilizin csoportok glikozilációja, a láncok közötti diszulfid hidak létrejötte, és a rostok magasabbrendű szerveződései segítik a funkcionális szerkezet kialakítását (Elsaid és Chichester, 2006). A IX-es és XI-es típusú kollagénnel heterofibrillumokat képez. Ezek közül a XI-es kollagén a rostátmérőt szabályozza, míg a IX-es kollagén a proteoglikánokkal való kölcsönhatásért felelős. A VI-os típusú kollagén mikrofibrillumokat képez a porc ECM-ben. A hialin porc mátrixának felépítésében a kollagén rostok mellett a proteoglikán aggrekán is részt vesz. Egy aggrekán monomer a központi fehérje láncból (core protein), az ehhez kapcsolódó kondroitin-szulfát (~100), és keratán-szulfát (~30) oldalláncokból, illetve N és O-kötésű oligoszaharidokból (~60) áll. A központi fehérjelánc N-terminális végén a G1 és G2 globuláris domén, míg C-terminális végén a G3 globuláris domén található. A globuláris régiók közötti szakaszhoz kapcsolódnak a GAG oldalláncok (Buzás és mtsai, 1996). Nevéből már sejthetjük jellegzetes tulajdonságát: link protein segítségével hialuronsavhoz kapcsolódnak a monomerek, így végül makromolekuláris aggregátumok jönnek létre (5. ábra).
28
Negatívan töltött szénhidrátláncai révén nagy mennyiségű vízet köt meg, mellyel a porc rugalmasságát biztosítja.
hialuronsav
aggrekán monomer
kollagén
link protein
5. ábra: Hialin porc alapállomány felépítése (Hardingham nyomán, Glycoforum, 1998,) A porc ezen fő alkotóelemei hozzák létre az extracelluláris mátrix alapvázát, mellettük azonban megemlíthetünk más kisebb molekulákat is, melyek a mátrix összerendeződésének szabályozásáért felelősek. A mátrilineket VWA- (von Willebrand faktor A) és epidermális növekedési faktorszerű doménjük, valamint coiled-coil régióik alapján az oligomer mátrix fehérjék családjába sorolják. Közülük a mátrilin-1 molekulát porc mátrix fehérjeként emlegetik, de a mátrilin-3 is nagy mennyiségben megtalálható a porcban, míg a mátrilin-2 és 4 más szövetekben is előfordulnak (Wagener és mtsai, 2005). Mind a
29
négy mátrilin homo-oligomereket képez coiled coil régióik segítségével. A mátrilin1-ről kimutatták, hogy mind a fibrilláris kollagénnel (Winterbottom és mtsai, 1992), mind az aggrekánnal (Hauser és mtsai, 1996) képes kapcsolódni. A kollagén hálózatok funkcionális sajátosságainak kialakításáért a leucinban gazdag ismétlődéseket hordozó fehérjecsalád (SLRPs, small leucine rich proteins) 12 extracelluláris tagja felel (Iozzo, 1997). Ezen molekulacsalád tagja a kis proteoglikán dekorin is, mely kapcsolódni képes a fibrilláris kollagénhez in vitro (Hedbom és Hinegard, 1993), de a kollagén fibrillumok képzésében is szerepet játszik (Rada és mtsai, 1993), továbbá a VI-os kollagénhez is kapcsolódhat (Bidanset és mtsai, 1992). Ugyanezen a helyen kapcsolódik a VI-os típusú kollagénhez egy másik leucinban gazdag ismétlődéseket hordozó proteoglikán, a biglikán is, mely a VI-os kollagén hexagonális struktúrájának képződését katalizálja in vitro. Míg az előbbi kis proteoglikán dekorin csak egy, addíg a biglikán két GAG oldallánccal (dermatánszulfát) rendelkezik (Wiberg és mtsai, 2003). Az SLRP fehérjecsalád tagjai közül a fibromodulin és lumikán is megtalálhatók a porc alapállományban, melyek a kollagén rost azonos régiójához kapcsolódva a rostok közötti interakciót és azok átmérőjét szabályozzák. Az SLRP-k GAG láncai növekedési faktorok megkötésére képesek, elősegítve azok ECM-beli akkumulációját,
melyek így a sejtek számára
hozzáférhetővé válnak (Martel-Pelletier és mtsai, 2008). A hialin porc proteoglikánjai közül megemlítendő továbbá a verzikán illetve a perlekán is, melyek közül a perlekán a porcsejtek metabolizmusát fibroblaszt növekedési faktorhoz és receptorához való kapcsolódása révén befolyásolja. 1.4.2. Metalloproteinázok Az RA során bekövetkező porc ECM degradációért a mátrix metalloproteinázok és a trombospondin motívummal rendelkező diszintegrin és metalloproteináz (A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin motifs, ADAMTS) család tagjai felelősek. Az ECM két fő komponensét, a proteoglikán aggrekánt, és a II típusú kollagént hasítják (Clark és mtsa, 2003). Az ADAMTS enzimcsalád tagjai (ADAMTS1, 4, 5, 8, 9, és 15) az aggrekán molekulát a Glu 373/Ala 374 (aggrekanáz hely), és más egyéb pozíciókban képesek hasítani, közűlük azonban az ADAMTS4 és ADAMTS5 (aggrekanáz-1 és
30
aggrekanáz-2) aktivitása a legjelentősebb. Az ADAMTS4 az aggrekán mellett más mátrix molekulák, mint például a brevikán (Nakamura és mtsai, 2000), a porc oligomer mátrix fehérje (COMP, cartilage oligomeric matrix protein), a fibromodulin, és a dekorin hasítására is képes (Kashiwagi és mtsai, 2004). Az aggrekán molekula hasítása súlyos következményekkel jár, hiszen intakt formájában a kollagén rostokat védi a kollagenázok hasításával szemben (Pratta és mtsai, 2003). Az egér arthritismodellek vizsgálata során szerzett tapasztalatok alapján elmondható, hogy az ADAMTS5 felelős elsődlegesen az arthritis során tapasztalt emelkedett aggrekanáz aktivitásért (Glasson és mtsai, 2005; Stanton és mtsai, 2005). A legfrisebb irodalom adat az ADAMTS-7 és ADAMTS-12 emelkedett expressziójáról számol be az RA-s szinoviumban, melyek a COMP degradációjáért felelősek arthritis során (Liu, 2009). Az MMP-k a kollagén, aggrekán, fibronektin és laminin mátrixkomponensek hasítására képesek. Az enzimcsaládnak 25 tagja ismert, melyeket négy csoportba oszthatunk: 1. kollagenázok (MMP-1, -8, -13); 2. zselatinázok (MMP-2, -9); 3. sztromelizinek (MMP-3, -10, -11); 4. heterogén alcsoport, ide tartozik a mátrilizin (MMP-7), az enamelizin (MMP-20), a makrofág metalloelasztáz (MMP12), és az MMP-19, valamint a membrán típusú MMP-k (MMP-14, -17, -24, -25) (MartelPelletier és mtsai, 2001). Szabályozásuk rendkívül komplex. Génexpressziós szinten különböző citokinek és növekedési faktorok indukálhatják kifejeződésüket. A transzkripciós kontroll folyamatokon sikeresen átjutott molekulák pro-enzim formájában szintetizálódnak, melyek aktiválásához más proteázok szükségesek. A már aktív enzimeket más aktív metalloproteázok hasíthatják, illetve szöveti inhibítorok
(TIMPs,
tissue
inhibitors
of
metalloproteinases)
szabályozzák
működésüket (Rengel és mtsai, 2007). Az RA-s porcdegradációban betöltött szerepüket számos eredmény igazolja. Az RA-s SFl-ben az MMP-1, MMP-3, MMP-8 és MMP-9 emelkedett szintje mutatható ki (Tchetverikov és mtsai, 2004). A szinoviális szövetben emellett magas konstitutív expresszió jellemzi az MMP-2, MMP-11 és MMP-19 enzimeket (Konttinen és mtsai, 1999). Az RA-s szinoviumban az MMP-3 különösen magas expressziója, az RA-s szérumban pedig magas MMP/TIMP arány figyelhető meg (Ainola és mtsai, 2005). Az RA-s SF-ek emelkedett MMP-1, MMP-3, MMP-13, MMP-14 és MMP-15 expressziójuk révén járulnak hozzá az ízület károsodásához (Fiedorczyk és mtsai, 2006), melyet gyulladásos citokinek (IL-1β és TNF-α) stimulálnak, illetve mely a fibroblasztok
31
transzformált fenotípusának is köszönhető. RA-s betegek szérum MMP-1 és MMP-3 szintje ráadásul a betegség aktivitásával is korrelál (Müller-Ladner és mtsa, 2002). Felmerült az MMP-3 aktivitás mérésének lehetősége korai RA-ban a várható porc és csont degradáció mértékének megbecslésére (Green és mtsai, 2003). Leflunomid, methotrexát és TNF-α ellenes antitestek alkalmazása hatékonyan csökkentette a szérum MMP szintet (Rengel és mtsai, 2007). Az MMP-k tehát az ízületi károsodás biomarkerei. A cisztein proteináz katepszinek közül a katepszin B és K enzimek szintén szerepet játszanak az RA-s porc és csont degradációban (Trabandt és mtsai, 1991; Hou és mtsai, 2001).
1.4.3. Exo- és endoglikozidázok, glikozidáz-szerű molekulák A szénhidrátok végleges szerkezetének kialakítását a glikozil-transzferázok és glikozidázok végzik, melyek közül a glikozidázok az RA-ra jellemző porc degradációért is felelősek. Ezt igazoltuk munkacsoportunk korábbi munkája során, hiszen az RA-s SFl-ben megemelkedett exoglikozidáz aktivitást mértünk, és ezen enzimek önmagukban, vagy az MMP-kel kombinálva hatékonyan emésztették a hialin porc GAG tartalmát (Ortutay és mtsai, 2003).
1.4.3.1. Exoglikozidázok A β-hexózaminidázok a terminális hexózaminok, mint például a GlcNAc és a GalNAc hidrolízisét katalizálja. Megismerésükhöz nagyban hozzájárult a Tay-Sachs és Sandhoff lizoszómális megbetegedések pathogenezisével való kapcsolata. A lizoszómális hexózaminidázok a HEXA és HEXB gének által kódolt α és β alegységekből felépülő homo és heterodimerek (HexA: αβ; HexB: ββ; HexS: αα) formájában fordulnak elő (Lemieux és mtsai, 2006; Mark és mtsai, 2003). A normál szövetekben és testfolyadékokban a HexA és HexB izoformák jelenléte dominál, míg a szulfatált GAG-okat hasító, rendkívül labilis és ritka előfordulású HexS csak kismértékű aktivitással rendelkezik (Hepbildikler és mtsai, 2002). A hexózaminidáz
32
család tagja azonban az MGEA5 gén által kódolt nucleocitoplazmatikus O-GlcNacase is, mely nagy valószínűséggel a HexC enzimnek felel meg (Hurtado-Guerrero és mtsai, 2008). Ez év áprilisában még egy további taggal, a HEXDC gén által kódolt nukleocitoplazmatikus HexD enzimmel bővült az enzimcsalád. A hexózaminidáz már korábban leírt N-acetil-galaktózaminidáz aktivitását érdekes módon ennek az izoformának tulajdonították. A többi izoformától hőstabilitásával és leginkább neutrális PH optimumával (PH 5.5) tér el. Nukleocitoplazmatikus enzim révén, jelátviteli folyamatokban betöltött szerepét feltételezik (Gutternigg és mtsai, 2009). Az RA-s SFl-ben a hexózaminidázokat emelkedett aktivitás jellemzi, forrásukként pedig a leukocitákat (Berenbaum és mtsai, 2000), illetve kondrocitákat (Shikhman és mtsai, 2000) jelölik meg. Az RA-s szérumban mért megnövekedett aktivitásért azonban nagy valószínűséggel vérlemezke eredetű hexózaminidáz felelős (Casal és mtsai, 2002). A szinoviális membránbeli aktivitás sejtes forrása nem tisztázott (Popko és mtsai, 2006). A β-D-glükuronidáz (Gus) lizoszómális enzim számos GAG, mint például a heparánszulfát, dermatán-szulfát, és kondroitin-szulfát hasítására képes. Működésének zavara a VII-es típusú mukopoliszaharidózishoz vezet (Tomatsu és mtsai, 2008). Az RA-s betegek szinoviális folyadékában a gükuronidáz enzim aktivitása és a szulfatált GAGok koncentrációja a gyulladással párhuzamosan megemelkedik (Astakhova és mtsai, 1989). Az RA-s szérumban is kimutatták a glükuronidáz aktivitásának fokozódását, mely aktív arthritis során a hisztomorfológiai változásokkal korrelált (Falkenbach és mtsai, 1991). Az eddigi irodalmi adatok alapján, az RA-s betegek perifériás vérsejtjei közül
nagy valószínűséggel
a
neutrofil
granulociták
termelik
legnagyobb
mennyiségben a glükuronidáz enzimet (Marinó és mtsai, 1996). A granulociták mellett azonban monociták és limfociták is szintetizálhatják (Ortutay és mtsai, 2003). A β-D-glükuronidáz aktivitást mostanáig csak a lizoszómális GusB enzimnek tulajdonították. A legújabb irodalmi adatok alapján azonban az öregedés ellenében ható klotho fehérjéről is leírták, hogy rendelkezik β-D-glükuronidáz aktivitással (Torres és mtsai, 2007). Az egészséges idősödő személyek, illetve RA-s betegek CD4+ limfocitáiban a klotho mRNS és fehérje szintű expressziója, valamint enzimaktivitása is lecsökkent (Witkowski és mtsai, 2007). A klotho szinoviális membrán (SM), illetve SF-beli expressziójára vonatkozólag még nincs adat.
33
1.4.3.2. Endoglikozidázok A hialuronidáz (Hyal) enzim a nagy molekulasúlyú (107 kDa) hialuronsavat hasítja, mely nélkülözhetetlen az ízületi porc homeosztázisának fenntartásában. Mivel RA-s és OA-s betegek SFl-ében a hialuronsav átlagos molekulasúlya és koncentrációja lecsökken (Yoshida és mtsai, 2004), ezért feltételezik a hialuronsav, és a katabolizmusáért felelős hialuronidáz enzimek szerepét az ízületi betegségek pathomechanizmusában (Pitsillides és mtsai, 1994; Ghosh, 1994). A lizoszómális hialuronidáznak öt izoformáját ismerjük. A HYAL1, 2 és 3 gén kódolta Hyal-1, -2, és -3 a szinóviumban expresszálódik, és hialuronsavat bont. A HYAL4 gén kódolja a hialuronidáz-4-et, mely tulajdonképpen kondroitináz enzim. A PH20/SPAM1 gén pedig
a
hímivarsejt-specifikus
hialuronidáz-5
enzimet
kódolja.
Az
emlős
hialuronidázok között említendő még a PHYAL1 pszeudogén is (Csoka és mtsai, 2001). A Hyal-1, -2, és -3 enzimek kondrocita monolayerekben és frissen izolált humán porcban is kimutathatók (Flannery és mtsai, 1998). Egy modell szerint az emlős szomatikus sejtek két legjelentősebb hialuronidáza a Hyal-1 és Hyal-2, melyek együtt vesznek részt a nagy molekulasúlyú hialuronsav tetraszaharidokká történő hasításában. A GPI-horgonyzott Hyal-2 segítségével 20 kDa-os fragmensek keletkeznek az endocitotikus vezikulákban, melyek tovább szállítódnak intracellulárisan, majd a Hyal-1 révén tovább emésztődnek. A két exoglikozidáz
(β-D-glükuronidáz
és
N-acetil-β-D-glükózaminidáz)
pedig
cukormolekulákat hasítanak le a hialuronán oligomerek redukáló végeiről, mintegy kiegészítve a hialuronidázok katabolítikus aktivitását a hialuronsav degradációban (Csoka és mtsai, 2001). A kondrociták Hyal expresszióját leszámítva a hialuronidáz gének ízületbeli kifejeződéséről nincs irodalmi adat.
1.4.3.3. Hc-gp 39, glikozidáz-szerű molekula A 39 kDa-os humán porc-glikoprotein (Hc-gp 39, Human cartilage-glycoprotein 39 kDa, vagy más néven YKL-40, vagy CHI-3L1) a szinoviális fibroblasztokban legnagyobb mennyiségben megtalálható fehérje (Nyirkos és mtsa, 1990). Glikozidázszerű molekulaként tartják számon, mivel aminosav sorrendje alapján a kitináz-szerű család 18 tagja, bár glikohidroláz aktivitását ezidáig nem sikerült bizonyítani (Fusetti és mtsai, 2003). A fibroblasztok mellett makrofágok és neutrofil granulociták és
34
kondrociták is termelik (Kirkpatrick és mtsai, 1997; Johansen és mtsai, 2001). Az akutfázis fehérjeként is számontartott Hc-gp39 keringésbeli szintje gyulladásos rheumatológiai betegségek során megemelkedik, ezért az akut és krónikus gyulladás potenciális biomarkere (Peltomaa és mtsai, 2001; Gossec és mtsai, 2004; Andreassen és mtsai, 2007). Ecetmuslicában szerkezeti hasonlóságot mutat bizonyos növekedési faktorokkal, mely feltételezést erősíti az a megfigyelés is, mely szerint kondrociták, szinoviális sejtek és fibroblasztok növekedési faktoraként proliferációt fokozó hatással rendelkezik (De Ceuninck és mtsai, 2001; Recklies és mtsai, 2002). A molekula
immunodomináns
epitópja,
a
263-275
peptid
RA-ban
felismert
autoantigénként viselkedik (Baeten és mtsai, 2004). Ligandjaként említik az I-es, IIes és III-as típusú kollagéneket, melyekhez kötődve a rostképződést szabályozza (Bigg és mtsai, 2006).
1.5. Nitrogén monoxid A nitrogén monoxid (NO) pleiotróp, rövid-életű szabadgyök, mely számos biológiai folyamatban játszik fontos szerepet, mint például a vérerek és légutak tónusának szabályozása, gyulladásos folyamatok, neurotranszmisszió, apoptózis, és különböző jelátviteli folyamatok (Nagy és mtsai, 2007). Az NO az NO-szintetáz (NOS) segítségével L-arginiből keletkezik (Bredt, 1999). A NOS enzimnek három különböző izoformáját különböztetjük meg: neuronális NOS (nNOS), indukálható NOS (iNOS) és endoteliális NOS (eNOS) enzimeket. Míg a humán perifériás vér limfociáira (PBL) az eNOS és nNOS expresszió jellemző, addig a monociták az iNOS enzimet expresszálják (Nagy és mtsai, 2003). Bár az iNOS révén sokkal lassabb az NO szintézis, de jóval több, nanomoláris mennyiségű NO termelődik, míg a konstitutív eNOS és nNOS izoformák hatására csak pikomoláris mennyiségű NO keletkezik (Nagy és mtsai, 2008). Számos tanulmány foglalkozik az RA-s betegek megemelkedett endogén NO szintézisével, alátámasztva a hipotézist, mely szerint az NO túlzott mértékű termelése hozzájárul az RA pathogeneziséhez. Az ízületen belül a szinoviális kapillárisok endotélsejtjei, mesenchymális sejtek, neutrofilek, fibroblasztok, limfociták, hízósejtek és makrofágok termelnek NO-t. A gyulladt ízületben képződő NO az RA-ra jellemző ízület-környéki csontkárosodáshoz is hozzájárulhat. Ezt támasztja alá az iNOS
35
deficiens egerek IL-1 indukálta csontreszorpcióval szembeni rezisztenciája (van’t Hof és mtsai, 2000). Más korábbi munka alapján feltételezhető, hogy az NO szintézis gátlása terápiás célpont lehet RA-ban, hiszen patkányok kísérletesen előidézett arthritisének súlyosságát és a gyulladást is csökkentette egy NOS inhibitor, az NGmonometil-l-arginin (McCartney-francis és mtsai, 1993). Úgy tűnik, hogy az NO a fiziológiás T-sejt aktiváció szabályozásán túl a citoplazmatikus kálcium (Ca2+) koncentráció emelkedéséért is felelős (Nagy és mtsai, 2003). Ezen felül, systemas lupus erythematosusban (SLE) T-sejt diszfunkciót és megváltozott Ca2+ szignalizációt okoz (Nagy és mtsai, 2004), továbbá az RA-s limfociták működésének csökkenéséért is felelőssé tehető (Nagy és mtsai, 2007). Ismert az is, hogy számos sejttípusban (mint például limfocitákban) az apoptózissal kapcsolatos mitokondriális eseményeket, illetve a mitokondriális biogenezist szabályozza az NO. A megváltozott mitokondrium tömeg ezt követően számos sejtfunkciót befolyásolhat, mint például a sejtlégzést vagy a szuperoxid termelést. Mitokondrium biogenezist a cGMP-függő peroxiszóma proliferátor-aktiváló receptor γ koaktivátor 1α-n keresztül indukál humán limfocitákban (Nisoli és mtsai, 2003; Nagy és mtsai, 2003).
36
2. CÉLKITŰZÉSEK A doktori disszertáció célkitűzései a következők voltak: 1. Glikozidáz génexpressziós profil meghatározása RA-s és OA-s szinoviális membránban és a szinoviális fibroblasztokban. a. A Hex, Gus, Hyal-1, Spam-1, klotho és Hc-gp 39 gének expressziójának jellemzése b. A jelentős expressziót mutató glikozidázok (HEX, GUS) enzimaktivitásának vizsgálata RA-s és OA-s szinoviális membránban, szinoviális fibroblasztokban, és szinoviális folyadék mintákban. c. Az RA pathogenezisében kulcsfontosságú citokinek (TNF-α, IL-1β, IL-17, TGFβ1) és az NO hatásának vizsgálata a glikozidázok génexpressziójára, illetőleg enzimaktivitására. d. Szinoviális fibroblaszt-eredetű mikrovezikulák izolálása és a mikrovezikulákkal asszociált glikozidáz aktivitás vizsgálata. 2.Glükózaminoglikán-ellenes antitestek jelenlétének kimutatása RA-s szérum és szinoviális folyadék mintákból. a. Az RA-ban betegség markerként használható GAG-ellenes antitest azonosítása b. GAG-ellenes antitestek keresztreaktivitásának vizsgálata más típusú GAG-al, peptidoglikánokkal és gomba eredetű poliszaharidokkal. c. Glikozidázzal emésztett humán porc aggrekán antitestek általi felismerésének vizsgálata. d. RA-ra jellemző szénhidrát-felismerő mintázatok meghatározása. e. Szénhidrát-specifikus antitestek porc mátrixhoz való kötődésének igazolása. 3. Annak vizsgálata, hogyan befolyásolhatja peptidepitópok citrullinációja perifériás vérsejtek IL-17 válaszát a. Citrullinált és nem citrullinált, shared epitóp szekvenciát hordozó/nem hordozó peptidekkel (HLA DRB1, porc aggrekán P135, és ATE peptidek) szembeni IL-17 válasz vizsgálata RA-es és kontroll személyeik PBMC kultúráiban.
37
b.
Kontroll
és
RA-s
betegek
perifériás
vér
mononukleáris
sejtjeinek
immunfenotipizálása, valamint Th1 és Th2 citokinjeinek összehasonlítása c. összefüggés vizsgálata a HLA genotípus és az SE-t hordozó szintetikus peptidek citrullinációjára való válaszkészség között. d. A citrullinált peptidekkel szembeni szérum antitest reaktivitás vizsgálata. 4. RA-s és kontroll T-limfociták intracelluláris NO szintjének, citoplazmatikus Ca2+ koncentrációjának, és mitokondriumaik tömegének meghatározása. TNFα RA-s betegek T-sejtjeinek NO termelésére gyakorolt hatásának vizsgálata.
38
3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Felhasznált humán minták Az enzimaktivitási vizsgálatokhoz szükséges szinoviális folyadék minták az Országos Rheumatológiai és Fizioterápiás Intézetben (ORFI), illetve a Budai Irgalmasrendi Kórházban (BIK) kezelt akut, exudatív synovitises 31 RA-s (6 férfi, 25 nő) és 16 OAs (4 férfi, 12 nő) betegektől származnak. Az SFl mintákat a sejtek kiülepítését (2000 rpm, 20 perc) követően -20°C-on tároltuk a felhasználásig. A génexpressziós, enzimaktivitási és az SF-ek izolálásához felhasznált SM mintákat 10 RA-ban (1 férfi, 9 nő; átlag életkor években ± átlag eltérés (tartomány): 61.5 ± 10.3 (25-79) év) és 17 OA-ban (7 férfi, 10 nő; átlag életkor ± átlag eltérés (tartomány): 64.53 ± 7.32 (39-79) év) szenvedő betegből nyertük, akik az ORFI, a BIK és a Szegedi Ortopédiai Klinikán ízületi arthroscopián estek át. Az RA-s betegek vörösvértest süllyedés értéke (átlag átlag eltérés) 28.60 18.04 mm/óra, szemben az OA-s betegek 19.00 9.88 mm/óra értékeivel. A C-reaktív protein szintjét csak az RA-s betegek esetében határoztak meg, mely 22.16 18.85 mg/l volt. Az RA-s betegek fehérvérsejtjeinek száma 8.020 1.360/l, míg az OA-s betegeké 7.019 1.320/l. A diagnózistól számított betegség időtartamának években kifejezett átlaga átlageltérés (tartomány) 10.4 8.4 (0 - 35) év az RA-s, és 3.5 2.25 (1 - 10) év az OA-s betegek esetében. Az RA-s betegek per os metotrexát, metilprednizolon és szulfaszalazin kezelésekben részesültek. A T-limfociták NO termelésének vizsgálatához 20 RA-ban szenvedő (Imperial College Healthcare National Health Service (NHS) Trust, London, UK betegei) és 12 egészséges kontroll személy heparinos vérmintáját használtuk. Ezek között 5 betegből az anti-TNF (infliximab, 3mg/kg) terápiát megelőzően, valamint a terápia 2. illetve 6. hetében került sor a vérvételre. Rendelkezésünkre állt továbbá a betegség aktivitását jellemző DAS28 (Disease Activity Score for 28 joints), illetve az anti-TNF terápiára adott válasz hatékonyságát megbecslő EULAR (European League Against Rheumatism) válasz kritériumok is. A természetes autoantitestek vizsgálatához felhasznált 66 RA-s beteg (14 férfi, 52 nő; átlag életkor átlageltérés: 62.5 9.13 év; tartomány: 42-88 év) szérum és szinoviális folyadék mintáit a Semmelweis Egyetem Reumatológiai Klinikáján, illetve az ORFI-ban gyűjtöttük. Az 55 felnőtt kontroll mintát (11 férfi, 43 nő; átlag
39
életkor átlageltérés: 59.7 11.6 év; tartomány: 31-84 év) az Országos Traumatológiai Intézetből kaptuk. A 11 köldökzsinór vérmintát a Semmelweis Egyetem I. számú Nőgyógyászati Klinikáján gyűjtöttük. A szérum mintákból meghatároztuk a ciklikus citrullinált peptid (CCP)-ellenes antitestek, az RF, és a Creaktív protein (CRP) szintjét. Az epitóp citrullináció T-sejtek IL-17 termelésére gyakorolt hatásának vizsgálatához 15 RA-s beteg (3 férfi, 12 nő; átlag életkor átlageltérés: 53.93 9.99 év; tartomány: 32-75 év) és 15 egészséges felnőtt (6 férfi, 9 nő; átlag életkor átlageltérés: 48.86 8.02 év; tartomány: 22-63 év) vérmintáit használtuk fel, melyeket a Semmelweis Egyetem Reumatológiai Klinikájáról kaptunk (1. táblázat). Minden betegnek rendelkezésre állt a DAS 28 score-ja (átlag átlageltérés: 4.78 +/- 0.87253). A betegek és kontrollok szérum mintáit -20°C-on tároltuk az anti-CCP és anti-peptid antitestek meghatározásáig. A HLA DRB1 genotipizáláshoz nátrium-citrátos vérmintákat használtunk, melyek szintén -20°C-on tároltunk a felhasználásig. A perifériás vér mononukleáris sejteket a betegek és a kontroll személyek 12 ml EDTAs véréből izoláltuk. Mind az RA-s, mind az OA-s betegek teljesítették az ACR (American College of Rheumatology) RA-ra (Arnett és mtsai, 1988) és OA-ra (Altman és mtsai, 1991) vonatkozó kritériumait. A humán minták felhasználására érvényes helyi etikai bizottsági engedéllyel rendelkeztünk és a vizsgálatban érintett betegek írásos beleegyező nyilatkozatot tettek.
40
RA betegek
kontrollok
#
Nem
Betegség kezdete
Betegség fennállása
RF IU/ mL
CRP
Terápia
Anti CCP
DAS
DRB1*
DRB1*
#
Nem
Anti CCP
DRB1*
DRB1*
1
F
45
20
278
17
+
5.48
11
11
1
N
-
11
14
2
N
32
10
149
1
Medrol, Azathiprin, Lefunomide MTX
+
5.44
01
0403
2
F
-
1001
13
3 4
N N
34 50
20 4
6 47
6 14
+ +
5.5 5.03
0401 07
16 11
3 4
F N
-
03 03
0404 0401
5
N
50
15
16
3
MTX Leflunomide, Adalimumab MTX, Medrol
+
5.6
13
16
5
N
-
03
0401
6 7
N F
54 62
4 6
43 150
17 18
+ +
5.06 3.12
01 11
07 12
6 7
N F
-
11 03
14 11
8
N
34
18
14
41
MTX, Medrol Etanercept, Medrol MTX, Medrol
-
6.02
0401
16
8
N
-
08
11
9
N
28
22
108
2.4
+
5.6
03
07
9
N
-
07
11
10
N
56
16
1
108
+
2.7
01
14
10
N
-
03
13
11
N
33
19
25
0.5
+
4.2
0401
12
11
N
-
07
08
12
N
42
4
85
38
+
4.2
0401
0408
12
F
-
11
13
13 14
N N
39 29
15 4
92 42
34 1
+ +
4.58 3.3
0401 0408
13 07
13 14
N F
-
13 01
14 11
15
F
61
5
117
0.9
MTX, Adalimumab Leflunomide, Medrol MTX, Sulphasalazyne, Azathyoprin Infliximab, Medrol, MTX MTX, Medrol MTX, Adalimumab Leflunomide
+
5.8
03
0408
15
F
-
01
11
1. táblázat: Az RA-s betegek és kontroll személyek demográfiai, klinikai és laboratóriumi paraméterei; N: nő; F: férfi; RF: rheuma faktor; CRP: C-reaktív protein; Anti CCP: ciklikus-citrullinált peptid-ellenes antitest; DAS: betegség aktivitását jelző érték; MTX: methotrexate. 3.2. Sejtkultúrák 3.2.1. Szinoviális fibroblaszt sejttörzsek izolálása Az SF sejttörzseket Neidhart és mtsai által leírt módon izoláltuk (Neidhart és mtsai, 2000). Az SM szövetdarabokat 1 mm3-es darabokra vágtuk, majd Dispase II jelenlétében (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország) egy órán keresztül, 37°Con inkubáltuk. Az emésztés eredményeképp létrejött sejtszuszpenziót 40 μm-es szűrőn átszűrtük, majd a sejteket Dulbecco's modified Eagle's medium-ban (DMEM) (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) tenyésztettük 10% hő inaktivált embrionális borjúsavó (Fetal Calf Serum, FCS) (Gibco-BRL, Paisley, USA), 100
41
U/ml penicillin, 0.1 mg/ml streptomicin, 2 mM glutamin, 1% nem-esszenciális aminosavak, 1% nátrium-piruvát, 50 μM β-merkaptoetanol (valamennyi a SigmaAldrich-tól) jelenlétében. Az SF kultúrákat 4-9. passzálásig tenyésztettük, 3-4 naponkénti tápfolyadék cserével. Kísérleteink során a sejtek életképessége minden esetben több mint 95%-os volt tripánkék festést követően. Az ismételt passzázsok biztosították a makrofág-mentes, tiszta SF populációkat. Ezt bizonyította a CD68 (anti-human CD68-FITC, eBioScience Inc, San Diego, CA, USA) festődés hiánya az SF kultúráinkban (Rosengren és mtsai, 2007), melyhez pozitív kontrollként perifériás vér monocitáit használtuk. Az in vitro körülmények közötti hosszas tenyésztés során felmerül, hogy megváltozik a fibroblasztok génexpressziós mintázata. Ennek kizárására minden második passzálás során megvizsgáltuk a glikozidázok alap expresszióját, de nem találtunk szignifikáns eltérést sem az RA-s, sem az OA-s SF-ek P1-P9 mintái között (6. ábra). Bár az RA-s minták génexpressziós mintázata a betegség stádiumával is változhat, kísérleteink nem terjedtek ki korai RA-s minták vizsgálatára, mivel korai stádiumból származó szinoviális membrán minták nem álltak rendelkezésünkre.
6. ábra: Glikozidázok génexpressziója a szinoviális fibroblasztok passzálása során. Az SF sejttörzsek in vitro tenyésztése során minden második passzálást követően RNS-t
izoláltunk,
majd
megvizsgáltuk
a
munkánk
során
vizsgált
gének
expressziójának változását. Nem találtunk szignifikáns eltérést az RA-s (n = 5) és az OA-s (n = 6) SF-ek P1, P3, P5, P7 és P9 mintái között.
42
3.2.2. Perifériás vér mononukleáris sejtek izolálása Humán perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC, peripheral blood mononuclear cell) alvadásgátolt vénás vérből Ficoll-Hypaque grádiensen (Sigma-Aldrich Ltd.) centrifugálva nyertünk. A PBL sejteket Petri csészében tenyésztettünk. Ezután a perifériás limfocitákat 106/ml sejtkoncentrációban RPMI 1600-as médiumban vettük fel, ami 10% FCS-t, 2 mM L-glutamint, 100 IU/ml penicillint, 100 μg/ml gentamicint tartalmazott. A TNFα kezelést megelőzően 1 μM Concanavalin A-val (Sigma Aldrich Ltd.) 48 órán át kezeltük a sejteket az aktiváció érdekében.
3.3. Real Time PCR Az SM-ből és SF-ből a totál RNS izolálást RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) segítségével végeztük, a gyártó előírásai szerint. Az RNS-minták integritását 2%-os agaróz gélelektroforézis segítségével, tisztaságát és a hozamot spektrofotometriásan
(Nanodrop
ND-1000
spektrofotométer
(NanoDrop
Technologies, Wilmington, DE, USA)), UV 260/280 nm-es abszorpcióméréssel határoztuk meg. Ezt követően 2 μg totál RNS-t cDNS-sé írtunk át 45 perces 42°C-on történő denaturáció, majd 5 perces 99°C-on végzett reverz transzkripció során. A reakcióhoz 5 mM MgCl2-t, 1 mM dNTP-t, random hexamer primert, RNasin RN-áz gátlót és reverz transzkriptázt (valamennyi: Promega, Madison, WI, USA) használtunk 40 μl végtérfogatban. Az átírt cDNS-ek felhasználásával ezután realtime PCR-t végeztünk. A Taqman rendszeren alapuló quantitatív realtime PCR vizsgálatokat AbiPrism® 7000 PCR készülékkel (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) végeztük, betartva a gyártó utasításait. Számos gén expressziós szintjét vizsgáltuk ezzel a rendszerrel, minden esetben a gyártó által garantált, Taqman Universal PCR Master Mix segítségével. Az alábbi, AbiPrism realtime PCR-platformhoz kereskedelemben elérhető Taqman próba készleteket használtuk fel: hexózaminidáz A alegység (HexA), hexózaminidáz B alegység
(HexB),
hexózaminidáz
D
(HexDC),
β-D-glükuronidáz
(GusB),
hialuronidáz 1 (Hyal1), 39 kDa-os humán porc-glikoprotein (Hc-gp 39), klotho, sperm adhesion molecule 1 (Spam1), mátrix metalloproteináz 1 (MMP1) és MMP3 (próba
azonosító:
Hs99999908_m1,
Hs00166843_m1, Hs00537920_g1,
Hs00166864_m1, Hs00609691_m1,
Hs00411582_m1, Hs00183100_m1,
Hs01095939_m1, Hs00899658_m1 és Hs00233962_m1). Belső housekeeping 43
kontrollként hipoxanthin-guanin foszforibozil transzferáz (HGPRT, hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase) próbakészletet (azonosító: Hs99999909_m1) használtunk. A PCR reakciókat 96 lyukú lemezen végeztük. A reakció előtt elkészítettük a próbák és a reakcióelegy keverékeit (lyukanként 12.5 μl Taqman Universal PCR Mix és 1.3 μl próba) illetve a reverz transzkripcióból származó cDNS hígított oldatát (lyukanként 2 μl cDNS és 9.2 μl desztillált víz). A reakciót megelőzően a két oldatot a lyukakba pipettáztuk. A teljes térfogat 25 μl/lyuk volt. A realtime PCR-protokollt templát nélküli negatív kontrollok esetében is elvégeztük. Valamennyi mintából két paralellt mértünk. A kapott eredményeket a komparatív CT (ΔΔCT)-módszer segítségével értékeltük ki, az eredményt minden esetben a megfelelő housekeeping mRNS-szintre vonatkoztatva. 3.4. Enzimaktivitás mérések Az SM mintákat 0.2M fenil-metil-szulfonil-fluorid-ot (PMSF), 1 mg/ml PepstatinA-t, 0.2M IodoAcetamid-ot és 0.2M EDTA-t (etilén-diamin-tetraecetsav) (mind: SigmaAldrich) tartalmazó jéghideg pufferben homogenizáltuk Heidolph Diax homogenizáló segítségével. A fibroblasztokat ötszöri fagyasztás-olvasztással tártuk fel, melyről előkísérleteinkben igazoltuk, hogy nem károsította jelentősen a vizsgált enzimek aktivitását. Az enzimaktivitásokat Bradford fehérje meghatározási módszer alapján mért fehérje tartalomra (50 µg minden mintából) normalizáltuk. Az SM, SF és SFl enzimaktivitását kromogén szubsztrátok segítségével határoztuk meg: a GusB aktivitását p-nitrofenil-β-D-glükuronid, a NAG aktivitását p-nitrofenil-N-acetil-β-Dglükózaminid, a β-D-N-acetil-galaktózaminidáz (NAGA) aktivitását p-nitrofenil-Nacetil-β-D-galaktózaminid (valamennyi a Sigma Aldrich Ltd.-től) segítségével mérhettük. A vizsgálatokat korábbi munkánk során leírt (Ortutay és mtsai, 2003), illetve Popko és mtsai által optimalizált metodika (Marciniak és mtsai, 2006) alapján végeztük: az 50 µg fehérjét tartalmazó mintákat 0.2 M nátrium-acetát oldattal (PH = 4.5, GusB), illetve 0.1 M citrát-foszfát pufferrel (PH = 4.7, NAG; PH = 4.3, NAGA) higítottuk 30 µl-re, majd 40 µl további puffer hozzáadása után 30 µl szubsztrátot adtunk minden egyes lyukba a 96 lyukú platen (MaxiSorp; Nunc Interned, Koppenhága, Dánia). Az enzimreakciót 2 órás 37°C-on történő inkubáció után 200 µl 0.2 M borát pufferrel állítottuk le (PH = 9.8), majd 405 nm-en az optikai denzitást (OD) mértük MS Reader (Multiskan MS, Labsystems, Helsinki, Finnország) segítségével. Az enzimaktivitásokat nemzetközi egységekben (U) fejeztük ki, 44
amelynek
meghatározásához
ismert
aktivitású
enzimstandardok
hígításait
használtunk, az adott mérésnek megfelelően GusB (EC 3.2.1.31), NAG (EC 3.2.1.52) enzimstandardokat (Sigma-Aldrich). 3.5. Citokinek hatásának vizsgálata szinoviális fibroblasztok glikozidázainak génexpressziójára és szekréciójára Az SF sejttörzseket 0, 1, 10, 50 ng/ml humán TNF-α (BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA, USA), IL-1β, TGF-β1 (mindkettő: ImmunoTools, Friesoythe, Németország) és 0, 1, 10, 100 ng/ml IL-17 koncentráció mellett (ImmunoTools) 24 órán
keresztül
ammonioethyl)
tenyésztettük.
Az
NO
donor
amino]diazen-1-ium-1,2-diolate
(Z)-1-[2-(2-aminoethyl)-N-(2diethylenetriamine
NOC-18-at
(Molecular Probes Inc, Eugene, OR, USA) 0, 100 és 1000 mM koncentrációkban használtuk a sejtek kezelésére. Az enzimszekréció vizsgálatához 96 lyukú lemezre lyukanként 5x104 SF került fenolvörös és FCS-mentes RPMI 1640 médiumban. Humán TGF-β1 jelenlétében 24 órán keresztül tenyésztettük. A felülúszó és a sejt lizátumok enzimaktivitását a fent leírt módon határoztuk meg, adott sejtszámra normalizálva. 3.6. Hisztokémiai vizsgálatok 3.6.1. SF glikozidázainak kimutatása enzimhisztokémiával Ezen vizsgálatokhoz a fibroblasztokat chamber slide-on (Nunc Inc, Naperville, IL, USA) 24 órán keresztül tenyésztettük, majd 50 μM ImaGene Green C12FDGlcU -Dglucuronidase vagy ELF® 97 N-acetylglucosaminide szubsztráttal (mindkettő a Molecular Probes-tól) inkubáltuk. A felesleg kimosását követően Bio-Rad MRC 1024 konfokális lézer scanning mikroszkóppal (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) analizáltuk a lemezeket.
3.6.2. GAG ellenes antitestek porcmátrixhoz való kötődésének vizsgálata immunhisztokémiával Normál felnőtt porcból kriosztát segítségével készített metszeteket Super Frost lemezekre (Thermo Fischer Scientific, Walthman, MA, USA)) vettünk fel. Alkohol és aceton elegyével történő fixálás után 5% BSA-val (marha szérum albumin, bovine
45
serum albumin) (Sigma Aldrich Ltd.) blokkoltuk a nem-specifikus kötőhelyeket. Ezt követően az RA-s szérum 1:25 higításával, majd fluoreszcein izotiocianáttal jelölt anti-humán Ig antitesttel (Sigma Aldrich Ltd.) inkubáltuk és a lefedést követően BioRad
MRC
1024
konfokális
mikroszkóppal
vizsgáltuk
a
metszeteket.
A
fluoreszcenciát a negatív kontrollokhoz normalizáltuk, melyek elhanyagolható háttérfluoreszcenciát mutattak.
3.7. Áramlási citometriás (FACS) mérések 3.7.1. SF-eredetű mikrovezikulák FACS vizsgálata A 75 cm2-es flaskákban 3x106 SF-et tenyésztettünk 24 órán keresztül FCS mentes DMEM-ben, ezután a felülúszóból 500g 10 perces centrifugálással eltávolítottuk a sejteket/sejttörmelékeket, majd áramlási citometria segítségével az előre és oldal szórás alapján kimutattuk az MV-k jelenlétét a fibroblasztok felülúszóiban. Az MV-k számát FACSCaliburTM áramlási citométerrel (Beckton Dickinson & Co., San Jose, CA, USA) mértük 30 másodpercig. A NAG és GusB detektálásához MV preparátumokat készítettünk RA-s (n = 4) és OA-s (n = 5) SF felülúszóiból. Az ultracentrifugálással izolált MV-k (500g 10 perc, 100,000g 1 óra) és a sejtek enzimaktivitását kromogén szubsztrátok segítségével határoztuk meg és 5 μg teljes fehérjetartalomra standardizáltuk. Az eredményeket a CELLQuestTM 3.2 szoftver (Becton Dickinson) segítségével analizáltuk.
3.7.2. PBMC-k immunfenotípusának és citokintermelésének vizsgálata A perifériás vér limfocita és granulocita populációit a sejtek mérete és granuláltsága alapján azonosítottuk (FSC/SSC dot plot). Az immunsejtek fenotipizálásához 1 μg antitestettel 106 sejtet 100μl PBS-ben 20 percig festettünk. Az antitesteket a BD Biosciences-től vásároltuk: anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD14, anti-CD20, anti-CD56 és anti-CD25. A monoklonális antitestekkel történő inkubáció után lizáltuk (FACS Lysing buffer, BD Biosciences) a vörösvértesteket, PBS-sel megmostuk a fehérvérsejteket, 2%-os paraformaldehiddel (Sigma-Aldrich) fixáltuk a sejteket és 2.5x104–1x105 sejtet számoltunk le. Az intracelluláris citokinfestést megelőzően a sejteket szintetikus peptidek (25μg/ml) jelenlétében vagy hiányában 24 órán át stimuláltuk, és az inkubáció utolsó 5 órájára
46
10 μg/ml Brefeldin A-t (Sigma-Aldrich) adtunk a sejteknek. Ezt követően 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk a sejteket, majd 0.5% szaponinnal (Sigma-Aldrich) permeablizáltuk őket. Az IL-17 szekretáló sejtek meghatározásához PE-jelölt antihumán IL-17A antitestet használtunk (eBioscience). A stimulált és stimulálatlan PBMC-k sejtkultúráinak felülúszóiból bead-alapú multiplex assay (Bender MedSystems, Vienna, Austria) segítségével meghatároztuk a szolubilis citokinek szintjét. Az IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, P70, IFN-γ, TNF-α citokinek szintjét négy RA-s és 4 egészséges felnőtt kontroll személyek mononukleáris sejtjeinek felülúszóiból mértük. Pozitív kontrollként 5μg/ml koncentrációban Concanavalin A-t (Sigma-Aldrich) használtunk minden kísérletünkben. 3.7.3. PBL vizsgálata FACS segítségével Sejtek életképességének vizsgálata Az apoptózis mértékét fluoreszcein-konjugált annexin V (Annexin V-FITC; FL-1 csatorna; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) és propidium-jodid (PI; FL-2 csatorna; Molecular Probes) segítségével áramlási citométeren határoztuk meg. Mitokondriális tömeg mérése A mitokondrium mennyiség meghatározásához membránpotenciáltól független 100 nM MitoTracker Green-FM festéket (excitációs hullámhossz 490 nm; emissziós hullámhossz 516 nm; FL-1 csatornán detektálható), illetve 50 nM nonyl acridine orange-t (NAO, excitációs hullámhossz 490 nm; emissziós hullámhossz 540 nm; FL1 csatornán detektálható) (mindkét festék a Molecular Probes-tól) használtunk. Citoplazmatikus kálcium (Ca2+) szint meghatározása A citoplazmatikus Ca2+ koncentráció méréshez 1 μM Fluo-3-acetoxymethylester (Molecular Probes) fluoreszcens, lipidoldékony festéket használtunk. A sejtbe jutott festék észter csoportjait a citoplazmatikus észterázok lehasítják, a vízoldékonnyá vált festék a sejtben marad, Ca2+-ot köt, melynek következtében a festék fluoreszencia intezitása sokszorosára fokozódik (excitációs hullámhossz 506 nm, emissziós hullámhossz 526 nm; FL-1 csatornán detektáljuk). Intracelluláris NO mérése Limfociták
NO
termelésének
méréséhez
4-amino-5-methylamino-2',7'-
difluorofluorescein diacetát (DAF-FM) festéket használtunk (Molecular Probes), mely passzív diffúzióval jut át a sejtmembránon, ahol az intracelluláris észterázok
47
deacetilálják, így lipidoldékonyságát elveszti, a sejtből nem tud kijutni. A festék NO kötődés hatására benzotriazollá alakul (excitációs hullámhossz 495 nm, emissziós hullámhossz 515 nm), fluoreszcencia intenzitása arányos a sejt által termelt NO koncentrációjával. A sejteket 2 órán keresztül inkubáltuk 1 μM DAF-FM festéket tartalmazó komplett RPMI 1640 médiumban, 37°C- on CO2 termosztátban. 3.8. SF-eredetű MV-k vizsgálata elektron mikroszkópiával (EM) A 24 órás SF felülúszók 500g 10 perces centrifugálását, 30 perces 100,000g-n történő ultracentrifugálás követte. A pelletet 2% paraformaldehid/2% glutáraldehid keverékével 2 órán keresztül fixáltuk, majd 30 percig 1%-os OsO4-ban utófixáltuk. Etanolos dehidrációt követően a blokkot 70%-os etanolban oldott 2%-os uranilacetáttal kontrasztoztuk 1 órán át, majd Taab 812-be (Emmer Green, Reading, England) ágyaztuk. Az ultravékony metszeteket Hitachi 7100 transzmissziós elektron mikroszkóppal vizsgáltuk (Hitachi; Tokyo, Japan).
3.9. ELISA rendszerek 3.9.1. Szénhidrát ELISA Az alábbi szénhidrátokkal szemben termelt természetes autoantitestek kimutatására alkalmaztuk: kondroitin-szulfát A (CSA), kondroitin-szulfát B (CSB), kondroitinszulfát C (CSC), keratán-szulfát (KS), alacsony molekulasúlyú heparán-szulfát (HS), hialuronsav (HA) (valamennyi: Sigma Aldrich Ltd.-től), illetve natív és glikozidáz emésztett emberi és borjú aggrekán. Mivel a polisztirén felszínhez a szénhidrátok igen
gyengén
kötődnek,
a
szénhidrát-specifikus
antitestek
mérésére
a
CovaLinkELISA rendszerhez folyamodtunk, mely segítségével a szénhidrát antigének kovalensen kötődnek ki a CovaLink lemez (Nunc, Wiesbaden, Németország)
felszínére.
Ezen
antigéneket
1%
1-(3-dimetilaminopropil)-3-
etilkarbodiimidben (1% EDC, Merck Whitehouse Station, NJ, USA) higítva 1 μg/well koncentrációban juttatjuk a lemezekre. Két órás 37°C-on, majd egy éjszakán keresztüli szobahőmérsékleten történő inkubációt követően PBS (foszfát-pufferelt fiziológiás sóoldat, phosphate buffered saline) 1% BSA/nátrium-aziddal 2 órán át blokkoltunk. A szérum és SFl mintákat 1:100 higításban alkalmaztuk. A HRPkonjugált anti-humán IgM és anti-humán IgG (Sigma Aldrich Ltd.) szekunder antitesteket 1:50000 és 1:30000 higításban használtuk. Orto-fenilén-diamin (OPD) és 48
0.33% hidrogén-peroxid (mindkettő: Sigma-Aldrich Ltd.) hozzáadását követően 492 nm-en mértük az abszorbanciát. A GAG-specifikus antitest kötődés gátlásának méréséhez bakteriális peptidoglikánt, gomba eredetű poliszaharidot, a zymosant, és gyengén anionos gyantát próbáltunk ki.
3.9.2. Peptid-specifikus antitestek mérése ELISA módszerrel A peptid-specifikus antitestek szintjét is a CovaLink ELISA rendszer segítségével határoztuk meg. A szintetikus peptidek 1 μg-ját 1% EDC-ben oldva 100 μl térfogatban osztottuk ki lyukanként. A peptidek a 37°C-on történő két órás, majd a szobahőmérsékleten lezajló egy éjszakás inkubáció során kovalensen kötődtek a lemezek aljához. A még szabad kötőhelyeket PBS/1% BSA segítségével két órán keresztül szobahőmérsékleten blokkoltuk. Ezt követően a szérum mintákat PBSTween 20-al 1:100-as arányban hígítottuk (előkísérleteink során meghatározott higítási koncentráció), 100 μl-enként szétosztottuk, majd 37ºC-on két órán át, végül 4 ºC-on egy éjszakán át inkubáltuk. A PBS-Tween 20-al történő mosást követően 1:30,000-es
arányban
higított
peroxid-konjugált
anti-humán
polivalens
immunglobulinokkal (anti-IgGAM) (Sigma-Aldrich) 37ºC-on két órán át inkubáltuk a lemezeket. Újabb mosás következett, majd OPD és 0.33% hidrogén-peroxid segítségével előhívtuk a reakciót. A reakciót 4N-os H2SO4 segítségével állítottuk le, végül 492nm-en MS Plate Reader (Multiskan MS; Labsystems, Helsinki, Finland) segítségével határoztuk meg az abszorbanciát. 3.10. Szénhidrát chip A szérum és szinoviális folyadék minták IgG molekuláit AlexaFluor 350-konjugált anti-humán IgG antitesttel (Zenon Human IgG Labeling Kits, Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA) jelöltük a gyártó előírásainak megfelelően. A jelölt IgG molekulát a szénhidrát chipre (Glycochip, Glycominds Ltd., Lod, Izrael) jutattuk, és megfelelő inkubációs idő és mosások után a fluoreszcenciát Perkin Elmer Victor II spektrofluoriméterrel mértük le.
49
3.11. ELISPOT mérések citokintermelő sejetk számának meghatározására Az ELISPOT méréseinkhez humán IL-17 ELISPOT rendszert (eBioscience Inc. San Diego, CA), és steril MultiSceenTM-IP lemezeket (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) használtunk. Az ELISPOT assay-t az eBioscience cég előírásainak megfelelően végeztük: a nagy fehérje megkötő képességű Immobilon P-membránnal rendelkező lemezek lyukainak alját 100 μl/lyuk elfogó (capture) antitesttel egy éjszakán át 4°C-on inkubáltuk. Ezt követően, kétszer mostuk a lemezeket, majd 200 μl RPMI/10%FCS-el egy órán keresztül szobahőmérsékleten blokkoltuk. Lyukanként 2x105 frissen izolált PBMC-t helyeztünk a lemezekre 200 μl RPMI/10%FCS-ben, a továbbiakban pedig 25 μg/ml koncentrációjú szintetikus peptidek jelenlétében vagy hiányában CO2 inkubátorban 37°C-on inkubáltuk őket egy éjszakán át. Újabb három mosási lépést követően 100 μl biotinilált detektáló antitestet juttattunk minden lyukba. A 4ºC-on történő kétórás inkubáció után lyukanként 100 μl avidinperoxidázzal 45 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk a lemezeket. A reakció eredményét 100 μl frissen oldott AEC szubsztráttal (AEC staining kit, SigmaAldrich) tettük láthatóvá. A lemezeket desztillált vízzel mostuk, megszárítottuk, majd ImmunoScanTM ELISPOT reader (Cellular Technology Ltd. Cleveland, OH, USA) segítségével meghatároztuk a spotok számát. 3.12. Lineáris peptidek szintézise Az aggrekán és HLA DR1 molekulák lineáris peptideinek szintézisét együttműködő partnereink végezték az Eötvös Lóránd Tudományegyetem Szerves Kémiai Intézetében. A szintézis során a szilárd fázisú metodológiához Rink Amide MBHA gyantán alapuló Fmoc/tBu stratégiát használtak. A folyamat során előállított „nyers terméket”
szemi-preparatív,
kromatográfiával
(RP-HPLC,
reverz-fázisú,
magas
reverse-phase
teljesítményű high-performance
folyadék liquid
chromatography) tisztították ki. A tisztított termékeket aminosav analízis, analitikai RP-HPLC
és
elektrospray
ionizációs
tömegspektrometriai
technikákkal
karakterizálták. A következő gyantákat és reagenseket használták a szintézishez: a Rink Amide MBHA gyantát (0.69mmol/g) és az Nα-Fluorenylmethyloxycarbonylvédett aminosav származékokat a Bachem-től (Bubendorf, Switzerland) vagy a NovaBiochem-től (Läufelfingen, Switzerland) rendelték. A scavenger-ek (thioanisole, 1,
2-ethanedithiole,
coupling
reagensek
(N,N’-diisopropylcarbodiimide,
1-
hydroxybenzotriazol, N-diisopropyl-ethylamine), és hasítási reagensek (piperidine,
50
1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene)) a Fluka (Buchs, Switzerland) termékei voltak. A szintézishez (N,N-dimethylformamide, dichloromethane, N-methyl-pirrolidone), és a tisztításhoz (diethyl ether, acetonitrile és trifluoroacetic acid) használt oldószerek a Reanal (Budapest, Hungary) cégtől származtak. Az aggrekán és HLA DR1 peptidek natív és citrullinált változatainak szekvenciái és kódjait a 2. táblázatban foglaltuk össze. P135
TTYKRRLQKRSSRHP
P135 1X
TTYKRRLQKCitSSRHP
P135 2X
TTYKRCitLQKCitSSRHP
P135 3X
TTYKRCitLQKCitSSCitHP
P135 4X
TTYKCitCitLQKCitSSCitHP
HLA DRB1 RCR
KDLLEQKRAAVDTYR
HLA DRB1 RCX
KDLLEQKCitAAVDTYR
HLA DRB1 XCR
KDLLEQKRAAVDTYCit
HLA DRB1 XCX
KDLLEQKCitAAVDTYCit
ATE R-R
ATEGRVRVNSAYQDK
ATE X-R
ATEGCitVRVNSAYQDK
ATE R-X
ATEGRVCitVNSAYQDK
ATE X-X
ATEGCitVCitVNSAYQDK
2. táblázat: A szintetikus peptidek szekvenciái. P135: shared epitópot szekvenciát hordozó humán aggrekán peptid. HLA: a HLA DRB1 shared epitóp szekvenciát hordozó peptidje. ATE: humán aggrekán core protein peptid (BALB/c egérben arthritogén, hasonlít a P135-re), mely nem hordozza a shared epitóp szekvenciát. A négy ATE peptidet később egymástól nem elkülönítve „shared epitópot nem hordozó peptidként” emlegetjük majd. A peptidek elnevezésében „X”-el azon arginin aminosavak pozícióját jelöljük, melyeket később citrullin vált fel.
51
3.13. HLA genotipizálás A HLA genotipizálást az Országos Haematológiai és Vértranszfúziós Intézetben dolgozó együttműködő partnereink végezték. Elsőként, a fagyasztott vérminták (nátrium-citráttal alvadásgátolt) 350 μl-éből GenoM-6 automata DNS izoláló (Qiagen, Hilden, Germany) segítségével DNS-t izoláltak. Ezt követően a HLA DRB1* tipizálást Olerup SSP DR alacsony felbontású kit (Qiagen, lot number: X46), majd a DRB1*04 allél tipizálását Olerup SSP DRB1*04 magas felbontású kit (Qiagen, lot number: V86) segítségével végezték el. A PCR termékeket 2% agaróz gélelektroforézissel (8x12cm; 100V, 7 perc) választották el. Végül a megfuttatott PCR termékek gélképét BioRad (Philadelphia, PA, USA) gél dokumentációs rendszer segítségével rögzítették. 3.14. Ciklikus citrullinált peptid-ellenes (anti-CCP) antitestek meghatározása Az anti-CCP antitestek szintjét Immunoscan RA anti-CCP test kit (EURODiagnostica, Malmö, Sweden) segítségével határoztuk meg. A koncentrációkat U/mlben határoztuk meg a gyártó utasításainak megfelelően. A 5.5 U/ml-es koncentrációt tekintettük az anti-CCP pozitivitási kritérium alsó határának. 3.15. Statisztikai analízis A későbbiekben bemutatott adatok, eredmények statisztikai feldolgozását a STATISTICA 7.1 szoftvercsomag (StatSoft Inc. Tulsa, OK, USA) segítségével végeztük el. A glikozidázok vizsgálata során részben Mann-Whitney rank sum tesztet alkalmaztunk, részben kétmintás t-próbát végeztünk. A GAG-ellenes antitestek vizsgálata során a következő statisztikai analíziseket hajtottuk végre: Az ELISA eredmények értékelése során egy három-paraméteres logisztikus görbét hoztunk létre az adatok kalibrálása céljából, majd az ismeretlen GAG ellenes minták koncentrációit a kalibrációs görbe alapján határoztuk meg. A betegek szérumának a kontroll és köldökzsinór szérummal való összehasonlításához háromfaktoros varianciaanalízist végeztünk (Three-Factor One Way ANOVA). A legjobb betegség specifikus markerként szolgáló anti-GAG antitest kiválasztásához Harrell által javasolt stratégiát (Harrell és mtsa; 2001) alkalmaztuk. A statisztikai tesztek elvégzése előtt normalitási vizsgálatot hajtottunk végre.
52
A mintacsoportok közötti különbségeket 0.05-ös hibaküszöb alatti p-értékek esetén tekintettük szignifikánsnak. A peptidepitóp citrullináció hatásának vizsgálata során kapott eredményeket ANOVA analízis segítségével értékeltünk ki (SPSS 15.0 for Windows, LEAD technologies Inc., Charlotte, NC). A T-limfociták NO termelésének vizsgálataiban kapott eredményeket Student’s t test vagy a nem-parametrikus adatok esetén Mann–Whitney U rank sum test segítségével analizáltuk.
53
4. EREDMÉNYEK 4.1.
Glikozidázok
génexpressziójának
és
enzimaktivitásának
vizsgálata
rheumatoid arthritises és osteoarthritises szinoviális fibroblasztokban
4.1.1. Glikozidázok génexpressziójának vizsgálata Munkánk során szisztematikusan vizsgáltuk a glikozidázok ízületi expresszióját. Meghatároztuk a HexA, HexB, GusB, Hyal1, klotho és a glikozidáz szerű Hc-gp39 gének expresszióját RA-s és OA-s betegek SM és SF mintáiban. A legmagasabb expresszióval a Hc-gp 39 gén jellemezhető, melynek mértéke nagyságrendekkel meghaladta a többi vizsgált gén expresszióját (7. ábra). Kifejeződése az SF-ben tízszer magasabb, mint az SM-ben. Az ízületekben a hexózaminidáz a legjelentősebb mértékben expresszálódó glikozidáz. A HexA alegységet kódoló gént jellemzi a legerősebb génexpresszió, mely megközelítőleg azonos mértékben fejeződik ki az SM és SF mintákban (7. ábra). A valamivel gyengébben expresszálódó HexB alegységet kódoló gén szignifikánsan magasabb expressziót mutat az RA-s és OA-s SF-ben az SM-hez képest (7. ábra). Az RA-s SF-ben a HexA gén expressziója magasabb, mint a HexB gén expressziója. Az SM-ben pedig szignifikánsan erősebb expresszióval jellemezhető a HexA gén a HexB génhez képest. Egyre kisebb expressziós értékeket tapasztaltunk a GusB, Hyal1 és klotho gének esetében (8. ábra). Ezen gének RA-s és OA-s SF-beli expressziója szignifikánsan alacsonyabb volt az RA-s és OA-s SM-ben tapasztalt értékeknél. Az OA-s SM mintáinkban szignifikánsan magasabbnak bizonyult a Hyal1 expressziója az RA-s SM-beli értékekhez képest. A Spam1 gén expressziója nem volt kimutatható.
54
7. ábra: A Hc-gp 39, HexA és HexB gének expressziója arthritises betegek SM és SF mintáiban. Az RA-s és OA-s SF-ben szignifikánsan magasabb a Hc-gp 39 gén expressziója az RA-s és OA-s SM-hez képest (Mann-Whitney rank sum test). A HexA gén expressziója nem tér el lényegesen az SF és SM minták között. A HexB gén az RA-s és OA-s SM-hez képest szignifikánsan magasabb expressziót mutat az RA-s és OA-s SF-ben (Mann-Whitney rank sum test). *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001. 55
8. ábra: A GusB, Hyal1 és klotho gének expressziója arthritises betegek SM és SF mintáiban. A GusB, Hyal1 és klotho gének RA-s és OA-s SF-beli expressziója szignifikánsan alacsonyabb az RA-s és OA-s SM-ben tapasztalt értékeknél (MannWhitney rank sum test). Az RA-s SM-hez képest a Hyal1 génexpressziója szignifikánsan magasabbnak mutatkozott OA-s SM-ben (Mann–Whitney rank sum
56
test). A Spam1 gén nem expresszálódik az SM és SF mintáinkban. *P <0.05; **P <0.01; ***P <0.001.
4.1.2. Glikozidázok enzimaktivitásának vizsgálata Munkánk során a NAG, NAGA és GusB enzimek aktivitását kromogén szubsztrátok segítségével határoztuk meg. Eredményeink a 8. ábrán láthatók. Az RA-s SFl-ben mindhárom enzim aktivitása szignifikánsan magasabb volt az OA-s SFl mintákban tapasztalthoz képest. Az SFl-ben tapasztalt aktivitás mértéke messze elmaradt az SM homogenizátumban és SF lizátumban detektálható értékekhez képest (9. ábra A, B, C). Ha összehasonlítjuk az RA-s SM és SF NAG enzimaktivitását, az utóbbi szignifikánsan magasabbnak bizonyul. Ezzel szemben a GusB SF-beli aktivitása alacsonyabb volt mint az SM-ben. Nem találtunk szignifikáns különbséget az RA-s és OA-s betegek SM és SF mintái között (9. ábra A, B, C).
57
9. ábra: RA-s és OA-s betegek SM, SF és SFl mintáinak glikozidáz aktivitása. Az RA-s SFl-ben a NAG (A), NAGA (B) és GusB (C) enzimek aktivitása szignifikánsan magasabb volt az OA-s SFl-hez képest. Az SM és SF homogenizátumok szignifikánsan magasabb enzimaktivitással jellemezhetők, mint az SFl minták. Az SM-hez képest az SF-ek szignifikánsan magasabb NAG és alacsonyabb, vagy megközelítőleg azonos NAGA és GusB aktivitást mutattak. *P <0.05; **P <0.01; ***P <0.001 58
4.1.3. GusB és NAG enzimhisztokémiai kimutatása SF-ben Az RA-s és OA-s SF monolayereket a GusB és NAG enzimek fluorogén szubsztrátjaival festettük. A kapott képek alapján elmondható, hogy mindkét enzim a lizoszómákban helyezkedik el; a sejtmagnak megfelelő területek pedig nem festődtek. A GusB szubsztrát fluoreszcencia intenzitása erősebbnek mutatkozott az OA-s SFben, mint az RA-s betegekből izolált sejtekben (10. ábra). A NAG szubsztrát fluoreszcencia intenzitása jóval erősebb a GusB szubsztráténál. A NAG festődés az RA-s fibroblasztokban intenzívebb, mint az OA-s fibroblasztokban (10. ábra).
10. ábra: Glikozidázok enzimhisztokémiai kimutatása SF-ben. A GusB és NAG enzimek aktivitásának kimutatása RA-s és OA-s SF monolayereken fluorogén szubsztrátok segítségével.
4.1.4. A citokinek és az NO hatása az SF-ek glikozidázainak génexpressziójára és enzimaktivitására Különböző citokinek és az NO glikozidáz génexpresszióra gyakorolt hatását vizsgáltuk. A stimulálatlan mintákban a gének HGPRT-hez viszonyított relatív génexpresszióját minden esetben 100%-nak tekintettük.
59
Amint a 11.A és 12.A ábrákon látható a TGF-1 szignifikánsan csökentette a HexA, HexB, valamint a GusB és Hc-gp 39 gének expresszióját. Az RA-s sejtekben jóval kifejezettebb volt a szupresszió mértéke, mint az OA-s minták esetében (11.A és 12.A ábrák). A legerősebb dózis-függő downregulációt a Hc-gp 39 gén esetében tapasztaltunk. A TNF- csökkentette az RA-s fibroblasztok Hc-gp-39, HexB és GusB (11.B ábra), valamint az OA-s SF HexA génexpressziót (12.B ábra). Az IL-1 szupresszív hatása az RA-s minták HexA, HexB és GusB gének esetében figyelhető meg (11.C ábra), míg az OA-s sejtek génexpressziójára nincs hatással (12.C ábra). Az utolsóként tesztelt citokin az IL-17 volt. Amint a 11.D és 12.D ábrán látható, az RA-s SF-ben a HexB és GusB gének expreszióját szignifikánsan csökkentette, míg az OA-s SF-ek glikozidázainak expresszióját nem változtatta. Végül megvizsgáltuk azt is, hogy az NO milyen mértékben képes szabályozni a fibroblasztok glikozidázainak expresszióját. Tapasztalataink szerint az NO donor NOC-18 jelenléte nem befolyásolta a vizsgált gének expresszióját a Hc-gp 39 gén kivételével, melynek downregulációját figyelhettük meg az OA-s SF-ben (11.E és 12.E ábrák). Az RA-s fibroblasztok Hyal1 expresszióját szignifikánsan csökkentette az 50 ng/ml TGF-1, illetve a 10 ng/ml koncentrációjú IL-17 kezelés. Pozitív kontrollként az MMP1 és MMP3 expressziójának citokinek általi indukcióját teszteltük. Az RA-s fibroblasztokban az MMP3 expressziója minden esetben legalább négyszeres emelkedést mutatott. Az NOC-18 nem változtatta az MMP-k expresszióját.
60
11. ábra: Rheumatoid arthritises fibroblasztok glikozidázainak génexpressziója citokin és NOC-18 kezelést követően. Az RA-s fibroblasztokat citokinek és NO donor jelenlétében vagy hiányában 24 órán keresztül stimuláltuk, majd meghatároztuk a glikozidázok relatív génexpresszióját (HGPRT-hez viszonyított). A stimulálatlan minták génjeinek relatív expresszióját minden esetben 100%-nak tekintettük. A: TGFβ1 stimuláció (n = 4). B: TNFα stimuláció (n = 6). C: IL-1β stimuláció (n = 4). D: IL-17 stimuláció (n = 4). E: NOC-18 stimuláció (n = 3). *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.0015 (paired t test).
61
12. ábra: Osteoarthritises fibroblasztok glikozidázainak génexpressziója citokin és NOC-18 kezelést követően. Az OA-s fibroblasztokat citokinek és NO donor jelenlétében vagy hiányában 24 órán keresztül stimuláltuk, majd meghatároztuk a glikozidázok relatív génexpresszióját (HGPRT-hez viszonyított). A stimulálatlan minták génjeinek relatív expresszióját minden esetben 100%-nak tekintettük. A: TGFβ1 stimuláció (n = 6). B: TNFα stimuláció (n = 6). C: IL-1β stimuláció (n = 3). D: IL-17 stimuláció (n = 3). E: NOC-18 stimuláció (n = 3). *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.0015 (paired t test).
62
Mivel a legtöbb citokin génexpresszióra gyakorolt hatása viszonylag kismértékű volt a TGF-1 hatásához képest, ezért a továbbiakban a TGF-1 NAG és GusB enzimek aktivitására gyakorolt hatását vizsgáltuk. Az enzimek aktivitását a fibroblaszt lizátumokban és a sejtek felülúszóiban is megmértük. NAG aktivitást többnyire a fibroblasztokban tapasztaltunk (13.A ábra). A TGF-1 hatására sem a sejt lizátumok, sem a felülúszók aktivitása nem változott (13.A és B ábra). Ezzel szemben a GusB aktivitást legnagyobbrészt a fibroblasztok 24 órás felülúszóiban mértük, míg magukban a sejtekben csak minimális GusB aktivitást észleltünk (13.C és D ábra). Habár az SF lizátumok GusB aktivitása nem változott TGF-1 hatására, az 50 ng/ml TGF-1 kezelés szignifikánsan csökkentette a szekretált enzim aktivitását a felülúszókban (13.D ábra).
13. ábra: Az RA-s és OA-s betegek fibroblasztjainak (n = 6) és a sejtek felülúszóinak enzimaktivitása TGF- 1 kezelést követően. A: NAG aktivitás SF lizátumban, B: NAG aktivitás SF felülúszóban, C: GusB aktivitás SF lizátumban D: GusB aktivitás SF felülúszóban. A NAG aktivitást többnyire az SF-ben észleltünk, míg a GusB aktivitás a sejtek felülúszójában volt kifejezett. P <0.01 ***
63
4.1.5. A HexDC expressziójának és aktivitásának vizsgálata Sikerült kimutatnunk a közelmúltban leírt HexDC gén expresszióját is az RA-s és OA-s szinoviális membrán és szinoviális fibroblasztokban. A génexpresszió mértéke nem tért el lényegesen az RA-s és OA-s, illetve az SM és SF minták között (14. ábra)
14. ábra: A HexDC gén expressziója RA-s és OA-s SM és SF-ben. A vizsgált mintáinkban kimutatható a HexDC gén expressziója, melynek szintje körülbelül azonos az SM és SF-ben. A TGF-1 citokin hatására mind az RA-s, mind az OA-s SF-ek HexDC expressziója dózisfüggő módon lecsökkent (15. ábra).
15. ábra: RA-s és OA-s SF-ek HexDC expressziója TGF-1 hatására. A TGF-1 kezelés szignifikánsan lecsökkentette a szinoviális fibroblasztok HexDC expresszióját.
64
Ha az SF-ben a TGF-1 N-acetil-galaktózaminidáz aktivitásra gyakorolt hatását mértük, hasonló dózisfüggő változásokat tapasztaltunk, azzal a különbséggel, hogy míg az OA-s SF-ek aktivitása továbbra is csökkent, addíg az RA-s SF-ek aktivitása dózisfüggően megemelkedett a citokin kezelés hatására. Ezt a jelenséget a sejtek lizátumaiban és a felülúszóikban is sikerült kimutatni (16. ábra).
16. ábra: Szinoviális fibroblasztok és felülúszóik N-acetil-galaktózaminidáz aktivitása TGF-1 hatására. Az OA-s SF-ben és felülúszóikban dózis-függő módon csökkent, míg az RA-s SF-ben és azok felülúszóiban dózis-függő módon emelkedett az N-acetil-galaktózaminidáz aktivitása. (S/N=felülúszó)
65
4.1.6. SF-eredetű MV-k és az MV-kel asszociált GusB és NAG aktivitás vizsgálata Megvizsgáltuk, hogy a SF-ek jelentősebb (NAG és GusB) glikozidázai jelen vannake az RA-s és OA-s SF felülúszóiból izolált membrán vezikulákban. Kromogén szubsztrátok segítségével kimutattuk mindkét enzim aktivitását a sejt-eredetű MVben. A 17.D ábrán jól látható, hogy a NAG aktivitása többnyire a sejtekre korlátozódik, az MV-ben viszonylag gyenge aktivitást mértünk. Ezzel szemben a GusB vezikulákban mért aktivitása igen magasnak mutatkozott, és ez az aktivitás hasonló mértékű volt a sejtekben tapasztalt aktivitáshoz képest (17.E ábra).
66
17. ábra: SF-eredetű MV-k GusB és NAG aktivitásának vizsgálata. A: SF-eredetű MV-ket a fibroblasztok 24 órás felülúszójából ultracentrifugálással izoláltuk. Az elektron mikroszkópos ábrán jól láthatók a különböző méretű és morfológiájú vezikulák, melyek közül az ektoszómák tűnnek a domináns MV típusnak (100-800 nm átmérő). B: PBS kontroll áramlási citometriás szórási képe. SSC-H (side scatter, oldal szórás), FSC-H (forward scatter, előre szórás). C: SF-ek 24 órás felülúszójában
67
található MV-k jelenlétének bemutatása. D: A NAG E: és GusB enzimek aktivitását RA-s (n = 4) és OA-s (n = 5) SF-ek lizátumaiban és a fibroblasztok felülúszóiból izolált vezikulákban határoztuk meg kromogén szubsztrátok segítségével, 5 μg fehérjére standardizálva Míg a NAG aktivitása többnyire a sejtekre korlátozódik (D), az MV-ben viszonylag gyenge aktivitást mértünk. Ezzel szemben a GusB vezikulákban mért aktivitása igen magasnak mutatkozott, mely a sejtekben tapasztalt aktivitással összevethető mértékű (E).
68
4.2. GAG-ellenes természetes autoantitestek vizsgálata rheumatoid arthritisben
4.2.1. GAG-ellenes antitestek kimutatása szérum mintákból Az 1. táblázat az újszülött, a felnőtt egészséges kontroll és RA-s betegek szérum mintáiban meghatározott GAG-ellenes IgM és IgG antitestek koncentrációját tartalmazza. A köldökzsinór vérmintákban a kimutathatóság határán volt az említett antitestek szintje. Ez tulajdonképpen várható volt, hiszen az irodalomban már korábban utaltak a köldökzsinór vér össz IgM rendkívül alacsony koncentrációjára (Koga és mtsai; 2001). A kontroll és köldökzsinór vérminták között az anti-GAG antitest koncentrációjának különbsége szignifikánsnak mutatkozott (F = 110.70; DF = 1.77; p <0.001) (F: F-statisztika, DF: degree of freedom). A kezdeti statisztikai analízis azt mutatta, hogy az RA-s betegek szérum mintájában szignifikánsan magasabb (F = 30.17; DF = 1.11; p <0.001, az antigén és antitest típusától függetlenül) a GAG-ellenes antitestek szintje a kontroll szérumbeli értékekhez képest (1. táblázat). Antitest μg/ml
Köldökzsinór szérum
Kontroll szérum
RA beteg szérum
Átlag ± SEM
Átlag ± SEM
Átlag ± SEM
Anti-CSA IgM Anti- CSB IgM Anti-CSC IgM Anti-KS IgM
1,63 ± 0,3 1,36 ± 0,2 1,73 ± 0,4 1,63 ± 0,2
1225,27 ± 354,2 1300,61 ± 389,2 1964,34 ± 461,7 836,87 ± 321,3
Anti-HS IgM Anti-HA IgM
2,27 ± 0,4 1,27 ± 0,2
750,95 ± 343,1 608,00 ± 302,3 673,70 ± 305,7 275,11 ± 184,5 1115,91 ± 383,0 4,32 ± 0,9
Anti- CSA IgG Anti- CSB IgG Anti- CSC IgG
1,54 ± 0,4 1,77 ± 0,8 1,27 ± 0,1
872,79 ± 310,7 1551,62 ± 417,2 717,86 ± 273,3
Anti-KS IgG
4,91 ± 4,3
Anti-HS IgG Anti-HA IgG
4,05 ± 3,8 1,09 ± 0,2
203,09 ± 89,1 508,07 ± 215,9 241,53 ± 176,3 1871,63 ± 481,1 1066,59 ± 326,7 960,93 ± 365,3
2605,36 ± 516,8 14,18 ± 4,5
2704,11 ± 525,2 2689,71 ± 515,8 1227,82 ± 379,3
1. táblázat: Szérum GAG-ellenes antitestek. Az anti-CSC és össz IgM szintek arányának átlaga 4.68 ± 3.15% (tartomány: 0.17 21.33%), míg az anti-CSC és totál IgG szint arányának átlaga 0.83 ± 0.73%
69
(tartomány: 0.1 - 14.29%) a beteg csoportban. A kontroll csoportban az anti-CSC és totál IgM szintek arányának átlaga 6.59 ± 3.04% (tartomány: 1.77 - 22.97%), míg az anti-CSC és totál IgG szint arányának átlaga 1.57 ± 1.36% (tartomány: 0.13 - 0.58%.
4.2.2. A GAG-ellenes antitestek kimutatása szinoviális folyadékból A GAG-ellenes antitestek szintje a szérum mintákban szignifikánsan magasabb volt, mint az SFl-ben (három-változós ANOVA, p <0.001). Szignifikáns korrelációt találtunk a szérum és szinoviális folyadék IgM antitestjeinek koncentrációja között (r = 0.71, p <0.001), ugyanakkor az IgG antitestek nem mutattak hasonló korrelációt (r = 0.13, 18. ábra). Az IgM antitestek szinoviális folyadék/szérum arányai: CSA 0.15 ± 0.04; CSB 0.23 ± 0.06; CSC 0.37 ± 0.19; KS 0.25 ± 0.10; HS 0.26 ± 0.13 és HA 0.75 ± 0.3. Az IgG antitestek szinoviális folyadék/szérum arányai: CSA 4.22 ± 6.53; CSB 1.75 ± 2.34; CSC 19.4 ± 30.84; KS 4.34 ± 6.46; HS 8.10 ± 9.40 és HA 1.32 ± 1.63.
18. ábra: A glükózaminoglikán-ellenes IgG és IgM antitestek RA-s szérum és szinoviális
folyadék
közötti
megoszlásának
korrelációja.
Rendkívül
erős
statisztikailag szignifikáns korrelációt találtunk a szérum és SF-beli GAG-ellenes IgM antitestek koncentrációja között (p <0.001). Az IgG antitestek vizsgálatakor nem találtunk hasonló szignifikáns korrelációt. (r = 0.13, NS).
70
4.2.3. Anti-GAG antitestek, mint betegség markerek A fenti elemzések során a betegek csoportját homogénnek tekintettük a mintavétel pillanatában fennálló betegség aktivitását illetően. Nagyon jól ismert, hogy az RA fluktuáló betegség, melynek során a biológiai markerek jól tükrözik a beteg pillanatnyi állapotát (Inoue és mtsai, 2007). A fenti statisztikai elemzések során nem derült ki, hogy a GAG-ellenes antitestek mint biomarkerek csak betegségspecifikusak, vagy akár a betegség állapotára is specifikusak lennének. Egy betegségspecifikus biomarker alkalmas a betegek és egészséges személyek elkülönítésére, ezzel szemben a betegség állapotára specifikus marker a betegek közt tesz különbséget azok állapotának megfelelően. Annak eldöntésére, hogy az általunk vizsgált antitestek betegség-specifikus, vagy a betegség állapotára specifikus biomarkerek, a betegeket a DAS28 indexeik alapján csoportosítottuk (Prevoo és mtsai, 1995). A GAG-ellenes antitestek koncentrációja és a DAS28 score közötti összefüggés vizsgálatakor a célunk az volt, hogy találjunk a vizsgált 12 GAG-ellenes antitest között egy vagy több olyan antitestet, mely az egész adathalmazzal azonos információt hordoz. Ilyen reprezentatív változók keresése ésszerű stratégiának tűnik ebben az esetben, amikor a változók ilyen szorosan korrelálnak egymással. Amint a 19. ábra mutatja, a GAG-ellenes antitestek koncentrációja pozitívan korrelál egymással, mely korreláció különösen erős volt az IgM molekulák esetén (minden esetben magasabb a korrelációs koefficiens 0.8-nál).
71
19. ábra: A GAG-ellenes antitestek koncentrációjának (μg/ml) korrelációs mátrixa. A logaritmikusan transzformált antitest koncentrációkat egymással szemben ábrázoltuk. Az ábrán erős korreláció látható a GAG-ellenes antitest szintek között, mely az IgM molekulák esetén különösen erős. Ezen megfigyelésünket statisztikai analízissel is alátámasztottuk, ahol a GAG-elles IgM antitestek közötti korrelációs koefficiensek értéke 0.86-nál nem volt alacsonyabb. A stepwise logistic regresszió során elsőként öt GAG-ellenes antitestet választottunk ki, melyek jó betegség markerek RA-ban: anti-KS IgG, anti-HS IgG, anti-CSC IgM, anti-CSB IgM és anti-HA IgM. Ezt követően stepwise ordinal regresszió segítségével kiválasztottuk azokat a GAG-ellenes antitesteket, melyek különbséget tesznek a különböző DAS score-al rendelkező betegek között. Az első lépésben kiválasztott öt lehetséges jelölt közül négyet elvetettünk a második lépés során, így végül csak a CSC-ellenes IgM maradt meg. Hipotézisünket ANOVA-t követő Tukey's post-hoc teszttel támasztottuk alá (20.A ábra). A CSC-ellenes IgM koncentrációja szignifikánsan magasabb volt RA-s betegekben, mint a kontrollokban (F = 6.17, DF = 1,93; p <0.02), mely a betegség állapotára specifikus markernek bizonyult (20.B ábra). Értéke szignifikánsan magasabb a betegség inaktív stádiumában lévő (DAS 28
72
<3.2) RA-s betegekben, szemben a kontrollokkal, illetve a betegség aktív stádiumában lévő RA-s betegekkel (p <0.05, ANOVA majd Tukey's post-hoc test). A kontrollok és az RA aktív stádiumában lévő betegek között nem volt szignifikáns eltérés. Hasonló összefüggést találtunk, amikor a betegség aktivitása, a CRP és a CSC-ellenes antitestek koncentrációja közti kapcsolatot elemeztük. Mivel a CRP értéke szignifikáns emelkedést mutat a DAS score értékének növekedésével (F = 4.64, DF = 2.34; p <0.02) (20.C ábra), ezért inverz korrelációt sejtettünk a betegség aktivitása és a szérum CSC-ellenes IgM szintje között. Ezen összefüggés igazolása érdekében a betegeket alacsony, közepes és magas CRP értékkel rendelkező csoportokba osztottuk, úgy, hogy mindhárom csoport nagyjából azonos számú betegből álljon. Sikerült igazolnunk az inverz összefüggést, habár a CSC-ellenes IgM szintje csak az alacsony és közepes CRP-vel rendelkező csoportok esetében mutatott szignifikáns különbséget (F =3.65, DF =2.45; p <0.05) (20.D ábra). Ezen eredmények alapján ismét összehasonlítottuk az RA-s és kontroll személyek GAG-ellenes antitestjeinek szintjét, de most a betegeket a DAS score alapján csoportosítottuk. Az analízis megerősítette eredményeinket. A három-változós variancia analízis segítségével igen magas szignifikáns különbséget észleltünk az alacsony (F = 0.3 DF = 1.71; p <0.001) és közepes (F = 33.35, DF = 1.91) DAS score-al rendelkező betegek esetén. Az 5.1, vagy annál magasabb DAS score-al rendelkező betegek és a kontrollok között nem láttunk eltérést (F = 0.22, DF = 1.79).
73
20. ábra: A CSC-ellenes IgM korrelációja az RA-val és a betegség aktivitását jelző markerekkel. A: Kontroll és RA-s betegek CSC-ellenes IgM logaritmukusan ábrázolt koncentrációja. A box-ban látható vonal a median értéket mutatja. Maguk a box-ok a 25 és 75% közötti intervallumot mutatják. A függőleges vonalak végei a minimum és maximum értékeket képviselik. A kontroll (n = 55) és RA-s betegek (n = 66) közötti különbség statisztikailag szignifikáns (p <0.02, F-test). B: CSC-ellenes IgM koncentrációja kontroll személyekben és a betegség aktivitását jelző DAS28 score alapján csoportosított RA-s betegekben. A DAS 1 (n = 6) csoport betegeinek CSCellenes IgM koncentrációja szignifikánsan magasabb, mint a kontroll csoport, vagy a DAS 2 (n = 22) és DAS 3 (n = 18) csoport betegeinek. Más szignifikáns különbséget nem tapasztaltunk (p <0.05, post-hoc Tukey's test). Ez az eredmény a CSC-ellenes IgM molekulát betegség aktivitás-specifikus markerként tűnteti fel. C: CRP szint és DAS score közötti összefüggés RA-s betegekben. A függőleges tengelyen a CRP koncentrációját logaritmikusan ábrázoltuk. Szignifikáns különbséget csak a DAS 1 és
74
3 csoportok között találtunk (p <0.05, post-hoc Tukey's test). D: CSC-ellenes IgM koncentrációja kontroll személyekben és a CRP szint alapján csoportosított (alacsony CRP: n = 17; közepes CRP: n = 16; magas CRP: n = 16) RA-s betegekben. A CSCellenes IgM titer a CRP koncentrációjának emelkedésével csökken. Az alacsony és közepes CRP-vel rendelkezők csoportjában statisztikailag szignifikáns volt a különbség (p <0.05, post-hoc Tukey's test).
4.2.4. A GAG-ellenes antitestek és az RF közti reláció Az RA-s betegek szérumában szignifikánsan magasabbnak találtuk az IgG és IgM RF szintet a kontroll szérumhoz képest (unpaired t-test, p <0.001). A különböző antitestekkel, vörösvértest süllyedés szinttel és CRP értékekkel való összevetést követően a legmagasabb korrelációs koefficienst a CSC-IgM és az RF (IgG és IgM) koncentrációja között találtunk (RA-s betegek IgG: r = 0.384 és IgM: r = 0.388).
4.2.5. A CSC-IgM és az anti-CCP antitestek közötti összefüggés Az anti-CCP antitestek megbízható prognosztikus és diagnosztikus markerek RAban. Ahogyan már mások is leírták (Morozzi és mtsai, 2007), az anti-CCP antitest koncentrációja a mi mintáinkban sem korrelált a DAS28 score-al (one-way ANOVA, F = 1.24, DF = 2.34). Továbbá nem találtunk szignifikáns eltérést az anti-CCP és CSC-IgM antitestek szintje között (r = 0.08).
4.2.6. A GAG-ellenes antitestek keresztreakciója más típusú GAG-al, peptidoglikánokkal és gomba eredetű poliszaharidokkal A GAG-ellenes antitestek kereszt-reaktivitásának vizsgálata érdekében, az antitestek különböző GAG-ok közötti, illetve a GAG-ok és peptidoglikánok vagy gomba eredetű poliszaharidok közötti antitest kötődésnek in vitro kereszt-gátolhatóságát teszteltük. Széleskörő keresztreaktivitást találtunk a különböző GAG típusok között. Meglepő módon tapasztaltuk, hogy a B. subtilis eredetű peptidoglikán meggátolta az antitestek GAG-okhoz való kötődést. Az RA-s szérum IgM értékek 3.1%, 23.0% és 32.3%; az RA-s szérum IgG értékek 9.3%, 20.6% és 39.4%; a kontroll szérum IgM értékek 1.4%, 9.7% és 12.5%; míg a kontroll szérum IgG értékei 22.1%, 22.1% és
75
33.8%, a gátló molekula 0.5 μg/μl, 5 μg/μl és 50 μg/μl koncentrációja mellett. Az RA-s szérum antitestek esetében hasonló IgM keresztreakciót figyeltünk meg a GAGok és a Zymosan között (CSA: 2.9%, 10.7% és 36.4%; CSB: 11.8%, 19.7% és 40.5%; CSC: 12.6%, 17.5% és 48.3%; KS: 11.8%, 23.5% és 50.6%; HS: 4.5%, 11.7% és 22.1%; HA: 15.0%, 20.7% és 33.0%-os gátlást észleltünk 0.5 μg/μl, 5 μg/μl és 50 μg/μl gátló molekula koncentrációk mellett).
4.2.7. A GAG-ellenes antitestek kötődésének gátlása anioncserélő gyantával Az antitestek gyengén savas ioncserélő gyantával történő előinkubációját követően drámai módon lecsökkent az antitestek GAG-okhoz való kötődése. Az RA-s szérum IgM antitestek következő GAG-okhoz való kötődését tudtuk gátolni a gyantával: CSA, CSB, CSC, KS, HS és HA (58.98% ± 0.88%, 59.56% ± 1.53%, 60.77% ± 2.17%, 59.93% ± 0.14%, 64.80% ± 1.76%, 45.95% ± 181.42%). Fontos megjegyezni, hogy a leggyengébb gátlást a HA, míg a legerősebb mértékű gátlást a HS esetében értük el (a vizsgált GAG-ok közül a legkevesebb és legtöbb negatív töltést hordozók) A Doulite-al IgG típusú GAG-ellenes antitestek kötődését is tudtuk gátolni a következő GAG-okhoz: CSA, CSB, CSC, KS, HS és HA (70.85% ± 0.05%, 58.57% ± 1.57%, 61.84% ± 0.60%, 64.49% ± 1.19%, 63.25% ± 2.1%, 62.60% ± 0.66%).
4.2.8.Glikozidázzal emésztett humán porc aggrekán antitestek általi felismerése Gyulladás és mikrobiális fertőzések során emelkedett lehet az ízületben a glikozidázok aktivitása (Ortutay és mtsai, 2003). Az aggrekán hialuronidáz általi emésztése 28% (p <0.05), illetve 42%-al (p <0.001) növelte az RA-s szérum és szinoviális folyadék aggrekánnal szembeni IgM reaktivitását (21. ábra). Hasonlóan, 21% (p <0.05) és 22%-al (p <0.01) növelte az RA-s szérum és szinoviális folyadék aggrekánnal szembeni IgM reaktivitását a molekula β-galaktozidázzal történő emésztése. Ugyanakkor, sem a hialuronidáz, sem a β-galaktozidáz emésztés nem változtatta meg a kontroll szérum IgM reaktivitását. Az aggrekán hialuronidáz emésztését követően csak az RA-s szinoviális folyadék IgG molekuláinak emelkedett szignifikánsan a reaktivitása (31%, p <0.05). Bár a kontroll IgG antitestek 28%-al erősebb reaktivitást mutattak a hialuronidázzal emésztett aggrekánnal szemben, a β-
76
galaktozidáz-emésztett
aggrekánnal
szembeni
reaktivitásuk
egyáltalán
nem
növekedett meg (21. ábra).
21. ábra: Glikozidázzal emésztett humán porc aggrekán antitestek általi felismerésének vizsgálata. Az emésztetlen, natív aggrekánnal szembeni antitest felismerést tekintettük 100%-nak. Legerősebb reaktivitás növekedést az RA-s szérum és szinoviális folyadék IgM molekulái mutattak a hialuronidáz és β-galaktozidáz emésztett aggrekánnal szemben.
4.2.9. Szénhidrát-felismerő mintázatok meghatározása Az egyedi szénhidrát-felismerő mintázat meghatározására Glycochip rendszert használtunk. Öt RA-s és kontroll szérum IgG molekuláit teszteltük a Glycochip-en. Bár az RA-s IgG reaktivitása számos szénhidráttal szemben erősebb volt (Gal (a), Man (a), GlcA (b), Gal (b1-3) [GlcNAc (b1-6)] GalNAc (a)), mint a kontroll IgG esetében, de RA-ra specifikus szénhidrát-felismerési mintázatot nem sikerült azonosítanunk.
77
4.2.10. Szénhidrát-specifikus antitestek kötődése a porc mátrixhoz Végül megvizsgáltuk a hialinporc ECM-hez való GAG-ellenes antitestkötődést. A hialinporc ECM-hez való viszonylag erős szérum antitestkötődést jelentős mértékben gátolta a különböző mennyiségű CSC-vel történő elő-inkubáció (22. ábra).
22. ábra: A GAG-ellenes antitestek hialinporc extracelluláris mátrixhoz való kötődésének vizsgálata. A fényképek (A) az RA-s szérum antitestjeinek humán porchoz való kötődését mutatják. A reaktivitást gátlása céljából a szérum mintákat 2 mg/ml (B) és 4 mg/ml (C) CSC-vel inkubáltuk elő. 100x nagyítás
78
4.3. T-sejt aktiváló peptidek és citrullinált változataik perifériás vérsejtek IL-17 termelésére gyakorolt hatásának vizsgálata
4.3.1. A kontrollok és az RA-s betegek aggrekán és HLA peptidekre adott IL-17 válasza Elsőként megvizsgáltuk az aggrekán és HLA DRB1 peptidekkel (2. táblázat) végzett in vitro stimuláció hatását a kontroll és RA-s betegek PBMC-inek IL-17 szekréciójára. A szintetikus peptidek hiányában közel azonos volt a kontroll és beteg személyek IL-17-et termelő spot képző sejtjeinek száma (23. ábra). Az SE szekvenciát nem hordozó ATE peptid jelenlétében sem változott az IL-17 spot formáló sejtek száma (23. ábra). E mellett sem a kontrollok, sem a betegek nem reagáltak a HLA DRB1 humán peptidre. Ezzel ellentétben, szignifikánsan megemelkedett az RA-s betegek IL-17-szekretáló spot formáló sejtjeinek száma az SE-t hordozó humán proteoglikán aggrekán P135-ös epitópja hatására. A normál kontroll személyek PBMC-i azonban nem mutattak ilyen jellegű változást.
23. ábra: A PBMC-k szintetikus peptidekre adott IL-17 válasza. Az ábra az ELISPOT eredmények alapján az IL-17-et szekretáló spot formáló sejtek egy lyukra eső számának átlagát mutatja ± átlageltérés. RA-s (n=15) és kontroll személyek (n=15) perifériás vér mononukleáris sejtjeit 24 órán keresztül inkubáltuk 25μg/ml
79
szintetikus peptid jelenlétében, vagy a peptidek nélkül (médium). Az ATE peptid a humán aggrekán molekula core proteinjének N-terminális peptidje, mely nem hordozza a shared epitópot (2. táblázat). A HLA peptid a HLA DRB1 molekula shared epitópot hordozó szintetikus peptidje. A P135 a humán aggrekán core protein C-terminálisának shared epitópot hordozó peptidje. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001.
4.3.2. A kontrollok és az RA-s betegek sejtjeinek IL-17 válasza különbözően citrullinált peptidvariánsokra Ezt követően megvizsgáltuk, hogy az arginint tartalmazó peptidek (ATE vagy P135) valamint a HLA DRB1 peptid citrullinációja hogyan befolyásolja ezen módosított peptidek IL-17-et termelő sejtek általi felismerését. Ehhez a vizsgálathoz RA-s és kontroll személyek perifériás véréből izolált mononukleáris sejteket stimuláltunk a szintetikus peptidek különböző módon citrullinált variánsaival. Az RA-s és kontroll csoportok között nem találtunk különbséget a citrullinált peptid variánsok és a vad típusú peptidek IL-17-et szekretáló sejtek általi felismerésében. Ezzel szemben, elkülöníthető volt egy-egy alcsoport mind az egészséges kontrollok (n=5), mind az RA-s betegek (n=6) csoportján belül, melyeknek tagjai a csoport többi tagjától teljesen eltérően reagáltak a peptidekre. Ezen alcsoportokon belüli személyek sejtjeinek IL-17 expressziója szignifikánsan megemelkedett a citrullinált P135 hatására (24.A és B ábra). A P135 peptidbeli citrullinok számának növekedésével párhuzamosan emelkedett az IL-17 spot formáló sejtek száma (24.A és B ábra). A kontrollok és betegek ezen „citrullináció-szenzitív” alcsoportjának IL-17 válasza azonban nem mutatott szignifikáns eltérést, sem az SE-t hordozó HLA DRB1 vad típusú és citrullinált peptidek (24.C és D ábra), sem az SE-t nem hordozó ATE peptidek hatására (24.E és F ábra). Az ELISPOT assay során mért IL-17 sejtes forrásának felderítése érdekében öt-öt random módon kiválasztott kontroll és RA-s beteg szintetikus peptiddel stimulált PBMC-it festettük intracelluláris IL-17-re, majd áramlási citometriával vizsgáltuk. Közülük csak az 5-ös számú RA-s beteg, valamint az 1-es számú kontroll személyek tartoztak a „citrullináció-szenzitív” alcsoportba. Az ELISPOT eredményeknek megfelelően, a limfocita kapun belül csak ezen két személy sejtjei mutattak emelkedett intracelluláris IL-17 festődést a P135 peptid citrullinált variánsaival
80
történő in vitro stimulációt követően. Bár szignifikánsan alacsonyabb gyakorisággal, de a monocita kapun belül is találtunk IL-17 pozitív sejteket, melyek átlagos fluoreszcencia intenzitása is jóval alacsonyabb volt, mint amit a limfocita kapun belüli sejtek esetén mértünk (p <0,001 mindkét esetben). Az IL-17 termelő limfociták altípusainak további karakterizálására megvizsgáltuk a CD56+ NK-sejtek, γδ Tsejtek, CD3+/CD8+ valamint CD3+/CD4+ T-sejtek intracelluláris IL-17 festődését. Bár a CD56 + NK-sejtek, a γδ T-sejtek, és a CD3+/CD8+ T-sejtek IL-17 festődése elhanyagolható mértékű volt, a CD3+/CD4+ T-sejtekben sikerült IL-17 festődést detektálni, melynek mértéke fokozódott, ha előzetesen in vitro citrullinált P135 peptidekkel stimuláltuk. Ezek alapján azt feltételezzük, hogy a peptid stimuláció hatására tapasztalt IL-17 válaszért a Th17 sejtek felelősek.
81
24. ábra: A kontrollok és az RA-s betegek „citrullináció-szenzitív” alcsoportjának IL-17 válasza a különböző módon citrullinált peptid epitópokra. IL-17 ELISPOT assay segítségével határoztuk meg az egészséges kontrollok (A, C és E) valamint az RA-s betegek (B, D és F) spot formáló sejtjeinek számát. A reaktivitást vad típusú és citrullinált szintetikus peptid variánsokkal (25μg/ml) szemben vizsgáltuk. P135: shared epitóp szekvenciát hordozó humán aggrekán peptid (A és B). HLA: shared epitóp szekvenciát hordozó HLA DRB1 peptid (C és D). ATE: shared epitóp szekvenciát nem hordozó humán aggrekán core protein peptid (E és F). X: citrullinra
82
cserélt arginin aminosav. SI: stimulációs index, melyet a spot formáló sejtek számának és a stimulált vagy stimulálatlan well-ek hányadosából képezünk. * p 0.05, ** p 0.01, *** p 0.001.
4.3.3. Szintetikus peptidekkel stimulált PBMC-k Th1/Th2 citokin termelése Egészséges kontrollok (n=4) és RA-s betegek (n=4) PBMC-inek peptiddel stimulált és stimulálatlan felülúszóiból határoztuk meg a Th1/Th2 citokineket. Szignifikáns eltérést csak az IL-4 esetében találtunk (a 4-szeresen citrullinált P135 hatására: átlag±átlageltérés: 238.86 ± 3.04 pg/ml a kontroll csoportban és 22.66 ± 1.64 pg/ml az RA-s betegekben; p <0.01, t test) az RA-s és kontroll csoportok Th1/Th2 citokin termelésének összehasonlítása során. A négy vizsgált RA-s betegen kívül a 4-es számú betegben látványosan megemelkedett az IFNγ termelés mértéke a citrullinált P135 hatására. A stimulációs indexek ebben az esetben (a peptid-stimulált és a stimulálatlan lyukak IFNγ koncentrációinak aránya): 2.33, 3.32, 10.95, 8.18 és 2.42 volt a P135, P135 1X, P135 2X, P135 3X és a P135 4X peptidek hatására. A kontrollok közül a 12-es számú személy stimulációs indexe is emelkedett INFγ termelésre utal a citrullinált peptid ligandok jelenlétében (0.43, 1.19, 2.27, 1.01 a P135, P135 1X, P135 2X, P135 3X és P135 4X peptidek hatására).
4.3.4. Az egészséges kontrollok és RA-s betegek perifériás vérsejtjeinek immunfenotípizálása Az RA-s betegek és kontroll személyek perifériás vér mononukleáris sejtjeinek fenotipizálása során nem találtunk különbséget a CD3+, CD4+, CD8+ T-sejtek gyakoriságában. Az RA-s személyekben szignifikánsan kevesebb CD4+/CD25high természetes reguláló T-sejtet találtunk (p=0.02, t test).
4.3.5. HLA genotipizálás A továbbiakban azt is megvizsgáltuk, hogy a kontrollok és a betegek hordozzák-e a shared epitóp szekvenciával rendelkező HLA DRB1 alléleket. A genotipizálás eredményei az 1. táblázatban tekinthetők meg. A kontrollok között egy személy hordozta a HLA DRB1* 1001 allélt, két személy hordozta a HLA DRB1* 0401 allélt, 83
és egy személy hordozta a HLA DRB1* 0404 allélt. Két további személy a DRB1*0101/0102 alléleket hordozta. Az RA-s betegek közül öt beteg hordozta a HLA DRB1* 0401 allélt, három beteg a HLA DRB1* 0408, továbbá egy beteg a HLA DRB1*0403 allélt hordozta. Egy betegünk heterozigóta volt a HLA DRB1 0401/0408 allélre. Nem találtunk összefüggést az SE-t tartalmazó genotípus és az SEt hordozó peptid szekvenciák citrullinációjára adott válasz között.
4.3.6. Szérum antitestek reaktivitása a különbözőképpen citrullinált HLA és aggrekán peptidekkel szemben. A kontrollok és RA-s betegek keringő antitestjeinek citrullinált és citrullinálatlan szintetikus peptidekkel szembeni reaktivitását vizsgáltuk. A P135 peptid kétszeresen és háromszorosan (P135 2X és P135 3X) (2. táblázat) citrullinált változatai a kontroll szérum antitestek reaktivitásának jelentős csökkenését eredményezték, az RA-s betegek antitestjeinek szintje azonban nem változott jelentős mértékben (25.A ábra). A reaktivitást a HLA peptid variánsokkal szemben is megvizsgáltuk. Az SE-t hordozó HLA DRB1 peptid kétszeresen citrullinált változata mind az RA-s betegekben, mind a kontrollokban csökkentette az antitestek válaszát (25.B ábra). Az ATE aggrekán peptid esetében az egyszeresen citrullinált változatok (ATE XR vagy ATE RX) hatására csökkent a kontroll szérum antitestek reaktivitása (2. táblázat). Bár az SE szekvenciát nem hordozó irreleváns peptidek sem natív, sem egyszeresen citrullinált (2. táblázat) formáiban nem okoztak változást, de a kétszeresen citrullinált variáns szignifikánsan megnövelte az RA-s betegek szérum antitestjeinek reaktivitását (25.C ábra). A „citrullináció-szenzitív betegek (24. ábra) és a kontrollok peptid-specifikus antitest szintje nem különbözött a többi RA-s beteg és kontrollok antitest szintjeitől.
84
25. ábra: Az RA-s betegek és kontrollok peptid-specifikus antitestjeinek szintje. A szintetikus peptideket kovalensen kötöttük a CovaLink lemezek felszínére, majd
85
ELISA-val meghatároztuk az RA-s betegek (n=15) és az egészséges kontrollok (n=15) szérum mintáinak peptidekkel szembeni reaktivitását. A szérum mintákat 1:100-as higításban használtuk. Az abszorbanciát 492 nm-en mértük. P135: a humán aggrekán shared epitóp szekvenciát hordozó peptidje (A). HLA: shared epitóp szekvenciát hordozó HLA DRB1 peptid (B). ATE: a humán aggrekán core protein shared epitópot nem hordozó peptidje (C). X: citrullinra cserélt eredetileg arginin aminosav. * p0.05, ** p0.01, *** p0.001.
86
4.4. RA-s és kontroll T-limfociták intracelluláris NO szintjének, citoplazmatikus Ca2+ koncentrációjának és mitokondrium-tömegének meghatározása Elsőként a keringő T-limfociták NO szintjét határoztuk meg áramlási citometriával. Eredményeink alapján elmondható, hogy a stimulálatlan T-sejtek kétszer annyi NOval rendelkeznek, mint az egészséges donorok sejtjei (p <0.001; 26.A ábra). Ezt követően megvizsgáltuk, hogy a megemelkedett NO szint hogyan befolyásolja a PBL működését. Mivel az NO fontos fiziológiai mediátora a mitokondrium biogenezisnek, megmértük az RA-s és egészséges kontroll T-sejtek mitokondriumainak tömegét, de nem találtunk szignifikáns eltérést a két csoport között (p = 0.651; 26.B ábra). További vizsgálataink kiterjedtek a PBL-ek citoplazmatikus Ca2+ szintjének meghatározására is. Az RA-s T-limfociták emelkedett NO szintje megnövekedett citoplazmatikus Ca2+ koncentrációval járt együtt (p <0.001; 26.C ábra), mely jelenség alátámasztja az NO citoplazmatikus Ca2+ szintet szabályozó szerepét felvető korábbi eredményeket (Nagy és mtsai, 2003, 2004, 2007). Következő kísérleteinkben arra kerestük a választ, hogy a TNFα mint az RA kiemelkedően fontos gyulladásos mediátora stimulálja-e a T-sejtek NO termelését. Ennek érdekében TNFα-val egy éjszakán át kezeltük a PBL-ket. A citokin hatására dózisfüggő módon emlkedett az NO termelés mértéke (p = 0.006). További elemzések során nem találtunk összefüggést az NO termelés, a mitokondrium tömeg, a citoplazmatikus Ca2+ szint és a betegség aktivitása között. Lehetőség adódott annak vizsgálatára, hogy in vivo milyen mértékben befolyásolja a TNFα jelenléte az RA-s betegek T-sejtjeinek NO termelését. Erre a célra 5 RA-s betegből gyűjtöttünk mintát infliximab kezelést megelőzően, illetve a kezelés második és hatodik hetében. Két héttel a kezelés megkezdése után nem tapasztaltunk változást az átlagos NO szintben, illetve két beteg esetében a T-sejtek NO termelésében átmeneti növekedést észleltünk. Ezzel szemben a hatodik hétre szignifikánsan lecsökkent az NO termelés a kiindulási szinthez képest (p = 0.005; 26.D ábra).
87
26. ábra: A: RA-s és kontroll T-sejtek NO termelése, melyet a DAF-FM festék relatív fluoreszcencia intenzitása mutat. A kontroll és RA-s PBL mitokondriumtömegét (B) és citoplazmatikus Ca2+ koncentrációját (C) a MitoTracker Green-FM és Fluo-3 festékek segítségével mutattuk ki. D: Anti-TNF terápiában részesülő RA-s betegek Tlimfocitáinak terápiát megelőzően, illetve a terápia során mérhető NO termelése.
88
4.5. Az eredmények rövid összefoglalása
27. ábra: A 4. fejezetben részletezett eredményeink közül a következőképpen foglalhatnánk össze a legjelentősebbeket: I. A glikozidázok expresszálódnak a szinoviális fibroblasztokban, és ezt a gyulladásos citokinek negatívan szabályozzák. II. Az RA-s szérumban emelkedett mennyiségben megtalálható GAG-ellenes antitestek közül az anti-CSC IgM az RA állapotára specifikus biomarker. III. Az SE-t hordozó P135 aggrekán peptid citrullinációja következtében fokozódott az RA-s és az egészséges kontrollok „citrullináció-szenzitív” alcsoportjában a perifériás vérsejtek IL-17 termelése. IV. Az RA-s T-limfocitákban emelkedett a NO termelés mértéke, mely a TNF-α citokin által szabályozható.
89
5. MEGBESZÉLÉS A porcmátrix károsításának rendkívül összetett folyamatában a széles körben tanulmányozott proteinázok működését jelentős mértékben befolyásolhatja a célfehérjék glikoziláltsága (Pratta és mtsai, 2000). Ezen felül, a porcmátrix proteoglikánok és glikoproteinek térszerkezetét és/vagy funkcióját is meghatározó oligoszaharid oldalláncok hasítására mind a proteázok, mind a glikozidáz enzimek képesek (Varki, 1993). Ezen nyilvánvaló ismeretek ellenére a rheumatológiai kutatások során kizárólag a proteinázok kerültek a figyelem középpontjába, és számos kutatócsoportnak sikerült bizonyítani a porc destrukcióban betöltött szerepüket (Little és mtsai, 2002; Burrage és mtsai, 2006; Primakoff és mtsa, 2000; Jones és mtsa, 2005; Solau-Gervais és mtsai, 2007). Mindeközben rendkívül kevés figyelemet fordítottak a szinoviális glikozidázok RA-ban betöltött szerepére. Az 1970-es években megjelenő tanulmányokat, melyek ízületi betegségekben emelkedett glikozidáz aktivitásról számolnak be (Bartholomew, 1972; Stephens és mtsai, 1975; Ganguly és mtsai, 1978), csak néhány beszámoló követte. Az RA-s szérumban és vizeletben megemelkedett GAG koncentrációt mértek (Volkova és mtsai, 1988). Emellett az RA-s SFl mérhető GAG szint megemelkedés pozitívan korrelált az érintett ízületek károsodásának mértékével (Engström-Laurent és mtsai, 1985), illetve az RA-s betegek ízületében a proteoglikán tartalom csökkenéséről is olvashatunk (CsSzabó és mtsai, 1995). I. Saját vizsgálataink során munkacsoportunk egy korábbi munkája során hialinporc degradálására képes exoglikozidázokat vizsgáltunk (Ortutay és mtsai, 2003). Majd Popko és munkatársai (Popko és mtsai, 2003, 2005, 2006, Pancewicz és mtsai, 2006; Popko és mtsai, 2008), illetve Shikhman kutatócsoportja közölte eredményeit (Shikhman és mtsai, 2000): ők magas hexózaminidáz aktivitásról számolnak be különböző reumatológiai betegségekben. Végül, a legfrissebb irodalmi adatok szerint emelkedett a heparanáz enzim aktivitása az RA-s SFl-ben és SM-ben (Li és mtsai, 2008). Míg az egyes proteinázok génszintű kifejeződése és szabályozhatósága rendkívül jól ismert a szinoviumban, addíg a glikozidázok szinoviumbeli génexpressziós mintázatáról nincs adat az irodalomban. Továbbá arról sincs adat, hogy az SF-ek glikozidázainak génexpresszióját hogyan szabályozzák a proinflammatorikus citokinek.
90
A Hc-gp 39 gén tekintetében robusztus génexpressziót tapasztaltunk az SM-ben, és ez az expresszió az SF-ben még kifejezettebb volt mind az RA-s, mind az OA-s betegekben. Az SF-ek emelkedett Hc-gp 39 expressziója szinoviumbeli expressziójuk gátlásával vagy az in vitro körülmények között megjelenő faktorok hatására bekövetkező upregulációjukkal magyarázható. Az ízületekben a glikozidázok közül a hexózaminidáz expresszióját és aktivitását találtuk a legmagasabbnak, mely eredményünk más korábbi munkákkal összhangban van (Popko és mtsai, 2006). Munkánk az első az irodalomban, mely a HexA és HexB gének erős expressziója alapján a szinoviális fibroblasztokat tekinti a hexózaminidáz enzim elsődleges forrásaiként az SM-ben. Meglepetésünkre a HexA gén expressziója az SF-ben és SMben is szignifikánsan magasabb volt, mint a HexB gén. Ez a megfigyelés a ritka hexózaminidáz S enzim intraartikuláris expressziójára utal, mely izoenzim a szulfatált GAG-ok degradációjáért felelős (Hepbildikler és mtsai, 2002). Elsőként sikerült kimutatnunk a nemrégiben expressziós vektorban leírt HexDC gén expresszióját SM-ben és SF-ben. Az expresszió mértéke valamivel elmaradt a fenti két hexózaminidáz alegységet kódoló gén kifejeződésétől. Bár a szinoviális fibroblasztokat a GusB enzim viszonylag alacsony expressziója jellemezte, feltételezhetjük, hogy az enzim túlnyomó részét lizoszómákban halmozzák fel a sejtek, majd sejt-eredetű MV-k révén ürítik ki magukból. Ezt a feltételezést támasztja alá az SF lizátumok SM homogenizátumokkal összevethető mértékű aktivitása, illetve az enzim sejt-eredetű MV-kben való kimutathatósága. Az SF-eredetű MV-k NAG és GusB aktivitása a porc-degradáló enzimek mostanáig ismeretlen lokalizációját bizonyítja. A MV-khez asszociált glikozidázok a mikrovezikuláris proteázokkal együtt feltehetően hozzájárulthatnak a fibroblaszt eredetű MV-k proinvazív karakteréhez, s ezáltal a porc alapállomány szinoviális fibroblasztok általi inváziójában fontos szerepet tölthetnek be. Az immunválasz elindításában a természetes immunitásnak kulcsfontosságú szerepe van. Csíravonalban kódolt receptorai, mint például a TLR-ek vészjeleket érzékelnek. RA-s SF-en is leírták ilyen receptorok, konkrétan a TLR2 jelenlétét (Pierer és mtsai, 2004; Kyburz és mtsai, 2003), melyen keresztül aktiválódva, kemokinek termelésével járulnak hozzá az arthritis kialakulásához. Bár számos exogén TLR ligand ismert, az endogén ligandok feltérképezésére eddig csak kevesen vállalkoztak. Ez utóbbiak közt említendők az ECM szénhidrát jellegű degradációs termékei (HA és HS-eredetű 91
tetraszaharidok és hexaszaharidok) (Termeer és mtsai, 2002; Johnson és mtsai, 2002; Beg,
2002).
A
szénhidrát
jellegű
TLR
ligandok
érdekes
módon
mind
endoglikozidázok révén keletkeznek, a poliszaharid láncok nem-terminális régióinak hasítása által. A munkánk során vizsgált endoglikozidázok (Hyal1, Spam1) rendkívül alacsony ízületbeli aktivitást mutattak. Úgy tűnik tehát, hogy a TLR-ek szénhidrát jellegű ligandjai sokkal inkább exogén (például mikrobiális) endoglikozidázok révén keletkeznek, mint az SM- vagy SF-erdetű enzimek révén. Korábbi eredményeinkkel összhangban, az ízületek domináns exoglikozidázaként a hexózaminidáz enzimet azonosítottuk. A hexózaminidáz működése következtében konstitutívan termelődnek a glükózamin hasítási termékek, melyek a normális ECM/GAG turnover részét képezik, de ismert róluk az is, hogy megvédik a kondrocitákat
az
IL-1β
arhtritogén
hatásával
szemben
(az
IL-1β
okozta
génexpressziós változásokat 73%-ban megakadályozták) (Gouze és mtsai, 2006). Az ízületekben keletkezett glükózamin tehát endogén anti-inflammatorikus molekulaként működik, így fiziológiás körülmények között a hexózaminidáz hasítási termékek a szöveti homeosztázis fenntartásában játszanak szerepet. Mikrobiális fertőzések során azonban a homeosztatikus egyensúly eltolódhat. Akut gyulladás során az infiltráló sejtek (például monociták, neutrofil granulociták) meghiúsuló fagocitózisuk (frusztrált
fagocitózis),
illetve
a
megemelkedett
intracelluláris
Ca2+
szint
következtében nagy mennyiségű lizoszómális enzimürítésbe kezdenek, mely további exoglikozidáz felszabadulást eredményez (Bunbury és mtsai, 2009). Ezek az enzimek az SF-eredetű hexózaminidázzal együttműködve funkcionálnak a továbbiakban. Így az exoglikozidázok (hexózaminidáz és glükuronidáz) egymást felváltva a porc mátrix degradációjához, illetve az ECM glükózaminoglikánjainak felszabadulásához vezethetnek. Meglepetésünkre, kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy a proteáz és glikozidáz gének expressziójának citokinek általi szabályozhatósága teljesen eltért egymástól. Az RA-t a citokinek komplex szabályozó mechanizmusa jellemzi, és jól ismert, hogy az MMP-k és egyéb proteázok kifejeződését a gyulladásos citokinek indukálják (Borghaei és mtsai, 1999; Fuchs és mtsai, 2004; Kanangat és mtsai, 2006; Hou és mtsai, 2006). Ezzel teljesen ellentétesen, a glikozidáz géneket downregulálták az IL1β, IL-17, és TNF-α proinflammatorikus citokinek. Legerősebb downregulációt a TGF-β1 hatására tapasztaltunk az RA-s és OA-s fibroblasztok génexpressziója esetében. Ezt a downregulációt erősítette meg az OA-s SF-ek HexDC gén által kódolt 92
N-acetil-galaktózaminidáz aktivitásának vizsgálata is. Érdekes módon azonban az RA-s SF-ek NAGA aktivitása ellentétes irányba változott, azaz upregulálódott a TGF-β1 hatására. A TGF-β nagy mennyiségben van jelen az SM-ben (Taketazu és mtsai, 1994), illetve a TGF-β-hoz kapcsolt jeátviteli útvonal konstitutívan upregulálódik az RA-s fibroblasztokban (Pohlers és mtsai, 2007). A TGF-β-nak anti-inflammatorikus, és proinflammatorikus hatásai is lehetnek a RANTES expressziójának downregulációja, illetve az MMP-1 és IL-1 szintézisének stimulációja révén (Müller-Ladner és mtsai, 2007). Feltételezzük tehát, hogy az ízületben rendkívül fontos a szinoviális glikozidázok stabil expressziója és szigorú szabályozása. Megfigyeléseink alapján a glikozidázok a proteázokkal szemben domináns negatív citokinszabályozás alatt állnak. Ennek lehetséges magyarázatául felmerül annak a lehetősége, hogy a glikozidázok citokinhatásra
emelkedő
expressziója
súlyos,
esetleg
beláthatatlan
következményekkel járhatna, melyet megpróbál elkerülni a szervezet. Ismert ugyanis, hogy az ECM a TGF-β és egyéb növekedési faktorok tárolására szolgál, melyek felszabadulását a proteoglikánok degradációja szabályozza (Imai és mtsai, 1997). Ezek a GAG-kötő fehérjék lehetnek különböző növekedési faktorok (mint fibroblaszt növekedési faktor, vaszkuláris endoteliális növekedési faktor, inzulin-szerű növekedési faktor-kötő fehérje), morfogének, enzimek citokinek, kemokinek, interleukinek és így tovább (Esko és Linhardt, 2008). Azt feltételezhetjük, hogy a glikozidázok génexpressziójának szigorú szabályozása akadályozza meg a már előbb említett igen jelentős mennyiségű szövethez-kötött fehérje szinkronizált szöveti felszabadulását. Azt azonban nem szabad figyelmen kívül hagynunk, hogy lokálisan az ízületi porc károsodásához nagymértékben járulhatnak hozzá a gyulladt szinoviális membránt tömegesen infiltráló sejtek lizoszomális enzimei. Mostanáig a GusB gént az emberi genom housekeeping génjeként tartották számon. Ezt egyedülálló promoter szekvenciájának köszönheti, melyből hiányzik a TATA box, de magas G+C tartalommal rendelkezik (Kunert-Keil és mtsai, 2004). Szabályozhatóságáról ezidáig egyetlen irodalmi adat létezett, melyben az A23187 Ca2+ ionofór, a Ca2+ ATP-áz inhibitor thapsigargin és a Ca2+ csatorna-blokkoló verapamil downreguláló hatását írták le a HepG2 emberi hepatóma sejtvonalban (Grube
és
mtsai,
2003).
Munkánk
elsőként
93
számol
be
a
glikozidázok
génexpressziójának (beleértve a GusB gént is) humán ciokinek általi negatív szabályozhatóságáról. II. A fibroblasztoktól elkanyarodva, a B-limfociták RA pathogenezisében játszott szerepe sem elhanyagolható. Az RA-s szinoviumban található sejtek RF-t, II. típusú kollagén-ellenes és CCP-ellenes antitesteket termelnek. A terápiás kezelések során, amikor a B-sejteket CD20-ellenes monoklonális antitestekkel célozzák (rituximab), csökken a betegség aktivitása és hosszabbodik a remissziós periódus (Edwards és mtsai, 2004), mely tovább bizonyítja a B-sejt aktiváció jelentőségét a betegség pathogenezisében. A szénhidrát-ellenes antitestek létezéséről már régóta tudunk Karl Landsteiner vércsoport specifikus antitestjei révén. Emellett számos szénhidrát-specifikus
antitestről
ismert
autoimmun
betegségek
pathomechanizmusában betöltött szerepük (Adderson és mtsai, 1998). Meglepő módon RA-ban még nem vizsgálták ezen szénhidrát-ellenes antitestek szerepét, annak ellenére, hogy a hialinporc és a szinoviális folyadék jelentős mennyiségben tartalmazza a HA, CS és KS-ből felépülő GAG-okat. Az ízület gyulladása során ezek a szénhidrátok szabadulnak ki a környező szövetekből (Majeed és mtsai, 2004; Pothacharoen és mtsai, 2006). Munkánk során azt tapasztaltuk, hogy míg az újszülöttekben hiányoztak a GAG-specifikus antitestek, addíg a felnőttek szérumában igen nagy mennyiségben voltak jelen. A GAG-ok ismétlődő természete alapján, valamint az újszülöttekben tapasztalt hiányuk révén úgy tűnik, hogy a csecsemőmirigy-független (TI, thymus independent) TI2 antigénekről van szó (Landers és mtsai, 2005; Zandvoort és mtsai, 2002; Adderson, 2001; Rijkers és mtsai, 1998). Mivel a B1 B-sejtekről tudjuk, hogy a TI2 antigénekkel szemben mutatnak reaktivitást, feltételezhetjük, hogy ezek a sejtek termelik a GAG-specifikus természetes autoantitesteket. Minthogy az anioncserélő gyanta meggátolta a GAG-specifikus antitestek kötődését, így azt gondoljuk, hogy a gyenge ionos kölcsönhatások is fontosak lehetnek a polianionos GAG-ok felismerésében. A természetes autoantitestek általában polireaktívak, ennek megfelelően erős korrelációt találtunk az IgM típusú GAG-specifikus antitestek között. A gátlási kísérletek során is széleskörő keresztreaktivitást találtunk az egyes GAG típusok között, mely még jobban megerősíti a vizsgált GAG-ellenes antitestek természetes autoantitest voltát. Az IgG típusú GAG-specifikus antitestek között sokkal kisebb 94
korrelációt találtunk, így ők egy külön populációt képviselhetnek, melyek csak az osztályváltás rekombinációs folyamatait követően, T-sejtek segítségével alakulhatnak ki. Ráadásul leírtak egy olyan T-limfocita populációt, mely a GAG-ok felismerésére képes egér arthritis modellben és az RA-s betegekben (Wang és mtsai, 2002). A kontrollokhoz képest az RA-s betegek szérumában szignifikánsan magasabb volt az összes IgM típusú és bizonyos IgG típusú GAG-ellenes antitestek szintje. Az RA-s betegek GAG-specifikus antitestjei azonban nemcsak a keringésben és a szinoviális folyadékban vannak jelen, hanem a hialinporc ECM-hez kötötten is megtalálhatók. Az SFl/szérum GAG-ellenes antitest szintek aránya az IgM antitestek esetén következetesen alacsony volt, míg az IgG tekintetében viszonylag magas. Az IgG szabadon bejut a szinoviális folyadékba, az IgM típusú GAG-specifikus antitestek azonban feltehetőleg nem jutnak ki a keringésből. Feltételezhető, hogy RA-ban a GAG-ellenes antitestek termelődése a porc molekuláinak felszabadulása révén lesz fokozottabb. Autoantigének folyamatosan jelen vannak a szevezetben, és a CD5 negatív B1b B-sejtek (TI2 antigén specifikus antitesteket termelnek) aktivitását növelik (Nakiri és mtsai, 2007; MontecinoRodriguez és mtsa, 2006). Következő lépésként a GAG-ellenes antitestek betegség aktivitásával való korrelációját vizsgáltuk. Érdekes módon a CSC-specifikus IgM antitestek szintje inverz korrelációt mutatott az RA aktivitásával. Következésképpen felvetődik, hogy a CSC-specifikus IgM antitestek RA-ban mint a betegség állapotát jelző biomarker lennének felhasználhatók. Hasonló összefüggést észleltünk a betegség aktivitása, a CRP szint és a CSC-ellenes IgM koncentrációk közötti kapcsolat vizsgálatakor. Azt gondoljuk tehát, hogy a betegség igen aktív stádiumában lecsökken a GAG-specifikus antitestek szintje, mivel ezek hozzákötődnek a degradálódó porcból fokozottan felszabaduló GAG-okhoz. Ez magyarázhatja azt a jelenséget, hogy az RA-s szérummal szemben, az RA-s SFl-ben szignifikánsan alacsonyabb a GAG-ellenes antitestek szintje. A GAG-ellenes antitestek újszülöttekben tapasztalt hiánya, a felnőttekben mért magas szintje, továbbá az erősen keresztreaktív sajátságuk ismeretében nagyon valószínűnek tartjuk, hogy a környezetben található mikrobiális szénhidrátok és glikozilált antigének hatására termelődnek. Ennek igazolására megvizsgáltuk, hogy a GAG-specifikus antitestek keresztreagálnak-e mikrobiális antigénekkel.
A
vizsgált
antitestek
valóban
képesek
kötődni
bakteriális
peptidoglikánokhoz, illetve a gomba eredetű poilszaharid Zymosan-hoz. Ez az 95
eredmény nem csak azt magyarázza meg, hogy miért nincsenek jelen a GAGspecifikus antitestek az újszülöttekben, de megerősíti azt az elképzelést is, miszerint az RA kialakulásában fertőzéseknek is fontos szerep jut. Ahhoz, hogy igazolhassuk a mikróbiális fertőzések szerepét a szénhidrát-specifikus immunválasz kialakulásában, megvizsgáltuk a szérumbeli antitestek reaktivitását a bakteriális glikozidázokkal emésztett aggrekán molekulával szemben. Mind a βgalaktozidáz, mind a hialuronidáz emészett aggrekánnal szemben szignifikánsan megemelkedett
az
antitestek
reaktivitása.
Ismert,
hogy a
hialuronidáz
a
Staphylococcus aureus, a Streptococcus pyogenes és a Clostridium perfringens virulenciafaktora (Parisi, 1966; Starr és mtsa, 2006; Shimizu és mtsai, 2002), továbbá a β-galaktozidázt az Escherichia coli expresszálja (Matthews, 2005). Így nagyon valószínű, hogy a fertőzések során ezen glikozidázok lokális aktivitása következtében szénhidrát neoepitópok keletkeznek in vivo. Az immunfelismerésben, valamint a saját/nem-saját struktúrák elkülönítésében a sejtfelszíni szénhidrát mintázatnak megkérdőjelezhetetlen szerep jut (Buzás és mtsai, 2006). Ahogyan a proteoglikánok GAG oldalláncainak módosítására képesek a glikozidázok, úgy a szövetek glikozilációs mintázatát is megváltoztathatják. Szénhidrát array segítségével a kontroll személyek és az RA-s betegek szérum és SFl szénhidrát specifikus IgG reaktivitási mintázatát próbáltuk meghatározni. A jelenleg hozzáférhető szénhidrát array segítségével azonban nem találtunk betegségspecifikus szénhidrát felismerési mintázatot. Úgy tűnik tehát, hogy a szénhidrát struktúrák vizsgálatára képes sokkal komplexebb array-re lenne szükség a keringő szénhidrát specifikus antitestek valódi epitóp specificitásának jellemzéséhez. RA-ban,
a
GAG-ellenes
antitestek
koncentrációjának
emelkedése
nagy
valószínűséggel a gyulladt ízületből fokozottan felszabaduló GAG-oknak köszönhető. Eredményeink szerint azonban a GAG-ellenes antitestek szintje fordítottan arányos a betegség súlyosságával. A GAG-ellenes antitestek védő szerepének mechanizmusa nem ismert. Azt tudjuk, hogy a peptidoglikánok és a HA, illetve a HS fragmensek is kötődhetnek a TLR-ekhez (Buzás és mtsai, 2006). Hipotézisünk szerint a természetes GAG-ellenes antitestek egyik szerepe a degradálódó mátrix molekuláihoz való kötődés, mely révén megakadályozzák azok különböző vészjelző receptorokhoz, mint például a TLR-ekhez való kötődését. Ennél fogva pedig csökkentik a naív Tlimfociták saját molekulák irányába történő elköteleződésének lehetőségét. A degradálódó mátrixból azonban nemcsak tiszta GAG fragmentumok szabadulnak fel, 96
de proteázok által emésztett peptidekhez vagy proteoglikánokhoz kapcsolódó GAGokkal is találkozhatunk. Így míg a szénhidrátok önmagukban nem indukálnak erős immunválaszt, addíg a glikopeptidek erősen immunogének (Black és mtsai, 2008). Mindezek ismeretében a GAG epitópok elfedése, az előbb említett glikopeptidek eliminációjának elősegítése (immunkomplex formájában), illetve a GAG-ellenes antitestek alkalmasak lehetnek az autoimmun folyamatok megakadályozásában vagy lassításában. III. A posztranszlációs módosítások jelentőségét emeli ki az a munkánk is, melynek során különböző SE szekvenciát hordozó peptidek citrullinációjára adott sejtválaszt vizsgáltuk. Ismert ugyanis, hogy az RA-asszociált HLA-DRB1 allélek a SE pentapeptid motívumot kódolják. Ez az SE kiemelkedő jelentőségű lehet egy adott RA-asszociált peptid preferenciális megkötésében, vagy molekuláris mimikri révén a betegség indukciójában. Néhány évvel ezelőtt Albani és munkatársa a „többlépéses molekuláris mimikri” koncepció révén magyarázta az SE szerepét RA-ban (Albani és Carson, 1996). A szerzők véleménye szerint az SE-t hordozó saját peptidek prezentálódnak a csecsemőmirigyben, így az SE szekvencia-MHC komplexet alacsony aviditással felismerő T-sejtek túlélik a csecsemőmirigyben lezajló szelekciós folyamatokat. A perifériára kerülve azonban, SE-t hordozó mikrobiális ágensek, mint például a bakteriális dnaJ hatására az előbb említett T-sejtek aktiválódhatnak. A „többlépéses molekuláris mimikri” hipotézis szerint tehát a bakteriális dnaJ hősokk fehérjék lehetnek a kezdeti antigének. Az ízületi gyulladás fenntartásáért azonban a gyulladt ízületből felszabaduló, memória T-sejtek által felismert, keresztreaktív saját molekulák lehetnek felelősek, mint például az ízületi autoimmmun folyamatok potenciális célpontjaiként ismert emlős hősokk fehérjék. Ezen koncepció alapján, epitóp-specifikus immunterápia segítségével próbálták RA-ban eltolni az egyensúlyt a gyulladásos stádiumtól a regulátoros T-sejtek működőképességének fokozása felé (Prakken és mtsai, 2004; Gaston, 1998). A „többlépéses molekuláris mimikri” koncepció tükrében, a peptid citrullinációs eredményeink a porc saját epitópjainak kiemelkedő jelentőségét hangsúlyozzák az RA pathomechanizmusában. A porc eredetű antigének RA pathomechanizmusában betöltött jelentőségét már korábban is kiemelték a klinikusok megfigyelései, mely szerint a synovectomia csak átmeneti remissziót eredményez, de az arthroplastica a betegség teljes teljes remissziójához vezet az adott ízületben (Gaston, 1998). Korábbi egérkísérletes munkáink során kimutattuk, hogy a P135 szekvencia (QKRSS) és a shared epitóp (QKRAA) közötti 97
különbség megengedi ezen peptidek keresztfelismerését a peptiddel érzékenyített egerekből izolált sejtek által (Hanyecz és mtsai, 2003). Jelen munkánk során elsőként vizsgáltuk az SE-t hordozó P135 peptiddel végzett in vitro stimuláció következtében megfigyelhető RA-s és kontroll PBMC választ. Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a kontrollokkal szemben az RA-s betegek szignifikánsan nagyobb Th17 válasszal reagáltak a P135 peptidre. Ezzel szemben, egy másik humán aggrekán epitóppal, az ATE szekvenciával szemben toleranciát tapasztaltunk, hiszen az IL-17 válasz rendkívüli mértékben lecsökkent. Az SE-t hordozó HLA DRB1 peptiddel szemben sem detektálhattunk szignifikáns in vitro IL-17 választ. Eredményeinkkel összhangban, más kutatócsoportok sem találtak perifériás T-sejt választ az SE-t hordozó HLA DRB1 és/vagy E. Coli dnaJ peptidekkel szemben (Salvat és mtsai, 1994; McColl és mtsai, 1997). Az SE szekvencia és flanking régiói arginin aminosavakat tartalmaznak, ezért érdemesnek találtuk megvizsgálni, hogy az SE valamint a környezetében található aminosavak citrullinációja hogyan befolyásolja a P135 peptid felismerését. Csoport szinten sem az RA-s betegek, sem a kontrollok nem reagáltak különbözőképpen a citrullinációval módosított peptid ligandokra az arginint tartalmazó vad típusú peptidekkel szemben. Váratlan eredményként azonban az RA-s betegek és kontrollok egy-egy alcsoportjának P135 peptiddel szembeni IL-17 válaszképtelensége (toleranciája) megszűnt a citrullináció hatására. Mind a kontrollok, mind az RA-s betegek alcsoportjaiban három-négyszeresére emelkedett a citrullinált P135 peptiddel szembeni IL-17 válasz. Azt azonban fontos hangsúlyozni, hogy az összes RA-s betegünk terápiás kezelés alatt állt a kísérleteink elvégzése során (DMARD és glükokortikoid). Így a kontrollok és az RA-s betegek perifériás sejtjei által adott hasonló IL-17 válaszkészségét az RA-s betegek immunszupresszált állapotával magyarázhatjuk. Arra azonban nem sikerült választ találnunk, hogy milyen tényezők hatására fokozódott a kontrollok és RA-s betegek 30%-ának citrullinált P135 peptidre adott IL17 válasza. Saját eredményeink alapján a citrullinációra való válaszkészség nem függ össze a dohányzással (a dohányzást az RA kockázati tényezőjeként tartják számon, melynek hatására fokozódik a tüdőben a PAD2 expressziója, valamint SE-t hordozó HLA DRB1-el rendelkező RA-s betegekben az anti-CCP antitestek kockázati tényezője) (Makrygiannakis és mtsai, 2008; Linn-Rasker és mtsai, 2006). Nem találtunk korrelációt a P135 citrullináció hatására bekövetkező tolerancia áttörés
98
és a HLA DRB1 genotípus, vagy a kísérletekbe bevont személyek rendelkezésünkre álló klinikai/laboratóriumi paraméterei között sem. Eredményeink tehát elsőként igazolták, hogy perifériás vérsejt IL-17 választ lehet indukálni SE-t hordozó humán porc aggrekán epitóp segítségével. Szerkezeti tulajdonságai alapján különösen érdekes lehet RA-ban ez a peptid. Egyrészről, az SE jelenléte ebben a porc proteoglikán peptidben felveti a molekuláris mimikri lehetőségét a HLA DRB1 és számos mikrobiális hősokk fehérjével. Másrészről, a peptidbeli argininek jelenléte lehetővé teszi a peptid (és homológjainak) citrullinációját, mely rendkívül fontos poszttranszlációs módosítási folyamat RA-ban. IV. A disszertációban szereplő negyedik kísérletes munka során az NO szabadgyök és a T-limfociták kapcsolatát vizsgáltuk. Korábbi vizsgálatok során igazolódott az NO szerepe az SLE-s T-sejtek működésének csökkentésében (Nagy és mtsai, 2004; 2007). Bár az SLE-s és normál T-sejtek nagyjából megegyező mennyiségű NO-t termeltek, a lupusos monociták szignifikánsan több NO-t termeltek a normál monocitákhoz képest. Ha a T-sejtekkel ko-kultúrában tenyésztettük őket, a lupusos T-sejtek esetén emelkedett Ca2+ beáramlást mérhettünk, mely alapján feltételezzük, hogy a monocita-eredetű NO az SLE-s T-sejtek mitokondriumainak működését akadályozza (Nagy és mtsai, 2004). Ennek bizonyítékául szolgált, hogy a lupusos T-sejtek mitokondriumainak száma megemelkedett, és méretük is megnagyobbodott. Mivel a mitokondriumok képesek a Ca2+ felvételére, tárolására és felszabadítására, azt gondoljuk, hogy a nagyobb mitokondriális tömeg az SLE-sek intracelluláris Ca2+ koncentrációjának, továbbá Ca2+-függő gének expressziójának eltérő regulációjával is együtt jár. Az iNOS-t makrofágok, fibroblasztok, kondrociták, oszteoblasztok és oszteoklasztok expresszálják (van’t Hof és Ralston, 2001; Nagy és Perl, 2006). Munkánkból azonban kiderül, hogy az RA-s T-limfociták is jelentős mennyiségű NO termelésére képesek, amely természetesen nem zárja ki a monocitaeredetű NO jelentőségét sem. Sőt, nagyon valószínű, hogy a gyulladásos infiltrátumban a monocita-eredetű NO hatással van a szomszédos T-sejtek működésére. Mi a legvalószínűbb magyarázata az RA-s T-sejtek emelkedett NO termelésének? Ez nagyon
fontos
kérdés,
és
egyértelműen
további
vizsgálatokat
igényel
a
megválaszolása. Egyik lehetséges magyarázat az NO jelátviteli útvonalakra gyakorolt direkt hatása, valamint a megemelkedett citoszolikus Ca2+ koncentráció gyulladásos 99
citokinek génjeire gyakorolt hatása. Ismert például, hogy az NO szelektíven fokozza a Th1 sejtek proliferációját (Niedbala és mtsai, 2002; Koncz és mtsai, 2007), illetve további szignálként szolgál a Th1 sejtek effektor funkciójához. A Th17 effektor Tsejtek fejlődésére és fenntartására gyakorolt NO hatást azonban még nem vizsgálták. Egy másik lehetséges út az NO-t expresszáló T-sejtek fokozott migrációs képességével
függ
össze.
Eredményeink
funkcionális
megismerése érdekében további vizsgálatok szükségesek.
100
következményeinek
6. KÖVETKEZTETÉSEK Vizsgálataink
a
glikozidáz
géncsalád
rendkívül
szigorúan
szabályozott
génexpressziójára mutatnak rá. Eredményeink alapján a glikozidáz gének a gyulladásos citokinek általi negatív reguláció alatt állnak. Ez a negatív szabályozás teljesen ellentétes a szinoviális fibroblasztok proteázainak citokinek általi pozitív regulációjával. Mivel az RA-s és OA-s betegek glikozidázainak génexpressziójában nem találtunk különbséget, feltételezhetjük, hogy az exoglikozidázok mindkét betegségben hasonló szereppel és szabályozhatósággal bírnak. Eredményeink nem mondanak ellent annak az elképzelésnek, miszerint a glikozidázok az MMP-kel kölcsönhatva mindkét betegségben fontos szerepet játszanak a porcdegradációban a GAG tartalom emésztése révén. Az RA-s ízület emelkedett glikozidáz aktivitásáért, melyet korábbi munkánk során tapasztaltunk, valószínűleg nem a szinoviális fibroblasztok felelősek kizárólagosan, hiszen az ízület különböző infiltráló gyulladásos sejtjei is jelentős mértékben hozzájárulhatnak a szinoviális folyadékban mérhető emelkedett glikozidáz aktivitáshoz. Ismert, hogy a természetes autoantitestek hálózatában bekövetkező változások (’immunculus torzulás’) a betegségek prediktora lehet, továbbá a korai betegségre jellemző markernek tekinthető (Poletaev és Osipenko, 2003). A disszertációban bemutatott munkánk során azt tapasztaltuk, hogy a GAG-ellenes antitestek szintje erősen eltér az egészséges felnőtt kontrollok és az alacsony betegség aktivitású (DAS28 ≤ 3.2) RA-s betegek között. Ezek alapján a GAG-ellenes antitest szint a korai betegség aktivitás olcsó, könnyen mérhető biomarkere lehet. Mindez azt is indokolttá teheti, hogy a jövőben bizonyos GAG struktúrák is helyet kapjanak diagnosztikus autoantigén microarray lemezeken. A P135 humán aggrekán peptiddel valamint annak citrullinált variánsával szembeni Th-17 válasz egy új lehetséges mechanizmust tár elénk, mely hozzájárulhat az RA kialakulásához. E szerint az SE és a citrullináció számos genetikai és környezeti tényezővel együtt fontos szerepet tölt be az RA kialakulásában az erre érzékeny egyénekben.
101
Az RA-s T-sejtek és az NO kapcsolatának vizsgálatából kitűnik, hogy az NO a Tsejtek működésének fontos szabályozója, melyet a TNF in vitro és in vivo is szabályoz. A T-sejt eredetű, emelkedett NO továbbá hozzájárul a gyulladásos citokinek termelésének felgyorsulásához illetve az RA-s T-sejtek jelátviteli folyamatainak fokozásához is. Így felmerül a különböző krónikus gyulladásos betegségek, mint például az RA terápiája során az NO gátlásának lehetősége is. Mivel az NO rendkívül sok fiziológiás folyamatot befolyásol, ezért a szisztémás alkalmazással szemben sokkal inkább a lokális NO szintézis gátlása javasolt.
102
7. ÖSSZEFOGLALÁS A rheumatoid arthritis (RA) pathomechanizmusának vizsgálata során manapság egyre nagyobb figyelem fordul a glikobiológia és a poszttranszlációs autoantigén módosítás
jelentőségére.
porcdegradációra
képes
Ennek
tükrében
glikozidázok
szisztematikusan
(β-D-hexózaminidáz,
vizsgáltuk
a
β-D-glükuronidáz,
hialuronidáz, sperm adhesion molecule1 és klotho) ízületi expresszióját. E mellett megvizsgáltuk
a
autoantitestek
glükózaminoglikánokkal
proteoglikán
keringésben
komponensek
a
nagy
mennyiségben (GAG)
degradálódó
jelen
szembeni
porcból
lévő
természetes
reaktivitását,
hatalmas
mely
mennyiségben
szabadulnak fel. Mivel a citrullinált antigéneket felismerő antitestek az RA széles körűen alkalmazott diagnosztikai és prognosztikai markere, megvizsgáltuk a T-sejtek reaktivitását a „shared epitóp” szekvenciát hordozó aggrekán peptid (P135) különbözőképpen citrullinált variánsaival szemben. Végül megvizsgáltuk a T-sejtek nitrogén-monoxid (NO) termelési képességét RA során. Legfontosabb eredményeink a következők: 1. Jellemeztük a glikozidázok kifejeződését a szinoviális membránban, szinoviális fibroblasztokban, és szinoviális fibroblaszt eredetű mikrovezikulákban. 2. Elsőként írtuk le, hogy az RA pathomechanizmusában széles körűen tanulmányozott proteázokkal szemben, a szinoviális membrán és szinoviális fibroblasztok glikozidázai negatívan szabályozódnak a lokálisan termelődő citokinek által. 3. Leírtuk, hogy a GAG-ellenes antitestek kimutathatók egészséges felnőtt személyekben, de RA-s betegekben szignifikánsan emelkedett mennyiségben fordulnak elő. 4. Igazoltuk, hogy a kondroitin-szulfát C-ellenes IgM antitestek szintje inverz korrelációt mutat az RA aktivitását jellemző markerekkel (DAS 28, CRP). 5. Kimutattuk, hogy az RA-s betegek IL-17 termelése szignifikánsan megemelkedett a „shared epitópot” hordozó P135 aggrekán peptid hatására. 6. Igazoltuk, hogy mind a kontrollok, mind az RA-s betegek egy-egy alcsoportja „citrullináció szenzitív”, azaz fokozott TH17 választ ad a P135 peptid citrullinált variánsaival szemben. 7. Leírtuk, hogy az RA-s T-sejtek NO termelése emelkedett a sejtek citoplazmatikus Ca2+ koncentrációjával összefüggésben, és in vitro TNFα kezelés hatására tovább emelkedik a szintje.
103
8. SUMMARY There is an increasing awareness of the importance of posttranslational autoantigen modifications and glycobiology in the course of investigating the pathomechanism of rheumatoid arthritis (RA). Thus, for the first time we systematically investigated the expression of cartilage degrading glycosidases (β-Dhexosaminidase, β-D-glucuronidase, hyaluronidase, sperm adhesion molecule 1 and klotho) within the joints. Next, we explored the glycosaminoglycan (GAG) reactivity of natural autoantibodies found in high amount in the circulation. Since citrullinated antigen-reactive antibodies are widely used diagnostic and prognostic tools in RA, we investigated if there was a differential T cell recognition of differently citrullinated variants of a disease relevant, shared epitope-containing aggrecan peptide (P135). Finally, we set out to explore the contribution of T cells to nitrogen monoxide (NO) production in RA. Our main results are as follows: 1. We characterized the expression of glycosidases in the synovial membrane, in synovial fibroblasts and also in synovial fibroblast-derived microvesicles. 2. We have shown for the first time that in contrast to proteases widely investigated in RA pathomechanism, glycosidases, expressed by the synovial membrane and synovial fibroblasts, are under negative regulation by some locally expressed cytokines. 3. We have shown that anti-GAG antibodies were readily detectable in adult controls, and were significantly elevated in patients with RA. 4. We provided evidence that in RA the level of anti-chondroitin sulphate C IgM antibody shows inverse correlation both with the Disease Activity Score (DAS) 28 scores and C-reactive protein (CRP) levels. 5. We found that the P135 peptide induced a significant IL-17 response in patients with RA but not in controls. 6. We found that subgroups of controls and patients with RA were „citrullination sensitive” showing an enhanced Th17 response to citrullinated variants of P135. 7. We found that T cells from RA patients produced significantly more NO than healthy donor T cells in association with an increased cytoplasmic Ca2+ concentration, that was further increased by in vitro treatment with TNF.
104
9. IRODALOMJEGYZÉK Adderson EE, Shikhman AR, Ward KE, Cunningham MW. Molecular analysis of polyreactive monoclonal antibodies from rheumatic carditis: human anti-Nacetylglucosamine/anti-myosin antibody V region genes. J Immunol 1998, 161:20202031.
Adderson EE. Antibody repertoires in infants and adults: effects of T-independent and T-dependent immunizations. Springer Semin Immunopathol 2001, 23:387-403.
Ainola MM, Mandelin JA, Liljestrom MP, Li TF, Hukkanen MV, Konttinen YT. Pannus invasion and cartilage degradation in rheumatoid arthritis: involvement of MMP-3 and interleukin-1beta. Clin Exp Rheumatol 2005, 23:644–650.
Albani S, Carson DA. A multistep molecular mimicry hypothesis for the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Immunol Today. 1996, 17:466-70.
Altman R, Alarcon G, Appelrouth D, Bloch D, Borenstein D, Brandt K, Brown C, Cooke TD, Daniel W, Feldman D, Greenwald R. Hochberg M, Howell D, Ike R, Kapila P, Kaplan D, Koopman W, Marino C, McDonald E, McShane DJ. The American College of Rheumatology criteria for the classification and reporting of osteoarthritis of the hip. Arthritis Rheum 1991, 34:505-514. Andreassen M, Vestergaard H, Kristensen LØ. Concentrations of the acute phase reactants high-sensitive C-reactive protein and YKL-40 and of interleukin-6 before and after treatment in patients with acromegaly and growth hormone deficiency. Clin Endocrinol (Oxf) 2007, 67:909-16.
Anzilotti C, Pratesi F, Tommasi C, Migliorini P. Peptidylarginine deiminase 4 and citrullination in health and disease. Autoimmun Rev 2009, Jun 18. [Epub ahead of print]
105
Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF, Cooper NS, Healey LA, Kaplan SR, Liang MH, Luthra HS, Medsger TA Jr, Mitchell DM, Neustadt DH, Pinals RS, Schaller JG, Sharp JT, Wilder RL, Hunder GG. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1988, 31:315-324.
Astakhova TA, Volkova ZI, Trofimova TM, Mul'diiarov PIa. Importance of betaglucuronidase activity and glycosaminoglycan concentration in synovial fluid in patients with rheumatoid arthritis in estimating local inflammation. Ter Arkh 1989, 61:55-7.
Avouac J, Gossec L, Dougados M. Diagnostic and predictive value of anti-cyclic citrullinated protein antibodies in rheumatoid arthritis: a systematic literature review. Ann Rheum Dis 2006, 65:845-851.
Baeten D, Steenbakkers PG, Rijnders AM, Boots AM, Veys EM, De Keyser F. Detection of major histocompatibility complex/human cartilage gp-39 complexes in rheumatoid arthritis synovitis as a specific and independent histologic marker. Arthritis Rheum 2004, 50:444-51.
Bartholomew BA. Synovial fluid glycosidase activity. Scand J Rheumatol 1972, 1:69-74.
Beg AA. Endogenous ligands of Toll-like receptors: implications for regulating inflammatory and immune responses. Trends Immunol 2002, 23:509-512.
Begovich AB, Carlton VE, Honigberg LA, Schrodi SJ, Chokkalingam AP, Alexander HC, Ardlie KG, Huang Q, Smith AM, Spoerke JM, Conn MT, Chang M, Chang SY, Saiki RK, Catanese JJ, Leong DU, Garcia VE, McAllister LB, Jeffery DA, Lee AT, Batliwalla F, Remmers E, Criswell LA, Seldin MF, Kastner DL, Amos CI, Sninsky JJ, Gregersen PK. A missense single-nucleotide polymorphism in a gene encoding a protein tyrosine phosphatase (PTPN22) is associated with rheumatoid arthritis. Am J Hum Genet 2004, 75:330–7.
106
Berckmans RJ, Nieuwland R, Tak PP, Böing AN, Romijn FP, Kraan MC, Breedveld FC, Hack CE, Sturk A. Cell-derived microparticles in synovial fluid from inflamed arthritic joints support coagulation exclusively via a factor VII-dependent mechanism. Arthritis Rheum 2002, 46: 2857-66.
Berckmans RJ, Nieuwland R, Kraan MC, Schaap MCL, Pots D, Smeets TJM, Sturk A, Tak PP. Synovial microparticles from arthritic patients modulate chemokine and cytokine release by synoviocytes. Arthritis Res Ther 2005, 7:R536-R544.
Berenbaum F, Le Gars L, Toussirot E, Sanon A, Bories C, Kaplan G, Loiseau PM. Marked elevation of serum N-acetyl-beta-D-hexosaminidase activity in rheumatoid rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol 2000, 18:63-6.
Bianco NR, Kim SH, Ruffner MA, Robbins PD. Therapeutic effect of exosomes from indoleamine 2,3-dioxygenase-positive dendritic cells in collagen-induced arthritis and delayed-type hypersensitivity disease models. Arthritis Rheum 2009, 60:380-9.
Bidanset DJ, Guidry C, Rosenberg LC, Choi HU, Timpl R, Hook M. Binding of the proteoglycan decorin to collagen type VI. J Biol Chem 1992, 267:5250-6.
Bigg HF, Wait R, Rowan AD, Cawston TE. The mammalian chitinase-like lectin, YKL-40, binds specifically to type I collagen and modulates the rate of type I collagen fibril formation. J Biol Chem 2006, 281:21082-95. Biró E, Nieuwland R, Tak PP, Pronk LM, Schaap MC, Sturk A, Hack CE. Activated complement components and complement activator molecules on the surface of cellderived microparticles in patients with rheumatoid arthritis and healthy individuals. Ann Rheum Dis 2007, 66:1085-92.
Black S, Shinefield H, Eskola J, Whitney C. Pneumococcal Conjugate Vaccines. In Vaccines 5th edition. Edited by: Plotkin S, Orenstein W, Offit P. Philadelphia: Elsevier; 2008.
107
Blass S, Engel JM, Burmester GR. The immunologic homunculus in rheumatoid arthritis. A new viewpoint of immunopathogenesis in rheumatoid arthritis and therapeutic consequences. Z Rheumatol. 2001, 60:1–16.
Borghaei RC, Sullivan C, Mochan E. Identification of a cytokine-induced repressor of interleukin-1 stimulated expression of stromelysin 1 (MMP-3). J Biol Chem 1999, 74:2126-2131.
Bowes J, Barton A. Recent advances in the genetics of RA susceptibility. Rheumatology (Oxford). 2008, 47:399-402.
Bredt DS. Endogenous nitrice oxide synthesis: biological functions and pathophysiology. Free Radic Res 1999, 31:577–96.
Brentano F, Kyburz D, Schorr O, Gay R, Gay S. The role of Toll-like receptor signalling in the pathogenesis of arthritis. Cell Immunol 2005, 233:90-6.
Brentano F, Kyburz D, Gay S. Toll-like receptors and rheumatoid arthritis. Methods Mol Biol 2009, 517:329-43.
Bunbury A, Potolicchio I, Maitra R, Santambrogio L. Functional analysis of monocyte MHC class II compartments. FASEB J 2009, 23:164-71.
Burrage PS, Mix KS, Brinckerhoff CE. Matrix metalloproteinases: role in arthritis. Front Biosci 2006, 11:529-543.
Bush KA, Farmer KM, Walker JS, Kirkham BW. Reduction of joint inflammation and bone erosion in rat adjuvant arthritis by treatment with interleukin-17 receptor IgG1 Fc fusion protein. Arthritis Rheum 2002, 46:802–5. Buzás EI, Mikecz K, Glant TT. Aggrecan: A Target Molecule of Autoimmune Reactions. Pathol Oncol Res. 1996, 2:219-228.
108
Buzas EI, Vegvari A, Murad YM, Finnegan A, Mikecz K, Glant TT. T-cell recognition of differentially tolerated epitopes of cartilage proteoglycan aggrecan in arthritis. Cell Immunol 2005, 235:98-108. Buzás EI, György B, Pásztói M, Jelinek I, Falus A, Gabius HJ.Carbohydrate recognition systems in autoimmunity. Autoimmunity 2006, 39:691-704. Casal JA, Mera A, Pérez LF, Tutor JC. Plasma and peripheral leukocyte beta-Nacetylhexosaminidase isoenzymes and disease activity in rheumatoid arthritis. Clin Biochem 2002, 35:483-8.
Chiang EY, Kolumam GA, Yu X, Francesco M, Ivelja S, Peng I, Gribling P, Shu J, Lee WP, Refino CJ, Balazs M, Paler-Martinez A, Nguyen A, Young J, Barck KH, Carano RA, Ferrando R, Diehl L, Chatterjea D, Grogan JL. Targeted depletion of lymphotoxin-alpha-expressing TH1 and TH17 cells inhibits autoimmune disease. Nat Med 2009, 15:766-73.
Clark IM, Parker AE. Metalloproteinases: their role in arthritis and potential as therapeutic targets. Expert Opin Ther Targets 2003, 7:19–34.
Cohen IR. Biomarkers, self-antigens and the immunological homunculus. J Autoimmun. 2007, 29:246–249.
Cope AP, Londei M, Chu NR, Cohen SB, Elliott MJ, Brennan FM, Maini RN, Feldmann M. Chronic exposure to tumor necrosis factor (TNF) in vitro impairs the activation of T cells through the T cell receptor/CD3 complex; reversal in vivo by anti-TNF antibodies in patients with rheumatoid arthritis. J Clin Invest 1994, 94:749– 60.
Cope AP. Altered signalling thresholds in T lymphocytes cause autoimmune arthritis. Arthritis Res Ther 2004, 6:112–6.
Csoka AB, Frost GI, Stern R. The six hyaluronidase-like genes in the human and mouse genomes. Matrix Biol 2001, 20:499–508. 109
Cs-Szabó G, Roughley PJ, Plaas AH, Glant TT. Large and small proteoglycans of osteoarthritic and rheumatoid articular cartilage. Arthritis Rheum 1995, 38:660-8.
Cvetkovic JT, Wallberg-Jonsson S, Stegmayr B, Rantapaa-Dahlqvist S, Lefvert AK. Susceptibility for and clinical manifestations of rheumatoid arthritis are associated with polymorphisms of the TNF-alpha, IL-1beta, and IL-1Ra genes. J Rheumatol 2002, 29:212-9.
Dayer JM, Bresnihan B. Targeting interleukin-1 in the treatment of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2002, 46:574-8.
De Ceuninck F, Gaufillier S, Bonnaud A, Sabatini M, Lesur C, Pastoureau P. YKL40 (cartilage gp-39) induces proliferative events in cultured chondrocytes and synoviocytes and increases glycosaminoglycan synthesis in chondrocytes. Biochem Biophys Res Commun 2001, 285:926-31.
De Rycke L, Nicholas AP, Cantaert T, Kruithof E, Echols JD, Vandekerckhove B, Veys EM, De Keyser F, Baeten D. Synovial intracellular citrullinated proteins colocalizing with peptidyl arginine deiminase as pathophysiologically relevant antigenic determinants of rheumatoid arthritis-specific humoral autoimmunity. Arthritis Rheum. 2005, 52:2323-30.
De Rycke L, Vandooren B, Kruithof E, De Keyser F, Veys EM, Baeten D. Tumor necrosis factor alpha blockade treatment down-modulates the increased systemic and local
expression
of
Toll-like
receptor
2
and
Toll-like
receptor
4
in
spondylarthropathy. Arthritis Rheum 2005, 52:2146–2158.
Distler JH, Pisetsky DS, Huber LC, Kalden JR, Gay S, Distler O. Microparticles as regulators of inflammation: novel players of cellular crosstalk in the rheumatic diseases. Arthritis Rheum 2005, 52:3337-3348. Distler JH, Jüngel A, Huber LC, Seemayer CA, Reich CF 3rd, Gay RE, Michel BA, Fontana A, Gay S, Pisetsky DS, Distler O. The induction of matrix metalloproteinase 110
and cytokine expression in synovial fibroblasts stimulated with immune cell microparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005, 102:2892-7.
Distler JH, Huber LC, Gay S, Distler O, Pisetsky DS. Microparticles as mediators of cellular cross-talk in inflammatory disease. Autoimmunity 2006, 39:683-690.
Dorner T, Egerer K, Feist E, Burmester GR. Rheumatoid factor revisited. Curr Opin Rheumatol. 2004, 16:246–253.
Dudler J, Renggli-Zulliger N, Busso N, Lotz M, So A. Effect of interleukin 17 on proteoglycan degradation in murine knee joints. Ann Rheum Dis 2000, 59:529-32. Lubberts E, Joosten LA, van de Loo FA, Schwarzenberger P, Kolls J, van den Berg WB. Overexpression of IL-17 in the knee joint of collagen type II immunized mice promotes collagen arthritis and aggravates joint destruction. Inflamm Res 2002, 51:102-4.
Edwards JC, Szczepanski L, Szechinski J, Filipowicz-Sosnowska A, Emery P, Close DR, Stevens RM, Shaw T. Efficacy of B-celltargeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis. N Engl J Med 2004, 350:2572-2581.
Egerer K, Hertzer J, Feist E, Albrecht A, Rudolph PE, Dorner T, Burmester GR. sEselectin for stratifying outcome in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2003, 49:546–548.
Elsaid KA, Chichester CO. Review: Collagen markers in early arthritic diseases. Clinica Chimica Acta 2006, 365:68–77. Engström-Laurent A, Hällgren R. Circulating hyaluronate in rheumatoid arthritis: relationship to inflammatory activity and the effect of corticosteroid therapy. Ann Rheum Dis 1985, 44:83-8.
Esko JD, Linhardt RJ. Proteins that bind sulfated glycosaminoglycans. In: Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Edited by Varki A, Cummings D, Esko JD, Freeze HH,
111
Stanley P, Bertozzi CR, Hart GW, Etzler ME. Plainview, NY. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2008, 441-453.
Eyre DR. Collagens of articular cartilage. Arthritis Res 2002, 4:30– 5.
Falkenbach A, Unkelbach U, Gottschalk R, Kaltwasser JP. Serum level of betaglucuronidase as potential indicator of disease activity in rheumatoid arthritis (RA) and systemic lupus erythematosus (SLE). Med Klin (Munich) 1991, 86:465-8.
Feldmann M, Brennan FM, Maini RN. Role of cytokines in rheumatoid arthritis. Annu Rev Immunol 1996, 14:397-440.
Fiedorczyk M, Klimiuk PA, Sierakowski S, Gindzienska-Sieskiewicz E, Chwiecko J. Serum matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with early rheumatoid arthritis. J Rheumatol 2006, 33:1523–1529.
Flannery CR, Little CB, Hughes CE, Caterson B. Expression and activity of articular cartilage hyaluronidases. Biochem Biophys Res Commun 1998, 251:824–829.
Fuchs S, Skwara A, Bloch M, Dankbar B. Differential induction and regulation of matrix metalloproteinases in osteoarthritic tissue and fluid synovial fibroblasts. Osteoarthritis Cartilage 2004, 12:409-418.
Furst DE, Breedveld FC, Kalden JR, Smolen JS, Burmester GR, Bijlsma JW, Dougados M, Emery P, Keystone EC, Klareskog L, Mease PJ. Updated consensus statement on biological agents, specifically tumour necrosis factor {alpha} (TNF{alpha}) blocking agents and interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra), for the treatment of rheumatic diseases, 2005. Ann Rheum Dis 2005, 64:iv2-14.
Fusetti F, Pijning T, Kalk KH, Bos E, Dijkstra BW. Crystal structure and carbohydrate-binding properties of the human cartilage glycoprotein-39. J Biol Chem 2003, 278:37753-37760.
112
Gabay C, McInnes IB. The biological and clinical importance of the 'new generation' cytokines in rheumatic diseases. Arthritis Res Ther 2009, 11:230. Gabius H-J, Andre´ S, Kaltner H, Siebert H-C. The sugar code: Functional lectinomics. Biochim Biophys Acta 2002, 1572:165–177.
Ganguly NK, Kingham JG, Lloyd B, Lloyd RS, Price CP, Triger DR, Wright R. Acid hydrolases in monocytes from patients with inflammatory bowel disease, chronic liver disease, and rheumatoid arthritis. Lancet 1978, 1:1073-1075.
Gaston JSH. Cellular immunity in RA. In: Klippel JH, Dieppe PA, eds. Rheumatology, Vol. I. London: Mosby, 1998:5.10.1–6.
Geijtenbeek TB, Torensma R, van Vliet SJ, van Duijnhoven GC, Adema GJ, van Kooyk Y, Figdor CG. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 2000, 100:575–585.
Ghosh P. The role of hyaluronic acid (hyaluronan) in health and disease: interactions with cells, cartilage and components of the synovial fluid. Clin Exp Rheumatol 1994, 12:75–82.
Giusti I, D'Ascenzo S, Millimaggi D, Taraboletti G, Carta G, Franceschini N, Pavan A, Dolo V. Cathepsin B mediates the pH-dependent proinvasive activity of tumorshed microvesicles. Neoplasia 2008, 10:481-8.
Glant TT, Mikecz K, Arzoumanian A, Poole AR. Proteoglycaninduced arthritis in BALB/c mice. Clinical features and histopathology. Arthritis Rheum 1987, 30:201212.
Glant TT, Buzas EI, Finnegan A, Negroiu G, Cs-Szabo G, Mikecz K. Critical roles of glycosaminoglycan side chains of cartilage proteoglycan (aggrecan) in antigen recognition and presentation. J Immunol 1998, 160:3812–3819.
113
Glasson SS, Askew R, Sheppard B, Carito B, Blanchet T, Ma HL, Flannery CR, Peluso D, Kanki K, Yang Z, Majumdar MK, Morris EA. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature 2005, 434:644–648.
Goldstone SD, Lavin MF. Isolation of a cDNA clone, encoding a human bgalactoside binding protein, overexpressed during glucocorticoid-induced cell death. Biochem Biophys Res Commun 1991, 178:746–750. Gossec L, Dougados M, Goupille P, Cantagrel A, Sibilia J, Meyer O, Sany J, Daurès JP, Combe B. Prognostic factors for remission in early rheumatoid arthritis: a multiparameter prospective study. Ann Rheum Dis 2004, 63:675-80.
Gouze JN, Gouze E, Popp MP, Bush ML, Dacanay EA, Kay JD, Levings PP, Patel KR, Saran JP, Watson RS, Ghivizzani SC. Exogenous glucosamine globally protects chondrocytes from the arthritogenic effects of IL-1β. Arthritis Res Ther 2006, 8:R173.
Green MJ, Gough AK, Devlin J, Smith J, Astin P, Taylor D, Emery P. Serum MMP-3 and MMP-1 and progression of joint damage in early rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford) 2003, 42:83–88.
Gregersen PK, Silver J, Winchester RJ. The shared epitope hypothesis. an approach to understanding the molecular genetics of susceptibility to rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1987, 30:1205-13.
Grube M, Kunert-Keil C, Sperker B, Kroemer HK. Verapamil regulates activity and mRNA-expression of human β-glucuronidase in HepG2 cells. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2003, 368:463-469. Guiducci S, Distler JH, Jüngel A, Huscher D, Huber LC, Michel BA, Gay RE, Pisetsky DS, Gay S, Matucci-Cerinic M, Distler O. The relationship between plasma microparticles and disease manifestations in patients with systemic sclerosis. Arthritis Rheum 2008, 58:2845-53. 114
Gutternigg M, Rendić D, Voglauer R, Iskratsch T, Wilson IB. Mammalian cells contain a second nucleocytoplasmic hexosaminidase. Biochem J 2009, 419:83-90. György B, Tóth E, Tarcsa E, Falus A, Buzás EI. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int J Biochem Cell Biol. 2006, 38:1662-77.
Hall FC, Weeks DE, Camilleri JP, Williams LA, Amos N, Darke C, Gibson K, Pile K, Wordsworth BP, Jessop JD. Influence of the HLA-DRB1 locus on susceptibility and severity in rheumatoid arthritis. QJM. 1996, 89:821-9. Halvorsen EH, Pollmann S, Gilboe IM, van der Heijde D, Landewé R, Ødegård S, Kvien TK, Molberg Ø. Serum IgG antibodies to peptidylarginine deiminase 4 in rheumatoid arthritis and associations with disease severity. Ann Rheum Dis 2008, 67:414-7.
Hamilton JA, Tak PP. The dynamics of macrophage lineage populations in inflammatory and autoimmune diseases. Arthritis Rheum 2009, 60:1210-21. Hanyecz A, Bárdos T, Berlo SE, Buzás E, Nesterovitch AB, Mikecz K, Glant TT. Induction of arthritis in SCID mice by T cells specific for the "shared epitope" sequence in the G3 domain of human cartilage proteoglycan. Arthritis Rheum 2003, 48:2959-73.
Harell JR, Frank E. Regression modeling strategies: with applications to linear models, logistic regression, and survival analysis. New York: Springer; 2001. Hauser N, Paulsson M, Heinegârd D, Mörgelin M. Interaction of cartilage matrix protein with aggrecan. Increased covalent cross-linking with tissue maturation. J Biol Chem 1996, 271:32247-52. Hedbom E, Heinegård D. Binding of fibromodulin and decorin to separate sites on fibrillar collagens. J Biol Chem 1993, 268:27307-12.
115
Hepbildikler ST, Sandhoff R, Kolzer M, Proia RL, Sandhoff K. Physiological substrates for human lysosomal beta-hexosaminidase S. J Biol Chem 2002, 277:25622572
Hill JA, Southwood S, Sette A, Jevnikar AM, Bell DA, Cairns E. Cutting edge: the conversion of arginine to citrulline allows for a high-affinity peptide interaction with the rheumatoid arthritis-associated HLA-DRB1*0401 MHC class II molecule. J Immunol 2003, 171:538-541.
Hou WS, Li Z, Gordon RE, Chan K, Klein MJ, Levy R, Keysser M, Keyszer G, Bromme D. Cathepsin k is a critical protease in synovial fibroblast-mediated collagen degradation. Am J Pathol 2001, 159:2167–2177.
Hou WS, Li W, Keyszer G, Weber E, Levy R, Klein MJ, Gravallese EM, Goldring SR, Brömme D. Comparison of cathepsins K and S expression within the rheumatoid and osteoarthritic synovium. Arthritis Res Ther 2006, 8:R176.
Huber LC, Distler O, Tarner I, Gay RE, Gay S, Pap T. Synovial fibroblasts: key players in rheumatoid arthritis. Rheumatology 2006, 45:669-675.
Hurtado-Guerrero R, Dorfmueller HC, van Aalten DM. Molecular mechanisms of OGlcNAcylation. Curr Opin Struct Biol 2008, 18:551-7.
Iero M, Valenti R, Huber V, Filipazzi P, Parmiani G, Fais S, Rivoltini L. Tumourreleased exosomes and their implications in cancer immunity. Cell Death Differ 2008, 15:80-8.
Ikeuchi H, Kuroiwa T, Hiramatsu N, Kaneko Y, Hiromura K, Ueki K, Nojima Y. Expression of interleukin-22 in rheumatoid arthritis: potential role as a proinflammatory cytokine. Arthritis Rheum 2005, 52:1037-46. Ilonen J, Reijonen H, Arvilommi H, Jokinen I, Möttönen T, Hannonen P. HLA-DR antigens and HLA-DQ beta chain polymorphism in susceptibility to rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 1990, 49:494-6. 116
Imai K, Hiramatsu A, Fukushima D, Pierschbacher MD, Okada Y. Degradation of decorin by matrix metalloproteinases: identification of the cleavage sites, kinetic analyses and transforming growth factor-β1 release. Biochem J 1997, 322:809-814.
Inoue E, Yamanaka H, Hara M, Tomatsu T, Kamatani N: Comparison of Disease Activity Score (DAS)28- erythrocyte sedimentation rate and DAS28- C-reactive protein threshold values. Ann Rheum Dis 2007, 66:407-409.
Iozzo RV. The family of the small leucine-rich proteoglycans: key regulators of matrix assembly and cellular growth. Crit Rev Biochem Mol Biol 1997, 32:141-74.
Isomaki P, Panesar M, Annenkov A, Clark JM, Foxwell BM, Chernajovsky Y, Cope AP. Prolonged exposure of T cells to TNF down-regulates TCR zeta and expression of the TCR/CD3 complex at the cell surface. J Immunol 2001, 166:5495–507.
Jacobsen S, Garred P, Madsen HO, Heegaard NH, Hetland ML, Stengaard-Pedersen K, Junker P, Lottenburger T, Ellingsen T, Smedegaard Andersen L, Hansen I, Skjødt H, Pedersen JK, Lauridsen UB, Svendsen AJ, Tarp U, Pødenphant J, Lindegaard H, Vestergaard A, Østergaard M, Hørslev-Petersen K. Mannose-binding lectin gene polymorphisms are associated with disease activity and physical disability in untreated, anti-cyclic citrullinated peptide-positive patients with early rheumatoid arthritis. J Rheumatol 2009, 36:731-5.
Johansen JS, Olee T, Price PA, Hashimoto S, Ochs RL, Lotz M. Regulation of YKL40 production by human articular chondrocytes. Arthritis Rheum 2001, 44:826-37.
John S, Shephard N, Liu G, Zeggini E, Cao M, Chen W, Vasavda N, Mills T, Barton A, Hinks A, Eyre S, Jones KW, Ollier W, Silman A, Gibson N, Worthington J, Kennedy GC. Whole-genome scan, in a complex disease, using 11,245 singlenucleotide polymorphisms: comparison with microsatellites. Am J Hum Genet. 2004, 75:54-64.
117
Johnson GB, Brunn GJ, Kodaira Y, Platt JL. Receptor-mediated monitoring of tissue well-being via detection of soluble heparan sulfate by Toll-like receptor 4. J Immunol 2002, 168:5233–5239.
Jones GC, Riley GP. ADAMTS proteinases: a multi-domain, multi-functional family with roles in extracellular matrix turnover and arthritis. Arthritis Res Ther 2005, 7:160-169.
Joosten LA, Koenders MI, Smeets RL, Heuvelmans-Jacobs M, Helsen MM, Takeda K, Akira S, Lubberts E, van de Loo FA, van den Berg WB. Toll-like receptor 2 pathway drives streptococcal cell wall-induced joint inflammation: Critical role of myeloid differentiation factor 88. J Immunol 2003, 171:6145–6153.
Joosten LA, Smeets RL, Koenders MI, van den Bersselaar LA, Helsen MM, OppersWalgreen B, Lubberts E, Iwakura Y, van de Loo FA, van den Berg WB. Interleukin18 promotes joint inflammation and induces interleukin-1-driven cartilage destruction. Am J Pathol 2004, 165:959-67.
Joosten LA, Netea MG, Kim SH, Yoon DY, Oppers-Walgreen B, Radstake TR, Barrera P, van de Loo FA, Dinarello CA, van den Berg WB. IL-32, a proinflammatory cytokine in rheumatoid arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103:3298-303. Jüngel A, Distler O, Schulze-Horsel U, Huber LC, Ha HR, Simmen B, Kalden JR, Pisetsky DS, Gay S, Distler JH. Microparticles stimulate the synthesis of prostaglandin E(2) via induction of cyclooxygenase 2 and microsomal prostaglandin E synthase 1. Arthritis Rheum 2007, 56:3564-74.
Kallberg H, Padyukov L, Plenge RM, Ronnelid J, Gregersen PK, van der Helm-van Mil AH, Toes RE, Huizinga TW, Klareskog L, Alfredsson L; Epidemiological Investigation of Rheumatoid Arthritis study group. Gene-gene and gene-environment interactions involving HLA-DRB1, PTPN22, and smoking in two subsets of rheumatoid arthritis. Am J Hum Genet. 2007, 80:867-75.
118
Kanangat S, Postlethwaite A, Hasty K, Kang A, Smeltzer M, Appling W, Schaberg D. Induction of multiple matrix metalloproteinases in human dermal and synovial fibroblasts by Staphylococcus aureus: implications in the pathogenesis of septic arthritis and other soft tissue infections. Arthritis Res Ther 2006, 8:R176.
Kashiwagi M, Enghild JJ, Gendron C, Hughes C, Caterson B, Itoh Y, Nagase H. Altered proteolytic activities of ADAMTS-4 expressed by C-terminal processing. J Biol Chem 2004, 279:10109–10119.
Keffer J, Probert L, Cazlaris H, Georgopoulos S, Kaslaris E, Kioussis D, Kollias G. Transgenic mice expressing human tumour necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. EMBO J 1991, 10:4025-31.
Kelso EB, Ferrell WR, Lockhart JC, Elias-Jones I, Hembrough T, Dunning L, Gracie JA, McInnes IB. Expression and proinflammatory role of proteinase-activated receptor 2 in rheumatoid synovium: ex vivo studies using a novel proteinase-activated receptor 2 antagonist. Arthritis Rheum 2007, 56:765-71.
Kirkham BW, Lassere MN, Edmonds JP, Juhasz KM, Bird PA, Lee CS, Shnier R, Portek IJ. Synovial membrane cytokine expression is predictive of joint damage progression in rheumatoid arthritis: a two-year prospective study (the DAMAGE study cohort). Arthritis Rheum 2006, 54:1122-31.
Kirkpatrick RB, Emery JG, Connor JR, Dodds R, Lysko PG, Rosenberg M. Induction and expression of human cartilage glycoprotein 39 in rheumatoid inflammatory and peripheral blood monocyte-derived macrophages. Exp Cell Res 1997, 237:46-54. Knedla A, Neumann E, Müller-Ladner U. Developments in the synovial biology field 2006. Arthritis Res Ther 2007, 9:209-217.
Knijff-Dutmer EA, Koerts J, Nieuwland R, Kalsbeek-Batenburg EM, van de Laar MA. Elevated levels of platelet microparticles are associated with disease activity in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2002, 46:1498-1503.
119
Kobayashi S, Momohara S, Kamatani N, Okamoto H. Molecular aspects of rheumatoid arthritis: role of environmental factors. FEBS J. 2008, 275:4456-62.
Koenders MI, Devesa I, Marijnissen RJ, Abdollahi-Roodsaz S, Boots AM, Walgreen B, di Padova FE, Nicklin MJ, Joosten LA, van den Berg WB. Interleukin-1 drives pathogenic Th17 cells during spontaneous arthritis in interleukin-1 receptor antagonist-deficient mice. Arthritis Rheum 2008, 58:3461–70.
Koga M, Matsuoka T, Katayama K, Takeda K, Nakata M, Sase M, Kato H, Furukawa S: Human parvovirus B19 in cord blood of premature infants. Am J Perinatol 2001, 18:237-240.
Kokkola R, Sundberg E, Ulfgren AK, Palmblad K, Li J, Wang H, Ulloa L, Yang H, Yan XJ, Furie R, Chiorazzi N, Tracey KJ, Andersson U, Harris HE. High mobility group box chromosomal protein 1: a novel proinflammatory mediator in synovitis. Arthritis Rheum 2002, 46:2598-603.
Koncz A, Pasztoi M, Mazan M, Fazakas F, Buzas E, Falus A, Nagy G. Nitric oxide mediates T cell cytokine production and signal transduction in histidine decarboxylase knockout mice. J Immunol 2007, 179:6613–9.
Konttinen YT, Ainola M, Valleala H, Ma J, Ida H, Mandelin J, Kinne RW, Santavirta S, Sorsa T, Lopez-Otin C, et al. Analysis of 16 different matrix metalloproteinases (MMP-1 to MMP-20) in the synovial membrane: different profiles in trauma and rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 1999, 58:691–697.
Krishnamoorthy L, Bess JW Jr, Preston AB, Nagashima K, Mahal LK. HIV-1 and microvesicles from T cells share a common glycome, arguing for a common origin. Nat Chem Biol 2009, 5:244-50.
Kunert-Keil C, Sperker B, Bien S, Wolf G, Grube M, Kroemer HK. Involvement of AP-2 binding sites in regulation of human β-glucuronidase. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2004, 370:331-339.
120
Kyburz D, Rethage J, Seibl R, Lauener R, Gay RE, Carson DA, Gay S. Bacterial peptidoglycans but not CpG oligodeoxynucleotides activate synovial fibroblasts by tolllike receptor signaling. Arthritis Rheum 2003, 48:642–650.
Laine RA. The information-storing potential of the sugar code. In: Gabius H-J, Gabius S, editors. Glycosciences: Status and perspectives. London: Chapman & Hall 1997, p 1–14.
Lally F, Smith E, Filer A, Stone MA, Shaw JS, Nash GB, Buckley CD, Rainger GE. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis Rheum 2005, 52:3460–3469.
Landers CD, Chelvarajan RL, Bondada S. The role of B-cells and accessory cells in the neonatal response to TI-2 antigens. Immunol Res 2005, 31:25-36.
Lard LR, van Gaalen FA, Schonkeren JJ, Pieterman EJ, Stoeken G, Vos K, Nelissen RG, Westendorp RG, Hoeben RC, Breedveld FC, Toes RE, Huizinga TW. Association of the -2849 interleukin-10 promoter polymorphism with autoantibody production and joint destruction in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2003, 48:1841-8.
Lee DM, Friend DS, Gurish MF, Benoist C, Mathis D, Brenner MB. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science 2002, 297:1689-92.
Leipe J, Skapenko A, Lipsky PE, Schulze-Koops H. Regulatory T cells in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2005, 7:93.
Lemieux MJ, Mark BL, Cherney MM, Withers SG, Mahuran DJ, James MN. Crystallographic structure of human beta-hexosaminidase A: interpretation of TaySachs mutations and loss of GM2 ganglioside hydrolysis. J Mol Biol 2006, 359:913929.
121
Linn-Rasker SP, van der Helm-van Mil AH, van Gaalen FA, Kloppenburg M, de Vries RR, le Cessie S, Breedveld FC, Toes RE, Huizinga TW. Smoking is a risk factor for anti-CCP antibodies only in rheumatoid arthritis patients who carry HLADRB1 shared epitope alleles. Ann Rheum Dis 2006, 65:366-71.
Li RW, Freeman C, Yu D, Hindmarsh EJ, Tymms KE, Parish CR, Smith PN. Dramatic regulation of heparanase activity and angiogenesis gene expression in synovium from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2008, 58:15901600.
Little CB, Hughes CE, Curtis CL, Janusz MJ, Bohne R, Wang-Weigand S, Taiwo YO, Mitchell PG, Otterness IG, Flannery CR, Caterson B. Matrix metalloproteinases are involved in C-terminal and interglobular domain processing of cartilage aggrecan in late stage cartilage degradation. Matrix Biol 2002, 21:271-288.
Liu CJ. The role of ADAMTS-7 and ADAMTS-12 in the pathogenesis of arthritis. Nat Clin Pract Rheumatol 2009, 5:38-45.
Lubberts E, Koenders MI, Oppers-Walgreen B, van den Bersselaar L, Coenen-de Roo CJ, Joosten LA, van den Berg WB. Treatment with a neutralizing anti-murine interleukin-17 antibody after the onset of collagen-induced arthritis reduces joint inflammation, cartilage destruction, and bone erosion. Arthritis Rheum 2004, 50:650– 9.
Lubberts E, Koenders MI, van den Berg WB. The role of T-cell interleukin-17 in conducting destructive arthritis: lessons from animal models. Arthritis Res Ther 2005, 7:29–37.
Lundberg K, Nijenhuis S, Vossenaar ER, Palmblad K, van Venrooij WJ, Klareskog L, Zendman AJ, Harris HE. Citrullinated proteins have increased immunogenicity and arthritogenicity and their presence in arthritic joints correlates with disease severity. Arthritis Res Ther 2005, 7:R458-67.
122
MacGregor AJ, Snieder H, Rigby AS, Koskenvuo M, Kaprio J, Aho K, Silman AJ. Characterizing the quantitative genetic contribution to rheumatoid arthritis using data from twins. Arthritis Rheum. 2000, 43:30-7.
Majeed M, McQueen F, Yeoman S, McLean L. Relationship between serum hyaluronic acid level and disease activity in early rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2004, 63:1166-1168.
Makrygiannakis D, Hermansson M, Ulfgren AK, Nicholas AP, Zendman AJ, Eklund A, Grunewald J, Skold CM, Klareskog L, Catrina AI. Smoking increases peptidylarginine deiminase 2 enzyme expression in human lungs and increases citrullination in BAL cells. Ann Rheum Dis 2008, 67:1488-92.
Manzo A, Paoletti S, Carulli M, Blades MC, Barone F, Yanni G, Fitzgerald O, Bresnihan B, Caporali R, Montecucco C, Uguccioni M, Pitzalis C. Systematic microanatomical analysis of CXCL13 and CCL21 in situ production and progressive lymphoid organization in rheumatoid synovitis. Eur J Immunol 2005, 35:1347-59.
Marciniak J, Zalewska A, Popko J, Zwierz K. Optimization of an enzymatic method for the determination of lysosomal N-acetyl-beta-D-hexosaminidase and betaglucuronidase in synovial fluid. Clin Chem Lab Med. 2006, 44:933-7. Marinò I, Columbo M, Marone G. The releasability of lysosomal enzymes from neutrophil leukocytes in patients with rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol 1996, 14:387-94.
Mark BL, Mahuran DJ, Cherney MM, Zhao D, Knapp S, James MN. Crystal structure of human beta-hexosaminidase B: understanding the molecular basis of Sandhoff and Tay-Sachs disease. J Mol Biol 2003, 327:1093-1109.
Martel-Pelletier J, Welsch DJ, Pelletier JP. Metalloproteases and inhibitors in arthritic diseases. Best Pract Res Clin Rheumatol 2001, 15:805-29.
123
Martel-Pelletier J, Boileau C, Pelletier JP, Roughley PJ. Cartilage in normal and osteoarthritis conditions. Best Pract Res Clin Rheumatol 2008, 22:351-84.
Matthews BW. The structure of E. coli beta-galactosidase. C R Biol 2005, 328:549556.
McCartney-francis N, Allen BJ, Mizel DE. Suppression of arthritis by an inhibitor of nitric oxide synthase. J Exp Med 1993, 178:749–54.
McColl GJ, Hammer J, Harrison LC. Absence of peripheral blood T cell responses to "shared epitope' containing peptides in recent onset rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 1997, 56:240-6.
McInnes IB, al-Mughales J, Field M, Leung BP, Huang FP, Dixon R, Sturrock RD, Wilkinson PC, Liew FY. The role of interleukin-15 in T-cell migration and activation in rheumatoid arthritis. Nat Med 1996, 2:175-82.
McInnes IB, Liew FY, Gracie JA. Interleukin-18: a therapeutic target in rheumatoid arthritis? Arthritis Res Ther 2005, 7:38-41.
McInnes IB, Schett G. Cytokines in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Nat Rev Immunol 2007, 7:429-442.
Meinecke I, Pap G, Mendoza H, Drange S, Ender S, Strietholt S, Gay RE, Seyfert C, Ink B, Gay S, Pap T, Peters MA. The small ubiquitin-like modifier mediates the resistance of prosthesis-loosening fibroblast-like synoviocytes against fas-induced apoptosis. Arthritis Rheum 2009, 60:2065-2070.
Meyer LH, Franssen L, Pap T. The role of mesenchymal cells in the pathophysiology of inflammatory arthritis. Best Pract Res Clin Rheumatol 2006, 20:969-81. Ménard HA. Anti-CCP versus anti-Sa antibodies for the diagnosis of RA. Nat Clin Pract Rheumatol 2007, 3:76-77.
124
Midwood K, Sacre S, Piccinini AM, Inglis J, Trebaul A, Chan E, Drexler S, Sofat N, Kashiwagi M, Orend G, Brennan F, Foxwell B. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nat Med 2009, 15:774-80.
Montecino-Rodriguez E, Dorshkind K. New perspectives in B-1 B-cell development and function. Trends Immunol 2006, 27:428-433.
Morand EF, Leech M, Bernhagen J. MIF: a new cytokine link between rheumatoid arthritis and atherosclerosis. Nat Rev Drug Discov 2006, 5:399-410.
Morozzi G, Fabbroni M, Bellisai F, Cucini S, Simpatico A, Galeazzi M. Low serum level of COMP, a cartilage turnover marker, predicts rapid and high ACR70 response to adalimumab therapy in rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol 2007, 26:1335-1338.
Mor-Vaknin N, Punturieri A, Sitwala K, Faulkner N, Legendre M, Khodadoust MS, Kappes F, Ruth JH, Koch A, Glass D, Petruzzelli L, Adams BS, Markovitz DM. The DEK nuclear autoantigen is a secreted chemotactic factor. Mol Cell Biol 2006, 26:9484-96.
Muller-Ladner U, Gay S. MMPs and rheumatoid synovial fibroblasts: Siamese twins in joint destruction? Ann Rheum Dis 2002, 61:957–959.
Muller-Ladner U, Ospelt C, Gay S, Distler O, Pap T. Cells of the synovium in rheumatoid arthritis. Synovial fibroblasts. Arthritis Res Ther 2007, 9:223.
Murphy CA, Langrish CL, Chen Y, Blumenschein W, McClanahan T, Kastelein RA, Sedgwick JD, Cua DJ. Divergent pro- and antiinflammatory roles for IL-23 and IL-12 in joint autoimmune inflammation. J Exp Med 2003, 198:1951-7.
Nadkarni S, Mauri C, Ehrenstein MR. Anti-TNF-alpha therapy induces a distinct regulatory T cell population in patients with rheumatoid arthritis via TGF-beta. J Exp Med 2007, 204:33-9.
125
Nagy G, Koncz A, Perl A. T cell activation-induced mitochondrial hyperpolarization is mediated by Ca2+- and redox-dependent production of nitric oxide. J Immunol 2003, 171:5188–97.
Nagy G, Barcza M, Gonchoroff N, Phillips PE, Perl A. Nitric oxide-dependent mitochondrial biogenesis generates Ca2+ signaling profile of lupus T cells. J Immunol 2004, 173:3676–83.
Nagy G, Perl A. The role of nitric oxide in abnormal T cell signal transduction in systemic lupus erythematosus. Clin Immunol 2006, 118:145–51.
Nagy G, Clark JM, Buzas EI, Gorman CL, Cope AP. Nitric oxide, chronic inflammation and autoimmunity. Immunol Lett 2007, 111:1–5.
Nagy G, Koncz A, Fernandez D, Perl A. Nitric oxide, mitochondrial hyperpolarization, and T cell activation. Free Radic Biol Med 2007, 1:1625–31.
Nagy G, Clark JM, Buzas E, Gorman C, Pasztoi M, Koncz A, Falus A, Cope AP. Nitric oxide production of T lymphocytes is increased in rheumatoid arthritis. Immunol Lett 2008, 118:55-8.
Nakamura H, Fujii Y, Inoki I, Sugimoto K, Tanzawa K, Matsuki H, Miura R, Yamaguchi Y, Okada Y. Brevican is degraded by matrix metalloproteinases and aggrecanase-1 (ADAMTS4) at different sites. J Biol Chem 2000, 275:38885–38890.
Nakiri Y, Minowa K, Suzuki J, Mitsuo A, Amano H, Morimoto S, Tokano Y, Takasaki Y. Expression of CD22 on peripheral B-cells in patients with rheumatoid arthritis: relation to CD5-positive B-cells. Clin Rheumatol 2007, 26:1721-1723. Nandakumar KS, Collin M, Olsén A, Nimmerjahn F, Blom AM, Ravetch JV, Holmdahl R. Endoglycosidase treatment abrogates IgG arthritogenicity: importance of IgG glycosylation in arthritis. Eur J Immunol 2007, 37:2973-2982.
126
Neidhart M, Gay RE, Gay S. Anti-interleukin-1 and anti-CD44 interventions producing significant inhibition of cartilage destruction in an in vitro model of cartilage invasion by rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis Rheum 2000, 43:1719-1728.
Netea MG, Azam T, Lewis EC, Joosten LA, Wang M, Langenberg D, Meng X, Chan ED, Yoon DY, Ottenhoff T, Kim SH, Dinarello CA. Mycobacterium tuberculosis induces interleukin-32 production through a caspase- 1/IL-18/interferon-gammadependent mechanism. PLoS Med 2006, 3:e277.
Newton JL, Harney SM, Wordsworth BP, Brown MA. A review of the MHC genetics of rheumatoid arthritis. Genes Immun 2004, 5:151–7.
Niedbala W, Wei XQ, Campbell C, Thomson D, Komai-Koma M, Liew FY. Nitric oxide preferentially induces type 1 T cell differentiation by selectively upregulating IL-12 receptor beta 2 expression via cGMP. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:16186–91.
Nigrovic PA, Lee DM. Mast cells in inflammatory arthritis. Arthritis Res Ther 2005, 7:1-11.
Nisoli E, Clementi E, Paolucci C. Mitochondrial biogenesis in mammals: the role of endogenous nitric oxide. Science 2003, 299:896–9.
Nyirkos P, Golds EE. Human synovial cells secrete a 39 kDa protein similar to a bovine mammary protein expressed during the non-lactating period. Biochem J 1990, 269:265-268.
Obregon C, Rothen-Rutishauser B, Gitahi SK, Gehr P, Nicod LP. Exovesicles from human activated dendritic cells fuse with resting dendritic cells, allowing them to present alloantigens. Am J Pathol 2006, 169:2127-36.
127
Ohata J, Zvaifler NJ, Nishio M, Boyle DL, Kalled SL, Carson DA, Kipps TJ. Fibroblast-like synoviocytes of mesenchymal origin express functional B cellactivating factor of the TNF family in response to proinflammatory cytokines. J Immunol 2005, 174:864-70.
Okamoto K, Makino S, Yoshikawa Y, Takaki A, Nagatsuka Y, Ota M, Tamiya G, Kimura A, Bahram S, Inoko H. Identification of I kappa BL as the second major histocompatibility complex-linked susceptibility locus for rheumatoid arthritis. Am J Hum Genet. 2003, 72:303-12.
Olee T, Hashimoto S, Quach J, Lotz M. IL-18 is produced by articular chondrocytes and induces proinflammatory and catabolic responses. J Immunol 1999, 162:1096100.
Ortutay Z, Polgar A, Gomor B, Geher P, Lakatos T, Glant TT, Gay RE, Gay S, Pállinger E, Farkas C, Farkas E, Tóthfalusi L, Kocsis K, Falus A, Buzás EI. Synovial fluid exoglycosidases are predictors of rheumatoid arthritis and are effective in cartilage glycosaminoglycan depletion. Arthritis Rheum 2003, 48:2163-2172.
Pancewicz SA, Wielgat P, Hermanowska-Szpakowicz T, Kondrusik M, Zajkowska J, Grygorczuk S, Popko J, Zwierz K. Activity of lysosomal exoglycosidases in the serum of patients with chronic Lyme arthritis. Int J Med Microbiol 2006, 40:280-282.
Palmer G, Talabot-Ayer D, Lamacchia C, Toy D, Seemayer CA, Viatte S, Finckh A, Smith DE, Gabay C. Inhibition of interleukin-33 signaling attenuates the severity of experimental arthritis. Arthritis Rheum 2009, 60:738-49.
Pap E, Pállinger E, Pásztói M, Falus A. Highlights of a new type of intercellular communication: microvesicle-based information transfer. Inflamm Res 2009, 58:1-8.
Pap T. Direct interaction of immunoglobulins with synovial fibroblasts: a missing link in the pathogenesis of rheumatoid arthritis? Arthritis Res Ther 2005, 7:44-6.
128
Parisi JT. Significance of chromogenic variants in studies of virulence factors of Staphylococcus aureus. J Bacteriol 1966, 92:589-591. Pascual M, Nieto A, Matarán L, Balsa A, Pascual-Salcedo D, Martín J. IL-6 promoter polymorphisms in rheumatoid arthritis. Genes Immun 2000, 1:338-40.
Peltomaa R, Paimela L, Harvey S, Helve T, Leirisalo-Repo M. Increased level of YKL-40 in sera from patients with early rheumatoid arthritis: a new marker for disease activity. Rheumatol Int 2001, 20:192-6.
Pettipher ER, Higgs GA, Henderson B. Interleukin 1 induces leukocyte infiltration and cartilage proteoglycan degradation in the synovial joint. Proc Natl Acad Sci U S A 1986, 83:8749-53.
Pierer M, Rethage J, Seibl R, Lauener R, Brentano F,Wagner U, Hantzschel H, Michel BA, Gay RE, Gay S, Kyburz D. Chemokine secretion of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts stimulated by Toll-like receptor 2 ligands. J Immunol 2004, 172:1256–1265.
Pitsillides AA, Worrall JG, Wilkinson LS, Bayliss MT, Edwards JCW. Hyaluronan concentration in non-inflamed and rheumatoid synovium. Br J Rheumatol 1994, 33:5–10.
Plenge RM, Cotsapas C, Davies L, Price AL, de Bakker PI, Maller J, Pe'er I, Burtt NP, Blumenstiel B, DeFelice M, Parkin M, Barry R, Winslow W, Healy C, Graham RR, Neale BM, Izmailova E, Roubenoff R, Parker AN, Glass R, Karlson EW, Maher N, Hafler DA, Lee DM, Seldin MF, Remmers EF, Lee AT, Padyukov L, Alfredsson L, Coblyn J, Weinblatt ME, Gabriel SB, Purcell S, Klareskog L, Gregersen PK, Shadick NA, Daly MJ, Altshuler D. Two independent alleles at 6q23 associated with risk of rheumatoid arthritis. Nat Genet 2007, 39:1477–82.
Plenge RM, Seielstad M, Padyukov L, Lee AT, Remmers EF, Ding B, Liew A, Khalili H, Chandrasekaran A, Davies LR, Li W, Tan AK, Bonnard C, Ong RT, Thalamuthu A, Pettersson S, Liu C, Tian C, Chen WV, Carulli JP, Beckman EM, 129
Altshuler D, Alfredsson L, Criswell LA, Amos CI, Seldin MF, Kastner DL, Klareskog L, Gregersen PK. TRAF1-C5 as a risk locus for rheumatoid arthritis--a genomewide study. N Engl J Med 2007, 357:1199-209.
Pohlers D, Beyer A, Koczan D, Wilhelm T, Thiesen HJ, Kinne RW. Constitutive upregulation of the transforming growth factor-beta pathway in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis Res Ther 2007, 9:R59.
Poletaev A, Osipenko L. General network of natural autoantibodies as immunological homunculus (Immunculus). Autoimmun Rev 2003, 2:264-271.
Polgar A, Falus A, Koo E, Ujfalussy I, Sesztak M, Szuts I, Konrad K, Hodinka L, Bene E, Meszaros G, Ortutay Z, Farkas E, Paksy A, Buzas EI. Elevated levels of synovial fluid antibodies reactive with the small proteoglycans biglycan and decorin in patients with rheumatoid arthritis or other joint diseases. Rheumatology (Oxford) 2003, 42:522-527. Popko J, Zalewska A, Olszewski S, Górska A, Sierakowski S, Zwierz K, Urban M. Activity of N-acetyl-beta hexosaminidase in serum and joint fluid of the knees of patients with juvenile idiopatic arthritis. Clin Exp Rheumatol 2003, 21:675-675. Popko J, Zalewska A, Gołaszewska Z, Marciniak J, Sierakowski S, Worowski K, Zwierz K. Comparative analysis of hexosaminidase and cathepsin D expression in synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis and traumatized joints. Clin Exp Rheumatol 2005, 23:725-726. Popko J, Marciniak J, Zalewska A, Małdyk P, Rogalski M, Zwierz K. The activity of exoglycosidases in the synovial membrane and knee fluid of patients with rheumatoid arthritis and juvenile idiopathic arthritis. Scand J Rheumatol 2006, 35:189-192.
Popko J, Marciniak J, Ilendo E, Knas M, Guszczyn T, Stasiak-Barmuta A, Moniuszko T, Zwierz K, Wysocka J. Profile of exoglycosidases in synovial cell cultures derived from human synovial membrane. Cell Biochem Biophys 2008, 51:89-95.
130
Pothacharoen P, Teekachunhatean S, Louthrenoo W, Yingsung W, Ong-Chai S, Hardingham T, Kongtawelert P. Raised chondroitin sulfate epitopes and hyaluronan in serum from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Osteoarthritis Cartilage 2006, 14:299-301.
Prakken BJ, Samodal R, Le TD, Giannoni F, Yung GP, Scavulli J, Amox D, Roord S, de Kleer I, Bonnin D, Lanza P, Berry C, Massa M, Billetta R, Albani S. Epitopespecific immunotherapy induces immune deviation of proinflammatory T cells in rheumatoid arthritis. Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 101:4228-33.
Pratta MA, Tortorella MD, Arner EC. Age-related changes in aggrecan glycosylation affect cleavage by aggrecanase. J Biol Chem 2000, 275:39096-102.
Pratta MA, Yao W, Decicco C, Tortorella MD, Liu RQ, Copeland RA, Magolda R, Newton RC, Trzaskos JM, Arner EC. Aggrecan protects cartilage collagen from proteolytic cleavage. J Biol Chem 2003, 278:45539–45545.
Prevoo ML, van't Hof MA, Kuper HH, van Leeuwen MA, Putte LB van de, van Riel PL. Modified disease activity scores that include twenty-eight joint counts. Development and validation in a prospective longitudinal study of patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1995, 38:44-48.
Primakoff P, Myles DG. The ADAM gene family: surface proteins with adhesion and protease activity. Trends Genet 2000, 16:83-87.
Quinn MA, Conaghan PG, O'Connor PJ, Karim Z, Greenstein A, Brown A, Brown C, Fraser A, Jarret S, Emery P. Very early treatment with infliximab in addition to methotrexate in early, poor-prognosis rheumatoid arthritis reduces magnetic resonance imaging evidence of synovitis and damage, with sustained benefit after infliximab withdrawal: results from a twelve-month randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Arthritis Rheum 2005, 52:27-35.
131
Quintana FJ, Buzas E, Prohaszka Z, Biro A, Kocsis J, Fust G, Falus A, Cohen IR. Knock-out of the histidine decarboxylase gene modifies the repertoire of natural autoantibodies. J Autoimmun 2004, 22:297–305.
Rada JA, Cornuet PK, Hassell JR. Regulation of corneal collagen fibrillogenesis in vitro by corneal proteoglycan (lumican and decorin) core proteins. Exp Eye Res 1993, 56:635-48.
Radstake TR, Roelofs MF, Jenniskens YM, Oppers-Walgreen B, van Riel PL, Barrera P, Joosten LA, van den Berg WB. Expression of toll-like receptors 2 and 4 in rheumatoid synovial tissue and regulation by proinflammatory cytokines interleukin12 and interleukin-18 via interferon-gamma. Arthritis Rheum 2004, 50:3856–3865.
Raychaudhuri S, Remmers EF, Lee AT, Hackett R, Guiducci C, Burtt NP, Gianniny L, Korman BD, Padyukov L, Kurreeman FA, Chang M, Catanese JJ, Ding B, Wong S, van der Helm-van Mil AH, Neale BM, Coblyn J, Cui J, Tak PP, Wolbink GJ, Crusius JB, van der Horst-Bruinsma IE, Criswell LA, Amos CI, Seldin MF, Kastner DL, Ardlie KG, Alfredsson L, Costenbader KH, Altshuler D, Huizinga TW, Shadick NA, Weinblatt ME, de Vries N, Worthington J, Seielstad M, Toes RE, Karlson EW, Begovich AB, Klareskog L, Gregersen PK, Daly MJ, Plenge RM. Common variants at CD40 and other loci confer risk of rheumatoid arthritis. Nat Genet 2008, 40:121623.
Recklies AD, White C, Ling H. The chitinase 3-like protein human cartilage glycoprotein 39 (HC-gp39) stimulates proliferation of human connective-tissue cells and activates both extracellular signal-regulated kinase- and protein kinase Bmediated signalling pathways. Biochem J 2002, 365:119-26.
Remmers EF, Plenge RM, Lee AT, Graham RR, Hom G, Behrens TW, de Bakker PI, Le JM, Lee HS, Batliwalla F, Li W, Masters SL, Booty MG, Carulli JP, Padyukov L, Alfredsson L, Klareskog L, Chen WV, Amos CI, Criswell LA, Seldin MF, Kastner DL, Gregersen PK. STAT4 and the risk of rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. N Engl J Med. 2007, 357:977-86.
132
Rengel Y, Ospelt C, Gay S. Proteinases in the joint: clinical relevance of proteinases in joint destruction. Arthritis Res Ther 2007, 9:221.
Rijkers GT, Sanders EA, Breukels MA, Zegers BJ. Infant B-cell responses to polysaccharide determinants. Vaccine 1998, 16:1396-1400.
Robinson WH, DiGennaro C, Hueber W, Haab BB, Kamachi M, Dean EJ, Fournel S, Fong D, Genovese MC, de Vegvar HE, Skriner K, Hirschberg DL, Morris RI, Muller S, Pruijn GJ, van Venrooij WJ, Smolen JS, Brown PO, Steinman L, Utz PJ. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nat Med. 2002, 8:295–301.
Rosengren S, Boyle DL, Firestein GS. Acquisition, culture, and phenotyping of synovial fibroblasts. Methods Mol Med 2007, 135:365-75.
Ruth JH, Amin MA,Woods JM, He X, Samuel S, Yi N, Haas CS, Koch AE, Bullard DC. Accelerated development of arthritis in mice lacking endothelial selectins. Arthritis Res Ther 2005, 7:R959–R970.
Salvat S, Auger I, Rochelle L, Begovich A, Geburher L, Sette A, Roudier J. Tolerance to a self-peptide from the third hypervariable region of HLA DRB1*0401 in rheumatoid arthritis patients and normal subjects. J Immunol 1994, 153:5321-9.
Schiller M, Bekeredjian-Ding I, Heyder P, Blank N, Ho AD, Lorenz HM. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death Differ 2008, 15:183-191.
Schulze-Koops H, Kalden JR. The balance of Th1/Th2 cytokines in rheumatoid arthritis. Best Pract Res Clin Rheumatol 2001, 15:677-91.
Sebbag M, Chapuy-Regaud S, Auger I, Petit-Texeira E, Clavel C, Nogueira L, Vincent C, Cornélis F, Roudier J, Serre G. Clinical and pathophysiological significance of the autoimmune response to citrullinated proteins in rheumatoid arthritis. Joint Bone Spine 2004, 71:493–502. 133
Seyler TM, Park YW, Takemura S, Bram RJ, Kurtin PJ, Goronzy JJ, Weyand CM. BLyS and APRIL in rheumatoid arthritis. J Clin Invest 2005, 115:3083-92.
Shahrara S, Huang Q, Mandelin AM II, Pope RM. TH-17 cells in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2008, 10:R93.
Sharif M, Rook G, Wilkinson LS, Worrall JG, Edwards JC. Terminal Nacetylglucosamine in chronic synovitis. Br J Rheumatol 1990, 29:25–31.
Shikhman AR, Brinson DC, Lotz M. Profile of glycosaminoglycan-degrading glycosidases and glycoside sulfatases secreted by human articular chondrocytes in homeostasis and inflammation. Arthritis Rheum 2000, 43:1307-1314.
Shimizu T, Ohtani K, Hirakawa H, Ohshima K, Yamashita A, Shiba T, Ogasawara N, Hattori M, Kuhara S, Hayashi H. Complete genome sequence of Clostridium perfringens, an anaerobic flesh-eater. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:996-1001. Siebert H-C, Born K, Andre´ S, Frank M, Kaltner H, von der Lieth C-W, Heck AJR, Jime´nez-Barbero J, Kopitz J, Gabius H-J. Carbohydrate chain of ganglioside GM1 as a ligand: Identification of the binding strategies of three 15 mer peptides and their divergence from the binding modes of growth-regulatory galectin-1 and cholera toxin. Chem Eur J 2006, 12:388–402.
Sigurdsson S, Padyukov L, Kurreeman FAS, Liljedahl U, Wiman, AC, Alfredsson L, Toes R, Ronnelid J, Klareskog L, Huizinga TWJ, Alm G, Syvanen AC, Ronnblom L. Association of a haplotype in the promoter region of the interferon regulatory factor 5 gene with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2007, 56:2202-2210.
Sivalingam SP, Yoon KH, Koh DR, Fong KY. Single-nucleotide polymorphisms of the interleukin-18 gene promoter region in rheumatoid arthritis patients: protective effect of AA genotype. Tissue Antigens 2003, 62:498-504.
134
Skriner K, Adolph K, Jungblut PR, Burmester GR. Association of citrullinated proteins with synovial exosomes. Arthritis Rheum 2006, 54:3809-14.
Solau-Gervais E, Zerimech F, Lemaire R, Fontaine C, Huet G, Flipo RM. Cysteine and serine proteases of synovial tissue in rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Scand J Rheumatol 2007, 36:373-377.
Spiro RG. Protein glycosylation: Nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology 2002, 12:43R–56R.
Stanton H, Rogerson FM, East CJ, Golub SB, Lawlor KE, Meeker CT, Little CB, Last K, Farmer PJ, Campbell IK, Fourie AM, Fosang AJ. ADAMTS5 is the major aggrecanase in mouse cartilage in vivo and in vitro. Nature 2005, 434:648–652.
Starr CR, Engleberg NC. Role of hyaluronidase in subcutaneous spread and growth of group A streptococcus. Infect Immun 2006, 74:40-48.
Stastny P. Mixed lymphocyte cultures in rheumatoid arthritis. J Clin Invest 1976, 57:1148–57.
Stastny P. Association of the B-cell alloantigen DRw4 with rheumatoid arthritis. N Engl J Med 1978, 298:869–71.
Stephens RW, Ghosh P, Taylor TK, Gale CA, Swann JC, Robinson RG, Webb J. The origins and relative distribution of polysaccharidases in rheumatoid and osteoarthritic fluids. J Rheumatol 1975, 2:393-400.
Stillman BN, Hsu DK, Pang M, Brewer CF, Johnson P, Liu FT, Baum LG. Galectin-3 and galectin-1 bind distinct cell surface glycoprotein receptors to induce T cell death. J Immunol 2004, 176:778–789. Sturm A, Lensch M, Andre´ S, Kaltner H, Wiedenmann B, Rosewicz S, Dignass AU, Gabius H-J. Human galectin-2: Novel inducer of T cell apoptosis with distinct profile of caspase activation. J Immunol 2004, 173:3825–3837. 135
Suzuki A, Yamada R, Chang X, Tokuhiro S, Sawada T, Suzuki M, Nagasaki M, Nakayama-Hamada M, Kawaida R, Ono M, Ohtsuki M, Furukawa H, Yoshino S, Yukioka M, Tohma S, Matsubara T, Wakitani S, Teshima R, Nishioka Y, Sekine A, Iida A, Takahashi A, Tsunoda T, Nakamura Y, Yamamoto K. Functional haplotypes of PADI4, encoding citrullinating enzyme peptidylarginine deiminase 4, are associated with rheumatoid arthritis. Nat Genet. 2003, 34:395-402. Szántó S, Bárdos T, Szabó Z, David CS, Buzás EI, Mikecz K, Glant TT. Induction of arthritis in HLA-DR4-humanized and HLA-DQ8-humanized mice by human cartilage proteoglycan aggrecan but only in the presence of an appropriate (non-MHC) genetic background. Arthritis Rheum 2004, 50:1984-95.
Takemura S, Braun A, Crowson C, Kurtin PJ, Cofield RH, O'Fallon WM, Goronzy JJ, Weyand CM. Lymphoid neogenesis in rheumatoid synovitis. J Immunol 2001, 167:1072-80. Taketazu F, Kato M, Gobl A, Ichijo H, ten Dijke P, Itoh J, Kyogoku M, Rönnelid J, Miyazono K, Heldin CH, Funa K. Enhanced expression of transforming growth factor-beta s and transforming growth factor-beta type II receptor in the synovial tissues of patients with rheumatoid arthritis. Lab Invest 1994, 70:620-630.
Tchetverikov I, Ronday HK, Van El B, Kiers GH, Verzijl N, TeKoppele JM, Huizinga TW, DeGroot J, Hanemaaijer R. MMP profile in paired serum and synovial fluid samples of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 2004, 63:881– 883.
Termeer C, Benedix F, Sleeman J, Fieber C, Voith U, Ahrens T, Miyake K, Freudenberg M, Galanos C, Simon JC. Oligosaccharides of Hyaluronan activate dendritic cells via toll-like receptor 4. J Exp Med 2002, 195:99–111. ’t Hart BA, van Kooyk Y. Ying-yang regulation of autoimmunity by DCs. Trends Immunol 2004, 25:353-359.
136
Théry C, Ostrowski M, Segura E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol 2009, 9:581-93.
Thomson W, Barton A, Ke X, Eyre S, Hinks A, Bowes J, Donn R, Symmons D, Hider S, Bruce IN; Wellcome Trust Case Control Consortium, Wilson AG, Marinou I, Morgan A, Emery P; YEAR Consortium, Carter A, Steer S, Hocking L, Reid DM, Wordsworth P, Harrison P, Strachan D, Worthington J. Rheumatoid arthritis association at 6q23. Nat Genet 2007, 39:1431–3.
Tokuhiro S, Yamada R, Chang X, Suzuki A, Kochi Y, Sawada T, Suzuki M, Nagasaki M, Ohtsuki M, Ono M, Furukawa H, Nagashima M, Yoshino S, Mabuchi A, Sekine A, Saito S, Takahashi A, Tsunoda T, Nakamura Y, Yamamoto K. An intronic SNP in a RUNX1 binding site of SLC22A4, encoding an organic cation transporter, is associated with rheumatoid arthritis. Nat Genet. 2003, 35:341-8. Tomatsu S, Montaño AM, Dung VC, Grubb JH, Sly WS. Mutations and polymorphisms in GUSB gene in mucopolysaccharidosis VII (Sly Syndrome). Hum Mutat 2009, 30:511-9. Torres PU, Prié D, Molina-Blétry V, Beck L, Silve C, Friedlander G. Klotho: an antiaging protein involved in mineral and vitamin D metabolism. Kidney Int 2007, 71:730-737.
Trabandt A, Gay RE, Fassbender HG, Gay S. Cathepsin B in synovial cells at the site of joint destruction in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1991, 34:1444–1451. Valadi H, Ekström K, Bossios A, Sjöstrand M, Lee JJ, Lötvall JO. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol 2007, 9:654-659.
Van den Berg WB. Lessons from animal models of arthritis. Curr Rheumatol Rep 2002, 4:232-9.
137
van Gaalen FA, Linn-Rasker SP, van Venrooij WJ, de Jong BA, Breedveld FC, Verweij CL, Toes RE, Huizinga TW. Autoantibodies to cyclic citrullinated peptides predict progression to rheumatoid arthritis in patients with undifferentiated arthritis: a prospective cohort study. Arthritis Rheum. 2004, 50:709–715.
van Lent PL, Figdor CG, Barrera P, van Ginkel K, Sloetjes A, van den Berg WB, Torensma R. Expression of the dendritic cell-associated C-type lectin DC-SIGN by inflammatory matrix metalloproteinase-producing macrophages in rheumatoid arthritis synovium and interaction with intercellular adhesion molecule 3-positive T cells. Arthritis Rheum 2003, 48:360–369. van’t Hof RJ, Armour KJ, Smith LM, Armour KE, Wei XQ, Liew FY, Ralston SH. Requirement of the inducible nitric oxide synthase pathway for IL-1-induced osteoclastic bone resorption. PNAS 2000, 97:7993–8. van’t Hof RJ, Ralston SH. Nitric oxide and bone. Immunology 2001, 103:255–61.
Varki A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology 1993, 3:97-130.
Vermeire K, Heremans H, Vandeputte M, Huang S, Billiau A, Matthys P. Accelerated collagen-induced arthritis in IFN-gamma receptor-deficient mice. J Immunol 1997, 158:5507-13.
Verpoort KN, Jol-van der Zijde CM, Papendrecht-van der Voort EA, Ioan-Facsinay A, Drijfhout JW, van Tol MJ, Breedveld FC, Huizinga TW, Toes RE. Isotype distribution of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies in undifferentiated arthritis and rheumatoid arthritis reflects an ongoing immune response. Arthritis Rheum. 2006, 54:3799–3808.
Visser H, le Cessie S, Vos K, Breedveld FC, Hazes JM. How to diagnose rheumatoid arthritis early: a prediction model for persistent (erosive) arthritis. Arthritis Rheum. 2002, 46:357–365.
138
Volkova ZI, Astakhova TA, Trofimova TM, Mul'diiarov PIa. Glycosaminoglycans and beta-glucuronidase in peripheral blood cells and biological fluids of patients with rheumatoid arthritis. Vopr Med Khim 1988, 34:53-9.
Wagener R, Ehlen HW, Ko YP, Kobbe B, Mann HH, Sengle G, Paulsson M. The matrilins--adaptor proteins in the extracellular matrix. FEBS Lett. 2005, 579:3323-9.
Wang JY, Roehrl MH. Glycosaminoglycans are a potential cause of rheumatoid arthritis. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:14362-14367.
Warstat K, Pap T, Klein G, Gay S, Aicher WK. Co-activation of synovial fibroblasts by laminin-111 and transforming growth factor-beta induces expression of matrix metalloproteinases 3 and 10 independently of nuclear factor-kappaB. Ann Rheum Dis 2008, 67:559-62.
Weyand CM, Goronzy JJ. Ectopic germinal center formation in rheumatoid synovitis. Ann N Y Acad Sci 2003, 987:140-9. Wiberg C, Klatt AR, Wagener R, Paulsson M, Bateman JF ¶, Heinegård D, Mörgelin M. Complexes of Matrilin-1 and Biglycan or Decorin Connect Collagen VI Microfibrils to Both Collagen II and Aggrecan. J Biol Chem 2003, 278:37698-37704.
Winterbottom N, Tondravi MM, Harrington TL, Klier FG, Vertel BM, Goetinck PF. Cartilage matrix protein is a component of the collagen fibril of cartilage. Dev Dyn 1992, 193:266-76. Witkowski JM, Soroczyńska-Cybula M, Bryl E, Smoleńska Z, Jóźwik A. Klotho--a common link in physiological and rheumatoid arthritis-related aging of human CD4+ lymphocytes. J Immunol 2007, 178:771-7.
Wucherpfennig KW. Mechanisms for the induction of autoimmunity by infectious agents. J Clin Invest. 2001, 108:1097-104.
139
Xu G, Nie H, Li N, Zheng W, Zhang D, Feng G, Ni L, Xu R, Hong J, Zhang JZ. Role of osteopontin in amplification and perpetuation of rheumatoid synovitis. J Clin Invest 2005, 115:1060-7.
Yoshida M, Sai S, Marumo K, Tanaka T, Itano N, Kimata K, Fujii K. Expression analysis of three isoforms of hyaluronan synthase and hyaluronidase in the synovium of knees in osteoarthritis and rheumatoid arthritis by quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction. Arthritis Res Ther 2004, 6:R514-20.
Yoshitomi H, Sakaguchi N, Kobayashi K, Brown GD, Tagami T, Sakihama T, Hirota K, Tanaka S, Nomura T, Miki I, Gordon S, Akira S, Nakamura T, Sakaguchi S. A role for fungal {beta}-glucans and their receptor Dectin-1 in the induction of autoimmune arthritis in genetically susceptible mice. J Exp Med 2005, 201:949–960.
Zandvoort A, Timens W. The dual function of the splenic marginal zone: essential for initiation of anti-TI-2 responses but also vital in the general first-line defense against blood-borne antigens. Clin Exp Immunol 2002, 130:4-11.
Zhang HG, Liu C, Su K, Yu S, Zhang L, Zhang S, Wang J, Cao X, Grizzle W, Kimberly RP. A membrane form of TNF-alpha presented by exosomes delays T cell activation-induced cell death. J Immunol 2006, 176:7385-93.
140
10. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 10.1. A disszertáció témájához kapcsolódó közlemények listája: 1. Tokatly I*, Pasztoi M*, Nagy G, Pozsonyi É, Rajczy K, Bősze S, Horvati K, Szakacs F, Laszlo V, Jelinek I, Holub MC, Pallinger É, Pap E, Glant TT, Hudecz F, Falus A, Buzás EI. Citrullination breaks TH-17 tolerance to a shared epitopecontaining cartilage proteoglycan aggrecan peptide. (közlésre elküldve)
2. Pasztoi M, Nagy G, Geher P, Lakatos T, Toth K, Wellinger K, Pocza P, Gyorgy B, Holub MC, Kittel A, Paloczy K, Mazan M, Nyirkos P, Falus A, Buzas EI. Gene expression and activity of cartilage-degrading glycosidases in human rheumatoid arthritis and osteoarthritis synovial fibroblasts. Arthritis Res Ther 2009, 11(3):R68. IF:4,485 3. Pap E, Pállinger E, Pásztói M, Falus A. Highlights of a new type of intercellular communication: microvesicle-based information transfer. Inflamm Res 2009, 58(1):18. Review. IF:1,457 4. György B, Tóthfalusi L, Nagy G, Pásztói M, Géher P, Lörinc Z, Polgár A, Rojkovich B, Ujfalussy I, Poór G, Pócza P, Wiener Z, Misják P, Koncz A, Falus A, Buzás EI. Natural autoantibodies reactive with glycosaminoglycans in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 2008, 10(5):R110. IF:4,485
5. Nagy G, Clark JM, Buzas E, Gorman C, Pasztoi M, Koncz A, Falus A, Cope AP. Nitric oxide production of T lymphocytes is increased in rheumatoid arthritis. Immunol Lett 2008, 118(1):55-8. IF:2,858 6. Buzás EI, György B, Pásztói M, Jelinek I, Falus A, Gabius HJ. Carbohydrate recognition systems in autoimmunity. Autoimmunity 2006, 39(8):691-704. Review. IF:2,033 A Ph.D. értekezés témájában megjelent közlemények összesített impakt faktora: 15,318
141
10.2. A disszertáció témájához nem kapcsolódó közlemények listája: 1. Nagy G*, Pasztoi M*, Trenkmann M, Haris A, Polner K, Moritz F, Jüngel A, Distler JHW, Hauser T, Brock M, Ulrich S, Gay RE, Falus A, Michel BA, Speich R, Distler O, Pisetsky DS, Buzas EI, Gay S, Huber LC. Correlations between the Serum Levels of Microparticles and Disease Activity in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. (közlésre elküldve)
2. Koncz A, Pasztoi M, Mazan M, Fazakas F, Buzas E, Falus A, Nagy G. Nitric oxide mediates T cell cytokine production and signal transduction in histidine decarboxylase knockout mice. J Immunol 2007, 179(10):6613-9. IF:6,068 3. Veszelka S, Pásztói M, Farkas AE, Krizbai I, Dung NTK, Niwa M, Abrahám CS, Deli MA. Pentosan polysulfate protects brain endothelial cells against bacterial lipopolysaccharide-induced damages. Neurochem Int 2007, 50(1):219-28. IF:2,975
Kumulatív impakt faktor: 24,361
142
11. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS Köszönetemet szeretném kifejezni Dr. Falus András Professzor Úrnak, aki befogadott az intézetbe, megteremtette számomra a sikeres doktori munka feltételeit, munkámat figyelemmel kísérte és hasznos szakmai tanácsokkal látott el. Köszönettel és hálával tartozok témavezetőmnek, Dr. Buzás Editnek, aki bevezetett a molekuláris biológia és az immunológia területére. Rendkívül szerencsésnek érzem magamat, hogy munkacsoportjának tagja lehettem, ahol megtanultam a felfedezés nehézségei mellett, annak szépségét és izgalmát is. Tőle sajátíthattam el a tudományos gondolkodásmódot, és éveken keresztül irányította tanácsaival segítette munkám előrehaladást. Minden nehéz pillanatban mellettem állt, és teljes mértékben támogatott. Köszönetet szeretnék mondani első témavezetőmnek, Dr. Deli Máriának, Ngo Thi Khue Dungnak és Farkasné Nagy Krisztinának, akiktől a sejttenyésztés technikáját és a kutatómunkához rendkívül fontos precizitást is megtanulhattam. Szeretném megköszönni a Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet és az MTASE Molekuláris Immunológiai Kutatócsoport összes dolgozójának, hogy barátsággal és szeretettel vettek körül. Köszönöm férjemnek, Szente Balázsnak, hogy mindvégig mellettem állt megértésével és szeretetével. Végül, de nem utolsó sorban köszönetem szeretném kifejezni a családomnak, hogy a kutatói pályafutásom első pillanatától ösztönöztek, szeretettel és lelkesen támogattak.
143
