Red de kastanje voor Nederland

Eindrapport Onderzoeksprogramma

‘Red de kastanje voor Nederland’

Werkgroep Aesculaap, november 2005, Boskoop

© 2005 Wageningen, Praktijkonderzoek Plant & Omgeving B.V. Alle rechten voorbehouden. Niets uit deze uitgave mag worden verveelvoudigd, opgeslagen in een geautomatiseerd gegevensbestand, of openbaar gemaakt, in enige vorm of op enige wijze, hetzij elektronisch, mechanisch, door fotokopieën, opnamen of enige andere manier zonder voorafgaande schriftelijke toestemming van Praktijkonderzoek Plant & Omgeving. Praktijkonderzoek Plant & Omgeving B.V. is niet aansprakelijk voor eventuele schadelijke gevolgen die kunnen ontstaan bij gebruik van gegevens uit deze uitgave.

Colofon Programmacoördinator: Dr. Ir. M.W.C. Dijkshoorn-Dekker Hoofdprojectleider onderzoek: Ir. A.J. van Kuik Wageningen UR Praktijkonderzoek Plant & Omgeving B.V. Adres Tel. Fax E-mail

2

: : : : :

Rijneveld 153, 2771 XV Boskoop Postbus 118, 2770 AC Boskoop 0172 - 236700 0172 - 236710 [email protected]

Voorwoord Eind 2004 bleek een mysterieuze bloedingsziekte in Nederland onder paardenkastanjes op grote schaal om zich heen te grijpen. De eerste verschijnselen werden overigens al in 2002 geconstateerd. Onderzoeksinstellingen, gemeenten en andere organisaties, die professioneel betrokken zijn bij de zorg voor de bomen in Nederland, maakten zich grote zorgen over deze tot dan onbekende ziekte en hebben daartoe hun krachten gebundeld in de werkgroep Aesculaap1. De minister van Landbouw, Natuur en Voedselkwaliteit heeft in april aan de werkgroep Aesculaap opdracht gegeven tot een onderzoek naar de oorzaak van de bloedingsziekte en naar de ernst en omvang van de ziekte in Nederland. Dit rapport is de weerslag van dat onderzoek. Het gehele onderzoek staat onder verantwoordelijkheid van de werkgroep Aesculaap. In deze werkgroep, onder coördinatie van het Praktijkonderzoek Plant en Omgeving (PPO) van Wageningen Universiteit en Researchcentrum, werkt een aantal partijen samen: het Ingenieursbureau Amsterdam, de Plantenziektenkundige Dienst van het Ministerie van LNV, het onderzoeksinstituut Alterra van Wageningen UR, het Centraal Bureau voor Schimmelcultures en de gemeenten Den Haag, Utrecht, Haarlemmermeer en Houten. Aan onderzoek werken verder mee Plant Research International van Wageningen UR en de leerstoelgroepen Plantencelbiologie en Plantenfysiologie van Wageningen Universiteit. De werkgroep beschikt over een, veelbezochte, website, waarop zij alle informatie zo actueel mogelijk beschikbaar stelt: www.kastanjeziekte.wur.nl.

Dr. ir. Marijke.W.C. Dijkshoorn-Dekker Praktijkonderzoek Plant en Omgeving Wageningen UR

Boskoop, 15 november 2005

1

De naam Aesculaap is een samentrekking van de naam voor het medisch symbool Esculaap en de Latijnse naam voor het geslacht paardenkastanje, Aesculus. De paardenkastanje is overigens een heel andere boomsoort dan de tamme kastanje (Castanea). 3

4

Inhoudsopgave Voorwoord..................................................................................................................3 Samenvatting .............................................................................................................7 Aanbevelingen voor vervolgonderzoek ........................................................................9 1

Inleiding .............................................................................................................11

2

Programma-organisatie Aesculaap......................................................................13 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

Opdrachtgever en stuurgroep.................................................................................. 13 Programmacoördinatie ........................................................................................... 13 Het onderzoeksteam .............................................................................................. 14 De onderzoeksprojecten ......................................................................................... 14 Het communicatieteam ........................................................................................... 14

3

Literatuuronderzoek ...........................................................................................15

4

Parasitair onderzoek...........................................................................................17 4.1

Fytopathologisch onderzoek aan de kastanjeziekte.................................................... 17

4.1.1

Monstername................................................................................................... 17

4.1.2

DNA-extractie................................................................................................... 18

4.1.3

Moleculair onderzoek schimmels ....................................................................... 18

4.1.4

Moleculair onderzoek op Phytohpthora ............................................................... 19

4.1.5

Moleculair onderzoek bacteriën ......................................................................... 19

4.1.6

Virologisch onderzoek ...................................................................................... 23

4.1.7

Fytoplasma-onderzoek...................................................................................... 24

4.1.8

Viroïden onderzoek........................................................................................... 25

4.1.9

Conventioneel diagnostisch onderzoek op schimmels, bacteriën en aaltjes ........... 26

4.1.10 Fytopathologisch veldonderzoek........................................................................ 28 4.2 5

Niet-parasitair onderzoek....................................................................................30 5.1 5.2

6

Celbiologische en anatomische karakterisering bloedingsziekte.................................. 31 Fysiologisch onderzoek aan de bloedingsziekte ........................................................ 34

Inventarisatie en groeiplaatsonderzoek ...............................................................43 6.1 6.2

7

Verspreidingsmechanismen ..................................................................................... 29

Landelijke verspreiding van bloedende paardenkastanjebomen................................... 43 Groeiplaatsonderzoek paardenkastanjebomen .......................................................... 45

Communicatie ....................................................................................................47

Bijlagen....................................................................................................................49

5

6

Samenvatting De bloedingsziekte in paardenkastanje (Aesculus spp.) is een nationaal en mogelijk internationaal probleem in het stedelijk groen, bossen en boomteeltsector.Werkgroep Aesculaap is voorjaar 2005 een onderzoeksprogramma gestart, breed van opzet en oriënterend van karakter. Dit onderzoeksprogramma heeft als doel het opsporen van de oorzaak van de ziekte en het vaststellen van ernst en omvang van de ziekte in Nederland. De aanpak van het programma is er op gericht zo snel mogelijk de juiste oplossingsrichting voor de kastanjeziekte te bepalen. Hiertoe zijn eerst de meest kansrijke en wetenschappelijk onderbouwde onderzoekssporen onderzocht. Via een literatuuronderzoek is de werkgroep op zoek gegaan naar meer informatie over de ziektesymptomen of vergelijkbare ziekte- en schadebeelden. De aantasting, die zich nu voordoet in de kastanje (Aesculus) bleek niet eerder te zijn beschreven in de wetenschappelijke literatuur. Er zijn op grond van de literatuurgegevens vier typen aftakelingsziekten bij bomen te onderscheiden, maar er is niet éénduidig naar voren gekomen tot welk type de kastanjeziekte behoort. Parasitair onderzoek Naast het literatuuronderzoek heeft de werkgroep parasitair en niet-parasitair onderzoek verricht. In het parasitaire onderzoek is gekeken of de bloedingsziekte (mede) veroorzaakt werd door een micro-organisme (schimmel, bacterie, virus, viroïde, aaltje, fytoplasma). Uit moleculair onderzoek kwam naar voren dat het onwaarschijnlijk is dat een schimmel de oorzaak is van de bloedingen. De symptomen van de bloedingsziekte in paardenkastanje lijken sterk op de symptomen die worden veroorzaakt door de pseudoschimmel Phytophthora. Echter moleculair onderzoek heeft geen Phytophthora kunnen aantonen. Wel is er, na DNAanalyse van zieke bomen verspreid over Nederland, een bacterie aangetoond welke tevens kon worden geïsoleerd. De aanwezigheid van deze bacterie, behorend tot de groep Pseudomonas syringae, is duidelijk geassocieerd met het ziektebeeld. Uit een eerste infectieproef bleek dat jonge zaailingen van kastanje, waarop de gevonden bacterie was aangebracht via injectie en snijwonden op de stam, exudaten (bloeding) en necrose (afgestorven plekken) vertoonden. Kunstmatige infectie van grotere kastanjebomen moet het wetenschappelijke bewijs leveren of deze bacterie dé veroorzaker is. Zowel in kastanjebomen zonder, als met bloedingsverschijnselen kon met behulp van electronenmicroscopie een Closterovirus worden aangetoond. Het is nog niet duidelijk of dit virus een rol speelt in het ziekteproces. Dit zal nader onderzoek moeten uitwijzen. Een mogelijke verspreiding van pathogene virussen door de kastanjemineermot en koningsdopluis, die in verband kunnen worden gebracht met de kastanjeziekte, kon in dit onderzoek niet worden aangetoond. Tevens zijn er geen indicaties naar voren gekomen dat fytoplasma’s (gespecialiseerde bacteriën zonder celwand) evenals viroïden (virussen zonder eiwitkapsel) een rol spelen in de bloedingsziekte van paardenkastanjebomen. Uitvoering van het conventionele diagnostische onderzoek heeft niet geleid tot het aanwijzen van een mogelijke veroorzaker in bacteriën, schimmels en nematoden. Het is nog te vroeg conclusies te trekken over nog lopend fytopathologisch veldonderzoek, waarbij op verschillende locaties infectieproeven worden uitgevoerd op ‘gezonde’ kastanjes. Niet-parasitair onderzoek Het niet-parasitair onderzoek heeft zich gericht op houtanatomische en fysiologische achtergronden. Uit cytologisch en anatomisch onderzoek van bloedingsplekken bleek dat aangetaste delen altijd afgestorven bastweefsel bevatten. Als de aantasting niet tot het cambium was doorgedrongen, kon dat cambium nog steeds nieuw vaatweefsel vormen, maar als ook het cambium en eventueel het onderliggende hout was aangetast, was herstel ter plaatse niet meer mogelijk. De paardenkastanje heeft tegen het afsterven van het bastweefsel ook een afweerreactie door vorming van nieuwe afsluitingsweefsels. Het lijkt erop dat de boom op deze wijze probeert uitbreiding van de ziekte te belemmeren. Een aangetaste boom heeft ondanks de aantasting nog steeds het vermogen om voedingsstoffen door de stam te transporteren zolang de bast niet over de gehele omtrek van de stam is aangetast.

7

Onafhankelijk van de vraag welke ziekteverwekkers de bloedingsziekte in paardenkastanjes initiëren, is het van belang om fysiologische en biochemische processen in en rond de 'wonden' tot stilstand te brengen. Duidelijk is geworden dat in de kastanjebast de verschillende componenten van het polyfenoloxidaseverbruiningsreactie-systeem actief zijn en dat het mogelijk is om in deze reacties in te grijpen. Een aantal remstoffen met weinig te verwachten neveneffecten (ascorbinezuur, citroenzuur, cysteïne, NaF) zijn getest op laboratoriumschaal en bleken in staat om de verbruiningsreactie geheel of gedeeltelijk te blokkeren. Deze stoffen zijn vervolgens ook in het veld op zieke kastanjebomen getest in verschillende concentraties en combinaties en met behulp van verschillende toedieningstechnieken. Het is nog te vroeg om conclusies te trekken, de proef wordt vervolgd en komend voorjaar moet daarin meer inzicht komen. Ernst en omvang bloedingsziekte in Nederland Een landelijke inventarisatie van de bloedingsziekte onder gemeenten laat zien dat de ziekte voorkomt in heel Nederland. De grootste aantallen zieke bomen staan in de provincies Zuid Holland, Noord Holland, Utrecht en Noord-Brabant. Aesculus hippocastanum en de cultivars daarvan worden het meest aangetast (31-45%), gevolgd door A. x carnea en haar cultivars (13-28%). De overige Aesculus soorten komen veel minder voor, maar incidenteel is ook aantasting gemeld in A. pavia en A. flava. De bloedingsziekte komt het meest voor in bomen met een diameter groter dan 20 cm; in alle diktecategoriën boven deze maat is het aantastingspercentage meer dan 30%. Het grootste aantal zwaar aangetaste bomen komt voor in de categorie 20-35 cm (25%). Tevens wordt de ziekte gemeld op alle bodemsoorten, maar op zand (aantastingspercentage 25%) komt ze minder voor dan op klei of veen (elk 35%). Hieruit kan echter niet zonder meer de invloed van de grondsoort op de ontwikkeling van de ziekte worden afgeleid, omdat ook de geografische ligging invloed kan hebben op het ziektebeeld. Veel meldingen komen uit gebieden waar overwegend veen- en kleigronden (en geen zandgronden die men ter onderlinge vergelijking zou kunnen gebruiken) van nature voorkomen. De mogelijke invloed van overige standplaatsfactoren (watervoorziening, wateroverlast, onderbegroeiing) kwam uit de inventarisatie onvoldoende eenduidig naar voren. Nog uit te voeren groeiplaatsonderzoek kan mogelijk meer inzicht geven in eventuele correlaties tussen het voorkomen van het aantastingsbeeld en diverse groeiplaatskenmerken, evenals de conditie van de bomen. Op basis van de behaalde resultaten in dit onderzoeksprogramma worden aanbevelingen gedaan voor verder onderzoek. Communicatie Sinds begin van dit jaar heeft de werkgroep Aesculaap veel aandacht besteed aan actieve externe communicatie. Direktbetrokkenen zijn geïnformeerd via een regelmatig verschijnende nieuwsbrief. Verder onderhoudt de werkgroep een eigen website, www.kastanjeziekte.wur.nl, waarop uitgebreide en actueel gehouden informatie is te vinden. Behalve belanghebbenden, zoals gemeenten, bezoekt het grote publiek deze website met grote regelmaat (enkele duizenden bezoekers per maand). De belangstelling en de zorg bij het publiek blijkt ook uit de honderden e-mails en telefoontjes die het projectteam van de zijde van particulieren hebben bereikt. De meeste communicatie verloopt via de media. Kranten, radio en televisie blijken grote belangstelling te hebben voor de kastanjeziekte en het onderzoek daarnaar. Dat blijkt uit de bijna 300 krantenartikelen die sinds 1 januari 2005 over dit onderwerp zijn verschenen en uit de tientallen radio- en tv-uitzendingen waarin aan de ziekte aandacht is besteed. Daarbij is meestal de programmacoördinator als woordvoerster opgetreden.

8

Aanbevelingen voor vervolgonderzoek Vervolgonderzoek aan Pseudomonas In het uitgevoerde oriënterende onderzoek naar de oorzaak van de bloedingsziekte komt naar voren dat een bacterie uit de Pseudomonas syringae-groep duidelijk is gerelateerd aan de bloedingsziekte. Vervolgonderzoek naar het infectie- en ziekteproces en de verspreiding is noodzakelijk voor het vinden van een bestrijdingsstrategie. Noodzakelijk onderzoek is het bevestigen van de postulaten van Koch (het aantonen dat de Pseudomonasbacterie de veroorzaker is van de bloedingsziekte). Inmiddels is een start gemaakt met een inoculatieproef met verschillende bacteriestammen op een gemeentekwekerij bij jonge bomen. De ontwikkeling van eventuele ziekteverschijnselen wordt gevolgd. Gelijktijdig wordt aanbevolen om cel- en weefselonderzoek van geïnfecteerde bomen en aanwezigheid van bacteriën uit te voeren. Modelsysteem Het opzetten van een modelsysteem is de basis van vervolgonderzoek aan Pseudomonas. Met een model- of toetssysteem kan de bloedingsziekte op reproduceerbare wijze worden geïnduceerd. Daarnaast kan met behulp van een toetssysteem de bloedingsziekte zorgvuldig worden bestudeerd in al zijn aspecten, fytopathologie, morfologie en fysiologie, maar vooral ook in onderlinge samenhang. Met een modelsysteem kunnen naast bestrijdingsmiddelen en remmingsmiddelen die de bruiningsreactie kunnen stoppen, ook antagonisten worden getoetst op hun werking tegen de bloedingsziekte. Beheersing en bestrijdingsstrategieën Onderzoek naar de verspreidingswijze (vectoren) is noodzakelijk om de bestrijding ter hand te kunnen nemen. Wanneer duidelijk wordt dat de gevonden Pseudomonas-bacterie inderdaad de veroorzaker is van de kastanjeziekte, zal onderzoek moeten worden gedaan naar de verspreidingswegen, infectieroutes en andere factoren, die bijdragen aan de ziektedrukverhoging. De noodzaak van onderzoek naar de bestrijding is evident. Met deze kennis kan een effectief praktijkadvies gegeven worden: hoe om te gaan met de kastanjeziekte. Voortgang buitenproef in Houten De bomen die zijn behandeld met remmingsmiddelen zullen verder gevolgd moeten worden in 2006. Waarnemingen in het voorjaar 2006 aan stam en kroon van de behandelde bomen moeten duidelijk maken of en welke behandelingen de bruiningsreactie van bomen in het veld kunnen stoppen/doen afnemen. Afhankelijk van de resultaten, is het zinvol met bepaalde behandelingen door te gaan in het voorjaar en wellicht (ook) andere concentraties en combinaties te testen. Laboratoriumproeven kunnen daarbij perspectiefvolle richtingen aangeven. Waardplantonderzoek Uit het inventariserend onderzoek is gebleken dat vooral de witte en rode paardenkastanje is aangetast. Bij de rode en gele pavia (Aesculus pavia en A. flava) is het aantal aangetaste bomen opvallend laag. Aanbevolen wordt om met dit gegeven binnen de Aesculus-soorten resistentieonderzoek te starten. Door genetische selectie van weinig of niet vatbare soorten kan voor de lange termijn een gezonde cultivar worden gevonden. Verdedigingsmechanismen Bij de zieke paardenkastanjebomen lijken de verdedigingsmechanismen te zijn aangetast, waardoor er bloeding ontstaat. Waarom dit zo sterk optreedt bij de aangetaste kastanjes, is nog onbekend. Het antwoord hangt mede af van de veroorzaker: is deze veroorzaker (een Pseudomonas?) een relatief nieuw pathogeen voor kastanje waartegen de ‘normale’ verdediging niet werkt, of is de kastanje door andere (stress?)-condities verzwakt waardoor een ‘overmatig’ sterke reactie optreedt? Mogelijk speelt een combinatie van factoren een rol. Wanneer één of meerdere van deze verdedigingsmechanismen niet goed werkt, dan krijgt het proces de kans zich verder uit te breiden. 9

De vraag blijft dan wel waarom de verdedigingsmechanismen in de kastanje niet goed functioneren. Een voor de hand liggende volgende stap zou daarom zijn om de achtergrond hiervan nader te onderzoeken, waarbij het testen van ziekgemaakte bomen (jonge bomen/zaailingen) in een modelsysteem een belangrijke stap zou kunnen zijn, nu het pathogeen mogelijk bekend is. Onderzoek naar stressfactoren Onderzoek naar stressfactoren is belangrijk om (relatieve) invloed van andere mogelijke factoren vast te stellen in verband met lokale beheersmaatregelen. Uit het oriënterende onderzoek is gebleken dat het Closterovirus zowel in gezonde als zieke kastanjebomen voorkomt. Vervolgonderzoek zal moeten aantonen of dit virus een van de stressfactoren is die een rol speelt in het aftakelingsproces van de paardenkastanjes. Uit het inventariserend onderzoek is gebleken dat a-biotische factoren een rol lijken te spelen. Het is niet uitgesloten dat een combinatie van a-biotische factoren rechtstreeks bloeding kan veroorzaken of de boom zo verzwakt dat gelegenheidspathogenen kunnen toeslaan. A-biotische factoren die in combinatie een rol kunnen spelen zijn: sterke afname van de hoeveelheid bladmassa door (forse) snoei, aantasting door de kastanjemineermot, een standplaats waar (grond)water in ruime mate voorhanden is of klimaatsomstandigheden als droge zomers of natte, zachte winters. A-biotische factoren zijn nog onvoldoende onderzocht en verdienen daarom meer aandacht. Het toetsen van het effect van bodemverbeterende behandelingen op de bloedingsziekte verdient nader onderzoek.

10

1

Inleiding

De paardenkastanjebomen (Aesculus spp.) in Nederland worden bedreigd door een onbekende bloedingsziekte. De ziekte blijkt snel om zich heen te grijpen en het lijkt erop dat als er geen actie wordt ondernomen, grote schade ontstaat. Beeld- en sfeerbepalende kastanjebomen zullen verdwijnen uit stads- en gezichten en het landschap. Vanaf de eerste berichten dat de kastanjeziekte zich op grote schaal voordoet in Nederland is gebleken dat onder de media en het grote publiek daarvoor veel belangstelling en zorg bestaat. Verwacht mag worden dat die belangstelling blijft omdat beseft wordt dat we te maken hebben met een ernstig probleem en vooral gemeenten en particuliere bomenbezitters naarstig uitkijken naar een mogelijke remedie. In de zomer van 2002 kwamen uit Noord- en Zuid Holland en Friesland meldingen binnen van bruine plekken op de stam. Zieke bomen blijken plekjes te hebben op de stam waar bruin vocht uit loopt. In een later stadium barst de bast open en kan de boom uiteindelijk doodgaan. In 2004 is geconstateerd dat vele duizenden paardenkastanjes in het gehele land zijn aangetast door deze ziekte. De werkgroep Aesculaap is opgericht toen duidelijk werd dat de onbekende bloedingsziekte bij paardenkastanjes een landelijk probleem werd. De werkgroep coördineert acties rond de onbekende aantasting in de kastanje. Door krachtenbundeling van verschillende expertises wil de werkgroep de oorzaak zo snel mogelijk achterhalen en een strategie ontwikkelen om het probleem te beheersen. Bloedingsziekte bij bomen wordt vaak geassocieerd met een schimmelaantasing (Phytophthora), maar kan vele (niet)-parasitaire oorzaken hebben. Uniek aan de bloedingsziekte in de paardenkastanje is dat de ziekte binnen een relatief kort tijdsbestek op deze grote schaal voorkomt. In de afgelopen jaren zijn er ervaringen opgedaan met onderzoek naar deze ziekte, voornamelijk via klassieke isolatiemethoden op schimmels en bacteriën. Dit onderzoek heeft tot op heden geen resultaten opgeleverd, wat noodzaakt tot een bredere aanpak van het probleem. In het voorjaar van 2005 is een onderzoeksprogramma gestart, dat breed van opzet en oriënterend van karakter is. Dit onderzoeksprogramma heeft als doel het onderzoeken van de bloedingsziekte en het achterhalen van de oorzaak van de ziekte. De aanpak van het programma is erop gericht om zo snel mogelijk de juiste oplossingsrichting voor de kastanjeziekte te bepalen. Hiertoe is onderzoek in verschillende richtingen ingezet. Opbouw van het rapport In dit eindrapport wordt de stand van zaken gepresenteerd betreffende het onderzoek naar de oorzaak van de kastanjeziekte. De programmaorganisatie voor de uitvoering van het onderzoek is beschreven in hoofdstuk 2. Eerst is er een uitgebreid literatuuronderzoek uitgevoerd naar deze ziektesymptomen of vergelijkbare ziekte/ schadebeelden (hoofdstuk 3). Dit kan leiden tot een betere onderbouwing van de verschillende onderzoeksrichtingen. Vervolgens worden in hoofdstuk 4 de resultaten van het parasitaire onderzoek beschreven. Dit onderzoek omvat zowel het ‘traditionele’ als moleculair fytopathologisch onderzoek naar een micro-organisme (schimmel, bacterie, virus, viroïde, fytoplasma) dat de (mede)veroorzaker kan zijn van de bloedingsziekte. Tevens wordt aandacht gegeven aan een mogelijk verband tussen de ziekte en de paardenkastanjemineermot, die de laatste jaren als grote plaag voorkomt. Het niet-parasitaire onderzoek (hoofdstuk 5) heeft zich geconcentreerd op anatomische en cellulaireverschillen tussen aangetast en niet aangetast bast- en houtweefsel. 11

Tevens zijn de fysiologische en biochemische processen, die in en rond de aantastingen spelen bestudeerd en zijn wondafdekkende middelen en sprays getoetst die het ziekteproces mogelijk kunnen remmen. Een landelijke inventarisatie is uitgevoerd om een goede indruk te krijgen van de aard, ernst en omvang van de ziekte (hoofdstuk 6). Slechte groeiplaatssituaties en (droogte)stress, al dan niet in combinatie met luchtverontreiniging, dragen bij aan het kwetsbaarder worden voor een aantasting. Bestudeerd is of er correlaties te vinden zijn tussen diverse groeiplaatskenmerken en het voorkomen van het aantastingsbeeld en de onbekende bloedingsziekte in paardenkastanjebomen. Communicatie van de onderzoeksresultaten wordt beschreven in hoofdstuk 7. Alle bevindingen van dit oriënterend onderzoek zijn gebruikt om te komen tot aanbevelingen voor vervolgonderzoek.

12

2

Programma-organisatie Aesculaap

De programmaorganisatie is schematisch weergegeven in Figuur 1.

Programma Aesculaap Stuurgroep Communicatie programmacoördinator

Programmateam vragen

Hoofdprojectleider

Onderzoeksteam projectleider

project

Figuur 1.

2.1

project

project

project

project

project

Programma-organisatie.

Opdrachtgever en stuurgroep

Het ministerie van Landbouw, Natuur en Voedselkwaliteit (LNV), directie Natuur is als opdrachtgever tevens eigenaar van dit programma. De stuurgroep is tijdens de uitvoering van dit onderzoeksprogramma nog niet ingericht. In een vervolgfase van dit programma is het van belang dat strategische afwegingen omtrent de koers van het onderzoek gemaakt kunnen worden in een stuurgroep, waar naast het ministerie bijvoorbeeld ook VNG in deelneemt. De programmacoördinator heeft tot nu toe haar verantwoording rechtstreeks afgedragen aan haar contactpersoon bij het ministerie van LNV.

2.2

Programmacoördinatie

De programmaorganisatie wordt aangestuurd door een programmateam onder leiding van de programmacoördinator. Het team heeft zorg gedragen voor de bewaking van samenhang tussen de verschillende organisatieonderdelen (communicatie, klankbord, onderzoeksteam) en de programmaplanning en resultaten zowel naar binnen als naar buiten toe.

13

Samenstelling programmateam • programmacoördinator (PPO) • gemeente Den Haag • gemeente Haarlemmermeer • gemeente Houten • gemeente Utrecht • hoofdprojectleider Onderzoek (PPO) • onderzoeker (CBS) • onderzoeker (Alterra) • projectleider Fytopathologie (PD) • projectleider Inventarisatie (IBA)

: Marijke Dijkshoorn-Dekker : Leendert Koudstaal : Rudolf Stelpstra : Geerten Kalter : Nico de Vos : Fons van Kuik : Arthur de Cock : Jitze Kopinga : Hans de Gruyter : Bart Stoffer

Het programmateam is in totaal 6 maal bijeen geweest.

2.3

Het onderzoeksteam

Het onderzoeksteam heeft zorg gedragen voor een goede bewaking en samenhang tussen de verschillende onderzoeksprojecten. Het onderzoeksteam is maandelijks bijeen geweest om de inhoudelijke voortgang met elkaar te bespreken. Het team bestaat uit de volgende personen: Ir. Fons van Kuik (PPO), Ir. Jitze Kopinga (Alterra), Hans de Gruyter (PD), Dr. Arthur de Cock (CBS), Dr. Joop van Doorn (PPO), Dr. Arjen Speksnijder (PRI), Ing. Martin Verbeek (PRI), Ing. Ko Verhoeven (PD), Dr. Jaap Janse (PD), Dr. André van Lammeren (Laboratorium Plantencelbiologie, Botanisch Centrum, WUR), Prof. Dr. Linus van der Plas, (Leerstoelgroep Plantenfysiologie WUR), Leo Slingerland (PPO), Dr. Ir. Ria Weijnen-Derkx (PPO), Bart Stoffer (IBA), Dr. Ir. Jelle Hiemstra (PPO), Ing. Ko Verhoeven, (PD)

2.4

De onderzoeksprojecten

Ieder onderzoeksproject is vertegenwoordigd door een projectleider. Zij maken tevens onderdeel uit van het onderzoeksteam. In een onderzoeksproject hebben meerdere onderzoeksorganisaties vanuit hun deskundigheid deel genomen. Het onderzoeksplan bestaat uit de volgende 6 projecten: Literatuuronderzoek, fytopathologie, verspreidingsmechanismen, houtanatomie, fysiologie, inventarisatie en standplaatsonderzoek.

2.5

Het communicatieteam

Het communicatieteam wordt aangestuurd door de programmacoördinator. Het communicatieteam werkt faciliterend aan het programmateam. De communicatiegroep is verantwoordelijk voor het naar buiten brengen van onder andere persberichten, vakbladartikelen, actuele stand van zaken. Het team is klein en slagvaardig gehouden. Het Ministerie van LNV is voornamelijk op de hoogte gehouden door Marijke Dijkshoorn-Dekker. In een later stadium is ook de PD erbij betrokken: Manon Leenders. Samenstelling communicatieteam • PPO Boskoop • Wageningen UR • Gemeente Den Haag • Ministerie van LNV

14

: Marijke Dijkshoorn-Dekker, coördinator en woordvoerder : Bouke de Vos : Mariëtte Pasman : Melanie Verheijden

3

Literatuuronderzoek

Projectleider: Ir. Fons van Kuik (PPO) Projectmedewerkers: Ir. Jitze Kopinga (Alterra), Hans de Gruyter (PD) De paardenkastanjebomen in Nederland worden bedreigd door een onbekende bloedingsziekte. Voor een gerichte aanpak is het belangrijk dat eerdere meldingen van bloedende bomen in de literatuur worden opgespoord. Daartoe is een uitgebreid literatuuronderzoek naar vergelijkbare aantastingen in andere bomen uitgevoerd. Doel Kennisvergaring van oorzaken en/ of veroorzakers van bloedingsziekten in bomen. Aanpak Een literatuursearch is uitgevoerd door de Bibliotheek van Wageningen UR. De literatuursearch is met behulp van een reeks trefwoorden uitgevoerd. Er is gezocht in de data bases: TreeCD 39-72; Scopus; CAB abstracts vanaf 1972. Daarnaast zijn artikelen aangedragen door vakgenoten, o.a. Prof. Dr. Josef Bauch, Universiteit van Hamburg. Resultaat Uit de verzamelde literatuur werd slechts één vakbladartikel gevonden waarin melding wordt gemaakt van dezelfde bloedingsverschijnselen in paardenkastanjebomen. In PHM-Revue Horticole novembre 2004 no 463 blz. 52 – 54, beschrijven de auteurs Pierre Aversenq en Philippe Rousseau verschijnselen van de bloedingsziekte die eind 2001 werden gezien in Noord-Frankrijk en de regio Brussel. De auteurs concluderen dat de beschreven symptomen niet zijn thuis te brengen en dat er is geen vermelding in de literatuur is gevonden. De aantasting, die zich nu voordoet in de kastanje (Aesculus), is niet eerder beschreven in de wetenschappelijke literatuur. In de literatuur kunnen vier typen aftakelingsziekten bij bomen worden onderscheiden: 1. Chronische irritatie door één oorzaak. Voorbeeld: zoutschade bij de suikeresdoorn of luchtverontreiniging bij naaldbomen. 2. Secundaire aantasting na (zware) verwonding. Voorbeeld: honingzwam of houtboorder. 3. Chronische irritatie door meerdere oorzaken. Dit vermindert de weerbaarheid met als indirect gevolg een aftakeling van de boom. Voorbeeld: bomen zijn gevoeliger voor Phytohpthora als er weinig ruimte is voor de wortels. 4. Groepsgedrag bij bomen van dezelfde leeftijd. Voorbeelden: voortijdige afsterving in reactie op stress, watertekort tijdens het groeiseizoen biedt kansen voor insecten en schimmels. Voor aftakelingstype 1 zijn geen directe aanwijzingen gevonden. De verspreiding van de bloedingsziekte is groot en de groeiplaatscondities variëren sterk. Echter de invloed van luchtverontreiniging of van een temperatuurschok tijdens een gevoelige periode van de kastanjeboom zou een rol hebben kunnen spelen in de wijd verbreide aantasting. Er worden wel steeds meer secundaire aantasters gevonden in zieke paardenkastanjes. Aangezien ook vele bomen ziek zijn die geen last hebben gehad van verwondingen komt aftakelingsziekte 2 te vervallen. De kastanjebomen kunnen last hebben van aftakelingstype 3. Een of meerdere irritaties kunnen een rol spelen in een verminderde weerstand. Te denken valt aan het massale voorkomen van de kastanjemineermot. Verder in dit rapport wordt ook melding gemaakt van het voorkomen van een Closterovirus bij de kastanjebomen. Het is niet duidelijk welke rol dit virus speelt. Een verandering van de grondwaterstand kan ook een chronische irritatie opleveren. 15

Aftakelingstype 4 is afgeleid van type 3. De meeste zieke kastanjebomen vallen in de categorie halfwas. In de zomer van 2003 was er grote droogte en waterstress bij heel veel bomen. Dit kan de trigger zijn geweest voor het massaal optreden van een algemeen voorkomend micro-organisme dat onder ‘normale’ omstandigheden bomen niet kan aantasten, maar onder speciale omstandigheden wel. Verder in dit rapport wordt melding gemaakt van een bacterie die een rol speelt in het ziekteproces. Deze bacterie zou zijn kans gegrepen kunnen hebben na het optreden van een stressfactor. Genoemde voorbeelden zijn hypothesen en moeten nog worden getoetst. Conclusie Gezien de beperkte ervaringen met de bloedingsziekte kan nog niet exact gezegd worden welk type aftakeling geldt voor de kastanjeziekte. De aftakelingsziekte van paardenkastanbomen kan het gevolg zijn van een chronische irritatie door één of meerdere oorzaken of het gevolg zijn van een stressfactor, waarna een micro-organisme zijn kans grijpt.

16

4

Parasitair onderzoek

4.1

Fytopathologisch onderzoek aan de kastanjeziekte

Projectleider: Hans de Gruyter (PD) Projectmedewerkers: Dr. Arthur de Cock (CBS), Dr. Joop van Doorn (PPO), Dr. Arjen Speksnijder (PRI), Ing Martin Verbeek (PRI), Ing. Ko Verhoeven (PD), Dr. Jaap Janse (PD) Uit zieke bomen zijn monsters genomen, die uitgebreid werden onderzocht op aanwezigheid van schimmels, bacteriën, virus, viroïden en fytoplasma’s. Grondmonsters werden genomen voor onderzoek op aanwezigheid van plantenparasitaire aaltjes. Daarnaast is bij aanvang van het onderzoek op drie locaties een infectieproef ingezet om te bepalen of met houtponsjes, genomen uit aangetaste stamdelen, symptomen op gezonde stamdelen konden worden opgewekt. In een later stadium zijn infectieproeven ingezet met reincultures van bacterie-isolaten, verkregen uit aangetaste bomen. Doel Door middel van biologische, biochemische en DNA technieken alsmede infectie-experimenten onderzoeken of er sprake is van een pathogeen, die deze bloedingsziekte veroorzaakt in paardenkastanje. 4.1.1 Monstername Op vier geselecteerde locaties, verspreid over Nederland, zijn monsters genomen van aangetaste en gezond ogende paardenkastanjebomen. Als locatie is gekozen voor de gemeenten Burgum, Geleen, Hoofddorp en Houten. De monstername werd in twee fasen uitgevoerd. Begin april 2005 zijn monsters genomen van hout- en bastweefsel uit en rondom verse bloedende plekken t.b.v. DNA-analyse. Tegelijkertijd werden twijgmonsters en grondmonsters genomen. Begin mei 2005 werden bloesem-, blad- en wortelmonsters genomen t.b.v. het isoleren en/of aantonen van mogelijke plantenpathogenen door middel van diverse technieken. De monsters werden direct na monstername verdeeld over de verschillende onderzoeksinstituten voor detectie onderzoek. De blad-, bloem-, stam-, wortel- en grondmonsters werden genomen volgens beschreven protocollen. Als voorbeeld het protocol van het nemen van de stammonsters: Per locatie worden van drie zieke en één gezonde boom stammonsters genomen met behulp van een 13 mm holpijp, waarbij eerst de kurklaag verwijderd wordt met een mesje. Per zieke boom worden monsters genomen op aangetaste plekken tussen de stambasis en 40 cm hoogte én op aangetaste plekken tussen 120 en 180 cm. Van elke monsterhoogte worden drie monsters genomen (Figuur 2).

17

3 2

1 Figuur 2. Monsternames uit stam. Monsters worden genomen uit het verkleurde bastweefsel op het grensvlak ziek-gezond (1), aangrenzend aan een aangetaste plek (2) en gezond ogende bast op enige afstand van de verkleuringen (3).

Tevens wordt er een monster genomen van een niet aangetaste kastanje van elke hierboven genoemde hoogte. Deze werkwijze levert per locatie 20 stammonsters op, 80 monsters in totaal. De monsters worden gekoeld (4°C) bewaard. Binnen 24 uur na monstername worden de monsters voorbewerkt voor DNA-extractie en opgeslagen bij -18 °C. 4.1.2 DNA-extractie Materiaal en methoden DNA isolatie uit deze monsters en zuiverheidsbepaling werd centraal uitgevoerd door de PD. Van 80 stammonsters en 40 wortelmonsters werd in duplo DNA geïsoleerd ten behoeve van bacteriologisch en mycologisch onderzoek. De zuiverheid van het DNA werd gecontroleerd door middel van een polymerase chain reactions (PCR) toets. DNA isolatie werd gedaan met de DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). Tenslotte werd het DNA opgezuiverd. Met deze DNA monsters werd het moleculaire onderzoek uitgevoerd. 4.1.3 Moleculair onderzoek schimmels Materiaal en methoden Van vier locaties zijn DNA monsters van zes zieke en twee gezonde kastanjes bestudeerd. De samenstelling van de populatie schimmels in de stammonsters werd moleculair onderzocht door Internal transcribed spacer (ITS) region amplificatie van schimmelachtige sequenties gevolgd door DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) analyse van deze monsters. Als een schimmel de oorzaak is, zal op de gel (Figuur 3) voor alle zieke bomen een identiek bandje worden gevonden, dat ontbreekt bij de gezonde bomen. Een eventueel aanwezig consistent bandje is een indicatie dat een schimmel de ziekteverwekker is, maar het is dan nog niet bekend welke schimmel het is. Resultaten Als voorbeeld wordt het bandenpatroon of DNA vingerafdrukken (rDNA-DGGE) van de schimmel-populaties monsters afkomstig van de locatie Houten weergegeven (Figuur 3). 18

Figuur 3.

Schimmelonderzoek. DGGE gel met monsters van locatie Houten genomen uit het Verkleurd bastweefsel op het grensvlak ziek-gezond (1), aangrenzend aan een aangetaste plek (2) en gezond ogende bast op enige afstand van de verkleuringen (3). G= gezond kastanjemateriaal, S=referentie

Met de DGGE analyse werden meerdere schimmelsoorten gevonden in bijna alle monsters. De schimmelpopulaties verschillen per monster. Er zijn wel overeenkomstige schimmelsoorten in de verschillende monsters. Deze breed aanwezige schimmels hebben echter geen direct verband met het grensvlak van de bemonstering of daarbuiten. Zieke bomen blijken een grotere diversiteit aan schimmels te bevatten, maar er werd geen specifieke band gevonden in associatie met zieke plekken. Conclusie Op basis van de DGGE analyse is het onwaarschijnlijk dat een schimmel de oorzaak is van de bloedingen. 4.1.4 Moleculair onderzoek op Phytohpthora Materiaal en methoden De symptomen van de bloedingsziekte in paardenkastanje lijken sterk op de symptomen die worden veroorzaakt door de pseudoschimmel Phytophthora. In dit onderzoek is daarom als aanvulling op het boven beschreven DGGE schimmelonderzoek specifiek gezocht naar Phytophthora in de houtmonsters met behulp van de real time Taqman PCR (polymerase chain reactions) techniek. Hiermee wordt een detectie verricht naar de aanwezigheid van Phytophthora of een nauw verwant organisme. Resultaat Het onderzoek naar Phytophthora met behulp van Taqman PCR heeft geen positieve monsters opgeleverd. Deze detectiemethode werd uitgevoerd met als controle DNA materiaal van andere Phytophthora-soorten . Twee monsters gaven een zgn. vals positieve reactie, welke na nauwkeurige beoordeling negatief bleken te zijn. Conclusie Met dit moleculair onderzoek werd geen Phytophthora aangetoond. 4.1.5 Moleculair onderzoek bacteriën Om de aanwezigheid van mogelijke plantenpathogene bacteriën te onderzoeken werd na 16S amplificatie van bacterie-achtige sequenties de DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) techniek toegepast. Als een bacterie éénduidig geassocieerd is met de aantastingsbeelden zal op de gel voor alle zieke bomen een karakteristiek bandje worden gevonden, dat ontbreekt bij de gezonde bomen. Een eventueel gevonden 19

bandje is een indicatie dat een bacterie de ziekteverwekker is, maar het is dan nog niet bekend welke bacterie het is. Resultaat Op basis van DGGE analyse bleek de bacteriediversiteit in de monsters heel laag. In de monsters, die op het grensvlak ziek/gezond genomen werden, werd steeds een karakteristieke band gevonden (Figuur 4), welke duidt op de aanwezigheid van een dominante bacteriesoort. Deze band bleek niet aanwezig in de monsters genomen uit aangetaste bomen ruim buiten de ‘zieke’ plekken, noch in de monsters genomen van de bomen zonder ziektesymptomen. In de monsters genomen net buiten het grensvlak werd deze bacterie af en toe waargenomen (Figuur 4).

Figuur 4.

Bacterieonderzoek. DGGE gel met monsters van locatie Houten genomen uit het verkleurd bastweefsel op het grensvlak ziek-gezond (1), aangrenzend aan een aangetaste plek (2) en gezond ogende bast op enige afstand van de verkleuringen (3).

Nader onderzoek door de sequentie bepaling van deze DGGE band heeft aangegeven dat het de bacterie Pseudomonas syringae betreft. Om de bacterie te identificeren op soortsniveau werd gebruik gemaakt van klonering en 16S rDNA sequentiebepaling over een lengte van 1400 basen. Uit vergelijking van de verkregen sequentie in een database met een bestand van ruim 40.000 bacteriesoorten is gebleken dat de Pseudomonas uit zieke kastanjebomen grote overeenkomst vertoont met Pseudomonas tremae, een Pseudomonas uit de syringaegroep. Deze Pseudomonas is geassocieerd met de rhizosfeer van gras. Er is geen aanleiding dat we te maken hebben met een bestaand quarantaine organisme. Vervolgens werd onderzoek gedaan ter bevestiging van bovenstaande DGGE analyse. Hiertoe werden bacteriën geïsoleerd zowel vanuit het grensvlak ziek/gezond van aangetast boommateriaal als van het ‘bloed’ exudaat uit de boom. De isolaties vonden plaats op specifiek medium met verschillende methoden. De identiteit van de isolaten werd bepaald met behulp van 16S rDNA sequensen. Verdere karakterisatie vond plaats door middel van Biolog fysiologie bepaling waarbij verwante soorten werden meegenomen.

Geïsoleerde bacteriën Het 'bloed' gaf veel verschillende kolonietypen bacteriën (Figuur 5). Het grensvlak van ziek naar gezond heeft een overheersend kolonietype gegeven. Van dit type is de volledige 16S sequentie bepaald en deze komt volledig overeen met de 16S sequentie van de moleculaire analyses.

20

Figuur 5.

Bacterie kolonies geïsoleerd uit zieke plekken. Deze kolonies bevatten hetzelfde 16SrDNA als de fingerprint met als typering een Pseudomonas syringae.

Via een niet moleculaire, maar een fysiologische methode van typering met behulp van een Biolog analyse, kwam na vergelijk met een referentie data base van 3000 bacterie-soorten, een identificatie met Pseudomonas syringea pv sesami naar voren. Een eerder door de PD verkregen isolaat uit kastanje, PD isolaat 4816, gaf op basis van 16S sequentie en Biolog een bijna identieke identificatie met het Pseudomonas isolaat uit kastanje.

Inoculaties van zaailingen Inoculaties werden uitgevoerd met het verkregen Pseudomonas isolaat uit kastanje (PRI1), een referentie, namelijk Pseudomonas syringae p.v. mori uit moerbei (PD isolaat 982) en water als referentie. Infecties werden kunstmatig aangebracht door middel van sneetjes en injectie. Dit op één- en tweejarige zaailingen in drievoud. In totaal werden 36 inoculaties uitgevoerd. De éénjarige zaailingen met de Pseudomonas uit kastanje (PRI1) vertoonden na verloop van tijd exudaten en bastnecrose (Figuur 6). De controles, inoculeerd met water of de Pseudomonas uit moerbei, vertoonden herstel van de sneetjes en geen symptomen bij de injecties. De tweejarige zaailingen vertoonden bastnecrose bij de sneetjes en exudatie bij de injecties. De controles vertoonden mechanische schade maar ook herstel.

Figuur 6.

Teruginoculatie op kastanjezaailingen. Zaailingen zijn op 1-jarig hout geïnoculeerd met A) nietpathogene bacterie (isolaat PD 982) en B) Pseudomonas isolaat PRI1. De inoculatieplaats (i) is aangegeven met een pijl, symptomen verschijnen ook op enige afstand van de inoculatieplaats na verspreiding van de bacterie (v). 21

Van een geïnjecteerde éénjarige plant werd na twee maanden een bacterie-isolatie gedaan door met een injectienaald aan te prikken. De isolaten verkregen uit deze plant zijn identiek aan het oorspronkelijke isolaat op basis van twee genomische fingerprint methodes. Strikt genomen zijn bij deze zaailingen de stappen in de postulaten van Koch doorlopen.

Isolaat-identificatie, taxonomisch onderzoek en de postulaten van Koch Door de PD werd naar aanleiding van eerdere vondsten Pseudomonas bij inzendingen kastanje (de eerste vondst dateert uit 2002, isolaties van Pseudomonas in latere inzendingen waren echter niet consistent) en de resultaten gevonden in bovenstaand onderzoek besloten infectieproeven uit te voeren. Dit voor taxonomisch onderzoek alsmede het toetsen van de postulaten van Koch en om verdere identificatie van de kastanje isolaten uit te voeren. Deze proeven werden afgestemd met PRI en bestaan uit de volgende onderdelen:

a. Bevestiging van de bovenstaande infectieproef van het PRI Uitvoering en voorlopig resultaat: Twee PD kastanje-isolaten en een verwante P.syringae uit perzik werden begin september geïnoculeerd in tweejarige kastanje zaailingen (zelfde werkwijze als PRI). Begin november zijn waarnemingen gedaan en is getracht de bacteriën terug te isoleren. Voor definitieve resultaten is het nog te vroeg omdat de teruggeïsoleerde bacteriën nog moeten worden gekarakteriseerd en omdat dit moet matchen met de gegevens die horen bij de geïnoculeerde isolaten. Op basis van kolonie-morfologie lijken de terugisolaties gelukt. De zaailingen geïnoculeerd met het perzik-isolaat van P. syringae vertoont inkapseling van de pathogeen en geen verdere uitbreiding vanuit de plaats van inoculatie. De kastanje isolaten geven duidelijk necrotisering van het onderliggende bastweefsel en verspreiding vanuit de plaats van inoculatie. De symptomen lijken sterk op die uit de kasproeven van het PRI met het PRI-isolaat. Voor mogelijke uitspraken over symptoomontwikkeling is het nog te vroeg. Er moet rekening gehouden worden met het feit dat de symptomen anders zijn dan die bij volwassen bomen.

b. Infectieproeven bij oudere kastanje bomen op een locatie in Nederland De sectie Bacteriologie van de PD heeft meerdere P. syringae isolaten geïsoleerd uit kastanje in de periode 2002 en 2004, en veel expertise op het gebied van bacteriële taxonomie en gedrag van pathogene bacterien in bomen (eerder onderzoek aan Fraxinyus met een Pseudomonas bacterie en bacteriekanker populier). Na overleg met hoofdprojectleider Onderzoek van Aesculaap werd besloten een bijdrage te leveren aan het pathogeniteitsonderzoek. In een inoculatieproef worden naast een aantal kastanje-isolaten (waaronder Belgische isolaten) veel meer pathovars van Pseudomonas syringae meegenomen. Het accent bij dit onderzoek ligt naast het vervullen van de postulaten van Koch op correcte identificatie (naamgeving) en verwantschapsbepaling (taxonomisch onderzoek). Naast de staminoculaties zijn inoculaties op jongere takken (ook van bladlittekens en van lenticellen) uitgevoerd. De PD heeft namelijk aanwijzingen dat naast de bekende symptomen van bloedingen op de stam ook jonge takken symptomen van bastverkleuring vertonen. Ook uit deze jongere takken is de P. syringae bacterie geïsoleerd. In de loop van december 2005 zullen de eerste terugisolaties uit de bomen worden uitgevoerd. Daarna zal de symptoomontwikkeling nog langere tijd gevolgd worden. Aanvullend zal door de PD in samenwerking met collega’s in België verdere karakterisatie van de kastanjeisolaten plaatsvinden d.m.v. biochemische bepalingen, vetzuuranalyse, Rep/Box PCR en DNA-hybridisaties. Samenvattend Uit dit bacterie-onderzoek is gebleken dat de aanwezigheid van Pseudomonas duidelijk is geassocieerd met het ziektebeeld. De Pseudomonas bacterie is uit een zieke boom opgekweekt. De herkomst van deze bacterie uit de zieke plekken is bevestigd met DNA karakterisatie. Deze Pseudomonas PRI1 is in juli aangebracht op zaailingen door middel van injectie en snijwonden aan de stam. De zaailingen, geïnoculeerd met een controle Pseudomonas (pathogeen in moerbei), vertoonden wondherstel. De zaailingen met het 22

Pseudomonas PRI1 isolaat vertoonden exudaten en necrose. Vervolgonderzoek in grotere kastanjebomen, inmiddels ingezet door zowel PRI als de PD op een locatie in Nederland, moet uitwijzen of deze bacterie de werkelijke veroorzaker is. 4.1.6 Virologisch onderzoek Materiaal en methoden

Voorstudie m.b.v elektronenmicroscopie (EM) In maart 2005 werden takken verzameld van twee bomen met duidelijke bloedingsplekken op locaties in Andel en Houten. De takken werden op water weggezet bij 20 oC en lange dag condities (16 h licht). Na ongeveer twee weken werden (EM) hakselpreparaten gemaakt van zeer jong blad uit uitlopende knoppen.

Screening van kastanjebomen Alle door de Plantenziektenkundige Dienst genomen twijg, blad en bloemmonsters werden verwerkt tot EMpreparaten.

Toetsplantenonderzoek Voor een eerste screening op virus werden vijf kastanjemonsters geïnoculeerd op een set toetsplanten. Hiervoor zijn twee methoden gebruikt: inoculatie van een monster vermalen en verdund in inoculatiebuffer en ‘directe inoculatie’ of ‘drooginoculatie’. De set toetsplanten bestond uit: Nicotiana glutinosa, N. clevelandii, N. tabacum ‘White Burley’, N. benthamiana, N. occidentalis ‘P1’, N. occidentalis ‘37B’, N. hesperis ‘67A’, Physalis floridana, Chenopodium quinoa, Cucumis sativus, Vicia

faba. Daarnaast werden in de herfst verzamelde kastanjes buiten gekiemd in zand. Zodra de kastanjes waren gekiemd zijn ze opgepot en overgebracht naar de kas. Na uitlopen is een aantal jonge kastanjebomen getoetst m.b.v. EM op aanwezigheid van virus. Deze kastanjezaailingen werden gebruikt in inoculatieexperimenten met virus en bacteriën. Resultaten

Voorstudie m.b.v elektronenmicroscopie In beide bomen (herkomst: Andel en Houten) werden duidelijke virusdeeltjes waargenomen. Deze deeltjes behoren qua morfologie tot het genus Closterovirus.

Screening van kastanjebomen Per boom werden tenminste twee EM preparaten bekeken. Van alle bomen, zowel gezond ogend als ziek, werden in tenminste één preparaat closterovirusdeeltjes gevonden. Dat wil zeggen dat alle 24 bomen positief werden bevonden voor closterovirusbesmetting.

Screening van kastanjezaailingen Tien gezonde zaailingen werden getoetst met de elektronenmicroskoop op aanwezigheid van virus. In één zaailing werd het closterovirus gevonden (Figuur 7). Dit is een aanwijzing voor zaadoverdracht of pollenoverdracht van het virus.

23

Figuur 7.

Electronenmicroscopische opname van closterovirusdeeltjes van kastanje.

Toetsplantenonderzoek Geen van de toetsplanten reageerde met symptomen na inoculatie met kastanjemateriaal. Het closterovirus gaf dus bij de gebruikte toetsplanten geen symptomen, als het al mechanisch is over te dragen. Samen met de EM resulaten is dit een aanwijzing dat er waarschijnlijk naast het closterovirus geen andere virussen aanwezig waren in het materiaal. De geïnoculeerde kastanjezaailingen lieten af en toe chlorotische vlekken zien na inoculatie. Met de EM konden geen virusdeeltjes worden waargenomen. Het bleek dat het closterovirus niet of nauwelijks meer is te detecteren later in het seizoen. Dit is niet ongebruikelijk bij virusinfecties in bomen. De beste tijd voor virusdetectie m.b.v. de EM blijkt juist na het uitlopen van de knoppen te zijn. De geïnoculeerde zaailingen zullen dus volgend voorjaar nogmaals moeten worden getoetst op aanwezigheid van virus. Conclusie Zowel in kastanjebomen zonder als met bloedingsverschijnselen is een Closterovirus aangetoond. Nader onderzoek moet aantonen of dit virus een rol speelt in het ziekteproces. 4.1.7 Fytoplasma-onderzoek Fytoplasma’s zijn gespecialiseerde bacteriën zonder celwand. Het zijn niet kweekbare parasieten, die in het floëemweefsel van planten kunnen voorkomen. Het fytoplasma-onderzoek werd uitgevoerd door middel van een polymerase chain reactions (PCR) methode op 40 wortel- en 40 houtmonsters, afkomstig van zieke en gezonde kastanjes uit vier Nederlandse gemeenten. Er werd gebruik gemaakt van algemene fytoplasma primers. Hiermee kan een indicatie worden gegeven over de aanwezigheid van fytoplasma. Materiaal en methoden DNA werd kant-en-klaar aangeleverd door de Plantenziektekundige Dienst en was gezuiverd volgens een standaardprotocol. Om aan te tonen dat er fytoplasma-DNA aanwezig was in de DNA-monsters van paardenkastanjes werd eerst een algemene PCR uitgevoerd, die het zogenaamde 16 S ribosomale gebied van fytoplasma’s (en in 24

mindere mate een groep bacteriën) in het algemeen vele miljoenen malen vermenigvuldigt. Om vervolgens specifiek fytoplasma-DNA te kunnen aantonen werd op dit geamplificeerde DNA een specifieke reactie uitgevoerd met primers, specifiek voor dit organisme. Detectie vond plaats door middel van nested PCR volgens PPO-protocol. Resultaten Met de algemene PCR werd een DNA-fragment van ong. 1600 bp geamplificeerd; in de specifieke nested PCR werd een fytoplasma-fragment van ong. 850 bp geamplificeerd (Figuur 8). Dit fragment werd tenslotte gecloneerd en gesequenced.

Figuur 8.

Nested PCR van DNA, afkomstig van houtmonsters uit Hoofddorp. Twee monsters waren positief; de baseparenladder geeft de grootte van ongeveer 850 bp aan.

De meeste gezonde kastanjebomen scoorden negatief voor fytoplasma; één boom gaf een zwakpositieve reactie. Niet alle zieke kastanjebomen bleken positief te zijn. Discussie De analyse van de DNA-monsters, afkomstig van vier locaties in Nederland, gaf een aantal positieve reacties. Dit betekent dat hier mogelijk fytoplasma’s aanwezig zijn. Er bestaat slechts een kleine kans dat er kruisreactie optreedt van de gebruikte fytoplasma-PCR met bacteriën. Hoewel bijna alle PCR-reacties positief zijn in die monsters, die ook positief waren met DGGE (paragraaf 4.1.5), zijn de gebruikte primers specifiek voor fytoplasma’s. Het verkregen amplicon gaf in datavergelijking (NCBI) 100% homologie met de fytoplasmagroep en niet met Pseudomonas. Nader onderzoek wees wel uit, dat een monster met fytoplasma ook Pseudomonas syringae bevatte. Er is een sterke correlatie gevonden tussen de kastanjemonsters met een positieve reactie op Pseudomonas syringae (zie paragraaf 4.1.5) en de aanwezigheid van fytoplasma. Gezien de toenemende incidentie van fytoplasma’s in houtige gewassen in Nederland is nader onderzoek wenselijk. Conclusie Uit onderzoek is gebleken dat een aantal kastanjebomen besmet waren met een fytoplasma. Ook een gezonde boom bleek licht geïnfecteerd. Gezien de mogelijkheid van kruisreactie met een kleine groep bacteriën, de afwezigheid van typische ‘heksenbezemachtige’ symptomen en de correlatie met de door Pseudomonas syringae besmette bomen kan worden geconcludeerd dat fytoplasma’s waarschijnlijk niet de primaire oorzaak zijn van de bloedingsziekte van paardenkastanjebomen. 4.1.8 Viroïden onderzoek Viroïden zijn veel kleiner en eenvoudiger dan virussen. Ze bevatten enkelstrengig RNA en missen een eiwitkapsel dat zo typerend is voor virussen. Viroïden gebruiken planten om zich te vermenigvuldigen. Tot dusver zijn ruim dertig soorten geïdentificeerd. 25

Materiaal en methoden Voor het viroïde-onderzoek werden op vier locaties zes monsters van bloemen genomen. Per locatie werden drie bomen zonder en drie bomen met symptomen van bloedingsziekte bemonsterd. Per boom werden vijf bloemen verzameld en als één mengmonster getoetst. Gekozen is om juist bloemen te toetsen om afbraak van eventueel aanwezige viroïden door oxiderende stoffen in bladeren en bast van de paardenkastanje zoveel mogelijk te beperken. Hierbij wordt aangenomen dat een eventueel aanwezig viroïde door de hele boom zal zijn verspreid, zoals bij de meeste viroïden en virussen het geval is. Van alle monsters werd het ‘totaal-RNA’ geïsoleerd. Hieraan werden vervolgens RT-PCR’s uitgevoerd met de twee beschikbare semi-universele primersets voor viroïden, respectievelijk Vd1F/Vd2R en AP-FW/AP-RE. RT-PCR staat voor reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Met deze techniek wordt een RNAstreng vertaald naar een DNA-streng, waardoor het mogelijk wordt om PCR (polymerase chain reactions) toe te passen. Met de gebruikte primers is het mogelijk een gedeelte van de bekende viroïden te detecteren. Resultaten Bij geen van de onderzochte monsters werd een viroïde gedetecteerd. Met de gebruikte primers kunnen 11 van de 28 voldoende gekarakteriseerde viroïden worden gedetecteerd. Dit betekent dat het onderzoek geen uitsluitsel geeft over de overige viroïden. Van 17 viroidentypen is dus nu geen uitsluitsel, maar in het licht van de bevindingen van het bacterieonderzoek is het de vraag of dit deel verder uitgevoerd moet worden. Conclusie Uit dit onderzoek zijn geen indicaties naar voren gekomen dat viroïden een rol spelen bij de bloedingsziekte van paardenkastanjes. 4.1.9 Conventioneel diagnostisch onderzoek op schimmels, bacteriën en aaltjes Onderzoek werd uitgevoerd aan 30 monsters door middel van conventionele isolatietechnieken op bacteriën en schimmels, evenals oriënterend op nematoden. De schimmel Phytophthora wordt regelmatig genoemd als een mogelijke veroorzaker van de kastanjeziekte. Dat is echter tot dusverre niet aangetoond. Mede vanwege literatuurvermeldingen van Phytophthoraisolaties uit soortgelijke symptomen heeft Aesculaap Phytophthora-deskundige Dr. Thomas Jung van de Bayerische Landesanstalt für Wald und Forstwirtschaft gevraagd voor een second opinion. Met Thomas Jung zijn de tot dusver negatieve Phytophthora-isolatiemethoden besproken. Vervolgens heeft hij op verzoek van Aesculaap op drie locaties eigen onderzoek verricht door middel van klassieke isolatiemethoden. Bij dit onderzoek werd in het hout geen Phytophthora aangetoond. Wel bleek bij ca 50% van de onderzochte bomen Phytophthora aanwezig in de bodem. De betekenis hiervan dient nader te worden onderzocht. Met aangepast protocol werd het Phytophthora-onderzoek voortgezet als aanvulling op het moleculaire onderzoek en eerder uitgevoerd klassiek diagnostisch onderzoek (CBS, PD, PPO). Uit het cytologisch en anatomisch onderzoek (paragraaf 5.1) bleek uit aspecifieke fluorescentie-labeling (DAPI - kleuring) bacteriën aanwezig in coupes. Na sterilisatie van de buitenkant groeiden er bacteriën uit dit materiaal op Luria-Broth medium. Dit werd verder geanalyseerd door PPO. Materiaal en methoden De aangeleverde stammonsters werden bewerkt volgens het standaard DiagnostiekService PPO protocol. Een deel van deze monsters is langdurig gespoeld alvorens op onderstaande media, specifiek voor een aantal schimmelgroepen, te worden uitgelegd. Dit laatste volgens voorschrift van Jung (mondeling voorschrift). 26

De gebruikte media waren AGA, een algemene voedingsbodem voor schimmels, en CMA en V8, voedingsbodems voor het isoleren van oomyceten als Phytophthora en Pythium. De PD leverde 24 wortelmonsters aan in zakjes met grond. Na het spoelen van de wortels is elk monster gesplitst en bewerkt enerzijds voor aaltjestoetsing, anderzijds voor analyse op schimmels. De analyses werden volgens standaard PPO-protocol uitgevoerd. Een deel van een monster werd beoordeeld op aanwezigheid van aaltjes. De aaltjes werden microscopisch beoordeeld en gedetermineerd op geslacht en familieniveau tot zover mogelijk. Het andere deel van de wortelmonsters werd uitgeplaat op de verschillende voedingsbodems. De agarplaten werden visueel en microscopisch beoordeeld. Determinatie vond plaats op vruchtlichamen en sporen, voor zover aanwezig. Resultaten en discussie

Analyse van houtmonsters De beoordeling vond in eerste instantie microskopisch plaats, een tiental vaak geïsoleerde (in de meeste monsters aangetroffen) bacterie-isolaten werden voor verdere moleculaire karakterisering doorgezonden naar PRI. Doorgaans worden soorten gevonden uit de genera Klebsiella, Pseudomonas en Enterobacter. Deze worden ook vaak geïsoleerd uit andere 'bloedingsziekten'; men gaat er vanuit dat deze, algemeen in grond en water voorkomende microben, via wondjes e.d. binnendringen en gaan groeien. Bij de beoordeling van de schimmeluitgroei werd ten eerste vastgesteld dat op de specifieke voedingsbodems voor oomyceten voornamelijk bacteriën en gisten uitgroeiden. Ten tweede werd microscopisch vastgesteld dat er meerdere schimmels niet sporuleerden zodat determinatie niet verder mogelijk was. Enkele van deze schimmels zijn aangehouden voor mogelijke karakterisering op DNA niveau. Phytophthora werd niet geisoleerd. Na sterilisatie van de buitenkant van het kastanjemateriaal, dat werd aangeleverd uit het cytologisch en anatomisch onderzoek (paragraaf 5.1), groeiden er bacteriën uit dit materiaal op Luria-Broth medium. Er leken twee kolonietypen aanwezig. De uitgroei op agarmedium (Figuur 9) leek sterk op die van Bacillus licheniformis (die in grond voorkomt); na Gramkleuring bleek de bacterie Grampositief. Uit vetzuuranalyse (LMG Gent, België) werd een sterke homologie gevonden met bacteriën, behorende tot het Bacillus cereus-complex. Via een algemene PCR werd het 16 S ribosomale gen van bacteriën geamplificeerd, gekloneerd en de sequentie van een fragment bepaald (BaseClear). Ook hier bleek de identiteit van beide isolaten tot het Bacillus cereus-complex te vallen.

Figuur 9.

Kweek van Bacillus cereus op agarbodem. Een aantal isolaten is bewaard voor eventuele verdere (moleculaire) determinatie.

27

Analyse van wortelmonsters Schimmels (oomyceten) In veel monsters (maar niet alle, en ook in een gezond monster) werd Pythium gevonden. Dit is een algemeen voorkomende schimmel met vele soorten. Het is niet uit te sluiten, dat in enkele gevallen een Phytophthora sp. aanwezig was, dit kon niet met zekerheid worden vbastgesteld. Ook werden vaak sporen van de schimmel Fusarium aangetroffen. Algemeen kwamen de schimmels in de hoogste aantallen en verscheidenheid voor in de zieke monsters.

Aaltjes Aaltjes werden gevonden, met name vertegenwoordigers uit de Pratylenchidae familie. Deze Pratylenchus spp. staan bekend als endoparasieten. Deze aaltjes komen algemeen voor als vrijlevende aaltjes in grondmonsters met wortels van hogere plantensoorten, maar vermenigvuldigen zich in de wortels. Volgens de tellingen kwamen in zieke bomen relatief meer aaltjes voor. Dit kan het gevolg zijn van verzwakking en de aanwezigheid van meer voedsel voor deze aaltjes. Ook werden relatief veel Macroposthonia gevonden, echter niet in alle monsters. Deze aaltjes behoren tot de Criconematidae familie en zijn algemeen voorkomend en bekend als plantenparasieten in diverse gewassen. Van de soort M. dherei wordt specifiek beschreven dat deze voorkomt in o.a. Burgum in Nederland! Echter ook in een gezond monster werd deze nematode aangetroffen. Conclusies De analyse van de stukjes stam van zieke kastanjes gaf aan, dat er meer organismen groeiden uit ziek dan uit gezond materiaal. Veel gisten waren aanwezig; dit duidt op fermentatie van het bloedingsap. Een aantal isolaten is gekarakteriseerd via een algemene PCR. Een reactie werd gevonden met algemene primers, die xanthomonaden en pseudomonaden herkennen. Een aantal van deze isolaten is naar PRI gestuurd voor nadere karakterisatie op een later tijdstip. De isolaten, verkregen uit de stammonsters vanuit het cytologisch en anatomisch onderzoek bleken te behoren tot de Bacillus cereus-groep. Deze zijn bekend als endofyt of saprofyt, maar niet als potentieel pathogeen. Bacteriën uit deze groep worden zelfs gebruikt als antagonist tegen Rhizoctonia solani. De wortelmonsters leverden geen aanwijzingen op, dat er sprake zou kunnen zijn van een parasitaire nematode of schimmel. Wel was er een trend zichtbaar van een groter aantal schimmels en nematoden in de zieke bomen vergeleken met de twee gezonde boommonsters. 4.1.10 Fytopathologisch veldonderzoek Op drie locaties (Houten,Haarlemmermeer en Geleen) werden infectieproeven uitgevoerd met aangetaste houtponsjes. Onderstaand zijn de eerste resultaten beschreven van de proef uitgevoerd in Geleen. De proeven zijn nog niet afgerond. Materiaal en methoden De proef in Geleen werd begin april uitgevoerd op 12 bomen, namelijk zes zieke bomen en zes gezonde bomen. Inoculatie vond plaats door met een holpijp, doorsnede 13 mm, in tweevoud ponsjes aangetast hout uit de stam te nemen en over te brengen op gezonde bomen respectievelijk gezonde delen van aangetaste bomen op verschillende hoogten (basis, 50, 100, 150, 200 cm). De aangetaste houtponsjes werden genomen van de buitenrand van zieke plekken. Er werden op deze wijze vijf gezonde bomen kunstmatig geïnfecteerd met ponsjes aangetast hout afkomstig van één zieke boom. Daarnaast werden op dezelfde wijze van vijf aangetaste bomen per boom aangetaste houtponsjes genomen en ingebracht in gezonde delen van dezelfde boom. Als referentie werden bij een gezonde boom op dezelfde wijze ponsjes genomen en ingebracht. De bomen werden periodiek beoordeeld op ontwikkeling van de aantasting, begin juli werd een beoordeling uitgevoerd. 28

In november zullen monsters genomen worden voor moleculair onderzoek door PRI om te toetsen of er een microorganisme betrokken is bij de ontwikkeling van verbruining vanuit aangetaste ponsjes naar omringend weefsel. Resultaten Zowel bij de gezonde bomen, die waren geïnfecteerd met houtponsjes afkomstig van een zieke boom, als bij de aangetaste bomen, die op gezonde delen van de boom waren geïnfecteerd met geïnfecteerde houtponsjes van dezelfde boom, werd bij 84% van de ingebrachte ponsjes ontwikkeling van de verbruining vanuit de ponsjes naar het omringende weefsel waargenomen (Figuur 10). De gemeten lesiedoorsnede van aantasting variëerde van 3 tot 8 cm (geen aantasting was 2 cm). Bij de gezonde boom geïnfecteerd met gezonde houtponsjes werd geen lesieontwikkeling waargenomen. Dit onderzoek wordt nog voortgezet.

Figuur 10. Lesie ontwikkeling na kunstmatige inoculatie met een aangetast houtponsje in een gezonde boom.

4.2

Verspreidingsmechanismen

Projectleider: Ing. Martin Verbeek (PRI) Projectmedewerkers: Ir. Fons van Kuik (PPO) Onderzoek naar aanwezigheid van virus in de paardenkastanjemineermot en in de koningsdopluis De laatste jaren is ons land ‘overspoeld’ met de paardenkastanjemineermot (Cameraria ohridella). Alle witbloeiende paardenkastanjebomen in ons land zijn aangetast door dit insect. Verondersteld wordt dat het beestje niet direct grote schade geeft. Van veel insecten is bekend dat ze een ziekteverwekker kunnen overdragen. In dit onderzoek werd onderzocht of de kastanjemineermot een overbrenger is van een virus en dus indirect de oorzaak zou kunnen zijn van de bloedingsziekte en de snelle verspreiding ervan.

Screening van kastanjemineermotten Medio april 2005 werden kastanjemineermotten getoetst. Het betrof hier uitgekomen poppen van bladeren uit seizoen 2004, afkomstig van een boom met bloedingsverschijnselen. Hiervan werden twee monsters gemaakt van elk tien motten. Deze monsters werden vermalen en verwerkt tot EM-preparaten. Medio mei 2005 werden kastanjemineermotten ontvangen van gezond-ogende en zieke kastanjebomen uit Gouda. Hiervan werden 14 monsters gemaakt van elk tien mineermotten. EM preparaten werden in duplo gemaakt en geanalyseerd. In totaal werden 160 mineermotten geanalyseerd. 29

Screening van dop/wolluizen Gaande het onderzoek kwam er meer aandacht voor een eventuele rol van de koningsdopluis (Pulvinaria regalis) als overbrenger van een mogelijk virus. Verschillende virusziekten kunnen worden overgebracht door bladluizen De koningsdopluis vormt de laatste jaren een ware plaag o.a. in de paardenkastanjebomen. In juli 2005 werden koningsdopluizen verzameld van zieke paardenkastanjes in de botanische tuin ‘Belmonte’ te Wageningen. Hiervan werden tien monsters gemaakt van elk twee luizen. EM-preparaten werden gemaakt en geanalyseerd. Resultaten In geen van de monsters van mineermotten werden deeltjes van plantenvirussen waargenomen. Wel is in één monster een geïnfecteerde insectencel gevonden, die een bolvormig virus bevatte, waarschijnlijk een virus van de mineermot zelf. Ook in de monsters van de dopluizen werden geen virusdeeltjes waargenomen in de EM preparaten. Conclusie Dit onderzoek toont aan dat de kastanjemineermot geen verspreider is van pathogene virussen die in verband kunnen worden gebracht met de kastanjeziekte. Ook zijn in dit onderzoek geen plantenpathogene (virussen) aangetoond in de verzamelde koningsdopluizen.

30

5

Niet-parasitair onderzoek

Het hiervoor beschreven onderzoek naar de mogelijke oorzaken van de bloedingsziekte in paardenkastanjes in Nederland heeft zich gericht op ziekteverwekkers zoals schimmels en bacteriën. Daarnaast is het goed mogelijk dat niet-parasitaire oorzaken verantwoordelijk zijn voor en/of een rol spelen bij de ontwikkeling van de bloedingsziekte in kastanje.

5.1

Celbiologische en anatomische karakterisering bloedingsziekte

Projectleider: Dr. André van Lammeren, Laboratorium Plantencelbiologie, Botanisch Centrum, Wageningen Universiteit en Research Centrum (WUR) Projectmedewerkers: Prof. Dr. Ir. Pierre de Wit (WUR), Ir. Jitze Kopinga (Alterra), Irene Paris Barrios (WUR), Henk Kieft (WUR) De door de bloedingsziekte aangetaste paardenkastanjebomen vertonen aan hun buitenzijde als vroeg symptoom bloedende plekken op de stam en takken, waaruit in meerdere of mindere mate een helderbruine vloeibare substantie naar buiten treedt. Doel Het cytologisch en anatomisch onderzoek is erop gericht om de symptomen in hout en bast op cellulair en weefselniveau vast te stellen en te achterhalen wat de oorzaak van de ziekte zou kunnen zijn. Materiaal en methoden Het ziektebeeld en het verloop van de ziekte van de paardenkastanje zijn in beeld gebracht in de periode februari t/m september 2005. Daarbij is gebruik gemaakt van monstermethodes waarbij twee-wekelijks meerdere hout- en bastmonsters zijn verzameld van de stam van zieke en gezonde bomen. De monsters zijn met een boortol of holpijp genomen en direct daarna geanalyseerd in het laboratorium (Figuur 11).

Figuur 11. Bastmonsters genomen van een gezonde paardenkastanjeboom (links) en een aangetaste boom (rechts).

Van het gemonsterde materiaal zijn met een microtoom microscopische preparaten gemaakt van het dwarse, tangentiale en radiale vlak. Preparaten zijn met verschillend histochemische kleuringsmethoden behandeld. Daarbij is onder andere gekleurd met Soedan IV om wasachtige stoffen en cutine te detecteren, met neutraal rood om verhouting aan te tonen, met aniline blauw (water blue) om callose zichtbaar te 31

maken, en met 4',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) om plant-eigen en plant-vreemd DNA van bijvoorbeeld het nuc1eoid van bacteriën en de celkernen van schimmels te detecteren. Preparaten zijn met lichtmicroscopische en fluorescentiemicroscopische technieken bestudeerd en hiervan zijn microfoto's gemaakt. Nadat bleek dat in het materiaal van aangetaste planten bacteriën voorkwamen, zijn deze geïsoleerd en ter identificatie aan andere onderzoekers van Aesculaap ter beschikking gesteld. Beeldmateriaal is geanalyseerd. Resultaten Allereerst is een analyse gemaakt van gezond bast- en houtweefselweefsel om een vergelijking te hebben voor het aangetaste materiaal.

Omschrijving van het gezond materiaal: Bastweefsel van Aesculus hippocastanum is opgebouwd uit zeefvaten met samengestelde zeefplaten, begeleidende cellen, lengteparenchym, straalparenchym, kristalcellenvezels en tangentiale lagen bastvezels. Alleen nabij het vaatweefselvormend cambium ligt een dunne laag geheel functioneel floeem, het sapvlies. Dit is de laag met assimilatentransport. De functionele zeefvaten zijn gekarakteriseerd door het vermogen nog callose te kunnen afzetten op hun zeefplaten. Het sapvlies gaat over in een laag floeem van vele millimeters dik, waarin het parenchym nog leeft, maar de zeefvaten en begeleidende cellen niet meer intact zijn. Hier is wel opslag, maar geen assimilatentransport. Bij bomen tot 20-25 jaar ligt in het buitenste deel van de bast een afsluitend periderm (kurklaag) dat ook direct de buitenkant van de bast vormt. De totale bastlaag kan tot 1 cm dik zijn. Houtweefsel bestaat uit diffuusporig hout met micropore houtvaten met enkelvoudige doorboringen. Het lengteparenchym is levend en grenst aan de houtvaten. Het grondweefsel bestaat uit libriform en er zijn enkelvoudige houtstralen.

Omschrijving van het aangetaste materiaal: Aantasting van een boom uit zich aan de buitenkant van de stam als eerste in de vorm van een kleine opening in het afsluitende periderm, waaruit helderbruine vloeistof naar buiten treedt. Ter plaatse van de aantasting is het floeem onder het periderm sterk bruin gekleurd. De bruinkleuring is een gevolg van polyphenoloxidase-activiteit, die in desintegrerend weefsel veel sterker is dan in intact weefsel. Zie voor het werkingsmechanisme van polyphenoloxidase paragraaf 5.2. De verkleuring betreft vooral de lengte- en straalparenchymcellen. Aangetaste parenchymcellen in de bast sterven vervolgens af en de cellen en het weefsel desintegreren. Bij dat proces komt veel vocht in de intercellulaire ruimte vrij en dat vocht kan als heldere bruine vloeistof naar buiten treden. Het proces van weefselverval is vaak lokaal. Het wordt dikwijls alleen in de buitenste lagen van de bast aangetroffen, terwijl het meer binnenwaarts gelegen weefsel nog intact is. Dat betekent dat ter plaatse van een aantasting, het assimilatentransporterend deel van het floeem (sapvlies) niet aangetast hoeft te zijn. Er is meestal geen geleidelijke overgang van aangetast weefsel naar niet aangetast weefsel. Op de overgang tussen beide gebieden is vaak een nieuwe afsluitingslaag aangetroffen, die door de plant als reactie op de aantasting is aangelegd. Een dergelijke laag bestaat uit cellen die verkurken nadat zij eerst enige keren gedeeld zijn en rijtjes gevormd hebben. Hier is sprake van hernieuwde peridermvorming kennelijk als reactie op de aantasting, waardoor verdere uitbreiding van aantasting wordt vertraagd/voorkomen. De nieuw-gevomde peridermlagen liggen grillig in de bast van periclinaal tot soms radiaal, waarbij het nieuw-gevormde periderm kan aansluiten op het oorspronkelijke periderm dat de bast aan de buitenzijde begrenst of op peridermlagen die al eerder tijdens het ziekteproces zijn gevormd. De aantasting van het floeem kan ook tot aan en in het hout optreden. Dan is ook het sapvlies en de cambiumlaag aangetast. Op een dergelijke plaats kan geen herstel meer optreden en zal na enige tijd de bast loslaten van de houtcylinder (Figuur 12).

32

Figuur 12. Links: Bastmonster van een aangetaste paardenkastanjeboom. De bovenzijde is de buitenkant van de stam, de onderzijde is het gebied van het vaatweefselvormend cambium. Het monster is in de lengterichting doorgesneden en toont bruinkleuring door aantasting tot aan het cambium, maar ook is een deel van het bastweefsel nog licht gekleurd en gezond. De pijlen wijzen op de aanleg van nieuwe afsluitingslagen zoals ook te zien zijn in de rechter figuur. Rechts: Detail van aangetast bastweefsel op dwarse doorsnede. Nieuw aangelegde afsluitingslagen (periderm) ontstaan als reactie op de aantasting. De verkurkte celwanden lichten rood op door kleuring met Soedan III. De donkerbruingekleurde cellen aan de bovenzijde zijn dood.

Daar waar het hout is aangetast verkleuren ook de houtparenchymcellen en vaak ontstaan lacunes waar de parenchymcellen van bast en hout vervallen zijn. Op plekken waar ook het hout is aangetast, zijn de houtvaten vaak gedeeltelijk gevuld met granulair materiaal. Het kan zijn dat het afbraakproducten zijn, die uit het lengteparenchym vrijgekomen zijn. Op basis van analyse gedurende de hele onderzoeksperiode van februari tot september hebben we geen progressie in het ziektebeeld kunnen waarnemen voor wat betreft het type afwijkingen in bast- en houtweefsel. De aangetaste bomen die bij het onderzoek zijn betrokken, bleven over het algemeen redelijk/goed in blad en bloeding nam niet toe. In de zomer zijn wel veel aantastingen op de paardenkastanjes waargenomen onder andere door de kastanje-mineermot. Dergelijke aantastingen leggen een stress op de bomen die wel degelijk van invloed kan zijn op de bacteriële infectie en de wijze waarop de plant daarop kan reageren.

Detectie en analyse van bacteriën in aangetast weefsel Microscopische analyses op het voorkomen van bacteriën heeft duidelijk gemaakt dat monsters van gezonde bomen en monsters van niet-aangetaste plekken van aangetaste bomen geen bacteriën bevatten. Monsters van geïnfecteerde plekken bleken wel bacteriën te bevatten. Bacteriën zijn aangetroffen in sterk aangetaste delen, waar zij soms als clusters bijeenlagen op plaatsen waar het weefsel al geheel gedesintegreerd was, maar ook werden bacteriën aangetroffen in intacte parenchym cellen van het floeem en het xyleem op plaatsen met geringe aantasting. Dit betekent dat bacteriën in weefsels met verschillende gradaties van aantasting zijn aangetoond (Figuur 13).

33

Figuur 13. Detailopname van bastparenchymlcel van een aangetaste paardenkastanjeboom. In het cytoplasma van de cel zijn bacteriën te zien na kleuring met DAPI (pijlen). Cw: celwand, Cy: cytoplasma, K: kristal. Met het oog op identificatie van de bacteriën zijn monsters van gezonde en zieke bomen genomen en op petrischalen getoetst op aanwezigheid van bacteriën (in samenwerking met J van Doorn (PPO) en A Speksnijder (PRI)). In samenwerking met Joop van Doorn (PPO) zijn bacteriecultures op schaal geïsoleerd. Uit analyse, onder meer uitgevoerd door het collectie/identificatielab (LMG) in Gent, bleek dat het waarschijnlijk onschuldige grampositieve bacteriën behorend tot het Bacillus cereus - complex in zaten en ook Gramnegatieve bacteriën mogelijk Erwinia of Xanthomonas; vergelijk ook paragraaf 4.1.9. Vervolgens zijn meerdere gezonde en aangetaste monsters gebruikt om bacteriecultures op te zetten. Gezond weefsel gaf geen kolonies, waarmee is aangetoond dat er geen endofytische bacteriën waren. Bacteriën die steeds voorkwamen in de monsters van aangetaste delen van zieke bomen zijn geïdentificeerd door A. Speksnijder (PRI). Zij behoren tot de groep van de Pseudomonaden (Pseudomonas syringae) en blijken bij herinfectie van zaailingen dezelfde ziekte symptomen te kunnen veroorzaken als te zien in de aangetaste bomen (zie ook paragraaf 4.1.5). Deze bacteriën spelen waarschijnlijk een belangrijke rol bij de bloedingsziekte. Als een aangetast monster enige tijd in vochtig milieu wordt gehouden (uitgevoerd tot 12 dagen en 4 °C), blijkt dat sterke hyfevorming op gang komt hetgeen betekent dat schimmels in het aangetaste materiaal aanwezig zijn. Er zijn vooralsnog geen aanwijzingen uit de andere projecten van dit onderzoeksprogramma dat deze schimmels de oorzaak van de aantasting zijn. Zij kunnen een contaminatie vormen nadat het bastweefsel is gedegenereerd.

5.2

Fysiologisch onderzoek aan de bloedingsziekte

Projectleider: Prof. Dr. Linus van der Plas, Leerstoelgroep Plantenfysiologie, (WUR) Projectmedewerkers: Leo Slingerland (PPO), Dr. Ir. Ria Weijnen-Derkx (PPO), Henk Dassen (WUR) Onafhankelijk van de vraag welke ziekteverwekkers de bloedingsziekte in paardenkastanjes initiëren is het van belang om fysiologische en biochemische processen in en rond de ‘wonden’ tot stilstand te brengen. Onderzocht wordt of een zichzelf versterkend proces van celafbraak en verbruining de verschijnselen kunnen veroorzaken, die bij de bloedingsziekte worden waargenomen en vervolgens of door ingrijpen in dit proces aan deze verschijnselen een halt kan worden toegeroepen. 34

In het beschreven proces zijn twee fasen te onderscheiden: (1) een initiatie-fase en (2) een vervolg-cascade (zie Figuur 14). In de initiatiefase treedt er afbraak op van de membranen van cellen in de bast. Deze membraanschade kan een gevolg zijn van een combinatie van oorzaken zoals verwonding (door bijv. insectvraat of aanprikken door een insect), binnendringen van een bacterie (bijv. Pseudomonas), milieuvervuiling, stress als gevolg van slechte standplaatsomstandigheden etc.

Figuur 14. Schematische weergave proces celafbraak en verbruining In alle gevallen is het gevolg decompartimentalisatie van de celonderdelen en activeren van de reactie van polyfenoloxydase, waarbij fenolen (altijd ruim aanwezig in de stam als bouwstenen van lignine) met zuurstof worden omgezet in chinonen, die op hun beurt (direct of indirect met eiwitten) reageren tot bruin of rood gekleurde melanine/tannine-achtige stoffen; vergelijk de linkerkant van het schema weergegeven in Figuur 14. Dergelijke reacties treden vaak op bij verwonding en zijn dan vaak beperkt van omvang. Deze chinonen kunnen echter ook aanleiding geven tot een vervolg-cascade, die bij kastanje de oorzaak zou kunnen zijn van de symptomen van de ‘bloedingsziekte’; vergelijk de rechterkant van het schema weergegeven in Figuur 14. Via een enzymatische tussenstap (redox cycling: vorming van semichinonen) kunnen er zuurstofradicalen ontstaan (en de nog schadelijker OH-radicalen) die, als ze niet tijdig worden weggewerkt, weer nieuwe membraanschade kunnen veroorzaken. Het gevolg is verdergaande decompartimentalisatie, verdergaande polyfenoloxydase-activatie, vorming van nog meer chinonen en vervolgens nog meer schadelijke radicalen. Wanneer dit proces niet gestopt wordt, breidt het zich verder uit en leidt tot bloeding en vorming van bruine pigmenten op steeds grotere schaal. Het voorkòmen van deze ‘vervolg-cascade’ is essentieel voor elke plant. Daarvoor is gewoonlijk een aantal verdedigingsmechanismen werkzaam. Wanneer één of meerdere van deze verdedigingsmechanismen niet goed werkt, dan krijgt het proces de kans zich verder uit te breiden. Bij de zieke paardenkastanjebomen lijken deze verdedigingsmechamismen te zijn aangetast, waardoor er bloeding ontstaat. Waarom dit zo sterk optreedt bij de aangetaste kastanjes, is nog onbekend. Het antwoord hangt mede af van de veroorzaker: is deze veroorzaker (een Pseudomonas? vergelijk hoofdstuk 4.1.5) een relatief nieuw pathogeen voor kastanje, waartegen de ‘normale’ verdediging niet werkt, of is de kastanje door andere (stress?)-condities verzwakt waardoor een ‘overmatig’ sterke reactie optreedt? Mogelijk speelt een combinatie van factoren een rol.

35

Om zeker te zijn dat het hier geschetste systeem inderdaad in kastanje voorkwam, is eerst met behulp van een aantal standaardreacties getoetst of de ‘spelers’ uit bovenstaand schema (zie Figuur 14) (met name fenolen en het polyfenoloxydase-enzym) inderdaad in monsters uit de stam van kastanje konden worden aangetroffen. Toen dit het geval bleek te zijn, heeft het onderzoek zich vooral gericht op het testen van mogelijkheden om in te grijpen in het proces. Dit ingrijpen in het proces is zowel gebruikt om het proces beter te begrijpen maar vooral om een mogelijke remedie te ontwikkelen, die eerst getest is in het laboratorium op monsters verzameld van zieke bomen, en later in het veld. De te testen ingrepen sloten direct aan op de fysiologische achtergrond, die in Figuur 10 is weergegeven. De initiatie-reactie kan worden geblokkeerd door het enzym polyfenoloxydase te remmen (een groot aantal remmers was hiervoor al beschreven, waarbij sommige, afkomstig uit de voedingsindustrie niet direct giftig zijn en ook buiten de laboratoriumsituatie getest kunnen worden) en door de vorming van chinon tegen te gaan De vervolg-cascade kan worden geremd door zuurstofradicalen en waterstofperoxide weg te vangen. Een aantal stoffen blijkt ook in beide processen in te grijpen; die stoffen (bijv. ascorbinezuur) waren voor de toepassing extra interessant. Na selectie en testen van een aantal remmers en combinaties hiervan in het laboratorium op stukjes kastanje afkomstig uit buitenkant van de stam zijn er een beperkt aantal uitgekozen om in het veld te testen. Deze veldtesten zijn gestart in juli en zullen uiteindelijk een eerste indicatie geven over de praktische toepasbaarheid van remstoffen. Deze aanpak heeft aangetoond dat de eerder genoemde processen, inderdaad optreden bij de bloedingsziekte bij de paardekastanje. De daarop aansluitende behandelingen om de symptomen te bestrijden, zijn vervolgens getest in het veld; deze veldtesten (zie onder) lopen nog. Materiaal en methoden

Laboratoriumproeven In literatuur werd informatie gezocht naar de wijze waarop polyfenoloxidase in planten kan worden bepaald en op welke wijze de werking kan worden geremd, waarbij vooral aandacht werd gegeven aan remmers/ remmingsmethodieken die geen of weinig schadelijke neveneffecten hebben, o.a. door na te gaan hoe polyfenoloxydase wordt geremd in de voedingsindustrie. Er werden bepalingsmethoden van polyfenoloxydase getest, om (1) na te gaan of polyfenoloxydase in de aangetaste delen van kastanje voorkomt en (2) om de in de literatuur gesuggereerde remmingsmethodieken in vitro te testen, ter voorbereiding van de geplande testen in het veld. Gestart werd met het maken van extracten van monsters uit de bast van kastanjebomen uit Houten, waarbij met behulp van een spectrofotometrische bepalingsmethode met catechol als substraat, snel duidelijk werd dat er in kastanjeweefsel inderdaad een hoge activiteit van het polyfenoloxydase kon worden aangetoond. Wanneer een extract gemaakt werd of wanneer de cellen van een bastmonster werden lekgemaakt door ze te bevriezen, bleek een intense bruinverkleuring ook plaats te vinden zonder toegevoegd substraat: blijkbaar is ook het substraat voor de polyfenoloxydase-reactie (fenolen) ruim aanwezig. Dit bleek ook wanneer met Folin-reagens de aanwezigheid van fenolen in kastanjemonsters werd getest. Nadat op deze wijze was aangetoond dat het polyfenoloxydase-systeem in kastanjemonsters voorkwam (en zeer actief was), heeft het onderzoek zich vooral gericht op het testen van remstoffen, met name met het oog op toepassing van dergelijke remstoffen in de praktijk. In eerste testen werden de effecten van NaF, cysteïne, citroenzuur (pH-verlaging), hexylresorcinol, ferulinezuur en een verlaagde zuurstofconcentratie onderzocht op extracten van bastmonsters, om de effectiviteit in het onderdrukken van de polyfenoloxydase-reactie van verschillende concentraties remstof nader te onderzoeken. Snel werd voor die remstoffen, die veelbelovend waren echter overgegaan op de ontwikkeling van een ‘in-vivo’-test, die op twee wijzen werd uitgevoerd: 36

(a) Het testen van de effecten van verschillende concentraties NaF, cysteïne, citroenzuur en ascorbinezuur op de ophoping van bruine kleurstoffen na toediening van extern catechol-substraat aan door kastanjemonsters aan water afgegeven polyfenoloxydase. Figuur 15 laat hiervan een voorbeeld zien: op deze manier kan snel een effect op de verbruiningssnelheid van deze stoffen worden getest.

0 (watercontrole)

Oplopende concentraties

Ascorbinezuur: 0 - 25 mM

Citroenzuur: 0 - 25 mM

Cysteïne: 0 - 5 mM

Figuur 15. Effecten van verschillende concentraties NaF, cysteïne, citroenzuur en ascorbinezuur op de phoping van bruine kleurstoffen na toediening van extern catechol-substraat aan door kastanjemonsters aan water afgegeven polyfenoloxydase.

De aandacht werd geconcentreerd op deze vier remstoffen omdat drie ervan (ascorbinezuur [vitamine C], cysteïne [een aminozuur] en citroenzuur) niet-giftige stoffen zijn, die eenvoudig kunnen worden toegepast, terwijl enkele van deze stoffen op meerdere plaatsen ingrijpen in het boven geschetste polyfenoloxydase-schema: ascorbinezuur en cysteïne remmen polyfenoloxydase, voorkómen de vorming van chinon en grijpen ook aan op de vervolgreacties/zuurstofradicalen, NaF remt polyfenoloxydase en citroenzuur zorgt via een verlaagde pH voor een verminderde polyfenoloxydase-activiteit. (b) In een tweede type in-vivo-test werden de verbruiningsreacties aan stukjes kastanjebast onder laboratoriumcondities geremd met behulp van deze remstoffen. Hierbij werd zowel gewerkt met extern substraat (catechol) als met het eigen (fenolische) substraat. Controlestukjes werden oranjebruin (door de reactie van het kastanje polyfenoloxydase in de stukjes met het eigen fenolsubstraat) of zwartbruin (wanneer extra catechol als substraat werd toegevoegd). Het bleek dat met name ascorbinezuur in staat was om ook na een langere periode de reactie te blokkeren. Daarnaast waren ook NaF, citroenzuur en cysteïne actief. Daarom werden deze stoffen gekozen om in de veldproeven te gebruiken.

37

Veldproeven Middelen In het laboratorium bleken diverse stoffen in staat de bruiningsreactie van ziek materiaal een halt toe te roepen of sterk te vertragen. Op grond van deze proeven zijn vier middelen geselecteerd die op bomen in het veld getest werden. Deze middelen zijn ascorbinezuur, cysteïne, citroenzuur en NaF. Ook combinaties van middelen werden getest omdat de geteste stoffen verschillen in werkingsmechanisme en daardoor elkaars werking zouden kunnen versterken, wanneer lange termijn effecten moeten worden verkregen. Naar aanleiding van literatuuronderzoek naar stamtoepassingstechnieken (bark application) van hormonen aan (fruit)bomen werden de middelen op twee verschillende manieren toegepast: gemengd met een lanoline-pasta of als spuitvloeistof, waarbij verschillende uitvloeiers aan de spuitvloeistoffen werden toegevoegd. Uitvloeiers zijn zeep-achtige stoffen die de oppervlaktespanning verlagen en daardoor de opname van stoffen verbeteren. Om de gewenste concentraties van middelen in lanoline-pasta te krijgen werden de middelen in tienmaal te hoge concentratie opgelost in water en één deel van deze oplossing werd vervolgens goed gemengd met negen delen vloeibaar gemaakte lanoline.

Behandeling bomen In totaal werden 140 zieke bomen langs de rondweg van de gemeente Houten behandeld. Deze bomen hadden een stamdiameter van ongeveer 30 cm. Elke behandeling werd in vijfvoud uitgevoerd (vijf blokken). Ook werden controle behandelingen (met alleen water + uitvloeier of lanolinepasta, zonder remstoffen) uitgevoerd. Lanolinepasta-behandelingen werden met een plamuurmes op zieke plekken op de stam gesmeerd (Figuur 16). Spraybehandelingen werden met een rugspuit op de stam gespoten (Figuur 17), waarbij de gehele stam vanaf de grond tot aan het begin van de kroon met een dunne laag vloeistof bedekt werd. In totaal werden de bomen vier keer behandeld: week 26 (1 juli 2005), week 29 (19 juli 2005), week 31 (5 augustus 2005), week 34 (26 augustus 2005).

Figuur 16. Behandeling van een zieke plek met lanolinepasta met daarin toevoegingen die de bruiningsreactie mogelijk doen stoppen.

38

Figuur 17. Bespuiting van de stam van een aangetaste paardenkastanje met een spray, bestaande uit een uitvloeier en in water opgeloste middelen die de bruiningsreactie mogelijk doen stoppen. Waarnemingen Op 14 juli 2005 zijn de kronen van alle bomen gefotografeerd. Deze foto’s kunnen dienen als referentiemateriaal om uitspraken te kunnen doen van een mogelijk effect van een behandeling op het algehele beeld van een boom. Daarnaast zijn alle bomen kort geclassificeerd met de mate van aantasting (niet, licht, matig, ernstig, bastscheuren). Ook is vermeld of een aantasting van dit jaar was (lichtbruine vlekken) of van voorgaande jaren (donkerbruine tot zwarte vlekken). Het fotograferen van alle bomen is op 13 september 2005 herhaald. Op 28 oktober 2005 zijn de stammen van alle bomen beoordeeld op nieuwe aantasting (niet, licht, matig, ernstig) sinds de laatste behandeling van de bomen op 26 augustus 2005. Foto ‘s van de kroon zijn eind oktober niet meer gemaakt, omdat een groot deel van het blad reeds bruin was. Van elke boom in de veldproef is een kroonopname gemaakt kort na start van de proef. Resultaten en discussie.

Laboratoriumproeven In de onderzochte kastanje monsters bleek een hoge polyfenoloxydase-activiteit voor te komen, ook in vergelijking met andere plantaardige systemen (tulp, appel). Ingevroren en weer ontdooide monsters lieten een sterke polyfenoloxydase-verbruinings-reactie zien, zowel bij gezond als bij ziek weefsel, en zowel met extern als met eigen substraat. Dit komt overeen met de verwachting dat de cellen een actief polyfenoloxydase-verbruinings-systeem bezitten, waarvan de componenten met elkaar reageren als de cellen kapotgaan; ook het substraat voor de reactie is blijkbaar voldoende aanwezig. Koelkast-monsters, waarvan de cellen niet kunstmatig zijn ‘lekgeprikt’ door een vriesdooi-cyclus vertonen alleen een snelle verbruining bij gebruik van ‘ziek’ kastanje-materiaal (dat blijkbaar al veel kapotte cellen bevat); monsters van ‘gezonde’ plekken verbruinen veel minder omdat het polyfenoloxydase uit de cellen niet beschikbaar is voor de reactie. In een oriënterende proef bleek dat cysteïne en NaF in staat waren de polyfenoloxydase-activiteit sterk te remmen. Ook een verlaagde pH via citroenzuur en verlaagde zuurstofconcentratie vertoonden een remmend effect. In de vervolgproef, waarin effecten van verschillende concentraties NaF, cysteïne, citroenzuur en ascorbinezuur getest werden op verbruinende kastanjemonsters, bleken de vier remstoffen te werken, waarbij de hoogste concentraties cysteïne en citroenzuur en met name de hoogste concentratie ascorbinezuur, 39

na vjjf dagen nog weinig verbruining vertoonden in vergelijking met de controles en lagere concentraties van de remstoffen; deze waren na vijf dagen allen donker bruinzwart gekleurd.

Veldproeven Aan het begin van de veldproef zijn alle bomen kort geclassificeerd (Tabel 1).

Tabel 1.

Korte classificatie van de bomen in de veldproef fysiologie in de gemeente Houten bij start van de proef.

Omschrijving

Aantal bomen

Lichte aantasting

91

Matige aantasting

49

Bastscheuren

19

Aantasting 2005

20

Aantasting 2004/eerder

24

Aantasting 2005 + aantasting 2004/eerder

96

Aan de kroon van de bomen was half september en eind oktober niet te zien of bepaalde behandelingen herstel van de boom geven. Lastig daarbij is dat een mogelijk effect van behandelingen gemaskeerd kan worden door reeds vroeg intredende herfstverschijnselen en aantasting door de kastanjemineermot. De kans is groot dat volgend voorjaar wel een uitspraak te doen is of bepaalde behandelingen effect hebben gehad. De stamwaarnemingen van 28 oktober 2005 lieten zien dat op 40% van de bomen geen nieuwe aantasting te zien was en op 60% van de bomen wel. Bij nieuwe aantasting ging het vaak om clusters van kleine plekjes. Opvallend daarbij was dat veel nieuwe aantasting aan de schaduwzijde van de boom te zien was, terwijl eerdere aantasting vaak aan de zonzijde te zien was. Op plekken waarop lanoline gesmeerd was, was meestal geen uitbreiding te zien. Dat gold echter ook voor de controle, waarbij lanoline zonder remstoffen aangesmeerd was. Figuur 18 geeft effecten van de geteste behandelingen op het optreden van nieuwe aantasting weer. In vergelijking met de verschillende controlebehandelingen, gaven de diverse remstoffen geen duidelijke vermindering van de aantasting te zien. Voortzetting van behandeling en waarneming in het voorjaar is noodzakelijk om met meer zekerheid uitspraken te kunnen doen over een mogelijk effect van de geteste remstoffen, al dan niet in combinatie.

40

120

Zipper

Pentra-bark

100 pasta

80

Agral-Gold

60 40 20

B Zipper

Pentra-bark

pasta

citric 25

cyst 5 asc 25

c NAF 25

asc 25 citric 25

c

NAF 25 cyst 5

asc 50 citric 50

NAF 50 cyst 10

cyst 5 + asc 25 + citric 25

citric 25 cyst 5 + asc 25

cyst 5 asc 25

c NAF 25

cyst 5 + asc 25 + citric 25

cyst 5 + asc 25

asc 25 citric 25

c

Agral-Gold

NAF 25 cyst 5

score aantasting

nieuwe aantasting 28-10-2005 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

citric 25

c

NAF 25 cyst 5 asc 25

asc 25 citric 25

c NAF 25 cyst 5

citric 50

NAF 50 cyst 10 asc 50

cyst 5 + asc 25 cyst 5 + asc 25 + citric 25

asc 25 citric 25

c NAF 25 cyst 5

cyst 5 + asc 25 + citric 25

citric 25 cyst 5 + asc 25

c

0 NAF 25 cyst 5 asc 25

Percentage bomen met nieuwe aantasting

A

nieuwe aantasting 28-10-2005

Figuur 18. Effecten van verschillende behandelingen met de remstoffen NaF, cysteïne, ascorbinezuur en citroenzuur op nieuwe aantasting tussen de behandeling van de bomen in de periode 1 juli – 26 augustus en waarneming op 28 oktober 2005. De remstoffen (getallen geven de concentratie in mM weer) werden toegediend in een lanolinepasta of als spuitvloeistof met verschillende uitvloeiers (Pentra_Bark, Zipper, Agral-Gold). C geeft telkens een controle-behandeling zonder remstoffen weer, dus alleen pasta of water met de verschillende uitvloeiers. Figuur A: Percentage bomen met nieuwe aantasting, ongeacht de ernst van deze nieuwe aantasting. Figuur B: de mate van nieuwe aantasting is meegenomen, berekend als gemiddelde score van 5 bomen, waarbij als volgt beoordeeld werd: 0= geen nieuwe aantasting, 1 = licht, 2 = matig, 3 = ernstig.

41

Conclusie Duidelijk is geworden dat in de kastanjebast de verschillende componenten van het polyfenoloxydaseverbruiningsreactie-systeem actief zijn en dat het mogelijk is om in deze reacties in te grijpen. Een aantal remstoffen met weinig te verwachten neveneffecten (ascorbinezuur, citroenzuur, cysteïne, NaF) zijn getest op laboratoriumschaal en bleken in staat om de verbruiningsreactie geheel of gedeeltelijk te blokkeren. Deze stoffen zijn vervolgens ook in het veld op zieke kastanjebomen getest in verschillende concentraties en combinaties en met behulp van verschillende toedieningstechnieken. De bomen zijn vier maal behandeld. Het is nog te vroeg om conclusies te trekken over een mogelijk effect in het veld. Komend voorjaar (2006) moet daarin meer inzicht komen.

42

6

Inventarisatie en groeiplaatsonderzoek

Projectleider: Bart Stoffer (IBA) Projectmedewerkers: Dr. Ir. Jelle Hiemstra (PPO), Ir. Jitze Kopinga (Alterra)

6.1

Landelijke verspreiding van bloedende paardenkastanjebomen

Dit deel van onderzoek is gericht op het verkrijgen van een representatief beeld van de verspreiding van de bloedingsziekte in paardenkastanjes in geheel Nederland. Het onderzoek is uitgevoerd door middel van een enquête onder groenbeheerders van de Nederlandse gemeenten. Deze werden verzocht hun kastanjebomen op een gestandaardiseerde methode te controleren op het voorkomen en de ernst c.q. aard van het aantastingbeeld. Doel Een representatief beeld te krijgen van de landelijke verspreiding en de mate van aantasting en van de eventuele invloed van een beperkt aantal boom- en groeiplaats- kenmerken op de aantasting. Materiaal en methoden Op basis van gegevens van de Vereniging Nederlandse Gemeenten zijn in april 2005 de 467 gemeenten van Nederland aangeschreven. Op basis van een korte vragenlijst is om deelname aan de inventarisatie verzocht. Hierop gaven 242 gemeenten aan te willen meewerken. Deze gemeenten ontvingen een set inventarisatieformulieren, vergezeld van informatie over het aantastingsbeeld en instructie/handleiding voor de wijze van beoordeling en categorisering. In juni 2005 waren 60 sets ontvangen. Door een bericht per email of telefoon zijn de andere gemeenten medio juni nogmaals herinnerd aan de inventarisatie. Op 10 juli 2005 is de inname-periode beëindigd om tijdige verwerking mogelijk te maken. Er was toen van 93 gemeenten een bruikbare set gegevens ontvangen, dwz. 38% van de uitgezette enquêteformulieren. Alle voor 10 juli ontvangen gegevens zijn handmatig omgezet in Excelbestanden. Vervolgens zijn deze statistisch bewerkt en gevisualiseerd op een plattegrond van Nederland. Een eerste versie hiervan werd in juli geplaatst op de website www.kastanjeziekte.wur.nl. Half augustus is een update hiervan geplaatst op de website. Bij de afsluiting van het inventarisatie-onderzoek zijn de resultaten per gemeente en provincie samengevat en gevisualiseerd op een kaart van Nederland (Figuur 19 en 20).

Figuur 19. Overzicht van de Nederlandse gemeenten (groene kleur) die hebben aangegeven om mee te doen aan de landelijke inventarisatie.

43

Verklaring van de kleurcodering: Geel: minder dan 10% van het aantal geïnventariseerde bomen is aangetast Blauw: tussen 10 en 25% van het aantal bomen is aangetast Paars: tussen 25 en 50% van het aantal bomen is aangetast Rood: meer dan 50% van het aantal bomen is aangetast

Figuur 20: Overzicht van het percentage per gemeente van de geïnventariseerde paardenkastanjes, waarop ziekteverschijnselen zijn waargenomen. N.B. Gemeenten die gegevens van minder dan 20 bomen hebben opgestuurd zijn hierin niet opgenomen.

Resultaten

Geografische spreiding Tot 2004 waren de meldingen van bloedingsziekte beperkt tot het gebied dat zich globaal bevindt ten westen van de lijn Groningen - Breda. In het oosten van het land werd het aantastingsbeeld vrijwel niet gemeld. Uit de huidige inventarisatie blijkt dat het westen van Nederland nog steeds grote aantallen aangetaste bomen kent, maar dat ook paardenkastanjes in Oost-Nederland niet vrij zijn van deze aantasting In hoeverre dit zou kunnen wijzen op een mogelijke oost- en zuidwaartse verspreiding van de ziekte door Nederland kan op basis van de gegevens echter niet worden vastgesteld. De meeste zieke bomen staan in Noord- en Zuid-Holland. Meer dan 30% van alle hier geïnventariseerde paardenkastanjes is aangetast. Een vergelijkbaar percentage, maar lagere aantallen paardenkastanjes vinden we in Utrecht, Gelderland, Flevoland, Groningen en Friesland. De overige provincies hebben veel minder ziektegevallen gerapporteerd. Opvallend zijn nog de gegevens van Brabant. Na Noord- en ZuidHolland heeft deze provincie de meeste kastanjes. Toch is ‘slechts’ 16% aangetast.

Soorten en cultivarverschillen De witte paardenkastanje (Aesculus hippocastanum) is ernstig aangetast. De cultivar ’Pyramidalis’ is met een ziektepercentage van 45% van het totale aantal, het meest aangetast. Gevolgd door de cultivar ’Baumannii’ met 34%. De soort zelf staat op 31%. Iets lagere percentages zijn gevonden bij de rode paardenkastanje (Aesculus x carnea). Van de cultivar ’Briotii’ en de hybridesoort zelf is één van de vier bomen in Nederland ziek. Naast de witte en rode paardenkastanje is, weliswaar in veel mindere mate, nog een aantal andere soorten of cultivars gemeld. In rode en gele pavia (Aesculus pavia en A. flava) is wel aantasting gemeld maar deze soorten komen met circa 200 individuen per soort verhoudingsgewijs weinig voor. Wél is het aantal aangetaste bomen binnen deze soorten opvallend laag. Van de soorten A. indica, A. glabra en A. parviflora en van de hybridesoort A. x mutabilis zijn slechts enkele exemplaren gemeld, alle niet zichtbaar aangetast.

Leeftijd boom Op de inventarisatieformulieren kon de diameter van de bomen worden aangegeven in vier klassen (gemeten op 130 cm boven het maaiveld). Uit de resultaten blijkt dat de bomen met een stamdoorsnede groter dan 20 cm het meest zijn aangetast. In de categorie beneden 20 cm is ‘slechts’ 20% aangetast, 44

terwijl in alle drie categorieën daarboven het aantastingspercentage ruim boven de 30% ligt. De meeste bomen verkeren nog in het beginstadium van aantasting (lichte aantasting). Opvallend is het hoge percentage ernstig aangetaste bomen in de diametercategorie 20-35 cm.

Groeiplaats De verschijnselen van bloedingsziekte blijken het meest voor te komen op klei- en veengronden, en aantoonbaar minder op zandgronden. Echter door de geografische spreiding mogen nog geen harde conclusies worden getrokken. Pas wanneer er voldoende gegevens voorhanden zijn van gemeenten waarbinnen paardenkastanjes zowel op zand- als veen/kleigronden voorkomen kan hierover na statistische analyse een meer harde uitspraak over worden gedaan. Bij eenderde van het aantal geïnventariseerde bomen komt onderbegroeiing voor. Uit de gegevens blijkt vooralsnog geen duidelijke relatie met het optreden van bloedingsziekte. Ook de aan- of afwezigheid van verharding rond de boom lijkt weinig invloed te hebben.

Invloed grondwater Veruit de meeste bomen staan op locaties waar hun wortels het grondwater kunnen bereiken. Deze bomen lijken wat vaker ziekteverschijnselen te hebben dan paardenkastanjes in een hangwaterprofiel, maar rekening houdend met de mate en aard van eventuele inschattingsfouten door de waarnemers kan aan dit verschil vooralsnog geen conclusies worden ontleend. Een duidelijk verschil in aantasting blijkt uit de gegevens met betrekking tot stagnatie van water op het maaiveld. Daar waar dit ’soms’ voorkomt treden de ziekteverschijnselen veel vaker op dan op plaatsen die droog blijven of die vaak onder water staan. Ook hier moet echter rekening worden gehouden met verschillen in de beoordeling c.q. inschatting door de waarnemers tussen ‘soms’ en ‘ja’ en zijn harde conclusies vooralsnog niet te trekken. Conclusies • • • •

•

Bloedingsziekte komt in heel Nederland voor. De grootste aantallen zieke bomen staan in de provincies Zuid Holland, Noord Holland, Utrecht en Noord-Brabant. Aesculus hippocastanum en de cultivars daarvan worden het meest aangetast (31-45%), gevolgd door A. x carnea en haar cultivars (13-28%). De overige Aesculus soorten komen veel minder voor, maar incidenteel is ook aantasting gemeld in A. pavia en A. flava. Bloedingsziekte komt het meest voor in bomen met een diameter groter dan 20 cm; in alle diktecategorieën boven die maat is het aantastingspercentage meer dan 30%. Het grootste aantal zwaar aangetaste bomen komt voor in de categorie 20-35 cm (25%). De ziekte is gemeld op alle bodemsoorten, maar op zand (aantastingspercentage 25%) komt ze minder voor dan op klei of veen (elk 35%). De invloed van de grondsoort op de ontwikkeling van de ziekte kan hieruit echter niet zonder meer worden afgeleid, omdat ook de geografische ligging invloed kan hebben op het ziektebeeld. Veel meldingen komen uit gebieden waar overwegend veen- en kleigronden (en geen zandgronden die men ter onderlinge vergelijking zou kunnen gebruiken) van nature voorkomen. De mogelijke invloed van overige standplaatsfactoren (watervoorziening, wateroverlast, onderbegroeiing) kwam uit de inventarisatie onvoldoende eenduidig naar voren.

6.2

Groeiplaatsonderzoek paardenkastanjebomen

Op basis van resultaten van de inventarisatie naar het vóórkomen en de ernst van de aantasting van kastanjebomen door de bloedingsziekte vindt een aanvullend en meer gedetailleerd groeiplaatsonderzoek plaats. Doel Het vinden van mogelijke correlaties tussen het voorkomen van de bloedingsziekte, de conditie van de bomen en boven- en ondergrondse omgevingsfactoren. 45

Materiaal en methoden Een selectie wordt gemaakt van 10 objecten met zoveel mogelijk variatie in aantasting en zo mogelijk een goede geografische spreiding. Objecten worden gekozen met alleen de (veel voorkomende) Aesculus hippocastanum en alleen diens cultivar ‘Baumannii’ teneinde de eventuele invloed van genetische variatie te beperken tot alleen die van de onderstam. Het accent ligt bij dit onderdeel van het onderzoek op invloed van de conditie van de bomen op de aantasting en de relatie met (ongunstige) standplaatsfactoren. Het onderzoek moet inzicht geven in de mate waarin deze aspecten een rol spelen bij de bloedingsziekte en kan tevens een indicatie geven voor beheersmaatregelen zoals verbetering van een aantal standplaatsfactoren waarmee het ziekteproces kan worden beïnvloed. Ieder object bevat ten minste 7 bomen in elk van de vier aantastingsklassen; ‘niet-licht-matig-zwaar’. Per object worden 28 bomen aan een nauwkeurig onderzoek onderworpen, waarbij van iedere boom 14 parameters worden genoteerd met betrekking tot de conditie en verschijningsvorm van de boom. Per aantastingsklasse worden 6 parameters met betrekking tot de groeiplaats genoteerd en wordt de profielopbouw van de doorwortelde bodem beschreven. Opname bovengrondse kenmerken: Geselecteerde bomen worden bovengronds beoordeeld op: schotlengte, bladgrootte, visuele beoordeling, stamdiameter, mate van aantasting door de kastanjemineermot, aanwezigheid van aantasting door Guignardia, inschatting (in %) van de ‘bedekkingsgraad’ van de ziekte op het takvrije stamgedeelte, beoordeling van de ‘versheid’ van de aantastingverschijnselen, aan- of afwezigheid van wondcallusvorming, boomhoogte, kroonbreedte, opkroonhoogte. Opname groeiplaatskenmerken: Type groeiplaats (verhard, onverhard), vorm/ afmeting boomspiegel, onderbegroeiing, waterstagnatie op maaiveld?, kunnen de wortels bij het grondwater?, expositie ten opzichte van de wind gerelateerd aan de aanwezigheid van ‘windobstakels’, expositie ten opzichte van de zon, het voor wortelgroei beschikbare bodemprofiel wordt aan de hand van een grondboring (edelmanboor) beschreven met een maximumdiepte van 120 cm. Gegevens worden vastgelegd in gestandaardiseerde opnamelijsten. Resultaten Het groeiplaatsonderzoek wordt nog opgestart.

46

7

Communicatie

Coördinator/woordvoerdster: Dr.ir. Marijke Dijkshoorn-Dekker (PPO) Drs. Bouke de Vos (WUR), Mariëtte Pasman (Gemeente Den Haag) De bloedingsziekte heeft het karakter van een maatschappelijke issue. Meerdere gemeenten, vooral de grote vier, hebben zich op politiek-bestuurlijk niveau hard gemaakt voor een grootschalige aanpak; de wethouder van Den Haag heeft zich uitgesproken voor groter draagvlak; de gemeenten hebben zich in het begin van het optreden van de werkgroep Aesculaap garant gesteld voor uitvoering van het onderzoek. De minister van LNV heeft uitgesproken de bezorgdheid te delen en heeft te kennen gegeven zich verantwoordelijk te voelen voor het onderzoek naar de oorzaak en heeft daarvoor begin april 2005 € 275.000 beschikbaar gesteld. Er is behoorlijke belangstelling bij de gemeenten en onder de media en het grote publiek Aesculaap heeft zich er voor ingezet om daar adequaat op te reageren. Omdat het om een onbekende ziekte gaat die bovendien veel onrust veroorzaakt, is het belangrijk dat de resultaten van het onderzoek eenduidig en vooral duidelijk en feitelijk worden gecommuniceerd, zonder mee te gaan in ongefundeerde speculatie. Aesculaap heeft ervaren dat dit communicatiedoel veel inspanning en de nodige regie vergt. Daarom is gekozen voor een adequate en stelselmatige informatievoorziening naar alle betrokken partijen, inclusief het grote publiek, en de communicatie onder verantwoordelijkheid te brengen vvan de programmacoördinator. Aanpak Binnen Aesculaap en haar communicatieteam is afgesproken dat de informatie in volgorde van betrokkenheid van de verschillende partijen naar buiten gaat. Dat zijn allereerst de Aesculaapleden en de opdrachtgever, het ministerie van LNV. Vervolgens gaat de informatie naar iedereen die zich heeft ingezet: gemeenten die hebben meegewerkt aan de inventariserende, de Vereniging Stadswerk, de VNG, de Nederlandse Bond voor Boomkwekers en de Bomenstichting. Zij krijgen een electronische brief, die verschijnt voorafgaand aan de andere communicatiemiddelen. Daarna wordt het nieuws via website en andere middelen vrijgegeven voor overige belanghebbenden. Uitvoering In de beginperiode van Aesculaap was de communicatie vooral gericht op het bekend worden van Aesculaap, het creëren van draagvlak en het bereiken van de gemeenten voor het inventariseren van het kastanjebestand in hun gemeente. In een later stadium was het belangrijk de juiste informatie regelmatig en adequaat vrij te geven over de stand van zaken in het onderzoek en ernst en omvang van het probleem. Aesculaap heeft sinds eind december 2004 een eigen website: www.kastanjeziekte.wur.nl (Bijlage 1). Op 4 april 2005 is er door middel van twee persberichten, van het ministerie van LNV en van Wageningen UR namens Aesculaap, landelijke aandacht gegeven aan de kastanjeziekte. Hierin zijn ook gemeenten opgeroepen tot inventarisatie van hun kastanjebestand. Aesculaap is sindsdien veelvuldig via verschillende kanalen (telefoon, Internet, email, bezoeken, brieven) benadert door media en particulieren. Dat heeft in een kleine tien maanden geleid tot bijna 300 artikelen in de Nederlandse kranten en tot bijna twintig optredens op radio en televisie. Een uitgebreid overzicht van de verschillende contacten op mediagebied (televisie, radio en schrijvende pers) is te vinden in Bijlage 2. In mei 2005 is de eerste informatie vanuit het onderzoek naar buiten gegaan door middel van een elektronische nieuwsbrief. Uiteindelijk werd het grote publiek evenals de media via de website op de hoogte gebracht. Volgende elektronische nieuwsbrieven zijn verzonden in juni en september. De website wordt regelmatig van verse inhoud en de laatste stand van zaken voorzien. Er wordt daarbij gelet op de toegankelijkheid van de informatie en hoe verschillende doelgroepen bereikt kunnen worden/ aan hun informatie kunnen komen (wetenschappers, particulieren, gemeenten, partijen in het groen). De website wordt nog steeds veelvuldig bezocht, met meer dan een paar duizend bezoekers per maand. Op deze site is ook de emailbox: [email protected] te vinden. Menigeen vindt deze ingang om eventuele vragen te stellen, foto's toe te sturen of te informeren. Het gaat hierbij voornamelijk om particulieren. 47

Op 14 september is een tweede persbericht uitgegaan. Hierin werden de resultaten van het inventarisatieonderzoek bekend gemaakt, evenals de mogelijke veroorzaker van de bloedingsziekte. Ook hierop was het aantal reacties groot. Verder zijn er in het kader van het programma presentaties gehouden op onder andere het ISB overleg en de boomteelttechniekdagen. Producten Producten opgeleverd gedurende het programma Aesculaap: -

48

website: www.kastanjeziekte.wur.nl persbericht voor het neerzetten van Aesculaap en het bereiken van alle gemeenten in Nederland persbericht eindrapport landelijke inventarisatie en mogelijke veroorzaker bloedingsziekte het bedienen van verschillende media, schrijvende pers, televisie en radio op regionaal en nationaal gebied. het communicatieplan 2 brieven richting gemeenten voor het oproepen tot inventarisatie van kastanjebestand het beantwoorden van vele vragen van particulieren/gemeenten en andere partijen in het groen door middel van www.kastanjeziekte @wur.nl centrale persoverzicht het houden van presentaties op verschillende bijeenkomsten draaiboek/protocol voor bekendmakingen eindresultaten onderzoek naar de oorzaak vakbladartikelen

Bijlagen Bijlage 1: Website Homepage website: www.kastanjeziekte.wur.nl

49

50

Bijlage 2: Kastanjeziekte in de media Optredens in de audio-visuele media: 13 november 2005 - Vroege Vogels 15 september 2005 - Teleac radio Hoe?zo! - klik hier voor de uitzending 14 september 2005 - Radio Gelderland, RTL Z, NOS Radionieuws, NOS journaal, NCRV Radio 2, School voor journalistiek 21 augustus 2005 - Vroege Vogels - klik hier voor de uitzending - klik hier voor informatie over de fotoactie van Vroege Vogels 6 augustus 2005 – Radio 1 Journaal 10 juni 2005 - RTL Nieuws 7 juni 2005 - Radio Rijnmond 30 mei 2005 - Omroep Flevoland 19 en 20 mei 2005 - RTL Nieuws 17 mei 2005 - Jeugdjournaal 28 april 2005 - Omroep Zeeland 25 april 2005 - Radio Oost 11 en 12 april 2005 - Radio 3 FM, Leuk is anders 7 april 2005 - TV Gelderland, Buitengewoon 5 april 2005 - Radio Gelderland: ochtend + middag: 22 maart 2005 - TV Gelderland, Buitengewoon 7 december 2004 - Radio Oost 26 november 2004 - Radio 3 FM, Leuk is anders 24 november 2004 - RTL Nieuws TV 24 november 2004 - Radio 1, Het Filiaal 23 november 2004 - Radio 2, VARA ontbijtradio 28 oktober 2004 Radio Friesland Overzicht verschenen krantenartikelen: Een uitdraai van LexisNexis Academic levert 273 artikelen over de bloedingsziekte op, die zijn verschenen in de periode 1 januari 2005 - 24 oktober 2005. NB: In dit overzicht zijn enkele dagbladen niet meegenomen, zodat het werkelijke aantal hoger ligt. 1. De Gelderlander, October 20, 2005, OSREG1 (regiopagina Rijk van Nijmegen), 98 woorden, PAALBERICHT: GEVELD Kastanjeziekte bereikt Groesbeek De kastanjeziekte heeft Groesbeek bereikt. ... PAALBERICHT: GEVELD Kastanjeziekte bereikt Groesbeek 2. Dagblad van het Noorden , October 18, 2005, G-Oost , 299 woorden, Kastanjes ziek in heel Scheemda ; Tientallen bomen in dorpen moeten worden gekapt , Door Pieter Broesder ... aan de zogeheten bloedingsziekte waaraan in heel ... ... de ziekte: www.kastanjeziekte.wur.nl 3. Dagblad van het Noorden , October 18, 2005, G-Noord ; G-Midden ; G-West , 296 woorden, Kastanjes ziek in de gemeente Scheemda ; Kap tientallen bomen is 51

noodzakelijk, Door Pieter Broesder ... aan de zogeheten bloedingsziekte waaraan in heel ... ... de ziekte: www.kastanjeziekte.wur.nl 4. Dagblad van het Noorden , October 18, 2005, G-Oost , 43 woorden, Kastanjeziekte in Scheemda 5. De Gelderlander, October 11, 2005, NYREG1 (regiopagina Nijmegen), 97 woorden, PAALBERICHT: GROENLINKS 'Paardekastanje ruilen voor plataan' ... ofwel de dodelijke bloedingsziekte ofwel lijden onder ... 6. De Gelderlander, October 8, 2005, MLREG1 (regiopagina Maasland), 240 woorden, Flinke toename zieke kastanjes ... aan de beruchte bloedingsziekte lijdt, is in zes ... ... besmet met de bloedingsziekte. Dit waren er ... ... de site www.kastanjeziekte.wur.nl aangeeft ... ... aan de ongeneeslijke bloedingsziekte. Dat blijkt uit ... ... Universiteit Wageningen. De bloedingsziekte wordt mogelijk veroorzaakt ... 7. Provinciale Zeeuwse Courant, October 6, 2005, 13, 245 woorden, Kastanjes langs Oostsingel niet aangetast ... door de gevreesde bloedingsziekte, die op dit ... ... De schade die bloedingsziekte aanricht, en waaraan ... 8. Zwolse Courant, October 6, 2005, NW1REG, 445 woorden, Stervende kastanjes produceren nog rijke oogst ... van de werkgroep Aesculaap die zich vanuit ... ... verspreiding van de kastanjeziekte, kan dat niet ... 9. BN/DeStem, October 3, 2005, 449 woorden, Bomen in slechte toestand; Serie ziekten 'onrustbarend' ... door de kastanje-bloedingsziekte, een landelijke epidemie, ... ... Omdat bij de kastanjeziekte de kans lijkt ... 10. NRC Handelsblad, September 30, 2005, CS; Pg. 24, 102 woorden, Zieke kastanjeboom. De bloedingsziekte en de kastanje ... ... ziektes. Bij de bloedingsziekte zit er een ... 11. Trouw, September 29, 2005, deVerdieping; Pg. V05, 1336 woorden, Een dodelijke epidemie in onze kastanjes, DOOR SANDER BECKER ... aan de mysterieuze 'bloedingsziekte'. Hierbij ontstaan donkere, ... ... onderzoek naar de bloedingsziekte. 'Het zou ontzettend ... ... team van Dijkshoorn, Aesculaap geheten, maakte toen ... ... oorzaak van de kastanjeziekte nog steeds niet ... ... op, want de bloedingsziekte richt enorme schade ... ... van de mysterieuze 'bloedingsziekte', maar ook van ... 12. Brabants Dagblad, September 29, 2005, 115 woorden, Ook Heesch kampt met bloedziekte van kastanjes ... besmet met de kastanjeziekte. Zo is de kastanje ... ... oorzaak van de kastanjeziekte is volgens de plantenziektenkundige ... 13. Dagblad Tubantia/Twentsche Courant, September 27, 2005, AM1 (Stadspagina Almelo), 409 woorden, Geen paniek over kastanjeziekte, wel zorgen De gevreesde kastanjeziekte slaat ook in ... 52

... door de zogeheten bloedingsziekte, die zich in ... ... omvang van de kastanjeziekte in Almelo vooralsnog ... ... vandaar de naam bloedingsziekte. Onder die vlekken ... Geen paniek over kastanjeziekte, wel zorgen 14. Provinciale Zeeuwse Courant, September 27, 2005, 9, 291 woorden, Korte berichten ... KAPELLE - De kastanje- of bloedingsziekte heeft in Kapelle ... 15. Boerderij, September 27, 2005, Akkerbouw: Kort; N.52 van 2005, J.90; P.28, 35 woorden, FYTOFTORA NIET IN KASTANJE, Red. ... voor de oprukkende bloedingsziekte in kastanjebomen, aldus ... 16. NRC Handelsblad, September 24, 2005, Wetenschap & Onderwijs; Pg. 42, 997 woorden, Kastanjedood ; Een derde van de kastanjes sterft door nieuwe ziekte, KAREL KNIP De verwoestende kastanjeziekte die door Nederland ... ... worden van de kastanjeziekte in de VS, ... ... Zie ook www.kastanjeziekte.wur.nl Boven: ... ... slachtoffer van de kastanjeziekte in Breda. Onder: ' ... 17. Brabants Dagblad, September 24, 2005, Regio, 268 woorden, 'Minder bomen, maar mooie grote. Svp geen geknotte Tsjernobyl-bomen' ... zorgen. Als de kastanjeziekte toeslaat is 'zijn deel' ... 18. Gelders Dagblad, September 24, 2005, LB1REG, 178 woorden, Kastanjeziekte nu ook in Berkelland ... BORCULO - De gevreesde kastanjeziekte heeft nu ook ... Kastanjeziekte nu ook in ... 19. Nieuw Kamper Dagblad, September 24, 2005, KP1REG, 563 woorden, Ook andere bomen vatbaar voor kastanjeziekte? ... voor de gevreesde kastanjeziekte? Een ontdekking in ... ... veroorzaker van de kastanjeziekte. ... trekken dat de kastanjeziekte overgeslagen is op andere ... ... bestrijding - van de kastanjeziekte te achterhalen. 'In ... ... Natuurlijk, door de kastanjeziekte zijn we er extra ... ... lijken op de kastanjeziekte. Een appel- en ... ... werkgroep tegen de kastanjeziekte denkt men nu ... ... bomen vatbaar voor kastanjeziekte? 20. Dagblad Tubantia/Twentsche Courant, September 23, 2005, HK2 (Haaksbergen), 381 woorden, Korte berichten ... over de oprukkende kastanjeziekte heeft ertoe geleid ... ... al om de kastanjeziekte gaat, dan is dat ... ... bij de werkgroep Aesculaap in Wageningen die ... 21. Dagblad Tubantia/Twentsche Courant, September 23, 2005, NE2 (Neede), 218 woorden, Kastanjeziekte nu ook in Berkelland ... EIBERGEN - De gevreesde kastanjeziekte heeft nu ook ... Kastanjeziekte nu ook in ... 22. Dagblad Tubantia/Twentsche Courant, September 23, 2005, EN1 (Enschede), 462 woorden, Dodelijke ziekte bedreigt ENSCHEDE - De mysterieuze kastanjeziekte heeft nu ook ... 53

... gevallen van de kastanjeziekte gemeld. Een van ... ... vertoont bastscheuren. De 'bloedingsziekte' verspreidt zich snel ... ... Boulevard.' De werkgroep Aesculaap, die de kastanjeziekte onderzoekt, adviseert om ... 23. Dagblad Tubantia/Twentsche Courant, September 23, 2005, VOP (voorpagina), 104 woorden, Kastanjeziekte rukt op in regio ENSCHEDE - De kastanjeziekte maakt langzaam maar ... ... dode opgeschreven. De kastanjeziekte wordt waarschijnlijk veroorzaakt ... Kastanjeziekte rukt op in ... 24. Boerderij, September 21, 2005, Akkerbouw: Kort; N.51 van 2005, J.90; P.30, 35 woorden, FYTOFTORA NIET IN KASTANJE, Red. ... voor de oprukkende bloedingsziekte in kastanjebomen, aldus ... 25. de Volkskrant, September 19, 2005, Binnenland; Pg. 02, 545 woorden, Een laan zonder bomen is geen laan meer ; hl2 class='subhead' Mysterieuze bloedingsziekte tast eenderde van paardekastanjes aan; in Haarlem kwijnt de helft weg /hl2, VAN ONZE VERSLAGGEVER, Haarlem ... van de mysterieuze bloedingsziekte die sinds 2002 ... ... aangetast door de bloedingsziekte. Deze kastanjes heb ... ... machteloosheid maakt de kastanjeziekte voor Heemskerk ingrijpender ... ... laatste strohalm is onderzoeksgroep Aesculaap in Wageningen. Maar ... 26. Het Parool, September 16, 2005, Amsterdam; Pg. 99, 415 woorden, Ziekte maakt kastanjeboom tot zorgenkindje, PAROOL ... gevolgen van de kastanjeziekte, vooral in stadsdeel ... ... aan de mysterieuze 'bloedingsziekte', blijkt uit onderzoek ... ... daarvoor opgerichte werkgroep Aesculaap. In het grootste ... ... de vraag vroeg Aesculaap de gemeente de ... ... de bevindingen van Aesculaap blijkt dat de bloedingsziekte zeer waarschijnlijk wordt ... 27. Eindhovens Dagblad, September 16, 2005, Regio, 256 woorden, Kastanjeziekte ook in de stad; Stichting Stadsbomen geschrokken EINDHOVEN - De gevreesde kastanjeziekte, waaraan inmiddels eenderde ... ... van de werkgroep Aesculaap worden in het ... ... daar komt de kastanjeziekte nu ook nog ... Kastanjeziekte ook in de ... 28. Leeuwarder Courant , September 16, 2005, noord ; west ; zuid ; stad , 243 woorden, Groene zeep en spiritus tegen kastanjeziekte ... lijden aan de bloedingsziekte moeten zoveel mogelijk ... 29. Het Parool, September 15, 2005, Binnenland; Pg. 6, 49 woorden, Zieke paardekastanjes, EXTERN ... besmet met een bloedingsziekte. In de provincie ... 30. de Volkskrant, September 15, 2005, Binnenland; Pg. 03, 191 woorden, Eenderde wilde kastanjes besmet met bloedingsziekte, VAN ONZE VERSLAGGEVER, AMSTERDAM ... met een onbekende bloedingsziekte. De bomen in ... Dit maakte werkgroep Aesculaap woensdag bekend na ... ... procent. In werkgroep Aesculaap zitten onder meer ... ... van Landbouw onderzoekt Aesculaap de verspreiding en ... ... oorzaak van de bloedingsziekte. Het onderzoek moet ... 54

31. Trouw, September 15, 2005, Economie; Pg. 12, 96 woorden, Bloedziekte teistert paardekastanjebomen ... met de onbekende bloedingsziekte. ... meldde de werkgroep Aesculaap gisteren na een ... ... oorzaak van de bloedingsziekte. Onderzoekers zijn somber ... 32. Trouw, September 15, 2005, Economie; Pg. 12, 96 woorden, Bloedziekte teistert paardekastanjebomen ... met de onbekende bloedingsziekte. ... meldde de werkgroep Aesculaap gisteren na een ... ... oorzaak van de bloedingsziekte. Onderzoekers zijn somber ... 33. NRC Handelsblad, September 15, 2005, Binnenland; Pg. 02, 267 woorden, Paardekastanje ziek, DOOR EEN ONZER REDACTEUREN, ROTTERDAM, 15 SEPT. ... door de dodelijke bloedingsziekte. Dat blijkt uit ... 34. Dagblad van het Noorden, September 15, 2005, D-Zuidwest; D-Zuidoost; D-Noord; G-Oost ; G-Noord ; D-Midden ; G-West ; G-Midden ; G-Stad , 57 woorden, Ziekte velt veel kastanjebomen ... met de onbekende bloedingsziekte. Deze bomen komen ... 35. De Gelderlander, September 15, 2005, GOBIN1 (Binnenland), 101 woorden, PAALBERICHT: BLOEDINGSZIEKTE Eenderde van de kastanjes is ziek ... aan de beruchte bloedingsziekte. ... bast. De onderzoeksgroep Aesculaap, onder leiding van ... PAALBERICHT: BLOEDINGSZIEKTE Eenderde van de ... 36. Leeuwarder Courant , September 15, 2005, stad , 432 woorden, Derde deel Leeuwarder kastanjes doodziek LEEUWARDEN De kastanjeziekte heeft zich in ... ... aangetast. Hoe de bloedingsziekte zich verspreidt, is niet ... ... opgeschreven. De werkgroep Aesculaap (onder andere Wageningen ... ... aan de kastanje- of bloedingsziekte. Landelijk gezien heeft ... ... pseudomonas syringae. De bloedingsziekte tast de bast ... 37. Leeuwarder Courant , September 15, 2005, noord ; west ; zuid ; stad , 62 woorden, Kwart kastanjes in Friesland bloedt ... van de werkgroep Aesculaap, die alle Nederlandse ... ... kastanjes aan de bloedingsziekte. 17 38. Leeuwarder Courant , September 15, 2005, noord ; west ; zuid , 363 woorden, Al 25 procent van kastanjebomen ziek ... aan de werkgroep Aesculaap beschikbaar hebben gesteld, ... ... een inventarisatie van Aesculaap onder de 467 ... ... lijdt aan de bloedingsziekte. Landelijk gezien heeft ... ... pseudomonas syringae. De bloedingsziekte tast de bast ... 39. Agrarisch Dagblad, September 15, 2005, N.4 van 2005, J.20; P.2;bb2, 93 woorden, BIJNA EENDERDE VAN PAARDEKASTANJES ZIEK, ANP/AgD ... met de onbekende bloedingsziekte. ... meldt de werkgroep Aesculaap na een inventarisatie ... ... van zieke bomen. Aesculaap herkent uit voorlopig ... 40. Algemeen Nederlands Persbureau ANP, September 14, 2005, BINNENLAND, 409 woorden, Bijna eenderde van paardekastanjebomen ziek, Vanloon/Paalvast, 55

WAGENINGEN (ANP) ... met de onbekende bloedingsziekte. In de provincie ... ... meldde de werkgroep Aesculaap woensdag na een ... ... oorzaak van de bloedingsziekte. In Aesculaap zitten deskundigen van ... ... paardekastanjes staan. De bloedingsziekte, die in 2002 ... ... oorzaak van de bloedingsziekte in principe afgerond ... AESCULAAP 41. Provinciale Zeeuwse Courant, September 14, 2005, 11, 463 woorden, Kastanjeziekte woedt op Schouwen-Duiveland ... door de zogeheten bloedingsziekte, blijft tot dusver ... ... van de werkgroep Aesculaap, vallend onder de ... ... de internetpagina www.kastanjeziekte.wur.nl een ... ... achtergrond van de bloedingsziekte. De belangrijkste ontdekking ... ... ook de veroorzaker is. Aesculaap handhaaft het advies ... Kastanjeziekte woedt op Schouwen- ... 42. Dagblad van het Noorden , September 13, 2005, D-Zuidwest , 374 woorden, Gevreesde bloedingsziekte ramp voor kastanjes , Door Jacqueline Wouda ... en zeer besmettelijke bloedingsziekte, waar landelijk al ... ... bestrijding van de kastanjeziekte in Meppel. Hij ... 43. Dagblad van het Noorden , September 13, 2005, D-Zuidwest , 48 woorden, Kastanjes massaal geveld door ziekte ... en zeer besmettelijke bloedingsziekte, waar landelijk al ... 44. Dagblad van het Noorden , September 13, 2005, D-Zuidwest , 51 woorden, Wat te doen met uw kastanjeboom ... onduidelijkheid is over de kastanjeziekte, is er maar één ... 45. Dagblad van het Noorden , September 13, 2005, D-Zuidwest , 69 woorden, Symptomen van kastanjeziekte ... die door de kastanjeziekte is aangetast, krijgt op ... 46. Dagblad van het Noorden , September 13, 2005, D-Zuidwest , 155 woorden, Speciale werkgroep onderzoekt kastanjeziekte ... bij experts onbekende kastanjeziekte binnen vanuit het ... ... daarop de werkgroep Aesculaap op, die zieke ... ... financieel oogpunt is de kastanjeziekte een kleine ramp. ... ... gemeente, zo waarschuwt Aesculaap. 47. Provinciale Zeeuwse Courant, September 8, 2005, 13, 638 woorden, Rilland in actie voor kastanjes ... de bomen de kastanjeziekte heeft. ‘Die boom ... ... onderzoek naar de kastanjeziekte, dat op dit ... ... onderzoek naar de kastanjeziekte afwachten. Kaprijp ‘Eigenlijk ... 48. Apeldoornse Courant, September 3, 2005, AP2REG, 300 woorden, Steun voor eigenaren zieke kastanjes ... maatregelen rond de kastanjeziekte kosten de gemeente ... 49. BN/DeStem, September 1, 2005, 339 woorden, 'Met die kastanjebomen is niets aan de hand' ... het om de kastanjeziekte ging. ‘Toen later ... 56

50. Rotterdams Dagblad, August 31, 2005, IJssel en Lek; Pg. 311, 239 woorden, Kastanjes ziek in Capelle ; Bomen blijven nog even overeind staan ... door de werkgroep Aesculaap, bleek daarna pas ... ... bomen zullen afsterven. Aesculaap, opgericht door Universiteit ... ... symptomen lijken op bloedingsziekte bij beukensoorten en ... 51. BN/DeStem, August 29, 2005, 498 woorden, Kastanjeziekte velt bomen regio ... kastanjes bij. ‘De kastanjeziekte werd in 2002 ... ... exemplaren. De mysterieuze kastanjeziekte heeft in Breda ... ... bekend is over de kastanjeziekte heeft deze gemeente ... ... bekend over de kastanjeziekte, ook wel bloedingsziekte genoemd. Aantasting is te ... ... door de werkgroep Aesculaap, waarin onder meer ... ... raadsel hoe de kastanjeziekte ontstaat. Zijn bacterien of ... ... informatie over de kastanjeziekte op http://www.kastanjeziekte.wur.nl Kastanjeziekte velt bomen regio 52. BN/DeStem, August 25, 2005, 559 woorden, De kastanje verkeert in zeer zwaar weer ... van de mysterieuze bloedingsziekte. En wie over ... ... beurt. De mysterieuze kastanjeziekte heeft in Breda ... ... wachten staat. De kastanjeziekte werd in 2002 ... ... door de werkgroep Aesculaap, waarin onder meer ... ... raadsel hoe de kastanjeziekte ontstaat. Zijn bacterien of ... ... informatie over de kastanjeziekte op www.kastanjeziekte.wur.nl 53. BN/DeStem, August 25, 2005, 319 woorden, Kastanjeziekte velt bomen in Valkenberg ... ook de agressieve kastanjeziekte de stad bereikt. ... ... bekend is over de kastanjeziekte heeft de gemeente ... ... de uiterst agressieve kastanjeziekte. Tot nu toe ... ... uiteindelijk aan de kastanjeziekte bezwijken. Vervolg op ... ... bekend over de kastanjeziekte, ook wel bloedingsziekte genoemd. Aantasting is te ... Kastanjeziekte velt bomen in ... 54. Het Nieuwsblad, August 23, 2005, MAGAZINE; Pg. 30, 142 woorden, Zieke bomen ... over de geheimzinnige kastanjeziekte. Onderzoekers van de ... 55. Rijn en Gouwe, August 22, 2005, Midden-Holland; Pg. 3, 155 woorden, Foto's gevraagd voor onderzoek naar ziekte, ANP, WAGENINGEN ... naar de zogeheten bloedingsziekte op de foto ... ... bomen doodgaan. De bloedingsziekte is te herkennen aan ... 56. Rijn en Gouwe, August 22, 2005, Midden-Holland; Pg. 3, 385 woorden, 'Zonder bomen? Dat kan gewoon niet' De kastanjeziekte grijpt in Alphen ... ... voetballen. ‘Van de kastanjeziekte hebben ze nog ... 57. Algemeen Dagblad, August 22, 2005, Cultuur & Media; Pg. 13, 94 woorden, Actie voor kastanjebomen ; MEDIA ... door de zogenaamde bloedingsziekte. In veel plaatsen is ... 58. Amersfoortse Courant, August 22, 2005, BIN2 (binnenland), 238 woorden, Korte berichten: Van Agt leidt delegatie Israel ]Utrecht OE Een delegatie van Europese oudpolitici... ... naar de zogeheten bloedingsziekte op de foto ... 57

59. Apeldoornse Courant, August 22, 2005, GO1ECO, 608 woorden, PAALBERICHT: Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk kastanjebomen moeten voor... Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk ... ... naar de zogeheten bloedingsziekte op de foto ... ... heeft aangetast. De bloedingsziekte is te herkennen aan ... PAALBERICHT: Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk ... 60. Dagblad Tubantia/Twentsche Courant, August 22, 2005, BB3 (binnen- en buitenland), 278 woorden, Korte berichten: Zieke paardenkastanjes met fotoactie in beeld Stockcarracer tijdens wedstrijd verongelukt Discovery na oponthoud eindelijk 'thuis' Vlaams-nationalisten voor splitsing Belgie Ruim 130.000 bezoekers bij Pukkelpop ... naar de zogeheten bloedingsziekte op de foto ... 61. Dagblad Flevoland, August 22, 2005, GO1ECO, 608 woorden, PAALBERICHT: Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk kastanjebomen moeten voor... Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk ... ... naar de zogeheten bloedingsziekte op de foto ... ... heeft aangetast. De bloedingsziekte is te herkennen aan ... PAALBERICHT: Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk ... 62. De Gelderlander, August 22, 2005, GOPAG1 (Voorpagina), 105 woorden, Vraag naar foto's kastanjebomen ... over de zogeheten bloedingsziekte die inmiddels de ... ... gezonde kastanjes. De bloedingsziekte is te herkennen aan ... 63. Deventer Dagblad, August 22, 2005, GO1ECO, 608 woorden, PAALBERICHT: Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk kastanjebomen moeten voor... Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk ... ... naar de zogeheten bloedingsziekte op de foto ... ... heeft aangetast. De bloedingsziekte is te herkennen aan ... PAALBERICHT: Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk ... 64. Eindhovens Dagblad, August 22, 2005, 720 woorden, Korte berichten binnenland ... naar de zogeheten bloedingsziekte op de foto ... ... heeft aangetast. De bloedingsziekte is te herkennen aan ... 65. Gelders Dagblad, August 22, 2005, GO1ECO, 608 woorden, PAALBERICHT: Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk kastanjebomen moeten voor... Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk ... ... naar de zogeheten bloedingsziekte op de foto ... ... heeft aangetast. De bloedingsziekte is te herkennen aan ... PAALBERICHT: Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk ... 66. Nieuw Kamper Dagblad, August 22, 2005, GO1ECO, 608 woorden, PAALBERICHT: Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk kastanjebomen moeten voor... Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk ... ... naar de zogeheten bloedingsziekte op de foto ... ... heeft aangetast. De bloedingsziekte is te herkennen aan ... PAALBERICHT: Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk ... 58

67. Utrechts Nieuwsblad, August 22, 2005, BIN2 (binnenland), 238 woorden, Korte berichten: Van Agt leidt delegatie Israel ]Utrecht OE Een delegatie van Europese oudpolitici... ... naar de zogeheten bloedingsziekte op de foto ... 68. Veluws Dagblad, August 22, 2005, GO1ECO, 608 woorden, PAALBERICHT: Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk kastanjebomen moeten voor... Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk ... ... naar de zogeheten bloedingsziekte op de foto ... ... heeft aangetast. De bloedingsziekte is te herkennen aan ... PAALBERICHT: Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk ... 69. Zwolse Courant, August 22, 2005, GO1ECO, 608 woorden, PAALBERICHT: Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk kastanjebomen moeten voor... Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk ... ... naar de zogeheten bloedingsziekte op de foto ... ... heeft aangetast. De bloedingsziekte is te herkennen aan ... PAALBERICHT: Geheimzinnige kastanjeziekte WAGENINGEN - -Zoveel mogelijk ... 70. Algemeen Nederlands Persbureau ANP, August 21, 2005, BINNENLAND, 163 woorden, Foto's moeten kastanjeziekte in beeld brengen, De Ruyter, WAGENINGEN (ANP) ... naar de zogeheten bloedingsziekte op de foto ... ... bomen doodgaan. De bloedingsziekte is te herkennen aan ... 71. Rijn en Gouwe, August 20, 2005, Voorpagina; Pg. 1, 109 woorden, Kastanjeziekte 'grote ramp', ALPHEN De mysterieuze kastanjeziekte, die in heel ... ... oorzaak van de kastanjeziekte wordt nog steeds ... 72. Rijn en Gouwe, August 20, 2005, Alphen; Pg. 3, 364 woorden, Driekwart alle kastanjes ziek ; 'Groenbeheerders barsten soms in tranen uit', ALPHEN ... Vandaar de naam 'bloedingsziekte'. Het verloop: De ... ... onderzoek naar de kastanjeziekte, dat wordt verricht door de werkgroep Aesculaap. Daarin zijn tal ... ... contact gelegd met Aesculaap. Een woordvoerster van ... ... de woordvoerster van Aesculaap. Zij wil wachten ... 73. BN/DeStem, August 20, 2005, 297 woorden, 'Kastanjes Nieuw-Vossemeer niet ziek' ... dat de werkgroep Aesculaap van de Universiteit ... ... het advies van Aesculaap om zieke bomen ... 74. BN/DeStem, August 17, 2005, 479 woorden, Ziekte velt Zeeuwse kastanjes; Vooral op Noord-Beveland ... gekapt vanwege de bloedingsziekte. Dat is gebeurd bij ... ... oorzaak van de bloedingsziekte gezocht. Minister Veerman ... 75. Rotterdams Dagblad, August 16, 2005, Voorne-Putten; Pg. 333, 306 woorden, Kastanjebomen op de paardenmarkt geveld ; Mysterieuze ziekte bedreigt dorpsgezicht Heenvliet ... in de gaten. ‘Bloedingsziekte Maar ook dat ... ... symptomen lijken op bloedingsziekte bij beukensoorten en ... 59

76. Dagblad Tubantia/Twentsche Courant, August 16, 2005, BB1 (binnen- en buitenland), 606 woorden, Korte berichten Kastanjeziekte grijpt om zich ... 77. Provinciale Zeeuwse Courant, August 16, 2005, 11, 541 woorden, Mysterieuze bloedingsziekte rukt op ... gekapt vanwege de bloedingsziekte. Dat is gebeurd bij ... ... oorzaak van de bloedingsziekte gezocht. Minister Veerman ... Mysterieuze bloedingsziekte rukt op 78. Haagsche Courant, August 11, 2005, HST3 (katern Den Haag), 734 woorden, BRIEVEN ... aangetast door de kastanjeziekte, waar blijkbaar nog ... 79. Haagsche Courant, July 30, 2005, ZST1 (katern Zoetermeer), 590 woorden, Iepenziekte blijft slachtoffers maken ... bomen. De zogenaamde bloedingsziekte zorgt voor talloze ... 80. Dagblad Tubantia/Twentsche Courant, July 29, 2005, NY2 (Nyverdal), 159 woorden, Honderd gevallen van kastanjeziekte ... aangetast door de kastanjeziekte. Die ziekte is besmettelijk ... Honderd gevallen van kastanjeziekte 81. Nieuw Kamper Dagblad, July 27, 2005, KP1REG, 674 woorden, Met pijn in hart toezien hoe kastanje loodje legt ... door de zogeheten bloedingsziekte: 66 licht, 40 ... ... door de werkgroep Aesculaap, dat met Wageningen ... 82. Zwolse Courant, July 27, 2005, NW1REG, 274 woorden, Kastanjes sluipend gedood Honderden bomen in regio ... informatie via: www.kastanjeziekte.wur.nl © Wegener. ... 83. Zwolse Courant, July 27, 2005, VD2REG, 324 woorden, Kastanjes sluipend gedood Nog weinig gevallen in regio ... met deze nieuwe bloedingsziekte en die zal ... 84. de Volkskrant, July 26, 2005, Binnenland; Pg. 02, 88 woorden, Volkskrant.nl ... over de mysterieuze bloedingsziekte op: > volkskrant. nl/ ... 85. Boerderij, July 26, 2005, Boerenleven: Te hooi & te gras; N.43 van 2005, J.90; P.47, 65 woorden, KASTANJEZIEKTE KOMT NIET DOOR FYTOFTORA, Red. De kastanjeziekte wordt waarschijnlijk veroorzaakt ... ... de speciale kastanjewerkgroep Aesculaap. Speculaties dat de ... 86. BN/DeStem, July 25, 2005, 273 woorden, Breda houdt zieke bomen in de gaten ... aan de dodelijke bloedingsziekte, die ook in ... ... in Breda de bloedingsziekte onder paardekastanjes ontdekt. ... ... ziekte de werkgroep Aesculaap opgericht, Breda is een ... 87. Nieuw Kamper Dagblad, July 25, 2005, KP1REG, 543 woorden, PAALBERICHT: Paardekastanjes allemaal aangetast KAMPEN - Praktisch alle paardekastanjebomen in... ... door de zogeheten bloedingsziekte. Dit blijkt uit ... ... Zie ook: www.kastanjeziekte.wur.nl Vals ... 88. de Volkskrant, July 23, 2005, Kennis; Pg. B05, 1553 woorden, Zoveel bomen naar de knoppen ; Deskundigen vrezen dat de talloze zieke paardekastanjes de voorbode zijn van 60

iets veel dramatischers, DOOR MARIEKE AARDEN ... ook wel de bloedingsziekte genoemd. In de ... ... oorzaak van de bloedingsziekte. Van Kuik en ... ... bomen. Maar de kastanjeziekte duikt op zoveel ... ... hebben de werkgroep Aesculaap opgericht, die van ... ... werkgroep is dat de kastanjeziekte het topje van ... ... eik ook aan bloedingsziekte te lijden als ... ... oorzaak van de kastanjeziekte. Dat de onderzoekers ... 89. De Gelderlander, July 23, 2005, MWREG2 (regiopagina Maas en Waal), 384 woorden, PAALBERICHT: Ziekte tast kastanjebomen in Buren en Tiel aan ... verslaggever TIEL De kastanjeziekte rukt op in ... 90. Deventer Dagblad, July 23, 2005, DD3REG, 297 woorden, Kastanjes ten onder aan ziekte ... aangetast door de kastanjeziekte. De ziekte is besmettelijk ... ... de landelijke werkgroep Aesculaap, speciaal samengesteld om ... 91. Deventer Dagblad, July 23, 2005, DD3REG, 158 woorden, Inventarisatie bomenziekte in hele land ... omvang van de kastanjeziekte in Nederland, heeft de Werkgroep Aesculaap alle 467 Nederlandse ... ... nationaal probleem, aldus Aesculaap. Meer informatie is te vinden op www.kastanjeziekte.wur.nl. Op ... 92. De Dordtenaar, July 22, 2005, ZHZ; Pg. 3, 188 woorden, Reddingsactie voor zieke kastanjebomen ... van de mysterieuze bloedingsziekte. 93. Rotterdams Dagblad, July 22, 2005, Voorne-Putten; Pg. 333, 124 woorden, Ook Bernisser kastanjes ziek ... Hellevoetsluis is de onbekende kastanjeziekte nu ook in ... 94. Dagblad Flevoland, July 22, 2005, FL1REG, 335 woorden, Ziekte tast kastanjes ernstig aan EMMELOORD/URK - De kastanjeziekte - 'bloedingsziekte' - heeft snoeihard toegeslagen ... 'Bloedingsziekte' slaat toe door ... ... zijn'. Dat de bloedingsziekte fors heeft toegeslagen, is ... ... leiden aan de bloedingsziekte. Burgers kloppen regelmatig ... ... kastanjes die de bloedingsziekte hebben overleefd. Pas ... ... de wortel. De bloedingsziekte begint met roestbruine ... 95. Dagblad Flevoland, July 22, 2005, FL1REG, 168 woorden, In de wachtkamer ... vlakte. Sinds de 'bloedingsziekte' - de kastanjeziekte - in 2002 de ... ... aardappels. Op /www.kastanjeziekte.wur.nl doet ' ... 96. De Gelderlander, July 22, 2005, TIREG1 (regiopagina Tiel ), 368 woorden, Ziekte tast kastanjebomen aan TIEL De kastanjeziekte rukt op in ... 97. De Gelderlander, July 22, 2005, TIREG1 (regiopagina Tiel ), 62 woorden, Kastanjeziekte: mysterieuze bloedingen 61

De kastanjeziekte is een mysterieuze 'bloedingsziekte'. Herkenbaar aan bruine ... Kastanjeziekte: mysterieuze bloedingen 8. De Gelderlander, July 22, 2005, GOPAG1 (Voorpagina), 126 woorden, REGIOLUIK: RIVIERENLAND Zieke kastanjebomen op stadswal Buren moeten worden gekapt ... besmet door de kastanjeziekte. ... te komen. De bloedingsziekte, zo genoemd omdat ... ... aangetast. De werkgroep Aesculaap van de universiteit ... 99. Nieuw Kamper Dagblad, July 22, 2005, KP3REG, 689 woorden, Dood hoort bij levend organisme als boom ... aard van de kastanjeziekte. Hoe de ziekte ... 100. Zwolse Courant, July 22, 2005, KP3REG, 689 woorden, Dood hoort bij levend organisme als boom ... aard van de kastanjeziekte. Hoe de ziekte ... 101. Utrechts Nieuwsblad, July 21, 2005, UR3, 299 woorden, Ziekte tast kastanjes massaal aan ... al langer bekende kastanjeziekte, uit Frankrijk. ‘Die ... 102. Zwolse Courant, July 21, 2005, ZW1REG, 690 woorden, Dood hoort bij levend organisme als boom ... aard van de kastanjeziekte. Hoe de ziekte ... 103. Rotterdams Dagblad, July 20, 2005, Drechtsteden; Pg. 361, 196 woorden, Extra voeding voor Dordtse kastanjebomen ... een nog onbekende bloedingsziekte. Het gaat om ... ... oorzaak van de bloedingsziekte is niet bekend. De ... 104. Utrechts Nieuwsblad, July 20, 2005, UG3 (stadspagina), 164 woorden, Korte berichten: Kastanjes ernstig ziek ]Montfoort - De twee monumentale kastanjebomen op het Kasteelplein... ... aangetast door de bloedingsziekte. De gemeente wil ... ... bij de werkgroep Aesculaap. 105. Zwolse Courant, July 20, 2005, ZW1REG, 331 woorden, Honderden kastanjes stervende ... symptomen van de kastanjeziekte vertoonden. Medewerkers van ... ... de landelijke werkgroep, Aesculaap, die vanuit Wageningen ... 106. Zwolse Courant, July 20, 2005, GOVPAG, 421 woorden, PAALBERICHT: Kaalslag onder Zwolse kastanjes ZWOLLE - Zeker 250 kastanjebomen in Zwolle zijn ten... ... kaalslag door de kastanjeziekte werkelijkheid te worden. ... 107. De Gelderlander, July 13, 2005, VOREG2 (regiopagina Veluwezoom-oost), 275 woorden, Gemeente laat zieke kastanjes in Ellecom voorlopig met rust ... afsterven. De werkgroep Aesculaap doet er nu ... ... onderzoek toegezegd. De kastanjeziekte is te herkennen aan ... 108. Amersfoortse Courant, July 12, 2005, VPUN (voorpagina), 292 woorden, Korte berichten: Lachende Duitsers Berlijn - Duitsers willen meer lachen. Uit onderzoek blijkt dat... ... Woerden - De mysterieuze kastanjeziekte heeft zich wellicht ...

62

109. De Gelderlander, July 12, 2005, MLREG1 (regiopagina Maasland), 215 woorden, Agressieve zwammen tasten laan aan ... door de mysterieuze kastanjeziekte, maar ook door ... ... zijn door de kastanjeziekte. Deze bomen kunnen ... 110. Utrechts Nieuwsblad, July 12, 2005, UG3 (stadspagina), 260 woorden, Twijfel over staat kastanjes rondom exercitieterrein ... Bevaart De mysterieuze kastanjeziekte lijkt zich te ... ... om de beruchte kastanjeziekte gaat, durft Jan ... ... aangetast door de bloedingsziekte. ‘De boom druipt ... ... 2002 werd de kastanjeziekte voor het eerst ... 111. Utrechts Nieuwsblad, July 12, 2005, VPUN (voorpagina), 292 woorden, Korte berichten: Lachende Duitsers Berlijn - Duitsers willen meer lachen. Uit onderzoek blijkt dat... ... Woerden - De mysterieuze kastanjeziekte heeft zich wellicht ... 112. Dagblad van het Noorden , July 6, 2005, D-Zuidoost , 168 woorden, Veel bomen aangetast door kastanjeziekte ... aangetast door de kastanjeziekte. Een inventarisatie binnen ... ... ruchtbaarheid aan de kastanjeziekte gegeven, om niet ... ... weten dat de kastanjeziekte zich heeft geopenbaard, ... ... te bellen. De kastanjeziekte verspreidt zich momenteel ... 113. Dagblad van het Noorden , July 6, 2005, D-Noord ; D-Midden , 178 woorden, Bomen al aangetast door kastanjeziekte ... aangetast door de kastanjeziekte. Een inventarisatie binnen ... ... ruchtbaarheid aan de kastanjeziekte gegeven, om niet ... ... weten dat de kastanjeziekte zich heeft geopenbaard, ... ... te bellen. De kastanjeziekte verspreidt zich momenteel ... 114. Dagblad van het Noorden , July 6, 2005, D-Zuidwest , 353 woorden, Tientallen bomen slachtoffer kastanjeziekte , Door Harald Buit ... aangetast door de kastanjeziekte. Een inventarisatie binnen ... ... aangetast door de kastanjeziekte. ‘De vier gemeenten ... ... ruchtbaarheid aan de kastanjeziekte gegeven, om niet ... ... weten dat de kastanjeziekte zich heeft geopenbaard, ... ... te bellen. De kastanjeziekte verspreidt zich momenteel ... ... oorzaak van de kastanjeziekte is nog steeds niet bekend. De werkgroep Aesculaap werkt aan een ... ... dat de mysterieuze bloedingsziekte bij paardenkastanjes een landelijk probleem werd. Aesculaap onderhoudt ook contacten ... 115. Utrechts Nieuwsblad, July 6, 2005, UZ3 (stadspagina), 295 woorden, Iepziekte heerst weer in Houten ... om een soort bloedingsziekte waarbij er bruine ... 116. BN/DeStem, July 2, 2005, 248 woorden, Ziekte bedreigt kastanjes in Breda; Geen medicijn voorhanden ... bomen. De zogeheten bloedingsziekte komt sinds 2002 ... ... Wageningen de werkgroep Aesculaap opgericht. Breda is een ... ... werkgroep deelnemen. Oorzaak Aesculaap heeft de oorzaak ... ... wethouders over de kastanjeziekte.

63

117. Brabants Dagblad, July 2, 2005, 718 woorden, Regioreportage: Ziekte paardenkastanjes grijpt om zich heen ... zoveel mysteries omgeven bloedingsziekte bij de paardenkastanje ... ... ook wel de bloedingsziekte wordt genoemd, lijkt ... ... indruk is dat de bloedingsziekte agressief om zich ... ... De speciale werkgroep Aesculaap, waarin ook gemeenten ... 118. Veluws Dagblad, June 30, 2005, VL1REG, 167 woorden, Alle kastanjebomen op kerkplein Hattem zijn ziek ... aangetast door de kastanjeziekte. ... van velling. De kastanjeziekte bedreigt alle kastanjes ... ... met de naam Aesculaap speurt naarstig naar ... 119. De Gelderlander, June 21, 2005, MWREG2 (regiopagina Maas en Waal), 382 woorden, Ruim een kwart van paardenkastanjes in Oss is nu ziek ... heeft de mysterieuze bloedingsziekte bij paardenkastanjebomen hard ... ... aangetast door de bloedingsziekte. Zij kunnen als ... 120. De Gelderlander, June 20, 2005, MLREG2 (regiopagina Maasland), 277 woorden, PAALBERICHT: VENLO Eindhoven grootste winkelconcurrent ... heeft de mysterieuze bloedingsziekte bij paardenkastanjebomen toegeslagen. ... 121. Rijn en Gouwe, June 18, 2005, Gouda; Pg. 5, 206 woorden, Oudewater vreest voor boomziekten, OUDEWATER ... beruchte iepenziekte en bloedingsziekte bij kastanjebomen moeten ... 122. Rijn en Gouwe, June 18, 2005, Woerden; Pg. 5, 206 woorden, Vrees voor boomziekten, OUDEWATER ... beruchte iepenziekte en bloedingsziekte bij kastanjebomen moeten ... 123. Amersfoortse Courant, June 18, 2005, AS1 (stadspagina), 294 woorden, Amersfoort kapt zieke kastanjes niet ... door de mysterieuze kastanjeziekte die momenteel door ... 124. Utrechts Nieuwsblad, June 18, 2005, AS1 (stadspagina), 294 woorden, Amersfoort kapt zieke kastanjes niet ... door de mysterieuze kastanjeziekte die momenteel door ... 125. Brabants Dagblad, June 17, 2005, Regio, 480 woorden, Veel kastanjebomen Oss ziek ... heeft de mysterieuze bloedingsziekte bij paardenkastanjebomen toegeslagen. ... ... aangetast door de bloedingsziekte. Zij kunnen als ... ... naar de werkgroep Aesculaap, die onderzoek doet naar de bloedingsziekte.-------------------------DE FEITEN: Kastanjeziekte: In de loop ... ... paardenkastanje (Aesculus). De 'bloedingsziekte' is herkenbaar aan bruine ... ... Phytophthoraschimmel. De werkgroep Aesculaap is speciaal samengesteld om ... ... meer informatie:www.kastanjeziekte.wur.nl www. ... 126. Deventer Dagblad, June 17, 2005, DD1REG, 468 woorden, Mysterieuze ziekte fataal voor paardekastanjes ... eerst aan de kastanjeziekte. Die heeft zich ... ... grone uitzien. De kastanjeziekte wordt veroorzaakt door ... ... er over de kastanjeziekte bekend is, zo weinig is ...

64

127. Haagsche Courant, June 17, 2005, HST4 (katern Den Haag), 744 woorden, DEN HAAG - Het vriendelijkste beestje gaat moorden ... nog altijd mysterieuze kastanjeziekte, of de wel gekende ... 128. Rotterdams Dagblad, June 14, 2005, Waterweg; Pg. 321, 91 woorden, Kastanjeziekte ook in Maasland De mysterieuze kastanjeziekte woekert voort. Doken ... 129. Amersfoortse Courant, June 8, 2005, VPUN (voorpagina), 443 woorden, Korte berichten: Bancroft overleden Los Angeles - De Amerikaanse actrice Anne Bancroft (73) is aan... ... Zeist - De mysterieuze kastanjeziekte heeft ook paardekastanjes ... 130. Haagsche Courant, June 8, 2005, DST1 (katernDelft), 324 woorden, Mysterieuze boomziekte breidt zich uit MAASLAND - De mysterieuze kastanjeziekte woekert ook in ... 131. Haagsche Courant, June 8, 2005, WST1 (katern Westland), 307 woorden, WESTLAND - Kastanjeziekte woekert ook in streek MAASLAND - De mysterieuze kastanjeziekte woekert voort. Doken ... WESTLAND - Kastanjeziekte woekert ook in ... 132. Utrechts Nieuwsblad, June 8, 2005, UO3 (stadspagina), 328 woorden, Kastanjes in Zeist nu ook al aangetast ... Dankbaar De mysterieuze kastanjeziekte heeft nu ook ... ... verschijnsel dat deskundigen 'bloedingsziekte' noemen. Dat geld ... ... naar de werkgroep Aesculaap die het onderzoek ... 133. Utrechts Nieuwsblad, June 8, 2005, UO3 (stadspagina), 156 woorden, De kastanjeziekte is een moderne ziekte. De ziekte is bij bomendeskundigen wereldwijd... De kastanjeziekte is een moderne ziekte. ... ... in de werkgroep, Aesculaap werken nauw samen ... De kastanjeziekte is een moderne ziekte. ... 134. Utrechts Nieuwsblad, June 8, 2005, VPUN (voorpagina), 443 woorden, Korte berichten: Bancroft overleden Los Angeles - De Amerikaanse actrice Anne Bancroft (73) is aan... ... Zeist - De mysterieuze kastanjeziekte heeft ook paardekastanjes ... 135. Amersfoortse Courant, June 2, 2005, UO3 (stadspagina), 487 woorden, Hoogbejaarde liefde van Liesbeth van Broekhoven is doodziek ... aan de mysterieuze kastanjeziekte. Wetenschappers moeten het ... ... vraag waardoor de kastanjeziekte wordt veroorzaakt. ‘Natuurlijk ... 136. Utrechts Nieuwsblad, June 2, 2005, UO3 (stadspagina), 487 woorden, Hoogbejaarde liefde van Liesbeth van Broekhoven is doodziek ... aan de mysterieuze kastanjeziekte. Wetenschappers moeten het ... ... vraag waardoor de kastanjeziekte wordt veroorzaakt. ‘Natuurlijk ... 137. Utrechts Nieuwsblad, June 2, 2005, UO3 (stadspagina), 487 woorden, Hoogbejaarde liefde van Liesbeth van Broekhoven is doodziek ... aan de mysterieuze kastanjeziekte. Wetenschappers moeten het ... ... vraag waardoor de kastanjeziekte wordt veroorzaakt. ‘Natuurlijk ...

65

138. Rotterdams Dagblad, May 31, 2005, Waterweg; Pg. 323, 346 woorden, Mysterieuze ziekte treft honderden kastanjes ... Landelijk is de werkgroep Aesculaap opgericht die de ... 139. Apeldoornse Courant, May 31, 2005, GOVPAG, 576 woorden, PAALBERICHT: Motorrijders razen over de Zomerdijk WANNEPERVEEN - Op de Zomerdijk in Wanneperveen... ... aangetast door de kastanjeziekte. Dat blijkt uit ... 140. Dagblad Flevoland, May 31, 2005, GOVPAG, 576 woorden, PAALBERICHT: Motorrijders razen over de Zomerdijk WANNEPERVEEN - Op de Zomerdijk in Wanneperveen... ... aangetast door de kastanjeziekte. Dat blijkt uit ... 141. Deventer Dagblad, May 31, 2005, GOVPAG, 576 woorden, PAALBERICHT: Motorrijders razen over de Zomerdijk WANNEPERVEEN - Op de Zomerdijk in Wanneperveen... ... aangetast door de kastanjeziekte. Dat blijkt uit ... 142. Gelders Dagblad, May 31, 2005, GOVPAG, 576 woorden, PAALBERICHT: Motorrijders razen over de Zomerdijk WANNEPERVEEN - Op de Zomerdijk in Wanneperveen... ... aangetast door de kastanjeziekte. Dat blijkt uit ... 143. Nieuw Kamper Dagblad, May 31, 2005, KP1REG, 209 woorden, Kastanjeziekte catastrofaal - Helft van kastanjes aangetast KAMPEN/IJSSELMUIDEN - De kastanjeziekte neemt in Kampen ... Kastanjeziekte catastrofaal - Helft van ... 144. Nieuw Kamper Dagblad, May 31, 2005, KP1REG, 40 woorden, De Kastanjelaan in Bovenbroek: alle 63 kastanjes zijn aangetast door de kastanjeziekte.... ... aangetast door de kastanjeziekte. Of dat betekent dat ... ... aangetast door de kastanjeziekte..... 145. Nieuw Kamper Dagblad, May 31, 2005, GOVPAG, 576 woorden, PAALBERICHT: Motorrijders razen over de Zomerdijk WANNEPERVEEN - Op de Zomerdijk in Wanneperveen... ... aangetast door de kastanjeziekte. Dat blijkt uit ... 146. Veluws Dagblad, May 31, 2005, GOVPAG, 576 woorden, PAALBERICHT: Motorrijders razen over de Zomerdijk WANNEPERVEEN - Op de Zomerdijk in Wanneperveen... ... aangetast door de kastanjeziekte. Dat blijkt uit ... 147. Zwolse Courant, May 31, 2005, GOVPAG, 576 woorden, PAALBERICHT: Motorrijders razen over de Zomerdijk WANNEPERVEEN - Op de Zomerdijk in Wanneperveen... ... aangetast door de kastanjeziekte. Dat blijkt uit ... 148. Gelders Dagblad, May 25, 2005, LB4REG, 374 woorden, Ziekten en mensen nekken bomen ... onderzoek naar de kastanjeziekte. De onderzoekers weten ... 149. Gelders Dagblad, May 25, 2005, LB4REG, 374 woorden, Ziekten en mensen nekken bomen ... onderzoek naar de kastanjeziekte. De onderzoekers weten ...

66

150. De Gelderlander, May 21, 2005, LIREG4 (regiopagina Liemers), 107 woorden, PAALBERICHT: BOOMZIEKTE Arnhem plant geen kastanjes meer ... onbekend. De werkgroep Aesculaap van de gemeente ... 151. De Gelderlander, May 21, 2005, LIREG4 (regiopagina Liemers), 106 woorden, PAALBERICHT: BOOMZIEKTE Arnhem plant geen kastanjes meer ... onbekend. De werkgroep Aesculaap van de gemeente ... 52. Trouw, May 17, 2005, Nederland; Pg. 4, 563 woorden, Paardenkastanjes sterven aan mysterieuze ziekte ; Reportage, DOOR MAAIKE BEZEMER ... het onderzoek coordineert -Aesculaap, naar de Latijnse ... ... hand is. ‘Vooralsnog adviseert Aesculaap niets aan zieke ... 153. Haagsche Courant, May 14, 2005, HST1 (katern Den Haag), 635 woorden, Kastanjes in bloei: nieuw begin of stuiptrekking? ... stoten. Maar www.kastanjeziekte.wur.nl inventariseert ... 154. Veluws Dagblad, May 14, 2005, NW1RSP, 599 woorden, Invloed van mens en schimmel nog altijd groter dan van klimaat - Ziektes of wortelschade nekken bomen ... onderzoek naar de kastanjeziekte die afgelopen drie ... 155. Zwolse Courant, May 14, 2005, NW1RSP, 599 woorden, Invloed van mens en schimmel nog altijd groter dan van klimaat - Ziektes of wortelschade nekken bomen ... onderzoek naar de kastanjeziekte die afgelopen drie ... 156. Apeldoornse Courant, May 12, 2005, AP4REG (regio), 598 woorden, Ziektes of stukgegraven wortels nekken bomen ... onderzoek naar de kastanjeziekte die afgelopen drie ... 157. Deventer Dagblad, May 12, 2005, DD4REG (regio), 379 woorden, Ziekten en mensen nekken bomen ... onderzoek naar de kastanjeziekte. De onderzoekers weten ... 158. Nieuw Kamper Dagblad, May 12, 2005, KP2REG (regio), 597 woorden, Invloed van mens en schimmel nog altijd groter dan van klimaat - Ziektes of wortelschade nekken bomen ... onderzoek naar de kastanjeziekte die afgelopen drie ... 159. Nieuw Kamper Dagblad, May 11, 2005, KP2REG (regio), 476 woorden, Kastanjeziekte op Kampereiland geconstateerd ... die af. De kastanjeziekte werd drie jaar ... Kastanjeziekte op Kampereiland geconstateerd; 160. Veluws Dagblad, May 11, 2005, VL1REG (regio), 458 woorden, - (korte berichten) ... naar hen in. Kastanjeziekte nu ook in ... 161. Zwolse Courant, May 11, 2005, ZW1REG (regio), 491 woorden, - (korte berichten) ... proces verbaal opgemaakt. Kastanjeziekte nu ook in ... 162. Nieuw Kamper Dagblad, May 6, 2005, GOVPAG (voorpagina), 158 woorden, Kastanjeziekte in Zwolle is 'ramp', zegt wethouder Pot Kastanjeziekte in Zwolle is 'ramp', ... 163. Veluws Dagblad, May 6, 2005, VL3REG (regio), 159 woorden, Zwolse wethouder noemt kastanjeziekte een ramp Zwolse wethouder noemt kastanjeziekte een ramp; 67

164. Zwolse Courant, May 6, 2005, GOVPAG (voorpagina), 158 woorden, Kastanjeziekte in Zwolle is 'ramp', zegt wethouder Pot Kastanjeziekte in Zwolle is 'ramp', ... 165. Brabants Dagblad, April 30, 2005, Regio, 100 woorden, Den Bosch in actie tegen bedreiging paardenkastanjes ... bedreiging, de nieuwe Bloedingsziekte, kan nog niet ... 166. Brabants Dagblad, April 30, 2005, Regio, 100 woorden, Den Bosch in actie tegen bedreiging paardenkastanjes ... bedreiging, de nieuwe Bloedingsziekte, kan nog niet ... 167. Haagsche Courant, April 27, 2005, HST3 (katern Den Haag), 327 woorden, RIJSWIJK - Gekapte boom 'betaalt' de vervanging ... de paardekastanje tegen kastanjeziekte, ontvouwde de wethouder ... 168. Nieuw Kamper Dagblad, April 27, 2005, KP3REG (regio), 270 woorden, Besmette boom moet je met rust laten ... hoe de nieuwe kastanjeziekte zich precies manifesteert ... 169. Zwolse Courant, April 27, 2005, ZW2REG (regio), 270 woorden, Besmette boom moet je met rust laten ... hoe de nieuwe kastanjeziekte zich precies manifesteert ... 170. Amersfoortse Courant, April 26, 2005, US4 (stadspagina), 512 woorden, Kastanjeziekte houdt stevig huis in Utrecht ... door de mysterieuze kastanjeziekte die al een ... ... onderzoek naar de kastanjeziekte. Besmette bomen zijn ... ... duidelijk is hoe de kastanjeziekte zich verspreidt, worden ... Kastanjeziekte houdt stevig huis ... 171. Amersfoortse Courant, April 26, 2005, US4 (stadspagina), 108 woorden, Utrecht werkt net als Haarlemmermeer, Den Haag en Houten mee aan een onderzoek naar de kastanjeziekte door de Rijksuniversiteit Wageningen. ... onderzoek naar de kastanjeziekte door de Rijksuniversiteit ... ... buitenland wordt de kastanjeziekte toegeschreven aan de ... 172. Utrechts Nieuwsblad, April 26, 2005, US4 (stadspagina), 512 woorden, Kastanjeziekte houdt stevig huis in Utrecht ... door de mysterieuze kastanjeziekte die al een ... ... onderzoek naar de kastanjeziekte. Besmette bomen zijn ... ... duidelijk is hoe de kastanjeziekte zich verspreidt, worden ... Kastanjeziekte houdt stevig huis ... 173. Utrechts Nieuwsblad, April 26, 2005, US4 (stadspagina), 108 woorden, Utrecht werkt net als Haarlemmermeer, Den Haag en Houten mee aan een onderzoek naar de kastanjeziekte door de Rijksuniversiteit Wageningen. ... onderzoek naar de kastanjeziekte door de Rijksuniversiteit ... ... buitenland wordt de kastanjeziekte toegeschreven aan de ... 174. Boerderij, April 26, 2005, Boerenleven: Te hooi & te gras, 49 woorden, ONDERZOEK KASTANJES ... nu toe onbekende 'kastanjeziekte'. Drie jaar geleden ...

68

175. NRC Handelsblad, April 25, 2005, Binnenland; Pg. 3, 60 woorden, Duinbehoud tegen konijnenjacht, (ANP), LEIDEN, 25 APRIL. ... konijn is door een bloedingsziekte een bedreigde soort ... 176. Haagsche Courant, April 19, 2005, WST1 (katern Westland), 506 woorden, Gewonde na frontale botsing met truck - (korte berichten) ... lande doemt de kastanjeziekte op die de ... 177. Haagsche Courant, April 19, 2005, HST1 (katern Den Haag), 496 woorden, Drugsdealer gepakt dankzij camera's - (korte berichten) ... van de geheimzinnige kastanjeziekte zal hoogstwaarschijnlijk pas ... 178. Rotterdams Dagblad, April 16, 2005, Waterweg; Pg. 323, 393 woorden, Het mysterie van de tranende bomen ; Alle Schiedamse kastanjes deze maand onder de loep, FRANK WILLEMSE ... Het mysterie wordt bloedingsziekte genoemd. Waar de ... ... van de mysterieuze 'bloedingsziekte' die slachtoffers maakt ... ... op de onbekende bloedingsziekte, die wetenschappers voor ... 179. Apeldoornse Courant, April 16, 2005, AP1REG (regio), 247 woorden, Mineermot kan schuldige zijn - Kapregels voor zieke kastanjes ... tasten over de kastanjeziekte, is de focus volgens ... ... het blad. Werkgroep Aesculaap van Universiteit Wageningen ... ... steeds mysterieuze verwoestende kastanjeziekte. © Wegener.NV2005 180. Apeldoornse Courant, April 16, 2005, AP1REG (regio), 174 woorden, Adviezen voor particulieren eDe Werkgroep Aesculaap van Universiteit Wageningen ... ... opgesteld rond de kastanjeziekte. OMGAAN MET AANGETAST ... 181. Veluws Dagblad, April 16, 2005, WV1REG (regio), 487 woorden, Puttenaar dwars; tegen politieagenten; PUTTEN - Een 31-jarige inwoner van Putten is donderdag na wat tegenstrubbelingen aangehouden door de politie uit zijn woonplaats. ... het ongeval gewond. Kastanjeziekte kost Harderwijk bomen HARDERWIJK - De kastanjeziekte die zich over ... 182. Apeldoornse Courant, April 11, 2005, GOVPAG (voorpagina), 158 woorden, Zwollenaren gevraagd op zieke kastanjebomen te letten ... de gevreesde nieuwe kastanjeziekte in de stad ... ... speciaal opgerichte werkgroep Aesculaap, gevestigd in Boskoop. ... 183. Dagblad Flevoland, April 11, 2005, GOVPAG (voorpagina), 158 woorden, Zwollenaren moeten op zieke kastanjebomen letten ... de gevreesde nieuwe kastanjeziekte in de stad ... ... speciaal opgerichte werkgroep Aesculaap, gevestigd in Boskoop. ... 184. Deventer Dagblad, April 11, 2005, GOVPAG (voorpagina), 158 woorden, Zwollenaren moeten op zieke kastanjebomen letten ... de gevreesde nieuwe kastanjeziekte in de stad ... ... speciaal opgerichte werkgroep Aesculaap, gevestigd in Boskoop. ... 185. Gelders Dagblad, April 11, 2005, GOVPAG (voorpagina), 158 woorden, Zwollenaren moeten op zieke kastanjebomen letten ... de gevreesde nieuwe kastanjeziekte in de stad ... ... speciaal opgerichte werkgroep Aesculaap, gevestigd in Boskoop. ... 69

186. Nieuw Kamper Dagblad, April 11, 2005, GOVPAG (voorpagina), 158 woorden, Zwollenaren moeten op zieke kastanjebomen letten ... de gevreesde nieuwe kastanjeziekte in de stad ... ... speciaal opgerichte werkgroep Aesculaap, gevestigd in Boskoop. ... 187. Veluws Dagblad, April 11, 2005, GOVPAG (voorpagina), 158 woorden, Zwollenaren moeten op zieke kastanjebomen letten ... de gevreesde nieuwe kastanjeziekte in de stad ... ... speciaal opgerichte werkgroep Aesculaap, gevestigd in Boskoop. ... 188. Zwolse Courant, April 11, 2005, GOVPAG (voorpagina), 158 woorden, Zwollenaren moeten op zieke kastanjebomen letten ... de gevreesde nieuwe kastanjeziekte in de stad ... ... speciaal opgerichte werkgroep Aesculaap, gevestigd in Boskoop. ... 189. Zwolse Courant, April 11, 2005, GOVPAG (voorpagina), 157 woorden, Zwollenaren gevraagd op zieke kastanjebomen te letten ... de gevreesde nieuwe kastanjeziekte in de stad. ... 190. De Gelderlander, April 7, 2005, GOPAG1 (Voorpagina), 135 woorden, REGIOLUIK: MAASLAND Massale kap kastanjebomen dreigt door mysterieuze bloedingsziekte ... doodskleed van de bloedingsziekte: bruine rottende plekken ... ... door de mysterieuze bloedingsziekte maakt geen schijn ... ... dreigt door mysterieuze bloedingsziekte; 191. De Gelderlander, April 7, 2005, MLREG1 (regiopagina Maasland), 622 woorden, Kaalslag dreigt door kastanjeziekte Bloedingsziekte tast landschap aan ... ... doodskleed van de bloedingsziekte: bruine rottende plekken ... ... door de mysterieuze bloedingsziekte maakt geen schijn ... ... door platanen. ‘De kastanjeziekte leidt volgens Brandts ... ... vijf kastanjebomen de bloedingsziekte waarschijnlijk onder de ... ... Sint-Hubert is de kastanjeziekte nog niet vastgesteld. ... ... kastanjes aan de bloedingsziekte bezweken. Volgens een ... Kaalslag dreigt door kastanjeziekte; 192. Haagsche Courant, April 7, 2005, DST1 (katernDelft), 343 woorden, Een op de drie kastanjebomen ziek ... om een soort bloedingsziekte waarbij er bruine ... 193. Rotterdams Dagblad, April 6, 2005, IJssel en Lek; Pg. 312, 115 woorden, Kastanjeziekte heeft Capelle niet bereikt 194. Rotterdams Dagblad, April 5, 2005, Binnenland; Pg. 210, 89 woorden, Massale kap zieke kastanjebomen dreigt, Wageningen ... om een soort bloedingsziekte waarbij er bruine ... 195. Trouw, April 5, 2005, Nederland; Pg. 6, 238 woorden, Rijksgeld voor onderzoek kastanjeziekte ... door de zogenoemde bloedingsziekte. Tot nu toe is ... ... deze inventarisatie. De bloedingsziekte is te herkennen aan ... 196. Algemeen Dagblad, April 5, 2005, Binnenland; Pg. 5, 67 woorden, Geld voor studie naar kastanjeziekte ; DEN HAAG ... naar de mysterieuze 'bloedingsziekte' onder paardenkastanjes. 70

197. Amersfoortse Courant, April 5, 2005, BIN1 (binnenland), 319 woorden, Massale kap zieke kastanjebomen om plaag te stoppen ... om een soort bloedingsziekte waarbij er bruine ... ... kampen met de kastanjeziekte. De eerste meldingen ... 198. Apeldoornse Courant, April 5, 2005, GODRIE (pagina drie), 588 woorden, - (korte berichten) ... borstkankeronderzoek. Groot onderzoek kastanjeziekte DEN HAAG - Het ... ... door de zogenoemde bloedingsziekte. Onbekend is waar de ... 199. BN/DeStem, April 5, 2005, 165 woorden, Mysterieuze ziekte teistert paardenkastanjes ... gaat om een 'bloedingsziekte' waarbij er bruine ... 200. Dagblad Tubantia/Twentsche Courant, April 5, 2005, BB1 (binnen- en buitenland), 327 woorden, Korte berichten ... gaat om een bloedingsziekte waarbij er bruine ... 201. Dagblad Flevoland, April 5, 2005, GODRIE (pagina drie), 588 woorden, - (korte berichten) ... borstkankeronderzoek. Groot onderzoek kastanjeziekte DEN HAAG - Het ... ... door de zogenoemde bloedingsziekte. Onbekend is waar de ... 202. De Gelderlander, April 5, 2005, GOBIN1 (Binnenland), 268 woorden, PAALBERICHT: Massale kap zieke kastanjes dreigt ... om een soort bloedingsziekte waarbij er bruine ... 203. Deventer Dagblad, April 5, 2005, GODRIE (pagina drie), 588 woorden, - (korte berichten) ... borstkankeronderzoek. Groot onderzoek kastanjeziekte DEN HAAG - Het ... ... door de zogenoemde bloedingsziekte. Onbekend is waar de ... 204. Gelders Dagblad, April 5, 2005, GODRIE (pagina drie), 588 woorden, - (korte berichten) ... borstkankeronderzoek. Groot onderzoek kastanjeziekte DEN HAAG - Het ... ... door de zogenoemde bloedingsziekte. Onbekend is waar de ... 205. Goudsche Courant, April 5, 2005, FRNT (voorpagina), 244 woorden, Rijksgeld voor onderzoek naar ziekte kastanjes ... door de zogenoemde bloedingsziekte. Alleen al in ... ... kampen met de kastanjeziekte. Tot nu toe is ... ... van de werkgroep Aesculaap, waarin betrokken gemeenten ... 206. Haagsche Courant, April 5, 2005, FRNT (voorpagina), 244 woorden, Rijksgeld voor onderzoek naar ziekte kastanjes ... door de zogenoemde bloedingsziekte. Alleen al in ... ... kampen met de kastanjeziekte. Tot nu toe is ... ... van de werkgroep Aesculaap, waarin betrokken gemeenten ... 207. Leeuwarder Courant , April 5, 2005, noord ; west ; zuid ; stad , 206 woorden, Rijk steunt onderzoek naar kastanjeziekte ... naar de mysterieuze kastanjeziekte krijgt financiële steun ... ... van deze zogeheten 'bloedingsziekte' is nog steeds onbekend. ... oorzaak van de kastanjeziekte in kaart te ... ... maanden doodgaan. De kastanjeziekte begon in het ... 71

... van de werkgroep Aesculaap, waarin organisaties zitten ... ... Uniek aan de bloedingsziekte is dat hij niet ... 208. Leeuwarder Courant , April 5, 2005, stad , 206 woorden, Rijk steunt onderzoek kastanjeziekte ... naar de mysterieuze kastanjeziekte krijgt financiële steun ... ... van deze zogeheten 'bloedingsziekte' is nog steeds onbekend. ... oorzaak van de kastanjeziekte in kaart te ... ... maanden doodgaan. De kastanjeziekte begon in het ... ... van de werkgroep Aesculaap, waarin organisaties zitten ... ... Uniek aan de bloedingsziekte is dat hij niet ... 209. Utrechts Nieuwsblad, April 5, 2005, BIN1 (binnenland), 319 woorden, Massale kap zieke kastanjebomen om plaag te stoppen ... om een soort bloedingsziekte waarbij er bruine ... ... kampen met de kastanjeziekte. De eerste meldingen ... 210. Veluws Dagblad, April 5, 2005, GODRIE (pagina drie), 588 woorden, - (korte berichten) ... borstkankeronderzoek. Groot onderzoek kastanjeziekte DEN HAAG - Het ... ... door de zogenoemde bloedingsziekte. Onbekend is waar de ... 211. Zwolse Courant, April 5, 2005, GODRIE (pagina drie), 588 woorden, - (korte berichten) ... borstkankeronderzoek. Groot onderzoek kastanjeziekte DEN HAAG - Het ... ... door de zogenoemde bloedingsziekte. Onbekend is waar de ... 212. Agrarisch Dagblad, April 5, 2005, 91 woorden, VEERMAN STEUNT ONDERZOEK NAAR KASTANJEZIEKTE, AGD/ANP ... oorzaak van de bloedingsziekte onder paardekastanjebomen. 213. Algemeen Nederlands Persbureau ANP, April 4, 2005, BINNENLAND, 296 woorden, Rijksgeld voor onderzoek kastanjeziekte, Vanloon, DEN HAAG (ANP) ... door de zogenoemde bloedingsziekte. Alleen al in ... ... kampen met de kastanjeziekte. Tot nu toe is ... ... van de werkgroep Aesculaap, waarin betrokken gemeenten ... ... deze inventarisatie. De bloedingsziekte is te herkennen aan ... 214. Amersfoortse Courant, April 1, 2005, AS3 (stadspagina), 249 woorden, Paardekastanjes in Eemland scherp in het oog gehouden ... Dijk De mysterieuze kastanjeziekte heeft nog niet ... ... het zeker: de kastanjeziekte heeft toegeslagen. Tot ... 215. Amersfoortse Courant, April 1, 2005, AS3 (stadspagina), 221 woorden, Werkgroep zoekt oorzaak en geeft gemeenten advies ... strijd tegen de kastanjeziekte aangebonden door een speciaal opgerichte werkgroep Aesculaap, gevestigd in Boskoop. ... ... de vlag van Aesculaap wordt onderzoek gedaan ... ... aan het onderzoek. Aesculaap geeft gemeenten en ... ... geen paardekastanjes. www.kastanjeziekte.wur.nl. © Wegener. ... 216. Amersfoortse Courant, April 1, 2005, AV3 (stadspagina), 214 woorden, Werkgroep zoekt oorzaak ... strijd tegen de kastanjeziekte aangebonden door een speciaal opgerichte werkgroep Aesculaap, gevestigd in Boskoop. ... 72

... de vlag van Aesculaap wordt onderzoek gedaan ... ... aan het onderzoek. Aesculaap geeft gemeenten en ... ... geen paardekastanjes. www.kastanjeziekte.wur.nl. © Wegener. ... 217. Amersfoortse Courant, April 1, 2005, AV3 (stadspagina), 219 woorden, Paardekastanjes in Eemland scherp in het oog gehouden ... Dijk De mysterieuze kastanjeziekte heeft nog niet ... ... het zeker: de kastanjeziekte heeft toegeslagen. Tot ... 218. Utrechts Nieuwsblad, April 1, 2005, AS3 (stadspagina), 249 woorden, Paardekastanjes in Eemland scherp in het oog gehouden ... Dijk De mysterieuze kastanjeziekte heeft nog niet ... ... het zeker: de kastanjeziekte heeft toegeslagen. Tot ... 219. Utrechts Nieuwsblad, April 1, 2005, AS3 (stadspagina), 221 woorden, Werkgroep zoekt oorzaak en geeft gemeenten advies ... strijd tegen de kastanjeziekte aangebonden door een speciaal opgerichte werkgroep Aesculaap, gevestigd in Boskoop. ... ... de vlag van Aesculaap wordt onderzoek gedaan ... ... aan het onderzoek. Aesculaap geeft gemeenten en ... ... geen paardekastanjes. www.kastanjeziekte.wur.nl. © Wegener. ... 220. Veluws Dagblad, April 1, 2005, VL3REG (regio), 88 woorden, Sapstroom in mei verraadt zieke kastanjes ... al door de kastanjeziekte zijn getroffen. © Wegener. ... 221. Zwolse Courant, March 31, 2005, ZW1REG (regio), 156 woorden, Aandacht voor achterstallig groenonderhoud ... al door de kastanjeziekte zijn getroffen. © Wegener. ... 222. Dagblad Tubantia/Twentsche Courant, March 30, 2005, WI1 (Winterswijk), 311 woorden, Korte berichten ... Achterhoek Lochem. De kastanjeziekte klopt aan de ... ... het leven geroepen, Aesculaap geheten. Nauw betrokken ... ... natuur en visserij. Aesculaap heeft de gemeenten ... ... verloop van de kastanjeziekte. Ook burgers wordt ... 223. Gelders Dagblad, March 29, 2005, LB1REG (regio), 288 woorden, Plaag nadert de Achterhoek - Ziekte bedreigt kastanjes ... deze contreien. De kastanjeziekte klopt aan de ... ... onzer verslaggevers De kastanjeziekte, die zich razendsnel ... ... het leven geroepen, Aesculaap geheten. Nauw betrokken ... ... natuur en visserij. Aesculaap heeft de gemeenten ... ... verloop van de kastanjeziekte. Ook burgers wordt ... 224. De Gelderlander, March 26, 2005, TIREG4 (regiopagina Tiel ), 240 woorden, DEN BOSCH - Paardekastanjes in stad zijn ziek ... de veelal dodelijke bloedingsziekte. In grote delen ... ... land heeft de bloedingsziekte inmiddels paardekastanjes aangetast. ... speciaal opgerichte werkgroep Aesculaap heeft nog geen ... ... uitbraak van de bloedingsziekte zou in Den ... ... Kuik van werkgroep Aesculaap is er geen verband. ‘ ... 225. Brabants Dagblad, March 24, 2005, Regio, 470 woorden, Veel paardekastanjes in stad zijn ziek 73

... de veelal dodelijke bloedingsziekte. Dat meldt J. ... ... land heeft de bloedingsziekte inmiddels paardekastanjes aangetast. ... ... speciaal opgerichte werkgroep Aesculaap heeft nog geen ... ... uitbraak van de bloedingsziekte zou in Den ... ... Van Asten is de bloedingsziekte inmiddels aangetoond op ... ... met name de bloedingsziekte. Bosch Belang richt ... ... ontstaan van de bloedingsziekte. Volgens F. van Kuik van werkgroep Aesculaap is er geen verband. ‘ ... ... alles. ‘-----------------------DE FEITEN: Bloedingsziekte: De oorzaak van de bloedingsziekte bij de paardekastanje ... ... daaropvolgende voorjaar. Werkgroep Aesculaap coordineert de landelijke ... 226. Apeldoornse Courant, March 19, 2005, AP1REG (regio), 410 woorden, Eerste kastanje geveld na ziekte ... geveld is door de kastanjeziekte. Dat gebeurde aan ... ... die de gevreesde kastanjeziekte hebben opgelopen. De ... 227. De Gelderlander, March 18, 2005, EWVRREG4 (regiopagina Ede-Wageningen - Vallei - Renkum), 233 woorden, Kastanjeziekte trekt over de Veluwe ... verslaggever HARDERWIJK De kastanjeziekte, die een nieuwe, ... ... gevallen van de kastanjeziekte. In Hattem moet ... Kastanjeziekte trekt over de ... 228. Veluws Dagblad, March 17, 2005, VL2REG (regio), 392 woorden, Speurtocht naar oplossing - Werkgroep zoekt zieke kastanjes ... De landelijke werkgroep Aesculaap roept volgende week ... ... inventarisatie van de kastanjeziekte. De werkgroep probeert ... ... manier om de kastanjeziekte tot staan te ... ... van de werkgroep Aesculaap. 'Vanuit het noordwesten is de kastanjeziekte naar het zuiden ... ... hun gevallen van kastanjeziekte al wel gemeld. ... ... voorkomen van de kastanjeziekte uitdragen. De ziekte is ... ... idee hoe de kastanjeziekte een halt kan ... ... aanpak van de kastanjeziekte adviseert de werkgroep ... 229. Veluws Dagblad, March 17, 2005, VL2REG (regio), 232 woorden, Gevreesde kastanjeziekte trekt over de Veluwe ... verslaggevers VELUWE - De kastanjeziekte, die een nieuwe, ... ... gevallen van de kastanjeziekte. In Hattem moet ... Gevreesde kastanjeziekte trekt over de ... 230. Rotterdams Dagblad, March 15, 2005, IJssel en Lek; Pg. 311, 74 woorden, 'Controleer kastanjebomen' ... aan de zogeheten bloedingsziekte. Dat stelt raadslid ... 231. Rotterdams Dagblad, March 10, 2005, Rotterdam; Pg. 302, 271 woorden, Kastanjes gaan eraan ... aangetast door de kastanjeziekte. De eerste bomen ... ... ziekte. De zogeheten bloedingsziekte komt voor bij ... ... aangetast door de kastanjeziekte. De eerste bomen ... 232. Veluws Dagblad, March 10, 2005, VN3REG (regio), 158 woorden, Geld mag probleem niet zijn bij bestrijden boomziekte ... bedreiging van de kastanjeziekte, als het oprukken ... 74

233. Veluws Dagblad, March 10, 2005, VN3REG (regio), 426 woorden, Nog een laatste keer witte kaarsen, daarna is het met de bomen gedaan - Sluipmoordenaar kastanjes razendsnel ... voor de dodelijke kastanjeziekte, die razendsnel toeslaat. ... ziekte. Tegen de kastanjeziekte is daarentegen nog geen ... ... door de werkgroep Aesculaap. Deelnemers aan die ... 234. Apeldoornse Courant, March 9, 2005, GOVPAG (voorpagina), 319 woorden, Kans op kaalslag in lanen - Massagraf dreigt voor kastanjes ... bedreigd door de kastanjeziekte. De gemeente heeft ... ... de gemeente. De kastanjeziekte, of eigenlijk kastanjebloedingsziekte, is vorig ... ... kampen met de kastanjeziekte blijkt gemiddeld 40 ... ... oorzaak van de kastanjeziekte wordt nog onderzoek ... 235. Apeldoornse Courant, March 9, 2005, AP1REG (regio), 430 woorden, Nog een laatste keer witte kaarsen, daarna is het met de bomen gedaan - Sluipmoordenaar kastanjes razendsnel ... voor de dodelijke kastanjeziekte, die razendsnel toeslaat. ... ziekte. Tegen de kastanjeziekte is daarentegen nog geen ... ... door de werkgroep Aesculaap. Deelnemers aan die ... 236. Apeldoornse Courant, March 9, 2005, AP1REG (regio), 158 woorden, Geld mag probleem niet zijn bij bestrijden boomziekte ... bedreiging van de kastanjeziekte, als het oprukken ... 237. Haagsche Courant, March 8, 2005, HST3 (katern Den Haag), 463 woorden, LEIDSCHENDAM-VOORBURG - Ander kapoentje moet kleverige auto tegengaan ... Van Kuik. ‘De bloedingsziekte’ Deze mysterieuze kastanjeziekte heeft maar een ... 238. Amersfoortse Courant, February 26, 2005, UR3, 406 woorden, Steeds meer kastanjes aangetast ... lijden van de kastanjeziekte, de mysterieuze ziekte ... De kastanjeziekte houdt hier inmiddels ... ... worden. De werkgroep Aesculaap onderzoekt het probleem ... ... info over de kastanjeziekte: www.kastanjeziekte.wur.nl © Wegener. ... 239. Brabants Dagblad, February 26, 2005, Regio, 452 woorden, Van Meurs wil door als wethouder ... het Boxtelse bedrijf Aesculaap op te geven. ... 240. Utrechts Nieuwsblad, February 26, 2005, UR3, 406 woorden, Steeds meer kastanjes aangetast ... lijden van de kastanjeziekte, de mysterieuze ziekte ... De kastanjeziekte houdt hier inmiddels ... ... worden. De werkgroep Aesculaap onderzoekt het probleem ... ... info over de kastanjeziekte: www.kastanjeziekte.wur.nl © Wegener. ... 241. NRC Handelsblad, February 25, 2005, CS; Pg. 22, 3012 woorden, De eters van Carel Briels ; Draaiboek van een ondergronds massaspel, JESSICA VOETEN ... gevrijwaard was. Met een Aesculaap en het oude ... 242. Amersfoortse Courant, February 24, 2005, UZ3 (stadspagina), 220 woorden, Korte berichten ... in de werkgroep Aesculaap, die de kastanjeziekte onderzoekt. De werkgroep, ... 75

243. Utrechts Nieuwsblad, February 24, 2005, UZ3 (stadspagina), 220 woorden, Korte berichten ... in de werkgroep Aesculaap, die de kastanjeziekte onderzoekt. De werkgroep, ... 244. Brabants Dagblad, February 17, 2005, Regio, 114 woorden, GroenLinks Oss 'bezorgd' over kastanjeziekte ... van een mysterieuze kastanjeziekte in het land. ... ... Oss 'bezorgd' over kastanjeziekte 245. De Gelderlander, February 17, 2005, NYREG3 (regiopagina Nijmegen), 81 woorden, GroenLinks vreest bomenziekte De nog naamloze 'bloedingsziekte' bij paardekastanjes werd ... 246. Haagsche Courant, February 17, 2005, HST3 (katern Den Haag), 216 woorden, RIJSWIJK - Kastanjes in Rijswijk zijn ziek RIJSWIJK - De kastanjeziekte heeft in de ... ... te wisselen. De kastanjeziekte begint met een ... 247. Rijn en Gouwe, February 8, 2005, Alphen; Pg. 5, 145 woorden, Onbekende ziekte treft kastanjes, DE RONDE VENEN ... door een vreemde kastanjeziekte die niet eerder ... ... remedie is tegen de kastanjeziekte. De schimmel is niet ... 248. Rijn en Gouwe, February 8, 2005, Woerden; Pg. 5, 145 woorden, Onbekende ziekte treft kastanjes, DE RONDE VENEN ... door een vreemde kastanjeziekte die niet eerder ... ... remedie is tegen de kastanjeziekte. De schimmel is niet ... 249. Dagblad van het Noorden , February 3, 2005, D-Noord , 221 woorden, Mysterieuze kastanjeziekte treft ook Noordenveld , Door Piter Bergstra ... De nieuwe mysterieuze kastanjeziekte is ook in Drenthe ... 250. Nieuw Kamper Dagblad, February 2, 2005, KP3REG (regio), 130 woorden, Ook minister bezorgd over kastanjeziekte ... minister Veerman is de kastanjeziekte die ook al ... ... minister bezorgd over kastanjeziekte; 251. Zwolse Courant, February 2, 2005, ZW1REG (regio), 158 woorden, Minister noemt kastanjeziekte 'zorgwekkende ontwikkeling' ... minister Veerman is de kastanjeziekte die ook al ... ... naar de slopende kastanjeziekte. ... In een werkgroep, Aesculaap, werkt een aantal ... Minister noemt kastanjeziekte 'zorgwekkende ontwikkeling'; 252. Zwolse Courant, February 2, 2005, VD3REG (regio), 130 woorden, Ook minister bezorgd over kastanjeziekte ... minister Veerman is de kastanjeziekte die ook al ... ... minister bezorgd over kastanjeziekte; 253. Dagblad van het Noorden , February 1, 2005, G-Oost , 227 woorden, Mysterieuze kastanjeziekte ook in Groningen en Drenthe , Door Piter Bergstra ... De nieuwe mysterieuze kastanjeziekte is ook in Groningen ... 254. Dagblad van het Noorden , February 1, 2005, G-Stad , 227 woorden, Nieuwe mysterieuze kastanjeziekte rukt op , Door Piter Bergstra ... De nieuwe mysterieuze kastanjeziekte is ook in Groningen ... 76

255. Dagblad van het Noorden , February 1, 2005, G-Noord ; G-West , 227 woorden, Mysterieuze kastanjeziekte ook in Groningen en Drenthe , Door Piter Bergstra ... De nieuwe mysterieuze kastanjeziekte is ook in Groningen ... 256. Leeuwarder Courant , January 27, 2005, west ; zuid ; stad , 121 woorden, Minister bestrijdt kastanjeziekte ... van de mysterieuze kastanjeziekte wil opsporen. De ... 257. Haagsche Courant, January 26, 2005, HST1 (katern Den Haag), 228 woorden, Herstel van kastanjes kost miljoenen ... van de mysterieuze kastanjeziekte gaat de gemeente ... 258. Haagsche Courant, January 26, 2005, ZSP1 (sport Zoetermeer), 365 woorden, DEN HAAG - Vervangen kastanjes kost miljoenen ... van de mysterieuze kastanjeziekte gaat de gemeente ... ... boom ook de bloedingsziekte genoemd, kent een ... 259. Haagsche Courant, January 26, 2005, DSP1 (sport Delft), 365 woorden, DEN HAAG - Vervangen kastanjes kost miljoenen ... van de mysterieuze kastanjeziekte gaat de gemeente ... ... boom ook de bloedingsziekte genoemd, kent een ... 260. Haagsche Courant, January 26, 2005, WSP1 (sport Westland), 365 woorden, DEN HAAG - Vervangen kastanjes kost miljoenen ... van de mysterieuze kastanjeziekte gaat de gemeente ... ... boom ook de bloedingsziekte genoemd, kent een ... 261. Haagsche Courant, January 26, 2005, HST3 (katern Den Haag), 156 woorden, DEN HAAG - 'Kastanjes in drie maanden tijd dood' ... DEN HAAG - De kastanjeziekte, vanwege roodzwarte vlekken ... ... boom ook de bloedingsziekte genoemd, kent een ... 262. Leeuwarder Courant , January 26, 2005, noord ; west , 200 woorden, Minister strijdt mee tegen kastanjeziekte ... van de mysterieuze kastanjeziekte wil opsporen. De ... ... EUR3500. De werkgroep Aesculaap, bestaande uit deskundigen, ... 263. Haagsche Courant, January 22, 2005, HST2 (katern Den Haag), 210 woorden, OVER - DEN HAAG ... die lijden aan 'bloedingsziekte', oorzaak onbekend. U ... 264. Zwolse Courant, January 22, 2005, ZW2REG (regio), 415 woorden, - rubriek ‘Krabbels’ ... door de gevreesde kastanjeziekte, is voor hem of haar ... 265. Nieuw Kamper Dagblad, January 19, 2005, KP3REG (regio), 287 woorden, Kaalslag dreigt in binnenstad Zwolle - Weinig hoop kastanjebomen ... aan een fatale kastanjeziekte. ... nog afgewacht of de kastanjeziekte echt doorzet. Naar ... ... internationaal opererende Werkgroep Aesculaap zijn geen gevallen ... ... zich nog herstellen. Aesculaap heeft inmiddels een ... ... een inventarisatie van Aesculaap zijn inmiddels duizenden ... ... weer samen met Aesculaap. © Wegener.NV2005

77

266. Nieuw Kamper Dagblad, January 19, 2005, KP3REG (regio), 121 woorden, Meedogenloos eDe gevreesde kastanjeziekte kwam een jaar of ... 267. Zwolse Courant, January 19, 2005, ZW1REG (regio), 287 woorden, Kaalslag dreigt in binnenstad Zwolle - Weinig hoop kastanjebomen ... aan een fatale kastanjeziekte. ... nog afgewacht of de kastanjeziekte echt doorzet. Naar ... ... internationaal opererende Werkgroep Aesculaap zijn geen gevallen ... ... zich nog herstellen. Aesculaap heeft inmiddels een ... ... een inventarisatie van Aesculaap zijn inmiddels duizenden ... ... weer samen met Aesculaap. © Wegener.NV2005 268. Zwolse Courant, January 19, 2005, ZW1REG (regio), 121 woorden, Meedogenloos eDe gevreesde kastanjeziekte kwam een jaar of ... 269. Zwolse Courant, January 19, 2005, GOVPAG (voorpagina), 185 woorden, in Zwolle Nog geen remedie fatale ziekte - Kaalslag kastanjes ... getroffen door de kastanjeziekte. Onder andere in ... ... zich verspreidt. De kastanjeziekte kan een forse ... 270. Zwolse Courant, January 18, 2005, ZW1REG (regio), 570 woorden, - (korte berichten) Kastanjeziekte duikt op in ... 271. NRC Handelsblad, January 15, 2005, Economie; Pg. 27, 844 woorden, De kostbare dood van een kastanje, DOOR FRIEDERIKE DE RAAT ... Winter is de mysterieuze kastanjeziekte die het bruine ... 272. Haagsche Courant, January 8, 2005, HGL3 (katern Haaglanden), 443 woorden, Voor veel zieke kastanjes komt onderzoek te laat ACHTERGROND ... met de mysterieuze kastanjeziekte die in Den ... ... de landelijke werkgroep Aesculaap opgericht. Daarin werken ... 273. Haagsche Courant, January 4, 2005, HST2 (katern Den Haag), 448 woorden, Voor veel zieke kastanjes komt onderzoek te laat ACHTERGROND ... met de mysterieuze kastanjeziekte die in Den ... ... de landelijke werkgroep Aesculaap opgericht. Daarin werken ...

78