Reaktivita krevních destiček při léčbě protidestičkovými. léky. Platelet reactivity during antiplatelet therapy

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE 3. LÉKAŘSKÁ FAKULTA

Reaktivita krevních destiček při léčbě protidestičkovými léky Platelet reactivity during antiplatelet therapy

MUDr. Petra Paulů III. interní – kardiologická klinika FNKV a 3. LF UK

Disertační práce Praha, 2014

1

BIBLIOGRAFICKÁ IDENTIFIKACE

Jméno a příjmení autora:

Petra Paulů

Název disertační práce: Reaktivita krevních destiček při léčbě protidestičkovými léky

Platelet reactivity during antiplatelet therapy

Studijní program:

Biomedicína

Studijní obor:

Fyziologie a patofyziologie člověka

Předseda oborové rady:

Prof. MUDr. Jaroslav Pokorný, DrSc.

Školitel:

doc. MUDr. Pavel Osmančík, PhD.

Rok obhajoby:

2014

Klíčová slova: Krevní destičky, protidestičková léčba, rezistence na clopidogrel, reaktivita destiček, VerifyNow, PRU

Key words: platelets, antiplatelet therapy, clopidogrel resistence, platelet reactivity, VerifyNow, PRU

2

Prohlášení Prohlašuji, že jsem předkládanou práci vypracovala samostatně a použila výhradně uvedené citované prameny, literaturu a další odborné zdroje. Současně dávám svolení k tomu, aby má disertační práce byla používána ke studijním účelům.

Prohlašuji, že odevzdaná tištěná verze disertační práce a verze elektronická, nahraná do Studijního informačního systému SIS 3. LF UK, jsou totožné.

V Praze dne 17.2. 2014

MUDr. Petra Paulů

3

PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych ráda poděkovala všem, kteří svou pomocí přispěli ke vzniku mé práce. Je to zejména školitel mého doktorandského studia doc. MUDr. Pavel Osmančík, PhD., kterému moje poděkování jistě patří za cenné rady a odborné vedení po celou dobu studia, za čas, který si pro mne vždy našel, za trpělivost a za důvěru k mé osobě, která pro mne byla vždy velkým povzbuzením. Velmi ráda bych také poděkovala prof. MUDr. Petru Widimskému, DrSc., přednostovi III. interní - kardiologické kliniky FNKVa 3.LF UK za jeho vstřícnost a odborné vedení v oblasti vědecké i klinické a dále doc. MUDr. Petrovi Touškovi, PhD. za pomoc, cenné rady i přátelské konzultace. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat svému otci, bez jehož pomoci bych nebyla tím, čím jsem.

4

OBSAH PODĚKOVÁNÍ OBSAH SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK I. PŘEDMLUVA II. HYPOTÉZY A CÍLE PRÁCE III. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ JSOU PODKLADEM DIZERTACE IV. TEORETICKÁ ČÁST 1. Trombocyty 2. Adheze a aktivace trombocytů 3.Agregace trombocytů 3.1.ADP receptory 4. Protidestičkové léky 4.1. Aspirin 4.2. ADP antagonisté 4.2.1. Clopidogrel 4.2.2. Prasugrel 4.2.3. Ticagrelor a cangrelor 5. Protidestičková léčba 5.1. Terapie aspirinem 5.1.1. Akutní koronární syndrom

5

5.1.2. Sekundární prevence 5.1.3. Primární prevence 5.2. Terapie clopidogrelem 5.3. Duální protidestičková léčba 5.3.1. Aspirin + clopidogrel 5.3.1.1. Perkutánní koronární intervence 5.3.1.2. Akutní koronární syndrom 5.3.1.3. Primární prevence 5.3.2. Aspirin + nové protidestičkové léky 6. Rezistence na aspirin a clopidogrel 6.1. Rezistence na aspirin 6.1.1. Rezistence z klinických příčin 6.1.2. Rezistence z buněčných příčin 6.1.3. Rezistence z genetických příčin 6.2. Rezistence na clopidogrel 6.2.1. Rezistence z klinických příčin 6.2.2. Rezistence z buněčných příčin 6.2.3. Rezistence z genetických příčin 7. Možnosti měření účinnosti antiagregační terapie 7.1. LTA 7.2. VerifyNow

6

7.2.1. Měření efektu IIb/IIIa antagonistů 7.2.2. Měření efektu aspirinu 7.2.3. Měření efektu thienopyridinů 7.3. PFA-100 7.4. Cone-and- Plate(let) Analyzer 7.5. Plateletworks 7.6. Chrono- Log Agregometr 7.7. Tromboelastogram 7.8. S- tromboxan B2, U-dehydrotromboxan 8. Možnosti ovlivnění účinnosti protidestičkové léčby V. PRAKTICKÁ ČÁST 1. Metodika 1.1. Zařazení pacientů 1.2. PCI a protidestičková léčba 1.3. Náběr vzorků 1.4. Serologická analýza 1.5. Genetická analýza 1.6. Sledování pacientů 1.7. Zvyšování dávky clopidogrelu a záměna za ticlopidin 1.8. Statistické zpracování dat

2. Výsledky

7

2.1. Incidence rezistence na clopidogrel a faktory související s rezistencí na clopidogrel 2.1.1. Multivariantní analýza 2.1.2. Diskuze 2.1.3. Závěr 2.2. Možnost ovlivění rezistence na clopidogrel navýšením chronické dávky 2.2.1. Diskuze 2.2.2. Závěr 2.3. Stanovení prognózy pacientů s ischemickou chorobou srdeční indikovaných k duální protidestičkové léčbě pomocí klinických, laboratorních a genetických parametrů 2.3.1. Multivariantní analýza 2.3.2. Diskuze 2.3.3. Závěr VI. ZÁVĚR VII. SOUHRN VIII. SUMMARY IX. LITERATURA X. PŘEHLED LITERATURY AUTORA

8

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK PCI

perkutánní koronární intervence

ADP

adenosindifosfát

PAF

platelet activating factor (faktor aktivující destičky)

GDP

guanosindifosfát

GTP

guanosintrifosfát

ATP

adenosintrifosfát

AMP

adenosinmonofosfát

PDGF

platelet derived growth factor (destičkový růstový faktor)

TGF

transforming growth factor (transformující růstový faktor)

PAI-I

inhibitor aktivátoru plasminogenu

ICAM-1

intercelullar adhesion moleclule-1

LDL

low density lipoprotein

IM

infarkt myokardu

AP

angina pectoris

STEMI

infarkt myokardu s ST elevacemi

NSTEMI

infarkt myokardu bez ST elevací

ICHS

ischemická choroba srdeční

CMP

cévní mozková příhoda

MACE

major adverse cardiac events

AKS

akutní koronární syndrom

COX-1

cyklooxygenáza - 1

COX-2

coklooxygenáza - 2

mRNA

mitochondriální ribonukleová kyselina

9

CABG

coronary artery bypass graft

TNF

tumor necrosis factor

IIP

inhibitory protonové pumpy

cAMP

cyklická adenosinmonofosfát

ROC

receiver operating characteristic curve

LTA

light transmission aggregometry (optická agregometrie)

PRU

platelet reactivity unit

VASP

vasodilator stimulated phosphoprotein

ELISA

enzyme-linked immunosorbent assay

FDP

fibrin degradační produkty

TRAP

thrombin receptor activating peptide (trombinové receptory aktivující protein)

PAU

platelet inhibition unit

NSAID

nesteroidní protizánětlivé léky

CT

closure time

vWF

von Willebrandův faktor

OTPR

on-treatement platelet reactivity (aktivita destiček při protidestičkové léčbě)

DES

drug eluting stent (lékový stent)

BMS

bare metal stent (kovový stent)

ICHDK

ischemická choroba dolních končetin

ACEI

inhibitory angiotenzin konvertujícího enzymu

UPV

umělá plicní ventilace

10

I. PŘEDMLUVA Předkládáná dizertační práce se zabývá duální protidestičkovou léčbou, tj. kombinací aspirinu a clopidogrelu. Tato terapie je indikována jak u pacientů s ICHS (ischemická choroba srdeční) po proběhlém AKS (akutní koronární syndrom), tak u pacientů po provedení elektivní PCI (perkutánní koronární intervence). Prokazatelně v těchto případech snižuje riziko kardiovaskulární smrti, re-infarktu myokardu či CMP (cévní mozková příhoda). Nicméně u určitého procenta pacientů dochází k rekurenci ischemických komplikací, čímž dochází ke zhoršení jejich prognózy. Tento stav může být způsoben selháním terapie na podkladě rezistence na léčbu a tím snížením její efektivity. Rezistence na protidestičkovou terapii a zejména rezistence na clopidogrel je hlavní téma mé práce. Rezistenci na clopidogrel a tím i náhled na tuto problematiku můžeme rozdělit podle etiologie na klinickou a laboratorní a podle vyvolávající příčiny na buněčnou, genetickou a klinickou. Po nezbytném teoretickém úvodu do problematiky a přesném popisu metodiky má tři části.

První část se zabývá incidencí rezistence na clopidogrel v reálné praxi tak, jak jí můžeme vídat u pacientů, kteří jsou přijímáni na kardiologická oddělení. Je diskutována možnost stanovení faktorů, které by mohly být asociovány s rezistencí a zaměřujeme se i na možnou etiologii rezistence. Pokusily jsme se stanovit parametry, které by mohly v klinické praxi pomoci vyselektovat pacienty s vyšším rizikem rezistence a tím i vyšším rizikem rekurence ischemických komplikací. První část je podpořena námi publikovaným článkem, který se zabývá odlišnou koncentrací zánětlivých parametrů u pacientů s dostatečnou a nedostatečnou odpovědí na léčbu clopidogrelem.

11

Druhá část práce se zaměřuje právě na výše zmíněné pacienty s horší odpovědí na léčbu. Snažily jsme se u nich pomocí navýšení chronické dávky clopidogrelu vytitrovat takovou dávku, která zefektivizuje léčbu clopidogrelem a tím sníží riziko ischemických komplikací bez zvýšení rizika krvácivých komplikací. Byla by to jedna z forem ovlivnění rezistence v klinické praxi. Je podložena námi prezentovanou publikací, která popisuje pilotní studii o ovlivnění laboratorní rezistence na clopidogrel titrací chronické dávky clopidogrelu.

Třetí část diskutuje možnost určení prognózy pacientů léčených duální protidestičkovou léčbou pomocí námi zvolených faktorů – klinických, laboratorních a genetických. Zaměřili jsme se na to, zda je možné nalézt metodu, která by jednoznačně označila pacienty s ischemickou chorobou srdeční, kteří mají horší prognózu. Je podpořena publikací, která je hlavním článkem autora dizertace.

12

II. HYPOTÉZY A CÍLE PRÁCE

Cílem mé práce bylo:

- zjistit incidenci rezistence na clopidogrel v reálné praxi

- stanovit faktory klinické, laboratorní a genetické, které jsou asociovány s horší odpovědí destiček na terapii clopidogrelem

- ovlivnit horší laboratorní odpověď na clopidogrel navýšením a titrací chronické dávky clopidogrelu aniž bychom zvýšili riziko krvácení

- určit faktory klinické, laboratorní a genetické, které predisponují k horší prognóze pacientů

Hypotézy práce byly:

- incidence rezistence na clopidogrel je v literatuře popisována od 5% do 40% v závislosti na metodě měření a charakteristice sledované populace; v reálné praxi bude incidence rezistence v tomto rozmezí

- existují faktory, které jsou zodpovědné za horší odpověď na léčbu clopidogrelem; jsou to faktory klinické (např. věk či pohlaví), laboratorní (biochemické a hematologické) a genetické (polymorfismy genů ovlivňující metabolismus clopidogrelu)

13

- ovlivnit laboratorní odpověď na clopidogrel lze navýšením dávky

- lze stanovit faktory, které předurčují horší prognózu pacientů léčených protidestičkovou léčbou; jsou to faktory klinické, laboratorní a genetické

14

III. SEZNAM PUBLIKACÍ, KTERÉ JSOU PODKLADEM DISERTACE

• Paulu P, Osmancik P, Tousek P, Minarik M, Benesova L, Bednar F, Motovska Z, Petr R, Kocka V, Widimsky P. Lack of association between clopidogrel responsiveness tested by point-of-care assay and prognosis of patients with coronary artery disease. J Thromb Thrombolysis 2013 Jul;36(1):1-6, IF 1,98 • Osmancik P, Paulu P, Tousek P, Kocka V, Widimsky P. High leukocyte count and interleukin-10 predict high on-treatment-platelet-reactivity in patients treated with clopidogrel. Thromb Thrombolysis. 2012 May;33(4):349-54, IF 1, 48 • Tousek P, Osmancik P, Paulu P, Kocka V, Widimsky P. Clopidogrel Up-Titration Versus Standard Dose in Patients with High Residual Platelet Reactivity After Percutaneous Coronary Intervention: A Single-Center Pilot Randomised Study. Int J Cardiol 2011;150(2):231-2, IF 7,07

• Paulů P, Toušek P, Osmančík P. Antiagregační léčba- přehled preparátů, přínos klinické praxi a možnosti stanovení rezistence na léčbu. Prakt. Lék. 2011; 91 (2): 73-76 • Osmančík P, Paulů P, Toušek P, Bednář F, Moťovská Z, Widimský P. Měření aktivity trombocytů a účinnosti antiagregační léčby. Cor Vasa 2010;52(Suppl 1):15–20

15

IV. TEORETICKÁ ČÁST Tato kapitola se zabývá teoretickými základy, na kterých byla vybudována hypotéza a cíle mé práce a pomocí kterých byla vysvětlena podstata mých zjištění. Pojednává o krevních destičkách (trombocytech), o jejich významu při tvorbě trombu jako odpovědi na vaskulární postižení, který hraje základní roli v rozvoji akutních forem ischemické choroby srdeční, ale i cévní mozkové příhody či ischemické choroby dolních končetin. Dále popisuje léčbu, která je zaměřena právě proti rozvoji trombu tj. antitrombotickou protidestičkovou léčbu pomocí aspirinu a clopidogrelu a s ní související rezistenci na tuto léčbu, a to jak rezistenci na aspirin, tak na clopidogrel. Zabývá se etiologií rozvoje rezistence, predisponujícími faktory a v neposlední řadě možnostmi jejího měření a stanovení a to jak laboratorně, tak v klinické praxi. Na závěr shrnuje i nejnovější poznatky o možnosti ovlivnění rezistence a směřování k individualizované antitrombotické léčbě.

1. Trombocyty Trombocyty jsou malé, bezjaderné, diskovité fragmenty cytoplazmy polypoidních megakaryocytů, které nacházíme v kostní dřeni. Měří v průměru asi 2-5 um, u zdravého člověka jich nacházíme asi 150-300 000 v jednom mikrolitru krve. Destičky mají kolem své periferie prstenec mikrotubulů a silně invaginovanou membránu s komplikovaným kanalikulárním systémem spojeným s extracelulární tekutinou. Jejich membrány obsahují četné receptory např. pro kolagen, von Willebrandův faktor či fibrinogen. Cytoplazma obsahuje aktin, myozin, glykogen, lysozomy a dva typy granul: a) denzní granula s neproteinovými substancemi uvolňovanými při aktivaci detsiček včetně serotoninu, ADP (adenosindifosfát) a dalších adenonukleotidů a b) alfa granula obsahující proteiny – srážlivé faktory, PDGF (destičkový růstový faktor) a další.

16

2. Adheze a aktivace trombocytů Adheze, aktivace a následně agregace trombocytů nejsou oddělené děje. Jsou to procesy, které se prolínají a navzájem se ovlivňují jak pozitivní, tak negativní zpětnou vazbou. Adheze trombocytů nastane, pokud dojde k obnažení subendotelových struktur cévní stěny a to zejména kolagenu, který je vysoce agresivní aktivátor agregace, ale i lamininu a von Willebrandova faktoru, na které se destičky vazbou přes integriny navážou. Aby se tak mohlo stát, musí destičky v rychlém krevním toku nejprve „zpomalit“, tomuto jevu se říká rolování. Děje se to pomocí vazby destičkového glykoproteinového komplexu GPIb-IX-V na von Willebrandův faktor. Následně se již destičky mohou navázat přes sve kolagenové receptory, z nichž nejvýznamnější je GP VI (s tyrozinkinázovou aktivitou) a integrin. Komplex GPIb/IX/V se neúčastní pouze adheze, ale i aktivace destičky. Proces adheze nevyžaduje metabolickou aktivitu destiček. Vazba destiček na subendotelové struktury spouští aktivaci destiček, na které se dále podílí řada faktorů. Je to např. ADP, který je uvolňován z postižených erytrocytů, poraněné cévy a sekundárně i z agregovaných destiček, serotonin, adrenalin, PAF (faktor aktivující destičky uvolněný nejen autokrinně z destiček, ale i z bazofilů, neutrofilů a makrofágů), trombin, kolagen, laminin a další. Aktivace destiček je zahájena pomocí agonistů aktivace a agregace, které aktivují destičkové receptory. Tyto agonisty aktivace a agregace bychom mohli rozdělit do dvou skupin podle typu působení na dva typy receptorů. První typ receptorů je spojen s G proteiny, v destičkách je těchto proteinů celkem 9. Po navázání agonisty dojde k změně vazby GDP-protein na GTP- protein. Tento komplex je aktivní a dále aktivuje fosfolipázu C, která katalyzuje hydrolýzu fosfatidilinositolu difosfátu na inositoltrifosfát a diacylglycerol. Inositoltrifosfát (IP3) difunduje do endoplasmatického retikula, kde spouští mechanismus uvolnění kalcia. Kalcium potencuje aktivitu fosfolipázy

17

A2, která způsobí, že se z membránových fosfolipidů uvolní kyselina arachidonová a dochází k tvorbě prostanoidů včetně tromboxanu A2. Současně dochází k fosforylaci myozinu. Diaclyglycerol dále způsobuje aktivaci proteinkinázy C. Druhý typ receptorů je přímo spjat s tyrozinkinázou, která přímo aktivuje cytoskeletální proteiny a podílí se na degranulaci destičkových granul. K nejdůležitějším destičkovým receptorům, které se podílejí na aktivaci, patří trombinové receptory PAR1-PAR4 (Brass, Hoxie et al. 1993). Jsou spojeny s G proteinem a mohou být aktivovány kromě trombinu i jinými proteázami např. metaloproteinázami monocytů a granulocytů (Mantovani, Sozzani et al. 1997) nebo plazminem (Rabhi-Sabile, de Romeuf et al. 1998). Dále jsou to ADP receptory (viz níže), receptory pro adrenalin, serotonin nebo tromboxan A2. Všechny jsou spojeny s G proteinem. Aktivaci destiček mohou způsobit i protilátky zaměřené proti destičkovým receptorům, autoprotilátky při antifosfolipidovém syndromu, kyslíkové radikály při zánětlivé reakci atd. V neposlední řadě k aktivaci destiček dochází např. při hemodialýze či mimotělním oběhu kontaktem s membránami přístroje. Po aktivaci a zvýšení intracelulárního kalcia dochází ke změně tvaru destičky a přestavbě cytoskeletu. Nejprve dochází k fosforylaci destičkových proteinů a štěpení a polymerizaci aktinu. To vede ke změně tvaru a prodloužení destičky, která vytváří pseudopodie, kterými se uchytí na cévní stěnu. Vytváří stresová vlákna uvnitř destičky, která se podílí na degranulaci a retrakci koagula. Dále dochází ke zvýšení exprese GP IIb/IIIa na povrchu destičky, který po navázání plazmatického fibrinogenu způsobí agregaci destiček mezi sebou a endotelem, dále Pselektinu, který se podílí na vzniku agregátů destiček s leukocyty a CD40 ligandu, který hraje roli při zánětlivé aktivaci endotelu (Lefkovits, Plow et al. 1995) (Clemetson 1995).

18

3. Agregace trombocytů Po adhezi a aktivaci dochází k agregaci – vzájemnému spojení destiček mezi sebou fibrinovými vlákny navázanými na komplex GP IIb/IIIa na každé destičce, což vede ke vzniku primární zátky. Při tomto procesu dochází neustále k uvolňování dalších látek z destiček, které tuto akci urychlují. Z denzních granulí se uvolňuje serotonin, ADP a ATP (adenosintrifosfát) a z alfa granulí fibrinogen, von Willebrandův faktor, fibronectin, selektin P, PDGF, TGF (transformující růstový faktor), PAI-1 (inhibitor aktivátoru plasminogenu) a další. Po agregaci dochází ke vzniku primárního trombu, který je zprvu nestabilní. Teprve po retrakci a zpevnění fibrinovými vlákny dochází ke stabilizaci trombu. 3.1. ADP receptory ADP secernovaný jak z erytrocytů, tak z endotelu i trombocytů se váže na purinové receptory, které se označují jako P2 receptory. Ty můžeme obecně rozdělit na receptory spojené s iontovými kanály (P2X) a receptory spojené s G-proteinem (P2Y), kam patří P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y11, P2Y12, P2Y13 a P2Y14 (Cattaneo, Lombardi et al. 1997) (Gachet, Cattaneo et al. 1995). ADP ovlivňuje destičku a aktivitu destiček na několika úrovních: a) rapidně zvyšuje intracelulární koncetraci kalcia v trombocytu (MacKenzie, Mahaut-Smith et al. 1996) b) aktivuje destičkovou fosfolipázu C, což vede k mobilizaci kalcia z intracelulárních zásob (Daniel, Dangelmaier et al. 1998) c) inhibuje destičkovou adenylcyklázu, což vede i k poklesu cAMP (Ohlmann, Laugwitz et al. 1995) d) aktivuje fosfolipázu A2 a uvolňuje arachidonovou kyselinu z membránových fosfolipidů, která se následně metabolizuje na tromboxan A2 (MacFarlane, Gardner et al. 1977). P2X1 receptor je ligandem otvíraný iontový kanál, který zprostředkuje influx kalcia

19

z okolí buňky. Zdá se, že v procesu agregace destiček nehraje významnou roli. Pro ADP indukovanou agregaci je důležitý receptor P2Y1 tak P2Y12. Aktivace prvního z nich iniciuje rychlou odpověď na ADP a ovlivňuje maximální stupeň agregace destiček (Jarvis, Humphries et al. 2000). P2Y1 receptor je vysokoafinitní receptor, který je spjatý s proteinem Gq. Pokud se na tento receptor naváže ADP, dojde k aktivaci fosfolipázy C, změně tvaru destičky a zvýšení intracelulárního kalcia (Fagura, Dainty et al. 1998). Receptor označovaný jako P2Y12 je ve velké míře přítomen na povrchu trombocytů, v menším procentu i na buňkách mozku (Hollopeter, Jantzen et al. 2001). Struktura receptoru je typická pro receptory spojené s G proteinem – 7 hydrofobních transmembránových okrsků spojených 3 intracelulárními a 3 extracelulárními smyčkami. Lidský P2Y12 receptor obsahuje 324 aminokyselinových reziduí s 10 cysteinovými rezidui. Důležitost cysteinových reziduí ukazuje možnost thiolových sloučenin (např. clopidogrel) inhibovat odpověď receptoru na ADP (Hollopeter, Jantzen et al. 2001). G proteiny zprostředkují interakci mezi povrchem buňky a intracelulárními enzymy během destičkové aktivace pomocí takzvaných „second messengerů“. G proteiny jsou složeny ze 3 podjednotek – α, β a γ, které mohou mít buď aktivační či inhibiční vlastnosti. Specificky P2Y12 je spojen s proteinem Giα. Jeho aktivace způsobuje disociaci α a βγ podjednotky. Přes četné signální dráhy podjednotka αi způsobí inhibici destičkové adenylcyklázy a tím snížení koncentrace cAMP a následně snížení aktivity cAMP kinázy (PAK). PAK má celou řadu substrátů např. aktin vázající protein ovlivňující stabilizaci cytoskeletu, GpIb ovlivňující polymerizaci aktinu nebo IP3 receptory, které ovlivňují uvolňování kalcia z intracelulárních zásob (Schwarz, Walter et al. 2001). PAK je rovněž zodpovědná za fosforylaci VASP (vasodilator stimulated phosphoprotein), který hraje důležitou roli v aktivaci receptorů pro fibrinogen a tím v agregaci destiček (Nguyen, Diodati et al. 2005). Současně podjednotka βγ stimuluje aktivitu fosfatidil inositol-3 kinázy (PI3K),

20

která zvyšuje koncentraci fosfatidilinositol -3-fosfátu, který hraje zásadní roli v udržení destičkové agregace. PI3K také ovlivňuje růst trombu potenciací vazby fibrinogenu (Jackson, Schoenwaelder et al. 2005). βγ dimery ovlivňují přes specifické draslíkové kanály a aktivaci fosfolipázy A2 i tvorbu tromboxanu A2 (Shankar, Kahner et al. 2006). Z uvedených příkladů jasně vyplývá, že ADP receptory (a specificky P2Y12 receptor) se ve značné míře účastní amplifikace destičkové aktivace a stabilizace agregace destiček.

4. Protidestičkové léky 4.1. Aspirin (kyselina acetylsalicylová) Aspirin je látka, která je užívána již přes 100 let pro své analgetické a antipyretické vlastnosti. Posledních 30 let se její užití rozšířilo i pro primární a sekundární kardiovaskulární prevenci (Mehta and Mohandas 2010). Substance nazývaná salicilin byla poprvé izolována z kůry vrby reverendem Edmundem Stonem již v roce 1763 (Mehta and Mohandas 2010) a firma Bayer Company ji v roce 1897 začala prodávat pod značkou Aspirin (Jack 1997) (Sneader 2000). Po objevu jiných nesteroidních antiflogistik důležitost aspirinu opadala, ale Craven v roce 1953 poprvé vyslovil domněnku, že by se mohl používat i k potlačení rozvoje trombu (Craven 1950). Tuto teorii poté potvrzovali vědci v 60. letech (Weiss, Aledort et al. 1968). Následně v roce 1971 Vane publikoval svojí observační studii, kde popsal inhibici tvorby prostaglandinů aspirinem (Vane 1971). Až Elwood v roce 1974 vytvořil první randomizovanou studii s aspirinem, která potvrdila 25% pokles mortality u 1239 pacientů po infakrtu myokardu (Elwood, Cochrane et al. 1974). Aspirin acetylací cyklooxygenázy-1 na pozici serinu 529 ireverzibilně inhibuje vznik prostaglandinu G2 a H2 z kyseliny arachidonové, čímž dochází k blokování tvorby tromboxanu A2 v trombocytu (Roth and Calverley 1994). Tromboxan A2 je jeden z nejsilnějších agonistů agregace, nicméně jiní agonisté jako trombin, ADP či katecholaminy

21

působit mohou. Acetylací vzniká kovalentní vazba, která nepodléhá hydrolýze, proto je účinek aspirinu ireverzibilní (Roth and Calverley 1994), tj. po celou dobu života destičky, tj. asi 10 dní (denně se obnoví asi 10% destiček). Aspirin můžeme v plazmě detekovat po jeho vstřebání sliznicí žaludku a tenkého střeva již za 20 minut, maximální koncentraci však můžeme zjistit až za 30-40 minut a měřit jeho účinek stanovením inhibice destiček až za 60 minut po vstřebání. Normální hemostáza se po vysazení aspirinu obnovuje již za 2 dny (tj. v přítomnosti 20% neinhibovaných destiček). Kromě inhibice tvorby tromboxanu A2 má aspirin ještě mnoho dalších funkcí. Snižuje zánětlivou aktivitu buněk, uvolňování elastáz a intracelulárních adhezivních molekul jako ICAM-1 a snižuje tvorbu oxidovaných LDL částic (Egger, Burda et al. 2001) (Steer, Wallace et al. 1997). Má značné antioxidační účinky. Chrání LDL částice před oxidací (Steer, Wallace et al. 1997), neutralizuje hydroxylové radikály (Betts, Whitehouse et al. 1985), indukuje tvorbu feritinu (Oberle, Polte et al. 1998) a acetyluje proteiny, čímž brání jejich oxidaci (Pinckard, Hawkins et al. 1968). Nesmíme zapomenout ani na jeho funkci stabilizace endotelu. Zabraňuje adhezi neutrofilů a monocytů (Husain, Andrews et al. 1998), inhibuje růst buněk hladkého svalstva v tkáňové kultuře (Bernhardt, Rogalla et al. 1993), což může mít například vliv na vznik restenózy po implantaci stentu. V neposlední řadě inhibuje angiogenezi a ruší hypoxií navozenou vazokonstrikci (Toda, Matsumoto et al. 1992). Proto i přes své poměrně slabé ovlivnění agregace destiček působí příznivě na kardiovaskulární aparát. 4.2. ADP antagonisté ADP antagonisty dělíme na thienopyridiny (ticlopidin, clopidogrel, prasugrel) a přímé antagonisty P2Y12 receptorů (ticagrelor, cangrelor). 4.2.1.Clopidogrel Patří do první generace thienopyridinů spolu s ticlopidinem. Clopidogrel má podobnou

22

strukturu i účinek jako ticlopidin, navíc má ve své struktuře karboxymetylovou funkční skupinu (Jacobson 2004). Ticlopidin má častější a závažnější nežádoucí účinky (zejména neutropenii), proto byl v praxi téměř zcela nahrazen clopidogrelem (Moussa, Oetgen et al. 1999),(Szto, Linnemeier et al. 1999). Clopidogrel se vstřebává se z gastrointestinálního traktu pomocí P-glykoproteinového transportu, který se také spolupodílí na ovlivnění jeho následného efektu (polymorfismem MDR1 genu, viz dále) (Taubert, von Beckerath et al. 2006). Vstřebání na rozdíl od ticlopidinu není ovlivněno jídlem. Je velmi rychle metabolizován v játrech, kde probíhaji dvě po sobě jdoucí oxidace na 2-oxo-clopidogrel a následně na aktivní metabolit pomocí enzymů systému cytochromu P450. Je to zejména enzym CYP2C19, v menší míře i CYP2C9, 3A4, 3A5, 1A2 a 2B6 (Savi, Combalbert et al. 1994) (Mega, Close et al. 2009). Pouze 15% původní látky je metabolizováno na aktivní metabolit, zbytek je hydrolyzován na inaktivní látku (Verstuyft, Simon et al. 2009), kterou můžeme detekovat v plazmě již za hodinu po podání (Easton 1999). Je eliminován z 50% ledvinami a ze 46% gastrointestinálním traktem (Jacobson 2004). Biologický poločas je 8 hodin. Po podání dochází k ireverzibilnímu potlačení na ADP závislé agregaci, které trvá 7-10 dní. Pro nutnost bioaktivace by byl nástup účinku zpožděn, čemuž předcházíme podáním nasycovací dávky. Po podání 300 mg clopidogrelu můžeme maximální efekt měřit za 4-5 hodin (Taubert, Kastrati et al. 2004). Pokud nasycovací dávku zdvojnásobíme, maximálního efektu je dosaženo již za 2-3 hodiny (von Beckerath, Taubert et al. 2005). Dalším zvyšováním nasycovací dávky již lepšího efektu nedosáhneme v důsledku omezené maximální absorbce. Aktivní metabolit se váže na P2Y12 receptor, čímž blokuje aktivaci GP IIb/IIIa receptoru, degranulaci a vytvoření tromboxanu (Daniel, Dangelmaier et al. 1999) a tím agregaci destiček. Ve srovnánní s ticlopidinem má clopidogrel zanedbatelný výskyt vedlejších účinků. Těžká

23

neutropenie se vyskytuje pouze u 0,05% pacientů (Schror 1995). Vznik trombotické trombocytopenické purpury při léčbě clopidogrelem byl zatím publikován pouze u 11 pacientů. Ani gastrointestinální obtíže nejsou časté. 4.2.2. Prasugrel Prasugrel patří do druhé generace thienopyridinů. Podobá se clopidogrelu jednak tím, že to je prodrug, tj. potřebuje ke svému působení aktivaci v játrech a jednak tím, že působí ireverzibilně. Ačkoli aktivní metabolity clopidogrelu i prasugrelu mají stejnou afinitu k P2Y12 receptoru in vitro, in vivo je situace jiná (Mega, Close et al. 2009). U clopidogrelu dochází působením esteráz k inaktivaci. U prasugrelu jsou esterázy součástí prvního kroku bioaktivace, kdy hydrolyzují prodrug na thiolakton, který je dále oxidován systémem cytochromu P450 na aktivní metabolit. Na rozdíl od clopidogrelu se této oxidace účastní zejména CYP3A a 2B6, pouze minimálně CYP2C9 a CYP2C19 (Rehmel, Eckstein et al. 2006). Protože izoformy CYP3A a 2B6 jsou méně zatíženy polymorfismy a celkově se systém P450 účastní pouze jednoho ze dvou kroků metabolizace, inhibice agregace jeví mnohem menší interindividuální aktivitu (Cattaneo and Podda 2010). Po podání nasycovací dávky 60 mg dosahuje maximální koncentrace v plazmě již za 30 minut a optimální inhibice destiček je dosaženo za 2 hodiny (Farid, Smith et al. 2007). Ze 70% je vylučován ledvinami. 4.2.3. Ticagrelor a cangrelor Na rozdíl od thienopyridiů je ticagrelor reverzibilní inhibitor receptoru P2Y12, patří do skupiny cyklopentyltriazolpyrimidinů. Je velmi rychle absorbován z gastrointestinálního traktu, proto dosahuje rapidně svého protidestičkového efektu, který je větší a stabilnější než efekt clopidogrelu. Jeho plasmatická koncentrace je závislá na dávce a v čase stabilní (Husted and van Giezen 2009). Ticagrelor je metabolizován enzymy cytochromu P450 3A a má pouze jeden známý aktivní metabolit, jehož koncentrace je asi třetinová ve srovnání s původní látkou, nicméně aktivace není podmínkou k jeho protidestičkovému efektu (van Giezen and

24

Humphries 2005). Maximální koncentrace dosahuje za 2-4 hodiny již po prvním podání. Cangrelor patří do skupiny ATP analogů, je vysoce specifický. Účinek nastupuje velmi rychle (v řádu minut) a stejně tak rychle i odeznívá (T1/2 je jen 3–5 minut). Ve srovnání s inhibicí destiček po thienopyridinech, po podání cangreloru dochází až ke 100% inhibici agregace ve srovnání s pouze 60 % inhibicí způsobenou thienopyridiny (Leonardi, Mahaffey et al. 2012).

5. Protidestičková léčba Protidestičková léčba tvoří jednu z hlavních a důležitých terapeutických metod v kardiologii. Díky jejímu rozvoji byl následně možný i rozvoj dalších postupů v léčbě i prevenci pacientů s ischemickou chorobou srdeční, ale i v léčbě a prevenci pacientů s ischemickou chorobou dolních končetin a cévní mozkové příhody. 5.1. Terapie aspirinem Aspirin má prokázaný efekt jak v primární, tak sekundární prevenci. 5.1.1. Akutní koronární syndrom Efektivita aspirinu u akutního koronárního syndromu je potvrzena čtyřmi kontrolovanými dvojitě zaslepenými studiemi (Lewis, Davis et al. 1983) (Cairns, Gent et al. 1985) (Theroux, Ouimet et al. 1988) (Wallentin 1991). První z nich byla Veterans Administration Cooperative Study, kam bylo randomizováno 1266 pacientů k léčbě 325 mg aspirinu či placebu, dále byli sledováni 3 měsíce. Došlo k 51% snížení rizika kardiovaskulární mortality i kombinovaného endpointu ve skupině s aspirinem ve srovnání s placebem (Lewis, Davis et al. 1983). Další studie potvrdila efekt aspirinu u pacientů s akutním koronárním syndromem již při dávce 75 mg denně (Wallentin 1991). Definitivní potvrzení významné role aspirinu v léčbě pacientů s aterosklerotickou nemocí přinesla velká studie ISIS-2 (The Second International Study of Infarct Survival). Srovnávala mortalitu 17187 pacientů po akutním infarktu myokardu, kteří

25

byli randomizováni do 4 ramen: aspirin 160 mg denně, streptokináza, kombinace obou a placebo. Při 5-ti týdenním sledování aspirin snížil mortalitu ze 13,2% ve skupině léčené placebem na 10,7% (23% redukce rizika). Kombinace byla nejúčinnější, vedla k poklesu mortality o 8% (Baigent, Collins et al. 1998). 5.1.2. Sekundární prevence „Antiplatelet Trialists´ Collaboration“ je metaanalýza šesti velkých randomizovaných studií s aspirinem a dalších 190 a obsahovala data od 135 000 pacientů. U pacientů s anamnézou IM (19 000) bylo prokázáno snížení vaskulárního rizika ze 17% na 13,5%. Stejně tak terapie aspirinem vedla ke snížení vaskulárního rizika u pacientů s nestabilní anginou pectoris (ze 13,3% na 8%), se stabilní AP (angina pectoris) (ze 14,1% na 9,9%) a po revaskularizaci (z 5,5% na 2,7%). Byl zde potvrzen i fakt, že dávky aspirinu kolem 75-150 mg denně mají stejný účinek při nižším riziku krvácení než dávky vyšší (Antithrombotic Trialists 2002). 5.1.3. Primární prevence Studií s aspirinem užívaného v rámci prevence je celkem pět (Peto, Gray et al. 1988) (Hansson, Zanchetti et al. 1998) (de Gaetano 2001). Žádná z nich nepotvrdila pokles mortality nebo snížení rizika cévní mozkové příhody, nutno ovšem podotknout, že ani jedna z nich neměla pro tento druh analýzy statistickou sílu. Metaanalýza těchto studií potvrzuje snižení rizika kardiovaskulární příhody při terapii aspirinem (OR 0,85), ale při zvýšeném riziku velkého necerebrálního krvácení (OR 1,69) (Sanmuganathan, Ghahramani et al. 2001). Význam podávání aspirinu přetrvává i v éře léčby PCI. Pro přesvědčivá data z výše uvedených studií je aspirin stále doporučován všem pacientům s akutním IM (STEMI i NSTEMI) při prvním kontaktu s lékařem v dávce 150 -300 mg p.o. nebo 80-150 mg i.v. (Steg, James et al. 2012) (Hamm, Bassand et al. 2011). Stejně tak je indikován u všech pacientů

26

s chronickou ICHS a stabilní AP (Montalescot, Sechtem et al. 2013).

5.2. Terapie clopidogrelem Velká studie srovnávající monoterapii aspirinem s monoterapií clopidogrelem byla provedena pouze jedna, další vždy srovnávaly již duální protidestičkovou léčbu s monoterapií aspirinem či clopidogrelem. 19000 pacientů po infarktu myokardu, ischemické cévní mozkové příhodě či s ischemickou chorobou dolních končetin bylo zařazeno do studie CAPRIE (Clopidogrel versus Aspirin in Patients at Risk of Ischemic Events Trial). Její výsledky potvrdily snížení relativního rizika velkých vaskulárních příhod (IM, CMP a vaskulární smrti) u pacientů léčených clopidogrelem ve srovnání s aspirinem o 8,7%. Největší přínos clopidogrelu byl potvrzen u nejrizikovějších pacientů. Terapie clopidogrelem ve srovnání s aspirinem byla nejen účinnější, ale i lépe tolerována (Committee 1996). 5.3. Duální protidestičková léčba 5.3.1. Aspirin + clopidogrel Bez rozvoje duální protidestičkové léčby (nejprve v kombinaci s ticlopidinem, poté spíše s clopidogrelem) by nebyl možný ani rozvoj perkutánních koronárních intervencí, které posunuly léčbu pacientů s akutním koronárním syndromem o velký krok kupředu. Zavedení duální léčby významně redukovalo riziko trombotických komplikací PCI a výrazně zlepšilo výsledky koronárních intervencí. 5.3.1.1. Perkutánní koronární intervence Před tím, než byly thienopyridiny zařazeny do standartní léčby pacientů po implantaci koronárního stentu, byli pacienti ohroženi významným rizikem trombózy stentu. Toto riziko se sice mírně snížilo při následném podávání antikoagulační terapie heparinem, bylo však vykoupeno zvýšením rizika krvácení a prodlužovalo hospitalizaci pacientů po PCI (Sigwart,

27

Puel et al. 1987). Po zavedení duální protidestičkové léčby aspirinu s ticlopidinem se riziko trombózy stentu významně zredukovalo, aniž by se zvyšovalo riziko krvácení (Lablanche, McFadden et al. 1996). Ticlopidin měl však stále nevýhodu v častém rozvoji nežádoucích účinků a to zejména neutropenie. Proto po objevu clopidogrelu byla provedena studie CLASSICS (The Clopidogrel Aspirin Stent International Cooperative Study), která srovnávala duální léčbu aspirinu s ticlopidinem s léčbou aspirinu s clopidogrelem, primárním endpointem bylo krvácení, neutropenie a trombocytopenie. Prokázala bezpečnost duální léčby s clopidogrelem (primární endpoint se vyskytl ve skupině s ticlopidinem v 9,1% ve srovnání se 4,6% ve skupině s clopidogrelem) a současně její efektivitu (MACE se v obou skupinách vyskytovaly srovnatelně – 0,9% vs. 1,2%) (Bertrand, Rupprecht et al. 2000). Na základě výsledků této studie se proto od duální protidestičkové léčby s ticlopidinem postupně přecházelo k bezpečnějšímu clopidogrelu. Další studie CREDO (Clopidogrel for the Reduction of Events During Observation) měla potvrdit přínos dlouhodbé 12-ti měsíční duální léčby u pacientů po PCI a současně přínos podání nasycovací dávky 300 mg clopidogrelu. Roční terapie snížila relativní riziko kombinovaného endopointu o 26,9%. Nasycovací dávka podaná 3 hodiny před PCI nesnížila v měsíčním follow-upu riziko rozvoje endpointů, ale subanalýza potvrdila přínos nasycovací dávky podané s větším předstihem než 3 hodiny (Steinhubl, Berger et al. 2002). 5.3.1.2. Akutní koronární syndrom Přínos clopidogrelu u pacientů s akutním koronárním syndromem sledovala studie CURE (Clopidogrel in Unstable Angina to Present Recurrent Events). Ve srovnání s monoterapií aspirinem snižovala duální antiagregační léčba výskyt následných kardiovaskulárních příhod o 20%. Příznivý trend přetrvával po celou dobu ročního sledování (Yusuf, Zhao et al. 2001). 2658 pacientů ze studie CURE podstoupilo PCI. Ta potvrdila lepší prognózu pacientů, kteří byli clopidogrelem předléčeni a následně léčeni po dobu 12 měsíců ve srovnání s pacienty,

28

kterým byl clopidogrel podán až po PCI a terapie trvala pouze 4 týdny. Riziko kardiovaskulární smrti a infarktu myokardu se snížilo o 31% (Mehta, Yusuf et al. 2001). Další dvě studie byly provedeny u pacientů se STEMI. Studie CLARITY-TIMI (Clopidogrel asAdjunctive Reperfusion Therapy – Thrombolysis in Myocardial Infarction) randomizovala pacienty léčené kombinací aspirin + fibrinolýza+heparin do větve s nasycovací dávkou clopidogrelu následovanou udržovací dávkou clopidogrelu nebo do větve s placebem. U pacientů léčených clopidogrelem došlo ke snížení výskytu kombinovaného endpointu nebo opakované ischemie o 20% (Sabatine, Cannon et al. 2005). Důležitost clopidogrelu potvrdila i studie COMMIT/CCS2 (Clopidogrel and Metoprolol in Myocardial Infarction Trial), protože přidání clopidogrelu k aspirinu snížilo relativní riziko smrti, infarktu myokardu či cévní mozkové příhody o 9% (Chen, Pan et al. 2005). 5.3.1.3. Primární prevence Duální antiagregační léčba se studovala i u pacientů s vysokým rizikem aterotrombotické příhody v rámci primární prevence. Výsledky ukazuje studie CHARISMA (Clopidogrel for High Atherothrombotic Risk and Ischemic Stabilization, Management and Avoidance). Sledováno bylo přes 15000 pacientů léčených buď samotným aspirinem nebo duální antiagregační terapií, primárním endpointem byl výskyt infarktu myokardu, cévní mozkové příhody a kardiovaskulárního úmrtí včetně krvácení. Výskyt endpointů se v jednotlivých skupinách nelišil (7,3 % vs. 6,8%, p=0,22), ani samostatné riziko jednotlivých příhod nebylo ve skupině s clopidogrelem nižší. Naopak byla duální léčba spojena s vyšším rizikem krvácení (Bhatt, Fox et al. 2006). Výsledky byly vysvětlovány zejména prokazatelně vyšší aktivitou destiček v průběhu akutního koronárního syndromu. Proto z účinnější duální protidestičkové léčby profitovali spíše symptomatičtí pacienti s větší predispozicí k ruptuře či erozi aterosklerotického plátu, kdy riziko trombózy převyšovalo riziko krvácení. Z tohoto důvodu není duální protidestičková léčba v rámci primární prevence doporučována.

29

5.3.2. Aspirin + nové protidestičkové léky Nově se do popředí dostávají další dva ADP antagonisté – prasugrel a ticagrelor. Studie TRITON-TIMI 38 (Trial to Assess Improvement in Therapeutic Outcomes by Optimizing Platelet Inhibition With Prasugrel-Thrombolysis in Myocardial Infarction 38), která zařadila více jak 13000 pacientů po PCI jak pro AKS či stabilní AP potvrdila další snížení rizika MACE v průběhu terapie prasugrelem ve srovnání s clopidogrelem (9,9% vs. 12,1%; HR 0,81; 95 % CI 0,71 - 0,96; p < 0,001), což bylo ale spojeno s mírně zvýšeným rizikem krvácení (2,4 % nemocných u prasugrelu oproti 1,8 % u clopidogrelu; HR 1,32; 95 % CI 1,03 - 1,68; p = 0,03) zejména u starších pacientů, pacientů s anamnézou cévní mozkové příhody či s váhou pod 60 kg (2,4% vs. 1,8%) (Montalescot, Wiviott et al. 2009). Důvodem byl jistě rychlejší nástup účinku prasugrelu a jeho vyrovnanější působení ve srovnání s clopidogrelem. Stejně tak byl potvrzen lepší efekt léčby ticagrelorem ve srovnání s clopidogrelem ve studii PLATO (Prospective Randomized Platelet Inhibition and Patient Outcomes), kam bylo zařazeno přes 18 000 pacientů. Ve studii bylo prokázáno snížení rizika ischemické příhody o 1,9 % (relativní snížení o 16 %) u pacientů léčených ticagrelorem ve srovnání s clopidogrelem, zajímavé je, že byla snížena i celková mortalita nemocných. Léčba ticagrelorem měla stejný přínos pro nemocné léčené invazivně i pro nemocné léčené konzervativním způsobem. Významný pokles rizika ischemickych příhod byl prokazatelný nejen v prvních 30 dnech po koronární příhodě, ale dále narůstal mezi 31–360. dnem (HR = 0,80, 95 % CI 0,70–0,91). Závažné krvácení bylo při léčbě clopidogrelem i ticagrelorem stejně pravděpodobné. Díky reverzibilnímu charakteru účinku měli nemocní léčení ticagrelorem trend k nižšímu výskytu krvácení při kardiochirurgické operaci. Avšak spontánni závažné krvácení bylo o významných 19 % častější při léčbě ticagrelorem. Podobně jako v případě prasugrelu, je i léčba ticagrelorem spojena s několikanásobně vyšším výskytem

30

fatálních intrakraniálních krvácení (Cannon, Harrington et al. 2010). Ve světle těchto studií jsou nové protidestičkové léky u akutního koronárního syndromu upřednostňovány před clopidogrelem (Hamm, Bassand et al. 2011) (Steg, James et al. 2012) a clopidogrel je ponechán pro stavy stabilní ICHS při intoleranci aspirinu (Montalescot, Sechtem et al. 2013) .

6. Rezistence na aspirin a clopidogrel Řada prací již v minulosti potvrdila, že odpověď na léčbu aspirinem či clopidogrelem je značně variabilní (Serebruany, Steinhubl et al. 2005). Nicméně jaký „typ variability“ je klinicky významný není zatím jasné. Variabilita destičkové odpovědi je komplexní děj, který utváří mnoho proměnných: jak je aktivita destiček měřena, jak definujeme špatnou odpověď či vyšší odpověď destiček, odlišná reaktivita destiček na jednotlivé agonisty, lékové interakce, genové polymorfismy (Sadanandan and Singh 2012). Obecně stav zhoršené odpovědi destiček při léčbě nazýváme rezistence, rezistence na aspirin nebo rezistence na clopidogrel. Rezistenci můžeme rozdělit na a) laboratorní, kdy pomocí laboratorních metod identifikujeme vyšší reaktivitu destiček i přes adekvátní antiagregační terapii a b) klinickou, kdy dochází právě k rekurenci ischemických příhod i přes plnou antiagregační terapii (bez vysvětlení patofyziologického mechanismu) (Hankey and Eikelboom 2006) (Kuliczkowski, Witkowski et al. 2009) (Mehta and Mohandas 2010). Takto odlišovat tyto dva typy rezistence je velmi důležité, protože laboratorní rezistence, tj. vyšší reaktivita destiček při antiagregační terapii ještě nemusí znamenat, že dojde k recidivě kardiovaskulárních příhod. Dle etiologie rezistenci dělíme na a) rezistenci z klinických příčin, b) rezistenci z buněčných příčin a c) rezistenci z genetických příčin. V literatuře lze nalézt mnoho studií, které potvrdily, že rezistentní pacienti s akutním koronárním syndromem (jak se STEMI či NSTEMI) mají horší prognózu než pacienti

31

s dobrou odpovědí na antiagregační terapii (Matetzky, Shenkman et al. 2004) (Cuisset, Frere et al. 2006). Podobná data jsou známa i u pacientů, kteří prodělali PCI pro stabilní AP (Muller, Besta et al. 2003). Stejné závěry nalézáme i u podskupiny pacientů s implantovaným lékovým stentem (Buonamici, Marcucci et al. 2007). Také metaanalýza 14 prospektivních studií popsala souvislost horší prognózy pacientů se zvýšenou reziduální destičkovou aktivitou (Sofi, Marcucci et al. 2010). V podstatě nemáme ani standartní metodu ke zjištění rezistence a používáme různé cut off hodnoty. Jednou z metod, jak definovat rezistenci a tím vyselektovat rezistentní pacienty je laboratorní změření dané populace pacientů. Odpověď na antiagregancia stanovená některou z laboratorních metod jeví v populaci klasickou gausovskou distribuci a jako rezistentní označíme ty, kteří mají hodnotu daného testu v posledním kvartilu hodnot nebo vzdálenou více než dvě směrodatné odchylky od průměrné hodnoty souboru. K posouzení síly vztahu mezi laboratorním výsledkem a klinickým dopadem se většinou používá ROC (receiver operating characteristics) analýza. Pomocí této analýzy můžeme zjstit, zda daný test dovede predikovat sledovanou klinickou událost, jaká je síla daného laboratorního testu a jaká je optimální cut-off hodnota s nejlepší možnou senzitivitou, specificitou, pozitivní a negativní prediktivní hodnotou. Pouze několik studií provedlo takovou analýzu s testy destičkové aktivity. Angiolillo et al. studoval vztah mezi destičkovou aktivitou indukovanou ADP a měřenou pomocí LTA a incidencí kombinovaného endpointu (smrt, IM, CMP) u pacientů s ICHS léčených clopidogrelem. Dle ROC analýzy byla optimální cut off hodnota 62% maximální agregace se senzitivitou 46% a specificitou 84% a z toho vyplývající nízkou pozitivní prediktivní hodnotu 41% a negativní prediktivní hodnotu 86% (Angiolillo, Bernardo et al. 2011). Price et al. zjišťoval asociaci mezi PRU měřeným pomocí VerifyNow a trombotickými komplikacemi u pacientů s implantovaným lékovým stentem a výskytem primárního endpointu v 6-ti měsíčním follow-upu. Dle ROC analýzy byla

32

ideální cut off hodnota 235 PRU, což odpovídá horní třetině populace. Tato hranice byla stanovena se 78% senzitivitou a 69% specificitou. Nicméně míra výskytu endpointu byla jen 2,3%, takže pozitivní prediktivní hodnota byla pouze 5,8% (Price, Endemann et al. 2008). Tyto studie jsou příkladem toho, jaké výzvě čelí všechny testy stanovující destičkovou aktivitu, aby byly schopny adekvátně stratifikovat pacienty dle endpointů, které se vyskytují pouze v malém procentu. Fakt, že zatím rezistenci nejsme schopni ani přesně definovat, natož ji i přesně měřit je jistě dán tím, že rezistence je velmi komplexní děj, který bude jen velmi těžké vyjádřit jednou laboratorní hodnotou. Nicméně fakt, že určitá skupina pacientů má horší prognózu i přes adekvátní léčbu protidestičkovými léky a že tuto skupinu alespoň nějakým způsobem můžeme definovat a měřit destičkovou odpověď je natolik závažný, že tímto tématem má cenu se zabývat. Abychom mohli rezistenci laboratorně co nejpřesnějí definovat, ideálně bychom měli získat vzorek před a po nasazení léčby a měli bychom porovnávat změnu. To je v praxi bohužel velmi obtížné, většinou se nám podaří získat vzorek pouze až po nasazení léčby. V praxi proto používáme pouze změřenou hodnotu po nasazení léčby bez odečtu od základní baseline hodnoty před nasazením terapie. Tato hodnota se nazývá on- treatement platelet reactivity (Aradi, Komocsi et al. 2010). 6.1. Rezistence na aspirin Aspirinová rezistence nemá přesnou definici. Na jedné straně vyjadřuje neschopnost aspirinu inhibovat destičky, na druhé straně popisuje v podstatě klinické selhání léčby při terapii aspiriem. Ani prevalence rezistence není známá. Dle jednotlivých studií se liší od 5% do 60% (Michos, Ardehali et al. 2006). Aspirinovou rezistencí se nicméně zabývalo několik prospektivních studií (Chen, Lee et al. 2004) (Gum, Kottke-Marchant et al. 2001) (Wang, Aucoin-Barry et al. 2003) (Zimmermann, Wenk et al. 2003) (Eikelboom, Hirsh et al. 2002),

33

které stanovily incidenci aspirinové rezistence ve značně širokém intervalu (od několika procent do několika desítek procent) a popsaly různé klinické i buněčné faktory ovlivňující odpověď na aspirin (viz dále). Tato značná variabilita je jistě dána stanovením aspirinové rezistence různými metodami (PFA-100, Ultegra Rapid,..) ve značně rozdílných populacích pacientů (s AKS, po kardiochirurgické operaci, se stabilní ICHS,..). 6.1.1. Rezistence z klinických příčin Nejsnáze vysvětlitelná příčina rezistence je noncompliance pacienta nebo špatné dávkování lékařem (Bhatt 2004) (Califf, DeLong et al. 2002). Dále je to špatná absorbce či lékové interakce. Efekt aspirinu může snižovat např. ibuprofen, který se váže a kompetuje tak na vazebném místě pro aspirin, čímž může limitovat jeho kardioprotektivní účinek (CatellaLawson, Reilly et al. 2001). Další prosté vysvětlení rezistence je ovlivnění efektivity aspirinu věkem a váhou. Maree et al. popsal horší odpověď na aspirin u mladších pacientů s vyšší hmotností (Maree, Curtin et al. 2005). Ve studii Gumm et al. měli horší odpověď na aspirin ženy a nekuřáci (Gum, Kottke-Marchant et al. 2001). Srdeční selhání se poměrně často vyskytuje u pacientů indikovaných k terapii aspirinem a může také vést k horší odpovědi destiček na léčbu (Serebruany, Malinin et al. 2003). Hyperglykemie zvyšuje oxidativní stres, který se také může podílet na rezistenci (Csiszar, Stef et al. 2002). Rovněž u hypercholesterolemie byl popsán změněný efekt protidestičkové terapie aspirinem (Osmancik, Bednar et al. 2007) (Szczeklik, Musial et al. 1996). Bednar et al. měřil efekt aspirinu v časném pooperačním období u pacientů podstupující CABG (aortokoronární bypass) stanovením suprese tromboxanu A2 a pomocí MULTIPLATE. Do 5. pooperačního dne dosáhlo efektivní odpovědi na aspirin pouze 34% pacientů (Bednar, Tencer et al. 2012). Je také popisován horší efekt aspirinu po použití mimotělního oběhu v důsledku zvýšeného obratu destiček (Zimmermann, Kurt et al. 2005).

34

6.1.2. Rezistence z buněčných příčin Rezistence na terapii aspirinem byla potvrzena při nedostatečné supresi destičkové COX-1 nebo při nadměrné expresi COX-2 mRNA destičkami nebo endoteliálními buňkami (Weber, Zimmermann et al. 1999) (Zimmermann, Wenk et al. 2003). Byla popsána např. zvýšená aktivita COX-2 v destičkách u pacientů po CABG. Současně po CABG dochází ke zvýšené tvorbě nových destiček (neinhibovaných aspirinem) v důsledku stimulace hematopoézy COX2. Stejně významná je jistě i zvýšená cirkulace TNF a dalších interleukinů po operaci, což může také stimulovat expresi COX-2 (Zimmermann, Wenk et al. 2003). Jiná práce popisuje zvýšení exprese F2 isoprostanů měřených jako PGF2αisomer a 8-iso PGF2α v moči. Tyto iso-eikosanoidy vznikají neenzymatickou peroxidací volnými radikály z arachidonové kyseliny a indukují vazkonstrikci a zvýšenou citlivost destiček na agonisty agregace (Davi, Guagnano et al. 2002). 6.1.3. Rezistence z genetických příčin Genetické příčiny aspirinové rezistence jsou zmapovány o mnoho méně než clopidogrelové rezistence. Jedním z popsaných polymorfismů ovlivňující rezistenci k aspirinu je polymorfismus pro gen receptoru GP IIb/IIIa PLA1/A2. GP IIIa je vysoce polymorfní protein s destičkovým antigenem 1 (PLA1) a 2 (PLA2). V alele PLA2 dochází k záměně cytosinu za thymidin v exonu 2, čímž dojde ke změně prolinu za leucin na pozici 33 GP IIIa. Takto modifikovaný receptor ve větší míře váže fibrinogen a zvyšuje tím destičkovou agregaci, čímž dochází k horší odpovědi na aspirin (Michelson, Furman et al. 2000). Integrin GP Ia/IIa je destičkový membránový repceptor pro kolagen. Pokud dojde k polymorfismu genu pro tento receptor na pozici 807T(873A), dojde ke změně denzity těchto receptorů na povrchu destičky a tím i ke změně odpovědi na kolagen (Kunicki, Kritzik et al. 1997). Z dalších polymorfismů ovlivňujících odpověď na aspirin můžeme zmínit polymorfismus von Willebrandova faktoru nebo single nucleotide polymorfismus genu pro receptor

35

P2Y1(Jefferson, Foster et al. 2005). V roce 2008 byla prezentována studie, která shrnula výsledky 31 prací o genetickém ovlivnění resistence na aspirin. Bylo popsáno 50 polymorfismů v 11 genech. Polymorfismus PL A1/A2 genu pro GPIIIa receptor byl nejčastější polymorfismus spojený s resistencí na aspirin (OR 2,36, 95% CI 1,24- 4,49; p = 0,009). Naopak polymorfismy genů pro COX-1, GPla, P2Y1 nebo P2Y12 nebyly spojeny s horší odpovědí na aspirin (Goodman, Ferro et al. 2008). 6.2. Rezistence na clopidogrel Prevalence clopidogrelové rezistence zjištěná zejména pomocí optické agregometrie má stejně jako aspirinová rezistecne značně široké rozmezí, a to od 5% do 44% (Angiolillo, Fernandez-Ortiz et al. 2005) (Kuliczkowski, Witkowski et al. 2009). Pokud je rezistence diagnostikována pomocí VASP, je její prevalence 30% (Aleil, Ravanat et al. 2005). Dle metaanalýzy z roku 2007 můžeme identifikovat horší odpověď na léčbu clopidogrelem u každého pátého pacienta podstupujícího PCI (Snoep, Hovens et al. 2007). Tato variabilita vzniká jistě v důsledku různorodých definic rezistence, řady možných testovacích možností, existenci preanalytických a analytických chyb, heterogenitou studovaných skupin pacientů a neexistencí dané cut off hodnoty (Kuliczkowski, Witkowski et al. 2009). Vlivem clopidogrelové rezistence na prognózu pacientů se zabývalo mnoho studií s rozdílným profilem pacientů – byli to pacienti s NSTEMI (Cuisset, Frere et al. 2006), stabilní AP (Breet, van Werkum et al. 2010), nestabilní AP (Aradi, Konyi et al. 2008), pacienti po PCI kmene levé koronární tepny (Migliorini, Valenti et al. 2009) nebo pacienti s implantovaným lékovým stentem (Sibbing, Braun et al. 2009). Metaanalýza 20 studií zabývajících se rezistencí na clopidogrel popsala 32,3% prevalenci vysoké destičkové aktivity při protidestičkové terapii, nicméně dle měření různými metodami, s různou cut off hodnotou a časem odběru. Vysoká destičková aktivita byla asociována s trojnásobně zvýšeným rizikem

36

nefatálního IM (OR 3,00 [2,26-3,99], p<0,00001), čtyřnásobně zvýšeným rizikem trombózy stentu (OR 4,14 [2,74-6,25], p<0,0001) a pětinásobně vyšším rizikem kombinovaného ischemického endpointu (OR 4,95 [3,34-7,34], p<0,00001). Důležité také je, že pacienti s vyšší destičkovou aktivitou měli čtyřnásobně zvýšené riziko kardiovaskulární mortality (OR 3,35 [2,39-4,70], p<0,00001) (Aradi, Komocsi et al. 2010). Naproti tomu výsledky naší studie a několika dalších vliv laboratorně změřené zvýšené destičkové aktivity při protidestičkové léčbě na prognózu pacientů popírají (Paulu, Osmancik et al. 2013) (Buch, Singh et al. 2007) (Price, Berger et al. 2011) 6.2.1. Rezistence z klinických příčin V úvodu je nutno zmínit, stejně jako u aspirinu, nejsnáze vysvětlitelnou příčinu rezistence a to noncompliance pacienta či špatné dávkování léku. Z dalších příčin je to například variabilita v absorbci (Taubert, Kastrati et al. 2004). U clopidogrelu jsou velmi často zmiňované různé lékové interakce. Neustále je zkoumána otázka komedikace inhibitory protonové pumpy (IPP). IPP jsou často předepisovány společně s protidestičkovou léčbou ke snížení rizika krvácení do gastrointestinálního traktu. Faktem je, že mění pH v žaludku, a tím mohou ovlivňovat vstřebání nejen clopidogrelu, ale i jiných léků (Robinson and Horn 2003). Současně je důležité, že jsou nejen substrátem, ale i inhibitory CYP2C19 (Furuta, Ohashi et al. 1998) (Li, Andersson et al. 2004). To znamená, že pacienti s defektní alelou CYP2C19 mají nejen horší odpověď na clopidogrel, ale i vyšší hladinu omeprazolu. Na jedné straně máme studie, které popisují vztah mezi komedikací IIP a horší prognózou pacientů (Ho, Maddox et al. 2009) (Juurlink, Gomes et al. 2009), jiné studie toto vyvracejí (Kwok and Loke 2010) (Bhatt, Cryer et al. 2010). Z metaanalýzy studií, která zahrnovala téměř 160 000 pacientů vyplynulo, že současná terapie IPP s clopidogrelem zvyšuje relativní riziko kombinovaného kardiovaskulárního endpointu o 29% a riziko IM o 31% ve srovnání s terapií bez IPP, nicméně celková mortalita není ovlivněna (Siller-Matula,

37

Jilma et al. 2010). Příčina je nejspíše v inhibici CYP2C19, který je současně zodpovědný za bioaktivaci clopidogrelu v játrech. Některé IPP, zejména omeprazol nebo lanzoprazol, jsou silnými inhibitory, některé, např. pantoprazol či esomeprazol, naopak slabými. Proto recentní Guideliness Evropské kardiologické společnosti indikují IIP u pacientů se zvýšeným rizikem krvácení nebo s anamnézou již proběhlého krvácení (Steg, James et al. 2012). Z dalších léků, u kterých se studoval vliv na efektivitu clopidogrelu je nutné zmínit statiny. Atorvastatin a simvastatin jsou metabolizovány CYP3A4. Některé studie popisují redukci protidestičkového efektu clopidogrelu (Neubauer, Gunesdogan et al. 2003) (Lau, Waskell et al. 2003), některé studie však tento vliv popírají (Mitsios, Papathanasiou et al. 2004) (Serebruany, Midei et al. 2004). Dalším klinickým ukazatelem, který ovlivňuje odpověď na antiagregační terapii clopidogrelem je hyperglykemie nebo diabetes mellitus. Několika studiemi bylo prokázáno, že pacienti s anamnézou diabetu mají zvýšenou reaktivitu destiček při antiagregační terapii (jak s aspirinem, tak s clopidogrelem) a tudíž jsou více rezistentní (DiChiara, Bliden et al. 2007) (Osmancik, Bednar et al. 2007). Hyperglykemie vede ke zvýšené expresi P-selektinu, zvyšuje agregaci indukovanou leukocyty a zvyšuje vazbu fibrinogenu (Sudic, Razmara et al. 2006). In vitro studie ukazují, že inzulin redukuje agregaci destiček inhibicí na P2Y12 receptorech závislé agregaci. V podstatě jsou lidské trombocyty ovlivňovány inzulinem, který se váže na jejich povrchu a snižuje aktivitu Gi. To způsobí snížení cAMP, který poté inhibuje přenos přes P2Y12 receptory (Ferreira, Mocking et al. 2006). Další mechanismus, který u pacientů s diabetem může snižovat destičkovou inhibici je zvýšená expozice ADP a vyšší koncentrace kalcia v cytosolu (Ferreira, Eybrechts et al. 2004) 6.2.2. Rezistence z buněčných příčin U odpovědi na clopidogrel může hrát roli interindividuální variabilita P2Y12 receptorů, různý počet receptorů na povrchu destičky či různé uvolňování ADP a jistě také alternativní

38

cesty aktivace destiček (Wang, Bhatt et al. 2006). 6.2.3 Rezistence s genetických příčin Genetické polymorfismy proteinů ovlivňující absorbci a metabolismus clopidogrelu můžeme nalézt asi v 15 až 20 procentech případů a jsou silně spojeny se špatnou prognózou (Campo, Parrinello et al. 2011). CYP2C9 se účastní jaterní biotransformace clopidogrelu na jeho aktivní metabolit a je potvrzeno, že může také ovlivnit efektivitu účinku clopidogrelu (Gremmel, Kopp et al. 2013), ačkoli je tento gen spojen spíše s metabolismem warfarinu. Asi u 85% populace můžeme najít funkční alelu CYP2C9, nejčastější LOF (loss of function) alelami jsou CYP2C9*2 a *3 (Gremmel, Kopp et al. 2013). Studiemi bylo potvrzeno, že fenotyp této LOF alely je spojen s vyšší reaktivitou destiček a tudíž s nižší efektivitou clopidogrelu. CYP2C19 ovlivňuje dvě po sobě jdoucí oxidace při bioaktivaci clopidogrelu. Pokud se zpomalí první z nich, dojde k přesměrování chemické reakce směrem ke vzniku neaktivního metabolitu. Bylo zjištěno, že toto probíhá právě u nositelů polymorfismu CYP2C19*2 (c.681 G>A) (Mega, Close et al. 2009). Z toho vyplývá, proč nositelé tohoto polymorfismu (zejména *2, ale i *3) mají 1,5 až 2x vyšší riziko MACE. Tento fakt byl potvrzen 5 velkými genetickými studiemi (Bauer, Bouman et al. 2011). Nositelé polymorfismu CYP2C19*2 mají vyšší i riziko trombózy stentu (2,7% vs. 0,8%, p=0,004) než ti, kteří tuto alelu nemají (Mega, Close et al. 2009). Nosičství CYP2C19*2 a CYP2C19*3 je dokonce spojeno s vyšší reaktivitou destiček i při podávání dvojnásobné dávky clopidogrelu (Jeong, Kim et al. 2010). Naopak existují tzv. „gain of function“ alely, které efekt clopidogrelu zvyšují. S tím je spojeno nejen vyšší riziko krvácení (HR =1,26; 95% CI 1,05- 1,50), ale i nižší výskyt kardiovaskulárních komplikací (HR =0,75; 95% CI 0,66 – 0,87). Nejčastější z nich je CYP2C19*17 (Zabalza, Subirana et al. 2012) (Dai, Chen et al. 2012). Donedávna se myslelo, že všechny polymorfismy genu pro receptor P2Y12 způsobují

39

pouze krvácivé komplikace a dochází pouze k mírné reverzibilní inhibici destiček, protože ADP je vázáno méně (Conley and Delaney 2003). Nicméně Lately et al. popsal 4 různé variace genu pro P2Y12 (nazval je H1-H4), 3 single nucleotide polymorfismy a jednu single nucleotide inserci. Potvrdil, že nosiči haplotypu H2 mají horší odpověď destiček na clopidogrel nejspíše v důsledku větší denzity receptorů na povrchu destičky (Fontana, Dupont et al. 2003). Bylo popsáno více než 30 různých single nucleotide polymorfismů genu pro CYP3A4 a 10 různých single nucleotide polymorfismů genu pro CYP3A5 (Lamba, Lin et al. 2002, Xie, Wood et al. 2004). Lau et al. popsal inverzní korelaci mezi aktivitou CYP3A a aktivitou destiček a definovali ve studované skupině jak nonrespondery, tak tzv. low respondery (Lau, Gurbel et al. 2004) Podobně byl popsán polymorfismus genu MDR-1 (nebo také nazývaný ABCB1) kódující P- glykoprotein. Byl popsán vztah mezi CT genotypem a sníženým vstřebáním clodpidogrelu ve srovnání s CC či TT genotypem, nicméně dlouhodobobá prognóza pacientů ovlivněna nebyla (Spiewak, Malek et al. 2009). Destičkový glykoprotein IIb/IIIa je membránový receptor pro fibrinogen a von Willebrandův faktor a hraje významnou roli v agregaci destiček. Strukturální základ polymorfismu PLA je změna jedné baze (thyminu nebo cytosinu), což vede ke změně aminokyseliny v pozici 33 na podjednotce GP IIIa: leucin u PLA1 nebo prolin u PLA2 (Newman, Derbes et al. 1989). V roce 1996 Weiss et al. objevil asociaci mezi akutní koronární trombózou a PLA2 polymorfismem genu kódující glykoprotein IIb/IIIa. V pozdějších letech byla prokázána asociace mezi tímto polymorfismem a IM s mnohočetným koronárním postižením (Abbate, Marcucci et al. 1998). V dalších studiích byl prokázán vztah mezi polymorfismem Pl A2/2 a horší dlouhodobou prognózou u pacientů po PCI. Polymorfismus Pl A1/2 tuto prognózu nezhoršoval, ovšem oba jsou asociovány

40

s obecnými trombotickými kardiovaskulárními komplikacemi (Galasso, Santulli et al. 2010) (Le Hello, Morello et al. 2007). Nicméně některé studie tyto výsledky zatím vyvrací (Simon, Verstuyft et al. 2009). Stále však platí, že nejvíce prozkoumanou alelou a také alelou, která je spojena s nejvyšším rizikem kardiovaskulárních komplikací při léčbě clopidogrelem je CYP2C19*2 a CYP2C19*3.

7. Možnosti měření účinnosti antiagregační terapie Od různých typů testů k měření aktivity destiček a účinnosti protidestičkové terapie očekáváme zejména možnost stratifikace pacientů podle rizika, ať už rizika krvácení nebo trombotických komplikací. K měření účinnosti antiagregační terapie bylo vyvinuto několik testů. Do první skupiny patří ty testy, kde dochází k aktivaci agregace některým z agonistů (např. LTA, VerifyNow, Multiplate, PlateletWorks). Do druhé skupiny patří ty testy, kde k aktivaci trombocytů dochází pomocí střižné síly (např. PFA-100, Impact Cone, INNOVANCE-PFA-P2Y). Do třetí skupiny řadíme testy, které aktivují destičky pomocí elektrické impedance (Chrono-Log Agregometr). Kromě toho je možné měřit přímo destičkové antigeny průtokovou cytometrií (VASP) nebo ELISA metodou měřit metabolity tromboxanu A2 v séru a v moči. Vedle toho se dá použít jako komplexního testu hemostázy tromboelastografie. 7.1. LTA (light transmission aggregometry) Přístroj na měření agregace se nazývá agregometr, je to v podstatě spektrofotometr a byl vynalezen už v roce 1960. Užívá se k měření vrozených a získaných defektů destiček, měření účinnosti thienopyridinů a inhibitorů GP IIb/IIIa. Podstatou je zachycení rozdílu opacity mezi plazmou bohatou na destičky (0% agregace- opacitní) a plazmou chudou na destičky (100 % agregace- čiré). Jak destičky agregují, plazma se „čistí“, čímž umožňuje větší průchod světla

41

(Cattaneo 2009). K vyšší senzitivitě měření je vhodné užít destičky promyté, aby byly odstraněny plazmatické proteiny, koagulační faktory, atd. Výsledek se zobrazí jako takzvaná křivka agregace, na které hodnotíme maximální amplitudu, změny tvaru a maxima v určitém bodě. Agregaci můžeme indukovat jak endogenními faktory (adrenalin, kolagen, trombin, ADP,…), tak exogenními (ristocetin, convulexin,..). K měření pomocí LTA je nutno užít velký vzorek plazmy, je to vyšetření časově a cenově náročné, vyžaduje velkou erudovanost provádějícího pracovníka. Existují také léky, které agregaci a tudíž i výsledek tohoto měření ovlivňují. Jsou to například beta-laktamová antibiotika, dipyridamol, některá fibrinolytika (např. FDP- kompetují s fibrinem o vazbu na destičky), dextran nebo některá anestetika (lidokain). Nevýhodou tohoto testu je nutnost velkého vzorku krve, značné erudice provádějícího a vysoká cena. 7.2 Verify Now (dříve Ultegra rapid platelet function analyzer, výrobce Accumetrics, USA) Verify Now je bed site metoda užívající se k měření efektu antiagregancií – aspirinu, thienopyridinů a GP IIb/IIIa antagonistů. K měření jsou potřebné kyvety vyplněné mikopartikulemi pokrytými fibrinogenem a agonisty agregace, které se liší podle antiagregancia, jehož aktivitu měříme (viz dále). Měří absorbci světelného paprsku vzorkem poté, co se aktivované destičky shlukují s fibrinogenem na mikropartikulích a tím se mění opacita vzorku (Malinin, Pokov et al. 2007). 7.2.1. Měření efektu IIb /IIIa antagonistů Jako agonista agregace se používá TRAP (trombinové receptory aktivující protein). Po přidání ke vzorku dochází k aktivaci destiček, které se vážou na mikropartikule a „vypadávají“ z roztoku. Velikost inhibice po podání inhibitorů se vyjadřuje jako procento inhibice ve srovnání se základním stavem – tj. PAU (platelet inhibition unit) = PAU po inhibici/PAU základu x 100. Výhodou je, že TRAP je velmi silný agonista, tudíž není výsledek ovlivněn současným užíváním jiných antiagregancií.

42

7.2.2. Měření efektu aspirinu V tomto případě se jako agonista agregace používá kyselina arachidonová. Procento inhibice destiček po podání aspirinu – ARU se nevyjadřuje jako procento základu, proto nepotřebujeme hodnotu ARU před podáním tohoto léku. Rezistence na aspirin se předpokládá při ARU větším než 550. Nevýhodou tohoto měření je, že hodnota ARU může být ovlivněna jinou protidestičkovou léčbou (thienopyridiny, GP IIb/IIIa antagonisty a inhibitory COX- NSAID). 7.2.3. Měření efektu thienopyridinů Pro měření aktivity thienopyridinů se jako agonista užívá ADP. Protože je v klinické praxi někdy velmi obtížné získat vzorek jak před, tak po podání thienopyridinů, umí VerifyNow navíc vytvořit tzv. baseline (tj. jakoby před podáním thienopyridinu) vzorek. Původní vzorek se rozdělí na dvě poloviny a k jedné polovině se přidá TRAP. Díky tomu, že je silný agonista agregace, překoná protidestičkový efekt thienopyridinů a tudíž se tato polovina vzorku může brát jako „základní“. Jistě právem je toto „vytvoření“ baseline hodnoty kritizováno s tím, že „TRAP základní vzorek“ zcela přesně neodpovídá skutečnému základnímu vzorku před podáním léku. Tento problém bychom však vyřešili pouze striktním odebíráním vzorku krve ještě před podáním antiagregancia. Výsledná hodnota se označuje jako PRU (platelet reactivity unit). Verify Now poté vypočítá dvě hodnoty- samotné PRU a tzv. PRU% (procento inhibice), což je PRU/BASE x 100. I zde hodnota PRU může být ovlivněna jako GP IIb /IIIa, tak inhibitory fosfodiesterázy (Price 2009). Výhoda měření pomocí Verify Now je jeho poloautomaticita, standardizace a možnost kalibrace. Nevýhodou je zejména velikost kivet, které nejsou často zcela naplněny a to, že vzorek se může srazit ještě před začátkem testu.

43

7.3. PFA-100 (Dade-Behring, Deerfield, IL) Tento test byl vyvinut pro screening destičkových defektů jako alternativa krvácivého času. Pro měření pomocí PFA-100 se užívá vzorek plné citrátové krve, který se udává do pohybu kapilárou pomocí vakua. Destičky jsou aktivovány střižnou silou a při průchodu malým lumen o průměru 150um pokrytým membránou s kolagenem a agonisty agregace dochází k postupné adhezi destiček na membránu. První adhezi destiček můžeme zaznamenat již za 15s od začátku testu, maximální adhezi asi za 45 s, agregáty destiček začínají obturovat lumen asi za 80 s a průtok se zastavuje cca za 110 s. Jako výsledek měření se udává tzv. CT – closure time, který udává čas do zastavení toku krve kapilárou (Price 2009) (Rand, Leung et al. 2003). CT může být ovlivněn a/ počtem destiček- hranice je asi 100x109, snížený počet destiček můžeme vykompenzovat zmenšením membrány; b/ hematokritem - hranice je 25%; c/ adhezivními receptory destiček; d/ von Willebrandovým faktorem - jeho snížení může zkrátit CT; e/ denní dobou - CT je nejkratší ráno, proto se také IM vyskytuje častěji v ranních hodinách f/ koncentrací antikoagulantů - vyšší koncentrace citrátu sodného prodlužuje CT nebo g/ krevní skupinou - krevní skupina 0 má nižší hladinu von Willebrandova faktoru (Kundu, Heilmann et al. 1995). Je velmi citlivý k detekci von Willebrandovy choroby a dalších těžkých defektů destiček jako Glanzmannovy trombastenie nebo Bernard-Soulierova syndromu. PFA-100 můžeme užít k měření rezistence jak na GP IIb /IIIa, aspirin i thienopyridiny, i když senzitivita měření rezistence thienopyridinů je touto metodou nízká (Hayward, Harrison et al. 2006). 7.4. Cone-and-Plate(let) Analyzer (IMPACT-R) (výrobce Siemens Healthcare Diagnostics, USA) Tato metoda měří agergaci destiček po jejich aktivaci střižnými silami. Může být použita k rychlé identifikaci vrozených a získaných destičkových defektů a poruch vWF, k detekci protrombogenních stavů s destičkovou hyperfunkcí či měření efektivity protidestičkové léčby.

44

Nicméně některé studie ukazují, že výsledky nejsou srovnatelné s jinými metodami a nekorelují s klinikou. 7.5. Plateletworks (Helena Laboratories, Beaumont, TX) Tato metoda se někdy užívá v kardiochirurgii. Je schopná měřit rezistenci jak na aspirin, thienopyridiny i GP IIb/IIIa antagonisty (Gurbel, Becker et al. 2007). Plný vzorek krve dodáme do komory obsahující ADP, kolagen či jiné agonisty. Neaktivované destičky jsou zadrženy a agregáty destiček jsou odfiltrovány. Poté můžeme stanovit počet agregátů a procento neaktivovaných destiček, z čehož můžeme určit efektivitu protidestičkové léčby. Tato metoda se ovšem v praxi neujala, protože její výsledky velmi málo korelují s chirurgickými endpointy (Lennon, Gibbs et al. 2004). 7.6. Chrono-Log Agregometr (Chronolog Corp., Havertown, PA) K měření aktivace destiček užívá elektrickou impedanci ke stanovení jak efektu aspirinu, tak thienopyridinů. Do plného vzorku krve vložíme dvě elektrody a změříme impedanci před a po podání agonistů agregace. Impedance se po přidání agonisty zvýší. Pokud je impedance vyšší než 3 ohmy, musíme pomyslet na rezistenci na léčbu antiagregancii. Tento test je rychlý, levný, nevyžaduje velkou technickou zručnost a měření se provádí ze vzorku plné krve. 7.7 Tromboelastogram (TEG) (Hemoscope Corporation, NIles, IL) Je komplexní test, založený na měření změn viskoelastických vlastností krve během tvorby krevního koagula; graficky znázorňuje proces polymerizace fibrinu. V klinické praxi umožňuje kompletní bedsite posouzení procesu tvorby a stability krevního koagula, a také následné fibrinolýzy. Užívá se v kardiochirurgii i jiných chirurgických oborech k upřesnění susbtituce srážecími faktory a trombokoncentráty. Může se použít k měření efektu aspirinu, thienopyridinů i GP IIb/IIa antagonistů, nicméně existuje pouze velmi málo studií, kde by byl použit k predikci klinických endpointů.

45

7.8. S- tromboxan B2, U- dehydrotromboxan Zjistilo se, že vyšší koncentrace těchto látek v séru a v moči je spojena s vyšším rizikem kardiovaskulárních příhod (Montine, Sonnen et al. 2010). Přetrvávající koncentrace těchto látek v séru nebo v moči při terapii aspirinem byly přijaty jako jeden z diagnostických kritérií pro aspirinovou rezistenci (Dalen 2007). Koncentrace U- dehydrotromboxanu > 67,9 ng/mmol bývá také spojována s rezistencí na aspirin. Tento typ měření však není vhodný používat, protože existuje i mimodestičkový zdroj tromboxanu A2.

8. Možnosti ovlivnění účinnosti protidestičkové léčby Jak vyplývá z etiologie rezistence, možností, jak se pokusit ovlivnit rezistenci na protidestičkovou léčbu, je několik. Je možné změnit komedikaci, která ovlivňuje vstřebání či metabolismus antiagregačních léků, můžeme stabilizovat hladiny glukózy a cholesterolu, pacientovi doporučíme přestat kouřit či snížit hmotnost. Jako další možnost se nabízí úprava dávky léku. U clopidogrelu byla potvrzena efektivita úpravy dávkování u nasycovací dávky, která má urychlit nástup účinku clopidogrelu rychlým navozením inhibice. Zpočátku se používala nasycovací dávka 300 mg. Studie PCI-CLARITY prokázala efekt podání nasycovací dávky clopidogrelu 300 mg, kdy ve skupině pacientů s nasycovací dávkou došlo k signifikantní redukci kombinovaného endpointu ve 30-ti denním follow upu (3,6% vs. 6,2%; OR 0,54 [0,35-0,85], p =0,008) aniž by došlo ke zvýšení rizika krvácení (2% vs. 1,9%; p>0,99) (Sabatine, Cannon et al. 2005). V dalším výzkumu bylo zjištěno, že nasycovací dávka 600 mg je účinnější než původních 300 mg. U pacientů, kteří před PCI dostali nasycovací dávku 600 mg namísto 300 mg došlo ke snížení rizika kardiovaskulárního endpointu z 12% na 4% (p=0,041) zejména díky snížení rizika periprocedurálního IM (Patti, Colonna et al. 2005) (Montalescot, Sideris et al. 2006). Naproti

46

tomu nasycovací dávka 900 mg má oproti dávce 600 mg vyšší účinek laboratorní, avšak patrně již ne klinický (Montalescot, Sideris et al. 2006). Navýšení udržovací dávky clopidogrelu bylo v poslední době studování mnoha klinickými studiemi, z nichž největší je asi studie GRAVITAS. Ta nepotvrdila přínos zdvojnásobení denní chronické dávky clopidogrelu u pacientů s vyšší reaktivitou destiček při protidestičkové léčbě (OTPR). Primární endpoint za 6 měsíců (smrt z kardiovaskulárních příčin, nefatální IM, trombóza stentu) se vyskytoval bez statisticky významného rozdílu v obou skupinách se standartní i navýšenou dávkou (2,3% vs. 2,3%) (Price, Berger et al. 2011). Vysvětlením může být fakt, že navýšení dávky clopidogrelu vede sice ke zlepšení laboratorního efektu clopidogrelu, který se však již nezpůsobí klinický efekt. Podobné výsledky byly dosaženy i ve studii OPTIMUS, kdy po navýšení chronické dávky clopidogrelu na 150 mg došlo sice k signifikantnímu zvýšení destičkové inhibice (p < 0,002), ale suboptimální efekt clopidogrelu stále přetrvával u 60 % pacientů ve skupině (Angiolillo, Shoemaker et al. 2007). Na úrovni kazuistik bylo popsáno dosažení dostatečné odpovědi na clopidogrel u rezistentních pacientů záměnou clopidogrelu za ticlopidin, to je způsobeno nejspíše tím, že ticlopidin se metabolizuje přes jiný isoenzym cytochromu P450 (Neubauer, Lask et al. 2008). V neposlední řadě je nyní po zavedení nových protidestičkových léků možná i záměna clopidogrelu za prasugrel či ticagrelor.

47

V. PRAKTICKÁ ČÁST Tato kapitola shrnuje výsledky mé práce. Má několik podkapitol. Ta první podrobně popisuje přesnou metodiku práce. Druhá detailně prezentuje výsledky. Je rozdělena na několik částí. První část se zabývá incidencí rezistence na clopidogrel v reálné praxi, to znamená v souboru konsekutivních pacientů tak, jak byli postupně hospitalizováni na naší klinice. Popisuje faktory (a to jak klinické, laboratorní či genetické), které by mohly souviset s rezistencí na clopidogrel a podle kterých bychom mohli rezistenci u pacientů v reálné praxi predikovat. Druhá část popisuje možnost ovlivnění laboratorní rezistence na clopidogrel u pacientů se standartní dávkou navýšením dávky clopidogrelu na dvoj- či trojnásobek. Třetí část shrnuje výsledky mé práce, kde jsme se zabývali prognózou pacientů léčených clopidogrelem. Snahou bylo definovat faktory, které by souvisely s horší prognózou pacientů. Zaměřila jsem se na faktory klinické, ale i laboratorní (včetně laboratorního stanovení účinku clopidogrelu pomocí VerifyNow), serologické či genetické.

48

1. Metodika 1.1. Zařazení pacientů Tato práce byla provedena jako prospektivní observační studie. Byli zařazeni konsekutivní pacienti, tj. všichni pacienti, kteří byli hospitalizováni na naší klinice za 36 měsíců, podstoupili PCI a byli indikováni k duální protidestičkové terapii dle doporučení České a Evropské kardiologické společnosti. Do studie byli zařazeni pacienti podstupující PCI jak pro akutní koronární syndrom (STEMI, NSTEMi či nestabilní anginu pectoris), tak pacienti podstupující koronarografii elektivně, kde PCI byla provedena na základě výsledku vyšetření. Potřeba duální protidestičkové terapie byla vedle podepsání informovaného souhlasu jediným vstupním kritériem. Vylučovací kritéria byly: a. plánovaný kardiochirurgický zákrok (aortokoronární bypass dle rozhodnutí indikačního semináře Kardiocentra FNKV) b. předpokládáná délka přežití kratší jeden rok z nekardiálních příčin (CHOPN, onkologické onemocnění, atd.) c. noncompliance pacienta d. podání inhibitoru GP IIb/IIIa; do studie byli zařazeni pouze pacienti, kteří dostali během PCI intrakoronární bolus eptifibatidu; kontinuální i.v. podání eptifibatidu po PCI či jakékoli podání abciximabu pacienty vylučovalo z účasti ve studii e. dlouhodobá léčba clopidogrelem před PCI f. koagulopatie s vysokým rizikem krvácení (jaterní cirhóza, hematologické onemocnění, atd.) Nezbytnou součástí zařazení do studie bylo podepsání informovaného souhlasu, který byl stejně jako celá studie schválen Etickou komisí FNKV. 1.2. PCI a protidestičková léčba Průběh koronarografie a PCI, stejně tak typ implantovaného stentu a podání GP IIb/IIIa

49

bylo ponecháno plně na provádějícím intervenčním kardiologovi. Všichni pacienti zařazení do studie dostali nasycovací dávku 600 mg clopidogrelu během PCI nebo méně než dvě hodiny před PCI. Pokud jim nebyla nabídnuta účast v podstudii s navyšováním dávky, následovala chronická léčba 75 mg clopidogrelu denně. Pokud pacienti nebrali chronicky aspirin, bylo před PCI také aplikováno 500 mg i.v. aspirinu. Standartní postup byl také dodržován při podání heparinu, dávka před a během PCI byla 70-150 IU/kg. Délka protidestičkové léčby závisela na diagnóze, pro kterou byla PCI prováděna (akutní koronární syndrom x elektivní PCI) a na komedikaci (zejména potřebě chronické antikoagulace) a následovala standartní doporučení Kardiocentra FNKV vycházející z doporučení České a Evropské kardiologické společnosti. Pacienti s akutním koronárním syndromem stejně jako pacienti po implantaci lékového stentu (DES) byli léčeni duální protidestičkovou léčbou po dobu 6-12 měsíců. Pacienti po elektivní PCI s implantovaným kovovým (BMS) stentem byli léčeni clopidogrelem minimálně po dobu 4 týdnů. 1.3. Náběr vzorků Vzorky žilní krve byly pacientům odebírány maximálně do 24 hodin od provedení PCI, ne dříve než 2 hodiny po PCI, většinou ráno nalačno, vždy až po podání nasycovací dávky clopidogrelu. Z krve byly stanoveny standartní odběry – základní biochemické, hematologické a koagulační parametry dle zvyklostí Kardiocentra FNKV, další vzorky byly odeslány na genetické a serologické vyšetření. Efekt clopidogrelu byl stanoven pomocí testu VerifyNow ze dvou vzorků žilní krve (2 ml žilní krve antikoagulované citrátem sodným o koncentraci 0,109 mol/l v poměru 9/1). Dle doporučení výrobce byly vzorky před zpracováním ponechány maximálně 30 minut při pokojové teplotě. Testem VerifyNow s ADP jako agnonistou agergace byly stanoveny PRU, PRU BASE a PRU%. V případě, že první měření bylo přístrojem hlášeno jako chybné, parametry byly stanoveny z druhého vzorku.

50

1.4. Serologická analýza Pro serologické stanovení byly odebrány dva vzorky žilní krve (bez přidání jakékoli antikoagulace). Vzorky byly ponechány po dobu 10 minut, následně byly centrifugovány (15g po dobu 15 min), sérum bylo odpipetováno do zkumavek Eppendorf a uschováno v mrazáku v – 80°C. Analýza byla provedena pomocí ELISA metody, jak interleukin-10 tak CD40L byly měřeny komerčně dostupnými ELISA soupravami (RD Systems, Minneapolis, USA) pomocí ELISA Readeru Elx808 (Biotek, VT, USA). U prvních vzorků byla stanovena intra-assay coeficient of variation, která byla pro obě měřené molekuly ucházející (<5%). 1.5. Genetická analýza DNA byla z krevních vzorků izolována s užitím standardního spin-column protokolu. Po izolaci byly polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) amplifikovány cílové úseky DNA za použití specificky navržených primerů a v získaných fragmentech genotypizovány vybrané polymorfismy genů CYP2C19, CYP2C9, GPIIIa, GpVI, a MDR pomocí denaturační kapilární elektroforézy (DCE). Tato metoda umožňuje separaci DNA fragmentů za podmínek jejich částečné denaturace a její výhodou jsou nízké nároky na kvalitu a množství DNA a vysoká citlivost. Pro separaci byl použit 96ti kapilární sekvenátor (MegaBACE 1000, Amersham Biosciences, NJ). 1.6. Sledování pacientů Při zařazení do studie byly od pacienta získány jeho kontaktní údaje (adresa, telefonní číslo), případě kontaktní údaje na rodinné příslušníky. Pacient byl informován, že bude lékařem studie kontaktován za šest měsíců a za dvanáct měsíců. První klinická kontrola proběhla den po zařazení do studie, druhá v den propuštění. Byla zjišťována přítomnost ischemických endpointů a významného krvácení. Jako významné krvácení bylo označeno takové, které prodloužilo hospitalizaci, vynutilo si podání krevních derivátů či si vyžádalo další zákrok (endoskopický, intervenční, chirurgický).

51

Za 180 dní byli pacienti telefonicky kontaktováni. Pokud nebyl pacient dostupný, byla kontaktována rodina pacienta. Pokud ani tento kontakt nebyl možný, byl odeslán dopis. Při třicetidenní kontrole bylo zjišťováno: a. zda je pacient naživu b. zda byl od propuštění z našeho Kardiocentra někde hospitalizován c. zda prodělal od propuštění z našeho Kardiocentra infarkt myokardu, cévní mozkovou příhodu, re-PCI, aortokoronární bypass d. zda od propuštění z našeho Kardiocentra trpěl nějakým závažnějším krvácením (vyžadující hospitalizaci) Pokud byla zjištěna přítomnost endpointu, byla od pacienta vyžádána propuštěcí zpráva či zpráva o ošetření. Pokud ani poté nebyl jasný osud pacienta, byl pozván na ambulantní kontrolu k vyšetření a dojasnění. Stejné schéma bylo užito při dvanáctiměsíční kontrole. 1. 7. Zvyšování dávky clopidogrelu a záměna za ticlopidin Efekt clopidogrelu byl stanoven pomocí VerfyNow. V případě, že PRU dosahovalo hodnoty nad 240, byla těmto pacientům nabídnuta účast v podstudii se zvýšením dávky clopidogrelu. Po podepsání informovaného souhlasu s podstudií byli tito pacienti randomizování do skupiny A a B. Skupině B se ponechala standartní dávka clodpidogrelu 75 mg denně. Pacientům skupiny A byla ještě tentýž den navýšena dávka clopidogrelu na 2x75 mg denně a byli pozvání na kontrolu za 7 dní (ta proběhla již ambulantně nebo ještě za hospitalizace). Během ní byl opět odebrán vzorek krve a stanoveno PRU testem VerifyNow. Pokud již bylo PRU pod 240, byla ponechána dvojnásobná dávka. Pokud za 7 dní přetrvávalo PRU stále nad 240, byla dávka ještě zvýšena na 3x 75 mg denně a kontrola opět proběhla za 7 dní. Pokud i nadále bylo PRU nad 240, clopidogrel byl vyměněn za ticlopidin s dávkou 2x 250 mg denně. Všem pacientům zařazeným do podstudie (bez ohledu na dávku clopidogrelu či terapii ticlopidinem) byla hladina PRU zkontrolována při ambulantní návštěvě za 30 dní od

52

konečné změny dávky. Dále byli sledováni standartním způsobem dle protokolu studie. 1.8. Statistické zpracování dat Kontinuální proměnné byly nejprve testovány na normalitu rozložení pomocí Kolmogorova-Smirnova testu. Kontinuální proměnné s normální (gausovskou) distribucí jsou udávány jako průměr ± směrodatná odchylka, v případě negausovské distribuce pak jako medián s mezikvartilovým rozpětím. Srovnání kontinuální data mezi skupinami bylo prováděno pomocí Studentova, Wilcoxonovova či Mann-Whitney testu, dle typu distribuce dat. Kategorická data jsou v textu udávána jako absolutní počty s relativním zastoupením v procentech a byla statisticky testována pomocí χ2 či Fisherova testu. Korelace mezi proměnnými byla testována pomocí Spearmanova korelačního testu. Pro zjištění asociace mezi sledovanými klinickými či laboratorními proměnnými (ať již biochemickými, serologickými či genetickými) se sledovanými end-pointy byla nejprve provedena univariantní logistická regresní analýza. Klinické údaje, které byly testovány v univariantní analýze, byly věk, pohlaví, anamnéza IM, anamnéza předchozí revaskularizace, (PCI nebo CABG), hypertenze, kouření a diabetes mellitus. Další proměnné zahrnuté v univariantních analýzách byla medikace před přijetím a změřené hematologické a biochemické hodnoty (výsledky krevního obrazu, koagulace, renálních parametrů, jaterních enzymů, troponinu, vstupní glykémie, lipidogramu, výsledky genetiky, hodnoty CD40L a interleukinu-10). Proměnné, které byly mezi skupinami s a bez end-pointu signifikantně odlišné (p< 0,05) či jejichž rozdíl byl blízký statistické významnosti byly dále zahrnuty do multivariantní analýzy za účelem stanovení těch, které jsou nezávisle spojeny s výskytem end-pointu. Hodnota významnosti p < 0,05 byla považována za významnou. Veškerá data byla hodnocena pomocí programů SPSS verze 15.0 (SPSS Inc.,Chicago, Illinois) či SigmaSTAT (Aspire Software Int., Ashburn, VA, USA). Veškerá statistická analýza byla provedena statistikem se zkušeností v biomedicínské statistice.

53

2. Výsledky 2.1. Incidence rezistence na clopidogrel a faktory související s rezistencí na clopidogrel Celkem bylo zařazeno 378 konsekutivních pacientů s průměrným věkem 67,4 + 10,1, s hmotností 82,4 + 16,4 kg, výškou 171,0 + 10,1 cm a BMI 28,9 + 17,7. Ve skupině bylo 262 (69,3%) mužů a 116 (30,7%) žen. V celé skupině pacientů bylo přes 50% kuřáků či bývalých kuřáků (224 [59,3%]) a hypertoniků (223 [58,9%]). Asi třetina pacientů byli diabetici (116 [30,7%]), s hyperlipoproteinemií (110 [27,6%]). Čtvrtina měla anamnézu infarktu myokardu (99 [24,8%]). Charakteristika celého souboru pacientů je uvedena v Tabulce 1. Celý soubor pacientů byl rozdělen podle hodnoty PRU. Jako cut off hodnota byla stanovena hodnota 240. Pacienti, kteří měli PRU <240 byli označeni jako respondeři (R), tj. s odpovídající odpovědí destiček na léčbu clopidogrelem. Pacienti s PRU > 240 byli označeni jako non-respondeři (NR), tj. s horší odpovědí destiček na clopidogrel. Responderů bylo celkem 243 (64,3%), non- responderů 135 (35,7%). Samozřejmě pacienti s nižším PRU měli současně vyšší procento inhibice destiček (PRU%: R 40,9 + 36,5, NR 8,9 + 35,2, p<0,001). Po porovnání základních klinických a laboratorních ukazatelů je patrné, že non- respondeři jsou starší (R: 65,8 + 13,3, NR: 69,8 + 11,5, p = 0,003), jsou to častěji ženy (R: 63 [25,9%], NR: 53 [39,3%], p = 0,01), častěji trpí diabetem (R: 64 [26,3%], NR: 52 [38,5%], p = 0,019) a byli častěji léčeni umělou plicní ventilací (R: 2 [0,8%[, NR: 6 [4,4%], p = 0,028). Z laboratorních ukazatelů se liší hladinou hemoglobinu, kterou mají non- respondeři nižší (R: 140,7 + 24,6, NR: 132,3 + 22,7, p = 0,001), naopak počet leukocytů mají non- respondeři vyšší (R: 9,9 + 3,5, NR: 11,7 + 12,8, p = 0,04). Srovnání základních klinických a laboratorních ukazatelů je shrnuto v Tabulce 2 a v Tabulce 3. Tabulka 4 podává informaci o podávané medikaci v den zařazení do studie. Jak vyplývá z Grafu 1, hladina CD40L se u responderů a non- responderů nelišila. Naproti tomu se respondeři a non-respondeři lišili koncentrací interleukinu- 10 (R: 3,1+ 0,9, NR: 5,4+ 1,1, p = 0,001), podobně jako hladinou

54

leukocytů. Při srovnání přítomnosti námi zvolených genových polymorfismů je patrné, že repondeři a non-respondeři se liší pouze výskytem CYP2C19*2 – AA alely (R: 1 [0,4%], NR: 10 [7,4%], p < 0,001), naproti tomu incidencí CYP2C9*2 – TT, CYP2C9*3 – AC, CC a MDR1- TT se skupiny responderů a non- responderů neliší. Výsledky genetického vyšetření ukazuje Tabulka 5.

Tabulka 1: Základní charakteristika celého souboru pacientů

Věk

Celkem pacientů (n = 378) 67,4 + 10,1

Váha (kg)

82,4 + 16,4

Výška (cm)

171,0 + 10,1

Hypertenze, n(%)

223 (58,9).

St.p. IM, n (%)

99 (24,8)

St.p. CMP, n (%)

32 (8,0)

ICHDK, n (%)

26 (6,5)

Hyperlipoproteinemie, n (%)

110 (27,6)

Diabetes mellitus, n(%)

116 (30,7)

Nikotinismus, n(%)

224 (59,3)

55

Tabulka 2: Základní klinická charakteristika responderů a non- responderů

Respondeři (n=243)

Non- respondeři (n=135)

P

Věk

65,8 + 13,3

69,8 + 11,5

0,003

Mužšské pohlaví, n (%) BMI

180 (74,1)

82 (60,7)

0,01

29,2 + 21,8

28,5 + 4,8

n.s.

STEMI, n (%)

101 (41,6)

58 (43,0)

n.s.

NSTEMI, n (%)

94 (38,7)

45 (33,3)

n.s.

Chronická ICHS, n (%) Diabetes mellitus, n (%) DM na inzulinu, n (%) Kouření, n (%)

48 (19,8)

32 (23,7)

n.s.

64 (26,3)

52 (38,5)

0,019

19 (8)

17(13)

0,16

152 (62,6)

72 (53,3)

0,101

Hypertenze, n (%)

143 (58,8)

80 (59,3)

n.s.

Anamnéza IM, n (%)

70 (28,8)

31 (23,0)

n.s.

Anamnéza CABG či PCI, n (%) Anamnéza CMP, n (%) EF levé komory (%)

83 (38,3)

44 (34,1)

n.s.

18 (7,4)

13 (9,6)

n.s.

49,5 + 11,9

47,6 + 12,3

n.s.

Umělá plicní ventilace, n (%)

2 (0,8)

6 (4,4)

0,028

56

Tabulka 3: Základní laboratorní charakteristika responderů a non- responderů

Respondeři

Non- respondeři

(n=243)

(n=135)

Hemoglobin (mmol/l)

140,7 + 24,6

132,3 + 22,7

0,001

Thrombocyty (x109/l)

225,4 + 63,6

225,2 + 59,3

n.s.

Leukocyty (x109/l)

9,9 + 3,5

11,7 + 12,8

0,04

Kreatinin (µmol/l)

92,9 + 54,4

100,4 + 54,9

n.s.

Urea (mmol/l)

7,7 + 16,5

9,1 + 17,7

n.s.

Glykémie (mmol/l)

7,4 + 3,3

7,9 + 3,6

n.s.

ALT (µkat/l)

0,97 + 2,2

1,1 + 2,3

n.s.

AST (µkat/l)

1,7 + 3,2

1,9 + 2,6

n.s.

Cholesterol (mmol/l)

4,7 + 1,2

4,8 + 1,2

n.s.

P

57

Tabulka 4: Medikace podávaná v den zařazení u responderů a non-responderů

Respondeři

Non-respodneři

(n = 243)

(n = 135)

Betablokátory

92 (37,9%)

57 (42%)

n.s.

ACEI

119 (49%)

66 (49%)

n.s.

Statiny

97 (40%)

42 (31%)

n.s.

IIP

35 (14%)

27 (20%)

0,18

P

Graf 1: Srovnání hladiny leukocytů a koncentrace IL-10 u responderů a nonresponderů

25

Interleukin-10

Leukocyty

20 20

P<0.05

P<0.05

15

10

10

5 0

0

respondeři

nerespondeři

respondeři

nerespondeři

58

Tabulka 5: Zastoupení sledovaných genetických polymorfismů ve skupině responderů a non- responderů

Respondeři

Non- respondeři

(n=243)

(n=135)

CYP2C19*2 – AA

1 (0,4 %)

10 (7,4 %)

<0,001

CYP2C9*2 – TT

1 (0,4 %)

2 (1,5 %)

n.s.

CYP2C9*3 – AC, CC GP III – CT, CC

33 (13,6 %)

15 (11,1 %)

n.s.

47 (19,3 %)

28 (20,7 %)

n.s.

MDR1- TT

52 (21,4 %)

28 (20,7 %)

n.s.

P

2.1.1. Multivariantní analýza S každým zjištěným parametrem byla provedena univariantní analýza. Parametry, které měly v této analýze prognostický význam, tj. ty, které se stastisticky významně lišily v jednotlivých skupinách (anebo se ke statistické významnosti blížily), byly podrobeny multivariantní analýze. Byly to věk, pohlaví, diabetes mellitus, kouření, umělá plicní ventilace, hodnota hemoglobinu, hladina leukocytů, IL-10 a CYP2C19*2 – AA. Paramtery, které vyšly nezávisle spojené s non-responderstvím byly a) vyšší věk (OR 1,03 [1,01-1,05], p<0,05) b) vyšší hmotnost (OR 1,02 [1,01-1,03], p<0,05) c) diabetes mellitus (OR 2,2, [1,7-5,5], p<0,05) d) ženské pohlaví (OR 1,9 [1,1-3,1], p<0,05) e) vyšší hodnota leukocytů (OR 1,1 [1,05-1,7], p<0.05)

59

f) vyšší koncentrace IL-10 (OR 1,29 [1,03-1,60], p<0.05) g) přítomnost alely AA genu CYP 2C19*2 (OR 1,8 [1,2-3,2],p<0,05) h) mechanická ventilace (OR 8,2 [1,9-74,8], p<0,05). 2.1.2. Diskuze V naší studii jsme rozhodnutí, zda pacienti dobře odpovídají na léčbu clopidogrelem, tj jsou respondeři, či neodpovídají na léčbu clopidogrelem, tj. patří do skupiny non-responderů, provedli na základě měření inhibice destiček metodou VerifyNow. Dle řady studií lze pomocí aktivity destiček při terapii clopidogrelem měřené pomocí VerifyNow stratifikovat riziko recidivy ischemického endpointu (Brar, ten Berg et al. 2011) (Aradi, Komocsi et al. 2010) (Price, Endemann et al. 2008) (Marcucci, Gori et al. 2009). Cut off hodnota PRU, která dle mnoha prezentovaných studií nejlépe rozděluje pacienty na respondery a non- respondery, je hodnota 235-240. ROC analýza, kterou provedl Price et al. ukázala, že cut off hodnota PRU 235 je schopna predikce následných MACE, kdy negativní prediktivní hodnota při takto dopočteném cut-off byla 99%, z toho vyplývá, že pacienti s hodnotou PRU pod 235 byli pouze v minimálním riziku MACE. Pacienti s PRU nad 235 měli během následujících 6 měsíců signifikantně vyšší riziko jak trombózy stentu, IM, tak i kardiovaskulární mortality. Cut-off hodnota PRU odpovídala zhruba hranici horní třetiny PRU hodnot sledovaného souboru (ta byla na hodnotě PRU 231) (Price, Endemann et al. 2008). Marcucci et al. stanovili jako optimální hraniční hodnotu PRU 240, kdy byla senzitivita testování 61%, specificita 70%, negativní prediktivní hodnota 96% a pozitivní prediktivní hodnota 12%. Pacienti s PRU nad 240 měli 2,5 x vyšší riziko úmrtí či re-IM během následujících 12 měsíců (Marcucci, Gori et al. 2009). Proto i v naší studii byla zvolena hodnota PRU 24O jako hodnota, která rozděluje skupinu pacientů na respondery s předpokládanou lepší prognózou a non-respondery s předpokládanou horší prognózou. Z našich výsledků dále vyplývá, že věk, hmotnost, pohlaví a přítomnost diabetu ovlivňují

60

efektivitu clopidogrelu ve smyslu horší inhibice destiček. K podobným závěrům došly i mnohé dříve publikované studie (DiChiara, Bliden et al. 2007) (Breet, van Werkum et al. 2010) (Cuisset, Frere et al. 2009). V těchto studiích však nebyl zmíněn vliv mechanické ventilace na efektivitu clopidogrelu, nicméně není úplně neznámý (Osmancik, Jirmar et al. 2010). Vyšší aktivita destiček u pacientů na mechanické ventilaci může souviset jednak s horší gastroduodenální motilitou pacientů na UPV, která vede k horšímu vstřebávání clopidogrelu (Heyland, Tougas et al. 1996), což ještě zhoršuje podávání opiátů během nutné sedace pacientů na UPV. Katecholaminy, které se běžně podávají u nestabilních pacientů na UPV, zvyšují aktivitu destiček a tím mohou přispívat k horší efektivitě clopidogrelu (Schedel, Schloss et al. 2008). Vyšší efektivita clopidogrelu byla paradoxně popsána u kuřáků (Motovska, Widimsky et al. 2009). I naše výsledky ukazují vyšší procento kuřáků u responderů, nicméně pouze v univariantní analýze. V multivariantní analýze jsme tuto korelaci nepotvrdily. Vliv podávání IPP na efektivitu clopidogrelu se v naší studii neprokázal. Skupina responderů a non-responderů se nelišila podáváním IPP v den PCI. Nicméně v našich datech nebylo blíže specifikováno podání určitého IIP (např. omeprazolu). Stejně jako v mnoha jiných studiích, přítomnost alely AA genu CYP 2C19*2 predikovala horší odpověď na léčbu clopidogrelem a byla signifikantně častější u non-responderů (Mega, Close et al. 2009) (Simon, Verstuyft et al. 2009) (Bauer, Bouman et al. 2011), nicméně jedna studie zahrnující přes 5000 pacientů tento již běžně přijímaný fakt vyvrací (Pare, Mehta et al. 2010) a vysvětluje to nepřítomností randomizované kontrolní skupiny, což může vyústit v přehlédnutí pleiotropního účinku „loss of function“ alel. Přítomnost polymorfismu CYP2C9*3, který se spíše účastní metabolismu warfarinu, se v naší studii neukázala jako významná stejně jako v mnoha jiných studiích (Mega, Close et al. 2009), nicméně i tento fakt není příjímán stoprocentně (Gremmel, Kopp et al. 2013). Podobně je tomu i v případě

61

přítomnosti polymorfismu genu MDR1, kdy v našich výsledcích se neliší skupina responderů a non-responderů signifikantně rozdílnou přítomností polymorfismu genu MDR1, ale není tomu tak úplně ve všech studiích (Spiewak, Malek et al. 2009). Zánět hraje významnou roli v rozvoji a prognóze akutního koronárního syndromu. Je známo, že pro- a protizánětlivá odpověď organismu je komplexní proces, který musí být v rovnováze. Akutní koronární syndrom zvyšuje zánětlivý stav organismu, do kterého patří leukocyty, CRP nebo IL-6. Aby bylo zabráněno nadměrné reakci, jako odpověď na zvýšenou hladinu prozánětlivých mediátorů, se současně vyplavují do organismu i protizánětlivé mediátory, ke kterým patří například IL-10. Hladina leukocytů u pacientů s AKS léčených duální protidestičkovou léčbou ovlivňuje jejich prognózu (Ndrepepa, Braun et al. 2009) (Turner, Ketch et al. 2008). Podobně byl popsán vztah mezi hladinou CRP v době podání clopidogrelu a clopidogrelovou rezistencí měřenou pomocí agregometrie (Ge, Zhou et al. 2012). Tyto studie potvrzují naše zjištění, že non-respondeři mají signifikantně vyšší hladinu leukocytů. Podobně jsme prokázali i signifikantně vyšší hladinu protizánětlivého IL-10 ve skupině non-responderů. V některých studiích bylo popsáno, že hladina IL-10 je signifikantně vyšší u pacientů s IM (Yip, Youssef et al. 2007), nicméně vztah mezi prognózou pacientů s AKS a hladinou protizánětlivých parametrů zatím jednotně popsán nebyl. 2.1.3. Závěr Ve skupině 378 konsekutivních pacientů indikovaných k duální protidestičkové léčbě bylo 35% procent pacientů, kteří měli zhoršenou odpověď na clopidogrel vyjádřenou nižší inhibicí destiček měřenou pomocí VerifyNow a popsanou pomocí PRU. Takoví pacienti byli popsáni jako non-respondeři. Jako faktory, které jsou nezávisle spojené s non-responderstvím jsme označili vyšší věk, větší hmotnost, ženské pohlaví, diabetes mellitus, hladinu leukocytů a IL-10, přítomnost alely AA genu CYP 2C19*2 a nutnost umělé plicní ventilace.

62

2.2. Možnost ovlivnění rezistence na clopidogrel navýšením chronické dávky Testování pomocí VerifyNow bylo provedeno u 378 pacientů. Z tohoto souboru bylo 134 (35%) identifikováno jako non-respondeři, tj. pacienti s hodnotou PRU nad 240. Těmto 134 pacientům byla nabídnuta účast v podstudii s navyšováním chronické dávky clopidogrelu. 60 z nich (44%), kteří splňovali přísnější kritéria do zařazení do této podstudie, souhlasilo se zařazením a podepsalo informovaný souhlas. Obálkovou metodou byli randomizováni do skupiny A (s titrováním dávky dle PRU) a skupiny B (ponechání standartní dávky). Do obou skupin byl zařazen stejný počet pacientů, tj. 30. Jak je patrné z Tabulky 6, skupiny se v základních klinických a laboratorních parametrech statisticky významně nelišily. Byli to pacienti starší kolem 65 let (A: 65 + 11 let, B: 66 + 12 let, p = 0,47), s vyšším BMI (A: 28,6 + 6,1, B: 30 + 5,2, p = 0,14). Téměř ¾ trpělo hypertenzí (A: 21 [70%], B 19 [63%], p = 0,58), třetina z nich měla diabetes (A: 9 [30%], B: 9 [30%], p = 1,0) a kouřila (A: 12 [40%], B: 10 [33%], p = 0,59). Procento pacientů s ICHS (ať už se stabilní AP, nestabilní AP, po infakrtu myokardu či PCI nebo po CABG) bylo v rozmezí od 17% do 43%. Pacienti se nelišili ani hladinou hemoglobinu (A: 137 + 16 g/l, B: 136 + 27 g/l, p = 0,68) či počtem trombocytů (A: 220 + 62 x106, B: 231 + 51 x106, p = 0,48). Při zařazení se hodnota PRU v obou skupinách nelišila (A: 297+37, B: 306+45, p = n.s). Za 30 dní byla hodnota PRU ve skupině A signifikantně nižší než ve skupině B (A: 201+56, B: 277+36, p<0,001), což je znázorněno v Tabulce 7. Ve skupině A bylo dosaženo snížení PRU pod 240, tj. efektivního účinku clopidogrelu u 86% pacinetů, ve skupině B pouze u 20% pacientů. Jak je patrno z Grafu 2, snížení PRU ve skupině A bylo o více než 30 (A: 31,6 + 17,1, B: 13,2 + 9,4) s průměrným rozdílem 18,4% (95% CI: 11,3% - 25,5%, p < 0,001). U 14 pacientů (46%) ve skupině A bylo k dosažení účinné inhibice třeba více než 150 mg clopidogrelu/den, u zbylých 16 (54%) stačilo k dosažení účinné inhibice 150mg clopidogrelu/den.

63

Při šestiměsíční kontrole byla zjišťována přítomnost ischemického endpointu (smrt, reIM a CMP) a přítomnost krvácení. Ischemický endpoint se objevil ve skupině A u jednoho pacienta (3%) a ve skupině B u dvou pacientů (7%) (OR 0, 48; 95% CI: 0,04 – 5,6, p = 0,55). Pacient ve skupině A prodělal infarkt myokardu v důsledku léze na jiné koronární tepně, než pro kterou byla prováděna PCI při zařazení do studie. Pacienti ve skupině B prodělali re-infakrt myokardu při těžké restenoze dříve intervenované tepny. 2 pacienti ve skupině A a 2 pacienti ve skupině B prodělali krvácení, které se dle TIMI klasifikace významně nelišilo. Tyto výsledky jsou patrny z Tabulky 8. Tři pacienti ze skupiny A byli nositelé defektní alely AA genu CYP2C19. U dvou z nich se podařilo dosáhnout účinné inhibice PRU < 240 dávkou 150mg clopidogrelu/den, u třetího z nich nebylo dosaženo účinné inhibice ani dávkou 225mg/den. Z celé skupiny A nebylo dosaženo účinné inhibice u 4 pacientů, 3 z nich byli nositelé alely AA CYP2C19.

64

Tabulka 6: Základní charakteristika sledovaných pacientů s navýšením dávky

Skupina A

Skupina B

p

(n=30)

(n=30)

Věk

65+11

66+12

n.s.

Ženské pohlaví (%)

6 (20)

9 (30)

n.s.

BMI kg/ m2

28,6+6,1

30,0+5,2

n.s.

STEMI, n (%)

16 (43)

10 (33)

n.s.

NSTEMI, n (%)

8 (27)

12 (40)

n.s.

Chronická ICHS, n (%) Hypertenze, n (%)

6 (20)

8 (27)

n.s.

21(70)

19 (63)

n.s.

Diabetes, n (%)

9 (30)

9 (30)

n.s.

Kouření, n (%)

12 (40)

10 (33)

n.s.

eGFR < 60ml/min, n (%)

7 (23)

8 (27)

n.s.

Hemoglobin g/l

137+16

136+27

n.s.

Trombocyty 109/l

220+62

231+51

n.s.

PCI v anam., n (%)

6 (20)

8 (27)

n.s.

CABG v anam., n(%) LV EF %

5 (17)

4 (13)

n.s.

44+13

50+11

0,037

65

Tabulka 7: Změna PRU při 30ti- denní kontrole ve skupině A a B

Skupina A

Skupina B

P

PRU

201±56

277 ± 36

0,001

∆ PRU

31,6±17,1

13,2±9,4

0,001

PRU > 240, n

26 (86%)

6 (20%)

0,001

Graf 2: Změny PRU u pacientů s a bez navýšení dávky

400

350

PRU

300

250

200

150

skupina A skupina B

100 baseline

30 dnů

66

Tabulka 8: Výskyt ischemických endpointů a krvácení při šestiměsíční kontrole

Skupina A

Skupina B

P

MACE, n

1

2

0,55

Smrt, n

0

0

Re-IM, n

1

2

CMP, n

0

0

KRVÁCENÍ, n

2

2

TIMI minor, n

2

0

TIMI major, n

0

2

1,0

2.2.1. Diskuze V literatuře můžeme najít několik studií, které se zabývaly možností ovlivnění vysoké destičkové aktivity při terapii clopidogrelem navýšením dávky. Ne všechny se však zabývaly nejen laboratorním efektem navýšení dávky, ale také jeho následným klinickým dopadem. Některé z těchto studií jsou v souladu s našimi výsledky. Je to například práce Angiolilla et al., kdy po podání 150 mg clopidogrelu denně u 20 pacientů podstupujících elektivní PCI se za 30 dní signifikantně snížila aktivita destiček měřená pomocí LTA ve srovnání se skupinou, která dostávala chronickou dávku 75 mg denně (Angiolillo, Bernardo et al. 2008). Na druhou stranu můžeme najít i studie, které naše výsledky popírají. Studie OPTIMUS zařadila 40 pacientů s diabetes mellitus 2. typu indikovaných k duální protidestičkové léčbě. 20 pacientům byla ponechána standartní dávka clopidogrelu a 20 pacientům byla navýšena na 150 mg denně. Aktivita destiček byla měřena pomocí LTA. Za 30 dní došlo ve skupině s dvojitou dávkou k signifikantnímu snížení destičkové aktivity ve srovnání se skupinou

67

s chronickou dávkou 75 mg (p = 0,002), ale u 60% pacientů stále přetrvával suboptimální efekt clopidogrelu (Angiolillo, Shoemaker et al. 2007). Podobných výsledků bylo dosaženo v práci Parka et al., kdy bylo zařazeno 36 pacientů s renální insuficiencí a polovině byla navýšena dávka clopidogrelu na 150 mg denně. Aktivita destiček byla měřena pomocí VerifyNow. I v této studii došlo ke snížení aktivity destiček ve skupině s dvojnásobnou dávkou, nicméně i přes to byl efekt clopidogrelu stále nedostačující (Park, Kim et al. 2009) V naší práci bylo možno dosáhnout navýšením dávky clopidogrelu efektivního snížení PRU u 85% pacientů, u poloviny z nich však bylo nutno podávat dávky vyšší než 150mg/den. Skupina pacientů s navýšenou dávkou však i přes lepší laboratorní odpověď destiček na clopidogrel neměla nižší výskyt ischemických endpointů (ale ani vyšší výskyt krvácivých endpointů). Ve velké multicentrické studii GRAVITAS bylo testováno pomocí VerifyNow celkem 5429 pacientů. Jednalo se o pacienty po PCI, kteří byli léčeni nasycovací dávkou 600 mg clopidogrelu. Cut-off hodnota pro PRU v této studii byla 230, pacienti s vyšší hodnotou než 230 byli označeni jako rezistentní a byli randomizováni do skupiny se standardní dávkou (75mg/den) a vyšší udržovací dávkou (150mg/den) tohoto léku. PRU nad 230 bylo zjištěno u 2214 (40,8%) pacientů. Ze zbývajících 3215 s hodnotou PRU pod 230 bylo 586 sledováno jako kontrolní skupina. Zvýšení dávky na 150mg/den u randomizovaných rezistentních pacientů sice vedlo k poklesu PRU, ale nebylo spojeno s lepší prognózou oproti dávce 75mg/den (kde kontrolní PRU nekleslo). Navíc, pacienti hodnotou PRU nad 230 PRU měli ve srovnání s kontrolní skupinou s hodnotou PRU pod 230 srovnatelné riziko úmrtí, re-IM či trombózy stentu (Price, Berger et al. 2011). Důležité je, že navýšení dávky clopidogrelu vedoucí k lepšímu efektu clopidogrelu nevedlo k vyššímu výskytu krvácivých komplikací, které bylo popsáno ve studii CURRENT OASIS-7. V této studii bylo více jak 25000 pacientů rozděleno do čtyř skupin. V první skupině byli pacienti léčeni vysokou dávkou clopidogrelu (600 mg nasycovací dávka + 150mg udržovací dávka) a vysokou dávkou aspirinu (300 mg

68

denně). Ve druhé skupině byli léčeni vysokou dávkou clopidogrelu a nízkou dávkou aspirinu (100mg denně). Třetí skupiny tvořili pacienti s běžnou dávkou clopidogrelu (300 mg nasycovací dávky + 75mg udržovací) a vysokou dávkou aspirinu a poslední skupinu tvořili pacienti s běžnou dávkou clopidogrelu i aspirinu. Sledovaným endpointem byly jak ischemické příhody, tak krvácivé komplikace. Autoři neprokázali žádné rozdíly mezi sledovanými dávkami aspirinu. Dvojitá dávka clopidogrelu podávaná nemocným s AKS statisticky významně snížila výskyt infarktu myokardu a primárního kombinovaného cíle složeného z kardiovaskulárního úmrtí, infarktu myokardu a cévni mozkové příhody. Kardiovaskulární mortalita na dávce clopidogrelu ani ASA nezávisela. Pozitivní vliv na snížení primárního kombinovaného cíle byl překvapivě pouze v podskupině pacientů léčených vysokou dávkou ASA. Toto bylo vykoupeno vyšším výskytem velkých a těžkých krvácení definovaných v rámci studie (Mehta, Bassand et al. 2008). Studie RECLOSE ACS2 (The Responsiveness To Clopidogrel And Stent Thrombosis 2) zahrnovala 1789 pacientů po akutním koronárním syndromu a PCI. Všichni pacienti obdrželi vyšší dávku aspirinu (325 mg) a nasycovací dávku clopidogrelu 600 mg, následovanou udržovací dávkou 75 mg denně. Pacienti s prokázanou zvýšenou agregabilitou destiček (13,8 % celkového souboru) byli následně nastaveni na dávku clopidogrelu 150–300 mg či byl tento vyměněn za ticlopidin (500–1000 mg). Avšak ani poté se nezdařilo u 94 pacientů (5,3 % z celého souboru) dosáhnout efektivního účinku clopidogrelu Podobné výsledky jako naše studie přinesla i studie ACCEL – DOUBLE. Do ní bylo zařazeno 126 pacientů indikovaných k duální protidestičkové léčbě. Všem byla podávána dvojnásobná dávka clopidogrelu 150 mg denně. Nosiči alely CYP2C19 *2 nebo *3(n = 80) měli signifikantně vyšší na ADP závislou agregaci destiček než ti, kdo tuto alelu neměli (n = 46) (40.7 ± 16.8% vs. 30.3 ± 12.6%, p < 0.001; 54.2 ± 16.2% vs. 40.5 ± 15.8%, p < 0.001) (Jeong, Kim et al. 2010).

69

2.2.3. Závěr Zjistili jsme, že titrace dávky clopidogrelu pomocí měření PRU u pacientů s nedostatečnou odpovědí na clopidogrel v porovnání se standartní dávkou clopidogrelu vede ve většině případů k dostatečné inhibici destiček. Důležité je, že při zvýšení dávky clopidogrelu nedochází ke zvýšení rizika krvácení, nicméně i přes zlepšení laboratorní odpovědi na clopidogrel nedochází k ovlivnění prognózy pacientů. K selhání terapie i přes navýšení dávky clopidogrelu dochází zejména u nosičů alely AA CYP2C19 .

70

2.3. Stanovení prognózy pacientů s ischemickou chorobou srdeční indikovaných k duální protidestičkové léčbě pomocí klinických, laboratorních a genetických parametrů

U všech 378 pacientů, kteří byli zařazení do studie, byly provedeny 3 kontroly – v den propuštění, za 6 a 12 měsíců. Primární kontakt byl telefonický a zjišťovala se přítomnost endpointu – re-infarktu myokardu, cévní mozkové příhody, závažného krvácení vyžadujícího hospitalizaci a smrti. Dle přítomnosti endpointu při šestiměsíční kontrole byly vytvořeny dvě skupiny. První skupina (A) obsahovala pacienty s přítomným endpointem. V průběhu šesti měsíců byl u 30 pacientů (7,94%) zjištěn alespoň jeden z předem definovaných endpointů. 12 pacientů (3,17%) prodělalo infarkt myokardu, pět pacientů (1, 32%) ischemickou cévní mozkovou příhodu a 15 pacientů (3,97%) zemřelo. U dvou pacientů jsme zaznamenali kombinaci dvou endpointů – cévní mozková příhoda + smrt a infarkt myokardu + smrt. V tomto případě byl analyzován pouze první endpoint (cévní mozková příhoda resp. infarkt myokardu). Druhá skupina (B) obsahovala 348 (92,06%) pacientů bez endpointu v průběhu prvních šesti měsíců. Pokud jsme srovnali klinické parametry obou skupin zjistili jsme, že pacienti ve skupině s endpointem se lišili od pacientů bez endpointu pouze přítomností diabetes mellitus (A: 17 [56,7%] B: 99 [28,4%], p = 0,003) a anamnézou cévní mozkové příhody (A: 8 [26,7%] B: 23 [6,6%], p < 0,001). Porovnání klinických parametrů skupin s a bez endpointu je znázorněné v Tabulce 9. Při srovnání základních laboratorních ukazatelů obou skupin je patrné, že skupina pacientů s endpointem měla vyšší počet leukocytů (A: 14,4 + 25,6 x 109 B: 10,2 + 3,8 x 109, p = 0,006) a vyšší hladinu kreatininu (A: 121,4 + 67,8 B: 93,4 + 52,9, p = 0,008). Hraničně se obě skupiny lišily hodnotou ALT (A: 1,7 + 4,2 B: 0,9 + 1,9, p = 0,068) a urey (A: 14,1 + 35,1 B: 7,7 + 14,3, p = 0,051). Shrnutí laboratorních parametrů obou skupin je v Tabulce 10.

71

Podobně jsme srovnali i zastoupení námi zvolených polymorfismů (CYP2C19*2 – AA, CYP2C9*2 – TT, CYP2C9*3 – AC, CC, GP III – CC a MDR1 – TT). Statisticky hraničně významně se lišila pouze přítomnost CYP2C19*2 – AA, která byla vyšší u pacientů s endpointem (A: 3 [10%] B: 8 [2,29%], p = 0,066), viz Tabulka 12. Nejvýznamnějším zjištěním naší analýzy byl fakt, že skupiny s a bez endpointu se nelišily hodnotou PRU (A: 208,5 + 85,5 B: 203,1 + 91,3, p = 0,75) a PRU% (A: 20,6 + 22,9 B: 30,3 + 40,1, p = 0,23). Tyto výsledky jsou prezentovány Tabulkou 11 a Grafem 3.

72

Tabulka 9: Srovnání klinických parametrů skupin s a bez endpointu

End-point

Bez end-pointu

(n=30)

(n=348)

70,7 + 11,0

66,9 + 12,9

n.s.

Mužské pohlaví, n (%) 23 (76,7)

239 (68,7)

n.s.

BMI

26,6 + 4,0

29,1 + 18,4

n.s.

STEMI, n (%)

16 (53,3)

143 (41,1)

n.s.

NSTEMI, n (%)

8 (26,7)

131 (37,6)

n.s.

Chronická ICHS, n (%) DM, n (%)

6 (20,0)

74 (21,3)

n.s.

17 (56,7)

99 (28,4)

0,003

Kouření, n (%)

15 (50)

209 (60,1)

n.s.

Hypertenze, n (%)

18 (60)

205 (58,9)

n.s.

Anamnéza IM, n (%)

10 (33,3)

91 (26,1)

n.s.

Anamnéza CABG či PCI, n (%) Anamnéza CMP, n (%)

16 (53,3)

123 (35,3)

0,085

8 (26,7)

23 (6,6)

<0,001

EF levé komory %

46,2 + 11,3

49,0 + 12,1

n.s.

Věk

p

73

Tabulka 10: Srovnání základních laboratorních parametrů skupin s a bez endpointu

End-point

Bez end-pointu

p

(n=30)

(n=348)

Hemoglobin (mmol/l)

137,2 + 22,5

137,7 + 24,4

n.s.

Thrombocyty (x109/l)

226,0 + 92,1

225,2 + 58,9

n.s.

Leukocyty (x1012/l)

14,4 + 25,6

10,2 + 3,8

0,006

Kreatinin (µmol/l)

121,4 + 67,8

93,4 + 52,9

0,008

Urea (mmol/l)

14,1 + 35,1

7,7 + 14,3

0,051

Glykémie (mmol/l)

8,6 + 3,5

7,5 + 3,5

n.s.

ALT (µkat/l)

1,7 + 4,2

0,9 + 1,9

0,068

AST (µkat/l)

2,2 + 3,2

1,7 + 3,0

n.s.

Cholesterol (mmol/l)

4,4 + 1,5

4,7 + 1,6

n.s.

Tabulka 11: Porovnání hodnot PRU a PRU% ve skupině pacientů s a bez endpointu

End-point

Bez end-point

p

(n=30)

(n=348)

PRU

208,5 + 85,5

203,1 + 91,3

n.s.

PRU%

20,6 + 22,9

30,3 + 40,1

n.s.

74

Tabulka 12: Zastoupení sledovaných genových polymorfismů ve skupinách s a bez endpointů

End-point

Bez end-pointu

P

(n=30)

(n=348)

CYP2C19*2 – AA

3 (10 %)

8 (2,29 %)

0,066

CYP2C9*2 – TT

0 (0 %)

3 (0,9 %)

n.s.

CYP2C9*3 – AC, CC 5 (16,7 %)

43 (12,4 %)

n.s.

GP III – CC

1 (3,3 %)

11 (3,2 %)

n.s.

MDR1- TT

5 (16,7 %)

75 (21,6 %)

n.s.

Graf 3: Porovnání hodnot PRU a PRU% ve skupině pacientů s a bez endpointu

500

p = 0.23

60

400

300

40

200 20

100

0

0

End-point

Bez end-pointu

End-point

Bez end-pointu

75

PRU %

PRU

p = 0.75

2.3.1. Multivariantní analýza S každým zjištěným parametrem byla provedena univariantní analýza. Parametry, které měly v této analýze prognostický význam, tj. ty, které se statisticky významně lišily v jednotlivých skupinách (anebo se ke statistické významnosti blížily), byly podrobeny multivariantní analýze. Byla to přítomnost diabetu, anamnéza cévní mozkové příhody, hladina leukocytů, hodnota urey, kreatininu a ALT a přítomnost CYP2C19*2 – AA. Parametry, které vyšly nezávisle spojené s horší prognózou pacientů byly a) vyšší hladina leukocytů (OR 1,7 [1,2-2,4], p<0,01) b) vyšší hodnota kreatininu (OR 1,4 [1,1-2,5], p<0,05) c) hraničně přítomnost AA alely CYP2C19*2 (OR 2,5 [0,99-4,1], p=0,052). 2.3.2. Diskuze Mnohé studie se zabývaly prognózou pacientů v závislosti na hodnotě OTPR. Metaanalýza zahrnující téměř 10000 pacientů potvrdila vztah horší prognózy vyjádřené IM, trombózou stentu a kardiovaskulární smrtí a vyšší OTPR při léčbě clopidogrelem (Aradi, Komocsi et al. 2010). Tyto výsledky však s výsledky naší studie nemůžeme porovnat, protože metaanalýza hodnotila efektivitu léčby clopidogrelem pomocí různých metod (VerifyNow, LTA, VASP,..). Ani výsledky těchto metod nejsou zcela porovnatelné. Proto někteří pacienti identifikovaní jednou metodou jako rezistentní mohou být jinou metodou zařazeni do skupiny s dobrou odpovědí na léčbu. Stejně tak je nutné brát v úvahu i rozdílné skupiny pacientů (elektivní PCI, AKS, s implantovaným DES), čas odběru vzorku či velikost nasycovací dávky. I když se podíváme na jednotlivé studie zvlášť, jejich výsledky se liší. Serebruany et al. prezentoval výsledky práce, kdy efekt clopidogrelu byl změřen pomocí LTA u více než 500 pacientů indikovaných k antiagregační léčbě clodpiogrelem. Téměř 5% pacientů označili jako hyporespondery a téměř 5% pacientů jako hyperrespondery, kteří měli ovšem stejnou prognózu jako pacienti, kteří měli správnou odpověď na clopidogrel (Serebruany, Steinhubl et

76

al. 2005). Naproti tomu Blindt et al. měřil efekt clopidogrelové léčby pomocí VASP u 99 pacientů s vyšším rizikem trombózy stentu. U 9 pacientů s následně rozvinutou trombózou stentu byl zjištěna statisticky významně vyšší VASP- PRI (platelet reacitivty index). V multivariantní analýze byla hodnota VASP jediným nezávislým prediktorem rozvoje trombózy stentu. ROC analýza ukázala cut off hodnotu VASP-PRI pro stanovení prognózy (trombózy stentu) hodnotu 48% VASP-PRI (Blindt, Stellbrink et al. 2007). Podobně Bonello et al. stanovil pomocí ROC analýzy cut off hodnotu pro VASP- PRI 50% (Bonello, CamoinJau et al. 2008). V naší studii neměla hodnota PRU či PRU% u pacientů podstupujících PCI prognostický význam. Hodnota PRU byla velmi podobná mezi oběma skupinami a nebyl patrný ani trend vyšší hodnoty PRU u pacientů s MACE. Mnoho studií se snažilo prokázat prognostický význam PRU a PRU% u pacientů indikovaných k léčbě clopidogrelem (Marcucci, Gori et al. 2009) (Price, Endemann et al. 2008) (Patti, Nusca et al. 2008) (Trenk, Stone et al. 2012) (Price, Berger et al. 2011) (Buch, Singh et al. 2007). Se všemi studiemi můžeme porovnat i naši práci ve smyslu počtu pacientů, načasování odběru vzorků a celé metodologie práce. Do studie Marcucciho et al. (Marcucci, Gori et al. 2009) bylo zařazeno 683 pacientů po PCI pro akutní koronární syndrom. Všichni dostali nasycovací dávku clopidogrelu 600 mg následovanou 75mg clopidogrelu denně. Efekt léčby clopidogrelu byl měřen do 24 hodin od PCI pomocí VerifyNow a pacienti byli sledování po dobu 12 měsíců ke zjištění kardiovaskulární smrti, nefatálního IM a revaskularizace cílové tepny. ROC analýza stanovila jako optimální cut off hodnotu PRU 240. Pacienti s PRU nad 240 měli 2,55x větší riziko kardiovaskulární smrti a nefatálního IM ve 12ti měsíčním sledování (kardiovaskulární smrt: HR 2,55, 95% CI 1,08 – 6,07, p=0,034; nefatální IM: HR 3,36, 95% CI 1,49- 7,58, p=0,004). K podobným výsledkům došla i studie Price et al. (Price, Endemann et al. 2008), která sledovala pacienty po PCI. Zařadila 380 pacientů, kteří podstoupily PCI s implantací

77

lékového stentu. Efekt clopidogrelu byl stanoven taktéž pomocí VerifyNow 12 hod po podání 600 mg clopidogrelu (jedině u pacientů na udržovací dávce byl stanoven během PCI). Dále byli pacienti léčeni dávkou 75mg clopidogrelu a sledováni 6 měsíců. Hodnota PRU po nasazení léčby byla 184 +/- 85. Optimální cut off pro kombinovaný endpoint kardiovaskulární smrt, nefatální IM a trombóza stentu byl PRU 235 (to odpovídalo horní třetině PRU hodnot ve sledovaném souboru. Negativní prediktivní hodnota při takto dopočteném cut-off byla 99%.V průběhu 6 měsíců měli pacienti s PRU nad 235 signifikantně vyšší riziko kardiovaskulární smrti (2,8 vs. 0%, P = 0,04), trombózy stentu (4,6 vs. 0%, P = 0,004) a kombinovaného endpointu (6,5 vs. 1,0%, P = 0,008). Ve studii Patti et al. (Patti, Nusca et al. 2008) bylo 160 pacientů s AKS sledováno po dobu 30 dnů. Efekt clopidogrelu byl měřen pomocí VerifyNow a podobně jako ve výše zmíněných studiích vyšší PRU bylo signifikantně asociováno s horší prognózou. Na tomto výsledku se značně podílela přítomnost „laboratorního“ periprocedurálního IM. Breet et al. sledoval, jak jsou různé testy destičkové aktivity schopny predikovat prognózu pacientů. Bylo zařazeno přes 1000 konsekutivních pacientů, kteří podstoupily elektivní PCI. Ti dostali buď nasycovací dávku clopidogrelu 300 či 600 mg a dále byli léčeni chronickou dávkou 75 mg denně. Efektivita léčby byla změřena ihned po PCI pomocí LTA, VerifyNow, Plateletworks, PFA-100 a IMPACT-R. Z těchto testů pouze LTA, VerifyNoW a Plateletworks byly schopni predikovat prognózu pacientů v ročním sledování. Primární endpoint (smrt, IM a CMP) se vyskytl častěji u pacientů s vyšší OTPR, pokud byla měřena pomocí LTA (11,7%; 95% CI, 8,9% - 15,0% vs 6,0%; 95% CI, 4,2% - 8,2%; P < 0,001), VerifyNow (13,3%; 95% CI, 10,2% - 17,0% vs 5,7%; 95% CI, 4,1% - 7,8%; P < 0,001) a Plateletworks (12,6%; 95% CI, 8,8% - 17,2% vs 6,1%; 95% CI, 3,8% - 9,2%; P = 0,005. Ani jeden z těchto testů nebyl schopen predikovat riziko krvácení (Breet, van Werkum et al. 2010). Naše výsledky jsou však zcela odlišné od výsledků studií zmíněných výše. V literatuře

78

však můžeme najít i další studie, které naše tvrzení naopak podporují. Buch et al. (Buch, Singh et al. 2007) sledoval 330 pacientů po elektivní PCI indikovaných k duální protidestičkové léčbě. Efekt clopidogrelu byl měřen pomocí Ultegra rapid (v podstatě starší typ VerifyNow) stejně jako v naší studii do 24 hodin od PCI, ve stejnou dobu byl stanoven i efekt aspirinu pomocí totožné metody, výsledek byl vyjádřen v jednotkách ARU. Stejně jako v naší studii byli pacienti sledováni 6 měsíců. A podobně jako v naší studii hodnota PRU ani ARU nekorelovala s prognózou zařazených pacientů (MACE či nutnost opakované revaskularizacese vyskytl v následujících 6 měsících u 8,2% pacientů, ale hodnota PRU/ARU je nebyla schopna predikovat). Do studie TRIGGER-PCI (Trenk, Stone et al. 2012) byli zařazeni pacienti, kteří podstoupili elektivní PCI. Ti, kteří měli PRU nad 208, byli randomizováni do dvou skupin. První skupina byla léčena standartně 75 mg clopidogrelu denně a druhá skupina 10 mg prasugrelu denně. Z 3283 screenovaných pacientů bylo 19 % rezistentních – 212 léčených prasugrelem a 211 clopidogrelem. Ačkoli bylo PRU signifikantně nižší ve skupině pacientů s prasugrelem, všechny endpointy (smrt, IM, CMP) se vyskytly zřídka a jejich rozdíl byl bez statistické významnosti. I krvácení se vyskytlo velmi raritně – u 1.4%pacientů při terapii prasugrelem a u 0.5% pacientů léčených clopidogrelem. Nicméně v důsledky nízké incidence sledovaných endpointů musíme brát výsledky studie značně s rezervou. Největší studie, která používala k měření efektivity léčby clopidogrelem VerifyNow, je studie GRAVITAS (Price, Berger et al. 2011). V této studii bylo testováno pomocí VerifyNow celkem 5429 pacientů. Jednalo se o pacienty po PCI, kteří byli léčeni nasycovací dávkou 600 mg clopidogrelu, testování bylo prováděno během 12 - 24 hod po podání clopidogrelu. Cut-off hodnota pro PRU v této studii byla 230, pacienti s vyšší hodnotou než 230 byli označeni jako rezistentní a byli randomizováni do skupiny se standardní dávkou (75mg/den) a vyšší udržovací dávkou (150 mg/den) tohoto léku. PRU nad 230 bylo zjištěno u 2214 (40,8%) pacientů. Ze zbývajících 3215 s hodnotou PRU pod 230

79

bylo 586 sledováno jako kontrolní skupina. Zvýšení dávky na 150mg/den u randomizovaných rezistentních pacientů sice vedlo k poklesu PRU, ale nebylo spojeno s lepší prognózou oproti dávce 75mg/den (kde kontrolní PRU nekleslo). Navíc, pacienti hodnotou PRU nad 230 PRU měli ve srovnání s kontrolní skupinou s hodnotou PRU pod 230 srovnatelné riziko úmrtí, reIM či trombózy stentu. Post-hoc analýza sice ukázala, že při reanalýze byla hodnota PRU nad 208 spojena s vyšším rizikem MACE. V analýze původně sledovaných skupin neměli však (dle hodnoty PRU definováni) respondeři a nonrespondeři prognózy. Naposledy zmíněné studie přinesly zklamání po předchozím nadšení z výsledků prací, které byly schopny predikovat prognózu pacientů provedením relativně jednoduchých bedsite testů. Studie srovnatelné s naší tyto počáteční slibné závěry nepotvrdily, navíc nepotvrdily ani to, že je možné ovlivnit prognózu pacientů titrací dávky clodpiogrelu s pomocí měření VerifyNow ani záměnou za prasugrel. Laboratorní efekt tato snaha měla, klinický dopad však nebyl žádný. Největší nehomogenita v možnosti porovnání těchto studií je v charakteristice zařazených pacientů. GRAVITAS zařazovala pacienty jak s AKS, tak se stabilní AP; Buch, Price a TRIGGER-PCI pouze pacienty se stabilní AP a Marcucci zase pouze pacienty s AKS. Musíme zmínit i rozdíl ve velikosti sledovaných souborů pacientů. Studie jako GRAVITAS zařadila řádově tisíce pacientů. Naše studie se řadí k těm menším, podobně jako např. práce Buch et al., sledovala řádově stovky pacientů a je tedy svým rozsahem plně srovnatelná. Také načasováním odběru vzorků, použitím VerifyNow a definováním endpointů jsou si výše zmíněné studie velmi podobné. Možným vysvětlením tak rozdílných výsledků podobně vedených studií nacházíme v komplexnosti destičkové agregace, což je značně složitý děj, stejně jako působení clopidogrelu, ze kterého vyplývá i multifaktoriální etiologie jeho rezistence. Aktivace destičky se neděje pouze jednou cestou přes jeden receptor, proto ani blokování pouze jednoho receptoru jedním lékem jistě nemusí vést k dostatečnému efektu,

80

který by byl schopen ovlivnit prognózu. Efekt léčby také nelze vyjádřit pouze jedním číslem a klinický výsledek jistě závisí na kombinaci faktorů genetických, laboratorních a klinických. Pouze kombinace všech těchto faktorů může najít správnou cestu k individualizaci léčby pacientů s ICHS. Vliv ztrátových mutací zejména CYP2C19*2, CYP2C19*3 a prognózou pacientů s ischemickou chorobou srdeční byl potvrzen již mnoha studiemi a náš výsledek tyto studie podporuje. Nositelé alespoň jedné alely CYP2C19*2 mají až dvojnásobné riziko ischemického endpointu ve srovnání s pacienty bez této ztrátové mutace (Mega, Close et al. 2010) (Bauer, Bouman et al. 2011), samozřejmě homozygoti jsou rizikovější než heterozygoti. Jednoznačné výsledky genetických studií s individualizací léčby zatím nemáme. Ve studii ELEVATE TIMI 56 vedlo zdvoj- či ztrojnásobení dávky clopidogrelu k poklesu OTPR u heterozygotů CYP2C19 s jednou ztrátovou alelou, u heterozygotů k poklesu však nedošlo. Podobný výsledek prezentovala i studie CLOVIS-2 (Collet, Hulot et al. 2011) (Mega, Hochholzer et al. 2011). V genetické podstudii GRAVITAS k poklesu OTPR nedošlo ani u heterozygotů. Klinický význam těchto genetických studií nebyl dosud prokázán vůbec. Stejně jako v naší práci, u ostatních mutací sledovaných genů není prokázán vliv na destičkovou aktivitu při léčbě clopidogrelem u pacientů s ICHS, ani na jejich prognózu. 2.3.3. Závěr Nenašli jsme žádnou korelaci mezi laboratorním efektem léčby clopidogrelem vyjádřeným pomocí PRU nebo PRU% a prognózou pacientů. Naopak přítomnost AA alely genu CYP2C19*2, vyšší hladina kreatininu a větší počet leukocytů je spojen s horší prognózou pacientů.

81

VI. ZÁVĚR

- incidence neefektivní laboratorní odpovědi na terapii clopidogrelem je v neselektované populaci 35%

- parametry, které jsou nezávisle spojeny s neefektivní laboratorní odpovědí na léčbu clopidogrelem stanovenou pomocí VerifyNow jsou vyšší věk, větší hmotnost, ženské pohlaví, přítomnost diabetes mellitus, léčba mechanickou ventilací, vyšší hladina leukocytů, vyšší koncentrace IL-10 a přítomnost alely AA genu CYP 2C19*2

- titrace dávky clopidogrelu pomocí měření PRU u pacientů s nedostatečnou odpovědí na clopidogrel v porovnání se standartní dávkou clopidogrelu vede v 86% případů k dostatečné inhibici destiček; při zvýšení dávky clopidogrelu nedochází ke zvýšení rizika krvácení; selhání terapie i přes navýšení dávky clopidogrelu dochází zejména u nosičů alely AA CYP2C19

- PRU ani PRU% nedokáže predikovat prognózu pacientů s ischemickou chorobou srdeční léčených duální protidestičkovou léčbou; přítomnost AA alely genu CYP2C19*2, vyšší hladina kreatininu a větší počet leukocytů je spojen s horší prognózou pacientů

82

VII. SOUHRN Duální protidestičková léčba je základem terapie u pacientů s ischemickou chorobou srdeční podstupujících PCI. Bez jejího rozvoje v uplynulých letech by nebyl možný ani rozvoj intervenční kardiologie a léčby pacientů s akutním koronárním syndromem. Prokazatelně snižuje riziko ischemických komplikací u těchto pacientů a tím i morbiditu a mortalitu. I přes veškerou snahu však u nemalého procenta pacientů dochází k rekurenci ischemických komplikací a tím k zhoršení jejich prognózy. Pokud vyloučíme stavy, které přímo nesouvisí s léčbou (např. technické provedení PCI), můžeme jako příčinu selhání léčby označit rezistenci na léčbu, tj. rezistenci na clopidogrel. V literatuře se její incidence značně liší zejména v závislosti na charakteristice souboru pacientů a metodě měření. Současně musíme rozlišovat rezistenci klinickou, kterou určíme pouze s přítomného klinického endpointu a laboratorní, kdy prokážeme zvýšenou aktivitu destiček i při správně probíhající protidestičkové léčbě. V naší práci jsme efektivitu léčby clopidogrelem měřily pomocí bedsite metody VerifyNow u konsekutivních pacientů po PCI, kteří byli hospitalizováni na naší klinice a jako cut off hodnotu pro stanovení neefektivní odpovědi na clopidogrel jsme stanovili hodnotu PRU 240. V našem reálném souboru pacientů byla incidence non- responderů 35%. Z toho vyplývá i nutnost stanovení faktorů, které by nezávisle souvisely s non-responderstvím a v klinické praxi by mohly pomoci lékaři vyselektovat pacienty, u kterých je nutná zvýšená opatrnost, kontrola a monitorace léčby při protidestičkové terapii. Jako parametry, které jsou nezávisle spojeny s neefektivní laboratorní odpovědí na léčbu clopidogrelem stanovenou pomocí VerifyNow jsme určily vyšší věk, větší hmotnost, ženské pohlaví, přítomnost diabetes mellitus, léčbu mechanickou ventilací, vyšší hladinu leukocytů, vyšší koncentraci IL-10 a přítomnost alely AA genu CYP 2C19*2. U pacientů rezistentních ke standartní léčbě je dále důležitá otázka jejího ovlivnění. Jako nejjednodušší se jeví navýšení chronické dávky, při tom však nesmí dojít k současnému

83

zvýšení rizika krvácení. V naší podskupině pacientů s neefektivní laboratorní odpovědí na clopidogrel jsme u 86% pacientů dosáhli navýšením dávky laboratorní efektivity, aniž bychom zvýšili riziko krvácení. U 46% pacientů však byla nutná více než dvojnásobná dávka k dosažení optimální odpovědi na léčbu. K selhání terapie i přes navýšení dávky clopidogrelu dochází zejména u nosičů alely AA CYP2C19. V klinické praxi by bylo přínosné, kdyby bylo možné určit jasné parametry, které by predikovali horší prognózu pacientů léčených duální protidestičkovou léčbou. V naší studii jsme zjistili, že přítomnost AA alely genu CYP2C19*2, vyšší hladina kreatininu a větší počet leukocytů je spojen s horší prognózou pacientů. Jako jednoduchý ukazatel prognózy stanovitelný do pár minut by se jevilo PRU. Zklamání naší práce bylo, že PRU ani PRU% nedokáže predikovat prognózu pacientů s ischemickou chorobou srdeční léčených duální protidestičkovou léčbou.

84

VII. SUMMARY Dual antiplatelet therapy is the basis of the treatement of patients with coronary artery disease following PCI. The developement of interventional cardiology and treatement of patiens with acute coronary syndrome would not have been possible without the growth of antiplatelet therapy in the recent years. It demonstrably reduces the risk of ischemic complications of patients with CAD and thus the morbidity and mortality. Despite all the effort we can see the recurrence of ischemic complications and worsening the prognosis in considerable percentage of patients. Resistance to treatement and resistance to clopidogrel can be marked as reason of therapy failure after excluding the causes which are not directly related with therapy (e.g. technical performance of PCI). The incidence of clopidogrel resistence appreciable differs according to characteristic of patients and the method of measurement. At the same time we must distinguish between clinical resistance, which is characterised by the presence of clinical endpoint and laboratory resistance, if the higher on treatement platelet reactivity during adequate antiplatelet therapy is established. In our study, the effect of clopidogrel treatement of consecutive patients after PCI, who were admitted to our department was measured by bedsite method VerifyNow. The PRU cut off value 240 was specified for the ineffective answer to clopidogrel treatement. The incidence of non-responders was 35% in our real group of patients. It follows the necessity of parametres assessment which are independently associated with poor platelet answer to clopidogrel. This could help to select the patients to be more observed and their therapy to be monitored in clinical practise. Higher age, higher weight, female gender, diabetes mellitus, mechanical ventilation, higher leukocyte count, higher concentration of IL-10 and the presence of AA allele CYP2C19*2 were identified as parametres which are independently associated with ineffective response to clopidogrel assesed by VerifyNow. Also the question of affecting the antiplatelet treatement is important in patients who are

85

resistant to clopidogrel. The increasing of chronic dose seems simpliest while it must not lead to an increased risk of bleeding. In our subgroup of patients with ineffective answer to clopidogrel, we achieved laboratory efficiency by increasing the clodpiogrel dose in 86% of patients without increased risk of bleeding. More than double chronic clopidogrel dose was necessary in 46% of patients to achieve appropriate platelet answer. Treatement failure occurs mainly in carriers of polymorphism of gene CYP2C19. The assesment of clear parametres which can predict worse prognosis of patients treated with dual antiplatelet therapy would be useful for clinical practise. We found in our study that presence of allele CYP2C19*2, higher level of creatinine and higher leukocyte count are associated with worse prognosis of patients. PRU value which can be determined in a few minutes appeared to be simple prognosis indicator. Disappointment was that neither PRU nor PRU% can predict the prognosis of patients with coronary artery disease treated with dual antiplatelet therapy.

86

IX. LITERATURA

Abbate, R., R. Marcucci, O. Camacho-Vanegas, G. Pepe, A. M. Gori, M. Capanni, I. Simonetti, D. Prisco and G. F. Gensini (1998). "Role of platelet glycoprotein PL(A1/A2) polymorphism in restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty." Am J Cardiol 82(4): 524-525. Aleil, B., C. Ravanat, J. P. Cazenave, G. Rochoux, A. Heitz and C. Gachet (2005). "Flow cytometric analysis of intraplatelet VASP phosphorylation for the detection of clopidogrel resistance in patients with ischemic cardiovascular diseases." J Thromb Haemost 3(1): 85-92. Angiolillo, D. J., E. Bernardo, J. Palazuelos, B. Desai, I. Weisberg, F. Alfonso, L. A. Guzman, R. Hernandez-Antolin, M. Z. Zenni, C. Macaya, A. Fernandez-Ortiz and T. A. Bass (2008). "Functional impact of high clopidogrel maintenance dosing in patients undergoing elective percutaneous coronary interventions. Results of a randomized study." Thromb Haemost 99(1): 161-168. Angiolillo, D. J., E. Bernardo, M. Zanoni, D. Vivas, P. Capranzano, G. Malerba, D. Capodanno, P. Prandini, A. Pasquali, E. Trabetti, M. Sabate, P. Jimenez-Quevedo, J. L. Ferreiro, M. Ueno, T. A. Bass, P. F. Pignatti, A. Fernandez-Ortiz and C. Macaya (2011). "Impact of insulin receptor substrate-1 genotypes on platelet reactivity and cardiovascular outcomes in patients with type 2 diabetes mellitus and coronary artery disease." J Am Coll Cardiol 58(1): 30-39. Angiolillo, D. J., A. Fernandez-Ortiz, E. Bernardo, C. Ramirez, C. Barrera-Ramirez, M. Sabate, R. Hernandez, R. Moreno, J. Escaned, F. Alfonso, C. Banuelos, M. A. Costa, T. A. Bass and C. Macaya (2005). "Identification of low responders to a 300-mg clopidogrel loading dose in patients undergoing coronary stenting." Thromb Res 115(1-2): 101-108.

87

Angiolillo, D. J., S. B. Shoemaker, B. Desai, H. Yuan, R. K. Charlton, E. Bernardo, M. M. Zenni, L. A. Guzman, T. A. Bass and M. A. Costa (2007). "Randomized comparison of a high clopidogrel maintenance dose in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease: results of the Optimizing Antiplatelet Therapy in Diabetes Mellitus (OPTIMUS) study." Circulation 115(6): 708-716. Antithrombotic Trialists, C. (2002). "Collaborative meta-analysis of randomised trials of antiplatelet therapy for prevention of death, myocardial infarction, and stroke in high risk patients." BMJ 324(7329): 71-86. Aradi, D., A. Komocsi, A. Vorobcsuk, O. Rideg, M. Tokes-Fuzesi, T. Magyarlaki, I. G. Horvath and V. L. Serebruany (2010). "Prognostic significance of high on-clopidogrel platelet reactivity after percutaneous coronary intervention: systematic review and meta-analysis." Am Heart J 160(3): 543-551. Aradi, D., A. Konyi, L. Palinkas, T. Berki, T. Pinter, T. Tahin, I. Horvath, L. Papp and A. Komocsi (2008). "Thienopyridine therapy influences late outcome after coronary stent implantation." Angiology 59(2): 172-178. Baigent, C., R. Collins, P. Appleby, S. Parish, P. Sleight and R. Peto (1998). "ISIS-2: 10 year survival among patients with suspected acute myocardial infarction in randomised comparison of intravenous streptokinase, oral aspirin, both, or neither. The ISIS-2 (Second International Study of Infarct Survival) Collaborative Group." BMJ 316(7141): 1337-1343. Bauer, T., H. J. Bouman, J. W. van Werkum, N. F. Ford, J. M. ten Berg and D. Taubert (2011). "Impact of CYP2C19 variant genotypes on clinical efficacy of antiplatelet treatment with clopidogrel: systematic review and meta-analysis." BMJ 343: d4588. Bednar, F., T. Tencer, P. Plasil, Z. Paluch, L. Sadilkova, M. Prucha and M. Kopa (2012). "Evaluation of aspirin's effect on platelet function early after coronary artery bypass grafting." J Cardiothorac Vasc Anesth 26(4): 575-580.

88

Bernhardt, J., K. Rogalla, T. F. Luscher, F. R. Buhler and T. J. Resink (1993). "Acetylsalicylic acid, at high concentrations, inhibits vascular smooth muscle cell proliferation." J Cardiovasc Pharmacol 21(6): 973-976. Bertrand, M. E., H. J. Rupprecht, P. Urban and A. H. Gershlick (2000). "Double-blind study of the safety of clopidogrel with and without a loading dose in combination with aspirin compared with ticlopidine in combination with aspirin after coronary stenting : the clopidogrel aspirin stent international cooperative study (CLASSICS)." Circulation 102(6): 624-629. Betts, W. H., M. W. Whitehouse, L. G. Cleland and B. Vernon-Roberts (1985). "In vitro antioxidant properties of potential biotransformation products of salicylate, sulphasalazine and amidopyrine." J Free Radic Biol Med 1(4): 273-280. Bhatt, D. L. (2004). "Aspirin resistance: more than just a laboratory curiosity." J Am Coll Cardiol 43(6): 1127-1129. Bhatt, D. L., B. L. Cryer, C. F. Contant, M. Cohen, A. Lanas, T. J. Schnitzer, T. L. Shook, P. Lapuerta, M. A. Goldsmith, L. Laine, B. M. Scirica, S. A. Murphy and C. P. Cannon (2010). "Clopidogrel with or without omeprazole in coronary artery disease." N Engl J Med 363(20): 1909-1917. Bhatt, D. L., K. A. Fox, W. Hacke, P. B. Berger, H. R. Black, W. E. Boden, P. Cacoub, E. A. Cohen, M. A. Creager, J. D. Easton, M. D. Flather, S. M. Haffner, C. W. Hamm, G. J. Hankey, S. C. Johnston, K. H. Mak, J. L. Mas, G. Montalescot, T. A. Pearson, P. G. Steg, S. R. Steinhubl, M. A. Weber, D. M. Brennan, L. Fabry-Ribaudo, J. Booth and E. J. Topol (2006). "Clopidogrel and aspirin versus aspirin alone for the prevention of atherothrombotic events." N Engl J Med 354(16): 1706-1717.

89

Blindt, R., K. Stellbrink, A. de Taeye, R. Muller, P. Kiefer, E. Yagmur, C. Weber, M. Kelm and R. Hoffmann (2007). "The significance of vasodilator-stimulated phosphoprotein for risk stratification of stent thrombosis." Thromb Haemost 98(6): 1329-1334. Bonello, L., L. Camoin-Jau, S. Arques, C. Boyer, D. Panagides, O. Wittenberg, M. C. Simeoni, P. Barragan, F. Dignat-George and F. Paganelli (2008). "Adjusted clopidogrel loading doses according to vasodilator-stimulated phosphoprotein phosphorylation index decrease rate of major adverse cardiovascular events in patients with clopidogrel resistance: a multicenter randomized prospective study." J Am Coll Cardiol 51(14): 1404-1411. Brar, S. S., J. ten Berg, R. Marcucci, M. J. Price, M. Valgimigli, H. S. Kim, G. Patti, N. J. Breet, G. DiSciascio, T. Cuisset and G. Dangas (2011). "Impact of platelet reactivity on clinical outcomes after percutaneous coronary intervention. A collaborative meta-analysis of individual participant data." J Am Coll Cardiol 58(19): 1945-1954. Brass, L. F., J. A. Hoxie and D. R. Manning (1993). "Signaling through G proteins and G protein-coupled receptors during platelet activation." Thromb Haemost 70(1): 217-223. Breet, N. J., J. W. van Werkum, H. J. Bouman, J. C. Kelder, H. J. Ruven, E. T. Bal, V. H. Deneer, A. M. Harmsze, J. A. van der Heyden, B. J. Rensing, M. J. Suttorp, C. M. Hackeng and J. M. ten Berg (2010). "Comparison of platelet function tests in predicting clinical outcome in patients undergoing coronary stent implantation." JAMA 303(8): 754-762. Buch, A. N., S. Singh, P. Roy, A. Javaid, K. A. Smith, C. E. George, A. D. Pichard, L. F. Satler, K. M. Kent, W. O. Suddath and R. Waksman (2007). "Measuring aspirin resistance, clopidogrel responsiveness, and postprocedural markers of myonecrosis in patients undergoing percutaneous coronary intervention." Am J Cardiol 99(11): 1518-1522. Buonamici, P., R. Marcucci, A. Migliorini, G. F. Gensini, A. Santini, R. Paniccia, G. Moschi, A. M. Gori, R. Abbate and D. Antoniucci (2007). "Impact of platelet reactivity after

90

clopidogrel administration on drug-eluting stent thrombosis." J Am Coll Cardiol 49(24): 2312-2317. Cairns, J. A., M. Gent, J. Singer, K. J. Finnie, G. M. Froggatt, D. A. Holder, G. Jablonsky, W. J. Kostuk, L. J. Melendez, M. G. Myers and et al. (1985). "Aspirin, sulfinpyrazone, or both in unstable angina. Results of a Canadian multicenter trial." N Engl J Med 313(22): 1369-1375. Califf, R. M., E. R. DeLong, T. Ostbye, L. H. Muhlbaier, A. Chen, N. A. LaPointe, B. G. Hammill, C. B. McCants and J. M. Kramer (2002). "Underuse of aspirin in a referral population with documented coronary artery disease." Am J Cardiol 89(6): 653-661. Campo, G., G. Parrinello, P. Ferraresi, B. Lunghi, M. Tebaldi, M. Miccoli, J. Marchesini, F. Bernardi, R. Ferrari and M. Valgimigli (2011). "Prospective evaluation of on-clopidogrel platelet reactivity over time in patients treated with percutaneous coronary intervention relationship with gene polymorphisms and clinical outcome." J Am Coll Cardiol 57(25): 2474-2483. Cannon, C. P., R. A. Harrington, S. James, D. Ardissino, R. C. Becker, H. Emanuelsson, S. Husted, H. Katus, M. Keltai, N. S. Khurmi, F. Kontny, B. S. Lewis, P. G. Steg, R. F. Storey, D. Wojdyla, L. Wallentin, P. L. inhibition and I. patient Outcomes (2010). "Comparison of ticagrelor with clopidogrel in patients with a planned invasive strategy for acute coronary syndromes (PLATO): a randomised double-blind study." Lancet 375(9711): 283-293. Catella-Lawson, F., M. P. Reilly, S. C. Kapoor, A. J. Cucchiara, S. DeMarco, B. Tournier, S. N. Vyas and G. A. FitzGerald (2001). "Cyclooxygenase inhibitors and the antiplatelet effects of aspirin." N Engl J Med 345(25): 1809-1817. Cattaneo, M. (2009). "Light transmission aggregometry and ATP release for the diagnostic assessment of platelet function." Semin Thromb Hemost 35(2): 158-167. Cattaneo, M., R. Lombardi, M. L. Zighetti, C. Gachet, P. Ohlmann, J. P. Cazenave and P. M. Mannucci (1997). "Deficiency of (33P)2MeS-ADP binding sites on platelets with secretion

91

defect, normal granule stores and normal thromboxane A2 production. Evidence that ADP potentiates platelet secretion independently of the formation of large platelet aggregates and thromboxane A2 production." Thromb Haemost 77(5): 986-990. Cattaneo, M. and G. M. Podda (2010). "State of the art of new P2Y12 antagonists." Intern Emerg Med 5(5): 385-391. Clemetson, K. J. (1995). "Platelet activation: signal transduction via membrane receptors." Thromb Haemost 74(1): 111-116. Collet, J. P., J. S. Hulot, G. Anzaha, A. Pena, T. Chastre, C. Caron, J. Silvain, G. Cayla, A. Bellemain-Appaix, J. B. Vignalou, S. Galier, O. Barthelemy, F. Beygui, V. Gallois, G. Montalescot and C.-. Investigators (2011). "High doses of clopidogrel to overcome genetic resistance: the randomized crossover CLOVIS-2 (Clopidogrel and Response Variability Investigation Study 2)." JACC Cardiovasc Interv 4(4): 392-402. Committee, C. S. (1996). "A randomised, blinded, trial of clopidogrel versus aspirin in patients at risk of ischaemic events (CAPRIE). CAPRIE Steering Committee." Lancet 348(9038): 1329-1339. Conley, P. B. and S. M. Delaney (2003). "Scientific and therapeutic insights into the role of the platelet P2Y12 receptor in thrombosis." Curr Opin Hematol 10(5): 333-338. Craven, L. L. (1950). "Acetylsalicylic acid, possible preventive of coronary thrombosis." Ann West Med Surg 4(2): 95. Csiszar, A., G. Stef, P. Pacher and Z. Ungvari (2002). "Oxidative stress-induced isoprostane formation may contribute to aspirin resistance in platelets." Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 66(5-6): 557-558. Cuisset, T., C. Frere, J. Quilici, F. Barbou, P. E. Morange, T. Hovasse, J. L. Bonnet and M. C. Alessi (2006). "High post-treatment platelet reactivity identified low-responders to dual

92

antiplatelet therapy at increased risk of recurrent cardiovascular events after stenting for acute coronary syndrome." J Thromb Haemost 4(3): 542-549. Cuisset, T., C. Frere, J. Quilici, P. E. Morange, L. Camoin, L. Bali, M. Lambert, I. JuhanVague, M. C. Alessi and J. L. Bonnet (2009). "Relationship between aspirin and clopidogrel responses in acute coronary syndrome and clinical predictors of non response." Thromb Res 123(4): 597-603. Cuisset, T., C. Frere, J. Quilici, P. E. Morange, L. Nait-Saidi, J. Carvajal, A. Lehmann, M. Lambert, J. L. Bonnet and M. C. Alessi (2006). "Benefit of a 600-mg loading dose of clopidogrel on platelet reactivity and clinical outcomes in patients with non-ST-segment elevation acute coronary syndrome undergoing coronary stenting." J Am Coll Cardiol 48(7): 1339-1345. Dai, Z. L., H. Chen and X. Y. Wu (2012). "Relationship between cytochrome P450 2C19*17 genotype distribution, platelet aggregation and bleeding risk in patients with blood stasis syndrome of coronary artery disease treated with clopidogrel." Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao 10(6): 647-654. Dalen, J. E. (2007). "Aspirin resistance: is it real? Is it clinically significant?" Am J Med 120(1): 1-4. Daniel, J. L., C. Dangelmaier, J. Jin, B. Ashby, J. B. Smith and S. P. Kunapuli (1998). "Molecular basis for ADP-induced platelet activation. I. Evidence for three distinct ADP receptors on human platelets." J Biol Chem 273(4): 2024-2029. Daniel, J. L., C. Dangelmaier, J. Jin, Y. B. Kim and S. P. Kunapuli (1999). "Role of intracellular signaling events in ADP-induced platelet aggregation." Thromb Haemost 82(4): 1322-1326.

93

Davi, G., M. T. Guagnano, G. Ciabattoni, S. Basili, A. Falco, M. Marinopiccoli, M. Nutini, S. Sensi and C. Patrono (2002). "Platelet activation in obese women: role of inflammation and oxidant stress." JAMA 288(16): 2008-2014. de Gaetano, G. (2001). "Low-dose aspirin and vitamin E in people at cardiovascular risk: a randomised trial in general practice. Collaborative Group of the Primary Prevention Project." Lancet 357(9250): 89-95. DiChiara, J., K. P. Bliden, U. S. Tantry, M. S. Hamed, M. J. Antonino, T. A. Suarez, O. Bailon, A. Singla and P. A. Gurbel (2007). "The effect of aspirin dosing on platelet function in diabetic and nondiabetic patients: an analysis from the aspirin-induced platelet effect (ASPECT) study." Diabetes 56(12): 3014-3019. Easton, J. D. (1999). "Clinical aspects of the use of clopidogrel, a new antiplatelet agent." Semin Thromb Hemost 25 Suppl 2: 77-82. Egger, G., A. Burda, A. Obernosterer, H. Mitterhammer, G. Kager, G. Jurgens, H. P. Hofer, J. S. Fabjan and E. Pilger (2001). "Blood polymorphonuclear leukocyte activation in atherosclerosis: effects of aspirin." Inflammation 25(2): 129-135. Eikelboom, J. W., J. Hirsh, J. I. Weitz, M. Johnston, Q. Yi and S. Yusuf (2002). "Aspirinresistant thromboxane biosynthesis and the risk of myocardial infarction, stroke, or cardiovascular death in patients at high risk for cardiovascular events." Circulation 105(14): 1650-1655. Elwood, P. C., A. L. Cochrane, M. L. Burr, P. M. Sweetnam, G. Williams, E. Welsby, S. J. Hughes and R. Renton (1974). "A randomized controlled trial of acetyl salicylic acid in the secondary prevention of mortality from myocardial infarction." Br Med J 1(5905): 436-440. Fagura, M. S., I. A. Dainty, G. D. McKay, I. P. Kirk, R. G. Humphries, M. J. Robertson, I. G. Dougall and P. Leff (1998). "P2Y1-receptors in human platelets which are pharmacologically distinct from P2Y(ADP)-receptors." Br J Pharmacol 124(1): 157-164.

94

Farid, N. A., R. L. Smith, T. A. Gillespie, T. J. Rash, P. E. Blair, A. Kurihara and M. J. Goldberg (2007). "The disposition of prasugrel, a novel thienopyridine, in humans." Drug Metab Dispos 35(7): 1096-1104. Ferreira, I. A., K. L. Eybrechts, A. I. Mocking, C. Kroner and J. W. Akkerman (2004). "IRS-1 mediates inhibition of Ca2+ mobilization by insulin via the inhibitory G-protein Gi." J Biol Chem 279(5): 3254-3264. Ferreira, I. A., A. I. Mocking, M. A. Feijge, G. Gorter, T. W. van Haeften, J. W. Heemskerk and J. W. Akkerman (2006). "Platelet inhibition by insulin is absent in type 2 diabetes mellitus." Arterioscler Thromb Vasc Biol 26(2): 417-422. Fontana, P., A. Dupont, S. Gandrille, C. Bachelot-Loza, J. L. Reny, M. Aiach and P. Gaussem (2003). "Adenosine diphosphate-induced platelet aggregation is associated with P2Y12 gene sequence variations in healthy subjects." Circulation 108(8): 989-995. Furuta, T., K. Ohashi, T. Kamata, M. Takashima, K. Kosuge, T. Kawasaki, H. Hanai, T. Kubota, T. Ishizaki and E. Kaneko (1998). "Effect of genetic differences in omeprazole metabolism on cure rates for Helicobacter pylori infection and peptic ulcer." Ann Intern Med 129(12): 1027-1030. Gachet, C., M. Cattaneo, P. Ohlmann, B. Hechler, A. Lecchi, J. Chevalier, D. Cassel, P. M. Mannucci and J. P. Cazenave (1995). "Purinoceptors on blood platelets: further pharmacological and clinical evidence to suggest the presence of two ADP receptors." Br J Haematol 91(2): 434-444. Galasso, G., G. Santulli, F. Piscione, R. De Rosa, V. Trimarco, R. Piccolo, S. Cassese, G. Iaccarino, B. Trimarco and M. Chiariello (2010). "The GPIIIA PlA2 polymorphism is associated with an increased risk of cardiovascular adverse events." BMC Cardiovasc Disord 10: 41.

95

Ge, H., Y. Zhou, X. Liu, X. Nie, Z. Wang, Y. Guo, W. Chen and Q. Yang (2012). "Relationship between plasma inflammatory markers and platelet aggregation in patients with clopidogrel resistance after angioplasty." Angiology 63(1): 62-66. Goodman, T., A. Ferro and P. Sharma (2008). "Pharmacogenetics of aspirin resistance: a comprehensive systematic review." Br J Clin Pharmacol 66(2): 222-232. Gremmel, T., C. W. Kopp, D. Seidinger, R. Koppensteiner, S. Panzer, R. Sunder-Plassmann, C. Mannhalter and S. Steiner (2013). "Differential impact of cytochrome 2C9 allelic variants on clopidogrel-mediated platelet inhibition determined by five different platelet function tests." Int J Cardiol 166(1): 126-131. Gum, P. A., K. Kottke-Marchant, E. D. Poggio, H. Gurm, P. A. Welsh, L. Brooks, S. K. Sapp and E. J. Topol (2001). "Profile and prevalence of aspirin resistance in patients with cardiovascular disease." Am J Cardiol 88(3): 230-235. Gurbel, P. A., R. C. Becker, K. G. Mann, S. R. Steinhubl and A. D. Michelson (2007). "Platelet function monitoring in patients with coronary artery disease." J Am Coll Cardiol 50(19): 1822-1834. Hamm, C. W., J. P. Bassand, S. Agewall, J. Bax, E. Boersma, H. Bueno, P. Caso, D. Dudek, S. Gielen, K. Huber, M. Ohman, M. C. Petrie, F. Sonntag, M. S. Uva, R. F. Storey, W. Wijns and D. Zahger (2011). "ESC Guidelines for the management of acute coronary syndromes in patients presenting without persistent ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute coronary syndromes (ACS) in patients presenting without persistent STsegment elevation of the European Society of Cardiology (ESC)." Eur Heart J 32(23): 29993054. Hankey, G. J. and J. W. Eikelboom (2006). "Aspirin resistance." Lancet 367(9510): 606-617. Hansson, L., A. Zanchetti, S. G. Carruthers, B. Dahlof, D. Elmfeldt, S. Julius, J. Menard, K. H. Rahn, H. Wedel and S. Westerling (1998). "Effects of intensive blood-pressure lowering

96

and low-dose aspirin in patients with hypertension: principal results of the Hypertension Optimal Treatment (HOT) randomised trial. HOT Study Group." Lancet 351(9118): 17551762. Hayward, C. P., P. Harrison, M. Cattaneo, T. L. Ortel and A. K. Rao (2006). "Platelet function analyzer (PFA)-100 closure time in the evaluation of platelet disorders and platelet function." J Thromb Haemost 4(2): 312-319. Heyland, D. K., G. Tougas, D. King and D. J. Cook (1996). "Impaired gastric emptying in mechanically ventilated, critically ill patients." Intensive Care Med 22(12): 1339-1344. Ho, P. M., T. M. Maddox, L. Wang, S. D. Fihn, R. L. Jesse, E. D. Peterson and J. S. Rumsfeld (2009). "Risk of adverse outcomes associated with concomitant use of clopidogrel and proton pump inhibitors following acute coronary syndrome." JAMA 301(9): 937-944. Hollopeter, G., H. M. Jantzen, D. Vincent, G. Li, L. England, V. Ramakrishnan, R. B. Yang, P. Nurden, A. Nurden, D. Julius and P. B. Conley (2001). "Identification of the platelet ADP receptor targeted by antithrombotic drugs." Nature 409(6817): 202-207. Husain, S., N. P. Andrews, D. Mulcahy, J. A. Panza and A. A. Quyyumi (1998). "Aspirin improves endothelial dysfunction in atherosclerosis." Circulation 97(8): 716-720. Chen, W. H., P. Y. Lee, W. Ng, H. F. Tse and C. P. Lau (2004). "Aspirin resistance is associated with a high incidence of myonecrosis after non-urgent percutaneous coronary intervention despite clopidogrel pretreatment." J Am Coll Cardiol 43(6): 1122-1126. Chen, Z. M., H. C. Pan, Y. P. Chen, R. Peto, R. Collins, L. X. Jiang, J. X. Xie and L. S. Liu (2005). "Early intravenous then oral metoprolol in 45,852 patients with acute myocardial infarction: randomised placebo-controlled trial." Lancet 366(9497): 1622-1632. Jack, D. B. (1997). "One hundred years of aspirin." Lancet 350(9075): 437-439. Jackson, S. P., S. M. Schoenwaelder, I. Goncalves, W. S. Nesbitt, C. L. Yap, C. E. Wright, V. Kenche, K. E. Anderson, S. M. Dopheide, Y. Yuan, S. A. Sturgeon, H. Prabaharan, P. E.

97

Thompson, G. D. Smith, P. R. Shepherd, N. Daniele, S. Kulkarni, B. Abbott, D. Saylik, C. Jones, L. Lu, S. Giuliano, S. C. Hughan, J. A. Angus, A. D. Robertson and H. H. Salem (2005). "PI 3-kinase p110beta: a new target for antithrombotic therapy." Nat Med 11(5): 507514. Jacobson, A. K. (2004). "Platelet ADP receptor antagonists: ticlopidine and clopidogrel." Best Pract Res Clin Haematol 17(1): 55-64. Jarvis, G. E., R. G. Humphries, M. J. Robertson and P. Leff (2000). "ADP can induce aggregation of human platelets via both P2Y(1) and P(2T) receptors." Br J Pharmacol 129(2): 275-282. Jefferson, B. K., J. H. Foster, J. J. McCarthy, G. Ginsburg, A. Parker, K. Kottke-Marchant and E. J. Topol (2005). "Aspirin resistance and a single gene." Am J Cardiol 95(6): 805-808. Jeong, Y. H., I. S. Kim, Y. Park, M. K. Kang, J. S. Koh, S. J. Hwang, C. H. Kwak and J. Y. Hwang (2010). "Carriage of cytochrome 2C19 polymorphism is associated with risk of high post-treatment platelet reactivity on high maintenance-dose clopidogrel of 150 mg/day: results of the ACCEL-DOUBLE (Accelerated Platelet Inhibition by a Double Dose of Clopidogrel According to Gene Polymorphism) study." JACC Cardiovasc Interv 3(7): 731-741. Juurlink, D. N., T. Gomes, D. T. Ko, P. E. Szmitko, P. C. Austin, J. V. Tu, D. A. Henry, A. Kopp and M. M. Mamdani (2009). "A population-based study of the drug interaction between proton pump inhibitors and clopidogrel." CMAJ 180(7): 713-718. Kuliczkowski, W., A. Witkowski, L. Polonski, C. Watala, K. Filipiak, A. Budaj, J. Golanski, D. Sitkiewicz, J. Pregowski, J. Gorski, M. Zembala, G. Opolski, K. Huber, H. Arnesen, S. D. Kristensen and R. De Caterina (2009). "Interindividual variability in the response to oral antiplatelet drugs: a position paper of the Working Group on antiplatelet drugs resistance appointed by the Section of Cardiovascular Interventions of the Polish Cardiac Society,

98

endorsed by the Working Group on Thrombosis of the European Society of Cardiology." Eur Heart J 30(4): 426-435. Kundu, S. K., E. J. Heilmann, R. Sio, C. Garcia, R. M. Davidson and R. A. Ostgaard (1995). "Description of an in vitro platelet function analyzer--PFA-100." Semin Thromb Hemost 21 Suppl 2: 106-112. Kunicki, T. J., M. Kritzik, D. S. Annis and D. J. Nugent (1997). "Hereditary variation in platelet integrin alpha 2 beta 1 density is associated with two silent polymorphisms in the alpha 2 gene coding sequence." Blood 89(6): 1939-1943. Kwok, C. S. and Y. K. Loke (2010). "Meta-analysis: the effects of proton pump inhibitors on cardiovascular events and mortality in patients receiving clopidogrel." Aliment Pharmacol Ther 31(8): 810-823. Lablanche, J. M., E. P. McFadden, J. L. Bonnet, G. Grollier, N. Danchin, M. Bedossa, C. Leclercq, A. Vahanian, C. Bauters, E. Van Belle and M. E. Bertrand (1996). "Combined antiplatelet therapy with ticlopidine and aspirin. A simplified approach to intracoronary stent management." Eur Heart J 17(9): 1373-1380. Lamba, J. K., Y. S. Lin, E. G. Schuetz and K. E. Thummel (2002). "Genetic contribution to variable human CYP3A-mediated metabolism." Adv Drug Deliv Rev 54(10): 1271-1294. Lau, W. C., P. A. Gurbel, P. B. Watkins, C. J. Neer, A. S. Hopp, D. G. Carville, K. E. Guyer, A. R. Tait and E. R. Bates (2004). "Contribution of hepatic cytochrome P450 3A4 metabolic activity to the phenomenon of clopidogrel resistance." Circulation 109(2): 166-171. Lau, W. C., L. A. Waskell, P. B. Watkins, C. J. Neer, K. Horowitz, A. S. Hopp, A. R. Tait, D. G. Carville, K. E. Guyer and E. R. Bates (2003). "Atorvastatin reduces the ability of clopidogrel to inhibit platelet aggregation: a new drug-drug interaction." Circulation 107(1): 32-37.

99

Le Hello, C., R. Morello, A. Lequerrec, C. Duarte, J. Riddell and M. Hamon (2007). "Effect of PlA1/A2 glycoprotein IIIa gene polymorphism on the long-term outcome after successful coronary stenting." Thromb J 5: 19. Lefkovits, J., E. F. Plow and E. J. Topol (1995). "Platelet glycoprotein IIb/IIIa receptors in cardiovascular medicine." N Engl J Med 332(23): 1553-1559. Lennon, M. J., N. M. Gibbs, W. M. Weightman, D. McGuire and N. Michalopoulos (2004). "A comparison of Plateletworks and platelet aggregometry for the assessment of aspirinrelated platelet dysfunction in cardiac surgical patients." J Cardiothorac Vasc Anesth 18(2): 136-140. Leonardi, S., K. W. Mahaffey, H. D. White, C. M. Gibson, G. W. Stone, G. W. Steg, C. W. Hamm, M. J. Price, M. Todd, M. Dietrich, D. Gallup, T. Liu, S. Skerjanec, R. A. Harrington and D. L. Bhatt (2012). "Rationale and design of the Cangrelor versus standard therapy to acHieve optimal Management of Platelet InhibitiON PHOENIX trial." Am Heart J 163(5): 768-776 e762. Lewis, H. D., Jr., J. W. Davis, D. G. Archibald, W. E. Steinke, T. C. Smitherman, J. E. Doherty, 3rd, H. W. Schnaper, M. M. LeWinter, E. Linares, J. M. Pouget, S. C. Sabharwal, E. Chesler and H. DeMots (1983). "Protective effects of aspirin against acute myocardial infarction and death in men with unstable angina. Results of a Veterans Administration Cooperative Study." N Engl J Med 309(7): 396-403. Li, X. Q., T. B. Andersson, M. Ahlstrom and L. Weidolf (2004). "Comparison of inhibitory effects of the proton pump-inhibiting drugs omeprazole, esomeprazole, lansoprazole, pantoprazole, and rabeprazole on human cytochrome P450 activities." Drug Metab Dispos 32(8): 821-827. MacFarlane, D. E., S. Gardner, C. Lipson and D. C. Mills (1977). "Malondialdehyde production by platelets during secondary aggregation." Thromb Haemost 38(4): 1002-1009.

100

MacKenzie, A. B., M. P. Mahaut-Smith and S. O. Sage (1996). "Activation of receptoroperated cation channels via P2X1 not P2T purinoceptors in human platelets." J Biol Chem 271(6): 2879-2881. Malinin, A., A. Pokov, M. Spergling, A. Defranco, K. Schwartz, D. Schwartz, E. Mahmud, D. Atar and V. Serebruany (2007). "Monitoring platelet inhibition after clopidogrel with the VerifyNow-P2Y12(R) rapid analyzer: the VERIfy Thrombosis risk ASsessment (VERITAS) study." Thromb Res 119(3): 277-284. Mantovani, A., S. Sozzani, A. Vecchi, M. Introna and P. Allavena (1997). "Cytokine activation of endothelial cells: new molecules for an old paradigm." Thromb Haemost 78(1): 406-414. Marcucci, R., A. M. Gori, R. Paniccia, B. Giusti, S. Valente, C. Giglioli, P. Buonamici, D. Antoniucci, R. Abbate and G. F. Gensini (2009). "Cardiovascular death and nonfatal myocardial infarction in acute coronary syndrome patients receiving coronary stenting are predicted by residual platelet reactivity to ADP detected by a point-of-care assay: a 12-month follow-up." Circulation 119(2): 237-242. Maree, A. O., R. J. Curtin, M. Dooley, R. M. Conroy, P. Crean, D. Cox and D. J. Fitzgerald (2005). "Platelet response to low-dose enteric-coated aspirin in patients with stable cardiovascular disease." J Am Coll Cardiol 46(7): 1258-1263. Matetzky, S., B. Shenkman, V. Guetta, M. Shechter, R. Beinart, I. Goldenberg, I. Novikov, H. Pres, N. Savion, D. Varon and H. Hod (2004). "Clopidogrel resistance is associated with increased risk of recurrent atherothrombotic events in patients with acute myocardial infarction." Circulation 109(25): 3171-3175. Mega, J. L., S. L. Close, S. D. Wiviott, L. Shen, R. D. Hockett, J. T. Brandt, J. R. Walker, E. M. Antman, W. Macias, E. Braunwald and M. S. Sabatine (2009). "Cytochrome p-450 polymorphisms and response to clopidogrel." N Engl J Med 360(4): 354-362.

101

Mega, J. L., S. L. Close, S. D. Wiviott, L. Shen, R. D. Hockett, J. T. Brandt, J. R. Walker, E. M. Antman, W. L. Macias, E. Braunwald and M. S. Sabatine (2009). "Cytochrome P450 genetic polymorphisms and the response to prasugrel: relationship to pharmacokinetic, pharmacodynamic, and clinical outcomes." Circulation 119(19): 2553-2560. Mega, J. L., S. L. Close, S. D. Wiviott, L. Shen, J. R. Walker, T. Simon, E. M. Antman, E. Braunwald and M. S. Sabatine (2010). "Genetic variants in ABCB1 and CYP2C19 and cardiovascular outcomes after treatment with clopidogrel and prasugrel in the TRITON-TIMI 38 trial: a pharmacogenetic analysis." Lancet 376(9749): 1312-1319. Mega, J. L., W. Hochholzer, A. L. Frelinger, 3rd, M. J. Kluk, D. J. Angiolillo, D. J. Kereiakes, S. Isserman, W. J. Rogers, C. T. Ruff, C. Contant, M. J. Pencina, B. M. Scirica, J. A. Longtine, A. D. Michelson and M. S. Sabatine (2011). "Dosing clopidogrel based on CYP2C19 genotype and the effect on platelet reactivity in patients with stable cardiovascular disease." JAMA 306(20): 2221-2228. Mehta, J. L. and B. Mohandas (2010). "Aspirin resistance: Fact or fiction? A point of view." World J Cardiol 2(9): 280-288. Mehta, S. R., J. P. Bassand, S. Chrolavicius, R. Diaz, K. A. Fox, C. B. Granger, S. Jolly, H. J. Rupprecht, P. Widimsky and S. Yusuf (2008). "Design and rationale of CURRENT-OASIS 7: a randomized, 2 x 2 factorial trial evaluating optimal dosing strategies for clopidogrel and aspirin in patients with ST and non-ST-elevation acute coronary syndromes managed with an early invasive strategy." Am Heart J 156(6): 1080-1088 e1081. Mehta, S. R., S. Yusuf, R. J. Peters, M. E. Bertrand, B. S. Lewis, M. K. Natarajan, K. Malmberg, H. Rupprecht, F. Zhao, S. Chrolavicius, I. Copland and K. A. Fox (2001). "Effects of pretreatment with clopidogrel and aspirin followed by long-term therapy in patients undergoing percutaneous coronary intervention: the PCI-CURE study." Lancet 358(9281): 527-533.

102

Migliorini, A., R. Valenti, R. Marcucci, G. Parodi, G. Giuliani, P. Buonamici, G. Cerisano, N. Carrabba, G. F. Gensini, R. Abbate and D. Antoniucci (2009). "High residual platelet reactivity after clopidogrel loading and long-term clinical outcome after drug-eluting stenting for unprotected left main coronary disease." Circulation 120(22): 2214-2221. Michelson, A. D., M. I. Furman, P. Goldschmidt-Clermont, M. A. Mascelli, C. Hendrix, L. Coleman, J. Hamlington, M. R. Barnard, T. Kickler, D. J. Christie, S. Kundu and P. F. Bray (2000). "Platelet GP IIIa Pl(A) polymorphisms display different sensitivities to agonists." Circulation 101(9): 1013-1018. Michos, E. D., R. Ardehali, R. S. Blumenthal, R. A. Lange and H. Ardehali (2006). "Aspirin and clopidogrel resistance." Mayo Clin Proc 81(4): 518-526. Mitsios, J. V., A. I. Papathanasiou, F. I. Rodis, M. Elisaf, J. A. Goudevenos and A. D. Tselepis (2004). "Atorvastatin does not affect the antiplatelet potency of clopidogrel when it is administered concomitantly for 5 weeks in patients with acute coronary syndromes." Circulation 109(11): 1335-1338. Montalescot, G., U. Sechtem, S. Achenbach, F. Andreotti, C. Arden, A. Budaj, R. Bugiardini, F. Crea, T. Cuisset, C. Di Mario, J. R. Ferreira, B. J. Gersh, A. K. Gitt, J. S. Hulot, N. Marx, L. H. Opie, M. Pfisterer, E. Prescott, F. Ruschitzka, M. Sabate, R. Senior, D. P. Taggart, E. E. van der Wall, C. J. Vrints, J. L. Zamorano, S. Achenbach, H. Baumgartner, J. J. Bax, H. Bueno, V. Dean, C. Deaton, C. Erol, R. Fagard, R. Ferrari, D. Hasdai, A. W. Hoes, P. Kirchhof, J. Knuuti, P. Kolh, P. Lancellotti, A. Linhart, P. Nihoyannopoulos, M. F. Piepoli, P. Ponikowski, P. A. Sirnes, J. L. Tamargo, M. Tendera, A. Torbicki, W. Wijns, S. Windecker, J. Knuuti, M. Valgimigli, H. Bueno, M. J. Claeys, N. Donner-Banzhoff, C. Erol, H. Frank, C. Funck-Brentano, O. Gaemperli, J. R. Gonzalez-Juanatey, M. Hamilos, D. Hasdai, S. Husted, S. K. James, K. Kervinen, P. Kolh, S. D. Kristensen, P. Lancellotti, A. P. Maggioni, M. F. Piepoli, A. R. Pries, F. Romeo, L. Ryden, M. L. Simoons, P. A. Sirnes, P. G. Steg, A.

103

Timmis, W. Wijns, S. Windecker, A. Yildirir and J. L. Zamorano (2013). "2013 ESC guidelines on the management of stable coronary artery disease: The Task Force on the management of stable coronary artery disease of the European Society of Cardiology." Eur Heart J. Montalescot, G., G. Sideris, C. Meuleman, C. Bal-dit-Sollier, N. Lellouche, P. G. Steg, M. Slama, O. Milleron, J. P. Collet, P. Henry, F. Beygui and L. Drouet (2006). "A randomized comparison of high clopidogrel loading doses in patients with non-ST-segment elevation acute coronary syndromes: the ALBION (Assessment of the Best Loading Dose of Clopidogrel to Blunt Platelet Activation, Inflammation and Ongoing Necrosis) trial." J Am Coll Cardiol 48(5): 931-938. Montalescot, G., G. Sideris, C. Meuleman, C. Bal-dit-Sollier, N. Lellouche, P. G. Steg, M. Slama, O. Milleron, J. P. Collet, P. Henry, F. Beygui, L. Drouet and A. T. Investigators (2006). "A randomized comparison of high clopidogrel loading doses in patients with nonST-segment elevation acute coronary syndromes: the ALBION (Assessment of the Best Loading Dose of Clopidogrel to Blunt Platelet Activation, Inflammation and Ongoing Necrosis) trial." J Am Coll Cardiol 48(5): 931-938. Montalescot, G., S. D. Wiviott, E. Braunwald, S. A. Murphy, C. M. Gibson, C. H. McCabe, E. M. Antman and T.-T. investigators (2009). "Prasugrel compared with clopidogrel in patients undergoing percutaneous coronary intervention for ST-elevation myocardial infarction (TRITON-TIMI 38): double-blind, randomised controlled trial." Lancet 373(9665): 723-731. Montine, T. J., J. A. Sonnen, G. Milne, L. D. Baker and J. C. Breitner (2010). "Elevated ratio of urinary metabolites of thromboxane and prostacyclin is associated with adverse cardiovascular events in ADAPT." PLoS One 5(2): e9340.

104

Motovska, Z., P. Widimsky, R. Petr, D. Bilkova, I. Marinov, S. Simek, P. Kala and P.-S. Investigators (2009). "Factors influencing clopidogrel efficacy in patients with stable coronary artery disease undergoing elective percutaneous coronary intervention: statin's advantage and the smoking "paradox"." J Cardiovasc Pharmacol 53(5): 368-372. Moussa, I., M. Oetgen, G. Roubin, A. Colombo, X. Wang, S. Iyer, R. Maida, M. Collins, E. Kreps and J. W. Moses (1999). "Effectiveness of clopidogrel and aspirin versus ticlopidine and aspirin in preventing stent thrombosis after coronary stent implantation." Circulation 99(18): 2364-2366. Muller, I., F. Besta, C. Schulz, S. Massberg, A. Schonig and M. Gawaz (2003). "Prevalence of clopidogrel non-responders among patients with stable angina pectoris scheduled for elective coronary stent placement." Thromb Haemost 89(5): 783-787. Ndrepepa, G., S. Braun, R. Iijima, D. Keta, R. A. Byrne, S. Schulz, J. Mehilli, A. Schomig and A. Kastrati (2009). "Total leucocyte count, but not C-reactive protein, predicts 1-year mortality in patients with acute coronary syndromes treated with percutaneous coronary intervention." Clin Sci (Lond) 116(8): 651-658. Neubauer, H., B. Gunesdogan, C. Hanefeld, M. Spiecker and A. Mugge (2003). "Lipophilic statins interfere with the inhibitory effects of clopidogrel on platelet function--a flow cytometry study." Eur Heart J 24(19): 1744-1749. Neubauer, H., S. Lask, A. Engelhardt and A. Mugge (2008). "How to optimise clopidogrel therapy? Reducing the low-response incidence by aggregometry-guided therapy modification." Thromb Haemost 99(2): 357-362. Newman, P. J., R. S. Derbes and R. H. Aster (1989). "The human platelet alloantigens, PlA1 and PlA2, are associated with a leucine33/proline33 amino acid polymorphism in membrane glycoprotein IIIa, and are distinguishable by DNA typing." J Clin Invest 83(5): 1778-1781.

105

Nguyen, T. A., J. G. Diodati and C. Pharand (2005). "Resistance to clopidogrel: a review of the evidence." J Am Coll Cardiol 45(8): 1157-1164. Oberle, S., T. Polte, A. Abate, H. P. Podhaisky and H. Schroder (1998). "Aspirin increases ferritin synthesis in endothelial cells: a novel antioxidant pathway." Circ Res 82(9): 10161020. Ohlmann, P., K. L. Laugwitz, B. Nurnberg, K. Spicher, G. Schultz, J. P. Cazenave and C. Gachet (1995). "The human platelet ADP receptor activates Gi2 proteins." Biochem J 312 ( Pt 3): 775-779. Osmancik, P., R. Jirmar, K. Hulikova, Z. Peroutka, A. Pompachova, Z. Motovska and P. Widimsky (2010). "A comparison of the VASP index between patients with hemodynamically complicated and uncomplicated acute myocardial infarction." Catheter Cardiovasc Interv 75(2): 158-166. Osmancik, P. P., F. Bednar and H. Mocikova (2007). "Glycemia, triglycerides and disease severity are best associated with higher platelet activity in patients with stable coronary artery disease." J Thromb Thrombolysis 24(2): 105-107. Pare, G., S. R. Mehta, S. Yusuf, S. S. Anand, S. J. Connolly, J. Hirsh, K. Simonsen, D. L. Bhatt, K. A. Fox and J. W. Eikelboom (2010). "Effects of CYP2C19 genotype on outcomes of clopidogrel treatment." N Engl J Med 363(18): 1704-1714. Park, S. H., W. Kim, C. S. Park, W. Y. Kang, S. H. Hwang and W. Kim (2009). "A comparison of clopidogrel responsiveness in patients with versus without chronic renal failure." Am J Cardiol 104(9): 1292-1295. Patti, G., G. Colonna, V. Pasceri, L. L. Pepe, A. Montinaro and G. Di Sciascio (2005). "Randomized trial of high loading dose of clopidogrel for reduction of periprocedural myocardial infarction in patients undergoing coronary intervention: results from the

106

ARMYDA-2 (Antiplatelet therapy for Reduction of MYocardial Damage during Angioplasty) study." Circulation 111(16): 2099-2106. Patti, G., A. Nusca, F. Mangiacapra, L. Gatto, A. D'Ambrosio and G. Di Sciascio (2008). "Point-of-care measurement of clopidogrel responsiveness predicts clinical outcome in patients undergoing percutaneous coronary intervention results of the ARMYDA-PRO (Antiplatelet therapy for Reduction of MYocardial Damage during Angioplasty-Platelet Reactivity Predicts Outcome) study." J Am Coll Cardiol 52(14): 1128-1133. Paulu, P., P. Osmancik, P. Tousek, M. Minarik, L. Benesova, Z. Motovska, F. Bednar, V. Kocka and P. Widimsky (2013). "Lack of association between clopidogrel responsiveness tested using point-of-care assay and prognosis of patients with coronary artery disease." J Thromb Thrombolysis 36(1): 1-6. Peto, R., R. Gray, R. Collins, K. Wheatley, C. Hennekens, K. Jamrozik, C. Warlow, B. Hafner, E. Thompson, S. Norton and et al. (1988). "Randomised trial of prophylactic daily aspirin in British male doctors." Br Med J (Clin Res Ed) 296(6618): 313-316. Pinckard, R. N., D. Hawkins and R. S. Farr (1968). "In vitro acetylation of plasma proteins, enzymes and DNA by aspirin." Nature 219(5149): 68-69. Price, M. J. (2009). "Bedside evaluation of thienopyridine antiplatelet therapy." Circulation 119(19): 2625-2632. Price, M. J., P. B. Berger, P. S. Teirstein, J. F. Tanguay, D. J. Angiolillo, D. Spriggs, S. Puri, M. Robbins, K. N. Garratt, O. F. Bertrand, M. E. Stillabower, J. R. Aragon, D. E. Kandzari, C. T. Stinis, M. S. Lee, S. V. Manoukian, C. P. Cannon, N. J. Schork, E. J. Topol and G. Investigators (2011). "Standard- vs high-dose clopidogrel based on platelet function testing after percutaneous coronary intervention: the GRAVITAS randomized trial." JAMA 305(11): 1097-1105.

107

Price, M. J., S. Endemann, R. R. Gollapudi, R. Valencia, C. T. Stinis, J. P. Levisay, A. Ernst, N. S. Sawhney, R. A. Schatz and P. S. Teirstein (2008). "Prognostic significance of postclopidogrel platelet reactivity assessed by a point-of-care assay on thrombotic events after drug-eluting stent implantation." Eur Heart J 29(8): 992-1000. Rabhi-Sabile, S., C. de Romeuf and D. Pidard (1998). "On the mechanism of plasmin-induced aggregation of human platelets: implication of secreted von Willebrand factor." Thromb Haemost 79(6): 1191-1198. Rand, M. L., R. Leung and M. A. Packham (2003). "Platelet function assays." Transfus Apher Sci 28(3): 307-317. Rehmel, J. L., J. A. Eckstein, N. A. Farid, J. B. Heim, S. C. Kasper, A. Kurihara, S. A. Wrighton and B. J. Ring (2006). "Interactions of two major metabolites of prasugrel, a thienopyridine antiplatelet agent, with the cytochromes P450." Drug Metab Dispos 34(4): 600-607. Robinson, M. and J. Horn (2003). "Clinical pharmacology of proton pump inhibitors: what the practising physician needs to know." Drugs 63(24): 2739-2754. Roth, G. J. and D. C. Calverley (1994). "Aspirin, platelets, and thrombosis: theory and practice." Blood 83(4): 885-898. Sabatine, M. S., C. P. Cannon, C. M. Gibson, J. L. Lopez-Sendon, G. Montalescot, P. Theroux, M. J. Claeys, F. Cools, K. A. Hill, A. M. Skene, C. H. McCabe and E. Braunwald (2005). "Addition of clopidogrel to aspirin and fibrinolytic therapy for myocardial infarction with ST-segment elevation." N Engl J Med 352(12): 1179-1189. Sabatine, M. S., C. P. Cannon, C. M. Gibson, J. L. Lopez-Sendon, G. Montalescot, P. Theroux, B. S. Lewis, S. A. Murphy, C. H. McCabe, E. Braunwald and I. Clopidogrel as Adjunctive Reperfusion Therapy -Thrombolysis in Myocardial Infarction (2005). "Effect of clopidogrel pretreatment before percutaneous coronary intervention in patients with ST-

108

elevation myocardial infarction treated with fibrinolytics: the PCI-CLARITY study." JAMA 294(10): 1224-1232. Sadanandan, S. and I. M. Singh (2012). "Clopidogrel: the data, the experience, and the controversies." Am J Cardiovasc Drugs 12(6): 361-374. Sanmuganathan, P. S., P. Ghahramani, P. R. Jackson, E. J. Wallis and L. E. Ramsay (2001). "Aspirin for primary prevention of coronary heart disease: safety and absolute benefit related to coronary risk derived from meta-analysis of randomised trials." Heart 85(3): 265-271. Savi, P., J. Combalbert, C. Gaich, M. C. Rouchon, J. P. Maffrand, Y. Berger and J. M. Herbert (1994). "The antiaggregating activity of clopidogrel is due to a metabolic activation by the hepatic cytochrome P450-1A." Thromb Haemost 72(2): 313-317. Serebruany, V. L., A. I. Malinin, S. D. Jerome, D. R. Lowry, A. W. Morgan, D. C. Sane, J. F. Tanguay, S. R. Steinhubl and M. O'Connor C (2003). "Effects of clopidogrel and aspirin combination versus aspirin alone on platelet aggregation and major receptor expression in patients with heart failure: the Plavix Use for Treatment Of Congestive Heart Failure (PLUTO-CHF) trial." Am Heart J 146(4): 713-720. Serebruany, V. L., M. G. Midei, A. I. Malinin, B. R. Oshrine, D. R. Lowry, D. C. Sane, J. F. Tanguay, S. R. Steinhubl, P. B. Berger, C. M. O'Connor and C. H. Hennekens (2004). "Absence of interaction between atorvastatin or other statins and clopidogrel: results from the interaction study." Arch Intern Med 164(18): 2051-2057. Serebruany, V. L., S. R. Steinhubl, P. B. Berger, A. I. Malinin, D. L. Bhatt and E. J. Topol (2005). "Variability in platelet responsiveness to clopidogrel among 544 individuals." J Am Coll Cardiol 45(2): 246-251. Shankar, H., B. N. Kahner, J. Prabhakar, P. Lakhani, S. Kim and S. P. Kunapuli (2006). "Gprotein-gated inwardly rectifying potassium channels regulate ADP-induced cPLA2 activity in platelets through Src family kinases." Blood 108(9): 3027-3034.

109

Schedel, A., P. Schloss, H. Kluter and P. Bugert (2008). "The dopamine agonism on ADPstimulated platelets is mediated through D2-like but not D1-like dopamine receptors." Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 378(4): 431-439. Schror, K. (1995). "Antiplatelet drugs. A comparative review." Drugs 50(1): 7-28. Schwarz, U. R., U. Walter and M. Eigenthaler (2001). "Taming platelets with cyclic nucleotides." Biochem Pharmacol 62(9): 1153-1161. Sibbing, D., S. Braun, T. Morath, J. Mehilli, W. Vogt, A. Schomig, A. Kastrati and N. von Beckerath (2009). "Platelet reactivity after clopidogrel treatment assessed with point-of-care analysis and early drug-eluting stent thrombosis." J Am Coll Cardiol 53(10): 849-856. Sigwart, U., J. Puel, V. Mirkovitch, F. Joffre and L. Kappenberger (1987). "Intravascular stents to prevent occlusion and restenosis after transluminal angioplasty." N Engl J Med 316(12): 701-706. Siller-Matula, J. M., B. Jilma, K. Schror, G. Christ and K. Huber (2010). "Effect of proton pump inhibitors on clinical outcome in patients treated with clopidogrel: a systematic review and meta-analysis." J Thromb Haemost 8(12): 2624-2641. Simon, T., C. Verstuyft, M. Mary-Krause, L. Quteineh, E. Drouet, N. Meneveau, P. G. Steg, J. Ferrieres, N. Danchin, L. Becquemont, S. T. E. French Registry of Acute and S. T. E. M. I. I. Non (2009). "Genetic determinants of response to clopidogrel and cardiovascular events." N Engl J Med 360(4): 363-375. Sneader, W. (2000). "The discovery of aspirin: a reappraisal." BMJ 321(7276): 1591-1594. Snoep, J. D., M. M. Hovens, J. C. Eikenboom, J. G. van der Bom, J. W. Jukema and M. V. Huisman (2007). "Clopidogrel nonresponsiveness in patients undergoing percutaneous coronary intervention with stenting: a systematic review and meta-analysis." Am Heart J 154(2): 221-231.

110

Sofi, F., R. Marcucci, A. M. Gori, B. Giusti, R. Abbate and G. F. Gensini (2010). "Clopidogrel non-responsiveness and risk of cardiovascular morbidity. An updated metaanalysis." Thromb Haemost 103(4): 841-848. Spiewak, M., L. A. Malek, G. Kostrzewa, B. Kisiel, A. Serafin, K. J. Filipiak, R. Ploski and G. Opolski (2009). "Influence of C3435T multidrug resistance gene-1 (MDR-1) polymorphism on platelet reactivity and prognosis in patients with acute coronary syndromes." Kardiol Pol 67(8): 827-834. Steer, K. A., T. M. Wallace, C. H. Bolton and M. Hartog (1997). "Aspirin protects low density lipoprotein from oxidative modification." Heart 77(4): 333-337. Steg, P. G., S. K. James, D. Atar, L. P. Badano, C. Blomstrom-Lundqvist, M. A. Borger, C. Di Mario, K. Dickstein, G. Ducrocq, F. Fernandez-Aviles, A. H. Gershlick, P. Giannuzzi, S. Halvorsen, K. Huber, P. Juni, A. Kastrati, J. Knuuti, M. J. Lenzen, K. W. Mahaffey, M. Valgimigli, A. van 't Hof, P. Widimsky and D. Zahger (2012). "ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation." Eur Heart J 33(20): 2569-2619. Steinhubl, S. R., P. B. Berger, J. T. Mann, 3rd, E. T. Fry, A. DeLago, C. Wilmer and E. J. Topol (2002). "Early and sustained dual oral antiplatelet therapy following percutaneous coronary intervention: a randomized controlled trial." JAMA 288(19): 2411-2420. Sudic, D., M. Razmara, M. Forslund, Q. Ji, P. Hjemdahl and N. Li (2006). "High glucose levels enhance platelet activation: involvement of multiple mechanisms." Br J Haematol 133(3): 315-322. Szczeklik, A., J. Musial, A. Undas, J. Swadzba, P. F. Gora, W. Piwowarska and M. Duplaga (1996). "Inhibition of thrombin generation by aspirin is blunted in hypercholesterolemia." Arterioscler Thromb Vasc Biol 16(8): 948-954.

111

Szto, G. Y., T. J. Linnemeier and M. W. Ball (1999). "Fatal neutropenia and thrombocytopenia associated with ticlopidine after stenting." Am J Cardiol 83(1): 138-139, A110. Taubert, D., A. Kastrati, S. Harlfinger, O. Gorchakova, A. Lazar, N. von Beckerath, A. Schomig and E. Schomig (2004). "Pharmacokinetics of clopidogrel after administration of a high loading dose." Thromb Haemost 92(2): 311-316. Taubert, D., N. von Beckerath, G. Grimberg, A. Lazar, N. Jung, T. Goeser, A. Kastrati, A. Schomig and E. Schomig (2006). "Impact of P-glycoprotein on clopidogrel absorption." Clin Pharmacol Ther 80(5): 486-501. Theroux, P., H. Ouimet, J. McCans, J. G. Latour, P. Joly, G. Levy, E. Pelletier, M. Juneau, J. Stasiak, P. deGuise and et al. (1988). "Aspirin, heparin, or both to treat acute unstable angina." N Engl J Med 319(17): 1105-1111. Toda, N., T. Matsumoto and K. Yoshida (1992). "Comparison of hypoxia-induced contraction in human, monkey, and dog coronary arteries." Am J Physiol 262(3 Pt 2): H678-683. Trenk, D., G. W. Stone, M. Gawaz, A. Kastrati, D. J. Angiolillo, U. Muller, G. Richardt, J. A. Jakubowski and F. J. Neumann (2012). "A randomized trial of prasugrel versus clopidogrel in patients with high platelet reactivity on clopidogrel after elective percutaneous coronary intervention with implantation of drug-eluting stents: results of the TRIGGER-PCI (Testing Platelet Reactivity In Patients Undergoing Elective Stent Placement on Clopidogrel to Guide Alternative Therapy With Prasugrel) study." J Am Coll Cardiol 59(24): 2159-2164. Turner, S. J., T. R. Ketch, S. K. Gandhi and D. C. Sane (2008). "Routine hematologic clinical tests as prognostic markers in patients with acute coronary syndromes." Am Heart J 155(5): 806-816. van Giezen, J. J. and R. G. Humphries (2005). "Preclinical and clinical studies with selective reversible direct P2Y12 antagonists." Semin Thromb Hemost 31(2): 195-204.

112

Vane, J. R. (1971). "Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like drugs." Nat New Biol 231(25): 232-235. Verstuyft, C., T. Simon and R. B. Kim (2009). "Personalized medicine and antiplatelet therapy: ready for prime time?" Eur Heart J 30(16): 1943-1963. von Beckerath, N., D. Taubert, G. Pogatsa-Murray, E. Schomig, A. Kastrati and A. Schomig (2005). "Absorption, metabolization, and antiplatelet effects of 300-, 600-, and 900-mg loading doses of clopidogrel: results of the ISAR-CHOICE (Intracoronary Stenting and Antithrombotic Regimen: Choose Between 3 High Oral Doses for Immediate Clopidogrel Effect) Trial." Circulation 112(19): 2946-2950. Wallentin, L. C. (1991). "Aspirin (75 mg/day) after an episode of unstable coronary artery disease: long-term effects on the risk for myocardial infarction, occurrence of severe angina and the need for revascularization. Research Group on Instability in Coronary Artery Disease in Southeast Sweden." J Am Coll Cardiol 18(7): 1587-1593. Wang, J. C., D. Aucoin-Barry, D. Manuelian, R. Monbouquette, M. Reisman, W. Gray, P. C. Block, E. H. Block, M. Ladenheim and D. I. Simon (2003). "Incidence of aspirin nonresponsiveness using the Ultegra Rapid Platelet Function Assay-ASA." Am J Cardiol 92(12): 1492-1494. Wang, T. H., D. L. Bhatt and E. J. Topol (2006). "Aspirin and clopidogrel resistance: an emerging clinical entity." Eur Heart J 27(6): 647-654. Weber, A. A., K. C. Zimmermann, J. Meyer-Kirchrath and K. Schror (1999). "Cyclooxygenase-2 in human platelets as a possible factor in aspirin resistance." Lancet 353(9156): 900. Weiss, H. J., L. M. Aledort and S. Kochwa (1968). "The effect of salicylates on the hemostatic properties of platelets in man." J Clin Invest 47(9): 2169-2180.

113

Xie, H. G., A. J. Wood, R. B. Kim, C. M. Stein and G. R. Wilkinson (2004). "Genetic variability in CYP3A5 and its possible consequences." Pharmacogenomics 5(3): 243-272. Yip, H. K., A. A. Youssef, L. T. Chang, C. H. Yang, J. J. Sheu, S. Chua, K. H. Yeh, F. Y. Lee, C. J. Wu and C. L. Hang (2007). "Association of interleukin-10 level with increased 30day mortality in patients with ST-segment elevation acute myocardial infarction undergoing primary coronary intervention." Circ J 71(7): 1086-1091. Yusuf, S., F. Zhao, S. R. Mehta, S. Chrolavicius, G. Tognoni, K. K. Fox and I. Clopidogrel in Unstable Angina to Prevent Recurrent Events Trial (2001). "Effects of clopidogrel in addition to aspirin in patients with acute coronary syndromes without ST-segment elevation." N Engl J Med 345(7): 494-502. Zabalza, M., I. Subirana, J. Sala, C. Lluis-Ganella, G. Lucas, M. Tomas, R. Masia, J. Marrugat, R. Brugada and R. Elosua (2012). "Meta-analyses of the association between cytochrome CYP2C19 loss- and gain-of-function polymorphisms and cardiovascular outcomes in patients with coronary artery disease treated with clopidogrel." Heart 98(2): 100108. Zimmermann, N., M. Kurt, A. Wenk, J. Winter, E. Gams and T. Hohlfeld (2005). "Is cardiopulmonary bypass a reason for aspirin resistance after coronary artery bypass grafting?" Eur J Cardiothorac Surg 27(4): 606-610. Zimmermann, N., A. Wenk, U. Kim, P. Kienzle, A. A. Weber, E. Gams, K. Schror and T. Hohlfeld (2003). "Functional and biochemical evaluation of platelet aspirin resistance after coronary artery bypass surgery." Circulation 108(5): 542-547.

114

PŘEHLED LITERATURY AUTORA:

Publikace s IF: 1. Paulu P, Osmancik P, Tousek P, Minark M, Benesova L, Bednar F, Motovska Z, Petr R, Kocka V, Widimsky P. Lack of association between clopidogrel responsiveness tested by point-of-care assay and prognosis of patients with coronary artery disease. J Thromb Thrombolysis 2013 Jul;36(1):1-6, IF 1, 98 2. Osmancik P, Paulu P, Tousek P, Kocka V, Widimsky P. High leukocyte count and interleukin-10 predict high on-treatment-platelet-reactivity in patients treated with clopidogrel. Thromb Thrombolysis. 2012 May;33(4):349-54, IF 1, 47 3. Osmancik P, Teringova E, Tousek P, Paulu P, Widimsky P. Prognostic value of TNFrelated apoptosis inducing ligand (TRAIL) in acute coronary syndrome patients. PLoS One. 2013;8(2):e53860, IF 3,73 4. Tousek P, Osmancik P, Paulu P, Kocka V, Widimsky P. Clopidogrel Up-Titration Versus Standard Dose in Patients with High Residual Platelet Reactivity After Percutaneous Coronary Intervention: A Single-Center Pilot Randomised Study. Int J Cardiol 2011;150(2):231-2, IF 7,07

Publikace bez IF: 1. Paulů P, Toušek P, Osmančík P. Antiagregační léčba- přehled preparátů, přínos klinické praxi a možnosti stanovení rezistence na léčbu. Prakt. Lék. 2011; 91 (2): 73-76 2. Osmančík P, Paulů P, Toušek P, Bednář F, Moťovská Z, Widimský P. Měření aktivity trombocytů a účinnosti antiagregační léčby. Cor Vasa 2010;52(Suppl 1):15–20

115

Abstrakta z konferencí: 1. Paulu P, Tousek P, Osmancik P, Petr R, Bednar F, Widimsky P. The Influence of Platelet Count and Platelet Mean Volume on High On-Treatment Platelet Reactivity in Patients After PCI. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2010; Suppl: p.230 (P662) Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2011 Scientific Sessions, Chicago, USA 2. Paulu P, Tousek P, Osmancik P, Petr R, Bednar F, Widimsky P. Role of Routine Assessment of Clopidogrel Resistance by Verifynow Assay for Prediction of Acute and Subacute Stent Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2010;Suppl.:p.158 (P464) Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2011 Scientific Sessions, Chicago, USA 3. Paulu P, Tousek P, Osmancik P, Petr R, Bednar F, Widimsky P. Diabetic Patients Exhibit Sufficient Effect of Clopidogrel Despite Higher Platelet Reactivity Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2010;Suppl.: p91(P257) Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2011 Scientific Sessions, Chicago, USA 4. Paulu P, Osmancik P, Tousek P, Widimský P. Resistance to clopidogrel – etiology, measurement and impact on the prognosis of patients with coronary artery disease. 10th International Medical Postgraduate Conference 2013; 57-59, Hradec Králové 5. Tousek P, Osmancik P, Paulu P, Kocka V, Widimsky P. Clopidogrel Up-Titration Versus Standard Dose in Patients with High Residual Platelet Reactivity After Percutaneous Coronary Intervention: A Single-Center Pilot Randomised Study. Circulation 2011;124:A11369 American Heart Association Scientific Session 2011, Orlando, USA 6. Paulů P, Toušek P, Widimský P, Moťovská Z, Osmančík P. Clopidogrelová rezistence v reálné praxi, etiologie, příčiny a dopad na prognózu pacientů. Cor Vasa Suppl 2011. XIX. Výroční sjezd České kardiologické společnosti, Brno 2011 7. Paulů P, Toušek P, Kočka V, Bednář F, Červinka P, Osmančík P, Línková H, Havlíková M, Widimský P. Stanovení efektu clopidogrelu pomocí VerifyNow P2Y12 u pacientů

116

podstupujících transkutánní implantaci aortální chlopně. Cor Vasa Suppl 2011. XIX. Výroční sjezd České kardiologické společnosti, Brno 2011 8. Paulů P, Osmančík P, Toušek P, Teringová E,Widimský P. Určení prognózy pacientů s nedostatečnou odpovědí na clopidogrel pomocí VerifyNow, genetického vyšetření a dalších klinických a laboratorních ukazatelů. Cor Vasa Suppl 2012. XX. Výroční sjezd České kardiologické společnosti, Brno 2012 9. Paulů P, Osmančík P, Toušek P.Vyšší reaktivita destiček při duální protidestičkové léčbě je spojena s vyšší hladinou IL-10 a leukocytů. Cor Vasa Suppl 2012. XX. Výroční sjezd České kardiologické společnosti, Brno 2012 10. Paulů P, Osmančík P, Toušek P, Widimský P. Predikce hemoragických komplikací pomocí klinických, laboratorních a genetických ukazatelů u pacientů s ischemickou chorobou srdeční léčených duální protidestičkovou léčbou. Cor Vasa Suppl 2013. XXI. Výroční sjezd České kardiologické společnosti, Brno 2013 11. Toušek P, Paulů P, Osmančík P, Kočka V, Lisa L, Buděšínský T, Widimský P. Cílená titrace versus standardní dávka clopidogrelu po perkutánní koronární intervenci s rezistencí na clopidogrel: pilotní randomizovaná studie. Cor Vasa Suppl 2011. XIX. Výroční sjezd České kardiologické společnosti, Brno 2011

117

118