Probiotika v pediatrii: Snížení rizika nosokomiálních infekcí perorálním osídlením probiotickým kmenem E.coli po narození a jeho vliv na frekvenci opakovaných infekcí a alergií po 10 a 20 letech Probiotics in Pediatrics: Reduction of Risk of Hospital Infections by Oral Colonization with a Probiotic E.coli Strain after Birth. Influence on the Frequency of Allergic and Infectious Diseases after 10 and 20 Years RAJA LODINOVÁ-ŽÁDNÍKOVÁ Ústav pro péči o matku a dítě, Praha-Podolí SOUHRN Výsledky našich studií potvrdily, že probiotický kmen E.coli perorálně podávaný po narození rychle osídlí střevní trakt novorozence, dochází k jeho kvantitativní převaze a stává se kmenem dominantním. Dlouhodobá přítomnost kmene ve střevě snižovala počet patogenů, osídlujících střevní, ale i jiné sliznice, výskyt onemocnění a nutnost podávání antibiotik u nedonošených a rizikových dětí. Příznivé působení podávaného kmene je možné vysvětlit stimulací lokální i celkové imunitní odpovědi. Časná indukce vlastní tvorby sekrečního IgA je zvláště významná u nekojených dětí. Nahrazení přirozeného, leč náhodného osídlení střeva cíleným osídlením probiotickým kmenem E.coli s výhodnými vlastnostmi snížilo u nedonošených dětí významně počet nosokomiálních infekcí. Ještě po 10 letech pak byl u této skupiny prokázán nižší výskyt opakovaných infekcí (23 %) než u dětí kontrolních (58 %). Cílené osídlení po narození kmenem E.coli mělo též dlouhodobý vliv na výskyt alergických onemocnění – významně nižší počet alergií byl prokázán po 10 a 20 letech (12 % po 10 letech, 16 % po 20 letech u osídlených dětí, 33 % a 32 % po 10 a 20 letech u kontrolních dětí). Výsledky jsou v souladu se současnými údaji ve světové literatuře o stoupajícím významu střevní flóry, která je důležitým modulátorem vývoje imunitních funkcí pro vznik alergických onemocnění. Kontrolovaná kolonizace probiotickými bakteriemi by tak mohla být užitečným preventivním i terapeutickým opatřením. Klíčová slova: osídlení střeva, prevence infekce a alergie, děti SUMMARY After oral administration of an probiotic, non-pathogenic E.coli the strain colonized effectively the intestine in full-term and preterm infants and remained dominant for many weeks showing, that it was capable to establish itself as a resident strain in the infant´s gut. The presence of E.coli stimulated significantly antibody production in gut, saliva and serum of colonized infants. An early induction of secretory IgA production is important particularly in formula-fed infants, where it partly replaces the lacking immunoglobulin supplied with mother milk. In full-term and premature infants the early presence of a non-pathogenic E.coli strain in the intestine decreased significantly the presence of bacterial pathogens in the intestine but also other mucosal surfaces of the body, decreased the number of nosocomial infections and the need for antibiotics. The effect of intentional E.coli colonization of the intestine after birth offering the advantage of the first colonizer, was both immediately beneficial to the infant (lower incidence of infections) and decreased an incidence of allergies and repeated infections in its later life. After 10 years the differences in occurrence of allergies between colonized and control subjects were statistically significant (12 % vs. 33 %) and remained significant after 20 years (16 % vs. 32 %, p < 0.01). Occurrence of repeated infections after 10 years was significantly lower in colonized than in control subjects (23 % vs. 58 %, p < 0.01); after 20 years there was no difference between these groups. Key words: intestinal colonization, prevention of infections and allergy, infants
Úvod V prvních hodinách po narození přichází dítě do styku s mikroorganismy vnějšího prostředí a povrchy jeho sliznic se osídlí bakteriální flórou. Tento první kontakt s bakteriálními antigeny představuje mohutný podnět pro rozvoj imunitních mechanismů, zároveň však znamená potenciální nebezpečí pro vznik infekce. Kapacita kmene vyvolat imunitní odpověď závisí na jeho schopnosti přetrvávat ve střevě (3, 24). Střevní flóra tvoří rovněž bariéru proti invazi patogenů (adherence, kompetice o receptory sliznice). Normální střevní mikroflóra je důležitým modulátorem lokálních i celkových imunitních reakcí (6). Klasická představa sekvence osídlení střeva: 1) aerobní či fakultativně anaerobní kmeny, tj. hlavně kmeny E.coli, které bývají identické s kmeny matky (je-li dítě matkou ošetřováno), vytvoří prostředí pro anaerobní bifidovou flóru spotřebou kyslíku. Je-li dítě kojené, převládne 2) anaerobní bifidová flóra. Sekreční IgA kolostra a mléka počne vykonávat svou funkci, tj. mimo jiné brání adhezi patogenů na sliznici, která předchází infekci. Mateřské mléko obsahuje specifické protilátky, jejichž spektrum je zrcadlovým obrazem antigenů ve střevě (4). Pokud je dítě kojené, je modulace lokální vrozené i adaptivní imunitní odpovědi v průběhu osídlování výrazně ovlivněna přítomností receptoru s CD14 v mateřském mléce (12). Městecký (18) prokázal určitý typ lokální IgA odpovědi, která umožňuje přetrvávání rezidentních kmenů a zesiluje imunitní odpověď střevních lymfatik. U nekojených dětí je střevní flóra pestřejší, objevují se různé druhy enterobakterií a bifidové flóry ubývá. Stejně je tomu při déledobé hospitalizaci. Normální střevní flóra je tedy důležitým modulátorem vývoje imunitních funkcí střeva. Výsledky studií u zvířat vedou k hypotéze, že specifické kmeny
střevní mikroflóry podporují ochranu hostitele proti senzibilizaci a vzniku alergií. U bezmikrobních zvířat chybí indukce vývoje tolerance. Po obnovení střevní flóry (avšak pouze stane-li se tak v neonatálním období) obnoví se vnímavost Th1 a Th2 odpovědi k orální indukci tolerance (22). Ověření u lidí zatím chybí. Ontogeneze alergické slizniční odpovědi není dosud plně objasněna. Je známo, že je ovlivněna 1) kojením, 2) aktivací dendritických buněk, které představují primární antigen prezentující buňky a 3) determinující úlohou cytokinů. Fetální Th2 cytokiny u zdravých dětí rychle klesají v průběhu prvního roku života, avšak u alergických dětí jejich hladina stoupá (9). Přežívání nedonošených dětí i s velmi nízkou porodní hmotností se v průběhu posledních 20 let výrazně zvýšilo. Závažným problémem však zůstaly nosokomiální infekce. Používání antibiotik je často nutností a má za následek stoupající výskyt rezistentních kmenů (23) i ovlivnění imunitní odpovědi (2). Pokud je dítě donošené, je vybaveno řadou obranných mechanismů: 1) transplacentárně přenesenými protilátkami od matky 2) humorálními a celulárními ochrannými složkami mateřského mléka, kterých je popsáno více než 100 3) plně vyvinutým vlastním imunitním systémem. Nedonošené dítě však má: 1) omezený přenos protilátek od matky 2) nezralý a „nezkušený“ imunitní systém 3) většinou není kojené a chybí mu ochranný vliv mateřského mléka 4) riziko infekce je dále zvýšeno nutností poměrně dlouhé hospitalizace 5) častá aplikace antibiotik naruší složení normální střevní mikroflóry a v některých případech působí depresivně na rozvoj imunitních funkcí. Vznikají rezistentní nemocniční kmeny a organismus těchto dětí je navíc vnímavý proti infekcím, na které v pozdějším věku již nereaguje. Nahrazení přirozeného, leč náhodného osídlení střevního traktu cíleným perorálním osídlením nepatogenními kmeny bylo popsáno četnými autory. Byly použity různé kmeny E.coli a laktobacilů, zvaných probiotika. Probiotika jsou definována jako „mono nebo smíšené kultury živých mikroorganismů, které kladně působí na hostitele vytvářením vyrovnaného a správného složení střevní mikroflóry (5). Mechanismus působení probiotických bakterií je 1) posílení neimunologické střevní bariéry (úprava mikroekologie, normalizace, event. zvýšené permeability, 2) zvýšení imunologické střevní bariéry (zvýšení IgA odpovědi, zvýšení aktivity makrofágů a T buněk), kontrola rovnováhy tvorby pro a proti zánětlivých cytokinů, 3) specifická kompetice o receptory střevní sliznice a jejich obsazení, 4) zmírnění zánětlivé odpovědi ve střevě a příznivé působení v léčbě atopické dermatitidy a potravinové alergie (7). Jako probiotika jsou většinou používány kmeny laktobacilů a bifidobakterií. Tyto bakterie však rychle mizí ze střeva po skončeném podávání – nenastává tedy dlouhodobá kolonizace ani dlouhodobá stimulace imunitní odpovědi (11, 10, 21). Některé studie uvádějí výsledky cíleného osídlení střeva nepatogenními kmeny E.coli u dětí. Působení bylo výrazně příznivé v prevenci nosokomiálních infekcí, snížení vzniku rezistentních kmenů a úpravě střevní mikroflóry (13). Výsledky osídlení střeva nepatogenním kmenem E.coli (kmen Nissle, vakcína Mutaflor) ukazují v dvojitě-slepé studii přetrvávání podaného kmene v naprosté převaze a snížení osídlení střeva patogeny do věku 6 měsíců (14). Chceme podat stručný přehled některých dosažených výsledků sledování vlivu osídlování střevního traktu probiotickým kmenem E.coli, s kterým pracujeme od r. 1965, na počet patogenů, nutnost podávání antibiotik, prevenci nosokomiálních infekcí u donošených a nedonošených dětí a ovlivnění výskytu alergií. Studie byly schváleny etickou komisí ústavu.
Popis kmene E.coli, z kterého je připravována živá vakcína, je nepatogenní kmen, jeho sérotyp je 083:K24:H31 a je uložen v Čs. Sbírce typových kmenů. Jde o vysoce selektovaný, produktivní kmen s obvyklými biochemickými reakcemi. Je citlivý na všechna běžná antibiotika: netvoří enterotoxin, nepatří mezi žádné ze skupin enteropatogenních E.coli. Nemá prokazatelný žádný plazmid (ani kryptický) a frekvence přenosu R1 plazmidu z donorové kultury je asi 100krát nižší než u kontrolního standardního kmene E.coli. Jeho neobvykle dobrá kolonizační schopnost je pravděpodobně zajištěna přítomností t1 fimbrií, prokázaných hemaglutinací, adherenčním testem a elektronmikroskopicky. Experimentálně byly vlastnosti kmene sledovány na bezmikrobních, bezkolostrálních selatech. Po perorální aplikaci suspenze byla prokázána translokace mikrobů pouze do mezenteriálních uzlin, zatímco ve slezině, plicích a játrech nebyla přítomnost mikrobů zjištěna. Nebyly též nalezeny žádné morfologické ani histologické změny střevní sliznice. Po intravenózní aplikaci kmen do 24 hodin z oběhu vymizel. Přítomnost kmene ve střevě nevyvolala žádné změny ve zdravotním stavu 15 sledovaných zvířat, která jinak okamžitě a citlivě reagují na přítomnost kteréhokoli z faktorů virulence. Kmen E.coli 083:K24:H31 byl tedy pro bezmikrobní selata zcela nepatogenní. Aplikace kontrolních enteropatogenních kmenů E.coli vyvolala sepsi a uhynutí zvířat.
Sledované skupiny a výsledky U donošených a nedonošených novorozenců byl kmen E.coli podáván per os v dávce obsahující 5 x 108 mikrobů od druhého dne po narození, 3x týdně, po dobu 4 týdnů. Kmen E.coli přetrvával ve stolici sledovaných dětí v naprosté převaze po dobu 16 týdnů. Po dobu 8 týdnů byly děti prakticky monokontaminovány (Graf 1). Přítomnost kmene ve střevě vyvolala lokální imunitní odpověď. IgA protilátky ve filtrátech stolice byly významně vyšší u kojených osídlených i kontrolních dětí než u nekojených osídlených a kontrolních dětí, ve všech intervalech (p < 0.05). U nekojených osídlených dětí byly hodnoty IgA izotypu vyšší než u dětí nekojených, kontrolních, v intervalech 2-3 a 4-7 týdnů po osídlení (p < 0.05). Časná indukce vlastní tvorby sekrečního IgA je u těchto dětí zvláště významná, neboť zčásti nahrazuje chybění tohoto imunoglobulinu obsaženého v mateřském mléce (Graf 2) (15). Graf 1: Osídlení střevního traktu u novorozenců po perorálním podávání suspenze kmene E.coli Hladiny izotypu IgA ve slinách byly významně vyšší u obou skupin osídlených dětí (kojených i nekojených) ve srovnání s kontrolami nekojenými mezi 2.-11. týdnem po osídlení a mezi 4.-7. týdnem též ve srovnání s kontrolami kojenými (p < 0.01). Hodnoty IgM byly významně vyšší u obou osídlených skupin než u skupin kontrolních mezi 2.-7. týdnem po osídlení (p < 0.01) (Graf 3). V další části práce jsme využili neobyčejné schopnosti použitého kmene E.coli přetrvávat ve střevě po dlouhou dobu a stimulovat lokální, ale i celkovou imunitní odpověď v klinické praxi, především pro prevenci vzniku gastrointestinálních i jiných nosokomiálních infekcí. Na novorozeneckém oddělení byla po dobu 7 měsíců sledována přítomnost patogenních bakteriálních kmenů a výskyt infekcí u všech dětí, pro epidemii vyvolanou Klebsiellami. Další 4 měsíce byly všechny přijímané děti preventivně osídlovány kmenem E.coli (celkem 860 dětí). Před osídlováním byly celých 7 měsíců v průměru u 60% dětí
prokazovány ve stolici bakteriální patogeny (enteropatogenní kmeny E.coli, klebsiella, proteus, enterobacter) a 12% dětí onemocnělo dyspepsií. V průběhu 4 měsíců osídlování klesal postupně počet dětí s prokázanými patogeny na 23% a onemocnělo 0,49% dětí. Po skončeném osídlování ihned opět stoupl počet dětí s prokázanými patogeny na 54% a onemocnělo 4,4% dětí (Graf 4).
Graf 2: Hladiny izotypů IgA a IgM ve filtrátech stolice u osídlených a kontrolních dětí, stanovené metodou ELISA. Výsledky jsou vyjádřeny v % referenčních standardů, které jsou považovány na 100% Na oddělení intenzivní péče bylo osídlováno celkem 230 dětí ihned po přijetí (v případě podávání antibiotik po jejich vysazení) a dále 4 týdny 3krát týdně, event. kratší dobu, podle délky pobytu dítěte na oddělení. Osídlování probíhalo po dobu dvou 6měsíčních období. Dalších 204 dětí bylo po dobu dvou 5měsíčních období sledováno jako kontroly. Přítomnost kmene ve stolici byla prokázána u 87% osídlených dětí. Celkové infekce – sepse, meningitidy, pneumonie, virové infekce, kandidové infekce – se vyskytly u 19% osídlených a 37% kontrolních dětí. Bakteriální patogeny vymizely po osídlení u 86% dětí, a to nejen ze stolice, ale též z nosu, krku a jiných míst těla (likvor, moč, hemokultura). Antibiotika bylo třeba podávat u 27% dětí osídlené skupiny a u 46% dětí skupiny kontrolní (Tab. 1). Preventivní osídlení střevního traktu u rizikových dětí tedy snižovalo významně počet infekcí, přítomnost patogenů ve střevě i jinde a snižovalo nutnost podávání antibiotik (16). Dosud bylo perorální osídlení použito u více než 2500 dětí.
Graf 3: Hladiny izotypů IgA a IgM ve slinách u osídlených a kontrolních dětí, stanovené metodou ELISA. Výsledky jsou vyjádřeny v % referenčních standardů, které jsou považovány za 100%
Pomocí dotazníků obsahujících 18 otázek byl zhodnocen výskyt opakovaných infekcí a alergických onemocnění po 10 letech u 77 nedonošených dětí osídlených po narození kmenem E.coli a u 55 dětí kontrolních. Stejné otázky byly hodnoceny po 20 letech u 150 donošených dětí osídlených po narození a 144 dětí kontrolních. Alergie byla potvrzena vyšetřením specifického IgE u pacientů s klinickými příznaky alergie. Po 10 letech byl výskyt opakovaných infekcí zjištěn u 23% nedonošených osídlených dětí, zatímco u skupiny kontrolní u 58% (p < 0.01). Alergickými onemocněními trpělo v osídlené skupině 12% (9 dětí), v kontrolní skupině 33% (18 dětí) (p < 0.01). Po 20 letech nebyl výskyt opakovaných infekcí mezi skupinami donošených osídlených dětí a dětmi kontrolními statisticky významný. Významný byl však stále rozdíl výskytu alergických onemocnění: u osídlených dětí 16% (24 dětí), v kontrolní skupině 32% (46 dětí) (p < 0.01) (Tab. 2) (17).
Diskuse Mechanismus odpovídající za příznivý vliv osídlení nepatogenními kmeny E.coli není dosud plně objasněn. Předpokládaný mechanismus interference, který brání adhezi jiných mikrobů včetně patogenů, je podpořen průkazem přítomnosti t1 fimbrií. Podaný kmen po narození zůstává v kvantitativní převaze, což mu přináší různé výhody, jakožto prvního „osidlovatele“, např. při nutritivní kompetici. Mechanismus je jistě komplexní. V posledním desetiletí dochází k významným změnám ve složení střevní mikroflóry, zvláště v zemích s vysokou úrovní hygieny, jako je Švédsko nebo USA. Ve střevní flóře ubývá enterobakterií a počínají převládat stafylokoky (stafylokokus epidermidis a aureus), které vždy patřily k mikrobiální flóře kůže, krku a nosu. V rozvojových zemích jsou děti naopak do 3. dne života osídleny kmeny E.coli a jinými enterobakteriemi (1). Pozdější osídlení kmeny enterobakterií snižuje expozici imunitního systému působení lipopolysacharidů, který stimuluje jeho zrání, schopnost rozlišovat škodlivé a neškodné antigeny (např. potravinové) a má rozhodující vliv na vývoj tolerance proti neškodným antigenům. Stoupající vývoj alergií v rozvinutých zemích je dáván do souvislosti se změnami střevní flóry (25). Výsledky studií u zvířat podporují hypotézu, že specifické kmeny střevní mikroflory podporují ochranu hostitele proti senzibilizaci a vzniku alergií. U bezmikrobních zvířat chybí indukce vývoje tolerance. Po obnovení střevní flóry (avšak pouze stane-li se tak v neonatálním období), obnoví se vnímavost Th1 a Th2 odpovědi k orální indukci tolerance (22). Otázka, je-li možná podpora vzniku atopie prostřednictvím mateřského mléka, má zásadní význam. U zvířat bylo prokázáno, že buňky mateřského mléka procházejí střevní stěnou – u lidí však tento důkaz zatím podán nebyl. Přenos cytokinů byl po perorálním podání u lidí již prokázán (8). Ogra (19) předpokládá u dětí přenos IgA a složek buněčné imunity ze střeva v neonatálním období. Počet sledovaných případů je však malý. Práce, které uvádějí výsledky perorálního osídlování střeva kmeny E.coli u novorozenců, jsou ojedinělé (20). Výsledky našich studií publikované od r. 1967 jsou však jednoznačně pozitivní, a to při krátkodobém a dlouhodobém sledování osídlených novorozenců. Naše výsledky byly v poslední době doplněny poznatky z oblasti genetiky. Při klonování hemolysinového operonu kmene byla zjištěna neznámá sekvence odlišná od sekvencí celých chromozomů různých kmenů E.coli a řady patogenních kmenů. Je možné, že právě tyto neznámé sekvence kódují pro geny, které odpovídají za mimořádné adhezivní a kolonizační schopnosti našeho kmene. Dále bylo zjištěno metodou pulzní elektroforezy, že vlastnosti kmene (citlivost na antibiotika, nepřítomnost plazmidu) se od r. 1971 nezměnily. (Dosud nepublikované výsledky.) Nahrazením přirozeného, avšak náhodného osídlení střeva podáváním známého kmene E.coli s výhodnými vlastnostmi byla snad nalezena možnost prevence nosokomiálních infekcí v prvních obdobích života u rizikových a nekojených dětí současně s možností prevence opakovaných infekcí a alergií v pozdějším věku. Použití kmene a příprava vakcíny byly patentovány v r. 1992. Vakcína COLINFANT je registrována SUKLem a vyráběna firmou DYNTEC Terezín.
Vakcína je indikována: 1. k prevenci gastrointestinálních a jiných nosokomiálních infekcí u nedonošených novorozenců, donošených nekojených novorozenců, na oddělení intenzivní péče či jiných zařízeních ohrožených nosokomiálními nákazami 2. ve všech případech, kdy lze předpokládat poruchu složení střevní mikroflóry, např. po léčbě antibiotiky 3. u nosičů enteropatogenních kmenů.
MUDr. Raja Lodinová-Žádníková Ústav pro péči o matku a dítě Podolské nábřeží 157 147 10 Praha 4 – Podolí
Literatura 1. Adlerberth I, Carlsson B, de Man P, Jalil F, Khan SR, Larsson P, et al. Intestinal colonization with enterobacteriaceae in Pakistani and Swedish hospital – delivered infants. Acta Paediatr Scand 1991; 80: 602-610. 2. Cukrowská B, Lodinová-Žádníková R, Sokol D, Tlaskalová H. In vitro immunoglobulin response of fetal B cells is influenced by perinatal infections: study in preterm infants. Europ J Ped 1999; 158: 463-468. 3. Dai D, Walker WA. Protective nutritients and bacterial colonization in the immature human gut. Adv Pediatr 1999; 46: 353-382. 4. Hanson LA, Adlerberth I, Carlsson B, Dahlgren U, Jalil F, Khan SR et al. The ontogeny of the immune response: the role of maternal factors. In: Burgio GR, Hanson LA, Ugaziio AU, eds. Immunology of the neonate: Berlin, Springer-Verlag, 1987, 51-58. 5. Havenaar R, Huis Veld MJH. Probiotics: a general view. In: Lactic acid bacteria in health and disease. Vol 1. Amsterdam: Elsevier Applied Science Publishers, 1992. 6. Isolauri E, Grönlund MM, Salminen S, Arvilommi H. Why don´t we bud? J Pediatr Gastroent 2000; 30: 214-216.
7. Isolauri E, Sütas Y, Kankaanpää P, Arvilommi H, Salminen S. Probiotics: effects of immunity. Am J Clin Nutr 2001; 73 (suppl): 444S-450S. 8. Jirapongsananuruk O, Leung DMY. Clinical applications of cytokines: new directions in the therapy of atopic diseases. Ann Allergy Immunol 1997; 79: 5-20. 9. Jones CA, Holloway JA, Warner JO. Does atopic disease start in foetal life? Allergy 2000; 55: 2-10. 10. Kalliomaki M, Salminen S, Arvilommi H, Koro, Isolauri E. Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomized placebo-controlled trial. Lancet 2001; 357: 1076-1079. 11. Kitajama H, Sumida Y, Tanaka R, et al. Early administration of Bifidobacterium breve to preterm infants: randomized controlled trial. Arch Dis Child 1997; 76: F101-F107. 12. Labeta MO, Vidal K, Nores JE, Arias M, Vita N, Morgan R, et al. Innate recognition of bacteria in human milk is mediated by a milk/derived highly expressed pattern recognition receptor, soluble CD14. J Exp Med 2000; 191 (10): 1807-1812. 13. Lari AR, Gold F, Borderon JC, Laugier J, Lafont P. Implantation and in vivo antagonistic effects of antibiotic-susceptible Escherichia coli strains administered to premature newborns. Biol Neonate 1990; 58: 73-78. 14. Lodinová-Žádníková R, Sonnenborn U. Effect of preventive administration of a nonpathogenic Escherichia coli strain on the colonization of the intestine with microbial pathogens in newborn infants. Biol Neonate 1997; 71: 224-232. 15. Lodinová-Žádníková R, Slavíková M, Tlaskalová-Hogenová H, Adlerberth I, Hanson LA, Wold A, et al. The antibody response in breast-fed and non-breast-fed infants after artificial colonization of the intestine with E.coli 083. Pediatr Res 1991; 29: 396-399. 16. Lodinová-Žádníková R, Tlaskalová H, Korych B, Bartáková Z. The antibody response in infants after oral administration of inactivated and living E.coli vaccines and their protective effect against nosocomial infections. Adv Mucosal Immunol (ed. Mestecky J ) Plenum Press, New York 1995; 1434-1438. 17. Lodinová-Žádníková R, Cukrowská B. Influence of oral colonization with a non-enteropathogenic E.coli strain after birth on the frequency of infections and allergic diseases after 10 and 20 year. Immunology letters 1999; 69: abstr 12. 6. 18. Mestecky J, Russel MV, Elson CO. Intestinal IgA: novel views on its function in the defence of the largest mucosal surface. Gut 1999; 44: 2-5. 19. Ogra SS, Weintraub D, Ogra PL. Immunologic aspects of human colostrum and milk. III. Fate and absorption of cellular and soluble components in the gastrointestinal tract of the newborn. J Immunol 1977; 119: 245-248. 20. Poisson DM, Borderon JC, Amorim-Sena JC, Laugier J. Evolution of the barrier effects against an exogenous drug-sensitive Escherichia coli strain after single or repeated oral administration to newborns and infants aged up to three months admitted to an intensive care unit. Biol Neonate 1986; 49: 1-7. 21. Rautava S, Kalliomaki M, Isolauri E. Probiotics during pregnancy and breast-feeding might confer immunomodulatory protection against atopic disease in the infant. J Allergy Clin Immunol 2002; 109: 119-121. 22. Sudo N, Sawamura S, Tanaka K, Aiba Y, Kubo C, Koga Y. The requirement of intestinal bacterial flora for the development of an IgE system fully susceptible to oral tolerance induction. J Immunol 1997; 159: 1739-1745. 23. Thompson PJ, Greenough A, Hird MF, Philpott-Howard J, Gamsu HR. Nosocomial bacterial infections in very low birth-weight infants. Eur J Pediatr 1992; 151: 451-454. 24. Tlaskalová H, Černá J, Mandel L. Peroral immunization of germ-free piglets: appearance of antibody-forming cells and antibodies of different isotypes. Scand J Immunol 1981; 13: 467-472. 25. Wold A, Adlerberth I, Herias V. Bacterial regulation of immunity. Old Hebron University Seminar Monograph (ed. Heidt PJ, Rush V, Van der Waaij D.) 1998: 14-27.
