Kód: EK-81
PSA ELISA készlet Az PSA ELISA készlet humán szérum Prosztata Specifikus Antigén (PSA) tartalmának direkt meghatározására szolgál. A készlet 96 meghatározásra elegendo reagenst tartalmaz, amellyel egyszeri standardizálás esetén két párhuzamossal mérve 42 minta PSA koncentrációja határozható meg, a 0–50 ng/ml mérési tartományban.
Tartalom
oldal
Bevezetés A mérés elve A készlet tartalma A készlet felhasználásához szükséges anyagok és eszközök A mérendo minták gyujtése és tárolása A reagensek elokészítése A meghatározás menete Az eredmények számítása Minoségi jellemzok Megjegyzések, tanácsok, hibaforrások Egyéb tudnivalók Biztonsági óvórendszabályok
IZOTÓP INTÉZET KFT, BUDAPEST
1 2 2 2 3 3 3 4 5 6 6 6
Bevezetés A PSA (Prostate Specific Antigen) körülbelül 30 kDa molekulatömegu, 237 aminosavból álló egyláncú glikoprotein. Szerkezete hasonló a tripszinszeru kallikreinekhez, enzimaktivitását tekintve a kimotripszinnel analóg szerin-proteáz. Keletkezése szövet-specifikus, a prosztata termeli, az ondó nagy koncentrációban tartalmazza. Proteáz-aktivitásának az ondó elfolyósításában funkcionális szerepet tulajdonítanak. A vérben lévo PSA 70-95 %-a α 1-antikimotripszinhez kötött formában van jelen. Mind malignus prosztata karcinóma, mind benignus prosztata hiperplazia esetében a vér PSA szintje megno, de malignus prosztata karcinóma esetében a komplex, míg benignus prosztata hiperplazia esetében a szabad PSA szint emelkedése figyelheto meg a vérben. A PSA meghatározás egységes módszertanának kialakulását, elfogadását mindmáig megnehezítik a kétféle molekuláris formából következo mérési, standardizálási nehézségek. A PSA szabad/komplex formáinak aránya egyedrol egyedre változik, így a mért látszólagos total PSA tartalom jelentosen eltérhet attól függoen, hogy az adott immunoassay rendszer milyen immunreaktivitást mutat a kétféle molekuláris formára. Ideális esetnek tekintheto, ha a mérorendszer nem tesz különbséget a szabad és a komplex forma között (ekvimoláris PSA assay), az ettol való eltérés pedig annak mértékétol függoen torzíthatja a látszólagos total PSA tartalmat. Analitikai szempontból további korlát a nemzetközi referencia-anyag hiánya, amely miatt a különbözo készítményekkel mért PSA koncentrációk igen tág határok között változnak. A total PSA koncentrációjának meghatározása nélkülözhetetlen módszer a prosztata karcinóma diagnosztikájában, a stádium meghatározásában és a terápia-követésben.
Jelen ELISA-készlet kiemelkedo tulajdonsága, hogy a szabad PSA – PSA-ACT molekuláris formákat ekvimolárisan méri.
5 üveg
STANDARD (0-4), felhasználásra kész. 5*1 ml szérum-oldat, 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval, koncentrációjuk O (S 0), 4 (S 1), 10 (S 2), 25 (S 3), 50 (S 4) ng/ml.
1 üveg
ELLENORZO SZÉRUM, felhasználásra kész. 1 ml szérum 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval. Várható értékét a mellékelt minoségi bizonylat tartalmazza.
1 db
MIKROTITER PLATE, 12 db. stripet tartalmaz szabványos keretben, záró-fóliával.
1 üveg
TMB SZUBSZTRÁT, ≥25 ml felhasználásra kész oldat, sötét muanyag flakonban. Fénytol védve tartandó.
1 üveg
MOSÓPUFFER KONCENTRÁTUM 20 ml puffer, 0,01 % mertiolát tartósítóval. Rekonstituálandó 600 ml desztillált vízzel
1 üveg
STOP REAGENS 1 M kénsav
1 db
Plate térkép
A mérés elve A készlet muködése a szilárd fázisú immunometrikus assay elvén alapul. Ehhez két olyan monoklonális antitest szükséges, amelyek a molekula két különbözo epitopját ismerik fel. A két antitest egyike jelzett (jelzo antitest), a másik jelöletlen (ún. befogó, vagy "capture" antitest). Az immunokémiai folyamatban a standardokban, illetve a mintákban lévo hormon mindkét antitesttel reagálva immunkomplexet ("szendvics") képez, amely szilárd fázison kötodik, és mennyisége arányos a hormon koncentrációjával. Jelen készletben a szilárd fázis szerepét szabványos, 8x12-es mikrotiter plate látja el, amely 12 db. egysoros egységbol áll. Az immunreakció 37 oC-on 2 óra alatt játszódik le, és a jelzo funkciót torma-peroxidáz (HRPO) enzim látja el, amely peroxid és tetrametilbenzidin (TMB), szubsztrát – kromogén, eleggyel reagálva 450 nmen detektálható jelet hoz létre. A szilárd fázison a jelet (optikai denzitást) szabványos ELISAfotométeren (ELISA-reader) mérjük, a mért jel intenzitása egyenesen arányos a rendszerben lévo hormon koncentrációjával. Az ismert koncentrációjú standardok kötési értékei alapján szerkesztett kalibrációs görbérol az ismeretlen minták koncentrációit kötési értékeik alapján visszaolvassuk.
6 ml
Minoségellenorzési bizonylat Használati utasítás
A készlet tartalma 1 üveg
A készlet felhasználásához szükséges anyagok és eszközök
TRACER, felhasználásra kész. 12 ml pufferes oldat 0,01 % mertiolát és 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval.
muanyag kémcsövek és kémcsotartó adagoló pipetták, 100, 200 és 300 µl-es eldobható muanyag hegyekkel örvénykevero (vortex) -2-
desztillált víz ELISA reagens-tálkák ELISA - termosztát ELISA - fotométer (450 nm hullámhosszra)
A meghatározás menete
Ajánlott: 8-csatornás adagoló pipetta orbitális kevero ELISA mosó-automata
(ld. folyamatábra, 1. táblázat) 1)
Készítsük elo a mérendo mintákat, vegyük elo a készletbol a standardokat, az ellenorzo szérumot, a tracert, valamint az ELISA-platet, és hagyjunk mindent szobahomérsékletre melegedni.
2)
Jelöljük meg külön plate térképen az alábbi minták pozícióját, 2-2 párhuzamosban: - standardok (S 0-4)(S 0=NSB) - ellenorzo szérum (C) - vizsgálandó minták (Mx)
3)
Felhasználás elott a mintákat és az összes reagenst alaposan homogenizáljuk, de kerüljük el a habzást. Öntsük ki a tracert ELISA tálkába.
4)
Mérjünk 100 µl Standardot (S 0-4), 100 µl Ellenorzo szérumot (C), és 100 µl szérummintát (Mx) a megfelelo wellekbe. Az adagolást egy-csatornás pipettával végezzük, és minden reagenshez új pipetta-hegyet használjunk.
5)
Mérjünk minden wellbe 100 µl Tracer oldatot a 8-csatornás pipettával. Lásd még Megjegyzések 1.
6)
Rögzítsük a zárófóliát, és helyezzük az ELISA-termosztátba.
7)
Inkubáljuk a platet 2 órán keresztül 37 °C homérsékleten.
8)
Vegyük ki a platet a termosztátból, vegyük le a zárófóliát, és öntsük ki a wellek tartalmát. 8-csatornás ismétlo pipettával
A mérendo minták gyujtése és tárolása A vizsgálandó szérummintákat a más, ugyancsak szérumot igénylo laboratóriumi vizsgálatoknál követett módon készítjük el. Amennyiben az PSA-meghatározás a mintavételt követo 1-2 napon belül megtörténik, a mintákat +2 - +8 °C-on, késobbi felhasználás esetén -18 °C-on mélyhutve tartjuk. A fagyasztott mintákat hagyjuk felolvadni, és felhasználás elott alaposan homogenizáljuk. Kerüljük az ismételt visszafagyasztást. Lipémiás, hemolizált, vagy más szempontból rendellenes szérumot ne használjunk mérésre. A legmagasabb standard értéknél magasabb koncentrációjú mintákat hígítás után ismételten mérjük meg. Hígításhoz fiziológiás sóoldat használható fel.
A reagensek elokészítése A mérés megkezdése elott engedjük szobahomérsékletre melegedni a reagens oldatokat, beleértve a mérendo mintákat is. A mosó puffer koncentrátumot öntsük hozzá 600 ml desztillált vízhez, így 620 ml hígított mosópuffert kapunk. A kihígított mosóoldatot késobbi felhasználásra +2 - +8 °C-on tároljuk.
-3-
adjunk mindegyik wellbe 300 µl mosópuffert, majd öntsük le a felülúszót. Lásd még Megjegyzések 2. 9)
Ismételjük meg egymás után ötször a 8. lépést. Ha rendelkezésre áll ELISA mosó, a hatszori mosást azzal végezzük.
10) Öntsük ki az TMB-szubsztrátot a tálkájába, majd 8-csatornás pipettával adagoljunk minden wellhez 200 µl-t, és hagyjuk szobahomérsékleten, fénytol védve 30 percig. Lásd még Megjegyzések 3.
Az eredmények számítása Kézi számítás A számítás menetét jellemzo mérési adatokkal szemléltetjük. A kapott számadatoknak, és a kalibrációs görbének hasonlítaniuk kell a 2. táblázathoz, illetve az 1. ábrához. Adatfeldolgozó program hiányában a kiértékelést manuálisan az alábbiak szerint végezzük el:
11) Adjunk mindegyik wellhez 50 µl stop reagenst, és hagyjuk 5 percig szobahomérsékleten állni. Lásd még Megjegyzések 3. 12) Tegyük a platet a fotométerbe, és végezzük el a mérést 450 nm hullámhosszon.
1) 2)
Számítsuk ki a párhuzamosok középértékét. Vonjuk ki az NSB-t (azaz az So OD értékét) a standardok, illetve a minták átlagos OD értékeibol (NSB korrekció). 3) Lin-lin papíron ábrázoljuk a standard koncentrációkhoz tartozó NSB-vel korrigált OD értékeket. 4) Olvassuk le a mérendo minták koncentrációit a standard görbérol az NSB-vel korrigált OD értékek alapján. Egyes adat-kiértékelésekhez, rendszerint minoségellenorzési célból, szükség lehet a specifikus kötési értékekre. Erre a B/Bmax értékek használhatók, amelyek számításához szintén a standardok, illetve minták NSB-vel korrigált értékeit osztjuk a maximális standard OD értékével az alábbi egyenlet szerint:
13) Számítsuk ki az eredményeket a következo fejezet szerint. 1. Táblázat Folyamatábra, Pipettázási kalauz (térfogatok mikroliterben)
Well Reagensek Standard Minta Ellenorzo szérum Tracer
Standard
Minta
Ellenorzo szérum
100 100
100 100 100 100 o Inkubálás 37 C-on 2 órán át. Mosópuffer 300 300 300 Felülúszó leöntése Mosás-leöntés ismétlése 5 további ciklusban TMB szubsztrát 200 200 200 Inkubálás szobahomérsékleten 30 percig, fénytol védve. Stop reagens 50 50 50 Inkubálás szobahomérsékleten 5 percig. Fotometriás mérés, kiértékelés
S1-4/Mx (AU) -S0 (AU)
B/Bmax (%) =
_________________ S4 (AU) - S0 (AU)
x 100
Számítógépes adatkiértékelés A korszeru mérokészülékek lehetové teszik a fotometriás mérést követo azonnali ("on-line") számítógépes adatfeldolgozást is. A sokféle feldolgozó program közül jelen készítményhez speciálisan -4-
immunometrikus assayre kifejlesztett illeszto programok (spline vagy simított négyzetes spline ) használatát javasoljuk. Ügyeljünk arra, hogy vannak olyan kiértékelo programok, amelyek a Ostandard és az elso standard között is interpolálnak, de a számított koncentrációk közül csak azok tekinthetok valósnak, amelyek értéke magasabb, mint a mérés statisztikailag meghatározott kimutatási határa (ld. ÉRZÉKENYSÉG).
2,6 2,4
Jellemzo mérési eredmények PSA ng/ml
S0 S1 S2 S3 S4 C
2,8
AU, O.D. (NSB korr.)
2. táblázat
3
0 4 10 25 50 -
PSA O.D.
0,054 0,489 1,230 1,964 2,820 0,529
O.D.
0,052 0,503 1,014 2,004 2,794 0,509
O.D. átlag
0,053 0,496 1,122 1,984 2,807 0,519
B/Bmax %
1,888 16,086 38,816 70,116 100 16,921
ng/ml
2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6
4,9211
0,4 0,2 0 0
10
20
30
40
50
Koncentráció, IU/ml
1. ábra Tipikus standard görbe (Mintameghatározásra nem használható!)
Minoségi jellemzok Az assay jellemzo paraméterei Bo/Bmax <5% Érzékenység Jelen készlettel az analitikai érzékenység a 0-standarddal 15 párhuzamos mérésbol meghatározva 0,5 ng/ml. Értéke egyenlo a Bo+2*SD kötési értékhez tartozó koncentrációval.
-5-
Funkcionális érzékenység
Várható referens tartomány: Egészséges felnottekben a refrens tartomány: ≤ 4 ng/ml.
A készlet funkcionális érzékenysége 1 ng/ml. Meghatározása alacsony PSA tartalmú minták 15 független méréssorozatban kapott inter-assay imprecíziós profiljából történt, értéke egyenlo egyenlo az imprecíziós görbe 22 %-os metszéspontjához tartozó PSA koncentrációval.
Megjegyzések, tanácsok, hibaforrások 1) A standardok, ellenorzo minta, szérum minták, valamint a tracer bemérése után a reakcióelegy homogenizálása céljából a plate-t a termosztát keverteto programjával, vagy - ha ez nem áll rendelkezésre - akkor egy keverogép alacsony fordulatszámú használatával kb. 5 másodpercig kevertessük. A kevertetésnél ügyeljünk arra, hogy a wellek tartalma ne fröccsenjen ki.
Specificitás Az assay-ben felhasznált antitestek keresztreakciója human PAP-re (prosztata specifikus savas foszfatáz), illetve human kallikreinre vizsgálva kisebb, mint 0,04%. Nagy-dózisú Hook effektus Az effektus 2000 ng/ml alatti koncentrációban nem jelentkezik.
2) Ha nem áll rendelkezésünkre ELISA mosó akkor kézi mosást kell végrehajtanunk, ami a reakcióelegy leöntésébol és 6 db. mosópuffer adagolás - leöntés ciklusból áll. A leöntéseket mindig a plate hirtelen lefordításával végezzük, majd csapkodjuk ki a wellek-ben maradt cseppeket egy nedvszívó papírra. A gyors kiöntésnek elsosorban a reakcióelegy eltávolítása esetén van nagy jelentosége, hiszen ellenkezo esetben a wellek tartalma elszennyezheti egymást, ami meghamisítja a mérést.
Pontosság és reprodukálhatóság Az intra-assay pontosságot 15 párhuzamossal egy sorozaton belül, az inter-assay pontosságot 2 párhuzamossal, 15 független mérésben értékelve, 6 mintára az alábbi adatokat kaptuk.
Intra-assay átlag (ng/ml) CV % 1,03 8,91 3,81 6,83 9,66 7,75 23,16 11,81 31,66 7,53 44,19 6,57
Inter-assay átlag (ng/ml) CV % 1,17 19,71 4,67 14,27 12,11 10,04 23,83 10,36 26,48 11,65 42,61 9,87
3) Ha rendelkezésünkre áll olyan ELISA inkubátor, vagy rázógép, amellyel a plate - a reagensek kifröccsenésének veszélye nélkül rázatható, akkor a szubsztrát reakciók (pNPP, TMB) elején, valamint a stop reagens adagolása után ajánlott egy kb. 10 másodperces óvatos rázatás.
Egyéb tudnivalók
-6-
Tárolás A készlet komponensei -felbontott reagensek is- 2-8 °C között tárolhatók a lejárati idon belül. A készlet lejárati ideje A készlet a gyártástól számítva általában legalább 16 hétig használható. A pontos lejárati ido a kíséro bizonylaton és a dobozcímkén van feltüntetve. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a különbözo gyártási számú készletek egyes komponensei nem helyettesíthetok sem egymással, sem más gyártó PSA készletének komponenseivel.
Biztonsági óvórendszabályok Fertozésveszély A kitben lévo humán szérumot tartalmazó komponensek eloállításához felhasznált szérum HIV-Ab és HBsAg vizsgálatra negatív eredményt adott. Ennek ellenére a humán szérumot tartalmazó komponenseket potenciálisan fertozoként kell kezelni, és az erre vonatkozó általános laboratóriumi higiénés szabályokat be kell tartani.
-7-
IZOTÓP INTÉZET K ft. 1535 Budapest, Pf.: 851. Tel.: 395-2577 Fax: 395-9247
HONLAP: Technikai e-mail: Kereskedelmi e-mail:
http://www.izotop.hu
[email protected] [email protected]
EK81m/2. verzió/2001.04.12.
-8-
