Protokoly Pracovní potřeby, pufry a chemikálie jsou uvedeny na konci protokolu. Pracovní postupy jsou odvozeny od těchto kitů: Champion™ pET160 Directional TOPO® Expression Kit with Lumio™ Technology (Invitrogen) a Ni-NTA Purification System (Invitrogen). Transformace plasmidu do elektrokompetentních buněk BL21 Pracovní postup: 1. Buňky necháme rozmrazit 5 min. na ledu. 2. K buňkám přidáme plazmid a opatrně zamícháme krouživým pohybem špičkou. (pozor!! Nepipetovat buňky do špičky a zpět, mohly by se poškodit!). 3. Směs přeneseme do elektroporační kyvety tak, aby se nevytvořily bubliny. Kyvetu vložíme do elektroporační aparatury a spustíme elektroporaci dle manuálu elektroporátoru. Pro E. coli použijeme pulz pod napětím 1700 V. 4. K buňkám do kyvety okamžitě přidáme 1 ml LB media, promícháme pipetováním a přelijeme směs do čisté eppendorfky. 5. Inkubujeme na třepačce 30 – 60 min. při 37°C, 220 rpm. 6. Inkubační směsí inokulujeme 20 ml LB media s ampicilinem (finální koncentrace amp = 0,1 mg / ml). 7. Inkubujeme přes noc na třepačce při 37°C. Transformace DNA do chemicky kompetentních buněk BL21 Pracovní postup: 1. Buňky necháme rozmrazit 5min. na ledu. 2. K buňkám přidáme plazmid a opatrně zamícháme krouživým pohybem špičkou. (pozor!! Nepipetovat buňky do špičky a zpět, mohly by se poškodit!). 3. Inkubujeme 5 – 10 minut na ledu. 4. Provedeme teplotní šok (inkubace 45 s při 42°C, zchladit na ledu). 5. K buňkám přidáme 1 ml LB media a inkubujeme na třepačce 30 – 60 min. 6. Inkubační směsí inokulujeme 20 ml LB media s ampicilinem (finální koncentrace amp = 0,1 mg / ml). 7. Inkubujeme přes noc na třepačce při 37°C. Expresní kinetika Pracovní postup: 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Inokulujeme 20 ml LB + amp 1 ml přes noc narostlé kultury. Necháme kulturu pomnožit do log fáze (obr. 4), OD600 = 0,5 – 0,8. Odebereme 1 ml kultury jako startovní vzorek v čase 0 hod. Kulturu rozdělíme po 10ml do dvou erlenmayerových baněk. V jedné kultuře indukujeme expresi proteinu 10 μl IPTG. Baňky řádně označíme!! Každou hodinu po dobu 4 hod. odebereme 1 ml kultury z obou baněk (vzorky v čase 1 – 4 hod.). Na spektrofotometru změříme optickou denzitu (OD600) všech vzorků a závislost růstu indukované a neindukované kultury na čase zaneseme do grafu.
7. Vzorky zcentrifugujeme 1min. při 10.000 rpm. 8. Pelet rozsuspendujeme v 250 μl B – PER a uchováme při -20°C pro další analýzu. Exprese rekombianntních proteinů v E. coli Pracovní postup: 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Inokulujeme 50 ml LB + amp 2,5 ml přes noc narostlé kultury. Necháme kulturu pomnožit do log fáze (obr. 4), OD600 = 0,5 – 0,8. Indukujeme expresi proteinu 50 μl IPTG. Inkubujeme 4 hod. při 37°C, 220 rpm. Bakteriální kulturu zcentrifugujeme 10 min, 3000 × g při 4°C. Pelet uskladníme při -80°C.
Příprava bakteriálního lyzátu: Pracovní postup: 1. 2. 3. 4.
Pelet rozsuspendujeme v 8 ml NLB a inkubujeme 30 min. na ledu. Sonikujeme 6 × 10 pulzů, síla 30 %, pulzer 50 %. Centrifugujeme 15 min., 3000 × g při 4°C. Ze supernatantu odebereme 40 μl vzorku pro detekci a supernatant i vzorek uskladníme při -20°C, nebo ihned pokračujeme afinitní chromatografií.
Afinitní chromatografie: Pracovní postup: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
Kolonku s Ni-NTA agarózou promyjeme 6 ml sterilní H2O, vodu necháme odtéci. Kolonku 2 × promyjeme 8 ml NBB, pufr necháme odtéci. Do kolonky přelijeme supernatant z bodu 4. - Příprava bakteriálního lyzátu. Inkubujeme na rotátoru 30 – 60 min. při 4°C. Necháme odtéci pufr s nenavázanými proteiny a frakci uskladníme při 4°C. Kolonku promyjeme 8 ml NWB1. a frakci uskladníme při 4°C. Bod 6. opakujeme s pufry NWB 2.– 4. Kolonku 2 × promyjeme 1,5 ml NEB a frakci uskladníme při 4°C Ze všech frakcí odebereme 40 μl vzorku pro detekci.
Detekce: SDS-PAGE, western blot Příprava vzorků: 40 μl vzorku smícháme s 10 ml 5 × Laemli buffer a denaturujeme 8 – 10 min. při 96°C. Vzorek ochladíme na pokojovou teplotu a pipetujeme po 20 μl do gelu (celkem 2 gely). SDS-PAGE: Gel: Pro SDS-PAGE analýzu použijeme 10 % polyakrylamidový gel. Podmínky elektroforézy: 90 V 10 min., 160 V 50 min. (dokud vzorky nedoběhnou do konce gelu). Protože v rámci úspory času využíváme vysoké napětí, elektroforetickou komoru chladíme ledem.
Wester blot: Podmínky elektrotransferu: 100 V, 60 min. Primární protilátka: Anti-His (1 : 1000) Sekundární protilátka: Anti-mouse (1 : 5000) Wester blot – pracovní postup: Příprava vzorku (5× koncentrovaný): 1. 100 µl proteinového extraktu vysrážíme přes noc 14 µl 100% TCA. 2. Centrifugujeme 2,5 min. 13000 rpm, RT, odstraníme supernatant. 3. K peletu přidáme 100 µl acetonu a pelet špičkou rozsuspendujeme, nebo zvortexujeme. 4. Centrifugujeme 2,5 min. 13000 rpm, RT, odstraníme supernatant. 5. K peletu přidáme 100 µl acetonu a pelet špičkou rozsuspendujeme, nebo zvortexujeme. 6. Centrifugujeme 5 min. 13000 rpm, RT, odstraníme supernatant. 7. Pelet rozpustíme v 20 µl 1 × PBS. 8. Přidáme 5 µl 5 × Laemli buffer a inkubujeme 10 min. při 95°C, následně ochladíme na ledu a zkondenzovanou vodu odstředíme na stolní centrifuze. SDS – PAGE (podmínky elektroforézy dle protokolu pro expresi proteinů) „Blotting“ 1. Gel promyjeme 1× 5 min. v 1 × TBS. 2. Filtrační papíry a molitan namočíme do 1 × TBS. 3. Membránu inkubujeme 10 sek. v 100% metanolu, poté 5 min. v destil. H2O a následně 10 min. v 1 × TBS. (!!membrána nesmí vyschnout!!). 4. Složíme sendvič pro elektrobloting v pořadí: černá strana kazety – molitan – 2 × filtr. papír – gel – membrána – 2 × filtr. papír (!!vyhladit bublinky!!) – červená strana kazety. 5. Sendvič blotujeme v 1 × TBS na ledu 60 min. při napětí 100V. 6. Membránu promzjeme v 1 × PBS a poté inkubujeme v blokovacím roztoku při 4 °C přes noc. Vyvíjení membrány s protilátkou: 1. Membránu inkubujeme v roztoku primární protilátky 1,5 hod při 4°C. 2. Membránu promyjeme 3 × 10 min. v 1 × PBS + 1% Tween. 3. Membránu inkubujeme v roztoku sekundární protilátky 1 hod při 4°C. 4. Membránu promyjeme 3 × 10 min. v 1 × PBS. Detekce sekundární protilátky: 1. Membránu přemístíme na igelitovou fólii a převrstvíme 1 ml Detection reagent 1 a 2 smíchaných v poměru 1 : 1. 2. Membránu inkubujeme 3 min. ve tmě, zabalíme do fólie (!!bez přehybů a bublin!!) a vyvoláme v luminátoru.
Pracovní potřeby, pufry a chemikálie – exprese a purifikace rekombinantních proteinů: Ampicilin (c = 100 mg / ml) B – PER (Pierce) Elektrokompetentní buňky BL21 Elektroporační kyvety vychlazené na ledu H2O (sterilní, deionizovaná) IPTG (0,8 M roztok) Kolonka s Ni-NTA agarózou LB medium s ampicilinem (finální koncentrace amp = 0,1 mg / ml) vytemperované na 37°C LB medium vytemperované na 37°C NBB (Native Binding buffer) NEB (Native Elution Buffer) NLB (Native Lysis Buffer) NWB 1.– 4. (Native Wash Buffer 1., 2., 3., a 4.) Plazmid (10 ng, 1 – 10 μl) Složení purifikačních pufrů: NBB, NEB, NLB, NWB 1.– 4. NBB (Native Binding buffer): 25 mM NaH2PO4 0,25 M NaCl pH 8.0 NEB (Native Elution Buffer): 25 mM NaH2PO4 0,25 M NaCl 250 mM imidazol pH 8.0 NLB (Native Lysis Buffer): 25 mM NaH2PO4 0,25 M NaCl 0,1 % Lysozym 0,1 mM PMSF pH 8.0 !!lysozym a PMSF jsou tepelně nestabilní, do pufru přidat těsně před použitím!! NWB 1. (Native Wash Buffer 1.): 25 mM NaH2PO4 0,25 M NaCl 20 mM imidazol pH 8.0 NWB 2. (Native Wash Buffer 2.): 25 mM NaH2PO4 0,25 M NaCl
30 mM imidazol pH 8.0 NWB 3. (Native Wash Buffer 3.): 25 mM NaH2PO4 0,25 M NaCl 40 mM imidazol pH 8.0 NWB 4. (Native Wash Buffer 4.):
25 mM NaH2PO4 0,25 M NaCl
50 mM imidazol pH 8.0
Pracovní potřeby, pufry a chemikálie – detekce rekombinantních proteinů: Elektroforetická aparatura Elektroblotovací aparatura PVDF membrána 100 % k. trichloroctová (TCA) Aceton 1 × PBS (Phosphate Buffered Saline) 5× Laemli buffer 1 × RB (Running Buffer) 1 × TB (Transfer buffer) 100 % metanol Blokovací roztok (12,5 g sušeného nízkotučného mléka (1 %) dolít do 250 ml 1 × PBS) Primární protilátka (Anti – HIS, Sigma), ředění 1 : 2000 v blokovacím roztoku (10 ml) Sekundární protilátka (Anti – mouse, Thermo), ředění 1 : 5000 v blokovacím roztoku 1 × PBS 1 × PBS + 1% Tween Detection Reagent (GE Healthcare RPN 3000 Oil 1) Složení roztoků: Tris – base Glicine 20% SDS 100% metanol NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 destil. H2O sterilní
1 × RB 3,02 g 18,8 g 5 ml Dolít do 1 litru
1 × TB 3,03 g 14,41 g 200 ml Dolít do 1 litru
Příprava 10% SDS-PAGE gelu: Separační gel (10 ml) destil. H2O sterilní 4 ml 30 % akrylamide mix_Bis 3,3 ml 1,5 M Tris (pH 8,8) 2,5 ml 1 M Tris (pH 6,8) 10 % SDS 100 µl 10 % APS 150 µl TEMED 6 µl
1 × PBS (pH 7,4) 8g 0,2 g 1,44 g 0,24 g Dolít do 1 litru Zaostřovací gel (2 ml) 1,4 ml 330µl 250 µl 20 µl 40 µl 2 µl
