Proteázok szerepe a sejtelhalás szabályozásában staurosporin kezelt kaszpáz-gátolt leukémia sejteken

Proteázok szerepe a sejtelhalás szabályozásában staurosporin kezelt kaszpáz-gátolt leukémia sejteken Doktori értekezés Imre Gergely Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola, Onkológia program I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet

Témavezető: Dr. Mihalik Rudolf, tudományos főmunkatárs, Ph.D Hivatalos bírálók: Dr. Matkó János, tudományos tanácsadó, MTA doktora Dr. Sőti Csaba, egyetemi adjunktus, Ph.D Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Demeter Judit, egyetemi tanár, MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Herszényi László, egyetemi adjunktus, Ph.D Dr. Uher Ferenc, tudományos főmunkatárs, Ph.D Budapest 2007

Doktori értekezés Imre Gergely _____________________________________________________________________________________

TARTALOMJEGYZÉK I. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE................................................................................. 3 II. IRODALMI HÁTTÉR........................................................................................... 6 II. 1. Problémafelvetés .............................................................................................. 6 II. 2. Az éltető halál................................................................................................... 7 II. 3. A sejthalál típusai - az elnevezések körüli zűrzavar ........................................... 8 II. 4. A sejtelhalás regulációja kaszpázokkal............................................................ 11 II. 4. 1. Kaszpázok szerkezete.............................................................................. 11 II. 4. 2. Külső aktivációs út.................................................................................. 13 II. 4. 3. Belső aktivációs út .................................................................................. 15 II. 4. 4. Az apoptózis belső útjának aktiválása staurosporinnal ............................. 18 II. 4. 5. Végrehajtó kaszpáz kaszkád. ................................................................... 19 II. 4. 6. A kaszpázok szubsztrátjai........................................................................ 20 II. 4. 7. Kaszpáz-függő apoptózis jelutak meghibásodása: az örök élet titka? ....... 21 II. 5. Nem kaszpáz-proteázok által közvetített szabályozott sejthalál ....................... 24 II. 5. 1. Katepszinek szerkezete és specifitása ...................................................... 25 II. 5. 2. Katepszinek fiziológiai funkciója és szerepe a betegségek kialakulásában26 II. 5. 3. Lizoszómák és katepszinek szerepe a sejthalál szabályozásában.............. 27 II. 5. 4. Vannak a katepszineknek specifikus szubsztrátjai?.................................. 30 II. 6. A mitokondrium szerepe a kaszpáz-független sejthalálban .............................. 30 II. 7. Kaszpáz- és mitokondriális fehérjéktől független jelutak a sejtelhalásban........ 31 III. CÉLKITŰZÉSEK .............................................................................................. 33 IV. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ......................................................................... 34 IV. 1. Vegyszerek ................................................................................................... 34 IV. 2. Sejttenyésztés................................................................................................ 34 IV. 3. A sejthalállal összefüggő funkcionális változások mérése áramlásos citométerrel............................................................................................................. 35 IV. 3. 1. [PI felvétel] profil: A plazma membrán sérülés detektálása .................... 35 IV. 3. 2. [Annexin V-FITC, PI] profil: A plazma membránt alkotó foszfatidil szerin eloszlás megváltozásának mérése ........................................................................ 36 V. 3. 3. [DiOC6(3)] profil: A mitokondrium transzmembrán potenciál változásának mérése................................................................................................................. 37

1


IV. 3. 4. [AO red] profil: a sejtben lévő savas sejtalkotók mennyiségi változásának mérése................................................................................................................. 38 IV. 3. 5. [Sub-G1] profil: Az oligonukleoszómális DNS fragmentáció mérése..... 38 IV. 3. 6. [SSC, DNS tartalom] profil: fényszórás változás és DNS fragmentáció mérése................................................................................................................. 39 IV. 3. 7. Sejtciklus analízis .................................................................................. 39 IV. 4. A hasított PARP fehérje western blot analízise .............................................. 40 IV. 5. Proteáz aktivitásmérés ................................................................................... 40 IV. 6. DNS gél elektroforézis .................................................................................. 41 IV. 7. Fénymikroszkópos vizsgálatok...................................................................... 41 IV. 8. Elektronmikroszkópos vizsgálatok ................................................................ 41 IV. 9. Statisztika...................................................................................................... 42 V. EREDMÉNYEK................................................................................................... 43 V. 1. Kaszpáz-gátolt sejthalál .................................................................................. 43 V. 2. Katepszinek szerepe a kaszpáz-gátolt sejthalálban .......................................... 49 V. 3. Hsp-90 szerepe a kaszpáz-gátolt sejthalál szabályozásában............................. 55 V. 4. A kaszpáz-gátolt sejtelhalás teljes felfüggesztése ............................................ 57 VI. MEGBESZÉLÉS ................................................................................................ 62 VII. KÖVETKEZTETÉSEK.................................................................................... 67 VIII. ÖSSZEFOGLALÁS......................................................................................... 68 IX. SUMMARY......................................................................................................... 69 X. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE................................................................ 70 X. 1. A disszertációhoz kapcsolódó publikációk...................................................... 70 X. 2. Egyéb közlemények........................................................................................ 70 X. 3. Előadások, poszterek ...................................................................................... 71 XI. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS............................................................................. 73 XII. IRODALOMJEGYZÉK ................................................................................... 75

2


I. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AIF-

apoptosis inducing factor

AMC-

7-amido-4-methylcoumarin

ANT-

adenine nucleotide translocator

ATP-

adenosine triphosphate

AO-

acridine orange

APAF-1-

apoptotic protease activating factor-1

BAX-

BCL2-associated X protein

BAK-

BCL2-antagonist/killer 1

BID-

BH3 interacting domain death agonist

BIM-

BCL-2 interacting mediator of cell death

BCL2-

B cell lymphoma protein 2

CA074-OMe

(L-3-trans-(Propylcarbamyl-2-carbonyl)-L-isoleucyl-Lproline methyl ester

CAD-

caspase activated DNase

CARD-

caspase recruitment domain

CAMK-

calcium/calmodulin-dependent protein kinase

CAMKK-

calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase

CED-3-

cell death abnormality family member

CHX-

cycloheximide

CHAPS-

3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1propanesulfonate

DCC-

deleted in colon cancer

DiOC6(3)-

3,3’-Dihexyiloxacarbocyanine iodide

DD-

death domain

DED-

death effector domain

DiOC6(3)-

3,3’-Dihexyiloxacarbocyanine iodide

DISC-

death-initiation signaling complex

DTT-

DL-Dithiothreitol

E64c-

(2S, 3S)-trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido-3 methylbutane

3


E64d-

(2S, 3S)-trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido-3methylbutane ethyl ester

EDTA-

Ethylenediaminetetraaceticacid-d12

EtBr-

ethidium bromide

FAS/CD95-

tumor necrosis factor receptor superfamily, member 6

FL-

fluorescence intensity

FADD/MORT1-

Fas-associating death domain-containing protein

FLICE-

Fas-linked ICE-like protease

FSC-

forward scatter

GA-

geldanamycin

HEPES-

(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid

Hsp90-

heat shock protein 90 kDa

ICE-

interleukin 1-B converting enzyme

IGF-IR-

insuline-like growth factor receptor I

JNK-

C-jun-amino-terminal kinase

MARK-

MAP/microtubule affinity-regulating kinase

MICE-

MHC class I polypeptide-related sequence E

NFkB-

nuclear factor kappa B

Omi/Htra2-

high temperature requirement protein A2

PARP-

poly (ADP-ribose) polimerase

PAK-

p21-activated kinase

PBS-

phosphate buffered saline

PHKG-

phosphorylase kinase gamma

PCD-

programmed cell death

PLA-

phospho lipase A

PI-

propidium iodide

PIDD-

p53-induced protein with a death domain

PS-

phosphatidil serine

RIP1-

receptor-interacting protein-1

ROS-

reactive oxygen species

SDS-

sodium dodecyl sulfate

SLK-

STE20-like kinase

4


SSC-

side scatter

STK-

serine/threonine protein-kinase

STS-

staurosporine

TNF-

tumor necrosis factor

TRAIL-

TNF related apoptosis inducing ligand

TRAIL-R-

TRAIL receptor

DR-

death receptor

TRIS-

Tris(hydroxymethyl-d3)amino-d2-methane

WAH-1-

worm AIF (apoptosis inducing factor) homolog

VDAC-

voltage dependent anion channel

z-DEVD.amc-

benzyloxycarbonyl-Asp(OMe)-Glu(OMe)-Val-DLASP(OMe)-7 aminomethylcoumarin

z-FA.fmk-

benzyloxycarbonyl-Phe-Ala-fluoromethylketone;

z-FR.amc-

benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-aminomethylcoumarin

z-RR.amc-

benzyloxycarbonyl-Arg-Arg-aminomethylcoumarin

z-VAD.fmk-

benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(OMe)fluoromethylketone

5


II. IRODALMI HÁTTÉR II. 1. Problémafelvetés Az apoptózis legfőbb szabályozó elemei a kaszpázok, melyek specifikus proteáz aktivitásuk révén szelektíven hasítanak proteineket a sejten belül. Ennek hatására megváltozik

a

membrán

foszfolipid

eloszlása,

a

DNS

nukleoszómálisan

fragmentálódik, a sejtmag és citoplazma zsugorodása figyelhető meg (1). A kaszpázok specificitására utal, hogy a sejt teljes fehérje készletéhez képest minimális változás megy végbe a kaszpázok hatására, de a sejt mégis elhal. A kaszpázok felfedezése után évekig az a nézet volt általánosan elfogadott, hogy kaszpázok nélkül apoptózis, vagyis sejt által szabályozott, aktív sejthalál nem megy végbe. Azonban a kilencvenes évek közepétől egyre több adat született arra vonatkozóan, hogy kaszpázok gátlása vagy hiánya mellett is létrejön szabályozott elhalás (2). Általánosságban a klinikumban alkalmazott daganatellenes szerek hatásossága összefügg az apoptózis indukáló képességgel. Azonban az alternatív sejtelhalást okozó jelpályák ismerete, illetve szabályozó elemeinek meghatározása két okból is fontos. Egyrészt bizonyos esetekben a kaszpáz-függő jelút sérült és ezáltal a daganatok rezisztenssé válnak az apoptózissal szemben. Ezekben az esetekben a kaszpázoktól független jelutak aktiválása elősegítheti a terápia sikerességét. Másik eset, amikor a daganatellenes kezelések hatásosak ugyan (a tumor térfogat szignifikánsan csökken), de apoptózis helyett más módon pusztulnak el a sejtek. Iyen esetekben a kaszpáz-független jelutak kutatása közelebb vihet a kemoterápiás szerek hatásmechanizmusának megértéséhez és ezáltal a terápia optimalizálásához (3). Kísérleteink során elsőként arra kerestük a választ, hogy humán leukémia sejteken lehetséges-e ilyen alternatív sejtelhalás útvonalakat aktiválni. Ennél még érdekesebbek voltak azok az eredmények, melyek a nekrózis egy típusának

„programozottságára”

utaltak

(4).

Szórványosan

születtek

olyan

közlemények, ahol a kaszpáz aktivitás hiányában létrejövő sejtelhalás formák nem apoptotikusak, hanem nekrotikusak voltak vagy esetleg „kevert” fenotípust mutattak. E sejtelhalás típusok szabályozhatósága, illetve farmakológiai gátlókkal történő egymásba alakítása szintén kijelölhet új kutatási célokat a terápiás alkalmazások területén. Az apoptózis során bekövetkező változások -a nekrózis immun és gyulladásstimuláló

6


hatásának ellenpontjaként- aktívan immunszupresszív hatásúak. Egyes akut szöveti sérülések során elsősorban a nekrózis gátlása lehet a cél. Abban az esetben, ha ez nem lehetséges a nekrózis apoptotikus irányba terelése még így is csökkentheti a másodlagos szöveti károsodás mértékét. A történet visszafele is hasznos: az apoptotikus daganatpusztulás

nekrotikus

irányba

vitele

stimulálhatja

a

daganatellenes

immunválaszban jelentős szerepet betöltő dendritkus sejteket. Ezért fontos kérdés, hogy a kaszpáz-gátolt szituációkban létrejövő sejthalálformák fenotípusa és molekuláris profilja mely elemek specifikus stimulálásán vagy éppen gátlásán keresztül alakítható egymásba. Azonban az alternatív sejthalál formák szabályozó komponensei mind a mai napig kevésbé ismertek.

II. 2. Az éltető halál Első hallásra ellentmondásnak tűnik, hogy az élet nem folytatódhat halál nélkül. Furcsa, de igaz. A szervezetünkben naponta 50-70 milliárd sejt pusztul el, egy év leforgása alatt pedig teljes testsúlyunknak megfelelő mennyiség, az év végére mégis megközelítőleg ugyanannyi a súlyunk, mint az év elején volt. Ez a szemléletes példa jól mutatja, hogy a sejtek halála és újra képződése mennyire szigorúan szabályozott, vagy ha úgy tetszik programozott a soksejtű szervezetben. De mi a halál értelme? Néhány esetben a válasz egyértelmű. A fejlődés során a sejtelhalás a különböző szervek, szervrendszerek, testrészek, pl.: testüregek vagy végtagok, kialakításában vesz részt. A sejtelhalás fontos szerepet játszhat olyan, a fejlődés bizonyos szakaszában funkcionáló struktúrák eltüntetésében, melyekre a továbbiakban már nincs szükség. A folyamatosan megújuló rendszerek esetén (bőr, bél, csontvelő) a sejthalál biztosít teret az újonnan keletkező sejteknek (5). A gerincesek fejlődése során a sejthalál segítségével eliminálódik a legtöbb újonnan kialakult lymphocita, melyek a szervezetre potenciális veszélyt jelentenek vagy éppen hasznavehetetlenek. A sejthalál ugyancsak segíthet a sejtszám szabályozásában a túlszaporodott sejtek eltüntetésével. A neutrophil granulocyták például állandóan termelődnek a csontvelőben, de a legnagyobb részük elpusztul néhány napon belül anélkül, hogy funkcióját betölthette volna. Ez az első hallásra pazarló körforgása a sejtosztódásnak és pusztulásnak a fertőzésekkel szemben mindig mobilizálható sejtkészlet fenntartását szolgálja. Egy szervezet egészével

7


szemben „néhány” sejt halála nem olyan nagy veszteség, így belátható, hogy miért éri meg az organizmusnak saját egészséges sejtjeinek pusztítása. A fejlődésbiológusok már a hatvanas években felfigyeltek a metamorfózis és az embrionális fejlődés során jelentkező szövetátalakulásra, sejtelhalásra (6). A sejt morfológiai jellemzőit vizsgálva Kerr és munkatársai javasolták 1972-ben a normális sejtek pusztulására a sejtöngyilkosság kifejezést, ami azt jelentette, hogy a sejtek egy intracelluláris jelutat aktiválva, szabályozottan pusztulnak el (1). A mechanizmust később apoptózisként vagy programozott sejtelhalásként nevezték el. Mivel e haldokló sejteket saját szomszédjaik fagocitálják és emésztik, ezért a nagy mértékű sejtelhalások ellenére is csak néhány halott sejtet figyelhetünk meg. Többek között ez is magyarázza, hogy a „beépített” halál programmal rendelkező sejtek ötlete még 20 évig nem vált általánosan elfogadottá. Az áttörés a Caenorhabditis elegans nevű fonalféreg részletes genetikai vizsgálataival kezdődött. A C. elegans-on végzett kísérletek során Horovitz és munkatársai két gént azonosítottak (ced-3, ced-4), ami a sejt haláláért volt felelős. Ha bármelyik gént inaktiválták mutációk létrehozásával, akkor a normál esetben a fejlődés során elpusztuló 131 sejt nem halt el. Ez volt az első konkrét bizonyíték arra vonatkozóan, hogy a sejtelhalás egyik típusa a fejlődés során meghatározott program szerint, genetikailag kódolva valósul meg (7). A sejtelhalás fontosságára éppúgy, mint a szabályozás aprólékosságára is utal, hogy a pusztulás és képződés közötti egyensúly felborulása egyik vagy másik irányba, mennyire komoly problémákat okozhat a szervezetben (daganatok képződése, illetve különböző neurodegeneratív kórképek kialakulása). Ez a felismerés adta a sejtelhalás kutatások létjogosultságát és vezetett el azokhoz az eredményekhez, melyek napjainkra egy meglehetősen komplex és még mindig nem teljes képet rajzolnak ki e folyamatok szabályozásáról.

II. 3. A sejthalál típusai - az elnevezések körüli zűrzavar Az apoptózis mind morfológiájában, mind biokémiai folyamatait tekintve a legjobban jellemzett típusa a sejtelhalásnak. Az apoptózis morfológiája a sejtmag változásában látszik a legnyilvánvalóbban. A kromatin erőteljesen kondenzálódik (1. ábra) és egyszerű, fénymikroszkóppal látható geometriai (gömb, félhold) formákba rendeződik, ezt a sejtmag fragmentációja követi (karyorrhexis). Az apoptózis további fontos jellemzői a sejt térfogatcsökkenése (pycnosis), apoptotikus testek formálódása,

8


vakuólizáció

és

a

membránalkotó

foszfatidil-szerin

áthelyeződése

a

citoplazmamembrán külső felére. Mindezek a változások úgy mennek végbe, hogy a sejtalkotó organellumok ultrastruktúrálisan nem, vagy csak minimálisan változnak, illetve a citoplazmamembrán is megőrzi épségét egészen a végsőkig (1).

apoptózis

nekrózis

1. ábra: A sejthalál formák ultrastruktúrális megjelenése Apoptózis-szerű, sejtelhalás-ról beszélhetünk, ha a kromatin kondenzációja nem annyira kompakt és teljes, mint az apoptózisnál. Az apoptózishoz hasonlóan szomszéd sejtek

fagocitózisát

aktiváló

molekulák

megjelenése

is

fellelhető

még

a

citoplazmamembrán lízise előtt. A sejtelhalás e formájánál az apoptózis többi jellemzői is megjelenhetnek bármilyen mértékben és kombinációban (2). Nekrózis, vagy más néven oncosis, jelenik meg többek között túl magas koncentrációjú detergenseknek kitett sejtekben, sérülések következtében, összegezve nem fiziológiás körülmények között (2). Azonban fokozatosan növekszik azoknak a publikációknak a száma, ahol leírják, hogy a nekrózis megjelenhet fiziológiás körülmények között is a sejt által szabályozottan (4). A nekrózis morfológiájában sokkal jobban jellemzett, mint biokémiai folyamataiban (1. ábra). A legfőbb morfológiai jellemzői a sejt és a sejtalkotók duzzadása, a citoplazma habosodása (ami az endoplazmás reticulum (ER) bomlásának a következménye) és az apoptózissal ellentétben, a citoplazma membrán permeabilizációja megelőzi a DNS fragmentációját, amely általában random, nem „nukleoszómális”. Autofágiás sejtelhalás szintén egy morfológiai kritérium, melynek jellemzője a jelentős mértékű autofágiás vakuólum képződés. Ezek a vakuólumok duplamembránnal rendelkeznek és bennük sejtalkotók találhatók, így elkülöníthetőek más vezikuláktól (1.

9


ábra). Azonban kérdéses, hogy az autofágia valóban egy elhalás típus-e, mivel az autophágiával kapcsolatos gének kiütésével végzett kísérletekből nem vonható le egyértelmű konklúzió. Számos esetben az autophágiával kapcsolatos gének, kiütése csökkenti a sejthalál mértékét, de sokszor a hatás pont ellentétes, vagy éppen a génkiütés nem okoz semmiféle változást (8). Vannak olyan speciális formái a sejthalálnak, mint a mitotikus katasztrófa, mely hibás mitózis következményeként zajlik le, az ER duzzadásával járó paraptosis, a posztszinaptikus neuronokban végbemenő excitotoxikus elhalás, illetve csak a neuron bizonyos részeit (pl.: axont) érintő degeneráció, de a szabályozott elhalás egyik formája az epidermiszben zajló szaruképződés is (9). A különböző sejtelhalás formák osztályozása (a fenti sem kivétel) legtöbbször morfológiai kritériumokon alapszik a sejtben lezajló biokémiai folyamatok jellemzése helyett. Az osztályozás fő problémája abban rejlik, hogy három kategória (morfológia, genetikai meghatározottság, a jelenséget kiváltó körülmények) szerinti osztályozás keveredik az elnevezésekben. Sok publikációban például a programozott sejtelhalást (PCD-programmed cell death) és az apoptózist szinonimaként alkalmazzák. A programozott sejtelhalás definíció arra utal, hogy bizonyos sejtek elhalása genetikailag programozott az egyed fejlődése során. Tehát nem a morfológiai megjelenésre illetve a biokémiai jellemzőkre utal. Sokszor a programozott sejtelhalást a nekrózissal állítják szemben. Ez szintén nem precíz, mivel a nekrózis klasszikus megfogalmazása azt takarja, hogy patológiás körülmények között jön létre. Azonban számos olyan eset van, amikor nekrózis megy végbe fiziológiás körülmények között is (4,9). Tehát érdemesebb sejt által szabályozott illetve nem szabályozott elhalásról beszélni. A szabályozott sejtelhalás definíció azt jelenti tehát, hogy a sejtelhalás felfüggeszthető a vizsgált sejtben lévő jelút vagy enzimaktivitás gátlásával. Ebbe a kritériumba így beletartozhat a genetikailag programozott, de a genetikailag ugyan nem programozott, viszont valamilyen specifikus stimulusra létrejövő elhalás is, a morfológiai megjelenéstől függetlenül. A sejtelhalás szó a folyamat-jelleget hangsúlyozza, míg a sejthalál kifejezés inkább a végállapotot jelenti.

10


II. 4. A sejtelhalás regulációja kaszpázokkal

II. 4. 1. Kaszpázok szerkezete Az előzőekben már említett C. elegans-on végzett kísérletek eredményeként azonosított, az apoptózisban részt vevő két gén közül az egyik, a ced-3 gén által kódolt fehérje és a humán interleukin-1 konvertáló enzim (ICE) között jelentős hasonlóságot találtak (10). Az ICE egy intracelluláris proteáz, ami emberben, a gyulladás kialakításában részt vevő interleukin-1 érését segíti elő a prekurzor fehérje hasításával. A két fehérje közötti hasonlóság volt az első bizonyítéka annak, hogy a sejtekben lévő sejthalál program proteolízis függő. Hamarosan a CED-3/ICE család más tagjait is azonosították (11), melyek közül a legtöbb apoptózis során aktiválódik. Ezek a proteázok ma kaszpáz néven ismertek. A kaszpázok mindegyikének cisztein aminosav van az aktív centrumában, és aszparaginsav mellett hasítják célfehérjéiket. Szubsztrátjaik az általában négy aminosavat

felismerő

peptidkötő

zsebükbe

illeszkednek (12). A kaszpázokról köztudott, hogy alapállapotban zimogén, azaz az aktív formához képest csak minimális aktivitással rendelkező formában vannak jelen a sejtben. Ezek az úgynevezett prokaszpázok. A prokaszpázok egy N terminális prodomainből, egy kb.: 20 kDa méretű nagy és egy kb.: 10 kDa-os kis alegységből állnak (13,14). A kaszpázok aktiválódása specifikus helyeken történő proteolítikus hasítás révén valósul meg, melyről részletesebben lesz szó a későbbiekben. A kaszpáz proteáz család funkciójuk és a prodomain struktúrája alapján három fő csoportba osztható. A nagyméretű prodomainnel rendelkező kaszpázok a gyulladási (I. csoport), illetve az apoptózis jelút elején résztvevő indító (II. csoport) kaszpázok. A kis prodomainnel rendelkezők az úgynevezett végrehajtó kaszpázok

(III. csoport) (1.

táblázat), melyek az apoptotikus morfológia létrehozásában működnek közre (15). A nagy prodomain magán hordoz egy bizonyos szerkezeti mintázatot az úgynevezett halál domain szupercsaládból. A halál domainek 80-100 aminosav hosszú motívumok, melyek az apoptotikus szignál közvetítésében vesznek részt a sejten belül. E fehérje szupercsalád tagjai között találhatók a DD (death domain), DED (death effector domain) és CARD (caspase recruitment domain) molekulák (16). Ezek

11


mindegyike interakcióba tud lépni más azonos szerkezetű molekulákkal hidrofób és elektrosztatikus kölcsönhatások révén. DED található a prokaszpáz-8 és-10 molekulák prodomainjén, míg CARD számos kaszpázon jelen van (kaszpáz-1, -2, -4, -5, -9, -11 és -12)(15). 1. táblázat: A kaszpázok csoportosítása funkció és prodomain struktúra alapján I CSOPORT

II CSOPORT

III CSOPORT

gyulladási kaszpázok

indító kaszpázok

végrehajtó kaszpázok

kaszpáz-1 / ICE

kaszpáz-2 / ICH-1

kaszpáz-3 / YAMA

kaszpáz -4 / ICH-2

kaszpáz -8 / FLICE

kaszpáz -6 / Mch-2

kaszpáz -5

kaszpáz -9 / Mch-6

kaszpáz -7 / Mch-3

kaszpáz-11 (mus musculus)

kaszpáz-10 / Mlc-4

kaszpáz-12 kaszpáz -13 kaszpáz -14 / MICE A szignálútban elfoglalt helyük alapján megkülönböztetnek a szignálkaszkád elején lévő indító (iniciátor) (ilyen a kaszpáz-8 és-9) és a jelút végén szereplő végrehajtó (effektor) kaszpázokat (pl.: kaszpáz-3) (17,18). A végrehajtó kaszpázok az indító kaszpázok által hasítódnak és így válnak aktív enzimmé (19). Felmerül a kérdés, hogy az indító kaszpázokat mi aktiválja? Ezért fontos a kaszpázok prodomainjén lévő, előbb említett két DD családba tartozó fehérje a DED és a CARD, ugyanis e két fehérje funkciója az iniciátor kaszpázok halál, illetve gyulladás keltő szignálkomplexekbe gyűjtése, amelyekben a kaszpázok egymást hasítják, vagyis autoaktiválódnak (15). Míg az indító kaszpázok szubsztrátjai szintén kaszpázok, addig a végrehajtó kaszpázok már az apoptózisra jellemző változások létrejöttében szerepet játszó, specifikus célmolekulák hasításában vesznek részt. Vagyis az effektor kaszpázok nem a tömeges fehérjedegradáció révén valósítják meg az apoptózist, hanem a sejt teljes fehérje készletéhez képest minimális mennyiségű szubsztrát hasításával (19).

12


II. 4. 2. Külső aktivációs út A többek között kaszpázokból álló „öngyilkos” apparátus jelen van a normális sejtekben, és csupán aktiválni kell, hogy elinduljon a sejtelhalás mechanizmusa, azonban az aktiválódás oka csak néhány esetben ismert. Ha egy vírus megfertőzi az emberi szervezetet, a citotoxikus T lymphociták aktiválódnak és a fertőzött sejtekben sejtelhalást indukálnak, ezáltal előzve meg a vírus tovaterjedését a szervezetben. Ilyenkor a T lymphociták egyrészt különböző fehérjéket (például: a pórusformáló perforin, vagy a szerin proteáz granzim B) szekretálnak a fertőzött sejtek felszínére, másrészt új membrán kötött molekulák is megjelennek az aktivált T sejtek felszínén. Ilyen például a FasL, amely a receptorjához (Fas) való kapcsolódás útján apoptózist idéz elő az arra érzékeny sejtekben (20). Ez utóbbit nevezik az irodalomban az apoptózis sejten kívülről jövő (extrinsic) aktivációjának. E folyamat kezdeti lépése a halál receptor-halál ligand kapcsolódás (21). A sejtfelszíni transzmembrán proteinek közé tartozó tumor nekrózis faktor receptor család tagjai (pl.: TNF-R1, CD95/Fas, TRAIL-R1/DR4, TRAIL-R2/DR5) az intracelluláris részükön - hasonlóan a kaszpázok prodomainjéhez - szintén tartalmaznak DD molekulákat (22,23), ezért nevezik őket halálreceptoroknak is. A halálreceptor kapcsolódik az extracelluláris térből érkező halálliganddal (TNFα, FasL, TRAIL), mely egy komplex formálódását teszi lehetővé (2. ábra) (24).

13


2. ábra: Az apoptózis külső aktivációs útja A receptorok oligomerizálódnak, majd ezekhez olyan, szintén DD-t tartalmazó adaptor fehérjék társulnak (pl.: FADD/MORT1), melyek a másik végükön DED molekulát tartalmaznak. Ezek DD végükkel a receptorokhoz, míg DED részükkel az Nterminálisukon DED-et tartalmazó prokaszpázokhoz (prokaszpáz-8 és prokaszpáz-10) kötnek. Az így létrejött szignálkomplexet nevezik az irodalomban DISC-nek (Death Initiation Signal Complex). Ebben a komplexben a kaszpáz-8, illetve -10 aktiválódása az „indukált proximitás” elve szerint megy végbe, ami azt jelenti, hogy a nagy helyi kaszpáz koncentráció és a kölcsönösen előnyös orientáció előidézi az autoproteolítikus aktivációt (25). A kaszpáz-8 aktiválódása két hasítási eseményt kíván meg. Az első a nagy és kis alegység között történik, ami elősegíti, hogy a nagy és a kis domain az aktív konformációba rendeződhessen. A második hasítás a prodomainről való lehasadást eredményezi, ami végeredményben két kaszpáz-8 molekula kis és nagy alegységéből álló aktív heterotetramer kialakulását és ennek a komplexről való leválását hozza létre (3. ábra) (26).

14


3. ábra: Az indító kaszpázok aktiválódása

A szabályozás negatív oldalán egy részről olyan halál receptorok állnak, melyek ugyan kötik a ligandot, de nincs sejten belüli halál domainjük, azaz nem közvetítenek jelet a sejt belseje felé, ezek a „csali” vagy decoy receptorok. Másik részről a halálreceptorok közvetítenek a sejt túlélését segítő jelet (pl.: NFkB aktiváció) is (5). II. 4. 3. Belső aktivációs út A prokaszpázok akkor is aktiválódhatnak, ha ugyan a sejt felszínéről nem érkezik stimulus, de a sejtet valamilyen stresszhatás érte. E stimulusok (farmakon által indukált stressz, UV sugárzás, túlélési faktor megvonás, hősokk, oxidatív stressz, DNS károsodás)

hatására

a

mitokondrium

permeabilizálódik.

A

mitokondrium

permeabilizálódásával kapcsolatban több elmélet létezik. Az egyik elmélet szerint csupán a mitokondrium külső membránja permeabilizálódik. Ebben az eseményben fontos szerepet játszanak a B-sejtes lymphoma proteinek (B cell lymphoma 2: BCL-2) családjába tartozó pro- (BID, BIM, BAX, BAK) és antiapoptotikus (BCL-2, BCL-XL) fehérjék (27). Ezek elsősorban a mitokondrium külső membránjának átjárhatóságát szabályozzák. Ha a proapoptotikus BID fehérje hasítódik (tBID), akkor képes aktiválni a citoszólikus BAX fehérjét, amely normál állapotában inhibitoraihoz kötődve van jelen a sejtben. Az aktivált BAX transzlokálódik a mitokondriumba, ahol a mitokondrium külső membránjában oligomerizálódik és egyéb fehérjék (BAK) és lipidek segítségével pórust képez a külső membránban. Ennek hatására a külső membrán permeabilizálódik,

15


amely lehetővé teszi a mitokondrium intermembrán teréből olyan proapoptotikus molekulák kiszabadulását, mint például a citokróm C (4. ábra) (28-32).

mitokondrium án mitokondrium külső membr

tBID

oligomerizáció

inzerció

konformáció változás

Citokróm C kiszabadulás

cytosol 4. ábra: A mitokondrium permeabilizációja

A citokróm C kiszabadulásának hatására egy nagy molekulasúlyú komplex, az apoptoszóma jön létre a citoplazmában. Ennek a komplexnek a központi alkotó eleme az Apaf-1 (apoptotic protease activating factor), mely ATP és citokróm C jelenlétében oligomerizálódik és így alakítja ki az apoptoszómát. A prokaszpáz-9 prodomainjén a már korábban említett halál domain család egyik tagját a CARD motívumot hordozza, melynek segítségével képes az Apaf-1 molekula hasonló domainjéhez kötni és így komplexbe rendeződni (5. ábra). A komplexbe rendeződés a kaszpáz-9 dimerizációját és az alegységek közötti hasítást eredményezi, mely a kaszpáz-9 aktivációjához vezet (33,34).

16


5. ábra: Az APAF-1 molekula komplexbe rendeződése és a kaszpáz-9 aktiválódása Felvetődik a kérdés, hogy a mitokondriális jelút elején szereplő BID, mely molekulák által hasítódik? Egyike a lehetséges jelölteknek a kaszpáz-2, (35). Úgy tűnik, hogy a kaszpáz-2 szintén egy komplexben, az úgy nevezett piddoszóma komplexben képes aktiválódni, melyhez a prodomainjén található CARD motívumán keresztül kötődik

17


(36). A BID hasításában a külső aktivációs út indító kaszpáza (kaszpáz-8) is részt vehet és egyéb proteázok is gyanúsíthatók (katepszinek, kalpainok) (37,38). Egy másik elmélet szerint a mitokondrium mindkét membránján átívelő permeabilitási pórus képződik, melyben számos mitokondrium membrán alkotó fehérje (pl.: cyclophillin D, VDAC, ANT) részt vesz. Ebben a modellben a mátrix duzzadása idézi elő a külső membrán felszakadását és a proapoptotikus proteinek kiszabadulását (33). Egy új elmélet szerint a BAX és az előbb említett mitokondriális fehérjék együtt hozzák létre a citokróm C kiszabadulását, anélkül, hogy az ionegyensúly felborulna. Ezen elképzelés szerint a mitokondriális depolarizáció nem feltétele a citokróm c kiszabadulásnak és az ezt követő apoptózisnak (39).

II. 4. 4. Az apoptózis belső útjának aktiválása staurosporinnal Az apoptózis egyik gyakran használt (modell-értékű) aktivátora a kevéssé szelektív protein kináz gátlószer, a mikrobiális eredetű STS (staurosporin). A STS kis koncentrációban (10 nM) a protein kináz C gátlószere, de újabb eredmények szerint már ilyen tartományokban sem teljesen specifikus inhibitor, mivel tirozin kinázok gátlásában is részt vehet. Az általunk alkalmazott koncentrációban már (1000 nM) a staurosporin számos protein kináz inhibitora (STK 10, SLK, CAMK2A, CAMKK1, CAMK2D, CAMK2G, MARK2, STK3_m, STK4, CAMKK2, PHKG1, PHKG2, PAK3, PAK6, PAK7, PAK1, STK18) (40-43). Az STS apoptózist indukáló hatásmechanizmusa nem ismert részleteiben, de azt tudjuk, hogy a mitokondriális utat aktiválja. A STS kezelés a BAX aktivációját és mitokondriális transzlokációját idézi elő. Ennek következményeként a mitokondrium külső membránja permeabilizálódik, lehetőséget teremtve ezzel számos proapoptotikus fehérje citoszólba jutására (citokróm C, Omi/HtrA2 és AIF) (28-32). A citokróm C kiszabadulása az apoptoszóma komplexben a kaszpáz-9 aktivációt idézi elő. Végül a kaszpáz-9 hasítja a végrehajtó kaszpázokat ( kaszpáz-3,-6,-7). Ezeket az eredményeket többek között neuronális és myeloid sejteken is leírták (44-46). Ugyanakkor myeloid sejtvonalon olyan eredmények is születtek, hogy bizonyos esetekben úgy jön létre apoptózis, hogy mitokondrium depolarizáció nem következik be (47,48) Más apoptózis indukáló szerekkel ellentétben a staurosporin okozta apoptózis késői fázisában a membránnal határolt sejtalkotórészeket hordozó ún. apoptotikus

18


testek képződése és leválása a sejtről nem jelentkezik. Ennek egyik lehetséges magyarázata lehet, hogy a protein kináz C gátlásával nem történik meg a mikrofilamentum átrendeződés sem, ami feltehetően szükséges lenne az apoptotikus testek képződéséhez (49). Ennek következében a sejtek „egyben” maradnak. Ez a tulajdonság teszi alkalmassá a staurosporint, hogy az apoptózis modellvegyületeként használjuk az áramlásos citometriás mérések során is.

II. 4. 5. Végrehajtó kaszpáz kaszkád. A jelút végén szereplő végrehajtó kaszpázok aktiválódása különböző módon folyik az előbb tárgyalt extrinsic és intrinsic utakon. A receptor közvetítette (extrinsic) úton két lehetőség is van az aktiválódásra. Az úgy nevezett I. típusú sejtekben a halálreceptor-ligand kapcsolódásra kialakuló komplex (DISC) nagy mennyiségben formálódik, ami jelentős számú aktív kaszpáz-8-at eredményez. A kaszpáz-8 aktivitása közvetlenül az effektor kaszpázok (kaszpáz-3 és -7) aktiválásához vezet. A II. típusú sejtekben azonban a kis mennyiségű DISC miatt szükség van egy erősítő körre is, hogy elegendő indító kaszpáz aktiválódhasson (50). Itt a kevés mennyiségű aktív kaszpáz-8 egy BCL-2 családba tartozó proteint hasít, az előbb már említett BID-et, melynek hasítására tBID keletkezik és ez a mitokondriumban az intrinsic jelútnál leírt változásokat idézi elő, melyek itt is a citokróm C felszabadulásához és kaszpáz-9 aktiválódáshoz vezetnek. A kaszpáz-9 már képes aktiválni a végrehajtó kaszpázokat (kaszpáz-3 és-7) ebben az esetben (II. típusú extrinsic), és a belső aktivációs úton is egyaránt. Az effektor kaszpázok, mint a kaszkád hóhérjai, szubsztrátok hasítását és így az apoptotikus morfológia megjelenését és biokémiai jelenségeit eredményezik (6. ábra) (15). A kaszpáz-3 és -7 nem csak a jelút végén játszik kulcs szerepet, ugyanis génkiütéses kísérletekkel megmutatták, hogy az apoptózis mitokondriális eseményei nem mennek végbe e két enzim jelenléte nélkül. Ez azt jelenti, hogy szerepük nem csak a mitokondrium utáni eseményekben van, hanem már a mitokondrium előtti folyamatoknak (pl.: BID hasítás, BAX transzlokációja) is irányítói lehetnek. Azonban az is kiderült, hogy a két gén kiütése ellenére a mitokondriális események késleltetve mégis megjelentek (51). Ezt az magyarázza, hogy a BID hasításában egyéb kaszpázok és más enzimek, pl. granzimek, kalpainok és katepszinek is szerepet játszhatnak (37,38).

19


II. 4. 6. A kaszpázok szubsztrátjai Az effektor kaszpázok, ha aktiválódtak specifikus proteineket hasítanak a sejtben. A kaszpázok meglehetősen szelektív enzimek. A sejtek apoptózis előtti és utáni fehérje profilja elenyésző változást mutat a sejt teljes fehérje mintázatához képest, mégis a sejtekben elegendő változás megy végbe ahhoz, hogy elpusztuljanak. Szubsztrát fehérjéik a mag struktúráját alakító laminok (52), amelyek hasítása elősegítheti a mag kondenzációját. A kaszpázok hasítják a sejtváz alkotó (aktin, gelsolin), és a sejtek letapadásában közreműködő (β-katenin és plakoglobin) molekulákat (53). Ezek vágása elősegíti a sejt elszakadását más sejtektől így téve könnyebbé a fagocitáló sejtek dolgát. A kaszpázok célmolekulái közt szerepelnek a DNS metabolizmusban, hibajavításában tevékenykedő fehérjék, mint például a PARP enzim (54), melynek specifikus hasítását gyakran használják a kaszpáz aktivitás markereként. A végrehajtó kaszpázok olyan fehérjéket is vágnak, melyek DNS-bontó enzimeket (pl.: CAD=caspase activated DNase) tartanak inaktív állapotban (55), ezzel elősegítve a DNS nukleoszómális fragmentálódását, mely az apoptózis egyik fő biokémiai jellemzője (6. ábra) (56). A DNS szétdarabolásával és a hibajavítás gátlásával a sejt elvágja az esetleges túlélés végső lehetőségét is. Ennek praktikus magyarázata az lehet, hogy így az önfeláldozó sejt blokkolja például a sejten belüli kórokozó szaporodását, vagy DNS károsodás esetén (pl.: UV, citotoxikus szer hatására) a mutáns DNS további replikációját. Az apoptózis során az egyik korai változás a negatív töltésű foszfolipid, a PS (foszfatidil-szerin) transzlokációja a sejt belső felszínéről a külsőre, ahol ez a vegyület a más sejtek (makrofágok) általi felismerést és bekebelezést könnyíti meg (57). A kaszpázok közvetlen szerepe ebben a foszfolipid átrendeződésben kérdéses. A közelmúltban C. elegans-on végzett kísérletek közben kiderült, hogy apoptózis során a mitokondriumból kiszabaduló WAH-1 (a humán AIF C. elegans homológja) aktivál egy enzimet (phospholipid scramblase), mely létrehozza a transzlokációt (58). A teljesség igénye nélkül felsorolt példák mindegyikében a szubsztrátok hasítása azt a célt szolgálja, hogy a haldokló sejt eltávolítása az immunrendszer számára észrevétlenül, gyulladási folyamat lezajlása nélkül menjen végbe (59).

20


Citotoxikus stimulus

Halálreceptor-ligand kapcsolódás

BCL-2 család antiapoptotikus tagjai

Mitokondrium permeabilizálódás

BCL-2 proapoptotikus tagjai

DISC formálódás

Apoptoszóma formálódás

Smac/diablo; Omi/Htra2

Kaszpáz- 8 aktiváció

IAP

Kaszpáz- 9 aktiváció

Kaszpáz- 3, - 7 aktiváció

PARP hasítás CAD DNáz Egyéb szubsztrátok hasítása: aktivációja aktin, fodrin, gelsolin, lamin DNS fragmentáció

Sejt elszakadása a többi sejttol

6. ábra: A kaszpáz-vezérelt apoptotikus jelút szabályozó elemei

II. 4. 7. Kaszpáz-függő apoptózis jelutak meghibásodása: az örök élet titka? Egyre több adat támasztja alá azt a megfigyelést, hogy az apoptózis szignáljában bekövetkező hiányosságok hozzájárulnak a daganatok kialakulásához (60-69). Ennek oka,

hogy

az

apoptózis

zavara

elősegítheti

génhibák

felhalmozódását,

az

immunsejtekkel szembeni rezisztenciát, a sejtek túlélését növekedési faktorok, hormonok nélkül, csökkenti a daganatsejtek oxigéntől és tápanyagtól való függését és végül, de nem utolsó sorban hozzájárul a citotoxikus szerekkel és a sugárzással szembeni rezisztenciához (5). A legfontosabb apoptózissal kapcsolatos gének, amelyek gyakran mutáltak vagy dereguláltak daganatsejtekben a következők: p53 tumorszupresszor gén mutációja vagy

21


deléciója (61,70); Akt kináz aktiváció (62); BCL-2 (non-Hodgkin lymphomák) (63); BAX mutáció (64) (gyomor, bél illetve vérképző rendszer tumorai); survivin és más IAP családba tartozó fehérjék (tüdőrák) (65), melyek gátolják a kaszpázok aktivitását. Egyes tumorok például Fas halálreceptor hiányával védekeznek az immunsejtek halálligand támadása ellen (66) (6. ábra). Daganatokban (neuroblasztóma, prosztatarák) a kaszpáz gének expresszió csökkenését, illetve mutáció miatti inaktiválásukat egyaránt leírták (67-69). Látható tehát, hogy számos esetben kaszpáz aktivitás nem jön létre még akkor sem, ha a megfelelő stimulus megtörtént. A szervezetben a sejtelhalás zavarai nemcsak daganatok kialakulásához vezethetnek. Az érem másik oldala, a túlzott sejtpusztulás, amely szintén betegségekhez vezet.

Parkinson-betegség

illetve

ischaemiás

stroke

esetén

bekövetkező

neurodegeneráció specifikus sejtpopulációk apoptotikus elhalásával köthető össze (71). Az Alzheimer-kór patogenezisében központi szerepet játszó amyloid-β peptid toxicitásában is kaszpázok, illetve legújabb eredmények szerint a halálreceptor vezérelte jelút részvételét is leírták (72). Mint már utaltam rá, a sejtekben azonban más szabályozott módja is kialakult az elhalásnak, melyekben kaszpáz aktivációt nem figyeltek meg. Néhány példa van arra vonatkozóan, hogy a szervezetben fiziológiás körülmények között is kaszpáz-független elhalás történik. A csont longitudinális növekedésekor a fejlődés során a chondrocyták nekrózissal (ez többek között a nekrózis programozottságára és szabályozottságára is utal) pusztulnak el (73). Nekrózis figyelhető meg a szöveti homeosztázis fenntartásában intesztinális epiteliális sejtek esetén (74). Kaszpáz-független elhalást találtak az alábbi esetekben

is:

oszteoblasztok

érése

(75),

keratinocyta

differenciáció

(76).

Kaszpázaktivitástól független, sejtelhalási-szerű folyamatok mennek végbe a lencse rost sejtek (77) és vörösvérsejtek érése során bekövetkező organellum vesztésben is (78). Ha túlmegyünk a fejlődés során beprogramozott eseteken, akkor is rengeteg példa van arra vonatkozóan, hogy egyrészt bizonyos sejtek túlélik a kaszpáz aktiválódást, másrészt számos olyan citotoxikus indukció (például mikrotubulus stabilizáló szerek: paclitaxel, discodermolide) ismert, amely sejtelhaláshoz vezet kaszpáz aktiváció

nélkül (79).

Kanamycin,

antibiotikum kezelés süketséget

eredményez, melyről megmutatták, hogy a cochlearis és vestibularis sejtek kaszpáz-

22


független elhalásával magyarázható in vivo egér modellen (80). A meningitis kísérletes rendszerében szintén leírták, hogy a pneumococcus fertőzés apoptózis szerű elhalást indukált, melyben kaszpáz aktivitás nem volt kimutatható (81). A kaszpáz-független elhalás jelutak morfológiájukban igen változatosak lehetnek: apoptózis-szerű, nekrózis-szerű, autophágiás. Néhány esetben a jellemzők egyszerre vagy keverve jelentkeznek. Sokszor az apoptózis indukció gátlása kaszpáz gátlókkal nem szünteti meg a sejtelhalást, csupán a morfológiáját változtatja meg (82). Leírták, hogy az esszenciális apoptotikus események gátlása együttesen az autophágia gátlásával (proapoptotikus BAX, BAK és a „proautofágiás” Beclin-1 együttes génkiütése) nekrózist eredményez (83). Az ATP megvonás (84) vagy a nitrogén monoxid, mely a kaszpázok kovalens módosításával gátolja azokat, szintén nekrotikus irányba tereli az apoptotikus utat (85). Sőt kaszpáz aktivitás gátlása sokszor oly módon szenzitizálja a sejteket nekrózis irányába, hogy kisebb stimulus hatására is reagálnak. Ezek az események a nekrózis ősi evolúciós szerepét erősítik, melyeket elfednek olyan később kialakuló jelutak, mint az apoptózis (86). Ez a sokféle alternatíva lehet a magyarázat arra, hogy pl.: a daganatos betegségeknek viszonylag kicsi az előfordulása, mivel az egyik sejthalál jelútban történő hiba még nem feltétlenül jelenti a sejt túlélését. Az előbbi példák azt a benyomást keltik, hogy itt átkapcsolásról van szó. Tehát, hogy az egyik sejtelhalás gátlása indítja be a másik jelutat. Azonban létezik olyan elképzelés is, mely szerint a jelutak párhuzamosan futnak, és a végeredmény csak azon múlik, hogy melyik út ér el hamarabb az effektor fázisba. Ezt támasztják alá azok az eredmények, ahol leírták, hogy a kaszpáz-független elhalásutak sokszor időben később jelentkeznek, mint a kaszpáz-függő apoptózis (87). A késleltetve manifesztálódó sejtelhalás további problémákat jelenthet az egyedfejlődés során. Erre egy hipotetikus példát hoznék fel: Ha egy X sejtcsoport faktorok termelésével serkenti Y sejtcsoport osztódását, akkor az X sejtcsoport tervezettnél később bekövetkező pusztulása az Y sejtcsoport kelleténél nagyobb mérvű növekedését eredményezheti (88). További magyarázat nélkül is látható, hogy ez szervezet szinten is komoly következményekkel járhat. Még tovább bonyolítja a képet, hogy a fejlődés során bekövetkező sejthalál kaszpáz-függősége sejt, illetve szövetrégió specifikus lehet. Ezt igazolják az egereken végzett kaszpázgén kiütéses kísérletek, ahol azt tapasztalták, hogy az egerek agyában

23


bizonyos területek normálisan kifejlődtek, míg egyes részek fejlődése zavart szenvedett (89). Az időbeni és sejtspecificitásban lévő különbségek mellett azonban meg kell említeni a morfológiai és biokémiai változatosságban rejlő lehetőségeket is. Az apoptózis során az apoptotikus testek teljes egészében kebeleződnek be a szomszédos sejtek által, így elkerülve sejttörmelékek és egyéb gyulladás keltő faktorok kiszabadulását. Ezzel ellentétben a nekrotikus sejt macropinocytosissal távolítódik el, vagyis csak a sejt bizonyos részeit veszik fel a fagociták. A nekrotikus sejt faktorokat bocsát ki magából, melyek figyelmeztetik, aktiválják, és a nekrózis forrásához vonzzák a természetes immunrendszer résztvevőit (makrofágok, granulocyták, NK sejtek) és ezáltal gyulladási reakciót idéznek elő (90,91). E jelutak ismerete és precízebb szabályozhatósága terápiás szempontból is fontos. A nekrózis szabályozó elemei még kevésbé ismertek. Ezek ismerete és specifikus gátlása előretörést jelenthet akut sejtpusztulások esetén vagy éppen specifikus indukciója apoptózis rezisztens daganatoknál. A gyulladáskeltő nekrotikus elhalás antiimflammatórikus (apoptotikus) irányba átkapcsolása a másodlagos szöveti károsodások mértékét csökkentheti. Fordítva: daganatok apoptotikus elhalásának nekrotikus irányba való befolyásolása előmozdíthaja az immunrendszer aktivációját, daganat ellenes specifikus immunválasz kialakulását (91).

II. 5. Nem kaszpáz-proteázok által közvetített szabályozott sejthalál A kaszpáz-független sejtelhalási útvonalak az előzőekben vázoltak szerint a közelmúltban élénk érdeklődést váltottak ki (2). Ezekben a sejtelhalási útvonalakban a kaszpázokat gyakran más proteázok helyettesítik, mint például a kalpainok, szerin proteázok (granzim B) és a lizoszomális katepszinek (92). A kalpainok a citoplazmában inaktív, zimogén formában elhelyezkedő proteázok, amelyek a szabad Ca++ szint emelkedésének hatására aktiválódnak (93). A Ca++ szint emelkedését és kalpainok aktiválódását, mind apoptotikus, mind nekrotikus kaszpáz-független sejtelhalási folyamatokban kimutatták (4,94,95). A szerin proteázok közül a citotoxikus sejtek granulumában található granzim B bír hasonló specificitással, mint a kaszpázok, vagyis aszpartát mellett hasít. Ezért ezek a

24


proteázok fontos szerepet töltenek be a citotoxikus T ill. NK sejtek hatékony sejtölő funkciójában (96). Külön érdekes csoportot alkotnak a lizoszómában elhelyezkedő katepszinek. Korábban általában a lizoszómát a fehérje lebontás egyik központjának tekintették. Később felismerték, hogy szekréciójuk útján elősegíthetik a sejtek motilitását, és csak a közelmúltban ismerték fel szerepüket a sejtelhalás regulációjában, illetve más szignálfolyamatok lezajlásánál (97-100).

II. 5. 1. Katepszinek szerkezete és specifitása A lizoszomális apparátus a makromolekulák és sejt organellumok irányított lebontásáért és újrahasznosításáért felelős a sejtben. Számos proteáz vesz részt ebben a folyamatban, melyek közül a katepszinek a legjobban tanulmányozott lizoszomális hidrolázok (101). A katepszinek lizoszomális proteolítikus enzimek, melyek között találhatók cisztein (katepszin B, C, H, F, K, L, O, S, V, W és X/Z), és aszpartát (katepszin D, E) aktív centrummal rendelkező proteázok is (101,102). A szerin proteáz katepszin G a neutrofil granulocyták ún. azurofil granulumaiban található meg, melyek hasonlóak a citotoxius T sejtek granzimeket tartalmazó citolítikus granulumaihoz (103). A katepszinek 30 kDa tömegű monomerek a tetramer katepszin C kivételével. Két alegységük között végig húzódik egy „V” alakú bemélyedés, mely a szubsztrát specifikus megkötésére és hasítására szolgál. Legtöbbjük endopeptidáz, ami azt jelenti, hogy a polipeptid láncok belső részein hasítanak, míg létezik néhány exopeptidáz (H, C, X) is, melyek a lánc vége felé bontják a peptid kötéseket. A katepszin B endo- és exopeptidáz is egyben. Aktivitásuk szabályozására sok lehetőség kínálkozik. Ezek közül két legfontosabb a zimogén aktiválás és az endogén inhibitorok jelenléte. A katepszinek, a kaszpázokhoz hasonlóan inaktív, zimogén formában szintetizálódnak, melyek N-terminális végükön még tartalmaznak egy propeptidet. A propeptid a katepszin B esetében végig fut a szubsztrátkötő mélyedésben, így akadályozva meg az enzim működését. E propeptid eltávolítása előidézi aktivációjukat, mely megtörténhet más enzimek által (pl.: pepszin, katepszin D) vagy az endopeptidázok esetén autokatalítikusan is.(7. ábra) (104). Ehhez azonban szükséges, hogy az enzimek savas (pH <4) környezetben legyenek (105).

25


N

1. alegység Pro peptid 2. alegység

C

C

Inaktív katepszin B

aktív katepszin B

7. ábra: A katepszin B aktiválódása II. 5. 2. Katepszinek fiziológiai funkciója és szerepe a betegségek kialakulásában A sejten belüli fehérje lebontás nem kizárólagosan katepszin függő (lásd: proteaszóma). Ezt bizonyítja, hogy katepszin deficiens egerekben nem sérül a protein degradáció folyamata (106). Azonban génkiütéses kísérletek rávilágítottak a katepszinek speciális funkcióira, melyek nagyon fontosak a szervezet normális működése szempontjából. Számos katepszin (pl.: katepszin L, F) játszik fontos szerepet az immunrendszer normális működése szempontjából elengedhetetlen, az antigén prezentációban fontos MHC-II-es molekula invariáns láncának processzálásában immunsejteken (pl.: makrofágokban) (107). Úgy tűnik, hogy a katepszin-L-nek kiemelt szerepe

van

az

epidermális

homeosztázis

fenntartásában

és

a

szőrtüszők

morfogenezisében (101,108). Bizonyos katepszinek (S, V, K) korlátozott szöveti lokalizációt mutatnak, ez is bizonyítja specifikus funkciójukat. Például a katepszin K alapvető fontosságúnak tűnik a csontszövet átrendeződésben (104,109,110). A katepszinek alapvetően savas környezetben (pH <4) működőképesek, azonban némelyikük (katepszin B és L) a citoszólba kerülve is részben aktív maradhat, bár életidejük lecsökken. A sejtekből kijutva az extracelluláris mátrix komponenseinek (laminin, fibronectin, kollagén) degradálásával elősegítik a daganatos sejtek migrációját és így a metasztázis kialakulását (111) . Mivel egyes katepszinek részt vesznek az antigén prezentációban fontos komplex (MHC II) képződésében, mely a tumor asszociált antigének prezentálását is végzi, ezért hiányuk vagy alacsony mennyiségük egyes daganatokban (pl.: kis sejtes tüdő karcinóma) rossz prognózist mutat. Más

26


esetekben éppen a katepszinek (katepszin B, L és D) nagy mértékű kifejeződése jelez rossz prognózist a daganat progressziójában (103).

II. 5. 3. Lizoszómák és katepszinek szerepe a sejthalál szabályozásában Az általános nézet szerint ahhoz, hogy a katepszinek sejtelhalás szabályozó szerepüket betöltsék, előbb ki kell kerülniük a lizoszómákból a citoszólba. Több stimulus (P53 aktiváció, mikrotubulus stabilizáló szerek, oxidatív stressz, növekedési faktor megvonás, staurosporin kezelés vagy halálreceptor-ligand kapcsolódás) képes részleges lizoszómális degenerációt és ezáltal a katepszin enzimek citoszólba való kiszabadulását előidézni (8. ábra) (112). A TNF-R1 aktiválása például a savas szfingomielináz enzimek aktiválását és így ceramid képződést eredményez. A ceramid képződés hozzájárul a lizoszómák permeabilizációjához (102). Másik lehetséges mechanizmusban a reaktív oxigén gyökök keletkezése okozza a lizoszómák permeabilizációját. Ebben az esetben viszont a kiszabaduló lizoszómális enzimek elősegíthetik a reaktív oxigén gyökök képződését a mitokondriumban. Ezzel egy öngerjesztő folyamat jön létre, melyben a még jobban megnövekedett oxigén gyök produkció még nagyobb lizoszómális degradációhoz vezet. Egy siRNS-ekkel végzett kísérletsorozat szerint a proapoptotikus BCL-2 család tagjai (BIM és BAX) JNK aktivitásfüggően transzlokálódnak a lizoszómákba és ott elősegítik a pórusképződést, a katepszin B kiszabadulást, illetve az apoptózist (113). A lizoszóma permeabilizálódási folyamatában szerepet kaphat a foszfolipáz A2 (PLA2), mely a membránalkotó foszfolipidek lebontásán keresztül fejti ki hatását (114). Érdekes az is, hogy a lizoszómák áteresztése méret szelektív, így csupán a 70 kDa molekulasúly alatti proteinek jutnak át a sérült membránon (102). A lizoszómális katepszinek felszabadulását a kalpainok aktivációja is elősegíti (115).

27

Doktori értekezés Imre Gergely _____________________________________________________________________________________ Citotoxikus stressz

Halálreceptor-ligand kapcsolódás

BAX, BIM

PLA2

ROS képzodés

Ceramid képzodés Lizoszómális permeabilizálódás

Mitokondrium permeabilizálódás

BID

Hsp70 Katepszinek

AIF, Omi/Htra2 kiszabadulás

Apoptózis-Nekrózis

8. ábra: A lizoszóma permeabilizálódás és a katepszinek sejthalálindukcióban betöltött szerepe A lizoszómális membrán permeabiltás fokozása effektív terápiának bizonyul daganatok kezelésében és a sejtelhalás fokozásában. A lizoszómák érésében, méretük szabályozásában és stabilitásában kulcsmolekula a foszfatidilinozitol 3 kináz, mely sok tumorban túltermelődik. Gátlásának hatására a TNF indukálta kaszpáz-függő apoptózis katepszin-függő irányba tolódik el (116). A lizoszómák stabilitása szempontjából fontos másik molekula a hősokkproteinek közé tartozó Hsp70, mely a lizoszómális membrán integráns része. A fehérje expressziója megfigyelhető daganatokban, ahol beépülése védi a tumorsejteket a lizoszómális permeabilizációtól és a sejtelhalástól (117). Nem véletlen tehát, hogy a Hsp70 megvonása szintén a lizoszómális enzimek kijutását és kaszpáz-független apoptózist eredményezett. Detergenssel végzett kísérletek jelzik, hogy a lizoszómális permeabilzáció nagysága lehet az egyik kulcstényező, mely meghatározza a sejtelhalás módját. Szelektív permeabilizáció apoptózist, míg a masszívabb depolarizáció nekrózist eredményez (118). Érdekes, hogy a tumorprogresszióban előtérbe kerülő katepszinek, a katepszin B, L és D fontos szerepet kapnak az apoptózis regulációjában is (101,102). Egér embrionális fibroblasztokban megmutatták, hogy a katepszin B hiányos egerekből nyert sejtek rezisztensek voltak a TNF-α stimulusra és katepszin B külső adásával a szenzitivitás visszaállítható volt. (119). A katepszin B jelentőségét májkárosodás során

28


is megfigyelték. Egereken végzett in vivo kísérletekben a TNF-α kezelés májsérülést okozott, ez a károsodás azonban nem jelentkezett katepszin B deficiens egyedeken (120). Hasonló eredményt értek el a proteáz farmakológiai gátlásával is. A katepszin B szerepet kap az immunrendszer sejtjeinek pusztulásában is. Immunszupresszív szerrel való kezelés apoptózist eredményezett T lymphocitákban.Ez az elhalás nem citokróm C felszabadulás vagy kaszpáz-3 illetve -9 által regulálódott, ellenben jelentős mennyiségű aktív katepszin B került ki a lizoszómákból, jelezve, hogy az immunszupresszióra bekövetkező apoptózis katepszin függő folyamat lehet (121). A katepszin B specifikus szerepére utal, hogy nem kis sejtes tüdőrák sejteket kezelve mikrotubulus stabilizáló szerekkel, a sejthalál csupán specifikus katepszin B gátlószerrel volt megszüntethető. Ebben az esetben sem a kaszpáz gátlás, sem pedig katepszin D gátlás nem volt hatásos (79). A katepszin D is jelentős szerepet kap a sejtelhalás szabályozásában. A p53 képes szintézisének növelésére, amely végül apoptózist eredményez HeLa sejteken (122). Érdekes új eredmény, hogy a katepszin D katalitikusan inaktív prekurzora is képes apoptózis indukálására HeLa sejtvonalon. Ez azt jelzi, hogy az enzimnek nincs szüksége az aktiv centrumára ahhoz, hogy a sejtelhalás effektor molekulájával interakcióba lépjen (123). Kimutatták, hogy a katepszin D géncsendesítése megakadályozza a hidrogénperoxid indukált sejtelhalást neuronális sejteken (124). Továbbá a katepszin D fontos szerepet kaphat tüdőbetegségek patogenezisében is. Bleomycin kezelés kiterjedt DNS károsodást és apoptózist okozott alveoláris epiteliális sejtekben, mely fokozott katepszin D expresszióval járt (125). Szilikózisban a katepszin D farmakológiai gátlószere, a Pepstatin A csökkentette a szilicium-dioxid okozta toxicitást makrofágokban (102,126). Míg az előzőekben azt láttuk, hogy a katepszinek egy akut hatásra a citotoxikus jel közvetítői lehetnek, arra is találni példát, hogy az autofágia és a lizoszómális enzimek (pl.: katepszin B és L) elengedhetetlenek a neuronok hosszútávú túléléséhez (122,127). Tehát a katepszinek kétélű fegyverként egyes sejtek elhalását vagy túlélését is elősegíthetik. Az, hogy a túlélésben vagy az elhalásban játszanak-e szerepet úgy tűnik, hogy egyrészt szövet specifikus, másrészt pedig függhet a katepszinek sejten belüli lokalizációjától (vagyis, hogy kijutnak-e a lizoszómából vagy nem).

29


II. 5. 4. Vannak a katepszineknek specifikus szubsztrátjai? Kérdéses, hogy a katepszinek – a kaszpázok analógiájára - milyen specifikus szubsztrátok révén érvényesítik hatásukat, mivel a kép nem annyira egyértelmű, mint a kaszpázok esetén. A specificitás jogosan megkérdőjelezhető, mivel a katepszinek rengeteg proteint hasítanak savas közegben. Azonban két ok miatt mégis elképzelhető, hogy a katepszinek a lizoszómából kijutva meglehetősen szelektívvé válnak. Egyrészt a citoszólba kikerülve csökken, illetve pl.: katepszin D esetén meg is szűnik aktivitásuk jelentős része, másrészt a savas közegben lévő szubsztrátjaik nagy része neutrális pH-n ellenálló lehet katepszinekkel szemben (128). Leírták, hogy bizonyos sejttípusokban a katepszin B a kaszpázok helyett, mint effektor proteáz működik (98), bár nem világos, hogy milyen fehérjék hasításán keresztül hajtja végre ezt a funkciót. Egyik feltételezett szubsztrát a BID, melyet a katepszinek egy meghatározott aminosavnál hasítnak. Azonban a BID egyéb enzimeknek is a szubsztrátja. A katepszinek (különösen a katepszin B), ha egyszer kijutottak, képesek az apoptózis klasszikus, mitokondriális útját is aktiválni a proapoptotikus BID hasításán keresztül. (129). Ugyanakkor leírták azt is, hogy BID deficiens sejtekben is végbe megy a katepszinek által okozott apoptózis. A katepszin D által vezérelt apoptózis magába foglalja a BAX aktivációt, AIF és citokróm c kiszabadulását a mitokondriumból, azonban ez a folyamat független a BID hasításától Turk és munkatársai nemrégiben a BCL-2, BCL-XL és MCL-1 antiapoptotikus fehérjéket azonosították katepszin szubszrátként, melyek degradációja a katepszinek által elősegítette az apoptózist (128). Leírták azt is, hogy a katepszin B a sejtmagba transzlokálódik és ily módon indukál apoptózist (130). Ez idáig nem sikerült kaszpáz-független elhalásban olyan effektor célmolekulát találni, amit kizárólagosan a katepszinek hasítanának, tehát a katepszinek részvétele a kaszpáz-független elhalásban egyelőre bizonytalan.

II. 6. A mitokondrium szerepe a kaszpáz-független sejthalálban Hasonlóan

az

apoptózis

kaszpáz-függő

jelútjához,

a

mitokondrium

membránpermeabilitása az apoptózis kaszpáz-független útjain is szabályozódhat a BCL-2 fehérje család által. A mitokondrium előtti jelutak többsége, néhány kivételtől eltekintve kaszpáz-független. A kalpainok, granzimek és katepszinek mind a

30


mitokondrium depolarizációjának előidézői lehetnek. Ezek a proteázok aktiválhatják a proapoptotikus BCL-2 család tagjait. Más, a mitokondrium depolarizációjáért felelősnek vélt folyamatok reaktív oxigéngyököt (ROS), intracitoplazmatikus szabad Ca++ -ot, nitrogén-monoxidot termelhetnek, melyek másodlagos jelközvetítőként gyakran jelennek meg a szabályozott sejtelhalás folyamán (131). A Ca++ szint emelkedése például konformáció változást idéz elő a mitokondriális permeabiltási pórus képzésében fontos ANT fehérjében. E mitokondriális peremeabilitási pórus további komponensei a VDAC és a Cyclophylin D. Egyes eredmények szerint ROS túltermelődéssel és Ca++ szint emelkedéssel indukált nekrózist a Cyclophilin D génjének kiütése megakadályozta. E molekula a BCL-2 család által vezérelt klasszikus apoptotikus mitokondriális membrán permeabilitást nem befolyásolja (132). A

mitokondrium

membrán

permeabilizációja

proapoptotikus

proteinek

kiszabadulását eredményezi a citoszólba, melyek felelősek lehetnek a mitokondrium utáni kaszpáz-független haláljel közvetítéséért. Ilyen fehérje az apoptózis indukáló faktor (AIF), az endonukleáz G vagy a szerin proteáz Omi/Htra2 (133).

II. 7. Kaszpáz- és mitokondriális fehérjéktől független jelutak a sejtelhalásban Létezik egy receptorcsalád, amelynek tagjai akkor közvetítenek haláljelet a sejtek számára, ha nem kötődik hozzájuk ligand. Ezek az úgynevezett kényszer vagy dependens receptorok. Ilyen például az inzulinszerű növekedési faktor I receptora (IGFIR), amely kaszpáz aktivitástól és a mitokondrium szerepétől független elhalási programot indukál, ugyanakkor érdekes módon a prokaszpáz-9 kötődését kívánja meg az IGF-IR intracelluláris részéhez. Egy másik ilyen kényszer-receptor a DCC (deleted in colon cancer), amely bár mitokodrium-független, de kaszpáz-függő apoptotikus jelutat indukál, ha nem kötődik hozzá a netrin nevű ligandja (134). A TNF-α által indukált szabályozott nekrózis jelensége jóval korábban volt ismert, mint az általa kiváltott apoptózisé, bár a lezajlásában szerepet játszó molekuláris összetevőkről csak nagyon keveset sikerült megismerni. A közelmúltban találtak rá egy fehérjére, a RIP-1-re (receptor interacting protein-1), amely death domain-jén keresztül kapcsolódik a TNF-R család több tagjához ligand stimulus hatására, és kináz

31


aktivitásán keresztül nekrotikus folyamatot indít el (135). E kináz szerepét írták le DNS alkilálás, illetve PARP aktiváció útján indukált nekrózisban is, ahol a RIP-1 expresszió kiütése a sejthalál megszűnését okozta (136,137). Az, hogy a RIP-1 pontosan hogyan is okoz nekrózist még nem ismert részleteiben.

32


III. CÉLKITŰZÉSEK Munkánk során az U937 humán premonocitás leukémia sejtvonalon létrejövő alternatív, kaszpázoktól független sejthalál jelutakat vizsgáltuk staurosporint, mint a mitokondriális sejtelhalás modellvegyületét alkalmazva. Kérdéseink a következők voltak:

1. STS kezelés hatására létrejön-e sejtelhalás abban az esetben, ha a kaszpáz aktivitást gátoljuk?

2. A kaszpáz gátlás során létrejövő alternatív sejtelhalás típusokat milyen egyedi morfológiai és biokémiai megkülönböztető jegyekkel jellemezhetünk? Erre már meglévő módszereket alkalmazunk és új áramlási citometriás eljárásokat dolgozunk ki.

3. Specifikus cisztein proteáz, illetve egyéb célmolekulákra irányuló farmakológiai gátlással a kaszpáz-gátolt sejtelhalás (előző pontban vizsgált) morfológiai és biokémiai paraméterei hogyan változtathatóak? E szabályozó molekulák gátlásával a sejtelhalás megszüntethető-e?

33


IV. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK IV. 1. Vegyszerek z-Val-Ala-Asp(OMe)-fluoromethylketone (z-VAD.fmk) és Z-Phe-Ala-FMK (zFA.fmk) E64c, E64d, pepstatin A szereket az Enzyme System Product-tól (MP Biomedicals, Solon, OH USA) és Bachem-től (Bubendorf, Switzerland) rendeltük. zDEVD.amc, z-RR.amc, z-FR.amc a Bachem-től. Staurosporin és geldanamycin a Sigma-tól (St Louis, MO, USA) lettek be szerezve.

IV. 2. Sejttenyésztés U937 premonocitás sejt vonalat RPMI 1640 médiumban (Sigma) tenyésztettük, amely 10 % hőinaktivált FBS-sel (Sigma), 2 mM L-glutaminnal (Sigma) és 100 µg/ml penicillin-streptomycinnel (Sigma) volt kiegészítve. A sejt kultúrát 5% CO2 koncentrációjú légkörben 37 oC -on tartottuk fenn. A kísérletek elkezdése előtt a sejteken ellenőriztük néhány, a sejtvonalra jellemző humán CD antigén expresszióját: CD45 (+); CD33 (+); CD13 (+); CD34 (-); CD14 (-); CD4 (-). A fluoreszcens festékkel direkt jelzett ellenanyagokat a Becton Dickinson-tól (Franklin Lakes, NJ, USA) rendeltük. A kezeléshez a sejteket 48 lyukú szuszpenziós szövettenyésztő tálcára (Greiner) pipettáztuk 0,5 ml végtérfogatban. A sejtek végkoncentrációja 3 x 105 sejt/ml volt a kontroll mintákban, és 5 x 105 sejt/ml a geldanamycin (GA; 1 µM) –el 12 órát előkezelt mintákban, mivel a GA gátolta a sejtek proliferációját. A plate overnight inkubációja (37 oC, 5% CO2) után kezeltük a sejteket z-FA.fmk-val (z-FA; 1 µM), CA074OMe-vel (CA-074), E64c-vel, E64d-vel és/vagy z-VAD(OMe).fmk-val (zVAD.fmk; 50 µM) 30 perccel staurosporin (STS; 1 µM) kezelés előtt. Pepstatin-A-t 4 órával STS kezelés előtt adtuk a mintához. A kezelt sejteket kísérlettől függően különböző ideig inkubáltuk.

34


IV. 3. A sejthalállal összefüggő funkcionális változások mérése áramlásos citométerrel A mintákat FACScalibur vagy FACScan áramlásos citométeren mértük (Becton Dickinson). A mért adatok kiértékelését WINLIST programmal (VERITY Software House, Topsham, USA) végeztük. A fluoreszcens csatornákon a következő standard fényszűrőket alkalmaztunk: FL1: 530/30 nm; FL2: 585/42 nm; FL3: >650nm. Az analízist a fluoreszcens szignál amplitúdójából (height, H) végeztük logaritmikus skálán. Az FL2 csatornára beállítottuk az ún. doublet discrimination panel-t, mellyel nemcsak az amplitúdót, hanem a fluoreszcens jel területét (FL2A (area)) és félérték szélességét (FL2W (width)) is mérhetjük. E paraméterek segítségével az összetapadt sejtek megkülönböztethetőek a többszörös DNS tartalmú sejtektől. A következő alfejezetek mindegyike egy-egy áramlási citometriás mérési módszer leírásával foglalkozik, mely tartalmazza a mintapreparálás, a mérés, illetve a kiértékelés leírását is. E lépések összekapcsolva alkotnak egy-egy áramlásos citometriás profilt.

IV. 3. 1. [PI felvétel] profil: A plazma membrán sérülés detektálása Ellentétben az élő sejtekkel, a sérült membránnal rendelkező, nekrotikus sejtek felveszik a membrán impermeábilis PI festéket, mely a DNS-hez kötődve megnövekedett fluoreszcencia intenzitást mutat. Az inkubációs idő lejárta után a sejtekre 0,5 mL,10 µg/mL propidium jodid-ot (Sigma) és 5 mM glükóz-t tartalmazó PBS-t pipettáztunk és 37 oC-on 15 percet állni hagytuk. A nekrotikus sejtek általában veszítenek fényszórás intenzitás értékükből, ezért az [FSC, SSC] kétparaméteres diagrammon a törmelékkel összekeveredve jelenhetnek meg. Ennek kiküszöbölésére az [FSC, FL3H] diagrammon elválasztottuk (kikapuztuk) a nekrotikus sejteket a törmeléktől, mivel ezen a diagrammon a nekrotikus sejtek magas DNS tartalmuk miatt elkülöníthetőek. A kikapuzott sejteket FL2H logaritmikus skálájú hisztogramon analizáltuk (9. ábra). Az eredmények fejezetben lévő diagramokon feltüntetett értékek a megjelölt régiókban szereplő sejtek százalékát mutatják. A PI festett mintákat vagy DiOC6(3) –al vagy annexin V-FITC-el is festettük.

35


nekrotikus sejtek

élő sejtek

FL3

sejtszám

törmelék

FSC

nekrotikus sejtek

FL2H (PI fluor int.)

9. ábra: [PI felvétel] profil: A plazmamembrán sérülés detektálása

IV. 3. 2. [Annexin V-FITC, PI] profil: A plazma membránt alkotó foszfatidil szerin eloszlás megváltozásának mérése Az apoptózis egyik korai markere a citoplazmamembrán alkotó foszfatidil-szerin molekulák a membrán belső oldaláról a külső oldalra történő áthelyeződése. Ezt tudjuk detektálni az [Annexin-V-FITC, PI felvétel] profil segítségével, ahol a FITC-cel konjugált annexin-V molekulák kötődnek a foszfatidil-szerinhez. Mivel a permeábilis membránnal rendelkező nekrotikus sejtekbe bejut az annexin-V és ott a belső oldalon is képes kötni a foszfatidil-szerin molekulákhoz, ezért a nekrotikus sejteket valamilyen módon el kell különítenünk. Erre szolgál a PI festés, mely csak a nekrotikus sejteket festi meg. A minta előkészítést a gyártó cég (Alexis Biochemicals, Lausen, Switzerland) leírása alapján végeztük. Az inkubációs idő lejárta után a sejtekre 0,5 ml ,10 µg/ml propidium jodid-ot (Sigma) és 5 mM glükóz-t

FL2H (PI fluor. Int.)

élő sejtek

tartalmazó PBS-t pipettáztunk, majd 37 oC-on nekrózis

15 percet állni hagytuk. Centrifugálás után (300 g/ 2 perc) a sejteket 400 µl binding buffer

apoptózis

(10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2)-ben vettük fel. Ebből kivettünk 80 µl-t

FL1H (annexin-V fluor. Int.)

10. ábra: [Annexin V-FITC, PI] profil

és összekevertük 20 µl annexin V-FITC oldattal (5 µl annexinV-FITC feloldva 15 µl

36


binding buffer-ben). A mintákat 10 percig sötétben inkubáltuk, majd további 400 µl binding buffer-t (1 µg/ml PI-dal) adtunk hozzájuk és rögtön mértük. A sejttörmelék kikapuzáshoz az [FSC, FL3H] diagramot használtuk, a kapuzott sejteket az [FL1H, FL2H] logaritmikus skálájú kétparaméteres diagramon analizáltuk (10. ábra). A sejtek auto-fluoreszcenciája a diagram első dekádjában található a logaritmikus skálán. Az FL-2 csatornán mérhető FITC fluoreszcenciát kompenzáltuk.

V. 3. 3. [DiOC6(3)] profil: A mitokondrium transzmembrán potenciál változásának mérése A mitokondrium belső tere és a citoplazma között jelentős elektronpotenciál különbség mérhető. A festék a negatív töltésű oldalon, vagyis a mitokondriumban halmozódik fel nagyobb mértékben, és ennek hatására megnövekedik fluoreszcenciája. A mitokondrium depolarizációja során e potenciál különbség, és így a DiOC6(3) fluoreszcenciája is csökken. mitokondrium depolarizáció

A mintákat Darzynkiewicz és Bender (138) szerint készítettük elő, néhány módosítással. Az inkubációs idő lejárta után a sejtekre 0,5 ml, 10

sejtszám

µg/ml PI-t (Sigma), 10 nM DiOC6(3)-at (Sigma) és 5 mM glükóz-t tartalmazó PBS-t pipettáztunk és 37 o

C-on 15 percet állni hagytuk, majd mértük. A

sejttörmeléket

az

[FSC,

FL3H]

diagramon

kikapuztuk, majd az FL1H logaritmikus skálájú FL1H (DiOC6(3) fluor. Int.)

11. ábra: [DiOC6(3)] profil

hisztogramon analizáltuk a mintát (11. ábra). A későbbi

ábrákon

kikapuzott

populáció

intenzitását jelzik.

37

szereplő

értékek

átlag

az

egész

fluoreszcencia


IV. 3. 4. [AO red] profil: a sejtben lévő savas sejtalkotók mennyiségi változásának mérése Acridine orange (AO) egy metakróm festék, mely alacsony koncentrációban zöld fluoreszcenciát mutat (pl.: ha duplaszálú DNS-hez köt), és vörös fluoreszcenciát (FL3H) magasabb koncentrációkban. (pl.: ha összegyűlik az élő sejtek savas organellumaiban). A mintákat Traganos és Darzynkiewicz szerint preparáltuk (139), néhány módosítással. Az inkubációs idő lejárta után a sejtekre 0,5 mL, 5 ug/ml AO-ot (Sigma) és 5 mM glükóz-t tartalmazó PBS-t pipettáztunk majd 37 oC-on 15 percet állni hagytuk. A sejtek centrifugálása után (300 g/ 2 perc) a mintát 1 ml 5 mM glükózt tartalmazó PBS-ben vettük fel és rögtön mértük. A sejttörmeléket az [FL1H, FL3H] diagramon kapuztuk ki, majd a maradék populációt az FL3H logaritmikus skálájú diagramon analizáltuk. Az ábrákon szereplő értékek az egész kikapuzott populáció átlag fluoreszcencia intenzitását jelzik.

IV. 3. 5. [Sub-G1] profil: Az oligonukleoszómális DNS fragmentáció mérése Az

Apoptotikus (Sub-G1) sejtek

apoptózis

során

a

DNS

nukleoszómális fragmentációja figyelhető meg. sejtszám

G1 G2

E fragmentált DNS egy extrahálási procedura segítségvel

kivonható

az

etanolban

fixált

sejtekből. Ennek következtében az apoptotikus sejtek DNS tartalma alacsonyabb lesz, mint az élő sejteké. E DNS tartalom csökkenést egy DNS FL2H (EtBr fluor. Int.)

12. ábra: [Sub-G1] profil Az apoptotikus (Sub-G1) és normál, a sejtciklus különböző fázisaiban (G1, G2) lévő sejtek

kötő,

fluoreszcens

festék

(EtBr)

hozzáadásával tudjuk mérni. A mintákat Gong és munkatársai (140) szerint készítettük elő. A sejteket centrifugáltuk (300 g/ 2 perc), majd a pelletet 1 ml 70 %-os etanol (-20 oC)- ban vettük fel. A mintát 30

percig szobahőmérsékleten, majd legalább 1 órát –20 oC-on tartottuk. Ez a sejtek megfelelő mértékű fixációját segítette elő. A sejteket újra centrifugáltuk (300 g/ 3 perc).

38


Az oligonukleoszómális DNS fragmenteket 750 µl/minta extrakciós puffer (200mM Na2HPO4/citromsav (pH=7,8) és frissen adott 10 µg/ml RNAse A (Sigma)) hozzáadásával vontuk ki. 15 perc inkubáció után a mintákhoz EtBr (ethidium bromide, 5 µg/ml végkoncentrációban)-ot adtunk és 15 perc múlva mértük. A sejttörmeléket az [FSC, FL2H] diagramon kikapuztuk, majd a sejteket az FL2H logaritmikus skálájú diagrammon analizáltuk (12. ábra). A későbbi diagramokon feltüntetett értékek a megjelölt Sub-G1 régióban szereplő sejtek százalékát mutatják.

IV. 3. 6. [SSC, DNS tartalom] profil: fényszórás változás és DNS fragmentáció mérése A minta előkészítés fixálási és festési lépései megegyeznek a [Sub-G1] profiléval. A kikapuzott populációt az [SSC, FL2H] diagrammon analizáltuk. Az SSCnormál, DNScsökkent populáció az apoptotikus, az SSCcsökkent, DNSnormál populáció a nekrotikus, míg az SSCcsökkent, DNScsökkent populáció kevert, atípusos sejthalál fenotípussal rendelkező sejteket foglalja magába (13. ábra). E populációkban szereplő sejtek százalékát mutatják a populációk mellett feltüntetett értékek.

FL2H (DNS tartalom)

nekrotikus sejtek

élő sejtek apoptotikus sejtek

SSC intenzitás

13. ábra: [SSC, DNS tartalom] profil

IV. 3. 7. Sejtciklus analízis A minta előkészítés fixálási és festési lépései megegyeznek a [Sub-G1] profiléval. A sejttörmeléket az (FSC, FL2H) diagrammon, míg az összetapadt sejteket az (FL2A, FL2W) diagrammon kapuztuk ki. A maradék sejteket az FL2A lineáris

39


skálájú hisztogrammon analizáltuk, a marker a G1-S fázis határa és az S fázis első negyede közé volt beállítva. A további grafikonokon szereplő értékek az ebbe a régióba eső sejtek százalékát mutatják.

IV. 4. A hasított PARP fehérje western blot analízise 0,5 x 106 sejtet a 3.2-es fejezetben leírt módon kezeltünk. Az inkubációs idő lejárta után a sejteket mostuk PBS-ben és centrifugáltuk (100 g , 4 perc). A pelletet 50 µl 2x Laemmli pufferben (62,5 mM Tris-HCl, pH=6,8, 2 % SDS, 25 % glicerin, 0,01 % brómfenolkék) vettük fel, melyhez frissen készített 5% merkaptoetanolt adtunk. A mintákat 3 percig forraltuk. Az elektroforézist 10 % poliakrilamid gélen végeztük. Nyúl poliklonális PARP ellenanyag (#9542, Cell Signaling Technology)-ot használtunk a teljes hosszúságú (116 kDa) és a hasított (89 kDa) PARP detektálására is. Másodlagos ellenanyagként kecskében termeltetett HRP-konjugált antinyúl IgG-t alkalmaztunk (#7074, Cell Signaling Technology). A csíkok láthatóvá tétele ECL western blotting substrate (#32106, PIERCE)-tal történt. A lumineszcenciát Kodak Image Station 4000MM készülékkel detektáltuk és a csíkok denzitását Kodak Molecular Imaging Software 4.0.3 program segítségével határoztuk meg. Az így számolt értékek a hasított PARP-nak az összes PARP mennyiséghez (teljes hosszúságú és hasított PARP) viszonyított százalékos arányát adják.

IV. 5. Proteáz aktivitásmérés A kezelt sejteket (0,5 x 106 sejt/ml) különböző ideig inkubáltuk, majd kétszer mostuk PBS-ben (300g / 2 perc). A mintákat méréstől függően 100 µl kaszpáz pufferben (50mM HEPES (pH:7,4), 100mM NaCl, 0,1 % (w/v) CHAPS, 10% (w/v) szaharóz, +10mM DTT (frissen adva)) vagy 100 µl katepszin pufferben (Na2HPO4/NaH2PO4 pH=6, 1mM EDTA, 1mM DTT (frissen adva)) vettük fel. A mintákat 96 lyukú tálcára pipettáztuk, majd Triton X-100 (0,2 %)- at adtunk a mintához és a teljes sejt lízis eléréséhez a sejteket többször szuszpendáltuk. A mintákhoz kaszpáz szubsztrátot (z-DEVD.amc (20µM)) vagy katepszin szubsztrátot (z-FR.amc (50µM) vagy z-RR.amc (50µM)) adtunk. A szubsztrát hasítása során felszabaduló amc fluoreszcenciáját detektáltuk 15 percen át Fluoroskan Ascent tálca leolvasó segítségével

40


(Thermo Fisher Scientific, Waltman MA, USA). A proteáz aktivitást az AMC fluoreszcencia és idő függvényében ábrázolt egyenes meredekségéből számoltuk ki. Az aktivitás a kontroll (csak vivő anyaggal kezelt) mintához viszonyított százalékban van feltüntetve.

IV. 6. DNS gél elektroforézis 106 sejtet felvettünk 100 ml pufferben (100mM EDTA, 10mM TRIS (pH=8) 0,5 % SDS (és frissen hozzáadott 0,1 mg/ml proteináz K) és legalább 1 órát 50oC-on inkubáltuk. Ekkor 0,2 mg/ml RNázt adtunk a sejtekhez és egy éjszakán át 30 oC-on inkubáltuk. A mintákat 1%-os agaróz gélen futattuk és utólagosan etidium bromid-dal festettük (15 percig), majd a DNS létrát UV fényben detektáltuk Eagle Eye II (Stratagene) készülék segítségével.

IV. 7. Fénymikroszkópos vizsgálatok 1 x 105 sejtből citospinnel (200 g / 5 perc) készített keneteket metanolban (20oC) fixáltuk. A mintákat hematoxilin (10 perc) és eozin (20 másodperc) festést követően felszálló etil alkohol sorban, acetonban és xilolban dehidráltuk. A sejtekben bekövetkező

morfológiai

változásokat

fénymikroszkóppal

vizsgáltuk.

Tárgylemezenként 200 sejtet számoltunk le és meghatároztuk az apoptotikus és nekrotikus sejtek számát. A sejteket Daugas és munkatársai szerint (141) kategorizáltuk: I-es típusú apoptotikus sejt: a sejt citoplazmája mérsékelten kondenzált II-es típusú apoptotikus sejt: a sejtmag erőteljes kondenzációja (pycnosis) és nukleáris apoptotikus testek formálódása. (karyorrhexis). Nekrotikusnak írtuk le az olyan sejteket, melyeket a citoplazma duzzadása és elhalványodása jellemzett. A nagyon halvány, éles határvonal nélküli sejteket, melyeket „ghost”-ként is említenek az irodalomban, késői nekrotikus sejtként karakterizáltuk.

IV. 8. Elektronmikroszkópos vizsgálatok A sejtekből (0,5 x 106) citospinnel (200 g / 5 perc) keneteket készítettünk (előzetesen parlodionnal kezelt tárgylemezekre). A mintákat glutáraldehidben (2,5 %, 30 perc, 4 oC) fixáltuk, majd egy éjszakán át 4 oC-on PBS-ben tartottuk. A következő napon a lemezeket PBS-ben oldott OsO4 -ban inkubáltuk 90 percig, majd PBS-ben

41


mostuk 10 percig. A mintákat felszálló alkohol sorban dehidráltuk (50-75-96-100 %), majd EPON-812 (1:1 absz. etanolban) gyantába ágyaztuk és egy napig 60 oC-on inkubáltuk. A beágyazott mintákat a tárgylemeztől folyékony nitrogén alatt választottuk el. A minták metszése LKB-Ultrotom-3A-val történt, majd a szeleteket rácsra helyeztük. A megfelelő kontraszt elérése érdekében a mintákat 2% uranil-acetáttal (10 perc) és ólom citráttal kezeltük (2 perc), végül transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgáltuk (Philips, CM-10).

IV. 9. Statisztika A kísérletek mindegyikét legalább kétszer megismételtük. Az eredmények szignifikanciáját student féle t próbával határoztuk meg (two tailed, párosított) Microsoft Excel program segítségével. A diagrammokon feltüntetett szignifikancia jelzések a következő értékeket jelentik: P<0.05 (*); P<0.01 (**); P<0.001 (***).

42


V. EREDMÉNYEK V. 1. Kaszpáz-gátolt sejthalál STS (staurosporin) kezelés hatására bekövetkező sejtelhalás időkinetikáját vizsgáltuk U937 sejtvonalon. STS kis koncentrációban a protein kináz C gátlószere, nagyobb koncentráció tartományokban (100-1000 nM) viszont az apoptózis belső útjának vizsgálatában széles körűen használt modell vegyület. Első kísérleteinkben a sejtelhalás megjelenését és annak módját áramlási citometriával vizsgáltuk. A nekrózist élő, nem fixált sejteken detektáltuk egy membrán impermeábilis, DNS kötő fluoreszcens festék a propidium jodid (PI) hozzáadásával. A nekrotikus, sérült membránnal rendelkező sejtek felvették a festéket, mely a DNS-hez való kötés pillanatától kezdve fluoreszcencia intenzitás növekedést (PI + sejtek) mutatott. Az apoptózis mérése során az apoptózisra jellemző nukleoszómális DNS-fragmentációt (Sub-G1 sejtek) vizsgáltuk etanolban fixált mintákon szintén áramlási citometriával. Továbbá párhuzamosan kaszpáz aktivitást mértünk sejtlizátumon (lásd részletesebben: ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK). STS (1 µM) kezelés már 3,5 óránál jelentős kaszpáz aktivitás növekedést eredményezett, melyet az apoptotikus (Sub-G1) sejtek számának növekedése kísért. A kezelés után 8 órával, összhangban a kaszpáz aktivitás emelkedéssel, a sejtek jelentős része már apoptotizált, de a növekedés – ugyan 8 órától már lassabb ütemben - egészen 14,5 óráig folytatódott. Ellenben a nekrózis csak órákkal később és csupán minimálisan emelkedett. Ezek az ún. másodlagosan nekrotikus sejtek valószínűleg a késői apoptotikus sejtekből jöttek létre (14. A. ábra). Más volt a helyzet abban az esetben, amikor a STS mellett egy általános kaszpáz-gátló szerrel a z-VAD.fmk-val is kezeltünk (14. B. ábra). A kaszpáz aktivitás teljes gátlása mellett az apoptotikus (Sub-G1) és érdekes módon a nekrotikus (PI +) sejtek száma is fokozatosan növekedni kezdett a kezelés után 5,5 órával. A kétfajta sejthalálforma növekedése szimultán következett be, jelezvén, hogy itt valószínűleg nem a fentebb említett posztapoptotikus másodlagos nekrózis megjelenéséről van szó. .

43


A

Sejthalál (%)

80 60

sub-G1

DEVDáz aktivitás

60

STS

40

80 40 20

20 0 0

2

4

6

0 8 10 12 14 16

100

100 PI +

80

Sejthalál (%)

PI +

Relativ DEVD-áz aktivitás

100

100

60 40

80 60 40 20

20 0 0

2

4

6

0 8 10 12 14 16

Kezelés után eltelt idő (óra)

D

100

Sejthalál áramlási Sejthalál morfológia citometriával mérve (%) alapján (%)

C STS

DEVDáz aktivitás

STS+z-VAD.fmk


Kontroll

sub-G1

Relativ DEVD-áz aktivitás

B

STS+z-VAD

4ó

E

8ó

80

■ apoptózis □ nekrózis

60 40 20 0

co n tr ol

ST S

ST S+z - V A D

10 0 80

■ sub-G1 □ PI +

60 40 20 0

co nt r o l

Ko

STS

ST S

ST S+z -V AD

−

−

z-VAD

STS+

14. ábra: A staurosporin (STS) proteinkináz gátlószer késleltetve indukál apoptózist és nekrózist a kaszpázgátlószerrel kezelt sejtekben U937 sejteket z-VAD.fmk (50 µM) jelenlétében vagy hiányában kezeltünk STS-sel (1µM) 8 óráig. A kezeletlen sejtekben, oldószer kontrollként DMSO-t használtunk. (AB) A sejthalál (Sub-G1: fragmentált DNS-sel rendelkező, apoptotikus sejtek; PI +: sérült citoplazma membránnal bíró nekrotikus sejtek) és effektor kaszpáz (DEVDáz) aktivitás (z-DEVD.amc fluoreszcens szubsztráttal detektálva) időkinetikája (A) STS vagy (B) STS+z-VAD.fmk kezelt mintákon.(n=2). (C) A sejteket kezeltük, majd hematoxilin-eozin-nal festettük (lásd: Anyagok és Módszerek / fénymikroszkópos vizsgálat). A nyilak az apoptotikus (fehér) vagy a nekrotikus (fekete) sejteket jelölik. (D) Az apoptotikus és nekrotikus sejtek meghatározása morfológiai kritériumok alapján (n=2). (E) Apoptotikus és nekrotikus sejtek arányának mérése [Sub-G1] és [PI felvétel] áramlási citometriás profilok alapján, 8 órás kísérletben. A hematoxilin-eozin festett fénymikroszkópos metszetek analízise alapján a STS kezelés számos II-es típusú apoptotikus morfológiával rendelkező sejt megjelenését eredményezte, melyek jellemzői a magfragmentáció (karyorrhexis) és kondenzáció. A II-es típusú apoptotikus morfológiával bíró sejtek aránya jól korrelált az áramlási citométerrel mért Sub-G1 sejtek számával. A z-VAD.fmk kezelés megakadályozta a

44


STS kezelés által létrejött karyorrhexis-t 4 óránál, de a sejt és magkondenzáció (I típusú apoptotikus morfológia) megjelenését csak részben mérsékelte. A 8 órás STS és z-VAD.fmk kezelt mintákban már megjelent a karyorrhexis is, melyre főleg egy sajátos, a mag perifériáján jelentkező kondenzáció volt jellemző. E mellett nekrotikus morfológiájú sejtek is megjelentek (14. C. ábra). A Sub-G1 sejtek száma a magkondenzációt mutató sejtekkel illetve a PI + sejtek száma a nekrotikus morfológiájú sejtekkel szintén jól korrelált (14. D., E. ábra). Összefoglalva az eddigieket a STS kezelés hatására az effektor kaszpáz aktivitás teljes gátlása mellett is létrejön sejtelhalás, mely a kaszpáz-függő apoptózishoz képest később jelentkezik és apoptotikus és nekrotikus jellemzőket is mutat. Az

elektronmikroszkópos

heterokromatinmentes

maggal

képeken és

a

határozott

nekrotikus struktúra

sejt nélküli

nem-kondenzált, citoplazmával

jellemezhető. Ezekben a sejtekben a sejtmag kétrétegű membránja kettéválik és az intermembán tér duzzadásával a citoplazma részben vagy egészben leválik a sejtmagról. Ezzel ellentétben a STS+z-VAD.fmk kezelt sejtek apoptózisa hasonló morfológiát mutat a csupán STS kezelt sejtek apoptózisához, vagyis megfigyelhető a mag heterokromatinizációja és erőteljes kondenzációja (15. ábra).

15. ábra: STS által kiváltott apoptotikus vagy nekrotikus morfológia külön, egyedileg jelentkezik kaszpáz-gátolt sejtekben I. Az U937 sejteket z-VAD.fmk (50µM) jelenlétében vagy hiányában kezeltünk STS-al (1µM) 8 órán keresztül. DMSO-t használtunk oldószer kontrollként. A kezelés után a sejteket ultrastruktúrális vizsgálatokra készítettük elő. A fekete nyilak a magmembrán kettéválását jelzik. A: apoptózis, N: nekrózis

45


Az elektronmikroszkópos és fénymikroszkópos vizsgálatok már azt jelzik, hogy a STS+z-VAD.fmk kezelés egyrészt apoptózist, másrészt nekrózist eredményez különkülön sejteken. Megfigyeltük, hogy a PI + sejtek nem csak a jól ismert ún. FSC (forward scatter - a sejtek előre fényszórása, mely a méretükkel arányos) intenzitás csökkenést mutatják, hanem jelentősen veszítenek az SSC (side scatter- a sejtek oldal fény szórása, mely a sejt partikuláltságával arányos) intenzitásukból is a STS és z-VAD.fmk kezelt mintákban. E tulajdonságuk érdekes módon még az etanolos fixálás után is megmaradt. Ugyanis azt tapasztaltuk, hogy az ily módon etanolban fixált STS és z-VAD.fmk kezelt mintákon valóban megjelent az SSC csökkent sejtpopuláció, mely azonban a normál, nem apoptotizáló sejtekkel megegyező DNS tartalommal rendelkezett, tehát ugyanolyan magas EtBr fluoreszcencia intenzitást produkált (16. A. ábra). Ez a fixált mintán is mérhető SSC csökkent populáció jó korrelációt mutatott a nem fixált PI + nekrotikus populációval (16. B. ábra). Az apoptotikus (sub-G1) sejtek ezzel ellentétben megőrizték normál SSC intenzitásukat, viszont alacsonyabb EtBr fluoreszcencia intenzitást mutattak mind a STS, mind pedig a STS + z-VAD.fmk kezelt mintákban (16. A. ábra). Ez az apoptotikus sejtekben mérhető EtBr fluoreszcencia csökkenés az előkészítési procedurának köszönhető. Az etanolban fixált sejtekből egy alkalikus puffer segítségével az apoptózis során fragmentálódott DNS darabokat kivontuk, melynek következtében az apoptotikus sejtekben kevesebb DNS tartalom maradt, mint a normál sejtekben. Tehát a DNS-hez kötődő EtBr fluoreszcencia intenzitása is csökkent. Ha a sejteket hosszabb időre kezeltük STS-al az etanol fixált mintán detektált Sub-G1 sejtek mellett a nem fixált mintán már PI + sejtek is megjelentek, jelezvén a posztapoptotikus másodlagosan nekrotikus sejtek létrejöttét (16. C. ábra). Elméletileg, ha a nekrózis az apoptózisból alakul ki, akkor a mi módszerünk esetén ez a populáció nem lesz átfedő az elsődlegesen nekrotikus populációval, mivel itt a másodlagos nekrotikus sejtek nemcsak SSC csökkenést szenvednek, hanem nukleoszómális DNS fragmentáción is keresztül mennek. Tehát a másodlagos nekrózis populációja az SSC csökkent, DNS csökkent kvadránsban kap helyet. A 20 órás STS kezelt mintákat vizsgálva azonban kiderült, hogy ugyan valóban növekedett ez a populáció a 8 órás STS kezeléshez képest, de

46


arányaiban elmaradt a fixálatlan mintákban kapott PI+ sejtekétől. Amennyiben H2O2dal indukáltunk nekrózist, a PI + sejtek és SSC csökkent sejtek aránya összevethető volt, de az SSC csökkenés mégsem volt olyan mértékben kifejezett, mint a STS + zVAD.fmk-val kezelt mintákon (16. C. ábra). Ez a két megfigyelés is azt erősíti meg, hogy a nekrotikus sejthalálba torkolló jelutak stimulus függően különbözhetnek egymástól. Ez az általunk megfigyelt áramlási citometriás jelenség lehetővé tette számunkra, hogy egyszerre detektálhassuk és két paraméteres diagramon (dot-plot) megjeleníthessük az elsődlegesen nekrotikus és az apoptotikus sejteket is. Ez a módszer alátámasztotta, hogy a STS-z-VAD.fmk kezelt mintákban jelentkező sejtelhalás két különálló populációra oszlik: elsődlegesen nekrotikusra és apoptotikusra.

47


A

NEM FIXÁLT

PI fluor. int.

N

STS + z-VAD

DNS tart. (EtBr fluor.)

Kontroll

ETANOL FIXÁLT

N 25

1

É+A

É+A

Kontroll 0

N

A

4

36

Sejtszám

Kontroll

STS 8 óra

5

H2O2

STS 20 óra 30

7

52

40

PI fluoreszcencia intenzitás

0 0

20

40

60

80

Etanol fixált SSC csökkent sejtek (%)

DNS tart.

20

2

1

1

35

1

3

13

2

Log. SSC intenzitás

ETANOL FIXÁLT

Nem fixált PI + sejtek (%)

R = 0,9305 60

6

NEM FIXÁLT

2

É N

Log. SSC intenzitás

C 80

25

A

1

Lin. SSC intenzitás

B

STS + z-VAD É

16. ábra: STS által kiváltott apoptotikus vagy nekrotikus morfológia külön, egyedileg jelentkezik kaszpáz-gátolt sejtekben II. Az U937 sejteket z-VAD.fmk (50µM) jelenlétében vagy hiányában kezeltünk STS-al (1µM) 8 órát. Oldószer kontrollként DMSO-t használtunk. A kezelés lejártával a sejteket áramlásos citometriás vizsgálatokra készítettük elő. (A) A PI–val festett NEM FIXÁLT mintákat az FL2-SSC diagrammon (SSC lineáris skálával) jelenítettük meg. Az EtBr-vel festett ETANOL FIXÁLT sejteket az [SSC, DNS tartalom] diagrammon (SSC logaritmikus skálával) jelenítettük meg. A diagrammokon feltüntetett értékek a kapuzott populáció százalékát mutatják A: apoptotikus, N: nekrotikus, É: élő sejtek. (B) A nem fixált mintán mért PI + sejtek és az etanol fixált mintán mért SSC csökkent sejtek száma jól korrelál. A pontok különböző kezeléseket reprezentálnak, melyek részletesebben a 4 C oszlopdiagramon, illetve ábraszövegben vannak feltüntetve. (C) A sejteket STS-sel (1µM) kezeltük 8 vagy 20 órát illetve H2O2 -dal (2,5 mM) 8 órát, majd áramlásos citometriás mérésre készítettük elő. A nem fixált PI festett mintákat [PI felvétel] diagramon jelenítettük meg. Az etanol fixált EtBr festett sejteket az [SSC, DNS tartalom] diagramon jelenítettük meg. A diagramokon feltüntetett értékek a régióval jelzett sejtpopulációnak a százalékos arányát mutatják.

48


V. 2. Katepszinek szerepe a kaszpáz-gátolt sejthalálban Apoptózisban az effektor-kaszpáz aktivitás eredményeként számos molekuláris szintű változás megy végbe a sejtben (lásd: IRODALMI HÁTTÉR). Ezek közül az egyik a nukleoszómális DNS-létra képződés, melyet agaróz gélelektrofórézissel detektáltunk, egy másik pedig a 116 kDa-os PARP enzim két meghatározott méretű (89 és 24 kDa) fragmentumra hasítása, melynek kimutatását western blottal végeztük. A DNS-létra képződés, valamint a hasított PARP fragmentum megjelenése alátámasztotta a STS kezelt sejtelhalás apoptotikus jellegét. A STS + z-VAD.fmk kezelt sejtekben azonban a kimutatható kaszpáz aktivitás teljes gátlása ellenére késleltetve (8 órával a kezelés után) mégis megjelent a DNS-létra és minimális mennyiségű 89 kD-os PARP fragment is (17. A. és B. ábra.) Ez a két adat, továbbá az, hogy a DNS fragtmentáció (sub-G1 sejtek aránya) és a 89 kDa-os PARP fragmentum aránya jól korrelált egymással, különböző koncentrációjú z-VAD.fmk-t alkalmazva, azt mutatja (17. C. ábra), hogy a folyamatban kaszpáz-szerű aktivitással bíró proteázok szerepelhetnek, még akkor is, ha a kaszpáz-3 jellegű (DEVDáz) aktivitás teljesen gátlódott. Ennek a problémának a megoldásaként proteáz aktivitást kerestünk, mely kaszpázoktól függetlenül is létrehozhatta a PARP fragmentációt U937 sejtvonalon. Elsősorban a lizoszómális katepszineket gyanúsítottuk. Azonban a lizoszómális katepszinekről leírták, hogy van affinitásuk a z-VAD.fmk irányában is. Annak kiderítésére, hogy a katepszin aktivitás is teljesen gátlódott-e a z-VAD.fmk kezelés hatására katepszin aktivitást (FR-áz) mértünk növekvő koncentrációjú z-VAD.fmk-val kezelt sejteken. Ellentétben a kaszpáz aktivitás (DEVD-áz) teljes gátlásával, az FR-áz aktivitás közel 40%-a megmaradt 10 µM-nál nagyobb koncentrációjú z-VAD.fmk kezelés esetén is (17. C. ábra). Ez az eredmény egy z-VAD.fmk „rezisztens” katepszin proteáz aktivitását jelezte.

49


A 4 óra

8 óra

Ko −

Ko −

STS STS+ − z-VAD

STS STS+ − z-VAD

Relatív aktivitás (%)

C 130 110 90 70 50 30 10 -10

sub-G1 hasított PARP DEVD-áz FR-áz

-10

0

10

20

30

40

50

60

Z-VAD.fmk koncentráció (µM)

B 4 óra

8 óra

Ko

STS

−

−

STS+

−

z-VAD z-VAD

Ko

STS

−

−

STS+

−

z-VAD z-VAD PARP (116) h-PARP (89)

0

29

0

0

0

46

21

3

h-PARP (%)

6

20

5

5

4

54

17

4

sub-G1

17. ábra:A DNS fragmentáció és a PARP hasítás nem függ össze az extrahálható DEVDáz aktivitással kaszpázgátlószer higitási sor esetében (A, B) Az U937 sejteket z-VAD.fmk (50 µM) jelenlétében vagy hiányában kezeltünk STS-sel (1 µM) 4 és 8 órát. A mintákon (A) DNS agaróz elektroforézist, (B) Western blot analízist és áramlásos citometriás méréseket végeztünk. PARP: teljes hosszúságú PARP (116 kD), h-PARP: hasított PARP fragment (89 kD). A számadatok a h-PARP százalékát (western blot) és a Sub-G1 sejtek százalékát (áramlásos citometria) mutatják. (C) A sejteket STS-sel kezeltük különböző koncentrációjú z-VAD.fmk-val kombinációban 4 órán keresztül. DEVD-áz (kaszpáz) aktivitást z-DEVD.amc fluoreszcens szubsztráttal detektáltuk; FR-áz aktivitást z-FR.amc fluoreszcens szubsztráttal mértünk; a Sub-G1 sejteket áramlási citometriával mértük; PARP fragmentáció vizsgálatára western blot-ot alkalmaztunk. A h-PARP százalékát tüntettük fel a diagramon. Farmakológiai gátlószereket alkalmaztunk annak kiderítésére, hogy a STS indukált kaszpáz-gátolt sejtelhalásban a lizoszómális katepszinek valóban szerepet játszanak-e. Elsőként egy általánosabb katepszin gátló szert, a z-FA.fmk-t alkalmaztuk, mely a B; L illetve kisebb affinitással a H katepszinnek is gátlószere. Áramlásos citometriás nekrózis és apoptózis méréshez 4 különböző sejthalál mérési profilt alkalmaztunk, mellyel 4 eltérő paraméter (PI felvétel, SSC csökkenés,

50


DNS tartalom csökkenés (Sub-G1) és Annexin pozitivitás) alapján tudtuk kategorizálni a sejthalál típusát. Az [Annexin-V-FITC, PI felvétel] (18. A. ábra), az [SSC, DNS tartalom] (18. B. ábra), a [Sub-G1] és a [PI felvétel] profilokat használtuk A STS+z-VAD.fmk kezelt mintákban a z-FA.fmk előkezelés jelentősen csökkentette az apoptotikus sejtek számát (p=0,0002 [Sub-G1] profilban), ugyanakkor szignifikánsan növelte a nekrotikus populációt (p=0,0051 [PI felvétel] profilban). Ezeket az eredményeket mind a négy áramlásos citometriás mérési profillal tudtuk reprodukálni (18. A, B. és 22. ábra). Kontroll PI fluor. Int.

A

2

STS 2

STS+z-VAD

1

7

2

2

84

17

STS+z-VAD+z-FA 2

40

25 16

B

DNS tartalom

Annexin-V fluoreszcencia intenzitás

1

0 0

12

1

2

80

3

26 43

2

12

SSC intenzitás

C PARP

116kDa

h-PARP

89 kDa

z-VAD STS z-FA

-

+ -

+ +

+ -

+ + -

+ + +

18. ábra: A STS által kiváltott apoptózist a z-FA.fmk katepszin inhibitor gátolja kaszpáz-gátolt sejtekben (A-C) U937 sejteket z-VAD.fmk (50µM) jelenlétében vagy hiányában kezeltünk STSsel (1µM) 8 órán keresztül. A minták egy részét előkezeltük (30 perc) z-FA.fmk-val (zFA) (1 µM). (A) A nem fixált mintákat Annexin V-FITC-cel és PI-vel festettük, majd áramlásos citometriával detektáltuk és [Annexin V-FITC, PI] diagrammon jelenítettük meg. (B) A fixált mintákat EtBr-ral festettük és áramlási citométerrel mértük, majd [SSC, DNS tartalom] diagrammon jelenítettük meg. A feltüntetett értékek a kapuzott populációk százalékos arányát mutatják. A kezeletlen sejtekben, oldószer kontrollként DMSO-t használtunk. (C) Western blot analízis. PARP: teljes hosszúságú PARP (116 kDa), h-PARP: hasított PARP fragment (89 kDa).

51


A sejthalál típusok különbözőségét mutatja, hogy a z-FA.fmk nem volt hatásos a csak STS kezelt minták apoptózisának gátlásában, és a H2O2 indukált nekrózis gátlásában sem (22. ábra). A z-FA.fmk által létrehozott többlet nekrózis SSC csökkenést is mutat az [SSC, DNS tartalom] profilban (18. B. ábra), ami azt jelzi, hogy ez a megnövekedett nekrotikus populáció ugyanazon az útvonalon aktiválódik, mint az a populáció, amely a csak STS+z-VAD.fmk kezelésre létrejött. A z-FA.fmk a maradék PARP hasítást is gátolta, míg a STS kezelt sejtekben megjelenő PARP hasításra nem volt hatással (18. C. ábra). A z-FA.fmk az apoptózis morfológiai jeleit is megszüntette, míg a nekrotikus jelleget fokozta a STS+z-VAD.fmk kezelt mintákon (hematoxilin-eozin festés) (24. ábra). Továbbá a katepszin (FR-áz) aktivitás gátlásához és az apoptotikus elhalás (SubG1) gátlásához szükséges z-FA.fmk koncentráció jól korrelált egymással (19. ábra). Az eredmények szerint cisztein katepszin aktivitás szükséges az apoptotikus program

100

FR.áz

RR.áz

100

apoptózis

80

80

60

60

40

40

20

20

0

0

10

-1

10

0

10

1

0

Apoptotikus sejtek (%)

Relatív enzim aktivitás (%)

beindulásához a STS indukált, kaszpáz-gátolt U937 sejteken.

z-FA.fmk koncentráció (µM)

19. ábra: A z-FA.fmk apoptózis- és katepszin-gátló hatása jól korrelál egymással U937 sejteket különböző koncentrációjú z-FA.fmk-val előinkubáltuk, majd a sejteket STS+z-VAD.fmk-val kezeltük 8 órán keresztül. Katepszin aktivitást a különböző koncentrációjú z-FA.fmk-val kezelt mintákon detektáltunk z-FR-AMC (--+--) és z-RRAMC (--x--) fluoreszcens szubsztrátok felhasználásával. A 15 percen keresztül mért aktivitásból kapott grafikon meredekségét ábrázoltuk a kontrollhoz (z-FA.fmk mentes minta) viszonyított százalékos arányban. Az apoptotikus sejtek arányát a [Sub-G1] áramlásos citometriás profilban határoztuk meg (fekete háromszög). A Sub-G1 sejtek abszolút százalékát ábrázoltuk. Reprezentatív diagram két független kísérletből.

52


Ezt követően más katepszin gátlószereket alkalmaztunk, hogy kiderítsük, melyik lehet a kérdéses katepszin. Ezen gátlószerek mindegyikével előkezelve csupán az E-64d (az E64c membránpermeábilis változata) és a CA074-OMe gátolta a STS + zVAD.fmk indukált sejthalált 8 óránál (2. táblázat). 2. táblázat: A kaszpáz-gátolt sejtelhalás felfüggesztése különböző katepszin inhibitorokkal Ismert katepszin Használt

Apoptózis

Nekrózis

specificitás

koncentráció

(Sub-G1 sejtek)

(PI + sejtek)

(µM)

gátlási %-a

gátlási %-a

E64c

B, L, H (142)

40

0

26

E64d

B, L, H

40

66

62

Pepstatin A

D (143)

20

0

0

CA074-OMe

B (144)

40

93

98

Érdekes, hogy ezek az inhibitorok nem csak az apoptózist, de a nekrózist is védték [PI felvétel], [Sub-G1] profilban vizsgálva a mintákat. Mivel a CA074-OMe egy specifikus katepszin B inhibitor, ezért feltételeztük, hogy a jelútban szereplő katepszin, a katepszin B. Ennek kiderítésére katepszin B aktivitást mértünk két fluoreszcens szubsztrát a z-FR.amc és z-RR.amc segítségével. A z-RR.amc a katepszin B specifikus szubsztrátja. Míg a z-FR.amc-t a katepszin B, L és S is hasítja. A z-VAD.fmk (50 µM) jelentősen gátolta a katepszin B aktivitást 4 órával STS kezelés után, azonban az aktivitás részben visszatért (a kezdeti aktivitás 35%-ára). Tehát nem zárhattuk ki a katepszin B szerepét. Ennek ellenőrzésére a z-RR.amc és z-FR.amc aktivitás gátlásához szükséges koncentrációkat korreláltattuk a sejtelhalás gátlásához szükséges CA074OMe koncentrációjával. Meglepő módon a katepszin B aktivitás már három nagyságrenddel kisebb koncentrációjú CA074-OMe hatására gátlódott, mint maga a sejthalál (20. ábra).

53

FR-áz RR-áz

apoptózis nekrózis

Sejt halál (%)

Relatív katepszin aktivitás (%)


CA074-Ome koncentrációja (µM)

20. ábra: A CA-074OMe sejthalál és katepszin gátló hatása eltérő koncentrációknál jelentkezik. U937 sejteket különböző koncentrációjú CA074-OMevel előinkubáltuk, majd a sejteket STS+z-VAD.fmk-val kezeltük 8 órát. Katepszin aktivitást a különböző koncentrációjú CA074-OMe-vel kezelt mintákon detektáltunk zFR-AMC (üres háromszög) és z-RR-AMC (üres fordított háromszög) fluoreszcens szubsztrátok felhasználásával. A 15 percen keresztül mért aktivitásból kapott grafikon meredekségét ábrázoltuk a kontrollhoz (CA074-OMe mentes minta) viszonyított százalékos arányban. Az apoptózist CA074-OMe és STS+zVAD.fmk kezelt mintákon mértük [Sub-G1] áramlásos citometriás profilban (fekete háromszög). A nekrózist CA074-OMe és STS+zVAD.fmk kezelt mintákon mértük [PI felvétel] áramlásos citometriás profilban (fekete fordított háromszög). A Sub-G1 és PI + sejtek relatív százalékát ábrázoltuk. Tehát ez az adat jelzi, hogy a CA074-OMe nem a katepszin B gátlásán keresztül valósítja meg a sejtelhalás gátlását. Ezt a feltételezést tovább erősíti, hogy már maga a z-VAD.fmk (50µM) jelentősen gátolja a katepszin B aktivitását. Végül a CA074-OMe specificitását az is megkérdőjelezi, hogy a gátlószer gátlási effektusa ellentétben az általánosabb inhibitorral (z-FA.fmk) a nekrózis felfüggesztésére is kiterjed, nemcsak az apoptóziséra. Az E64d szintén gátolta az apoptózist és a nekrózist is. Erről a gátlószerről leírták, hogy már 1 µM-os koncentrációban képes gátolni az összes katepszin aktivitását. E két inhibitornál a specificitás elvesztése talán összefügghet membrán permeabilitásukkal. Összefoglalva a STS indukált kaszpáz gátolt sejtelhalás apoptotikus ágát egy z-FA.fmk-val gátolható cisztein katepszin szabályozhatja, mely azonban nem a katepszin D, illetve B.

54


V. 3. Hsp-90 szerepe a kaszpáz-gátolt sejthalál szabályozásában RIP1 kináz számos nekrotikus jelút szabályozó eleme (135). Mivel a RIP1 a Hsp90 chaperon szubsztrát fehérjéje, ezért működése leszabályozható a GA (geldanamycin), egy Hsp90 gátló hosszantartó kezelésével (145). U937 sejteket 12 órára előkezeltük GA-val, hogy elegendő idő legyen a Hsp90 szubsztrát proteinek degradációjára. A GA kezelés szignifikánsan csökkentette a nekrózist (p=0,0032 [PI felvétel] profilban), miközben az apototikus sejtek számát növelte a STS + z-VAD.fmk kezelt mintákban. Az effektus mind a négy áramlásos citometriás mérési profillal reprodukálható volt (21. A., B. és 22. ábra). Kontroll

A PI fluoreszcencia intenzitás

2

STS

2

STS+z-VAD

1

7

2

17

STS+z-VAD+z-FA

2

25 Kontroll

2

1

6

84

5

9

40

2

10

16

2

7 GA

6

49

7

36


DNS tartalom (EtBr fluor. Int.)

B 1

0

12

26 Kontroll

0

2

1

1

80

1

3

43

3

2

12

7 GA

1

6

1

74

1

61

1

9

SSC intenzitás

21. ábra: STS kezelésre létrejövő nekrózis és apoptózis is gátolható a kaszpázgátolt sejtekben I. (A-B) U937 sejteket z-VAD.fmk (50µM) jelenlétében vagy hiányában kezeltünk STSsel (1µM) 8 órára. A mintákat GA (1 µM)-vel 12 órára és/vagy z-FA.fmk (z-FA)-val (1 µM) 30 percre előinkubáltuk. (A) A nem fixált mintákat Annexin V-FITC-cel és PI-vel festettük, majd áramlási citometriával detektáltuk és [Annexin V-FITC, PI] diagramon jelenítettük meg. (B) A fixált mintákat EtBr-dal festettük és áramlási citométerrel mértük, majd [SSC, DNS tartalom] diagramon jelenítettük meg. A feltüntetett értékek a kapuzott populációk százalékos arányát mutatják.

55


A gátlás specificitására utal, hogy a GA nem gátolta sem a STS indukált apoptózist, sem pedig a H2O2 által okozott nekrózist sem (22. A. ábra). GA minimálisan növelte a PARP hasítás arányát STS+ z-VAD.fmk-val kezelt mintákban (22. B. ábra), mely összhangban van az áramlási citometriával mért Sub-G1 sejtek, illetve a fénymikroszkópos képeken látható II-es típusú apoptotikus morfológiájú sejtek számának növekedésével (24. ábra). sub-G1 Sub-G1 és PI+ sejtek (%)

A

PI +

100

100

80

80

60

60

40

40

20

20

0

0

z-VAD STS z-FA GA

-

+

+ -

+ +

+ -

+ +

+ + -

+ + +

-

+

+ -

+ +

+ -

+ +

+ + -

+ + +

z-VAD STS z-FA GA

+ -

+ +

+ + -

+ + +

+ + -

+ + +

+ + + -

+ + + +

PI+ sejtek (%)

100 80 60 40 20

0 z-VAD H2O2 z-FA GA

B PARP

116 kD

h-PARP

89 kD

z-VAD STS z-FA GA

-

+

+ -

+ +

+ + -

+ + +

z-VAD + STS z-FA GA

+ -

+ + +

+ + -

+ + +

+ + + -

+ + + +

22. ábra. STS kezelésre létrejövő nekrózis és apoptózis is gátolható a kaszpázgátolt sejtekben II. (A-B) U937 sejteket z-VAD.fmk (50 µM) jelenlétében vagy hiányában kezeltünk STSnal (1 µM), illetve H2O2-vel (2,5 mM) kezeltük 8 órára. E minták egy részét GA-val (1 µM) 12 órára és/vagy z-FA.fmk-val (z-FA; 1 µM) 30 percre előinkubáltuk. (A) Az oszlop diagramok a [Sub-G1] és [PI felvétel] profilokból számolt értékeket mutatják (átlag±SD)(n=5). (B) Western blot analízis. PARP: teljes hosszúságú PARP (116 kDa), h-PARP: hasított PARP fragmentum (89 kDa).

56


A GA okozta Hsp90 gátlás sejtciklus blokkot eredményez G1 és G2/M fázisban. Azt találtuk, hogy a GA két funkciója: a nekrózis felfüggesztése és a sejtciklus gátlás ugyanazoknál a GA koncentrációknál jelentkezik, tehát a két funkció valóban a Hsp90 gátlásán keresztül érvényesül (23. ábra). Az eredmények szerint a Hsp90 vagy szubsztrátja a RIP1 fontos szerepet játszik a STS által létrehozott nekrózis szabályozásában a kaszpáz-gátolt U937 sejtekben.

20

Sejtek (%)

korai S fázis

nekrózis

15 10 5 0

0

-2

10

-1

10

0

10

GA koncentráció (µM)

23. ábra: GA sejtciklus és nekrózis gátló hatása jól korrelál egymással U937 sejteket előkezeltük különböző koncentrációjú GA-val 12 órára, majd kezeltük STS+z-VAD.fmk-val 8 órára. A sejtciklus eloszlást GA kezelt mintákon határoztuk meg áramlásos citometriával. A korai S fázisban lévő sejtek abszolút százalékát ábrázoltuk (--x--). A nekrózist GA és STS+z-VAD.fmk kezelést követően detektáltuk [PI felvétel] áramlásos citometriás profilban (üres háromszög). Reprezentatív diagramm két független kísérletből.

V. 4. A kaszpáz-gátolt sejtelhalás teljes felfüggesztése Az eddigi eredmények szerint sem a GA, sem az z-FA.fmk nem gátolta a sejtelhalást csak a sejteket az egyik elhalásból a másikba terelte. Azt vizsgáltuk, hogy vajon a két szer együttes adása megszünteti-e a STS + z-VAD.fmk indukált elhalást. Eredményeink szerint a két szer együttes adása szignifikánsan csökkentette az apoptózist és nekrózist [Sub-G1], [PI felvétel] profilban mérve (p<0,00002). Az apoptózis (annexin V pozitivitás és Sub-G1 sejtek) és a nekrózis (PI felvétel, SSC csökkenés) összes áramlási citometriás jellemzőit gátolta a két szer együttes adása STS + z-VAD.fmk kezelés után 8 órával (21. A. és B. ábra). GA + z-FA.fmk nem volt hatással sem a STS okozta apoptózisra, sem pedig a H2O2 indukálta nekrózisra (22. A.

57


ábra). A fénymikroszkópos képeken jól látszik, hogy az együttes kezelés eredményesen megőrizte a sejtek citoplazmatikus és magi struktúráját, ellenben a sejtek térfogata csökkent a kontrollhoz képest (24. ábra). Áramlásos citometriával vizsgálva a sejtek méretével arányos FSC intenzitást kiderült, hogy a GA + z-FA.fmk együttes kezelése valóban nem állítja vissza a sejtek normál térfogatát a STS + z-VAD.fmk kezelt mintákon (25. B. ábra). Ennek ellenére a kettős kezelés hosszú távon védte a sejteket a pusztulástól, melyet a morfológiai analízis (24. ábra, 25. A. ábra), az áramlási citometriás [annexin V-FITC, PI felvétel] (8, 18 órás mérés) (25. C., D. ábra) és [PI felvétel] (42 órával kezelés után) (25. E. ábra) profilok támasztanak alá. Mivel a sejtek térfogat vesztése a sejtelhalás során viszonylag hamar bekövetkező jelenség, ezért megnéztük, hogy vajon a mitokondriális és lizoszómális funkciók megőrződnek-e a GA + z-FA.fmk kezelés hatására a STS + z-VAD.fmk kezelt mintákon. A mitokondriális membránpotenciál-változást egy DiOC6(3) nevű festékkel vizsgáltuk (26. A. és B. ábra). A festék a negatív töltés többlettel bíró mitokondriumban gyűlik össze és ott megnövekedett fluoreszcencia intenzitást mutat. Abban az esetben, ha a mitokondrium sérül, a nyugalmi potenciál különbség csökken és ez által a fluoreszcencia intenzitása is kisebb lesz. Ezt a különbséget mértük áramlási citometriával. A savas (endolizoszómális) sejtalkotók mennyiségét AO fluoreszcens festékkel mértük, mely ezekben a kompartmentekben összegyűlve erős piros fluoreszcenciát ad (26. E. és F. ábra). A STS kezelés önmagában közepesen csökkentette a mitokondriumok membrán potenciálját és a savas kompartmentumok mennyiségét is. Még jelentősebb mitokondriális és lizoszómális leromlás STS + z-VAD.fmk kezelés hatására következett be a nekrotikus sejtekben. STS + z-VAD.fmk kezelésre létrejött apoptotikus sejtek megmaradtak a STS kezelésre létrejött mitokondriális és lizoszómális degradáció szintjén. A lizoszómális és mitokondriális leromlástól GA + zFA.fmk együttes kezelés teljesen védte a sejteket (26. A, B, E, F. ábra). A fluoreszcencia intenzitás átlag értékeinek megjelenítése mutatja, hogy a kettős kezelés szignifikánsan védte a sejteket a mitokondrium depolarizációtól és a lizoszómális kompartmentum térfogatcsökkenésétől (26. C, D, G, H. ábra).

58


z-VAD+FA+GA

M B

STS+z-VAD

STS+z-VAD+GA

STS+z-VAD+FA STS+z-VAD+GA+FA

STS+z-VAD

STS+z-VAD+GA

STS+z-VAD+FA STS+z-VAD+GA+FA

M

8 óra

A

M DMSO

18 óra

Z

Z

24. ábra: GA+z-FA.fmk kezelés a sejteket hosszabb távon is megvédte a kaszpázgátolt sejthaláltól I. (A-C) U937 sejteket z-VAD.fmk (50 µM) jelenlétében kezeltünk STS-al (1 µM) 8 óráig. E minták egy részét GA (1 µM)-vel 12 órára és/vagy z-FA.fmk (z-FA)-val (1 µM) 30 percre előinkubáltuk. A mintákat fénymikroszkópos vizsgálatra készítettük elő a kezelés után (A) 8 és (B) 18 órával. Fekete nyíl: nekrotikus sejt, fehér nyíl: apoptotikus sejt, Z: zeiózis: membránba csomagolt citoplazma részek levállása a sejtről, M: mitotikus sejt.

59


C

8 óra

40 20 0

c o n tr o l

-

ST S

ST S+z-V A D

+ + -

+ + +

c o n tr o l

+ + + -

ST S

+ + + +

PI fluor. intenzitás

60

z-VAD STS z-FA GA

B

■ apoptózis □ nekrózis

80

Kontroll STS+z-VAD

Sejtszám

STS+z-VAD +GA+FA

N 2

N 14

N 5

A 1

A 29

A 4

N 2 PM A 2

N 46 PM A 18

N 20 PM A 10


E 110

PI+ sejtek (%)

STS+z-VAD+FA+GA

STS+z-VAD

D 18 óra

Sejthalál morfológia alapján (%)

1 00

Kontroll

PI fluor. intenzitás

A

Kontroll

90

STS+z-VAD STS+z-VAD+FA+GA

70 50 30 10 -10 0

FSC intenzitás

10

20

30

40

50


25. ábra: GA+z-FA.fmk kezelés a sejteket hosszabb távon is megvédte a kaszpázgátolt sejthaláltól II. (A-D) U937 sejteket z-VAD.fmk (50µM) jelenlétében kezeltünk STS-al (1µM) 8 (A-C) vagy 18 (D) órára. E minták egy részét GA (1 µM)-vel 12 órára és z-FA.fmk (z-FA)val (1 µM) 30 percre előinkubáltuk (A) Az oszlopdiagramok a fénymikroszkóppal meghatározott apoptotikus és nekrotikus sejtek százakékát mutatják (átlag±SD) (n=2). (B) A kezelt mintákat a [PI felvétel] áramlásos citometriás profil szerint készítettük elő és az élő (nem PI +) sejtek FSC intenzitását ábrázoltuk. DMSO-t oldószer kontrollként használtuk (folyamatos vonal), STS+z-VAD (pontozott vonal), STS+z-VAD+GA+FA (szaggatott vonal) (reprezentatív diagram n=5). (C, D) A nem fixált mintákat Annexin V-FITC-cel és PI-vel festettük, majd áramlási citometriával detektáltuk és [Annexin VFITC, PI] diagramon jelenítettük meg. (C) 8 és (D) 18 órával kezelés után. N: nekrotikus sejtek, PM: poszt mortem sejtek, A: apoptotikus sejtek. A feltüntetett értékek a kapuzott populációk százalékos arányát mutatják (n=2). (E) A diagram a PI + sejtek mennyiségi változásának hosszú távú kinetikáját mutatja [PI felvétel] áramlásos citometriás profilban mérve (n=2). A mintákat DMSO-val (üres háromszög), STS+zVAD-val (fekete háromszög), STS+z-VAD+GA+FA-val (fekete négyzet) kezeltük.

60


B z-FA+GA

Sejtszám

Kontroll

DiOC6(3) fluoreszcencia intenzitás

F z-FA+GA

Sejtszám

Kontroll

AO fluoreszcencia intenzitás Kontroll STS STS+z-VAD

Átlag AO fluor. int.

E

C

D

750

750

500

500

250

250

Átlag DiOC6(3) fluor. int.

A

0

0 1

2

3

4

5

1

G

H

600

600

400

400

200

200

2

3

4

5

**

0

0

z-VAD STS z-FA GA

**

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

– – – –

– + – –

– + + –

– + – +

– + + +

+ – – –

+ + – –

+ + + –

+ + – +

+ + + +

26. ábra: A STS indukált sejtelhalás gátlása összekapcsolható a mitokondriális és lizoszómális leromlás megakadályozásával Az U937 sejteket z-VAD.fmk (50µM) jelenlétében vagy hiányában kezeltük STS-al (1µM) 8 órára. E minták egy részét GA (1 µM)-vel 12 órára és/vagy z-FA.fmk (z-FA)-val (1 µM) 30 percre előinkubáltuk. (A-B) A DiOC6(3) és PI festett mintákat [DiOC6(3)] áramlásos citometriás profilban mértük. (E-F) Az AO festett sejteket [AO red] áramlásos citometriás profilban mértük. A mintákat (A, E) DMSO-val (B, F) GA+z-FA.fmk-val és: vagy DMSO-val (pontozott vonal), vagy STS-val (szaggatott vonal) vagy STS+z-VAD.fmk (folyamatos vonal) kezeltük. (C-D) Az oszlopdiagramokon a [DiOC6(3)] profilban mért teljes populációra vonatkozó átlag fluoreszcencia értékeket tüntettük fel. (G-H) Az oszlopdiagramokon a [AO red] profilban mért teljes populációra vonatkozó átlag fluoreszcencia értékeket jelenítettük meg (átlag±SD) (n=3).

61


VI. MEGBESZÉLÉS Jelen tanulmányban a STS-t modellvegyületként alkalmaztuk a mitokondriumapoptoszóma által irányított sejthalál út indukciójára. Megmutattuk, hogy STS z-VAD.fmk kaszpáz gátló jelenlétében időben egyszerre megjelenő apoptotikus és nekrotikus sejtelhalást is eredményezett. Az apoptózis és nekrózis egy mintán történő mérésére egy új áramlási citometriás mérési profilt dolgoztunk ki, mellyel eldönthetővé vált, hogy a két sejtelhalás típus elkülönülten és nem pedig egy sejten egyszerre jelenik meg. E profilban az SSC és DNS tartalom változásokat jelenítettük meg etanolban fixált sejtek mérését követően. Ezzel a mérési módszerrel a szokásos festék felvételen alapuló nekrózis mérési módszert egészítettük ki. E két módszer együttes alkalmazása lehetővé tette számunkra, hogy különbséget tehessünk elsődleges és másodlagos nekrózis között, mivel az elsődleges nekrotikus sejteknél nem jelentkezik DNS fragmentáció a korai időpontokban, míg a másodlagos nekrotikus sejteknél igen. Továbbá az elsődleges nekrotikus sejtek már korán, jelentősen veszítenek SSC intenzitás értékükből, míg a másodlagos nekrotikus sejteknél ez csak enyhébben és lassabban jelenik meg. Azonban a

sejtben

lezajló

poszt-mortem változások

elmoshatják ezeket

a

különbségeket, köszönhetően a szérumban lévő DNázoknak és proteázoknak. A nekrotikus sejtek granuláltságának csökkenésére az egyik magyarázat az lehet, hogy a heterokromatin megszűnik, melynek hatására jelentősen változhat a sejt fényszórás tulajdonsága is. Másrészt az elektronmikroszkópos képeken a nekrózis késői fázisában a sejt elveszíti teljes citoplazmáját, mely szintén magyarázhatja a nagy mértékű SSC csökkenést. Az általunk kifejlesztett és egyéb áramlásos citometriás módszereket használva, kiegészítve morfológiai megfigyelésekkel, továbbá specifikus PARP fragmentum western blottal és enzimaktivitás esszékkel azt találtuk, hogy a z-FA.fmk, cisztein proteáz inhibitor és a GA, Hsp90 gátló az egyik sejtelhalás formából a másikba kapcsolta át a STS indukált kaszpáz gátolt U937 sejteket. Továbbá a z-FA.fmk és GA kombinációban adva megszüntette a sejtelhalást a mitokondrium

membrán

potenciál

és

savas

pH-jú

megőrzésével, míg a sejtek zsugorodását nem állította meg.

62

sejtalkotók

(lizoszómák)


Miközben a kaszpáz-gátolt apoptózisra és nekrózisra jellemző biokémiai markereket kerestük azt találtuk, hogy a z-VAD.fmk-ból használt dózis teljesen gátolta a STS kezelés által létrehozott végrehajtó kaszpáz aktivitást. Ugyanakkor a nukleoszómális DNS fragmentáció, a kaszpáz vezérelt apoptózisra jellemző PARP hasítás és a DNS morfológiailag látható kondenzációja nem gátlódott, csupán késleltetve jelent meg. Z-FA.fmk alkalmazása mind a három jelenséget megszüntette. Ez a cisztein proteázok részvételét mutatja a STS indukált kaszpáz-gátolt elhalásban U937 sejteken. A következő megállapítások bizonyítják, hogy a szóban forgó cisztein proteázok katepszinek lehetnek: a) z-VAD.fmk –val kezelt sejtek megőrizték a katepszinek szélesebb spektrumára jellemző FR-áz aktivitásuk jelentős részét, (146); b) a z-FA.fmk mind az apoptózist, mind pedig az FR-áz aktivitást gátolta ugyanabban a koncentrációban. Mások a közelmúltban megmutatták, hogy az U937 sejtek mérsékelten expresszálnak katepszin B, -H, -L, -S cisztein katepszineket, míg katepszin D-t fokozott mértékben (147,148). Kísérleteinkben azonban a katepszin D specifikus gátlószere nem volt hatásos a kaszpáz-gátolt apoptózis felfüggesztésében 4 óra előkezelés után. Azonban egyéb katepszinek szerepe is felmerülhet, ugyanis aktivitásmérésen alapuló próbák egyéb cisztein katepszineket is azonosítottak e sejtvonalban. Nem világos, hogy ezek a proteázok vajon hasonlóan az effektor kaszpázokhoz, közvetlenül elérik és processzálják a sejtelhalás megjelenési formájáért felelős szubsztrát proteineket (149). Tisztított katepszinek (B és L) például képesek cPLA2 processzálására vagy a PARP hasítására (katepszin B, D, G) (150), bár az így kapott PARP hasítási termék különbözik a tipikus, kaszpázok által hasított fragmentumtól. Azonban azt is leírták, hogy izolált lizoszómák képesek a tipikus apoptotikus fragmentum létrehozására is (150) vagy BID hasításra, mely megegyezik a kaszpáz-függő processzálással (129). Később azt is megmutatták, hogy a katepszinek is képesek a BID hasítására ugyanannál az aminosavnál (151). Feltételezhető, hogy a lizoszómák tartalmaznak kaszpáz-szerű aktivitást is. Ennek az lehet a magyarázata, hogy a kaszpázok fehérjeinklúziókhoz kötődve autophágia útján bekerülhetnek a lizoszómákba és ott megőrzik aktivitásukat. Az is elképzelhető, hogy a kaszpázok hasítási szekvenciájához közeli helyeken egyéb lizoszómális proteázok is hasíthatnak. A mi eredményeinkhez hasonló eredményt kapott Brockhaus és Brüne, akik U937 sejteken azt találták, hogy bár a DNS

63


fragmentáció megszűnt z-VAD.fmk kaszpázgátlóval kezelve, de a tipikus apoptotikus PARP fragment (85 kD) késleltetve mégis megjelent (8 órával kezelés után) (152). Viszont a katepszinek e folyamatban betöltött szerepével nem foglalkoztak. Indirekt bizonyítékok vannak arra vonatkozóan, hogy TNF-α kezelés és bortezomib kezelés májsejtekben a katepszin B lizoszómákból való kiszabadulását stimulálta, mely kaszpáz-2 aktivációt és mitokondriális depolarizációt eredményezett. A mitokondriális depolarizáció kaszpáz függő és független apoptózis effektor molekulák (AIF, Endonuzkleáz G) felszabadulását okozta (141,153). A kaszpáz-2 két okból kifolyólag is fontos lehet kísérleteink szempontjából. Egyrészt a többi kaszpázhoz viszonyítva kevésbé érzékeny az általunk használt z-VAD.fmk kaszpáz-gátlóra (154). Másrészt pedig leírták, hogy a z-FA.fmk nagyobb koncentrációkban (10 µM környékén) közvetlenűl gátolja a kaszpáz-2 aktivitását (155). Elképzelhető tehát, hogy a kaszpáz-2 úgy működik, mint a katepszinek által aktiválható indító kaszpáz. A bevezetőben már tárgyalt legújabban leírt kaszpáz aktiváló komplex a PIDDoszóma megfelelő környezetet biztosít a kaszpáz-2 aktivációnak (36) éppúgy, mint ahogy a RIP1 aktivációnak is (156). A PIDD autoproteolízise révén keletkező két különböző fragmentum közül az egyik a kaszpáz-2, a másik a RIP1 aktivációnak kedvez (157). Érdekes elképzelés, hogy a PIDDoszóma lehet az elköteleződési pont, ahol eldől, hogy nekrotikus vagy apoptotikus irányba terelődik a sejtelhalás abban az esetben, ha az effektor kaszpázok aktivitása blokkolva van farmakológiailag vagy IAP-ok által. Ez és egyéb megfigyelések (158), melyek felvetik a kaszpázok lehetséges részvételét DEVDáz aktivitástól mentes sejtelhalás lezajlásában vitt minket arra az elhatározásra, hogy a kaszpáz-független helyett a kaszpáz-gátolt kifejezést használjuk ebben a tanulmányban. Már

a

bevezetőben

utaltam

rá,

hogy

a

lizoszómák

-pontosabban

azok

permeabilizációja- szintén egy lehetséges elágazási pontot képviselhetnek a jelútban. A lizoszómák minimális permeabilizációja az apoptózis iniciációját, míg a nagy mértékű lizoszómális permeabilizáció inkább a nekrózis megjelenését eredményezi (159). A proteinek és lipidek fokozott oxidációja a permeabilizációt, míg a Hsp70 kifejeződése a stabilizációt segíti (160). A GA által előidézett Hsp90 gátlás a Hsp70 expresszió növekedését eredményezi (161), mely így védheti a lizoszómákat az erőteljesebb depolarizációtól és a nekrózistól. Azonban ez a forgatókönyv a mi kísérletes rendszerünkben nem valószínű, mert a GA előkezelés nem gátolta a STS+z-

64


VAD.fmk kezelés által generált AO red fluoreszcencia intenzitás csökkenést, amely jelzi a lizoszómális sérülést, legalább a H+ homeosztázis szintjén, vagyis a GA által indukált Hsp-70 önmagában nem védte meg a lizoszómákat. Érdekes, hogy a mitokondrium depolarizáció legalább részben csökkent a GA hosszantartó kezelése hatására.

Elképzelhető,

hogy

a

RIP-1

függő

nekrotikus

jelút

itt

esetleg

összekapcsolódik a mitokondriális úttal. STS

z-VAD

kaszpázok

katepszinek

Elköteleződési pont (?) (RIP?)

z-FA

4óra

8óra

Hsp90

GA

Apoptózis

Apoptózis szerű

Nekrózis szerű

27. ábra: A kaszpáz-gátolt sejthalál jelútjának sémája U937 sejten Eredményeink azt sugallják, hogy az elágazódási pont az apoptotikus és nekrotikus jelpálya között a STS+z-VAD.fmk indukált folyamatban a mitokondriális depolarizáció és a lizoszómális leromlás közelében vagy inkább elé tehető. A kapott adatok alapján két jelút séma is elképzelhető. Egyrészt lehetséges, hogy a STS kezelésre létrejövő kaszpáz-gátolt sejthalál útvonal a gátlószerek hatására kapcsolódik át nekrotikus vagy apoptotikus irányba. Itt az előbb említett PIDDoszóma komplex lehet az egyik elköteleződési pont. Elképzelhető, hogy a katepszinek által létrejövő PIDD hasítás szabályozhatja azt, hogy a sejtelhalás a RIP által regulált, nekrotikus vagy esetleg az apoptotikus irányba terelődik abban az esetben, ha az effektor kaszpáz aktivitás gátolt (27. ábra). A másik elképzelés szerint az apoptotikus és nekrotikus jelút párhuzamosan fut a sejtben. Ebben az esetben az, hogy a sejt szintjén aktuálisan melyik sejthalálforma jelenik meg, azon múlik, hogy éppen melyik jelút jutott el hamarabb a

65


point of no return szakaszába. Ez a sejt aktuális állapotától függhet, konkrétan például attól, hogy a sejtciklus mely fázisában van a sejt. Ezt támasztja alá az a megfigyelés, hogy a nekrózis gátlása GA-val sejtciklus blokkot is eredményezett G1 és G2/M fázisban. Az utóbbi elmélet, vagyis az apoptotikus és nekrotikus jelutak párhuzamos lefutása talán jobban magyarázza azt a jelenséget, hogy az egyik sejthalál típus gátlásával a sejtek miért haltak el mégis a másik sejthalálformában.

66


VII. KÖVETKEZTETÉSEK A dolgozat alapján levonható főbb következtetések:

1. U937 sejtvonalon a DEVD-áz specificitású kaszpáz aktivitás gátlása önmagában nem elegendő a STS indukált elhalás megszüntetéséhez. 2. Az ekkor jelentkező sejtelhalásnak morfológiai és áramlási citometriás eredményeink szerint kétféle megjelenési formája figyelhető meg: apoptózisszerű és nekrózis-szerű. E két sejthaláltípus időben párhuzamosan, külön sejteken jelentkezik. 3. Az általunk kidolgozott áramlásos citometriás mérési profillal, amelyben SSC csökkenés és DNS tartalom változást vizsgáljuk, a szabályozott sejtelhalás formák könnyebben elkülöníthetőek egymástól illetve a másodlagos nekrózistól. 4. A z-FA.fmk cisztein proteáz gátlószer adásával az apoptotikus sejtelhalás nekrotikus irányba terelhető, melynek regulátor molekulája nem a katepszin B és D. 5. A GA, Hsp90 chaperon gátlószer kezelés feltehetőleg a RIP1 kináz gátlásán keresztül a nekrotikus sejtelhalást apoptotikus irányba befolyásolja. 6. A két szer együttes adása hosszútávon védi a sejteket a sejtelhalástól, a mitokondriális és lizoszómális leromlástól, tehát a mitokondriumok és lizoszómák szerepe fontos lehet e sejthalál létrejöttében. 7. A CA074-OMe az irodalomban egy specifikus katepszin B gátlóként alkalmazott inhibitor. Az eredményeink szerint azonban a CA074-OMe nem a katepszin B aktivitás gátlásán keresztül fejti ki sejtelhalás felfűggesztő hatását.

67


VIII. ÖSSZEFOGLALÁS Az apoptózis szabályozásában központi szerepet foglalnak el a kaszpáz, cisztein proteázok. Egyre több adat van arra vonatkozóan, hogy a kaszpáz aktivitás gátlása nem feltétlenül

szünteti

meg

a

sejtelhalást.

E

kaszpáz

aktivitástól

független

sejtelhalásformák morfológiájukban eltérőek lehetnek. Egyre élesebben látszik, hogy e sejtelhalás formák szintén aktívan szabályozottak a sejt által, és néhány esetben az egyedfejlődésben és fiziológiás szituációkba betöltött szerepük is bizonyított. Azonban az alternatív aktív sejtelhalásformák szabályozó elemei és mechanizmusai még kevésbé ismertek, pedig ismeretük a daganatok, illetve a gyulladást és másodlagos szövetkárosodást

okozó

akut

nekrotikus

folyamatok

terápiájában

előrelépést

eredményezhet. Az alternatív jelutakat vizsgálva azt találtuk, hogy a STS, a mitokondriális apoptotikus sejthalál egyik modell vegyülete mind apoptotikus, mind nekrotikus jellegű sejtelhalást indukált z-VAD.fmk kaszpáz gátló jelenlétében. A fénymikroszkópos és áramlási citometriás vizsgálatok megerősítették, hogy a sejtekben a két elhalásforma időben párhuzamosan, de külön sejteken jelentkezett és nem egy sejten belül. A cisztein katepszinek gátlása z-FA.fmk-val megvédte a kaszpáz-gátolt sejteket a STS indukált apoptózistól, de a sejthalál nem csökkent csupán nekrotikus irányba tolódott el. A Hsp90 chaperon aktivitás gátlása GA segítségével megvédte a kaszpáz-gátolt sejteket a nekrózistól, ellenben a sejtelhalás jelentős csökkenése itt sem mutatkozott, mivel a sejthalál apoptotikus irányba tolódott. A z-FA.fmk és GA együttes kezelése mindkét elhalásforma megjelenését gátolta a mitokondriális transzmembránpotenciál és a lizoszómák megőrzésével. E sejthalál gátló hatás csupán a STS kezelt, kaszpáz gátolt sejtekre volt érvényes és sem a STS által indukál apoptózist, sem a H2O2-vel létrehozott nekrózist nem gátolta. Eredményeink szerint a STS indukált jelút kettéágazik kaszpáz-gátolt sejtekben és az egyik vagy másik irányba való elköteleződés cisztein katepszinek aktivitásától, illetve a Hsp90 chaperon aktivitástól függ, melyek gátlásával a sejtelhalás formák átkapcsolhatóak egymásba, illetve együttes gátlásukkal a sejtelhalás hosszabb távon gátolható.

68


IX. SUMMARY A type of cystein proteases, called caspases are the main regulators of apoptosis. However, more and more data support the idea that the inhibition of caspase activity is not by all means sufficient to inhibit cell death. These caspase activity-independent cell death forms may be diverse according to morphological and even biochemical studies. Increasing amount of evidence suggests that the alternative forms of cell death are actively regulated by cells and in some cases their role in physiological and developmental situations has also been demonstrated. However, the regulator components and mechanisms of caspase-compromised cell death are less understood. Knowledge of these alternative cell death pathways may help us to overcome chemotherapy resistance of tumors or to decrease the intensity of necrosis resulting in secondary tissue damage. By examining alternative cell death pathways we found that staurosporine (STS), a model compound of apoptotic death, resulted in both apoptotic and necrotic cell death even in the presence of z-VAD.fmk, a caspase inhibitor. Light microscopic and flow cytometry analysis confirmed that the two distinct forms of cell death occurred in parallel in separate cells. Inhibition of cystein cathepsins by z-FA.fmk prevented STS induced apoptosis in caspase-inhibited cells, however, cells did not survive but died with necrosis. Inhibition of Hsp90 chaperon activity with geldanamycin (GA) blocked necrotic cell death in caspase compromised cells. In this case cells died with apoptosis. Cotreatment with z-FA.fmk and GA inhibited both forms of caspase compromised cell death by preserving mitochondrial membrane potential and lysosomes. Cotreatment with these two inhibitors was not effective in the inhibiton of STS only induced (caspase dependent) apoptosis and H2O2 stimulated necrosis, indicating the specificity of inhibitors. In conclusion, STS induced cell death diverges in STS treated, caspase-inhibited U937 cells. Decision between the two types of death might depend on the activity of cystein cathepsins and the Hsp90 chaperon protein.

69


X. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE X. 1. A disszertációhoz kapcsolódó publikációk 1.

Mihalik R, Imre G, Petak I, Szende B, Kopper L. Cathepsin B-independent abrogation of cell death by CA-074-OMe upstream of lysosomal breakdown. Cell Death Differ 2004;11(12):1357-60. IF: 8, 192

2.

Imre G, Dunai Z, Petak I, Mihalik R. Cystein cathepsin and Hsp90 activities determine the balance between apoptotic and necrotic cell death pathways in caspase-compromised

U937

cells.

Biochim

Biophys

Acta

2007;

1773(10):1546-57. IF: 6, 900

X. 2. Egyéb közlemények 3.

Nagy K, Petak I, Imre G, Barna G, Gezane-Csorba M, Sebestyen A, Houghton JA, Mihalik R, Kopper L. Proteasome inhibitors abolish cell death downstream of caspase activation during anti-microtubule drug-induced apoptosis in leukemia cells. Anticancer Res 2005;25(5):3321-6. IF: 1, 604

4.

Felfoldi B, Imre G, Igyarto B, Ivan J, Mihalik R, Lacko E, Olah I, Magyar A. In ovo

vitelline

duct

ligation

results

in

transient

changes

of

bursal

microenvironments. Immunology 2005;116(2):267-75. IF: 3, 507 5.

Mihalik R, Imre G. Kaszpázok, apoptózis, sejtelhalás: (jel)útvesztőben. Orvosképzés 2006, LXXXI. évfolyam, 3. szám: 151-157

70


X. 3. Előadások, poszterek 6.

Imre Gergely, Dunai Zsuzsanna: TPCK és TLCK szerinproteáz inhibitorok nem az Omi/Htra2 proteáz inaktiválásán keresztül gátolják a kaszpázfüggetlen elhalást leukémia sejtekben. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola PhD Tudományos Napok, Budapest 2006. április 13-14. absztrakt szám: E-III/7

7.

Z. Dunai, G. Imre and R. Mihalik: Staurosporine-induced caspase independent cell death is abrogated by the Omi/Htra2 inhibitor UCF101 by preserving mitochondrial trans-membrane potential. 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary 2-7 July 2005, The FEBS Journal, Volume 272 Supplement 1, poster abstract: N5-019P

8.

Imre Gergely, Dr. Mihalik Rudolf: Apoptózis-nekrózis reosztát kaszpáz gátolt leukémia sejtekben. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola PhD Tudományos Napok, Budapest 2005. április 14-15. absztrakt szám: E-V/1

9.

G. Imre, Z. Dunai and R. Mihlaik: Abrogation of caspase-independent cell death (CICD) by TPCK or TLCK (unlike to UCF101) is not mediated by Omi/Htra2. 13th Euroconference on Apoptosis, Budapest, Hungary October 1-4, 2005, poster abstract: P-91

10.

Gergely Imre, Rudolf Mihalik. To kill two birds with one stone: simultaneous detection of apoptosis and necrosis in ethanol fixed cells by flow cytomery.(2004) XXII Internationa l Congress of the International Society for Analytical Cytology (ISAC), LeCorum, Montpellier, France 2004. május 22-27. Cytometry, abstract issue, part A, 59A, number 1, abstract number: 95719

11.

Imre Gergely, Dr. Mihalik Rudolf (2004) Programozott sejtelhalás szabályozása kaszpázgátolt leukémia sejtekben: a katepszinek és a Hsp90 szerepe, PhD. Tudományos Napok, Semmelweis Egyetem, Budapest, 2004. április 8-9., Absztrakt gyűjtemény, 62-63.o.

71


12.

Imre Gergely, Dr. Mihalik Rudolf (2004) Két legyet egy csapásra: az apoptózis és a nekrózis egyidejű detektálása etanol fixált sejteken áramlási citometriával. Modern sejtanalitikai módszerek, IV. Magyar Sejtanalitikai Konferencia, Semmelweis Egyetem Budapest, 2004. május 6-8. absztrakt katalógus,150.

72


XI. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS Először is köszönöm szüleimnek, Dr. Imre Tamásnak és Dr. Imre Tamásné, Iván Ildikónak a szerető családi légkört, melyet megteremtettek számomra és testvéreim számára. Szeretném megköszönni, hogy mindig mellettem voltak és támogattak. Hálás vagyok témavezetőmnek, Dr. Mihalik Rudolfnak, aki megmutatta számomra mi az igaz, tiszta kutatás és ennek elengedhetetlen kelléke a kritikus és kreatív gondolkodás. Sokat tanultam tőle szakmailag és emberileg a munkával együtt eltöltött évek során. Köszönettel tartozom Dr. Kopper László professzor úrnak, hogy lehetőséget nyújtott számomra laboratóriumában és intézetében, hogy egyetemi hallgatóként bekapcsolódhassak az Intézetben folyó kutatómunkába. Köszönöm Dr. Peták Istvánnak, a szakmailag építő beszélgetéseket és a nem csekély anyagi támogatást. Sokat köszönhetek Dr. Nagy Katalinnak, akivel első kísérleteimet végeztem és azóta is rengeteget tanulok tőle. Köszönöm a munkatársként, barátként együtt eltöltött időt. Köszönöm Dr. Barna Gábornak, hogy alapos bírálatával, jó meglátásaival és kérdéseivel segítette a dolgozat tökéletesedését. Hálával tartozom a Kopper labor összes dolgozójának, akik olyan munkahelyi légkört teremtettek számomra, amiért érdemes volt reggel munkába indulni. Külön köszönettel tartozom, Mallászné Bagi Györgyinek, Csorba Gézáné Maricának és Dr. Berczi Lajosnak a rengeteg emberi támogatásért. Nagy köszönet illeti Dr. Sebestyén Annát, akihez szakmai kérdésekben mindig fordulhattam. Köszönöm Dr. Hajdu Melindának a western blot technikában nyújtott segítséget és a sok baráti beszélgetést. Köszönöm Dunai Zsuzsannának, hogy lelkesedésével,

szorgalmával segítette

munkámat és, hogy együtt dolgozhattunk. Nagyon köszönöm Dr. Paku Sándornak, hogy szakértelmével segítette az elektronmikroszkópos képek készítését, értékelését. Köszönetemet szeretném kifejezni Dr. Matolcsy András professzor úrnak, hogy lehetővé tette számomra, hogy laborjában elvégezhessem az áramlásos citométeres vizsgálatokat.

73


Köszönettel tartozom Dr. Kovalszky Ilonának és a Biokémia labor összes munkatársának, hogy lehetőséget teremtettek számomra a Biokémia labor műszereinek használatára. Hálával tartozom a Molekuláris Terápia labor munkatársainak, hogy befogadtak fiatal, lelkes csapatukba. Külön köszönet illeti Barti-Juhász Helgát, Kánya Melindát, Dr. Pintér Ferencet, Lőrincz Andrást és Jóri Balázst. Hálás vagyok Deák Lindának, Dr. Reiniger Lillának, Bödör Csabának, Dr. Dicházi Csabának, Sándor Szilviának, Dr. Füle Tibornak és Dr. Máthé Miklósnak a jó munkahelyi hangulat megteremtéséért, amitől a munka is jobban ment. Sok köszönet Laczik Ceciliának az értekezésemmel kapcsolatos adminisztratív feladatok lebonyolításáért. Köszönöm az I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet minden dolgozójának, hogy munkatársuk lehettem.

74


XII. IRODALOMJEGYZÉK 1.

Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972;26(4):239-57.

2.

Leist M, Jaattela M. Four deaths and a funeral: from caspases to alternative mechanisms. Nat Rev Mol Cell Biol 2001;2(8):589-98.

3.

Kim R. Recent advances in understanding the cell death pathways activated by anticancer therapy. Cancer 2005;103(8):1551-60.

4.

Golstein P, Kroemer G. Cell death by necrosis: towards a molecular definition. Trends Biochem Sci 2006.

5.

Kopper L, Jeney A. Onkológia-a géntől a betegágyig. 2002:41.

6.

Tata JR. Requirement for RNA and protein synthesis for induced regression of the tadpole tail in organ culture. Dev Biol 1966;13(1):77-94.

7.

Ellis HM, Horvitz HR. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell 1986;44(6):817-29.

8.

Boya P, Gonzalez-Polo RA, Casares N, Perfettini JL, Dessen P, Larochette N, Metivier D, Meley D, Souquere S, Yoshimori T and others. Inhibition of macroautophagy triggers apoptosis. Mol Cell Biol 2005;25(3):1025-40.

9.

Kroemer G, El-Deiry WS, Golstein P, Peter ME, Vaux D, Vandenabeele P, Zhivotovsky B, Blagosklonny MV, Malorni W, Knight RA and others. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death. Cell Death Differ 2005;12 Suppl 2:1463-7.

10.

Yuan J, Shaham S, Ledoux S, Ellis HM, Horvitz HR. The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 betaconverting enzyme. Cell 1993;75(4):641-52.

11.

Xue D, Shaham S, Horvitz HR. The Caenorhabditis elegans cell-death protein CED-3 is a cysteine protease with substrate specificities similar to those of the human CPP32 protease. Genes Dev 1996;10(9):1073-83.

12.

Thornberry NA, Lazebnik 1998;281(5381):1312-6.

13.

Walker NP, Talanian RV, Brady KD, Dang LC, Bump NJ, Ferenz CR, Franklin S, Ghayur T, Hackett MC, Hammill LD and others. Crystal structure of the cysteine protease interleukin-1 beta-converting enzyme: a (p20/p10)2 homodimer. Cell 1994;78(2):343-52.

Y.

75

Caspases:

enemies

within.

Science


14.

Rotonda J, Nicholson DW, Fazil KM, Gallant M, Gareau Y, Labelle M, Peterson EP, Rasper DM, Ruel R, Vaillancourt JP and others. The threedimensional structure of apopain/CPP32, a key mediator of apoptosis. Nat Struct Biol 1996;3(7):619-25.

15.

Lavrik IN, Golks A, Krammer PH. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J Clin Invest 2005;115(10):2665-72.

16.

Fesik SW. Insights into programmed cell death through structural biology. Cell 2000;103(2):273-82.

17.

Strasser A, O'Connor L, Dixit VM. Apoptosis signaling. Annu Rev Biochem 2000;69:217-45.

18.

Ferri KF, Kroemer G. Organelle-specific initiation of cell death pathways. Nat Cell Biol 2001;3(11):E255-63.

19.

Nicholson DW, Thornberry NA. Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci 1997;22(8):299-306.

20.

Apasov S, Redegeld F, Sitkovsky M. Cell-mediated cytotoxicity: contact and secreted factors. Curr Opin Immunol 1993;5(3):404-10.

21.

Schneider P, Holler N, Bodmer JL, Hahne M, Frei K, Fontana A, Tschopp J. Conversion of membrane-bound Fas(CD95) ligand to its soluble form is associated with downregulation of its proapoptotic activity and loss of liver toxicity. J Exp Med 1998;187(8):1205-13.

22.

Tartaglia LA, Ayres TM, Wong GH, Goeddel DV. A novel domain within the 55 kd TNF receptor signals cell death. Cell 1993;74(5):845-53.

23.

Itoh N, Nagata S. A novel protein domain required for apoptosis. Mutational analysis of human Fas antigen. J Biol Chem 1993;268(15):10932-7.

24.

Kischkel FC, Hellbardt S, Behrmann I, Germer M, Pawlita M, Krammer PH, Peter ME. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. Embo J 1995;14(22):5579-88.

25.

Boatright KM, Renatus M, Scott FL, Sperandio S, Shin H, Pedersen IM, Ricci JE, Edris WA, Sutherlin DP, Green DR and others. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell 2003;11(2):529-41.

26.

Lavrik I, Krueger A, Schmitz I, Baumann S, Weyd H, Krammer PH, Kirchhoff S. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC. Cell Death Differ 2003;10(1):144-5.

76


27.

Desagher S, Martinou JC. Mitochondria as the central control point of apoptosis. Trends Cell Biol 2000;10(9):369-77.

28.

Capano M, Crompton M. Biphasic translocation of Bax to mitochondria. Biochem J 2002;367(Pt 1):169-78.

29.

Scarlett JL, Sheard PW, Hughes G, Ledgerwood EC, Ku HH, Murphy MP. Changes in mitochondrial membrane potential during staurosporine-induced apoptosis in Jurkat cells. FEBS Lett 2000;475(3):267-72.

30.

Tafani M, Minchenko DA, Serroni A, Farber JL. Induction of the mitochondrial permeability transition mediates the killing of HeLa cells by staurosporine. Cancer Res 2001;61(6):2459-66.

31.

Springs SL, Diavolitsis VM, Goodhouse J, McLendon GL. The kinetics of translocation of Smac/DIABLO from the mitochondria to the cytosol in HeLa cells. J Biol Chem 2002;277(48):45715-8.

32.

Wei MC, Zong WX, Cheng EH, Lindsten T, Panoutsakopoulou V, Ross AJ, Roth KA, MacGregor GR, Thompson CB, Korsmeyer SJ. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science 2001;292(5517):727-30.

33.

Acehan D, Jiang X, Morgan DG, Heuser JE, Wang X, Akey CW. Threedimensional structure of the apoptosome: implications for assembly, procaspase-9 binding, and activation. Mol Cell 2002;9(2):423-32.

34.

Jiang X, Wang X. Cytochrome c promotes caspase-9 activation by inducing nucleotide binding to Apaf-1. J Biol Chem 2000;275(40):31199-203.

35.

Kumar S, Vaux DL. Apoptosis. A cinderella caspase takes center stage. Science 2002;297(5585):1290-1.

36.

Tinel A, Tschopp J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science 2004;304(5672):843-6.

37.

Yin XM. Bid, a BH3-only multi-functional molecule, is at the cross road of life and death. Gene 2006;369:7-19.

38.

Bossy-Wetzel E, Green DR. Caspases induce cytochrome c release from mitochondria by activating cytosolic factors. J Biol Chem 1999;274(25):1748490.

39.

Grimm S, Brdiczka D. The permeability transition pore in cell death. Apoptosis 2007;12(5):841-55.

77


40.

Secrist JP, Sehgal I, Powis G, Abraham RT. Preferential inhibition of the platelet-derived growth factor receptor tyrosine kinase by staurosporine. J Biol Chem 1990;265(33):20394-400.

41.

Badwey JA, Erickson RW, Curnutte JT. Staurosporine inhibits the soluble and membrane-bound protein tyrosine kinases of human neutrophils. Biochem Biophys Res Commun 1991;178(2):423-9.

42.

Fallon RJ. Staurosporine inhibits a tyrosine protein kinase in human hepatoma cell membranes. Biochem Biophys Res Commun 1990;170(3):1191-6.

43.

Davies SP, Reddy H, Caivano M, Cohen P. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem J 2000;351(Pt 1):95-105.

44.

McGinnis KM, Gnegy ME, Wang KK. Endogenous bax translocation in SHSY5Y human neuroblastoma cells and cerebellar granule neurons undergoing apoptosis. J Neurochem 1999;72(5):1899-906.

45.

Campos CB, Paim BA, Cosso RG, Castilho RF, Rottenberg H, Vercesi AE. Method for monitoring of mitochondrial cytochrome c release during cell death: Immunodetection of cytochrome c by flow cytometry after selective permeabilization of the plasma membrane. Cytometry A 2006;69(6):515-23.

46.

Guo HR, Chen CH, Ho SY, Ho YS, Chen RJ, Wang YJ. Staurosporine modulates radiosensitivity and radiation-induced apoptosis in U937 cells. Int J Radiat Biol 2006;82(2):97-109.

47.

Finucane DM, Waterhouse NJ, Amarante-Mendes GP, Cotter TG, Green DR. Collapse of the inner mitochondrial transmembrane potential is not required for apoptosis of HL60 cells. Exp Cell Res 1999;251(1):166-74.

48.

Salvioli S, Dobrucki J, Moretti L, Troiano L, Fernandez MG, Pinti M, Pedrazzi J, Franceschi C, Cossarizza A. Mitochondrial heterogeneity during staurosporine-induced apoptosis in HL60 cells: analysis at the single cell and single organelle level. Cytometry 2000;40(3):189-97.

49.

Cotter TG, Lennon SV, Glynn JM, Green DR. Microfilament-disrupting agents prevent the formation of apoptotic bodies in tumor cells undergoing apoptosis. Cancer Res 1992;52(4):997-1005.

50.

Scaffidi C, Fulda S, Srinivasan A, Friesen C, Li F, Tomaselli KJ, Debatin KM, Krammer PH, Peter ME. Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways. Embo J 1998;17(6):1675-87.

51.

Lakhani SA, Masud A, Kuida K, Porter GA, Jr., Booth CJ, Mehal WZ, Inayat I, Flavell RA. Caspases 3 and 7: key mediators of mitochondrial events of apoptosis. Science 2006;311(5762):847-51.

78


52.

Rao L, Perez D, White E. Lamin proteolysis facilitates nuclear events during apoptosis. J Cell Biol 1996;135(6 Pt 1):1441-55.

53.

Earnshaw WC, Martins LM, Kaufmann SH. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. Annu Rev Biochem 1999;68:383-424.

54.

Lazebnik YA, Kaufmann SH, Desnoyers S, Poirier GG, Earnshaw WC. Cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature 1994;371(6495):346-7.

55.

Liu X, Zou H, Slaughter C, Wang X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell 1997;89(2):175-84.

56.

Liu X, Li P, Widlak P, Zou H, Luo X, Garrard WT, Wang X. The 40-kDa subunit of DNA fragmentation factor induces DNA fragmentation and chromatin condensation during apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95(15):8461-6.

57.

Fadok VA, Voelker DR, Campbell PA, Cohen JJ, Bratton DL, Henson PM. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol 1992;148(7):2207-16.

58.

Wang X, Wang J, Gengyo-Ando K, Gu L, Sun CL, Yang C, Shi Y, Kobayashi T, Shi Y, Mitani S and others. C. elegans mitochondrial factor WAH-1 promotes phosphatidylserine externalization in apoptotic cells through phospholipid scramblase SCRM-1. Nat Cell Biol 2007;9(5):541-9.

59.

Maderna P, Godson C. Phagocytosis of apoptotic cells and the resolution of inflammation. Biochim Biophys Acta 2003;1639(3):141-51.

60.

Evan GI, Vousden KH. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer. Nature 2001;411(6835):342-8.

61.

Soussi T. p53 alterations in human cancer: more questions than answers. Oncogene 2007;26(15):2145-56.

62.

Fraser M, Bai T, Tsang BK. Akt promotes cisplatin resistance in human ovarian cancer cells through inhibition of p53 phosphorylation and nuclear function. Int J Cancer 2007.

63.

Chanan-Khan A, Czuczman MS. Bcl-2 antisense therapy in B-cell malignant proliferative disorders. Curr Treat Options Oncol 2004;5(4):261-7.

64.

Oliveira C, Seruca R, Seixas M, Sobrinho-Simoes M. The clinicopathological features of gastric carcinomas with microsatellite instability may be mediated

79


by mutations of different "target genes": a study of the TGFbeta RII, IGFII R, and BAX genes. Am J Pathol 1998;153(4):1211-9. 65.

Dean EJ, Ranson M, Blackhall F, Holt SV, Dive C. Novel therapeutic targets in lung cancer: Inhibitor of apoptosis proteins from laboratory to clinic. Cancer Treat Rev 2007;33(2):203-12.

66.

Mizuno T, Zhong X, Rothstein TL. Fas-induced apoptosis in B cells. Apoptosis 2003;8(5):451-60.

67.

McKee AE, Thiele CJ. Targeting caspase 8 to reduce the formation of metastases in neuroblastoma. Expert Opin Ther Targets 2006;10(5):703-8.

68.

Zornig M, Hueber A, Baum W, Evan G. Apoptosis regulators and their role in tumorigenesis. Biochim Biophys Acta 2001;1551(2):F1-37.

69.

Winter RN, Kramer A, Borkowski A, Kyprianou N. Loss of caspase-1 and caspase-3 protein expression in human prostate cancer. Cancer Res 2001;61(3):1227-32.

70.

Evan GI, Brown L, Whyte M, Harrington E. Apoptosis and the cell cycle. Curr Opin Cell Biol 1995;7(6):825-34.

71.

Mattson MP. Apoptosis in neurodegenerative disorders. Nat Rev Mol Cell Biol 2000;1(2):120-9.

72.

Uberti D, Ferrari-Toninelli G, Bonini SA, Sarnico I, Benarese M, Pizzi M, Benussi L, Ghidoni R, Binetti G, Spano P and others. Blockade of the tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand death receptor DR5 prevents beta-amyloid neurotoxicity. Neuropsychopharmacology 2007;32(4):872-80.

73.

Roach HI, Clarke NM. Physiological cell death of chondrocytes in vivo is not confined to apoptosis. New observations on the mammalian growth plate. J Bone Joint Surg Br 2000;82(4):601-13.

74.

Barkla DH, Gibson PR. The fate of epithelial cells in the human large intestine. Pathology 1999;31(3):230-8.

75.

Manolagas SC. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocr Rev 2000;21(2):115-37.

76.

Polakowska RR, Piacentini M, Bartlett R, Goldsmith LA, Haake AR. Apoptosis in human skin development: morphogenesis, periderm, and stem cells. Dev Dyn 1994;199(3):176-88.

80


77.

Dahm R, Gribbon C, Quinlan RA, Prescott AR. Lens cell organelle loss during differentiation versus stress-induced apoptotic changes. Biochem Soc Trans 1997;25(4):S584.

78.

Bratosin D, Estaquier J, Petit F, Arnoult D, Quatannens B, Tissier JP, Slomianny C, Sartiaux C, Alonso C, Huart JJ and others. Programmed cell death in mature erythrocytes: a model for investigating death effector pathways operating in the absence of mitochondria. Cell Death Differ 2001;8(12):114356.

79.

Broker LE, Huisman C, Span SW, Rodriguez JA, Kruyt FA, Giaccone G. Cathepsin B mediates caspase-independent cell death induced by microtubule stabilizing agents in non-small cell lung cancer cells. Cancer Res 2004;64(1):27-30.

80.

Jiang H, Sha SH, Forge A, Schacht J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death Differ 2006;13(1):20-30.

81.

Braun JS, Novak R, Murray PJ, Eischen CM, Susin SA, Kroemer G, Halle A, Weber JR, Tuomanen EI, Cleveland JL. Apoptosis-inducing factor mediates microglial and neuronal apoptosis caused by pneumococcus. J Infect Dis 2001;184(10):1300-9.

82.

Kroemer G, Martin 2005;11(7):725-30.

83.

Degenhardt K, Mathew R, Beaudoin B, Bray K, Anderson D, Chen G, Mukherjee C, Shi Y, Gelinas C, Fan Y and others. Autophagy promotes tumor cell survival and restricts necrosis, inflammation, and tumorigenesis. Cancer Cell 2006;10(1):51-64.

84.

Leist M, Single B, Castoldi AF, Kuhnle S, Nicotera P. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis. J Exp Med 1997;185(8):1481-6.

85.

Nicotera P, Bernassola F, Melino G. Nitric oxide (NO), a signaling molecule with a killer soul. Cell Death Differ 1999;6(10):931-3.

86.

Golstein P, Kroemer G. Redundant cell death mechanisms as relics and backups. Cell Death Differ 2005;12 Suppl 2:1490-6.

87.

Lang-Rollin IC, Rideout HJ, Noticewala M, Stefanis L. Mechanisms of caspaseindependent neuronal death: energy depletion and free radical generation. J Neurosci 2003;23(35):11015-25.

88.

Chipuk JE, Green DR. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death? Nat Rev Mol Cell Biol 2005;6(3):268-75.

SJ.

Caspase-independent

81

cell

death.

Nat

Med


89.

Oppenheim RW, Flavell RA, Vinsant S, Prevette D, Kuan CY, Rakic P. Programmed cell death of developing mammalian neurons after genetic deletion of caspases. J Neurosci 2001;21(13):4752-60.

90.

Festjens N, Vanden Berghe T, Vandenabeele P. Necrosis, a well-orchestrated form of cell demise: signalling cascades, important mediators and concomitant immune response. Biochim Biophys Acta 2006;1757(9-10):1371-87.

91.

Proskuryakov SY, Konoplyannikov AG, Gabai VL. Necrosis: a specific form of programmed cell death? Exp Cell Res 2003;283(1):1-16.

92.

Johnson DE. Noncaspase proteases in apoptosis. Leukemia 2000;14(9):1695703.

93.

Sorimachi H, Ishiura S, Suzuki K. Structure and physiological function of calpains. Biochem J 1997;328 ( Pt 3):721-32.

94.

Ray SK, Fidan M, Nowak MW, Wilford GG, Hogan EL, Banik NL. Oxidative stress and Ca2+ influx upregulate calpain and induce apoptosis in PC12 cells. Brain Res 2000;852(2):326-34.

95.

Wang KK. Calpain and caspase: can you tell the difference? Trends Neurosci 2000;23(1):20-6.

96.

Bleackley RC. A molecular view of cytotoxic T lymphocyte induced killing. Biochem Cell Biol 2005;83(6):747-51.

97.

Guicciardi ME, Deussing J, Miyoshi H, Bronk SF, Svingen PA, Peters C, Kaufmann SH, Gores GJ. Cathepsin B contributes to TNF-alpha-mediated hepatocyte apoptosis by promoting mitochondrial release of cytochrome c. J Clin Invest 2000;106(9):1127-37.

98.

Foghsgaard L, Wissing D, Mauch D, Lademann U, Bastholm L, Boes M, Elling F, Leist M, Jaattela M. Cathepsin B acts as a dominant execution protease in tumor cell apoptosis induced by tumor necrosis factor. J Cell Biol 2001;153(5):999-1010.

99.

Zang Y, Beard RL, Chandraratna RA, Kang JX. Evidence of a lysosomal pathway for apoptosis induced by the synthetic retinoid CD437 in human leukemia HL-60 cells. Cell Death Differ 2001;8(5):477-85.

100.

Kagedal K, Zhao M, Svensson I, Brunk UT. Sphingosine-induced apoptosis is dependent on lysosomal proteases. Biochem J 2001;359(Pt 2):335-43.

101.

Fehrenbacher N, Jaattela M. Lysosomes as targets for cancer therapy. Cancer Res 2005;65(8):2993-5.

82


102.

Chwieralski CE, Welte T, Buhling F. Cathepsin-regulated apoptosis. Apoptosis 2006;11(2):143-9.

103.

Turk V, Turk B, Guncar G, Turk D, Kos J. Lysosomal cathepsins: structure, role in antigen processing and presentation, and cancer. Adv Enzyme Regul 2002;42:285-303.

104.

Turk V, Turk B, Turk D. Lysosomal cysteine proteases: facts and opportunities. Embo J 2001;20(17):4629-33.

105.

Turk B, Turk D, Turk V. Lysosomal cysteine proteases: more than scavengers. Biochim Biophys Acta 2000;1477(1-2):98-111.

106.

Deussing J, Roth W, Saftig P, Peters C, Ploegh HL, Villadangos JA. Cathepsins B and D are dispensable for major histocompatibility complex class II-mediated antigen presentation. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95(8):4516-21.

107.

Hsing LC, Rudensky AY. The lysosomal cysteine proteases in MHC class II antigen presentation. Immunol Rev 2005;207:229-41.

108.

Roth W, Deussing J, Botchkarev VA, Pauly-Evers M, Saftig P, Hafner A, Schmidt P, Schmahl W, Scherer J, Anton-Lamprecht I and others. Cathepsin L deficiency as molecular defect of furless: hyperproliferation of keratinocytes and pertubation of hair follicle cycling. Faseb J 2000;14(13):2075-86.

109.

Chapman HA, Riese RJ, Shi GP. Emerging roles for cysteine proteases in human biology. Annu Rev Physiol 1997;59:63-88.

110.

Gelb BD, Shi GP, Chapman HA, Desnick RJ. Pycnodysostosis, a lysosomal disease caused by cathepsin K deficiency. Science 1996;273(5279):1236-8. Gocheva V, Joyce JA. Cysteine cathepsins and the cutting edge of cancer invasion. Cell Cycle 2007;6(1):60-4.

111. 112.

Kroemer G, Jaattela M. Lysosomes and autophagy in cell death control. Nat Rev Cancer 2005;5(11):886-97.

113.

Werneburg NW, Guicciardi ME, Bronk SF, Kaufmann SH, Gores GJ. TRAIL activates a lysosomal pathway of apoptosis that is regulated by Bcl-2 proteins. J Biol Chem 2007.

114.

Wang JW, Sun L, Hu JS, Li YB, Zhang GJ. Effects of phospholipase A2 on the lysosomal ion permeability and osmotic sensitivity. Chem Phys Lipids 2006;144(2):117-26.

115.

Yamashima T. Ca2+-dependent proteases in ischemic neuronal death: a conserved 'calpain-cathepsin cascade' from nematodes to primates. Cell Calcium 2004;36(3-4):285-93.

83


116.

Madge LA, Li JH, Choi J, Pober JS. Inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase sensitizes vascular endothelial cells to cytokine-initiated cathepsin-dependent apoptosis. J Biol Chem 2003;278(23):21295-306.

117.

Gyrd-Hansen M, Nylandsted J, Jaattela M. Heat shock protein 70 promotes cancer cell viability by safeguarding lysosomal integrity. Cell Cycle 2004;3(12):1484-5.

118.

Bursch W. The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death. Cell Death Differ 2001;8(6):569-81.

119.

Fehrenbacher N, Gyrd-Hansen M, Poulsen B, Felbor U, Kallunki T, Boes M, Weber E, Leist M, Jaattela M. Sensitization to the lysosomal cell death pathway upon immortalization and transformation. Cancer Res 2004;64(15):5301-10.

120.

Baskin-Bey ES, Canbay A, Bronk SF, Werneburg N, Guicciardi ME, Nyberg SL, Gores GJ. Cathepsin B inactivation attenuates hepatocyte apoptosis and liver damage in steatotic livers after cold ischemia-warm reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2005;288(2):G396-402.

121.

Michallet MC, Saltel F, Preville X, Flacher M, Revillard JP, Genestier L. Cathepsin-B-dependent apoptosis triggered by antithymocyte globulins: a novel mechanism of T-cell depletion. Blood 2003;102(10):3719-26.

122.

Felbor U, Kessler B, Mothes W, Goebel HH, Ploegh HL, Bronson RT, Olsen BR. Neuronal loss and brain atrophy in mice lacking cathepsins B and L. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99(12):7883-8.

123.

Schestkowa O, Geisel D, Jacob R, Hasilik A. The catalytically inactive precursor of cathepsin D induces apoptosis in human fibroblasts and HeLa cells. J Cell Biochem 2007;101(6):1558-66.

124.

Castino R, Bellio N, Nicotra G, Follo C, Trincheri NF, Isidoro C. Cathepsin DBax death pathway in oxidative stressed neuroblastoma cells. Free Radic Biol Med 2007;42(9):1305-16.

125.

Li X, Rayford H, Shu R, Zhuang J, Uhal BD. Essential role for cathepsin D in bleomycin-induced apoptosis of alveolar epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2004;287(1):L46-51.

126.

Pfeiffer RM, Goldin LR, Chatterjee N, Daugherty S, Hemminki K, Pee D, X LI, Gail MH. Methods for testing familial aggregation of diseases in populationbased samples: application to Hodgkin lymphoma in Swedish registry data. Ann Hum Genet 2004;68(Pt 5):498-508.

127.

Sevenich L, Pennacchio LA, Peters C, Reinheckel T. Human cathepsin L rescues the neurodegeneration and lethality in cathepsin B/L double-deficient mice. Biol Chem 2006;387(7):885-91.

84


128.

Turk B, Stoka V. Protease signalling in cell death: caspases versus cysteine cathepsins. FEBS Lett 2007;581(15):2761-7.

129.

Stoka V, Turk B, Schendel SL, Kim TH, Cirman T, Snipas SJ, Ellerby LM, Bredesen D, Freeze H, Abrahamson M and others. Lysosomal protease pathways to apoptosis. Cleavage of bid, not pro-caspases, is the most likely route. J Biol Chem 2001;276(5):3149-57.

130.

Roberts LR, Kurosawa H, Bronk SF, Fesmier PJ, Agellon LB, Leung WY, Mao F, Gores GJ. Cathepsin B contributes to bile salt-induced apoptosis of rat hepatocytes. Gastroenterology 1997;113(5):1714-26.

131.

Kim R, Emi M, Tanabe K. Role of mitochondria as the gardens of cell death. Cancer Chemother Pharmacol 2006;57(5):545-53.

132.

Nakagawa T, Shimizu S, Watanabe T, Yamaguchi O, Otsu K, Yamagata H, Inohara H, Kubo T, Tsujimoto Y. Cyclophilin D-dependent mitochondrial permeability transition regulates some necrotic but not apoptotic cell death. Nature 2005;434(7033):652-8.

133.

Mathiasen IS, Jaattela M. Triggering caspase-independent cell death to combat cancer. Trends Mol Med 2002;8(5):212-20.

134.

Forcet C, Ye X, Granger L, Corset V, Shin H, Bredesen DE, Mehlen P. The dependence receptor DCC (deleted in colorectal cancer) defines an alternative mechanism for caspase activation. Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98(6):341621.

135.

Holler N, Zaru R, Micheau O, Thome M, Attinger A, Valitutti S, Bodmer JL, Schneider P, Seed B, Tschopp J. Fas triggers an alternative, caspase-8independent cell death pathway using the kinase RIP as effector molecule. Nat Immunol 2000;1(6):489-95.

136.

Zong WX, Ditsworth D, Bauer DE, Wang ZQ, Thompson CB. Alkylating DNA damage stimulates a regulated form of necrotic cell death. Genes Dev 2004;18(11):1272-82.

137.

Xu Y, Huang S, Liu ZG, Han J. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 signaling to mitochondria in necrotic cell death requires RIP1/TRAF2-mediated JNK1 activation. J Biol Chem 2006;281(13):8788-95.

138.

Darzynkiewicz Z, Bedner E. Analysis of apoptotic cells by flow and laser scanning cytometry. Methods Enzymol 2000;322:18-39.

139.

Traganos F, Darzynkiewicz Z. Lysosomal proton pump activity: supravital cell staining with acridine orange differentiates leukocyte subpopulations. Methods Cell Biol 1994;41:185-94.

85


140.

Gong J, Traganos F, Darzynkiewicz Z. A selective procedure for DNA extraction from apoptotic cells applicable for gel electrophoresis and flow cytometry. Anal Biochem 1994;218(2):314-9.

141.

Daugas E, Susin SA, Zamzami N, Ferri KF, Irinopoulou T, Larochette N, Prevost MC, Leber B, Andrews D, Penninger J and others. Mitochondrionuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis. Faseb J 2000;14(5):72939.

142.

Barrett AJ, Kembhavi AA, Brown MA, Kirschke H, Knight CG, Tamai M, Hanada K. L-trans-Epoxysuccinyl-leucylamido(4-guanidino)butane (E-64) and its analogues as inhibitors of cysteine proteinases including cathepsins B, H and L. Biochem J 1982;201(1):189-98.

143.

McAdoo MH, Dannenberg AM, Jr., Hayes CJ, James SP, Sanner JH. Inhibition of cathepsin D-type proteinase of macrophages by pepstatin, a specific pepsin inhibitor, and other substances. Infect Immun 1973;7(4):655-65.

144.

Murata M, Miyashita S, Yokoo C, Tamai M, Hanada K, Hatayama K, Towatari T, Nikawa T, Katunuma N. Novel epoxysuccinyl peptides. Selective inhibitors of cathepsin B, in vitro. FEBS Lett 1991;280(2):307-10.

145.

Lewis J, Devin A, Miller A, Lin Y, Rodriguez Y, Neckers L, Liu ZG. Disruption of hsp90 function results in degradation of the death domain kinase, receptor-interacting protein (RIP), and blockage of tumor necrosis factorinduced nuclear factor-kappaB activation. J Biol Chem 2000;275(14):10519-26. Mlinaric-Rascan I, Turk B. B cell receptor-mediated nuclear fragmentation proceeds in WEHI 231 cells in the absence of detectable DEVDase and FRase activity. FEBS Lett 2003;553(1-2):51-5.

146.

147.

Greiner A, Lautwein A, Overkleeft HS, Weber E, Driessen C. Activity and subcellular distribution of cathepsins in primary human monocytes. J Leukoc Biol 2003;73(2):235-42.

148.

Journet A, Chapel A, Kieffer S, Roux F, Garin J. Proteomic analysis of human lysosomes: application to monocytic and breast cancer cells. Proteomics 2002;2(8):1026-40.

149.

Jaattela M, Tschopp J. Caspase-independent cell death in T lymphocytes. Nat Immunol 2003;4(5):416-23.

150.

Gobeil S, Boucher CC, Nadeau D, Poirier GG. Characterization of the necrotic cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP-1): implication of lysosomal proteases. Cell Death Differ 2001;8(6):588-94.

151.

Cirman T, Oresic K, Mazovec GD, Turk V, Reed JC, Myers RM, Salvesen GS, Turk B. Selective disruption of lysosomes in HeLa cells triggers apoptosis

86


mediated by cleavage of Bid by multiple papain-like lysosomal cathepsins. J Biol Chem 2004;279(5):3578-87. 152.

Brockhaus F, Brune B. U937 apoptotic cell death by nitric oxide: Bcl-2 downregulation and caspase activation. Exp Cell Res 1998;238(1):33-41.

153.

Li LY, Luo X, Wang X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria. Nature 2001;412(6842):95-9.

154.

Garcia-Calvo M, Peterson EP, Leiting B, Ruel R, Nicholson DW, Thornberry NA. Inhibition of human caspases by peptide-based and macromolecular inhibitors. J Biol Chem 1998;273(49):32608-13.

155.

Lopez-Hernandez FJ, Ortiz MA, Bayon Y, Piedrafita FJ. Z-FA-fmk inhibits effector caspases but not initiator caspases 8 and 10, and demonstrates that novel anticancer retinoid-related molecules induce apoptosis via the intrinsic pathway. Mol Cancer Ther 2003;2(3):255-63.

156.

Janssens S, Tinel A, Lippens S, Tschopp J. PIDD mediates NF-kappaB activation in response to DNA damage. Cell 2005;123(6):1079-92.

157.

Tinel A, Janssens S, Lippens S, Cuenin S, Logette E, Jaccard B, Quadroni M, Tschopp J. Autoproteolysis of PIDD marks the bifurcation between pro-death caspase-2 and pro-survival NF-kappaB pathway. Embo J 2007;26(1):197-208.

158.

Rebe C, Cathelin S, Launay S, Filomenko R, Prevotat L, L'Ollivier C, Gyan E, Micheau O, Grant S, Dubart-Kupperschmitt A and others. Caspase-8 prevents sustained activation of NF-kappaB in monocytes undergoing macrophagic differentiation. Blood 2007;109(4):1442-50.

159.

Brunk UT, Dalen H, Roberg K, Hellquist HB. Photo-oxidative disruption of lysosomal membranes causes apoptosis of cultured human fibroblasts. Free Radic Biol Med 1997;23(4):616-26.

160.

Nylandsted J, Gyrd-Hansen M, Danielewicz A, Fehrenbacher N, Lademann U, Hoyer-Hansen M, Weber E, Multhoff G, Rohde M, Jaattela M. Heat shock protein 70 promotes cell survival by inhibiting lysosomal membrane permeabilization. J Exp Med 2004;200(4):425-35.

161.

Ali A, Bharadwaj S, O'Carroll R, Ovsenek N. HSP90 interacts with and regulates the activity of heat shock factor 1 in Xenopus oocytes. Mol Cell Biol 1998;18(9):4949-60.

87

Proteázok szerepe a sejtelhalás szabályozásában staurosporin kezelt kaszpáz-gátolt leukémia sejteken

Recommend Documents